JP7686802B2 - 抗－ｔｍ４ｓｆ４ヒト化抗体及びこの用途 - Google Patents

Description

本発明は、ＴＭ４ＳＦ４（ＴｒａｎｓＭｅｍｂｒａｎｅ ４ Ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ
Ｍｅｍｂｅｒ ４）に高い親和度で特異的結合することができ、ヒトにおいて低い免疫原性を示すヒト化抗体及びこれを含む癌の予防又は治療用組成物に関する。

ＴＭ４ＳＦ４（ＴｒａｎｓＭｅｍｂｒａｎｅ ４ Ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ Ｍｅｍｂｅｒ ４）は、テトラスパニン（ｔｅｔｒａｓｐａｎｉｎ）タンパク質の一種であり、この分類の他のタンパク質であるＴＭ４ＳＦ１及びＴＭ４ＳＦ５は多数の腫瘍から発現が上向き調節され、上皮間葉転換及び細胞移動に関与することが報告され、癌細胞関連の研究が多数進められている。ＴＭ４ＳＦ４は、癌細胞で細胞の死滅と分化、そして細胞の浸透能力に関与すると一部で報告されており、最近、本発明の研究陣は、ヒト肺癌細胞でＴＭ４ＳＦ４タンパク質が癌幹細胞の成長、自己複製（Ｓｅｌｆ－ｒｅｎｅｗａｌ）能力及び転移／浸潤を促進させると報告し、ＴＭ４ＳＦ４が癌の発生に重要な信号伝達システムであるＩＧＦ１Ｒβ／ＡＫＴ／ＮＦκＢ又はＪＡＫ２（又はＦＡＫ）／ＳＴＡＴ３活性化を促進させ、それにより促進されるサイトカイン分泌により癌幹細胞の特性を強化させ、腫瘍をさらに悪性化させることを提示した（Ｃｈｏｉ ＳＩ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．２０１４；５（２０）：９８２３－９８３７、Ｃｈｏｉ ＳＩ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．２０１７；８（６０）：１０１２８４－１０１２９７）。

抗体は、ターゲット抗原に対する高い結合特異性と人体内安定性により治療剤として活用されている。特に、抗癌機能の抗体は、抗体工学技術の発展に基づいてヒト化抗体、単鎖抗体、二重抗体、薬物融合抗体などに改善し、癌治療効能を大きく向上させて活用されている。しかし、癌特性の多様性と新たな抗原の発現による治療抵抗性の誘導などにより、既存に癌細胞ターゲティングのために活用されている抗原の種類に限界性が指摘されており、新規の癌特異抗原を探索してこれに対する抗体を導出する研究が持続している。

特に、既存の癌治療法に活用されている標的薬物や放射線治療に抵抗性を示して再発する癌の場合、癌幹細胞の特性が重要に作用することが報告されており、癌幹細胞ターゲティングに活用することができる抗原の発掘及び特異抗体の確保が重要なものとして浮上している。

一方、特定抗原に対して特異的に結合する単一クローン抗体を開発するため、ヒト以外の動物を対象として抗原を注入させ、動物の免疫システムを介して作られる抗体を用いる方法が主に用いられている。ところが、前記方法を介して作られる抗体は、ヒト以外の動物から由来する抗体であるという点でヒトのタンパク質でないので、人体に投与した際に免疫原性（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）の問題点が発生することがある。すなわち、ヒト以外の種から由来する抗体が人体に投与される場合、ＨＡＭＡ（Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ）の発生を誘導することがあり、前記異種由来の抗体による治療効能が減少することがある。

よって、前記ヒト以外の種から由来する抗体を構成するアミノ酸配列のうち、抗原との結合に重要な役割を担う配列を得て、残りの部分はヒト抗体の配列で代替することにより、前記で説明した問題点を解決しようとする方法が提示される。ところが、このような方法を介して製造されるキメラ抗体（ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ）やヒト化抗体（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ）は、互いに異なる２つのタンパク質領域を融合させたものであるという点で、抗体として機能することができないか、抗原に対する結
合親和度が減少する可能性が発生する。よって、人体においてＨＡＭＡの発生を誘導しないとともに、抗原に対する高い特異性と親和度を示すヒト化抗体を開発することには依然として困難を伴うことが実情である。

本発明は、癌細胞の表面に過剰発現して現れるＴＭ４ＳＦ４（ＴｒａｎｓＭｅｍｂｒａｎｅ ４ Ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ Ｍｅｍｂｅｒ ４）タンパク質に高い親和度で特異的に結合することができながらも、人体に投与されたときに低い免疫原性を示し得る新規のヒト化抗体又はこの抗原結合断片を提供することを目的とする。

また、本発明は、前記ヒト化抗体又はこの抗原結合断片を暗号化してこれを発現させることができるポリヌクレオチド、発現ベクター、宿主細胞、そして前記ヒト化抗体又はこの抗原結合断片を生産する方法を提供することを目的とする。また、本発明は、前記宿主細胞を培養する段階を含む、抗体又はこの抗原結合断片を生産する方法を提供する。

また、本発明は、ＴＭ４ＳＦ４を検出するための用途の組成物、キット、そしてＴＭ４ＳＦ４を検出する方法を提供することを目的とする。

また、本発明は、癌を予防するか治療するための薬学的組成物、癌幹細胞の成長抑制用組成物、そして放射線抗癌治療補助用組成物を提供することを目的とする。

前記目的を達成するために、配列番号１のアミノ酸配列を有するＦＲ－Ｈ１、配列番号２又は配列番号３のアミノ酸配列を有するＦＲ－Ｈ２、配列番号４のアミノ酸配列を有するＦＲ－Ｈ３及び配列番号５のアミノ酸配列を有するＦＲ－Ｈ４を含む重鎖可変領域；及び、配列番号６のアミノ酸配列を有するＦＲ－Ｌ１、配列番号７のアミノ酸配列を有するＦＲ－Ｌ２、配列番号８のアミノ酸配列を有するＦＲ－Ｌ３及び配列番号９のアミノ酸配列を有するＦＲ－Ｌ４を含む軽鎖可変領域；を含み、ＴＭ４ＳＦ４（ＴｒａｎｓＭｅｍｂｒａｎｅ ４ Ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ Ｍｅｍｂｅｒ ４）に特異的に結合する、ヒト化抗体又はこの抗原結合断片を提供する。

本発明の他の側面は、前記ヒト化抗体又はこの抗原結合断片を暗号化する塩基配列を含むポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、そして前記発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。

本発明の他の側面は、前記ヒト化抗体又はこの抗原結合断片を含むＴＭ４ＳＦ４検出用組成物、及び前記ＴＭ４ＳＦ４検出用組成物を含むＴＭ４ＳＦ４検出用キットを提供する。

本発明の他の側面は、前記ヒト化抗体又はこの抗原結合断片を含むＴＭ４ＳＦ４が含まれているものと予想される検出対象試料と接触させる段階を含むＴＭ４ＳＦ４を検出する方法を提供する。

本発明の他の側面は、前記ヒト化抗体又はこの抗原結合断片を含む癌の予防又は治療用薬学的組成物、癌幹細胞成長抑制用組成物及び放射線抗癌治療補助用組成物を提供する。

本発明のヒト化抗体は、ＢＳＡのような物質には結合しないながらもＴＭ４ＳＦ４に特異的に結合することができるので、ＴＭ４ＳＦ４を検出するかＴＭ４ＳＦ４を過剰発現す
る癌細胞、癌幹細胞を標的として有用に用いることができる。特に、本発明のヒト化抗体は、マウス由来の抗体と類似するか、キメラ抗体に比べて結合親和度が顕著に高いという特徴があるので優れた効果を奏する。

また、本発明のヒト化抗体は、大部分のＣＤＲ配列を除外した残りの配列がヒト抗体由来のアミノ酸配列を用いるかその一部を変形したものなので、人体に投与した際にもＨＡＭＡ（Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ）を誘導する可能性が低くて免疫原性（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｃｉｔｙ）も低いという効果がある。これによって、本発明のヒト化抗体は、マウス由来の抗体を用いることにより発生し得る免疫反応の問題点を解決することができるという長所がある。

但し、本発明の効果は、前記で言及した効果に制限されず、言及されていないまた他の効果は、下記の記載から当業者に明確に理解され得るであろう。

本発明のヒト化抗体のうちＨｚ２Ｂ７－１．０と称される重鎖可変領域を暗号化する遺伝子配列を製造するための組換えＰＣＲ過程に対して説明している模式図である。 前記Ｈｚ２Ｂ７－１．０重鎖可変領域遺伝子の製造結果を示した図であって、Ａは、Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３切片に対するアガロースゲル電気泳動の結果を示し、Ｂは、Ｔ、Ｔ２、Ｔ３を連結した最終完成のＨｚ２Ｂ７－１．０重鎖可変領域遺伝子が含まれたＤＮＡの電気泳動の結果を示す。 本発明のヒト化抗体のうちＨｚ２Ｂ７－０．１と称される軽鎖可変領域を暗号化する遺伝子が含まれたＤＮＡのアガロースゲル電気泳動の結果を示した図である。 本発明のヒト化抗体であるＨｚ２Ｂ７－１．１抗体のアミノ酸配列と抗原であるＴＭ４ＳＦ４のエピトープ配列に基づき、ドッキングシミュレーションを介してこれらの相互作用を分析した結果であって、エピトープと相互作用する抗体の主なアミノ酸残基と結合自由エネルギーの値を表示した。表示した抗体原子の中で、ピンク色は炭素、青色は窒素、赤色は酸素を示す。エピトープの炭素原子は緑色で表示した。 本発明のヒト化抗体であるＨｚ２Ｂ７抗体を製造する過程で元来のマウス抗体（２Ｂ７）及びこれと類似のヒト抗体（ｈｕｍａｎ－３ＱＲＧ）重鎖（Ａ）軽鎖（Ｂ）アミノ酸配列と、新しく製造したヒト化抗体Ｈｚ２Ｂ７重鎖４種、軽鎖３種のアミノ酸配列を互いに比較した図である。ハイフン（－）は、元来のマウス抗体アミノ酸と同一であることを意味し、ボックスで表示したのは、本発明でエピトープと結合に重要に発掘したアミノ酸の位置である。 Ａは、本発明のヒト化抗体のうち、Ｈｚ２Ｂ７－２．０と称される重鎖可変領域（Ｈｚ２Ｂ７ ＨＣ Ｖ４６Ａ）、Ｈｚ２Ｂ７－３．０と称される重鎖可変領域（Ｈｚ２Ｂ７ ＨＣ Ｗ５５Ｙ）、Ｈｚ２Ｂ７－４．０と称される重鎖可変領域（Ｈｚ２Ｂ７ ＨＣ Ｗ５５Ｓ）遺伝子を含むＤＮＡのアガロースゲル電気泳動の結果を示した図であり、Ｂは、Ｈｚ２Ｂ７－０．２と称される軽鎖可変領域（Ｈｚ２Ｂ７ ＬＣ Ｎ３１Ｖ）、Ｈｚ２Ｂ７－０．３と称される軽鎖可変領域（Ｈｚ２Ｂ７ ＬＣ Ｎ３１Ｆ）遺伝子を含むＤＮＡのアガロースゲル電気泳動の結果を示した図である。 比較例として用いられたキメラ抗体の重鎖及び軽鎖遺伝子のアガロースゲル電気泳動の結果（Ａ）、前記重鎖遺伝子が含まれたベクターの電気泳動の結果（Ｂ）、前記軽鎖遺伝子が含まれたベクターの電気泳動の結果（Ｃ）を示した図である。 前記キメラ抗体の遺伝子を含むベクターの構造を示した図である。 Ａは、本発明のヒト化抗体とキメラ抗体、マウス由来の２Ｂ７抗体、そして、ヒト抗体であるＩｇＧを対象としてＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びクマシブルー染色を行った結果を示した図である。Ｂは、前記抗体を対象としてウェスタンブロッティングを行った結果を示した図であって、２次抗体は、ヒト抗体のＩｇＧガンマ鎖とカッパ鎖に結合するものを用いた。 本発明の１０種のヒト化抗体、キメラ抗体（Ｃｈｉ２Ｂ７）、そして、ヒトＩｇＧ（Ｉｓｏｔｙｐｅ ｈＩｇＧ）を用いて、間接ＥＬＩＳＡ（Ｉｎｄｉｒｅｃｔ ＥＬＩＳＡ）を行った結果を示した図であって、Ａは、ＴＭ４ＳＦ４－ＢＳＡ抗原に対する全ての抗体の結合親和度を、Ｂは、ヒト化抗体の中でもより高い結合親和度を示すＨｚ２Ｂ７－１．１、Ｈｚ２Ｂ７－１．２、Ｈｚ２Ｂ７－１．３の結合親和度を、Ｃは、ＢＳＡに対する全ての抗体の結合親和度を示すグラフである。 表面プラズモン共鳴（Ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌａｓｍｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ、ＳＰＲ）分析を用いて抗－ＴＭ４ＳＦ４ヒト化抗体５種のＴＭ４ＳＦ４タンパク質エピトープに対する抗体親和度を比較分析したものであって、先ずビオチン結合されたＴＭ４ＳＦ４ペプチドをセンサチップに付着し、５種のヒト化抗体を流しながら、抗体の結合率（Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｒａｔｅ、Ｋａ）と解離率（Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｒａｔｅ、Ｋｄ）及び平衡解離定数（ＫＤ、Ｋｄ／Ｋａ）の値を算出したものを示した図である。 本発明のヒト化抗体（Ｈｚ２Ｂ７－１．１、Ｈｚ２Ｂ７－１．２、Ｈｚ２Ｂ７－１．３）、キメラ抗体（Ｃｈｉ２Ｂ７）、そして、ヒトＩｇＧを用いて肺癌、ヒト初代肝細胞、肝癌細胞株を対象としてフローサイトメーターを用いてＦＡＣＳ分析を行った結果を示す図である。Ａは、肺癌細胞株であるＡ５４９細胞とＣａｌｕ－３細胞株での抗体の結合能を比較したグラフであり、Ｂは、Ｈｚ２Ｂ７－１．１とＨｚ２Ｂ７－１．２抗体の結合能をヒト初代肝細胞（ｈＰＨ）、肝癌細胞株であるＨｕｈ－７、ＳＮＵ－３８７、ＳＮＵ－４４９細胞株で確認したグラフである。 ＣＨＯ－ＤＧ４４細胞に本発明のヒト化抗体を暗号化する遺伝子を導入させて形質転換させた後、Ｇ４１８抵抗性を有するクローンを選別し、ＥＬＩＳＡを介して各クローンの抗体生産量をＯＤ値を測定して比較した図である。陽性対照群としては、１μｇのヒトＩｇＧを用いた。 ＭＴＸを介して抗体遺伝子を増幅させたＨｚ２Ｂ７－１．１－４Ｈ１２クローン及びＨｚ２Ｂ７－１．２－４Ａ１２クローンを対象としてサンドイッチＥＬＩＳＡ（ｓａｎｄｗｉｃｈ ＥＬＩＳＡ）を介して抗体生産量を比較したものであって、Ａは、Ｈｚ２Ｂ７－１．１－４Ｈ１２クローンのうちＭＴＸを処理していないクローンと０．０８μＭのＭＴＸを処理したクローンの抗体生産量を比較して示し、Ｂは、Ｈｚ２Ｂ７－１．２－４Ａ１２クローンの抗体生産量を比較して示した図である。 ０．０８μＭのＭＴＸを処理して抗体遺伝子を増幅させたＨｚ２Ｂ７－１．１－４Ｈ１２クローン及びＨｚ２Ｂ７－１．２－４Ａ１２クローンの抗体生産量（μｇ／１０^６ｃｅｌｌ／２４ｈｒ）をサンドイッチＥＬＩＳＡを介し測定して比較した図である。 ヒト血清内におけるマウス及びヒト化抗体の安定性を測定し比較したグラフである。

以下、本発明を詳細に説明する。

１．ＴＭ４ＳＦ４に特異的に結合するヒト化抗体及びこの抗原結合断片
本発明の一側面は、ＴＭ４ＳＦ４に特異的に結合して人体で低い免疫原性を示すヒト化抗体又はこの抗原結合断片を提供する。

