JP7681069B2 - 抗ペリオスチン抗体及びその使用 - Google Patents

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年１２月１４日に出願された米国仮出願番号第６２/７７９，９９６号、及び２０１９年９月１１日に出願された米国仮出願番号第６２/８９９，０７５号の恩典を主張し、これらは全て、その全体が参照によりここに組み入れられる。

背景
ペリオスチン（ＰＯＳＴＮ）は、上皮間葉転換（ＥＭＴ）、細胞・マトリックス相互作用、及び炎症をはじめとする、多くの病理学的プロセスに関与する多細胞タンパク質である。ＰＯＳＴＮは、炎症、線維症、及びがんを含む、いくつかの病的状況において過剰発現され、ここでそれは、悪い予後に相関する。がんにおいて、ＰＯＳＴＮは典型的には、がん関連線維芽細胞（ＣＡＦ）などの間質細胞によって発現されるが、ＰＯＳＴＮの発現はまた、がん惹起細胞（ＣＩＣ）及び骨髄由来免疫抑制細胞においても報告されている。ＰＯＳＴＮは、フィブロネクチン及びコラーゲンなどの他のマトリクス細胞タンパク質に結合することによって細胞外基質再構築を調節し、インテグリン受容体リガンドとして作用して、細胞の生存、遊走／浸潤、上皮間葉転換、血管新生、及び免疫細胞の動員を促進する。ＰＯＳＴＮは、免疫の排除を促進することによって、及び腫瘍浸潤骨髄球系細胞による免疫抑制を増加させることによって、抗腫瘍免疫を抑制することを含む、がんの生物学の複数の側面に対して作用することによって、腫瘍の増殖及び進行を駆動すると仮定されている。

要約
本明細書には、インテグリンにより媒介される細胞接着などの、ペリオスチンの機能を阻害する抗体が記載されている。このような抗体は、がんの処置に有用である。本明細書に記載の抗ペリオスチン抗体は、腫瘍のコラーゲン含量を減少させ、マクロファージのＭ１表現型への極性化を増加させつつ、顆粒球細胞及び腫瘍関連マクロファージなどの抑制性骨髄系細胞集団の浸潤を減少させ、腫瘍浸潤Ｔ細胞の蓄積及び抗腫瘍特性を増加させる。

本明細書には、ペリオスチンに結合する組換え抗体又はその抗原結合断片が記載され、ここでの該抗体又はその抗原結合断片は、配列番号１（GYTFTSYG）に示されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖ＣＤＲ１（ＣＤＲ－Ｈ１）；配列番号２（ISAYNGNT）、３（ISAYSGNT）、４（ISAYQGNT）、５（ISAYTGNT）、又は６（ISAYDGNT）のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖ＣＤＲ２（ＣＤＲ－Ｈ２）；配列番号７（DILVVPFDY）、８（DVLVVPFDY）、又は９（DMLVVPFDY）のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖ＣＤＲ３（ＣＤＲ－Ｈ３）；配列番号１０（SSDIGSNR）に示されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖ＣＤＲ１（ＣＤＲ－Ｌ１）；配列番号１１（SND）に示されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖ＣＤＲ２（ＣＤＲ－Ｌ２）；及び配列番号１２（AAWDDSLSTYV）に示されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖ＣＤＲ３（ＣＤＲ－Ｌ３）を含む。いくつかの実施態様では、該抗体又はその抗原結合断片は、配列番号１（GYTFTSYG）に示されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖ＣＤＲ１（ＣＤＲ－Ｈ１）；配列番号２（ISAYNGNT）に示されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖ＣＤＲ２（ＣＤＲ－Ｈ２）；配列番号９（DMLVVPFDY）に示されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖ＣＤＲ３（ＣＤＲ－Ｈ３）；配列番号１０（SSDIGSNR）に示されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖ＣＤＲ１（ＣＤＲ－Ｌ１）；配列番号１１（SND）に示されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖ＣＤＲ２（ＣＤＲ－Ｌ２）；及び配列番号１２（AAWDDSLSTYV）に示されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖ＣＤＲ３（ＣＤＲ－Ｌ３）を含む。