本発明における用語『抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）』は、免疫学的に抗原のエピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ）と特異的に結合して反応性を有する免疫グロブリン分子を意味する。前記抗体は、単一クローン抗体、多クローン抗体、全体長さの鎖構造を有した抗体（全長抗体、ｆｕｌｌ－ｌｅｎｇｔｈ ａｎｔｉｂｏｄｙ）、少なくとも抗原結合機能を有する機能的な断片（抗原結合断片）及び組換え抗体をいずれも含むことができ、具体的に、本発
明の抗体は、単一クローン抗体又はこの抗原結合断片であってよい。前記単一クローン抗体は、実質的に同一の抗体集団から得た単一分子組成の抗体分子を称し、このような単一クローン抗体は、特定のエピトープに対して単一結合特異性及び親和度を示す。前記全長抗体は、２個の全長軽鎖及び２個の全長重鎖を有する構造であり、それぞれの軽鎖は重鎖とジスルフィド結合で連結されてよい。前記抗体は、重鎖（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ、ＨＣ）及び軽鎖（ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ、ＬＣ）ポリペプチドを含み、前記重鎖及び軽鎖は、可変領域及び不変領域を含むことができる。

前記不変領域は、免疫系の多様な種類の細胞（Ｔ－細胞など）、補体系の成分を含む宿主組織などに、前記抗体が結合できるように媒介する部位である。前記不変領域は、同じ種から由来する同じ種類の抗体であれば、抗原の種類と関わりなく同一の機能をし、これをなすアミノ酸配列も抗体ごとに同一であるか高い類似度を有する。前記不変領域は、重鎖不変領域（ＣＨと略称され得る）と軽鎖不変領域（ＣＬと略称され得る）に分類され得る。前記重鎖不変領域は、ガンマ（γ）、ミュー（μ）、アルファ（α）、デルタ（δ）及び／又はイプシロン（ε）タイプを有し、サブクラスとしてガンマ１（γ１）、ガンマ２（γ２）、ガンマ３（γ３）、ガンマ４（γ４）、アルファ１（α１）及び／又はアルファ２（α２）を有する。軽鎖不変領域は、カッパ（κ）及びラムダ（λ）タイプを有する。ＩｇＧは、亜型（ｓｕｂｔｙｐｅ）として、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４を含む。

前記可変領域は、抗原に対して特異性を有する抗体部位であって、重鎖可変領域（ＶＨと略称され得る）と軽鎖可変領域（ＶＬと略称され得る）に分類され得る。前記可変領域には、３個のＣＤＲ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ－ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎｓ、又は相補性決定領域）と４個のＦＲ（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎｓ）が含まれてよい。前記ＣＤＲは、抗原の認識に関与する環状の部位であってよく、前記ＣＤＲのアミノ酸配列によって抗原に対する特異性が決定され得る。前記ＣＤＲは、その順序により、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３と称されてよく、重鎖及び軽鎖のうちどのポリペプチドのＣＤＲであるのかにより、重鎖可変領域の場合、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３に、軽鎖可変領域の場合、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、ＣＤＲ－Ｌ３に称されてよい。ＦＲも同様に、重鎖可変領域の場合、ＦＲ－Ｈ１、ＦＲ－Ｈ２、ＦＲ－Ｈ３、ＦＲ－Ｈ４に、軽鎖可変領域の場合、ＦＲ－Ｌ１、ＦＲ－Ｌ２、ＦＲ－Ｌ３、ＦＲ－Ｌ４に称されてよい。また、前記ＣＤＲ及びＦＲは、それぞれの可変領域で次のような順に配列されてよい。順は、Ｎ－末端（アミノ－末端）からＣ－末端（カルボキシ－末端）の方向：重鎖可変領域の場合、ＦＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ１、ＦＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ２、ＦＲ－Ｈ３、ＣＤＲ－Ｈ３、ＦＲ－Ｈ４、軽鎖可変領域の場合、ＦＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ１、ＦＲ－Ｌ２、ＣＤＲ－Ｌ２、ＦＲ－Ｌ３、ＣＤＲ－Ｌ３、ＦＲ－Ｌ４。

本発明における用語『抗原結合断片』は、抗体の抗原結合機能を保有する、本発明のヒト化抗体の任意の断片を意味する。前記抗原結合断片は、『断片』、『抗体断片』などの用語と互換して称されてよく、前記抗原結合断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖなどであってよいが、これに制限されるものではない。

前記Ｆａｂは、軽鎖及び重鎖の可変領域と軽鎖の不変領域及び重鎖の１番目の不変領域（ＣＨ１ドメイン）を有する構造で、１個の抗原結合部位を有する。前記Ｆａｂ’は、重鎖ＣＨ１ドメインのＣ末端に１つ以上のシステイン残基を含むヒンジ領域（ｈｉｎｇｅ ｒｅｇｉｏｎ）を有するという点で前記Ｆａｂと差がある。前記Ｆ（ａｂ’）_２は、Ｆａｂ’のヒンジ領域のシステイン残基がジスルフィド結合をなすことで生成される。前記Ｆｖは、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のみを有している最小の抗体片を意味する。二重鎖Ｆｖ（ｔｗｏ－ｃｈａｉｎ Ｆｖ）は、非共有結合で重鎖可変領域と軽鎖可変領域が連結されており、単鎖Ｆｖ（ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ Ｆｖ）は、一般にペプチドリンカー
を介して重鎖可変領域と軽鎖可変領域が共有結合で連結されるか、又はＣ－末端で直ぐ連結されているので、二重鎖Ｆｖのようにダイマーのような構造をなすことができる。前記抗原結合断片は、タンパク質加水分解酵素を用いるか（例えば、全体抗体をパパインで制限切断すればＦａｂを得ることができ、ペプシンで切断すればＦ（ａｂ’）_２断片を得ることができる）、又は遺伝子組換え技術を介して製作することができるが、これに制限されるものではない。

本発明における用語『ヒト化抗体（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ）』は、ヒトに減少した免疫原性（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）を示したり、非免疫原性（ｎｏｎ－ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｃｉｔｙ）である抗体を意味する。前記ヒト化抗体は、例えば、ヒト以外の個体（非ヒト種）から由来するＣＤＲ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎｓ）を、ヒト抗体由来の不変領域、ヒト抗体由来の可変領域のうちＦＲ（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎｓ）と結合して製造されるものであってよい。前記ヒト化抗体は、ＣＤＲ－移植（ＣＤＲ－ｇｒａｆｔｉｎｇ）方法を介して非ヒト種抗体のＣＤＲがヒト抗体のＦＲ配列間に移植されて製造されてよい。

本発明における用語『ＦＲ（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎｓ）』は、免疫グロブリン分子の可変領域のうち相補性決定領域以外の部分を称する。フレームワーク領域には、軽鎖、重鎖それぞれ４個のフレームワーク領域（フレームワーク領域１、フレームワーク領域２、フレームワーク領域３及びフレームワーク領域４）がある。

本発明における用語『ヒト抗体』は、軽鎖、重鎖のいずれもヒト由来の抗体を称する。ヒト抗体は、重鎖の不変領域の差によって、γ鎖の重鎖を有するＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４を含む）、μ鎖の重鎖を有するＩｇＭ、α鎖の重鎖を有するＩｇＡ（ＩｇＡ１、ＩｇＡ２を含む）、δ鎖の重鎖を有するＩｇＤ、又はε鎖の重鎖を有するＩｇＥを含む。また、原則的に軽鎖は、κ鎖及びλ鎖のうち１つ以上を含む。

本発明における用語『キメラ抗体（ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ）』は、抗体の可変領域がヒト以外の個体（非ヒト種）から由来し、不変領域が前記個体と異なる種、例えば、ヒトから由来する抗体を意味する。

前記ヒト化抗体及びキメラ抗体についてより詳細に説明する。マウス由来の抗体とヒト抗体を対象として比較するとき、マウス抗体－キメラ抗体－ヒト化抗体－ヒト抗体の順にヒト抗体と配列上の類似性を有するようになる。よって、ヒト化抗体は、マウス抗体やキメラ抗体と比較するとき、ヒト抗体との類似性がさらに高いため、人体に投与されたときに免疫原性が低いという特徴がある。

本発明における用語『エピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ）』は、免疫グロブリン、抗体又はこの抗原結合断片が特異的に認識して結合することができる抗原上の特定部位を意味する。前記エピトープは、連続アミノ酸から、又はタンパク質の３次折り畳みにより併置された不連続アミノ酸から形成されてよい。

本発明のヒト化抗体又はこの抗原結合断片は、配列番号１のアミノ酸配列を有するＦＲ－Ｈ１、配列番号２又は配列番号３のアミノ酸配列を有するＦＲ－Ｈ２、配列番号４のアミノ酸配列を有するＦＲ－Ｈ３、配列番号５のアミノ酸配列を有するＦＲ－Ｈ４を含む重鎖可変領域を含み、配列番号６のアミノ酸配列を有するＦＲ－Ｌ１、配列番号７のアミノ酸配列を有するＦＲ－Ｌ２、配列番号８のアミノ酸配列を有するＦＲ－Ｌ３、配列番号９のアミノ酸配列を有するＦＲ－Ｌ４を含む軽鎖可変領域を含み、ＴＭ４ＳＦ４（ＴｒａｎｓＭｅｍｂｒａｎｅ ４ Ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ Ｍｅｍｂｅｒ ４）に特異的に結合する。

前記配列番号１のアミノ酸配列を有するＦＲ－Ｈ１は、本発明において「Ｈｚ２Ｂ７－１．０」、「Ｈｚ２Ｂ７－２．０」、「Ｈｚ２Ｂ７－３．０」、「Ｈｚ２Ｂ７－４．０」と称される重鎖可変領域のＦＲ１配列であってよい。前記配列番号２のアミノ酸配列を有するＦＲ－Ｈ２は、本発明において「Ｈｚ２Ｂ７－１．０」、「Ｈｚ２Ｂ７－３．０」、「Ｈｚ２Ｂ７－４．０」と称される重鎖可変領域のＦＲ２配列であってよく、前記配列番号３のアミノ酸配列を有するＦＲ－Ｈ２は、本発明において「Ｈｚ２Ｂ７－２．０」と称される重鎖可変領域のＦＲ２配列であってよい。前記配列番号４のアミノ酸配列を有するＦＲ－Ｈ３は、本発明において「Ｈｚ２Ｂ７－１．０」、「Ｈｚ２Ｂ７－２．０」、「Ｈｚ２Ｂ７－３．０」、「Ｈｚ２Ｂ７－４．０」と称される重鎖可変領域のＦＲ３配列であってよい。前記配列番号５のアミノ酸配列を有するＦＲ－Ｈ４は、本発明において「Ｈｚ２Ｂ７－１．０」、「Ｈｚ２Ｂ７－２．０」、「Ｈｚ２Ｂ７－３．０」、「Ｈｚ２Ｂ７－４．０」と称される重鎖可変領域のＦＲ４配列であってよい。

前記配列番号６のアミノ酸配列を有するＦＲ－Ｌ１は、本発明において「Ｈｚ２Ｂ７－０．１」、「Ｈｚ２Ｂ７－０．２」、「Ｈｚ２Ｂ７－０．３」と称される軽鎖可変領域のＦＲ１配列であってよい。前記配列番号７のアミノ酸配列を有するＦＲ－Ｌ２は、本発明において「Ｈｚ２Ｂ７－０．１」、「Ｈｚ２Ｂ７－０．２」、「Ｈｚ２Ｂ７－０．３」と称される軽鎖可変領域のＦＲ２配列であってよい。前記配列番号８のアミノ酸配列を有するＦＲ－Ｌ３は、本発明において「Ｈｚ２Ｂ７－０．１」、「Ｈｚ２Ｂ７－０．２」、「Ｈｚ２Ｂ７－０．３」と称される軽鎖可変領域のＦＲ３配列であってよい。前記配列番号９のアミノ酸配列を有するＦＲ－Ｌ４は、本発明において「Ｈｚ２Ｂ７－０．１」、「Ｈｚ２Ｂ７－０．２」、「Ｈｚ２Ｂ７－０．３」と称される軽鎖可変領域のＦＲ４配列であってよい。

前記ＴＭ４ＳＦ４は、テトラスパニン（ｔｅｔｒａｓｐａｎｉｎ）タンパク質の一種であって、癌細胞において細胞の死滅と分化、そして細胞の浸透能力に関与するものと知られているタンパク質である。また、前記ＴＭ４ＳＦ４は、癌幹細胞の生長、転移などを促進するものと知られており、癌幹細胞の特性を強化させて腫瘍をさらに悪性化させることがある。前記ＴＭ４ＳＦ４タンパク質は、細胞の膜に存在する膜タンパク質であってよく、ＴＭ４ＳＦ４の一部が細胞外部に露出されていてよい。前記露出部位は、２個のループ構造を含むことができ、前記ＴＭ４ＳＦ４の細胞外露出部位のうち一部のアミノ酸配列が、本発明のヒト化抗体又はこの抗原結合断片が特異的に認識して結合することができるエピトープとなり得る。前記ＴＭ４ＳＦ４のエピトープは、例えば、「ＴＷＧＹＰＦＨＤＧＤＹＬＮＤＥ」（Ｎ－末端からＣ－末端の方向の順）のアミノ酸配列を含むものであってよい。

前記重鎖可変領域は、配列番号１０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ－Ｈ１、配列番号７７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ－Ｈ２及び配列番号１４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ－Ｈ３よりなる群から選択される少なくとも１つのＣＤＲをさらに含むものであってよい。特に、前記ＣＤＲ－Ｈ２は、配列番号７８のアミノ酸配列を有するものであってよく、具体的に、配列番号１１、配列番号１２及び配列番号１３よりなる群から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列を有するものであってよい。

前記軽鎖可変領域は、配列番号７９のアミノ酸配列を有するＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ－Ｌ２及び配列番号８０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ－Ｌ３よりなる群から選択される少なくとも１つのＣＤＲをさらに含むものであってよい。特に、前記ＣＤＲ－Ｌ１は、配列番号１５、配列番号１６及び配列番号１７よりなる群から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列を有するものであってよく、前記ＣＤＲ－Ｌ３は、配列番号１９のアミノ酸配列を有するものであってよい。

前記配列番号１０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ－Ｈ１は、本発明において「Ｈｚ２Ｂ７－１．０」、「Ｈｚ２Ｂ７－２．０」、「Ｈｚ２Ｂ７－３．０」、「Ｈｚ２Ｂ７－４．０」と称される重鎖可変領域のＣＤＲ１配列であってよい。前記配列番号１１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ－Ｈ２は、本発明において「Ｈｚ２Ｂ７－１．０」、「Ｈｚ２Ｂ７－２．０」と称される重鎖可変領域のＣＤＲ２配列であってよく、前記配列番号１２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ－Ｈ２は、本発明において「Ｈｚ２Ｂ７－３．０」と称される重鎖可変領域のＣＤＲ２配列であってよく、前記配列番号１３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ－Ｈ２は、本発明において「Ｈｚ２Ｂ７－４．０」と称される重鎖可変領域のＣＤＲ２配列であってよい。前記配列番号１４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ－Ｈ３は、本発明において「Ｈｚ２Ｂ７－１．０」、「Ｈｚ２Ｂ７－２．０」、「Ｈｚ２Ｂ７－３．０」、「Ｈｚ２Ｂ７－４．０」と称される重鎖可変領域のＣＤＲ３配列であってよい。

前記配列番号１５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ－Ｌ１は、本発明において「Ｈｚ２Ｂ７－０．１」と称される軽鎖可変領域のＣＤＲ１配列であってよく、前記配列番号１６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ－Ｌ１は、本発明において「Ｈｚ２Ｂ７－０．２」と称される軽鎖可変領域のＣＤＲ１配列であってよく、前記配列番号１７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ－Ｌ１は、本発明において「Ｈｚ２Ｂ７－０．３」と称される軽鎖可変領域のＣＤＲ１配列であってよい。前記配列番号１８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ－Ｌ２は、本発明において「Ｈｚ２Ｂ７－１．０」、「Ｈｚ２Ｂ７－２．０」、「Ｈｚ２Ｂ７－０．３」と称される軽鎖可変領域のＣＤＲ２配列であってよい。前記配列番号１９のアミノ酸配列を有するＣＤＲ－Ｌ３は、本発明において「Ｈｚ２Ｂ７－１．０」、「Ｈｚ２Ｂ７－２．０」、「Ｈｚ２Ｂ７－０．３」と称される軽鎖可変領域のＣＤＲ３配列であってよい。

前記重鎖可変領域は、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２及び配列番号２３よりなる群から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列を有するものであってよい。

前記軽鎖可変領域は、配列番号２４、配列番号２５及び配列番号２６よりなる群から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列を有するものであってよい。

前記配列番号２０のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域は、本発明において「Ｈｚ２Ｂ７－１．０」と称される重鎖可変領域の配列であってよく、前記配列番号２１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域は、本発明において「Ｈｚ２Ｂ７－２．０」と称される重鎖可変領域の配列であってよく、前記配列番号２２のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域は、本発明において「Ｈｚ２Ｂ７－３．０」と称される重鎖可変領域の配列であってよく、前記配列番号２３のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域は、本発明において「Ｈｚ２Ｂ７－４．０」と称される重鎖可変領域の配列であってよい。

前記配列番号２４のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域は、本発明において「Ｈｚ２Ｂ７－０．１」と称される軽鎖可変領域の配列であってよく、前記配列番号２５のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域は、本発明において「Ｈｚ２Ｂ７－０．２」と称される軽鎖可変領域の配列であってよく、前記配列番号２６のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域は、本発明において「Ｈｚ２Ｂ７－０．３」と称される軽鎖可変領域の配列であってよい。

本発明のヒト化抗体又はこの抗原結合断片は、ヒトから由来する抗体の重鎖不変領域及び／又は軽鎖不変領域を含むことができ、前記ヒト化抗体又はこの抗原結合断片がＴＭ４ＳＦ４に対して特異的に結合する特性を阻害しないものであれば、前記ヒトから由来する抗体の重鎖不変領域及び／又は軽鎖不変領域は制限なく用いられてよい。例えば、前記重鎖不変領域は、配列番号２７のアミノ酸配列を有する重鎖不変領域であってよく、前記軽鎖不変領域は、配列番号２８のアミノ酸配列を有する軽鎖不変領域であってよい。

前記で説明したアミノ酸配列は、これを含むポリペプチドの構造、機能、活性などに影響を及ぼさない範囲内で、アミノ酸残基の欠失、挿入、置換又はこれらの組み合わせにより異なる配列を有する変異体を含むことができる。また、前記アミノ酸配列は、当業界に知られている通常の変形が起こったアミノ酸を含むものであってよく、前記アミノ酸の変形は、例えば、リン酸化（ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ）、硫化（ｓｕｌｆａｔｉｏｎ）、アクリル化（ａｃｒｙｌａｔｉｏｎ）、糖化（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）、メチル化（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）、ファルネシル化（ｆａｒｎｅｓｙｌａｔｉｏｎ）などであってよい。本発明のヒト化抗体又はこの抗原結合断片は、前記で説明したアミノ酸配列を含むものだけでなく、これと実質的に同一のアミノ酸配列を有するものであるか、その変異体を含む。前記実質的に同一のアミノ酸配列を有することの意味は、前記で説明したアミノ酸配列と９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、又は９９．５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むものであってよいが、これに制限されるものではない。

本発明のヒト化抗体又はこの抗原結合断片は、平衡解離定数（ＫＤ）が３．０×１０^－８Ｍ以下であってよく、例えば、２．９×１０^－８Ｍ以下、２．８×１０^－８Ｍ以下、２．７×１０^－８Ｍ以下、２．６×１０^－８Ｍ以下又は２．５×１０^－８Ｍ以下であってよく、具体的に、２．４×１０^－８Ｍ以下であってよい。

本発明の具体的な実施例によると、本発明のヒト化抗体を用いた間接ＥＬＩＳＡを介してＴＭ４ＳＦ４に対する結合能を測定して比較した結果、本発明のヒト化抗体は、キメラ抗体（マウス由来のＥＣＬ－２Ｂ７抗体の可変領域とヒト抗体の不変領域を組み合わせた抗体）と比較するとき、顕著に高い結合力を示すことを確認することができた（図１０のＡ、Ｂ）。特に、軽鎖可変領域と重鎖可変領域の多様な組み合わせのヒト化抗体の中でも、Ｈｚ２Ｂ７－１．２と称されるヒト化抗体の結合能が最も優れたものと示された（図１０、図１１）。また、本発明のヒト化抗体は、ＢＳＡを対象として行った前記間接ＥＬＩＳＡ実験では結合力が表れていないので、ＴＭ４ＳＦ４に対してのみ特異的に結合する抗体であるとのことも確認することができた（図１０）。

本発明の他の具体的な実施例によると、本発明のヒト化抗体を用いたＦＡＣＳ実験の結果、本発明のヒト化抗体は、ＴＭ４ＳＦ４を細胞表面に過剰発現する肺癌細胞株であるＣａｌｕ－３及びＡ５４９細胞に対して優れた結合能があることを確認することができた（図１２）。前記キメラ抗体を用いたＦＡＣＳ実験の結果と比較するときにも、本発明のヒト化抗体を用いる場合、肺癌細胞との結合力がより高く測定され、前記間接ＥＬＩＳＡ実験と同様にＨｚ２Ｂ７－１．２と称されるヒト化抗体の効果が最も優れていることを確認することができた（図１０から図１２）。

２．ＴＭ４ＳＦ４特異的ヒト化抗体を発現するための技術
本発明のまた他の側面は、前記ヒト化抗体又はこの抗原結合断片を発現して製造するために用いられ得る、ポリヌクレオチド、発現ベクター、宿主細胞及び生産方法を提供する。

前記ヒト化抗体、この抗原結合断片、ＴＭ４ＳＦ４などに関する説明は、「１．ＴＭ４ＳＦ４に特異的に結合するヒト化抗体及びこの抗原結合断片」でこれらについて説明したものと同一なので、繰り返し説明を避けるために記載を省略し、以下では、ポリヌクレオチド、発現ベクター及び宿主細胞に係わる内容に対してのみ説明する。

本発明における用語『ポリヌクレオチド』は、ＤＮＡ及びＲＮＡ分子を包括的に含むものであって、前記ポリヌクレオチドの基本構成単位であるヌクレオチドは、自然界に存在
するヌクレオチドだけでなく、糖又は塩基部位が変形された類似体（ａｎａｌｏｇｕｅ）も含まれてよい。

本発明のポリヌクレオチドは、ヒト化抗体又はこの抗原結合断片を暗号化する塩基配列を含む。

前記ヒト化抗体又はこの抗原結合断片を暗号化するとのことは、前記ポリヌクレオチドが転写、翻訳などの通常のタンパク質発現の過程を経て、本発明のヒト化抗体又はこの抗原結合断片のアミノ酸配列を有するタンパク質が合成できる遺伝情報が暗号化されているということを意味する。このとき、前記ヒト化抗体又はこの抗原結合断片と完全に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質だけでなく、前記で説明したように、前記タンパク質と実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質や、前記タンパク質と同一及び／又は類似の活性を有するタンパク質を暗号化するポリヌクレオチドまで本発明の範囲に含まれてよい。

前記ポリヌクレオチドは、これを導入させて発現させようとする生物の種類と前記生物の転写、翻訳などの発現システムによって、最適化された塩基配列を含むことができる。

具体的に、前記ポリヌクレオチドは、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５及び配列番号５６よりなる群から選択される少なくとも１つの塩基配列を含むものであってよい。

前記配列番号２９の塩基配列は、前記配列番号１のアミノ酸配列を暗号化するものであってよく、前記配列番号３０の塩基配列は、前記配列番号２のアミノ酸配列を暗号化するものであってよく、前記配列番号３１の塩基配列は、前記配列番号３のアミノ酸配列を暗号化するものであってよく、前記配列番号３２の塩基配列は、前記配列番号４のアミノ酸配列を暗号化するものであってよく、前記配列番号３３の塩基配列は、前記配列番号５のアミノ酸配列を暗号化するものであってよく、前記配列番号３４の塩基配列は、前記配列番号６のアミノ酸配列を暗号化するものであってよく、前記配列番号３５の塩基配列は、前記配列番号７のアミノ酸配列を暗号化するものであってよく、前記配列番号３６の塩基配列は、前記配列番号８のアミノ酸配列を暗号化するものであってよく、前記配列番号３７の塩基配列は、前記配列番号９のアミノ酸配列を暗号化するものであってよく、前記配列番号３８の塩基配列は、前記配列番号１０のアミノ酸配列を暗号化するものであってよく、前記配列番号３９の塩基配列は、前記配列番号１１のアミノ酸配列を暗号化するものであってよく、前記配列番号４０の塩基配列は、前記配列番号１２のアミノ酸配列を暗号化するものであってよく、前記配列番号４１の塩基配列は、前記配列番号１３のアミノ酸配列を暗号化するものであってよく、前記配列番号４２の塩基配列は、前記配列番号１４のアミノ酸配列を暗号化するものであってよく、前記配列番号４３の塩基配列は、前記配列番号１５のアミノ酸配列を暗号化するものであってよく、前記配列番号４４の塩基配列は、前記配列番号１６のアミノ酸配列を暗号化するものであってよく、前記配列番号４５の塩基配列は、前記配列番号１７のアミノ酸配列を暗号化するものであってよく、前記配列番号４６の塩基配列は、前記配列番号１８のアミノ酸配列を暗号化するものであってよく、前記配列番号４７の塩基配列は、前記配列番号１９のアミノ酸配列を暗号化するものであってよく、前記配列番号４８の塩基配列は、前記配列番号２０のアミノ酸配列を暗号化するものであってよく、前記配列番号４９の塩基配列は、前記配列番号２１のアミノ酸配列を暗号化するものであってよく、前記配列番号５０の塩基配列は、前記配列番号２２
のアミノ酸配列を暗号化するものであってよく、前記配列番号５１の塩基配列は、前記配列番号２３のアミノ酸配列を暗号化するものであってよく、前記配列番号５２の塩基配列は、前記配列番号２４のアミノ酸配列を暗号化するものであってよく、前記配列番号５３の塩基配列は、前記配列番号２５のアミノ酸配列を暗号化するものであってよく、前記配列番号５４の塩基配列は、前記配列番号２６のアミノ酸配列を暗号化するものであってよく、前記配列番号５５の塩基配列は、前記配列番号２７のアミノ酸配列を暗号化するものであってよく、前記配列番号５６の塩基配列は、前記配列番号２８のアミノ酸配列を暗号化するものであってよい。

本発明のポリヌクレオチドは、前記羅列された塩基配列と実質的に同一の塩基配列を含むことができる。前記実質的に同一の塩基配列とは、例えば、転写及び翻訳されたときに同一のアミノ酸が合成できる場合を含み、前記羅列された塩基配列と９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、又は９９．５％以上の相同性を有する塩基配列であってよいが、これに制限されるものではない。

本発明の発現ベクターは、前記ポリヌクレオチドを含む。

本発明における用語『発現ベクター』は、宿主細胞で特定の遺伝子を発現させるための手段を意味し、具体的に、プラスミドベクター；コスミドベクター；そしてバクテリオファージベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター及びアデノ随伴ウイルスベクターなどのウイルスベクターなどを含むが、これに制限されない。

前記発現ベクターは、前記ヒト化抗体又はこの抗原結合断片を暗号化する塩基配列の他にも、プロモーター、ターミネーターなどの調節配列をさらに含むことができ、前記ヒト化抗体又はこの抗原結合断片を暗号化する塩基配列がプロモーターに作動可能に連結されている（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）ものであってよい。前記作動可能に連結されていることは、調節配列（例えば、プロモーター、シグナル配列、転写調節因子結合位置のアレイなど）と他の塩基配列の間の機能的な結合を意味し、これにより前記調節配列は、前記他の塩基配列の転写及び／又は翻訳を調節することができる。

本発明の発現ベクターシステムは、当業界に公知の多様な方法を介して構築されてよい。

前記発現ベクターは、原核細胞又は真核細胞を宿主として構築されてよい。

例えば、前記発現ベクターが原核細胞を宿主とする場合は、転写を進めさせることができる強力なプロモーター（例えば、ｔａｃプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｌａｃＵＶ５プロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｐＬλプロモーター、ｐＲλプロモーター、ｒａｃ５プロモーター、ａｍｐプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ＳＰ６プロモーター、ｔｒｐプロモーター及びＴ７プロモーターなど）、翻訳開始のためのリボソーム結合サイト及び転写／翻訳終結配列を含むことが一般的である。宿主細胞としてＥ．ｃｏｌｉ（例えば、ＨＢ１０１、ＢＬ２１、ＤＨ５αなど）が用いられる場合、Ｅ ｃｏｌｉトリプトファン生合成経路のプロモーター及びオペレーター部位（Ｙａｎｏｆｓｋｙ，Ｃ，Ｊ
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、（１９８４）１５８：１０１８－１０２４）、そしてファージλの左向プロモーター（ｐＬλプロモーター、Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ，Ｉ ａｎｄ Ｈａｇｅ
ｎ，Ｄ，Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ，（１９８０）１４：３９９－４４５）が調節部位として用いられてよい。宿主細胞としてバチルス菌が用いられる場合、バチルスチューリンゲンシスの毒素タンパク質遺伝子のプロモーター（Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ（１９９８）６４：３９３２－３９３８；Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ（１
９９６）２５０：７３４－７４１）又はバチルス菌で発現可能な如何なるプロモーターであっても調節部位に用いられてよい。前記発現ベクターは、当業界でたびたび用いられるプラスミド（例えば、ｐＣＬ、ｐＳＣ１０１、ｐＧＶ１１０６、ｐＡＣＹＣ１７７、ＣｏｌＥ１、ｐＫＴ２３０、ｐＭＥ２９０、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ８／９、ｐＵＣ６、ｐＢＤ９、ｐＨＣ７９、ｐＩＪ６１、ｐＬＡＦＲ１、ｐＨＶ１４、ｐＧＥＸシリーズ、ｐＥＴシリーズ及びｐＵＣ１９など）、ファージ（例えば、λｇｔ４・λＢ、λ－Ｃｈａｒｏｎ、λΔｚ１及びＭ１３など）又はウイルス（例えば、ＳＶ４０など）を操作して製作されてよい。

前記発現ベクターが真核細胞を宿主とする場合は、哺乳動物細胞のゲノムから由来されたプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター、β－アクチンプロモーター、ヒトヘモグロビンプロモーター及びヒト筋肉クレアチンプロモーター）、又は哺乳動物ウイルスから由来されたプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７５Ｋプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＨＳＶのｔｋプロモーター、マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ＨＩＶのＬＴＲプロモーター、モロニーウイルスのプロモーター、エプスタインバールウイルス（ＥＢＶ）のプロモーター及びラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）のプロモーター）が用いられてよく、転写終結配列としてポリアデニル化配列を一般的に有することができる。前記発現ベクターは、ＣＭＶプロモーターを有するものであってよい。

また、前記発現ベクターは、これから発現される抗体の精製を容易にするために他の配列と融合されてよい。融合される配列には、例えば、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ＵＳＡ）、マルトース結合タンパク質（ＮＥＢ、ＵＳＡ）、ＦＬＡＧ（ＩＢＩ、ＵＳＡ）及び６ｘ Ｈｉｓ（ｈｅｘａｈｉｓｔｉｄｉｎｅ；Ｑｕｉａｇｅｎ、ＵＳＡ）などがある。また、本発明の発現ベクターにより発現されるタンパク質がヒト化抗体又はこの抗原結合断片なので、この特性を考慮するとき、精製のための更なる配列がなくとも、発現されたタンパク質をタンパク質Ａカラムなどを介して容易に精製することもできる。

前記発現ベクターは、選択標識として当業界で通常用いられる抗生剤耐性遺伝子を含み、例えば、アンピシリン、ゲンタマイシン、カベニシリン、クロラムフェニコール、ストレプトマイシン、カナマイシン、ゲネチシン、ネオマイシン及びテトラサイクリンに対する耐性遺伝子を含むことができる。

前記発現ベクターは、軽鎖と重鎖が１つのベクターで同時に発現されるベクターシステムであるか、軽鎖と重鎖をそれぞれ別途のベクターで発現させるシステムであってよい。後者の場合、２つのベクターは、例えば、同時形質転換(ｃｏ－ｔｒａｎｓｆｏｍａｔｉ
ｏｎ）又は標的形質転換（ｔａｒｇｅｔｅｄＴｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を介して宿主細胞に導入され得る。同時形質転換は、軽鎖及び重鎖をコーディングするそれぞれのベクターＤＮＡを同時に宿主細胞に導入した後、軽鎖と重鎖を全て発現する細胞を選別する方法である。標的形質転換は、軽鎖（又は重鎖）を含むベクターに形質転換された細胞を選別し、選別された細胞を重鎖（又は軽鎖）を含むベクターに再び形質転換して軽鎖及び重鎖の全部を発現する細胞を最終的に選別する方法である。