いくつかの実施態様では、該抗体又はその抗原結合断片は、ヒトであるか、キメラであるか、又はヒト化されている。いくつかの実施態様では、該組換え抗体又はその抗原結合断片は、ＩｇＧ抗体である。特定の実施態様では、該組換え抗体又はその抗原結合断片は、該組換え抗体又はその抗原結合断片の１つ以上のエフェクター機能を減少させる１つ以上の突然変異を含む。特定の実施態様では、該組換え抗体又はその抗原結合断片の１つ以上のエフェクター機能を減少させる１つ以上の突然変異は、ＥＵの番号付け体系による、ＩｇＧ４のＮ４３４Ａ、Ｎ４３４Ｈ、Ｔ３０７Ａ／Ｅ３８０Ａ／Ｎ４３４Ａ、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ、４３３Ｋ／４３４Ｆ／４３６Ｈ、Ｔ２５０Ｑ、Ｔ２５０Ｆ、Ｍ４２８Ｌ、Ｍ４２８Ｆ、Ｔ２５０Ｑ／Ｍ４２８Ｌ、Ｎ４３４Ｓ、Ｖ３０８Ｗ、Ｖ３０８Ｙ、Ｖ３０８Ｆ、Ｍ２５２Ｙ／Ｍ４２８Ｌ、Ｄ２５９Ｉ／Ｖ３０８Ｆ、Ｍ４２８Ｌ／Ｖ３０８Ｆ、Ｑ３１１Ｖ／Ｎ４３４Ｓ、Ｔ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ａ、Ｅ２５８Ｆ／Ｖ４２７Ｔ、Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、Ｓ２２８Ｐ／Ｌ２３５Ｅ／Ｒ４０９Ｋ、Ｓ２２８Ｐ／Ｌ２３５Ｅ、Ｋ３７０Ｑ、Ｋ３７０Ｅ、Ｇ４４６の欠失、Ｋ４４７の欠失、及びその組合せから選択された１つ以上の突然変異又は突然変異のセットを含む。特定の実施態様では、該組換え抗体又はその抗原結合断片の１つ以上のエフェクター機能を減少させる１つ以上の突然変異は、ＥＵの番号付け体系による、ＩｇＧ４のＳ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、及びＬ２３５Ａの突然変異を含む。いくつかの実施態様では、該組換え抗体又はその抗原結合断片は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）_２、単一ドメイン抗体、又は一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である。いくつかの実施態様では、該抗体又はその抗原結合断片は、免疫グロブリン重鎖可変領域及び免疫グロブリン軽鎖可変領域を含み、ここでの免疫グロブリン重鎖可変領域は、配列番号１３に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％、９５％、９７％、９９％同一であるか、又は１００％同一である、アミノ酸配列を含み；そして、ここでの免疫グロブリン軽鎖可変領域は、配列番号１４に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％、９５％、９７％、９９％同一であるか、又は１００％同一である、アミノ酸配列を含み、ここでの配列番号１３のアミノ酸残基番号５５のアミノ酸は、アスパラギン、セリン、グルタミン、トレオニン、又はアスパラギン酸であり、ここでの配列番号１３のアミノ酸残基番号１００のアミノ酸は、メチオニン、イソロイシン、又はバリンである。いくつかの実施態様では、該組換え抗体又はその抗原結合断片は、ペリオスチンに対する特異的な結合のために、配列番号１５の以下の残基（Ｎ２７６、Ｒ２８４、Ｅ２８８、Ｌ２８７、Ｖ２９５又はＫ３０２）の中の少なくとも１つを必要とする。いくつかの実施態様では、該組換え抗体又はその抗原結合断片は、ペリオスチンに対する特異的な結合のために、配列番号１５の以下の残基（Ｎ２７６、Ｒ２８４、Ｅ２８８、Ｌ２８７、Ｖ２９５又はＫ３０２）の中の少なくとも２つ、３つ、４つ、又は５つを必要とする。いくつかの実施態様では、該組換え抗体又はその抗原結合抗体は、ペリオスチンに対する特異的な結合のために、配列番号１５の以下の残基（Ｎ２７６、Ｒ２８４、Ｅ２８８、Ｌ２８７、Ｖ２９５又はＫ３０２）の少なくとも全部を必要とする。本明細書には、該組換え抗体又はその抗原結合断片と薬学的に許容される賦形剤、担体、又は希釈剤とを含む、医薬組成物が記載されている。いくつかの実施態様では、該医薬組成物は、静脈内投与用に製剤化されている。いくつかの実施態様では、該医薬組成物は、皮下投与用に製剤化されている。いくつかの実施態様では、該医薬組成物は、腫瘍内投与用に製剤化されている。