本発明の宿主細胞は、前記発現ベクターを含む。

前記宿主細胞は、本発明の前記発現ベクターを安定的かつ連続的にクローニング及び発現させることができる宿主細胞であれば、当業界に公知の如何なる宿主細胞も用いることができ、例えば、エシェリキアコリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、バチルスサブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）及びバチルスチューリンゲンシス（
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）のようなバチルス属菌株、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、例えば、シュードモナスプチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）、プロテウスミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）、又はスタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、例えば、スタフィロコッカスカルノーサス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｒｎｏｓｕｓ）のような原核宿主細胞であってよいが、これに制限されるものではない。

前記宿主細胞が真核宿主細胞である場合、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ
ｓｐｅｃｉｅｓ）のような真菌、ピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、サッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミケス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）及びニューロスポラクラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）のような酵母、その他の下等真核細胞、昆虫－由来細胞のような高等真核生物の細胞、そして植物又は哺乳動物から由来した細胞を用いることができる。前記宿主細胞は、ＣＯＳ７細胞（ｍｏｎｋｅｙ ｋｉｄｎｅｙ ｃｅｌｌｓ）、ＮＳＯ細胞、ＳＰ２／０、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ：Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａｒｙ）細胞、Ｗ１３８、ベビーハムスターの腎臓（ＢＨＫ：ｂａｂｙ ｈａｍｓｔｅｒ ｋｉｄｎｅｙ）細胞、ＭＤＣＫ、骨髄腫細胞株、ＨｕＴ ７８細胞又は２９３細胞であってよいが、これに制限されない。

前記宿主細胞への形質転換及び／又は形質感染は、核酸を有機体、細胞、組織又は器官に導入する如何なる方法で用いられてもよく、当分野で公知の通り、宿主細胞に従って好適な標準技術を選択して行うことができる。具体的に、電気衝撃遺伝子伝達法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、原形質融合、リン酸カルシウム（ＣａＰＯ_４）沈澱、塩化カルシウム（ＣａＣｌ_２）沈澱、シリコンカーバイド繊維を用いた撹拌、アグロバクテリア媒介形質転換、ＰＥＧ、硫酸デキストラン、リポフェクタミン及び乾燥／抑制媒介形質転換方法などが含まれるが、これに制限されない。

本発明のヒト化抗体又はこの抗原結合断片を生産する方法は、前記宿主細胞を培養する段階を含む。

前記ヒト化抗体又はこの抗原結合断片を生産する方法は、前記宿主細胞で前記ヒト化抗体又はこの抗原結合断片を発現させる段階をさらに含むことができる。

前記宿主細胞の培養は、当業界に知られている適当な培地と培養条件によりなされ得る。このような培養の過程は、当業者であれば、選択される菌株に従って容易に調整して用いることができる。細胞培養は、細胞の成長方式により懸濁培養と付着培養、培養方法により回分式、流加式及び連続培養式の方法に区分される。培養に用いられる培地は、特定の菌株の要求条件を適切に満たさなければならない。

動物細胞培養において、前記培地は、多様な炭素源、窒素源及び微量元素成分を含む。使用可能な炭素源の例には、ブドウ糖、蔗糖、乳糖、果糖、マルトース、澱粉及びセルロースのような炭水化物、大豆油、ひまわり油、ひまし油、ココナッツ油のような脂肪、パルミチン酸、ステアリン酸及びリノール酸のような脂肪酸、グリセロール及びエタノールのようなアルコール、そして酢酸のような有機酸があり、これらの炭素源は単独で又は組み合わせて用いられてよい。

前記窒素源は、例えば、ペプトン、酵母抽出物、肉汁、麦芽抽出物、トウモロコシ浸漬液（ＣＳＬ）及び大豆粕のような有機窒素源、並びにヨウ素、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム及び硝酸アンモニウムのような無機
窒素源を含んでよく、これらの窒素源は単独で又は組み合わせて用いられてよい。

前記培地には、リン源として、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム及び対応されるナトリウム含有塩が含まれてよい。また、硫酸マグネシウム又は硫酸鉄のような金属塩を含むことができる。その他、アミノ酸、ビタミン、及び適切な前駆体などが含まれてよい。

前記培養する段階で、培養中に、水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、アムモニア、リン酸及び硫酸のような化合物を培養物に適切な方式で添加することで培養物のｐＨを調整することができる。また、培養中には、脂肪酸ポリグリコールエステルのような消泡剤を用いて気泡の生成を抑制することができる。また、培養物の好気状態を維持するために、培養物内に酸素又は酸素－含有気体（例えば、空気）を注入する。培養物の温度は、普通２０℃から４５℃、又は２５℃から４０℃であってよい。

前記生産方法は、前記宿主細胞で発現されたヒト化抗体又はこの抗原結合断片を回収する段階をさらに含むことができる。前記形質転換された宿主細胞を培養して得た前記ヒト化抗体又はこの抗原結合断片は、精製していない状態で用いられてよく、又は追加で多様な通常の方法、例えば、透析、塩沈澱及びクロマトグラフィーなどを用いて高純度に精製して用いられてよい。クロマトグラフィーを用いる場合、カラムの種類と順序は、抗体の特性、培養方法などにより、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィーなどから選択することができる。

３．本発明のヒト化抗体のＴＭ４ＳＦ４検出の用途
本発明のまた他の側面は、前記ヒト化抗体又はこの抗原結合断片のＴＭ４ＳＦ４検出の用途を提供する。具体的に、本発明では、ＴＭ４ＳＦ４検出用組成物、ＴＭ４ＳＦ４検出用キット及びＴＭ４ＳＦ４を検出する方法を提供する。

前記ヒト化抗体、この抗原結合断片、ＴＭ４ＳＦ４などに関する説明は、「１．ＴＭ４ＳＦ４に特異的に結合するヒト化抗体及びこの抗原結合断片」でこれらについて説明したものと同一なので、繰り返し説明を避けるために記載を省略する。

本発明のＴＭ４ＳＦ４検出用組成物は、前記ヒト化抗体又はこの抗原結合断片を含み、本発明のＴＭ４ＳＦ４検出用キットは、前記ＴＭ４ＳＦ４検出用組成物を含む。

また、本発明のＴＭ４ＳＦ４を検出する方法は、前記ヒト化抗体又はこの抗原結合断片を、ＴＭ４ＳＦ４が含まれているものと予想される検出対象試料と接触させる段階を含む。

前記ＴＭ４ＳＦ４検出用組成物、これを含むキットは、ＴＭ４ＳＦ４に特異的に結合する本発明のヒト化抗体又はこの抗原結合断片を検出対象試料に接触させて抗原－抗体複合体を形成することにより、効果的にＴＭ４ＳＦ４を検出することができる。

前記抗原－抗体複合体は、試料中のＴＭ４ＳＦ４を発現する腫瘍又は癌細胞を確認するための、ＴＭ４ＳＦ４とこれを認知する抗体の結合物を意味する。
ＴＭ４ＳＦ４検出用組成物、これを含むキット又は前記ヒト化抗体、この抗原結合断片を用いたＴＭ４ＳＦ４抗原の定量方法は、抗原－抗体複合体の形成を確認して行われてよく、前記抗原－抗体複合体の形成の確認は、酵素免疫分析法（ＥＬＩＳＡ）、ウエスタンブロッティング（Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ）、免疫蛍光（Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）、免疫組織化学染色（Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｓｔａｉｎｉｎｇ）、フローサイトメトリー（Ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）、免疫疫
細胞化学法（Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、放射免疫分析法（ＲＩＡ）、免疫沈澱分析法（Ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ）、免疫拡散分析法（Ｉｍｍｕｎｏｄｉｆｆｕｓｉｏｎ ａｓｓａｙ）、補体固定分析法（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｆｉｘａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ）、タンパク質チップ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｉｐ）などによりなされてよいが、これに制限されるものではない。前記酵素免疫分析法（ＥＬＩＳＡ）には、固体支持体に付着された抗原を認知する標識された抗体を用いる直接的ＥＬＩＳＡ、固体支持体に付着された抗原を認知する抗体の複合体で捕獲抗体を認知する標識された２次抗体を用いる間接的ＥＬＩＳＡ、固体支持体に付着された抗体と抗原の複合体で抗原を認知する標識されたまた他の抗体を用いる直接的サンドイッチＥＬＩＳＡ、固体支持体に付着された抗体と抗原の複合体で抗原を認知するまた他の抗体と反応させた後、この抗体を認知する標識された２次抗体を用いる間接的サンドイッチＥＬＩＳＡなどの多様なＥＬＩＳＡ方法を含む。

抗原－抗体複合体の形成を定性又は定量的に測定可能とする標識には、酵素、蛍光物、リガンド、発光物、ミクロ粒子（ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅ）、レドックス分子及び放射線同位元素などがあるが、これに制限されるものではない。前記酵素には、β－グルクロニダーゼ、β－Ｄ－グルコシダーゼ、β－Ｄ－ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アセチルコリンエステラーゼ、グルコースオキシダーゼ、ヘキソキナーゼとＧＤＰａｓｅ、ＲＮａｓｅ、グルコースオキシダーゼとルシフェラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、アスパルテートアミノトランスフェラーゼ、ホスホエノールピルビン酸デカルボキシラーゼ、β－ラクタマーゼなどがあるが、これに制限されない。

４．本発明のヒト化抗体の癌の予防又は治療用途、癌幹細胞の成長抑制用途及び放射線抗癌治療補助の用途
本発明のまた他の側面は、前記ヒト化抗体又はこの抗原結合断片を含む癌の予防又は治療用薬学的組成物、癌幹細胞の成長抑制用組成物及び放射線抗癌治療補助用組成物を提供する。

前記ヒト化抗体、この抗原結合断片、ＴＭ４ＳＦ４などに関する説明は、「１．ＴＭ４ＳＦ４に特異的に結合するヒト化抗体及びこの抗原結合断片」でこれらについて説明したものと同一なので、繰り返し説明を避けるために記載を省略する。

但し、本発明の前記ヒト化抗体又はこの抗原結合断片は、２Ｂ７抗体のＣＤＲ配列と同一であるか、その一部配列を変形させたＣＤＲ配列を含むことができるが、前記２Ｂ７抗体の特徴及び効果は、韓国特許出願第２０２０－０１６８４６７号を参考とすればよい。

本発明の癌の予防又は治療用薬学的組成物は、前記ヒト化抗体又はこの抗原結合断片を含む。

前記ヒト化抗体又はこの抗原結合断片は、ＴＭ４ＳＦ４に高い親和度で結合することができ、前記ＴＭ４ＳＦ４は、癌細胞の表面に過剰発現されて存在するものと知られているので、前記ヒト化抗体又はこの抗原結合断片は癌細胞を標的に用いられてよい。

前記組成物は、前記ヒト化抗体又はこの抗原結合断片が単独で用いられるか、又は通常の薬学的に許容される担体とともに、癌のような過増殖性疾患の治療、予防及び診断に用いられてよい。

前記癌は、具体的に、肺癌、胃癌、大腸癌、直腸癌、三重陰性乳癌、膠母細胞腫、すい臓癌、頭頸部癌、乳癌、卵巣癌、腎臓癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮内膜癌、唾液腺癌又は
甲状腺癌であり、より具体的には、肺癌、乳癌、肝癌、腎臓癌、胃癌、すい臓癌、脳癌であってよいが、これに制限されない。本発明における癌は、特にＴＭ４ＳＦ４の過剰発現、増幅、突然変異又は活性化による癌であってよいが、これに制限されない。すなわち、本発明のヒト化抗体又はこの結合断片を含む組成物は、ＴＭ４ＳＦ４の異常発現又は突然変異と関わりなく全ての癌腫に対して増殖抑制効果を有するので、本発明の医薬用途がＴＭ４ＳＦ４の発現様態又は突然変異の有無により制限されない。

前記組成物は、薬学的組成物、医薬外品組成物、健康食品用組成物の形態であってよい。

本発明の癌の予防又は治療用組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含むことができる。前記「薬学的に許容可能な」の意味は、有効成分の活性を抑制せずとも、適用（処方）対象が適応可能である以上の毒性を有しないということであり、前記「担体」は、細胞又は組織内への化合物の付加を容易にする化合物として定義される。

本発明の前記薬学的組成物は、単独で又はある便利な担体などと共に混合して投与されてよく、そのような投与の剤形は、単回投与又は反復投与の剤形であってよい。前記薬学組成物は、固形製剤又は液状製剤であってよい。固形製剤には、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、坐剤などがあるが、これに限定されるものではない。固形製剤には、担体、着香剤、結合剤、防腐剤、崩壊剤、滑剤、充填剤などが含まれてよいが、これに制限されるものではない。液状製剤としては、水、プロピレングリコール溶液のような溶液剤、懸濁液剤、乳剤などがあるが、これに限定されるものではなく、適当な着色剤、着香剤、安定化剤、粘性化剤などを添加して製造することができる。例えば、散剤は、本発明の有効成分である多重不飽和脂肪酸のトリ－ヒドロキシ誘導体と、乳糖、澱粉、微晶質セルロースなどの薬剤学的に許容可能な適当な担体とを単に混合することにより製造され得る。顆粒剤は、本発明の前記多重不飽和脂肪酸のトリ－ヒドロキシ誘導体、薬学的に許容可能な適当な担体、及びポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルセルロースなどの薬学的に許容可能な適当な結合剤を混合した後、水、エタノール、イソプロパノールなどの溶媒を用いた湿式顆粒法、又は圧縮力を用いた乾式顆粒法を用いて製造され得る。また、錠剤は、前記顆粒剤をマグネシウムステアレートなどの薬学的に許容可能な適当な滑剤と混合した後、打錠機を用いて打錠することにより製造され得る。

前記薬学的組成物は、治療すべき疾患及び個体の状態により、経口剤、注射剤（例えば、筋肉注射、腹腔注射、静脈注射、注入（ｉｎｆｕｓｉｏｎ）、皮下注射、インプラント）、吸入剤、鼻腔投与剤、膣剤、直腸投与剤、舌下剤、経皮剤、外用剤などで投与されてよいが、これに制限されるものではない。投与経路により、通常用いられて非毒性である、薬学的に許容可能な担体、添加剤、ビヒクルを含む適当な投与ユニットの剤形に製剤化されてよい。

前記薬学組成物は、毎日約０．０００１ｍｇ／ｋｇから約１０ｇ／ｋｇが投与されてよく、約０．００１ｍｇ／ｋｇから約１ｇ／ｋｇの１日投与用量で投与されてよい。しかし、前記投与量は、前記混合物の精製の程度、患者の状態（年齢、性別、体重など）、治療している状態の深刻性などにより多様であり得る。必要に応じて、便利性のために１日の総投与量が１日間数回に分けて投与されてよい。

本発明の癌幹細胞成長抑制用組成物は、前記ヒト化抗体又はこの抗原結合断片を含む。

前記癌幹細胞（ｃａｎｃｅｒ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ、ＣＳＣ）は、多様な癌細胞に分化することができる能力を有した未分化細胞を意味する。癌幹細胞は、悪性腫瘍組織内に１～２％程度で存在し、正常の幹細胞の特性である自己複製能力と多分化能を有しているが
、自己調節機能に異常があって細胞分裂活性化で細胞数が増加するようになり、自ら悪性腫瘍細胞に分化する。このような癌幹細胞の特徴により、抗癌治療を介して一般の癌細胞は除去されるが癌幹細胞は生き残り、生き残った一部の癌幹細胞により癌の再発及び転移がなされると知られている。

具体的に、本発明の癌幹細胞は、癌幹細胞のマーカー中の１つであるＡＬＤＨ１（ａｌｄｅｈｙｄｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ １）タンパク質が過剰発現されるか、タンパク質活性が陽性である癌細胞であってよい。

本発明の前記ヒト化抗体又はこの抗原結合断片は、癌幹細胞を選択的に抑制することができ、特に、抗癌治療抵抗性の高い癌幹細胞が含まれている癌細胞群を死滅させることにより、優れた抗癌効果を得ることができる。前記ヒト化抗体又はこの抗原結合断片は、癌幹細胞の自己再生能力、浸潤能力及び移住能力を減少させることにより、癌幹細胞の成長を抑制することができる。

前記抗体又はこの抗原結合断片は、癌幹細胞の特性を有する癌を予防又は治療するために用いることができるが、これに制限されるものではない。前記癌幹細胞の特性を有する癌は、既存の抗癌治療に対して抵抗性を示してその予後が良くないので、既存の抗癌治療とは異なる治療が適用されなければならない。例えば、同一の癌腫の患者であるとしても、その癌腫が癌幹細胞の比率が高い場合に該当するならば、この患者は抗癌剤投与又は放射線治療のような既存に知られている抗癌治療では、癌治療効果を得ることができなくなる。したがって、同一種類の癌であるとしても、癌病変部位の細胞で癌幹細胞の比率が高い場合には、既存の抗癌治療と異なる新たな治療法を適用するのが非常に重要である。

前記癌幹細胞特性を有する癌は、癌を構成する細胞群で癌幹細胞の比率が高い癌であってよい。一般的な癌細胞中の癌幹細胞の比率が約１％以上５％未満程度であることを考慮するとき、例えば、癌を構成する細胞群で癌幹細胞の比率が５％以上、１０％以上、３０％以上、５０％以上、７０％以上である場合を癌幹細胞特性を有する癌として定義することができ、前述した通り、既存の抗癌治療に対して抵抗性を示して抗癌治療の予後が良くないことを特徴とすることができる。具体的に、本発明における前記癌幹細胞特性を有する癌は、ＡＬＤＨ１を過剰発現する癌であってよい。前記ＡＬＤＨ１を過剰発現する癌は、ＡＬＤＨ１を発現するかその活性が陽性である癌幹細胞の比率が一般的な癌より相対的に高い癌であってよい。

具体的に、前記ＡＬＤＨ１を過剰発現する癌は、肺癌、乳癌、肝癌、腎臓癌、胃癌、すい臓癌及び脳癌より構成された群から選択される何れか１つ以上のものであってよいが、これに制限されない。

前記癌の予防又は治療は、癌幹細胞の再生能、成長能、浸潤能又は移動能を減少させることを介し、癌治療途中又は癌治療後の癌化学耐性、癌再発、又は癌転移を予防又は治療することであってよい。

本発明の放射線抗癌治療補助用組成物は、前記ヒト化抗体又はこの抗原結合断片を含む。

前記組成物は、前記ヒト化抗体又はこの抗原結合断片を、癌関連細胞の放射線敏感性を向上させるための有効成分として含む。

前記癌関連細胞は、癌を構成している細胞であって、正常の細胞に比べて形状が一定でなく、無制限に増殖し、周辺細胞との結束力が弱い特徴を有するものであってよい。具体
的に、前記癌関連細胞は、癌細胞又は癌幹細胞であってよく、具体的に癌幹細胞であってよい。

前記癌幹細胞は、多様な癌細胞に分化することができる能力を有した未分化細胞であってよく、具体的にＡＬＤＨ１を発現するか活性が陽性である癌細胞であってよい。本発明における前記癌幹細胞は、放射線の照射によっても細胞増殖が抑制されず、自己再生能力が低下せず、移動及び浸潤能力が抑制されないという特徴を有するものであってよい。

また、前記癌関連細胞は、放射線に対する敏感性が低いもの、すなわち放射線治療に対する抵抗性が高いものであってよく、実質的に放射線に対する敏感性がなくて放射線照射による抗癌治療が不可能なものであってよい。

前記抗癌は、放射線照射、外科的手術及び化学療法などを介して癌関連細胞の増殖の抑制、転移及び浸潤の抑制、細胞の死滅を誘導することであってよい。本発明における前記抗癌は、放射線照射と併用して前記ヒト化抗体又はこの抗原結合断片を投与することであってよい。このようにヒト化抗体又は抗原結合断片を放射線照射と併用して投与する場合、前記抗体又は抗原結合断片により癌関連細胞の放射線敏感性が向上され、放射線照射による抗癌治療効果を最大化することができ、さらには、癌の再発及び転移を防ぐことができる。

以下、本発明を実施例により詳細に説明する。

但し、下記実施例は、本発明を具体的に例示するものであり、本発明の内容が下記実施例によって限定されない。

［実施例及び比較例］

［実施例１］
ＴＭ４ＳＦ４に特異的に結合するヒト化抗体の設計及び発現ベクターの製造
ＴＭ４ＳＦ４タンパク質に対し高い親和度を有して特異的に結合することができるヒト化抗体を製造した。このために、ＴＭ４ＳＦ４と特異的な結合を形成するための抗体部位のうち可変領域のＣＤＲ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎｓ）のアミノ酸配列を、ヒト抗体の不変領域のアミノ酸配列と可変領域のＦＲ（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎｓ）のアミノ酸配列を用いて、ＴＭ４ＳＦ４に対する特異的結合性を有しながらも、人体に投与されたときに低い免疫原性（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）を示し得る新規のヒト化抗体を製造した。

具体的に、本発明のヒト化抗体のＣＤＲ配列は、ＴＭ４ＳＦ４に特異的に結合可能なマウス由来抗体のＣＤＲ配列に次の配列を用いた。重鎖可変領域のＣＤＲ－Ｈ１（配列番号１０）、ＣＤＲ－Ｈ２（配列番号１１）、ＣＤＲ－Ｈ３（配列番号１４）、そして軽鎖可変領域のＣＤＲ－Ｌ１（配列番号１５）、ＣＤＲ－Ｌ２（配列番号１８）、ＣＤＲ－Ｌ３（配列番号１９）を用いた。また、ＦＲ配列には、重鎖可変領域のＦＲ－Ｈ１（配列番号１）、ＦＲ－Ｈ２（配列番号２）、ＦＲ－Ｈ３（配列番号４）、ＦＲ－Ｈ４（配列番号５）、そしてＦＲ－Ｌ１（配列番号６）、ＦＲ－Ｌ２（配列番号７）、ＦＲ－Ｌ３（配列番号８）、ＦＲ－Ｌ４（配列番号９）を用いた。前記ＣＤＲ配列は、マウス由来のＴＭ４ＳＦ４抗体であるＥＣＬ－２Ｂ７抗体のＣＤＲ配列を用いており、前記ＦＲ配列は、ヒト抗体である３ＱＲＧ抗体のＦＲ配列を用いた。前記３ＱＲＧ抗体は、米国国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）のＢＬＡＳＴＰ分析プログラムを用いて前記ＥＣＬ－２Ｂ７抗体の重鎖及び軽鎖アミノ酸配列と類似のヒト抗体候補群の中から選別したものである。前記ＣＤＲ配列をＣＤＲ－移植（ＣＤＲ－ｇｒａｆｔｉｎｇ）方法で前記ＦＲ配列に移植し、本
発明のヒト化抗体を製造した。先ず、前記ＣＤＲ配列中で重鎖可変領域のＣＤＲ配列（配列番号１０、配列番号１１及び配列番号１４）の前方に信号ペプチド配列を追加して得たＣＤＲ配列のアミノ酸配列に基づき、逆翻訳（ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｌａｔｅ）プログラム（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｏｒｇ／ｓｍｓ２／ｒｅｖ＿ｔｒａｎｓ．ｈｔｍｌ）を用いて、これを暗号化する塩基配列に変換した。その後、組換えＰＣＲを用いて、前記ＦＲ配列（配列番号１、配列番号２、配列番号４及び配列番号５）と連結して本発明のヒト化抗体の重鎖可変領域を暗号化する遺伝子を合成した。約４５０ｂｐの長さの遺伝子を３個の区間に分け、図１に示したように、ＥＣＬ－２Ｂ７－Ｓ－Ｈ－５’及びＥＣＬ－２Ｂ７－Ｓ－Ｈ－３’プライマーを用いてＴ１（１６４ｂｐ）を、ＥＣＬ－２Ｂ７－ＨＣ－１－５’及びＥＣＬ－２Ｂ７－ＨＣ－１－３’プライマーを用いてＴ２（１６７ｂｐ）を、そして、ＥＣＬ－２Ｂ７－ＨＣ－２－５’及びＥＣＬ－２Ｂ７－ＨＣ－２－３’プライマーを用いてＴ３（１５７ｂｐ）に該当する部位の重鎖可変領域遺伝子の切片を合成した。その後、Ｔ１及びＴ２切片を組換えＰＣＲを介して連結して３１０ｂｐ大きさの切片に合成し、Ｔ１とＴ２が連結された切片を再びＴ３切片とＣｈ５７－Ｈ．Ｃ－５’及びＥＣＬ－２Ｂ７－ＷＨ－３’プライマーを用いて連結することにより、ＥｃｏＲＩとＡｐａＩ制限酵素切断部位を両末端に有した約４５０ｂｐの本発明のヒト化抗体の重鎖可変領域（Ｈｚ２Ｂ７－１．０）遺伝子を合成した。前記重鎖可変領域は、ＦＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ１、ＦＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ２、ＦＲ－Ｈ３、ＣＤＲ－Ｈ３、ＦＲ－Ｈ４の順に配列されるように製作し、これをアガロースゲルで確認した（図２）。この過程に用いられた前記プライマー配列は、下記表１に示した。そして、本発明のヒト化抗体の軽鎖可変領域（Ｈｚ２Ｂ７－０．１）の遺伝子は、遺伝子合成業者（Ｂｉｏｎｉｃｓ、韓国）に依頼し、ＦＲ－Ｌ１（配列番号６）、ＣＤＲ－Ｌ１（配列番号１５）、ＦＲ－Ｌ２（配列番号７）、ＣＤＲ－Ｌ２（配列番号１８）、ＦＲ－Ｌ３（配列番号８）、ＣＤＲ－Ｌ３（配列番号１９）、ＦＲ－Ｌ４（配列番号９）の順に配列されるようにして約４５０ｂｐの長さの軽鎖可変領域（Ｈｚ２Ｂ７－０．１）遺伝子を合成し、これをアガロースゲルで確認した（図３）。そして、Ｔ４連結酵素（Ｔ４ ｌｉｇａｓｅ、ＮＥＢ、米国）を用いて前記重鎖可変領域遺伝子をｐｄＣＭＶ－ｄｈｆｒベクターのＥｃｏＲＩ－ＡｐａＩの位置に、前記軽鎖可変領域遺伝子をＨｉｎｄＩＩＩ－ＢｓｉＷＩの位置にＴ４連結酵素を用いてクローニングし（図８）、本発明のヒト化抗体（Ｈｚ２Ｂ７－１．１）を暗号化するベクターｐｄＣＭＶ－ｄｈｆｒＣ－Ｈｚ２Ｂ７－１．１を製造した。

［実施例２］本発明のヒト化抗体の変異体抗体の設計及び発現ベクターの製造

［２－１］本発明のヒト化抗体とエピトープの相互作用分析及び分子モデリング
前記実施例１を介して設計した本発明のヒト化抗体のアミノ酸配列のうち一部の配列を変形させた変異体抗体を製造するために、先ず、前記ヒト化抗体と標的であるＴＭ４ＳＦ４のエピトープの間の相互作用を確認した。一般に、抗原－抗体の結合力は、ドッキングシミュレーション（ｄｏｃｋｉｎｇ ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎ）を介して定性的に予測することができるが、前記実施例１のヒト化抗体は、Ｘ－線構造が知られていないため、ホモロジー（Ｈｏｍｏｌｏｇｙ）モデリングを介してその構造を予測し、それに基づいて前記
抗体とエピトープの間の結合力を確認した。このために、ＭＯＤＥＬＬＥＲプログラムの８．２バージョンを用いて、前記実施例１のヒト化抗体とアミノ酸配列との類似度が高いマウスのキメリック抗体Ｘ８３６をＢＬＡＳＴを用いてホモロジーモデリングのテンプレートとして用いた。前記Ｘ８３６抗体の２３５個のアミノ酸のうち、実施例１のヒト化抗体と１７６個のアミノ酸が一致してアミノ酸配列の類似性が７５％程度と示され、これに基づいて前記実施例１のヒト化抗体の３次元構造を予測することができた（図４）。

抗原であるＴＭ４ＳＦ４タンパク質のエピトープは、短い長さのポリペプチド鎖なので、１つの有機化合物としてみなして前記実施例１のヒト化抗体のＣＤＲ領域でドッキングシミュレーションを行い、結合自由エネルギーと結合モードを計算した。具体的に、ＴＭ４ＳＦ４タンパク質の１２６番から１４０番までのアミノ酸配列Ｔｈｒ－Ｔｒｐ－Ｇｌｙ－Ｔｙｒ－Ｐｒｏ－Ｐｈｅ－Ｈｉｓ－Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ－Ｔｙｒ－Ｌｅｕ－Ａｓｎ－Ａｓｐ－Ｇｌｕで構成された１５－ｍｅｒオリゴペプチドを全体抗原に対する単純化モデルにして計算を行った。前記ヒト化抗体に対するエピトープの結合自由エネルギーは－１１．６ｋｃａｌ／ｍｏｌに算出され、Ｋ_ｉ値に換算すると、３ｎＭ程度と計算された。これは、本発明のヒト化抗体とＴＭ４ＳＦ４のエピトープの間に非常に強い抗原－抗体の結合が形成されるものであることを意味する。ドッキングプログラムとしては、米国Ｓｃｒｉｐｐｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅで開発したＡｕｔｏＤｏｃｋ ｖｅｒｓｉｏｎ ４．２．６を変形したものを用い、正確度の向上のためにタンパク質－リガンド結合自由エネルギー関数の一部の項を改善して用いた。具体的に、静電気的相互作用項と水素結合エネルギー項及びリガンドの水和エネルギー項に入っているパラメーターをより正確に最適化し、ドッキングシミュレーションに用いた。抗体とエピトープの間の静電気的相互作用部分においては、抗体分子の誘電定数値を直接計算して用い、水素結合エネルギー項では、角度と距離の相互依存性も反映するために、モース（Ｍｏｒｓｅ）関数の積として表現することにより計算の正確度を向上させた。リガンド水和エネルギー部分においては、パラメーター数を６９個に増やした後、遺伝アルゴリズムを介して最適化する方法により正確度を改善した。ファンデルワールス結合、水素結合、静電気的相互作用、エントロピー、そして水和エネルギー項に対する重み付け係数（ｗｅｉｇｈｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）の値は、それぞれ０．１４８５、０．０６５６、０．１１４６、０．３１１３、及び０．１７１１として既存のＡｕｔｏＤｏｃｋプログラムに与えられた値をそのまま用いた。

前記のようなドッキングシミュレーションで得た実施例１のヒト化抗体とエピトープの複合体構造分析の結果を介し、結合に重要な役割を担うアミノ酸の部位を確認することができた。前記ヒト化抗体Ｈｚ２Ｂ７－１．１のアミノ酸のうち、軽鎖９９番のアルギニン（Ａｒｇ，Ｒ）、重鎖５８番のアスパラギン（Ａｓｎ，Ｎ）、重鎖６０番のチロシン（Ｔｙｒ，Ｙ）、重鎖１０２番のグリシン（Ｇｌｙ，Ｇ）、重鎖１０３番のセリン（Ｓｅｒ，Ｓ）などの５個がＣＤＲ領域に属するとともに、エピトープと水素結合を形成しつつ抗体の機能において核心の役割を担うものと予想された（図４、図５）。ファンデルワールス結合は相対的に弱いものと示され、疎水性アミノ酸のうち、軽鎖３８番のチロシンと軽鎖９８番のチロシンのみが抗体－エピトープ複合体の境界面で観察された（図４、図５）。

エピトープと水素結合あるいはファンデルワールス結合で直接相互作用するアミノ酸は、抗体の機能に重要な役割を担うので維持し、エピトープとの結合力を増大するためには、結合力が弱いか遠い距離にあるアミノ酸を置換する必要がある。例えば、図４と図５においてエピトープのフェニルアラニン及びトリプトファン残基が結合する部分である、前記ヒト化抗体Ｈｚ２Ｂ７－１．１の軽鎖可変領域のＣＤＲ１に該当する３１番のアスパラギン（Ａｓｎ，Ｎ）を、より疎水性を帯びた芳香族性アミノ酸で置換する場合、エピトープと抗体の間のファンデルワールス結合が強化されるに伴って結合力が増加するものと予測された。また、前記ヒト化抗体Ｈｚ２Ｂ７－１．１の重鎖可変領域のＣＤＲ２に該当す
る５５番のトリプトファン（Ｔｒｐ，Ｗ）は、エピトープのアスパラギン酸と隣接した位置にあるので、水素結合をより強く形成することができるアミノ酸で置換する場合、結合力が増加するものと予測された。したがって、軽鎖可変領域のＣＤＲ１に該当する３１番、重鎖可変領域のＣＤＲ２に該当する５５番の位置は、エピトープと親和度を増加させることができる重要な位置である（図４、図５）。また、軽鎖可変領域のＣＤＲ３に該当する１００番のトレオニン（Ｔｈｒ，Ｔ）、重鎖可変領域のＣＤＲ２に該当する５４番のトリプトファン、重鎖可変領域のＣＤＲ２に該当する５６番のアスパラギンなどの３つのアミノ酸もエピトープと比較的に近くの距離に位置しているので、これらを化学的性質が異なるアミノ酸で置換すると、エピトープとの新たな水素結合又はファンデルワールス結合が誘導されて抗体の効能を増大させることができるものと予想される。したがって、軽鎖可変領域のＣＤＲ３に該当する１００番、重鎖可変領域のＣＤＲ２に該当する５４番、５６番の位置も、エピトープと親和度を増加させることができるまた他の重要な位置である（図４、図５）。