本明細書には、腫瘍内のコラーゲン含量を減少させるのに使用するための、該組換え抗体若しくはその抗原結合断片又は医薬組成物も記載されている。いくつかの実施態様では、該組換え抗体若しくはその抗原結合断片又は医薬組成物は、がんを処置するのに使用するためのものである。いくつかの実施態様では、がんは、神経膠芽腫、膵臓がん、乳がん、膀胱がん、腎臓がん、頭頸部がん、卵巣がん、皮膚がん、胃がん、中皮腫、肝臓がん、子宮内膜がん、大腸がん、子宮頸がん、前立腺がん、又は肺がんを含む。本明細書には、該組換え抗体若しくはその抗原結合断片又は医薬組成物を個体に投与する工程を含む、個体の腫瘍内のコラーゲン含量を減少させる方法も記載されている。本明細書には、該組換え抗体若しくはその抗原結合断片又は医薬組成物を個体に投与する工程を含む、個体の腫瘍内のＭ１マクロファージ表現型を増加させる及び／又はＭ２マクロファージ表現型を減少させる方法も記載されている。本明細書には、該組換え抗体若しくはその抗原結合断片又は医薬組成物を個体に投与する工程を含む、個体における抑制性顆粒球系骨髄球系細胞及び／又は腫瘍関連マクロファージの蓄積を減少させる方法も記載されている。本明細書には、該組換え抗体若しくはその抗原結合断片又は医薬組成物を個体に投与する工程を含む、個体の腫瘍内のＣＤ４陽性及び／又はＣＤ８陽性Ｔ細胞の出現頻度を増加させる方法も記載されている。本明細書には、該組換え抗体若しくはその抗原結合断片又は医薬組成物を個体に投与する工程を含む、個体におけるＣＤ８陽性Ｔ細胞によるインターフェロンγの発現及び／又は放出によって測定されるような、腫瘍内のＣＤ８陽性Ｔ細胞の機能を高める方法も記載されている。本明細書には、該組換え抗体若しくはその抗原結合断片又は医薬組成物の治療有効量を個体に投与する工程を含む、個体におけるがんの処置法も記載されている。いくつかの実施態様では、がんは、神経膠芽腫、膵臓がん、乳がん、膀胱がん、腎臓がん、頭頸部がん、卵巣がん、皮膚がん、胃がん、中皮腫、肝臓がん、子宮内膜がん、大腸がん、子宮頸がん、前立腺がん、又は肺がんを含む。本明細書には、該組換え抗体又はその抗原結合断片と薬学的に許容される賦形剤、担体、又は希釈剤とを混合する工程を含む、腫瘍内のコラーゲン含量を減少させるための組成物を作製する方法も記載されている。本明細書には、該組換え抗体又はその抗原結合断片と薬学的に許容される賦形剤、担体、又は希釈剤とを混合する工程を含む、腫瘍内のＭ１マクロファージ表現型を増加させるための及び／又はＭ２マクロファージ表現型を減少させるための組成物を作製する方法も記載されている。本明細書には、該組換え抗体又はその抗原結合断片と薬学的に許容される賦形剤、担体、又は希釈剤とを混合する工程を含む、個体における抑制性顆粒球系骨髄球系細胞及び／又は腫瘍関連マクロファージの蓄積を減少させるための組成物を作製する方法も記載されている。本明細書には、該組換え抗体又はその抗原結合断片と薬学的に許容される賦形剤、担体、又は希釈剤とを混合する工程を含む、個体の腫瘍内におけるＣＤ４陽性及び／又はＣＤ８陽性Ｔ細胞の出現頻度を増加させるための組成物を作製する方法も記載されている。本明細書には、該組換え抗体又はその抗原結合断片と薬学的に許容される賦形剤、担体、又は希釈剤とを混合する工程を含む、個体におけるＣＤ８陽性Ｔ細胞によるインターフェロンγの発現及び／又は放出によって測定されるような、腫瘍内のＣＤ８陽性Ｔ細胞の機能を高めるための組成物を作製する方法も記載されている。本明細書には、該組換え抗体又はその抗原結合断片と薬学的に許容される賦形剤、担体、又は希釈剤とを混合する工程を含む、がんを処置するための組成物を作製する方法も記載されている。いくつかの実施態様では、がんは、神経膠芽腫、膵臓がん、乳がん、膀胱がん、腎臓がん、頭頸部がん、卵巣がん、皮膚がん、胃がん、中皮腫、肝臓がん、子宮内膜がん、大腸がん、子宮頸がん、前立腺がん、又は肺がんを含む。