［２－２］変異体ヒト化抗体アミノ酸配列の設計及びベクターの製造
前記実施例２－１のドッキングシミュレーション分析を介し、前記実施例１のヒト化抗体重鎖可変領域の４６番のアラニン（Ａｌａ、Ａ）をバリン（Ｖａｌ，Ｖ）で置換することにより、前記実施例１のヒト化抗体配列のうちＦＲ－Ｈ２を配列番号３のアミノ酸配列として重鎖可変領域Ｈｚ２Ｂ７－２．０（ＨＣ Ａ４６Ｖ）を設計した（図５）。

また、前記実施例１のヒト化抗体重鎖可変領域の５５番のトリプトファン（Ｔｒｐ，Ｗ）をセリン（Ｓｅｒ，Ｓ）又はチロシン（Ｔｙｒ，Ｙ）でそれぞれ置換することにより、前記実施例１のヒト化抗体配列のうちＣＤＲ－Ｈ２を、それぞれ配列番号１２又は配列番号１３のアミノ酸配列として重鎖可変領域Ｈｚ２Ｂ７－３．０（ＨＣ Ｗ５５Ｓ）と重鎖可変領域Ｈｚ２Ｂ７－４．０（ＨＣ Ｗ５５Ｙ）を設計した（図５）。このために、ｈ２Ｂ７－Ｈ．Ｃ－Ｗ５５Ｓ－５’とｈ２Ｂ７－Ｈ．Ｃ－Ｗ５５Ｓ－３’プライマー、そして、ｈ２Ｂ７－Ｈ．Ｃ－Ｗ５５Ｙ－５’とｈ２Ｂ７－Ｈ．Ｃ－Ｗ５５Ｙ－３’プライマーを合成し、インフュージョンクローニング（ｉｎ－ｆｕｓｉｏｎ ｃｌｏｎｉｎｇ）のためにｈ２Ｂ７－Ｈ．Ｃ－ＳＬＩＣ－３’プライマーとｈ２Ｂ７－Ｈ．Ｃ－ＳＬＩＣ－３’プライマーを用いて組換えＰＣＲを施行した（図６のＡ）。合成された遺伝子の配列をキット（ＥＺ－Ｆｕｓｉｏｎ^ＴＭ ＨＴ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ、Ｅｎｚｙｍｏｍｉｃｓ、韓国）を用いてＥｃｏＲ１とＡｐａＩで切断したｐｄＣＭＶ－ｄｈｆｒ－ｈ２Ｂ７ベクターにクローニングした（図８）。塩基配列分析で変異を確認した後、前記変異体ヒト化抗体を発現させることができるｐｄＣＭＶ－ｄｈｆｒ－Ｈｚ２Ｂ７－３．０とｐｄＣＭＶ－ｄｈｆｒ－Ｈｚ２Ｂ７－４．０を製造した。

また、前記実施例１のヒト化抗体軽鎖可変領域の３１番のアスパラギン（Ａｓｎ，Ｎ）をフェニルアラニン（Ｐｈｅ，Ｆ）又はバリン（Ｖａｌ，Ｖ）でそぞれ置換することにより、前記実施例１のヒト化抗体配列のうちＣＤＲ－Ｌ１を、それぞれ配列番号１６又は配列番号１７のアミノ酸配列として軽鎖可変領域Ｈｚ２Ｂ７－０．２（ＬＣ Ｎ３１Ｆ）と軽鎖可変領域Ｈｚ２Ｂ７－０．３（ＬＣ Ｎ３１Ｖ）を設計し、これをアガロースゲルで確認した（図５）。このために、ｈ２Ｂ７－Ｌ．Ｃ－Ｎ３１Ｆ－５’とｈ２Ｂ７－Ｌ．Ｃ－Ｎ３１Ｆ－３’プライマー、そして、ｈ２Ｂ７－Ｌ．Ｃ－Ｎ３１Ｖ－５’とｈ２Ｂ７－Ｌ．Ｃ－Ｎ３１Ｖ－３’プライマーを合成し、インフュージョンクローニングのためにｈ２Ｂ７－Ｌ．Ｃ－ＳＬＩＣ－３’プライマーとｈ２Ｂ７－Ｌ．Ｃ－ＳＬＩＣ－３’プライマーを用いて組換えＰＣＲを施行した（図６のＢ）。合成された遺伝子の配列をキット（ＥＺ－Ｆｕｓｉｏｎ^ＴＭ ＨＴ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ、Ｅｎｚｙｍｏｍｉｃｓ、韓国）を用いてＨｉｎｄＩＩＩとＢｓｉＷＩで切断したｐｄＣＭＶ－ｄｈｆｒ－ｈ２Ｂ７－１．１ベクターにクローニングした（図８）。塩基配列分析で変異を確認した後、前記変異体ヒト化抗体を発現させることができるｐｄＣＭＶ－ｄｈｆｒ－Ｈｚ２Ｂ７－０．２とｐ
ｄＣＭＶ－ｄｈｆｒ－Ｈｚ２Ｂ７－０．３を製造した。

この過程で用いられた前記プライマー配列は、下記表２に示した。

［比較例］ＴＭ４ＳＦ４を標的とするキメラ抗体の設計及び発現ベクターの製造
前記実施例１及び２のヒト化抗体は、抗体の重鎖／軽鎖可変領域のうちＣＤＲ配列は、マウス抗体のＣＤＲ配列を用い、抗体の不変領域と可変領域のうちＦＲ配列は、ヒト抗体の配列を用いて製造したものである。よって、本発明のヒト化抗体と比較するために、重鎖／軽鎖可変領域全体はマウス抗体から由来し、不変領域はヒト抗体から由来するキメラ抗体（ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ）を製造した。すなわち、前記キメラ抗体は、ヒト抗体との類似度の側面から、マウス抗体とヒト化抗体の中間に該当する抗体であるとみることができる。

先ず、マウス由来の前記ＥＣＬ－２Ｂ７抗体の重鎖及び軽鎖遺伝子を対象として、ＰＣＲを行い、ゲル抽出キット（ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ、ＦＡＶＯＲＧＥＮ、台湾）を用いて約４００ｂｐと３９０ｂｐのＤＮＡを分離した。そして、重鎖遺伝子の信号配列を合成するために、ｐｄＣＭＶ－ｄｈｆｒベクターを鋳型として５’－ｓｉｇｎａｌ－ＥｃｏＲ１（５｀－ＧＡＣ ＧＡＡ ＴＴＣ ＡＣＴ ＣＴＡ ＡＣＣ ＡＴＧ
ＧＡＡ ＴＧＧ Ａ）プライマーとＥＣＬ－２Ｂ７－Ｓ－Ｈ－３’（ＣＴＴ ＣＡＣ ＣＴＣ ＧＧＡ ＧＴＧ ＧＡＣ ＡＣＣ ＴＧＴ ＡＧＴ ＴＡ－３｀）プライマーを用いてＰＣＲを行った（図７のＡ）。また、重鎖可変領域を増幅するために、重鎖可変領域のＤＮＡを鋳型として２Ｂ７－Ｓ－Ｈ－５’（５｀－ＧＴＣ ＣＡＣ ＴＣＣ ＧＡＧ ＧＴＧ ＡＡＧ ＣＴＧ ＧＡＧ ＧＡＧ ＴＣ）プライマーとＥＣＬ－２Ｂ７－ＨＣ－Ｃｈｉ－３’（ＴＴＧ ＧＧＣ ＣＣＴ ＴＧＧ ＴＧＧ ＡＧＧ ＣＴＧ ＣＡＧ ＡＧＡ ＣＡＧ ＴＧＡ ＣＣＡ Ｇ－３｀）プライマーを用いてＰＣＲを行った（図７のＡ）。その後、前記重鎖の信号配列と重鎖可変領域遺伝子を連結するために、５’－ｓｉｇｎａｌ－ＥｃｏＲ１プライマーとＥＣＬ－２Ｂ７－ＨＣ－Ｃｈｉ－３’プライマーを用いて組換えＰＣＲを行った。これを介して重鎖可変領域と重鎖信号配列が連結された遺伝子を得、１％のアガロースゲルに展開させて確認し、ＤＮＡ分離キット（ＦａｖｏｒＰｒｅＰ ＧＥＬ^ＴＭ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ、Ｆａｒｖｏｒｇｅｎ、台湾）を用いて約４５０ｂｐに該当するＤＮＡを分離した（図７のＡ）。前記信号配列が連結された重鎖可変領域遺伝子をＥｃｏＲＩ及びＡｐａＩで処理した後、前記ＦａｖｏｒＰｒｅｐ ＧＥＬ^ＴＭ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて分離した（図７のＢ）。このように得られた重鎖可変領域遺伝子を、ヒト抗体の重鎖不変領域（ＩｇＧ１）遺伝子が含まれているｐｄＣＭＶ－ｄｈｆｒベクターのＥｃｏＲＩ及びＡｐａＩの位置にＴ４ ＤＮＡ連結酵素（Ｔ４ ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅ、ＮＥＢ、米国）を用いてクローニングした（図８）。軽鎖遺伝子の場合にも同様に、信号配列を合成するためにｐｄＣＭＶ－ｄｈｆｒ－ｃｈ５７ベクターを鋳型として、ｃｈ５７－ＬＣ－ｗｈｏｌｅ ５’（５｀－ＣＴＧ ＣＡＡ ＡＧＣ ＴＴＣ ＧＧＣ ＡＣＧ ＡＧＣ Ａ）プライマーとＥＣＬ－２Ｂ７－Ｓ－Ｌ－３’（ＣＡＣ ＡＡＴ ＡＴＣ ＴＣＣ ＴＴＣ ＡＡＣ ＡＣＣ ＡＧＡ ＣＡＡ ＣＣ－３｀）プライマーを用いてＰＣＲを行い、軽鎖可変領域遺伝子の増幅のためにＥＣＬ－２Ｂ７－Ｓ－Ｌ－５’（５｀－ＧＴＴ ＧＡＡ ＧＧＡ ＧＡＴ ＡＴＴ ＧＴＧ ＡＴＧ ＡＣＣ ＣＡＧ ＴＣＴ）プライマーとＥＣＬ－２Ｂ７－ＬＣ－ｃｈｉ－３’（ＣＣＡ ＣＣＧ ＴＡＣ ＧＴＴ ＴＧＡ ＴＴＴ ＣＣＡ ＧＣＴ Ｔ－３｀）プライマーを用いてＰＣＲを行った（図７のＡ）。前記信号配列と軽鎖可変領域の連結のために、ｃｈ５７－ＬＣ－ｗｈｏｌｅ ５’プライマーとＥＣＬ－２Ｂ７－ＬＣ－ｃｈｉ－３’プライマーを用いて組換えＰＣＲを行った後、１％のアガロースゲルに展開させて確認し、重鎖可変領域遺伝子と同一の方法で分離した（図７のＡ）。前記軽鎖可変領域遺伝子をＨｉｎｄＩＩＩ及びＢｓｉｗＩで処理して分離した後、ヒト抗体の軽鎖不変領域（Ｃｋ）遺伝子を含んで先に製作した重鎖遺伝子が挿入されたｐｄＣＭＶ－ｄｈｆｒ－ｃｈｉ２Ｂ７－ＨＣベクターのＨｉｎｄＩＩＩ及びＢｉｓＷＩの位置にクローニングすることにより（図７のＣ）、前記キメラ抗体を発現させることができるベクターを製造した（ｐｄＣＭＶ－ｄｈｆｒ－ｃｈｉ２Ｂ７、図８）。前記ベクターを大腸菌ＤＨ５αにＲｂＣｌ２方法で形質転換した後、約４５０ｂｐの大きさを有した大腸菌を選抜した。この大腸菌を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンが含有された５ｍｌのＬＢ培地で一晩中培養した後、プラスミドＤＮＡ分離のためのキット（ＤＮＡ－ｓｐｉｎ^ＴＭ Ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ、ＩＮＴＲＯＮ、韓国）を用いてプラスミドＤＮＡを分離して塩基配列を確認した（Ｂｉｏｎｉｃｓ、韓国）。その結果、前記形質転換体から分離されたｃＤＮＡの塩基配列は、前記ＥＣＬ－２Ｂ７抗体の可変領域遺伝子と同一であり、ヒト抗体の重鎖及び軽鎖不変領域遺伝子と正しく連結されていることを確認した。

［実験例１］
ヒト化抗体及びキメラ抗体の発現及び精製
前記実施例１、２を介して製造した本発明のヒト化抗体のベクターと、前記比較例のキメラ抗体ベクターから抗体タンパク質を発現させて精製した。

先ず、前記キメラ抗体（「Ｃｈｉ２Ｂ７」）を発現させて精製するために、１５０ｍｍ
の培養皿を用いて１×１０^７のＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ヒト胚芽腎細胞株）を２０ｍｌのＤＭＥＭ培地（Ｂｉｏｗｅｓｔ、フランス）で培養した。培養された細胞に５０μｇの前記ｐｄＣＭＶ－ｄｈｆｒ－ｃｈｉ２Ｂ７発現ベクターと７５μｌのポリエチレンイミン（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ、１ｍｇ／ｍｌ）を混ぜた後、トランスフェクション最適化培地５００μｌと混ぜて均一に細胞培養培地の上にふりかけた。翌日、上澄液を収集し、新しい培地を満たして細胞株から発現されて出たキメラ抗体を収集し、その上澄液をビーズ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ ａｇａｒｏｓｅ ｂｅａｄｓ、Ａｍｉｃｏｇｅｎ、韓国）がパッキングされているカラムに入れ、抗体が前記ビーズと結合することができるようにした。その後、ＰＢＳ（ｐＨ８．０）でビーズを洗浄し、０．１Ｍのグリシン（ｐＨ２．８）１０ｍｌと１ＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ９．０）を用いて抗体をビーズから溶出することでＣｈｉ２Ｂ７キメラ抗体を精製し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥとクマシブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ ｂｌｕｅ）染色法を介してこれを確認した（図９のＡ）。また、前記精製したキメラ抗体がヒト抗体の不変領域を有したものなのか否かを、ヤギの抗体（ｇｏａｔ－α－ｈＩｇＧ－ｇａｍｍａ ｃｈａｉｎ－ＨＲＰ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国、そして、ｇｏａｔ－α－ｈＩｇＧ－ｋａｐｐａ ｃｈａｉｎ－ＨＲＰ、Ｂｅｔｈｙｌ、米国）を２次抗体として用いてウェスタンブロッティングを介して検出した結果、前記キメラ抗体は、ヒト抗体の不変領域を含む抗体であることを確認することができた（図９のＢ）。

また、前記実施例１、２のヒト化抗体を発現、精製した。前記実施例１及び２を介し、本発明のヒト化抗体の重鎖可変領域を４種類に、軽鎖可変領域を３種類に製造したので、これらの組み合わせを介して多様な形態のヒト化抗体を製造することができる。これによって、前記実施例１、２の発現ベクターをＨＥＫ２９３Ｔ細胞に導入させ、前記キメラ抗体と同一の方法を介してヒト化抗体を発現させ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇビーズ及びカラムを用いて分離及び精製した。

精製された前記キメラ抗体と本発明のヒト化抗体、そしてマウス由来の２Ｂ７抗体の精製純度を確認するために１０％のＳＤＳ－ＰＡＧＥを実施した。全体１０種のヒト化抗体のうち代表的な６種（Ｈｚ２Ｂ７－１．１、Ｈｚ２Ｂ７－１．２、Ｈｚ２Ｂ７－１．３、Ｈｚ２Ｂ７－２．１、Ｈｚ２Ｂ７－３．２、Ｈｚ２Ｂ７－４．３）を分析し、このとき、各抗体は１μｇずつ用いて、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ以後、クマシブルー染色とウェスタンブロッティング分析を行った（図９）。クマシブルー染色のための溶液（ＰａｇｅＢｌｕｅ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）を処理して染色を行った結果、各抗体の重鎖及び軽鎖が約５５ｋＤａ、２５ｋＤａの位置で確認された（図９のＡ）。これは、前記キメラ抗体及びヒト化抗体がいずれもＩｇＧタイプの抗体であり、ヒト抗体の一部の配列を有するものであることを意味する。ウェスタンブロッティングのために、２次抗体としてヤギの抗体（ｇｏａｔ－α－ｈＩｇＧ－ｇａｍｍａ ｃｈａｉｎ－ＨＲＰ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国、そして、ｇｏａｔ－α－ｈＩｇＧ－ｋａｐｐａ ｃｈａｉｎ－ＨＲＰ、Ｂｅｔｈｙｌ、米国）を用い、ＥＣＬキット（Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｒｉｇｈｔ ＥＣＬ ｋｉｔ、ａｄｖａｎｓｔａ、米国）を用いてバンドを検出した。その結果、ＥＣＬ－２Ｂ７抗体はマウス抗体なので、ウェスタンブロッティングを介して検出されず、他の抗体（キメラ抗体及びヒト化抗体）の場合、ＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果と同様に各抗体の重鎖及び軽鎖が検出され、これらがヒト抗体配列を有することを確認することができ、抗体の精製純度を確認することができた（図９のＢ）。

［実験例２］
ＥＬＩＳＡによるヒト化抗体のＴＭ４ＳＦ４抗原結合能の比較
本発明のヒト化抗体、そしてキメラ抗体を用いて、間接ＥＬＩＳＡ（ｉｎｄｉｒｅｃｔ
ＥＬＩＳＡ）を介しＴＭ４ＳＦ４に対する結合能を確認した。
具体的に、前記ヒト化抗体は、前記実施例１、２を介して設計した重鎖可変領域変異種の４種と軽鎖可変領域変異種の３種を組み合わせて、Ｈｚ２Ｂ７－１．１、Ｈｚ２Ｂ７－１
．２、Ｈｚ２Ｂ７－１．３、Ｈｚ２Ｂ７－２．１、Ｈｚ２Ｂ７－３．１、Ｈｚ２Ｂ７－３．２、Ｈｚ２Ｂ７－３．３、Ｈｚ２Ｂ７－４．１、Ｈｚ２Ｂ７－４．２及びＨｚ２Ｂ７－４．３の１０種の形態に製造した。このために、９６－ウェルプレートの各ウェルの底にコーティング緩衝溶液（１００ｍＭ ｃａｒｂｏｎａｔｅ／ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ ｃｏａｔｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ、ｐＨ９．６）で溶解させたＴＭ４ＳＦ４－ＢＳＡ（１μｇ／ｍｌ）又はＢＳＡ溶液（１μｇ／ｍｌ）１００μｌを加えて４℃で１６時間以上吸着させた。その後、コーティングされた抗原を洗浄緩衝溶液（ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒ、０．０５％ ＰＢＳ－Ｔ、Ｔｗｅｅｎ－２０）で３回洗浄し、各ウェルの底に抗原が吸着されていない部分にブロック緩衝溶液（ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ、５％ ｓｋｉｍ ｍｉｌｋ ｉｎ ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒ）２００μｌを加えて４℃で１６時間以上反応させた後、再び洗浄緩衝溶液で３回洗浄した。その後、前記実験例１を介して精製させた前記１０種の組み合わせのヒト化抗体とキメラ抗体をブロック緩衝溶液を用いて多様な濃度も希釈して準備した後、濃度別に各ウェルに１００μｌずつ入れて室温で２時間反応させた。再び３回洗浄した後、これを検出するための１ｍｇ／ｍｌの抗体（α－ｈｕｍａｎ
ＩｇＧ－Ｋａｐｐａ ｃｈａｉｎ－ＨＲＰ、Ｂｅｔｈｙｌ、米国）をブロック緩衝溶液を用いて１０，０００倍に希釈し、各ウェルに１００μｌを加えて室温で１時間反応させた。反応が終わった後、洗浄緩衝溶液で３回洗浄し、基質溶液（ＯＰＤ ｓｏｌｕｔｉｏｎ、３０％のＨ_２Ｏ_２ ４μｌ、１００μｌのＯＰＤ ｓｔｏｃｋ（４０ｍｇ／ｍｌ）、ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｃｉｔｒａｔｅ ｂｕｆｆｅｒで１０ｍｌに合わせる）を各ウェルに１００μｌずつ加えて室温で反応させた後、２．５ＭのＨ_２ＳＯ_４ ５０μｌを加えて反応を終結させた。最後に、固体状に結合された酵素の活性を測定するために、ＥＬＩＳＡリーダーを用いて４９０ｎｍで吸光度を測定した（図１０）。

その結果、本発明のヒト化抗体１０種はいずれもＢＳＡに結合せず、ＴＭ４ＳＦ４－ＢＳＡ抗原に対しては高い特異性を有して結合するものと表れた（図１０）。よって、本発明のヒト化抗体は、ＴＭ４ＳＦ４に対する結合力を有するだけでなく、これに対して特異的に結合する特性があることを確認することができた。また、ＴＭ４ＳＦ４－ＢＳＡに対する親和度を比較したとき、１０種のヒト化抗体は、いずれもキメラ抗体Ｃｈｉ２Ｂ７に比べて顕著に高いＴＭ４ＳＦ４親和度を示した。そして、１０種のヒト化抗体は、それぞれ異なる結合親和度（ｂｉｎｄｉｎｇ ａｆｆｉｎｉｔｙ）を示し、その中でＨｚ２Ｂ７－１．２ヒト化抗体の場合、Ｈｚ２Ｂ７－１．１に比べて明白に増加した結合親和度を示したので、ＴＭ４ＳＦ４に対する結合力が最も優秀であることを確認することができた（図１０のＡ及びＢ）。

［実験例３］
ＳＰＲ分析による抗－ＴＭ４ＳＦ４ヒト化単一クローン抗体敏感度の比較
構築された抗－ＴＭ４ＳＦ４ヒト化単一クローン抗体のヒトＴＭ４ＳＦ４－ペプチド（ｈＴＭ４ＳＦ４ ａａ １２６－１４０）抗原に対する結合能を比較するために表面プラズモン共鳴（Ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌａｓｍｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ、ＳＰＲ）分析を行った。

アナライト（Ａｎａｌｙｔｅ）であるヒト化抗体は計５種であって、表３のように、最初突然変異型１種（ＨｚＥ２Ｂ７－１．１）、軽鎖突然変異型２種（ＨｚＥ２Ｂ７－１．２（ＬＣ Ｎ３１Ｆ）、ＨｚＥ２Ｂ７－１．３（ＬＣ Ｎ３１Ｖ））、重鎖／軽鎖突然変異型２種（ＨｚＥ２Ｂ７－４．３（ＨＣ Ｗ５５Ｙ、ＬＣ Ｎ３１Ｖ）、ＨｚＥ２Ｂ７－３．２（ＨＣ Ｗ５５Ｓ、ＬＣ Ｎ３１Ｆ））が分析され、ヒトＴＭ４ＳＦ４タンパク質の１２６番から１４０番までのアミノ酸配列にビオチン（ｂｉｏｔｉｎ）が結合された形態である合成ペプチド（Ｂｉｏｔｉｎ－ＧＳＡＧＧＳＴＷＧＹＰＦＨＤＧＤＹＬＮＤＥ、ＧＳＡＧＧＳ：ＢｉｏｔｉｎとＴＭ４ＳＦ４ ａａ １２６－１４０であるＴＷＧＹＰＦＨＤＧＤＹＬＮＤＥの間のスペース配列）をリガンド（Ｌｉｇａｎｄ）として用いた。

先ず、ストレプトアビジン接合センサチップ（Ｓｅｒｉｅｓ Ｓ Ｓｅｎｓｅｒ Ｃｈｉｐ ＳＡ、Ｃｙｔｉｖａ社）をＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００（Ｃｙｔｉｖａ社）に挿入して活性化バッファー（１Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＮａＯＨ）を３０秒間流した後、ＨＢＳ－ＥＰバッファー（Ｃｙｔｉｖａ社）を流してセンサチップ表面の活性化と安定化を誘導した。安定したセンサチップにリガンド（Ｂｉｏｔｉｎ－ｈＴＭ４ＳＦ４ ａａ １２６－１４０）を１ｎＭ～１２８ｎＭの濃度で流してリガンドをセンサチップ表面に固定させ、再生溶液（Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ、２０ｍＭ ＮａＯＨ）を流してビオチン－ペプチドリガンドが安定的に結合されたストレプトアビジン接合センサチップを構築した。親和度分析のためのアナライト抗体は、５１２ｎｍｏｌｅ／Ｌから１／２順次希釈して１６ｎｍｏｌ／Ｌの濃度まで準備し、構築されたリガンド結合ストレプトアビジン接合センサチップに各濃度別のアナライト抗体を４８０秒間３０ｕｌ／ｍｉｎの速度で流して結合を誘導した後、ＨＢＳ－ＥＰ緩衝溶液を同一時間と速度で流してアナライト抗体がリガンドペプチドから解離される程度を反応値（Ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｕｎｉｔ）の形態で得、同一方法で得られたリガンド非結合センサチップ反応値を除外する方式でＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００評価ソフトウェア（Ｃｙｔｉｖａ社）を用いて結合率（Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｒａｔｅ、Ｋ_ａ）と解離率（Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｒａｔｅ、Ｋ_ｄ）及び平衡解離定数（ＫＤ、Ｋ_ｄ／Ｋ_ａ）値を算出した。算出基準としてリガンドペプチドとアナライト抗体の相互作用に対する物質伝達フィッティングモデルは１：１結合を用いて分析された。図１１に表記された平衡解離定数（ＫＤ）を基準として抗－ＴＭ４ＳＦ４ヒト化単一クローン抗体のヒトＴＭ４ＳＦ４－ペプチド（ｈＴＭ４ＳＦ４ ａａ １２６－１４０）抗原に対する結合能は、ＨｚＥ２Ｂ７－１．２（ＬＣ Ｎ３１Ｆ）抗体が６．０３×１０^－９Ｍで最も低く、ＨｚＥ２Ｂ７－１．１は２．４４２×１０^－８Ｍ、ＨｚＥ２Ｂ７－１．３（ＬＣ Ｎ３１Ｖ）は３．５４２×１０^－８Ｍ、ＨｚＥ２Ｂ７－４．３（ＨＣ Ｗ５５Ｙ ＬＣ Ｎ３１Ｖ）は８．１６５×１０^－８Ｍ、ＨｚＥ２Ｂ７－３．２（ＨＣ Ｗ５５Ｓ ＬＣ Ｎ３１Ｆ）は１．１１９×１０^－７Ｍに評価された（表３）。ヒト化抗体の平衡解離定数（ＫＤ）値は低いことがより好ましく、商業的に許可を受けた一般的なヒト化抗体でその値が普通１０^－８Ｍ以下であり、下限は特に限定されない。したがって、最初にデザインしたヒト化抗体（ＨｚＥ２Ｂ７－１．１）のＫＤが既に有用な２．４４２×１０^－８Ｍを有し、ドッキングモデルを介して得た情報に基づいて軽鎖３１番目のアスパラギン（Ａｓｐａｒａｇｉｎｅ，Ｎ）をフェニルアラニン（Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ，Ｆ）で置換したＨｚＥ２Ｂ７－１．２（ＬＣ Ｎ３１Ｆ）抗体は、抗原に対する結合力が最初にデザインしたＨｚＥ２Ｂ７－１．１より約４倍さらに増加し、平衡解離定数（ＫＤ）値が６．０３×１０^－９Ｍに至っていることを示すことから、商業的
な価値がより高い抗体であることが分かる。

［実験例４］
ＦＡＣＳによるヒト化抗体の癌細胞結合能の比較
前記実験例２を介し、本発明のヒト化抗体がＴＭ４ＳＦ４に対して高い親和度を有し特異的に結合することを確認したので、前記ＴＭ４ＳＦ４を過剰発現する特徴がある癌細胞に本発明のヒト化抗体を処理して結合可否を確認した。

具体的に、肺癌細胞株であるＣａｌｕ－３、Ａ５４９細胞株をＤＭＥＭ培地（Ｂｉｏｗｅｓｔ、フランス）に１０％のウシ胎児血清（ＷｅｌＧｅｎｅ）を用いて培養した。そして、肝癌細胞株であるＨｕｈ７、ＳＮＵ－３８７、ＳＮＵ－４４９細胞株は、ＲＰＭＩ－１６４０培地（Ｂｉｏｗｅｓｔ）に１０％のウシ胎児血清を用いて培養した。その後、８０％程度成長した前記細胞に酵素（ＴｒｙｐＬＥ^ＴＭ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｅｎｚｙｍｅ、Ｇｉｂｃｏ^ＴＭ）を処理して離し、この細胞をＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄した後、４％のパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で４℃で１５分間固定させた。その後、ＰＢＡ（０．１％ ＢＳＡ ｉｎ ＰＢＳ）で２回洗浄した後、抗体別に５×１０５個の細胞にマウス由来の２Ｂ７抗体（１０μｇ／ｍｌ）、キメラ抗体Ｃｈｉ２Ｂ７（１０μｇ／ｍｌ）、本発明のヒト化抗体Ｈｚ２Ｂ７－１．１（１０μｇ／ｍｌ）、Ｈｚ２Ｂ７－１．２（１０μｇ／ｍｌ）、Ｈｚ２Ｂ７－１．３（１０μｇ／ｍｌ）、マウスとヒトのアイソタイプ（Ｉｓｏｔｙｐｅ）対照群のＩｇＧ１抗体（１０μｇ／ｍｌ）をそれぞれ含んでいるＰＢＡを入れ、１時間４℃で反応させた。反応後、ＰＢＡで２回洗浄した後、マウス由来の２Ｂ７抗体及びマウスアイソタイプＩｇＧ（２μｇ／ｍｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が入っているグループにはＦＩＴＣ蛍光が結合されており、マウスＩｇＧに特異的なα－ｍｏｕｓｅ
ＩｇＧ－ＦＩＴＣ（２μｇ／ｍｌ）抗体を入れた。そして、ヒトアイソタイプＩｇＧ、キメラ抗体及びヒト化抗体が入っているグループにはＦＩＴＣ蛍光が結合されており、ヒトＩｇＧに対して特異的なα－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ－ＦＩＴＣ（２μｇ／ｍｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）抗体を入れ、３０分間４℃で反応させた。反応後、ＰＢＡで洗浄し、５００μｌのＰＢＡで浮遊させた後、フローサイトメーター（ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ、ＢＤ、米国）を用いて前記抗体が抗原に対して特異性を有するのかを確認した。

その結果、マウス由来の２Ｂ７抗体と同様に、本発明のヒト化抗体と比較例のキメラ抗体は、表面にＴＭ４ＳＦ４を発現するＣａｌｕ－３とＡ５４９肺癌細胞に特異的に結合することを確認することができた。また、ヒト初代肝細胞（ｈｕｍａｎ ｐｒｉｍａｒｙ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ、ｈＰＨ）の表面には結合しなかったが、肝癌細胞株であるＨｕｈ７、ＳＮＵ－３８７及びＳＮＵ－４４９肝癌細胞にも特異的に結合することを確認することができた。その中でも、本発明のヒト化抗体Ｈｚ２Ｂ７－１．２の場合、分析の結果、特に、Ａ５４９細胞株で顕著に高い結合能を有していることを確認することができた（図１２）。

［実験例５］
本発明のヒト化抗体を高い生産性で生産することができる細胞株の製造
本発明のヒト化抗体を生産することができる細胞株を製造するために、ＣＨＯ細胞（Ｃｈｉｎｅｓｅ ｏｖａｒｙ ｈａｍｓｔｅｒ ｃｅｌｌｓ）の中でジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）を暗号化する遺伝子が欠損されているＤＧ４４細胞株を用いた。前記ＤＧ４４細胞は、ＩＭＤＭ培地（Ｗｅｌｇｅｎｅ、韓国）にＨ．Ｔ．（ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ－ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ、ｓｉｇｍａ、Ｇｅｒｍａｎｙ）及びＤｉａｌｙｅｄ ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、ＵＳＡ）を添加して培養し、トリプシン－ＥＤＴＡ（ｗｅｌｇｅｎｅ、韓国）で細胞株を離した後、６ウェルプレートに１×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌだけ分株した。ここに、本発明のヒト化抗体の中でＨｚ２Ｂ７－１．１及びＨｚ２Ｂ７－１．２（ＬＣ Ｎ３１Ｆ）を暗号化する発現ベクターを形
質転換（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）するために、１５ｕｇのＰｖｕＩ制限酵素（Ｅｎｚｙｎｏｍｉｃｓ、韓国）をそれぞれ処理して線形化させたｐｄＣＭＶ－ｄｈｆｒ－ｈｚ２Ｂ７－１．１及びｐｄＣＭＶ－ｄｈｆｒ－ｈｚ２Ｂ７－１．２をＴＯＭ培地（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｍｅｄｉｕｍ）によく混ぜて準備し、１５μｌのリポフェクタミン（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）をＴＯＭ培地で反応させた後、前記ベクターが含有された培地と混合して２０分間反応させた。そして、反応された溶液を前記ＤＧ４４細胞に滴下して形質転換を行った。

本発明のヒト化抗体を暗号化する遺伝子が導入された前記細胞は、１００μｇ／ｍｌ濃度のＧ４１８が含有された培地でネオマイシン（ｎｅｏｍｙｃｉｎ）抵抗性可否を介しスクリーニングし、コロニーが形成された細胞の上澄液を得た。上澄液に含まれた本発明のヒト化抗体を用いてサンドイッチＥＬＩＳＡ（Ｓａｎｄｗｉｃｈ ＥＬＩＳＡ）を行って抗体の生産を確認した。それぞれの形質転換体のうち、ＥＬＩＳＡの結果、ＯＤ値が高い結果を示して抗体発現量に優れた５個のクローンを選抜した後、ＭＴＸ（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）を処理して本発明の抗体遺伝子を増幅させた。０．０２μＭ濃度でＭＴＸを処理して１週間前記抗体遺伝子を増幅させた後、再びＥＬＩＳＡを介して抗体生産量を測定し、生産量が増加したクローンを再び５個ずつ選別し、０．０８μＭ濃度でＭＴＸを増加させて遺伝子を２次増幅させた。

これにより、Ｈｚ２Ｂ７－１．１ヒト化抗体を高く生産する細胞株として３Ａ１２、Ｈ１２、４Ａ１２、４Ｂ１２及び４Ｈ１２の計５個のクローンを選抜した。そして、ｈｚ２Ｂ７－１．２抗体（ＬＣ Ｎ３１Ｆ）を高く生産する細胞株として４Ａ９、４Ａ１２、４Ｂ９、４Ｃ７及び４Ｈ１２クローンを選抜し、さらなる形質転換を介して得た７Ａ８及び６Ｇ１０クローンを含めて計７個のクローンを選抜した（図１３）。前記１２個のクローンの細胞スタックを作り、これをＩＭＤＭ培地に１０％のＤｉａｌｙｚｅｄ ＦＢＳを添加して培養し、細胞が５０％程度育った後、ＭＴＸを２日ごとに０．０８μＭの濃度で処理して抗体遺伝子を増幅させた。約３０日間ＭＴＸを処理しつつ培養した結果、０．０８μＭ濃度のＭＴＸで抵抗性を有する細胞株を獲得することができたし、Ｈｚ２Ｂ７－１．１抗体の高発現細胞株として４Ｈ１２クローンを、Ｈｚ２Ｂ７－１．２抗体の高発現細胞株として４Ａ１２クローンを選定した。

前記０．０８μＭ濃度のＭＴＸで生き残って選定されたクローンを単一クローン選別するために、１００ｍｍディッシュに３×１０^４ｃｅｌｌｓだけ分株した。約１０日後、形成された各コロニーを用いてスタックを作って保管し、残った細胞はサンドイッチＥＬＩＳＡを介して抗体生産量の増加可否を確認した。具体的に、９６ウェルプレートの各ウェルの底にコーティング緩衝溶液（１００ｍＭ ｃａｒｂｏｎａｔｅ／ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ ｃｏａｔｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ、ｐＨ ９．６）で溶解させたα－ヒトＩｇＧ－Ｆｃ特異的抗体（２μｇ／ｍｌ）を１００μｌ加えて４℃で１６時間以上吸着させた。洗浄及びブロッキングを行った後、前記４Ｈ１２クローン（Ｈｚ２Ｂ７－１．１－４Ｈ１２）、４Ａ１２クローン（Ｈｚ２Ｂ７－１．２－４Ａ１２）とＭＴＸ ０．０８μＭの濃度で選別した、抗体遺伝子が増幅されたそれぞれの単一クローンを、３７℃のＣＯ_２培養器で２４時間培養した後、培養液を収集した。前記培養液とヒトＩｇＧアイソタイプ対照群抗体を多様な濃度に希釈して準備した後、濃度別に各ウェルに１００μｌずつ入れ、室温で２時間反応させた。その後、α－ヒトＩｇＧ－Ｋａｐｐａ鎖－ＨＲＰ（１ｍｇ／ｍｌ、Ｂｅｔｈｙｌ、米国）をブロッキングバッファーを用いて１０，０００倍に希釈し、各ウェルに１００ｕｌ加えて室温で１時間反応させた。反応が終わった後、基質であるＯＰＤ溶液（３０％のＨ_２Ｏ_２ ４μｌ、１００μｌのＯＰＤ ｓｔｏｃｋ（４０ｍｇ／ｍｌ）、ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｃｉｔｒａｔｅ ｂｕｆｆｅｒで１０ｍｌに合わせる）を各ウェルに１００μｌずつ加えて室温で１０分間反応させた後、２．５ＭのＨ_２ＳＯ_４ ５０μｌを加えて反応を終結させた。

ＥＬＩＳＡを行った結果、ＭＴＸにより抗体遺伝子が増幅されたＨｚ２Ｂ７－１．１－４Ｈ１２－０．０８及びＨｚ２Ｂ７－１．２－４Ａ１２－０．０８の各クローンのうち、ＭＴＸにより増幅される前のクローンに比べてより高い吸光度を示したクローンを確認した。そして、定量的抗体生産量の分析を介して抗体の濃度を計算した（図１４及び図１５）。その結果、Ｈｚ２Ｂ７－１．１－４Ｈ１２クローンの場合、ＭＴＸにより抗体遺伝子が増幅される前の細胞の抗体生産量が約２．８μｇ／１０^６ｃｅｌｌ／２４ｈｒであったが、ＭＴＸにより抗体遺伝子が増幅されたＨｚ２Ｂ７－１．１－４Ｈ１２－０．０８－＃１クローンの抗体生産量は、約３．８倍増加して１０．８μｇ／１０^６ｃｅｌｌ／２４ｈｒと示され、Ｈｚ２Ｂ７－１．２－４Ａ１２クローンの場合、増幅前の抗体生産量が２．５μg／１０^６ｃｅｌｌ／２４ｈｒであったが、このクローンをＭＴＸ濃度０．０８μＭ
に増幅したＨｚ２Ｂ７－１．２－４Ａ１２－０．０８クローンの場合、＃９クローンは約１４．２μｇ／１０^６ｃｅｌｌ／２４ｈｒ、＃２０クローンは７．９μｇ／１０^６ｃｅｌｌ／２４ｈｒの抗体生産量を示し、遺伝子が増幅されていないクローンと比べてそれぞれ約５．７倍、３．１倍増加した抗体生産量を示したので、最大５．７倍に抗体生産性が増加したことが分かる（図１５）。

次に、血液内の抗体の安定性を測定するために血清安定性（ｓｅｒｕｍ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ）実験を進めた。マウスハイブリドーマ細胞株から精製したマウス抗体２Ｂ７と、ＣＨＯ細胞株から精製したヒト化抗体Ｈｚ２Ｂ７－１．１及びＨｚ２Ｂ７－１．２とを、それぞれ３７℃の６０％ヒト血清（ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）に最大４日間培養した後、０、３、２４、４８、７２、９６時間での抗原結合能をＩｎｄｉｒｅｃｔ ＥＬＩＳＡを用いて測定した。具体的に、０．５μｇ／ｍｌのＴＭ４ＳＦ４－ＢＳＡ抗原をコーティング緩衝溶液（１００ｍＭ ｃａｒｂｏｎａｔｅ／ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ ｃｏａｔｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ、ｐＨ ９．６）を用いて４℃で１６時間以上吸着させた後、洗浄及びブロッキング過程を行った。その後、ヒト血清で培養した抗体を一次抗体として用いて、以前と同様にＥＬＩＳＡ過程を進め、時間に応じて抗原結合能が維持されるのかを確認した。吸光度を測定した後、０時間での抗原結合能を１００％と仮定して比べた結果、マウス抗体２Ｂ７は、ヒト血清内で９６時間まで同等な抗原結合能を有することを確認した（図１６のＡ）。また、抗体の配列と構造が変化したヒト化抗体Ｈｚ２Ｂ７－１．１及びＨｚ２Ｂ７－１．２も、ヒト血清内で約４日まで分解されずに一定の抗原結合能が維持されるものと確認された（図１６のＢ及びＣ）。

したがって、本発明のヒト化抗体遺伝子で形質転換されたＣＨＯ－ＤＧ４４細胞でＭＴＸを用いて抗体遺伝子を特異的に増幅することにより、本発明の抗体を生産する細胞株としてＨｚ２Ｂ７－１．１－４Ｈ１２－０．０８－＃１、Ｈｚ２Ｂ７－１．２－４Ａ１２－０．０８－＃９の細胞株を確立することができた。

以上、本発明は、記載された実施形態に対してのみ詳細に説明されたが、本発明の技術思想の範囲内で多様な変形及び修正が可能であるのは当業者において明白なことであり、このような変形及び修正が特許請求の範囲に属するのは当然なことである。

Claims (21)

1. 配列番号１のアミノ酸配列を含むＦＲ－Ｈ１、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号２又は配列番号３のアミノ酸配列を含むＦＲ－Ｈ２、配列番号１１、配列番号１２及び配列番号１３より構成される群から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、配列番号４のアミノ酸配列を含むＦＲ－Ｈ３、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３及び配列番号５のアミノ酸配列を含むＦＲ－Ｈ４を含む重鎖可変領域；及び
   配列番号６のアミノ酸配列を含むＦＲ－Ｌ１、配列番号１５、配列番号１６及び配列番号１７より構成される群から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号７のアミノ酸配列を含むＦＲ－Ｌ２、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、配列番号８のアミノ酸配列を含むＦＲ－Ｌ３、配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３及び配列番号９のアミノ酸配列を含むＦＲ－Ｌ４を含む軽鎖可変領域；
   を含み、
   ＴＭ４ＳＦ４（ＴｒａｎｓＭｅｍｂｒａｎｅ ４ Ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ Ｍｅｍｂｅｒ ４）に特異的に結合する、ヒト化抗体又はこの抗原結合断片。
2. 配列番号１のアミノ酸配列よりなるＦＲ－Ｈ１、配列番号１０のアミノ酸配列よりなるＣＤＲ－Ｈ１、配列番号２又は配列番号３のアミノ酸配列よりなるＦＲ－Ｈ２、配列番号１１、配列番号１２及び配列番号１３より構成される群から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列よりなるＣＤＲ－Ｈ２、配列番号４のアミノ酸配列よりなるＦＲ－Ｈ３、配列番号１４のアミノ酸配列よりなるＣＤＲ－Ｈ３及び配列番号５のアミノ酸配列よりなるＦＲ－Ｈ４を含む重鎖可変領域；及び
   配列番号６のアミノ酸配列よりなるＦＲ－Ｌ１、配列番号１５、配列番号１６及び配列番号１７より構成される群から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列よりなるＣＤＲ－Ｌ１、配列番号７のアミノ酸配列よりなるＦＲ－Ｌ２、配列番号１８のアミノ酸配列よりなるＣＤＲ－Ｌ２、配列番号８のアミノ酸配列よりなるＦＲ－Ｌ３、配列番号１９のアミノ酸配列よりなるＣＤＲ－Ｌ３及び配列番号９のアミノ酸配列よりなるＦＲ－Ｌ４を含む
   軽鎖可変領域；
   を含む、請求項１に記載のヒト化抗体又はこの抗原結合断片。
3. 前記重鎖可変領域は、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２及び配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含み、
   前記軽鎖可変領域は、配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２及び配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含むものである、請求項１に記載のヒト化抗体又はこの抗原結合断片。
4. 前記重鎖可変領域は、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２及び配列番号２３よりなる群から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列を含むものであり、
   前記軽鎖可変領域は、配列番号２４、配列番号２５及び配列番号２６よりなる群から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列を含むものである、請求項１に記載のヒト化抗体又はこの抗原結合断片。
5. 前記重鎖可変領域は、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２及び配列番号２３よりなる群から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列よりなるものであり、
   前記軽鎖可変領域は、配列番号２４、配列番号２５及び配列番号２６よりなる群から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列よりなるものである、請求項１に記載のヒト化抗体又はこの抗原結合断片。
6. 前記ヒト化抗体は、配列番号２７のアミノ酸配列を含む重鎖不変領域及び配列番号２８のアミノ酸配列を含む軽鎖不変領域より構成される群から選択される少なくとも１つを含むものである、請求項１から５のいずれか１項に記載のヒト化抗体又はこの抗原結合断片。
7. 前記抗原結合断片は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）_２及びＦｖよりなる群から選択されるいずれか１つのものである、請求項１から５のいずれか１項に記載の抗体又はこの抗原結合断片。
8. 前記抗体又はこの抗原結合断片は、平衡解離定数（ＫＤ）が２．４×１０^－８Ｍ以下のものである、請求項１から５のいずれか１項に記載の抗体又はこの抗原結合断片。
9. 請求項１から５のいずれか１項に記載のヒト化抗体又はこの抗原結合断片を暗号化する塩基配列を含む、ポリヌクレオチド。
10. 請求項９に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
11. 請求項１０に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
12. 請求項１１に記載の宿主細胞を培養する段階を含む、ＴＭ４ＳＦ４（ＴｒａｎｓＭｅｍｂｒａｎｅ ４ Ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ Ｍｅｍｂｅｒ ４）に特異的に結合する、ヒト化抗体又はこの抗原結合断片を生産する方法。
13. 請求項１から５のいずれか１項に記載のヒト化抗体又はこの抗原結合断片を含む、ＴＭ４ＳＦ４検出用組成物。
14. 請求項１３に記載のＴＭ４ＳＦ４検出用組成物を含む、ＴＭ４ＳＦ４検出用キット。
15. 請求項１から５のいずれか１項に記載のヒト化抗体又はこの抗原結合断片を、ＴＭ４ＳＦ４が含まれているものと予想される検出対象試料と接触させる段階を含む、ＴＭ４ＳＦ４を検出する方法。
16. 請求項１から５のいずれか１項に記載のヒト化抗体又はこの抗原結合断片を含む、癌の予防又は治療用薬学的組成物。
17. 前記癌の予防又は治療は、癌治療途中の癌化学耐性、癌治療後の癌化学耐性、癌再発及び癌転移よりなる群から選択される少なくとも１つを予防するか治療するものである、請求項１６に記載の癌の予防又は治療用薬学的組成物。
18. 前記癌は、肺癌、胃癌、卵巣癌、子宮頸部癌、乳癌、すい臓癌、大腸癌、結腸癌、食道癌、皮膚癌、甲状腺癌、腎臓癌、肝癌、頭頸部癌、膀胱癌、前立腺癌、血液癌、多発性骨髓腫、急性骨髓性白血病、悪性リンパ腫、胸腺癌、骨肉腫、繊維質腫瘍及び脳癌よりなる群から選択される少なくとも１つのものである、請求項１６に記載の癌の予防又は治療用薬学的組成物。
19. 請求項１から５のいずれか１項に記載のヒト化抗体又はこの抗原結合断片を含む、癌幹細胞成長抑制用組成物。
20. 請求項１から５のいずれか１項に記載のヒト化抗体又はこの抗原結合断片を含む、放射線抗癌治療補助用組成物。
21. 前記ヒト化抗体又はこの抗原結合断片は、癌幹細胞を含む癌細胞の放射線に対する敏感度を増進させるものである、請求項２０に記載の放射線抗癌治療補助用組成物。