本明細書には、免疫グロブリン重鎖可変領域及び免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む、ペリオスチンに結合する組換え抗体又はその抗原結合断片も記載され、ここでの免疫グロブリン重鎖可変領域は、配列番号１３に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％、９５％、９７％、９９％同一であるか、又は１００％同一である、アミノ酸配列を含み；そして、ここでの免疫グロブリン軽鎖可変領域は、配列番号１４に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％、９５％、９７％、９９％同一であるか、又は１００％同一である、アミノ酸配列を含み、ここでの配列番号１３のアミノ酸残基番号５５は、アスパラギン、セリン、グルタミン、トレオニン、又はアスパラギン酸であり、ここでの配列番号１３のアミノ酸残基番号１００は、メチオニン、イソロイシン、又はバリンである。いくつかの実施態様では、該組換え抗体又はその抗原結合断片はヒト抗体である。いくつかの実施態様では、該組換え抗体又はその抗原結合断片は、ＩｇＧ抗体である。特定の実施態様では、該組換え抗体又はその抗原結合断片は、該組換え抗体又はその抗原結合断片の１つ以上のエフェクター機能を減少させる１つ以上の突然変異を含む。特定の実施態様では、該組換え抗体又はその抗原結合断片の１つ以上のエフェクター機能を減少させる１つ以上の突然変異は、ＥＵの番号付け体系による、ＩｇＧ４のＮ４３４Ａ、Ｎ４３４Ｈ、Ｔ３０７Ａ／Ｅ３８０Ａ／Ｎ４３４Ａ、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ、４３３Ｋ／４３４Ｆ／４３６Ｈ、Ｔ２５０Ｑ、Ｔ２５０Ｆ、Ｍ４２８Ｌ、Ｍ４２８Ｆ、Ｔ２５０Ｑ／Ｍ４２８Ｌ、Ｎ４３４Ｓ、Ｖ３０８Ｗ、Ｖ３０８Ｙ、Ｖ３０８Ｆ、Ｍ２５２Ｙ／Ｍ４２８Ｌ、Ｄ２５９Ｉ／Ｖ３０８Ｆ、Ｍ４２８Ｌ／Ｖ３０８Ｆ、Ｑ３１１Ｖ／Ｎ４３４Ｓ、Ｔ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ａ、Ｅ２５８Ｆ／Ｖ４２７Ｔ、Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、Ｓ２２８Ｐ／Ｌ２３５Ｅ／Ｒ４０９Ｋ、Ｓ２２８Ｐ／Ｌ２３５Ｅ、Ｋ３７０Ｑ、Ｋ３７０Ｅ、Ｇ４４６の欠失、Ｋ４４７の欠失、及びその組合せから選択された１つ以上の突然変異又は突然変異のセットを含む。特定の実施態様では、該組換え抗体又はその抗原結合断片の１つ以上のエフェクター機能を減少させる１つ以上の突然変異は、ＥＵの番号付け体系による、ＩｇＧ４のＳ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、及びＬ２３５Ａの突然変異を含む。いくつかの実施態様では、該組換え抗体又はその抗原結合断片は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）_２、単一ドメイン抗体、又は一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である。本明細書には、該組換え抗体又はその抗原結合断片と、薬学的に許容される賦形剤、担体、又は希釈剤とを含む、医薬組成物も記載されている。いくつかの実施態様では、該医薬組成物は、静脈内投与用に製剤化されている。いくつかの実施態様では、該医薬組成物は、皮下投与用に製剤化されている。いくつかの実施態様では、該医薬組成物は、腫瘍内投与用に製剤化されている。本明細書には、腫瘍内のコラーゲン含量を減少させるのに使用するための、該組換え抗体若しくはその抗原結合断片又は医薬組成物も記載されている。いくつかの実施態様では、該組換え抗体若しくはその抗原結合断片又は医薬組成物は、がんを処置するのに使用するためのものである。いくつかの実施態様では、がんは、神経膠芽腫、膵臓がん、乳がん、膀胱がん、腎臓がん、頭頸部がん、卵巣がん、皮膚がん、胃がん、中皮腫、肝臓がん、子宮内膜がん、大腸がん、子宮頸がん、前立腺がん、又は肺がんを含む。本明細書には、該組換え抗体若しくはその抗原結合断片又は医薬組成物を個体に投与する工程を含む、個体の腫瘍内のコラーゲン含量を減少させる方法も記載されている。本明細書には、該組換え抗体若しくはその抗原結合断片又は医薬組成物を個体に投与する工程を含む、個体の腫瘍内のＭ１マクロファージ表現型を増加させる及び／又はＭ２マクロファージ表現型を減少させる方法も記載されている。本明細書には、該組換え抗体若しくはその抗原結合断片又は医薬組成物を個体に投与する工程を含む、個体における抑制性顆粒球系骨髄球系細胞及び／又は腫瘍関連マクロファージの蓄積を減少させる方法も記載されている。本明細書には、該組換え抗体若しくはその抗原結合断片又は医薬組成物を個体に投与する工程を含む、個体の腫瘍内におけるＣＤ４陽性及び／又はＣＤ８陽性Ｔ細胞の出現頻度を増加させる方法も記載されている。本明細書には、該組換え抗体若しくはその抗原結合断片又は医薬組成物を個体に投与する工程を含む、個体におけるＣＤ８陽性Ｔ細胞によるインターフェロンγの発現及び／又は放出によって測定されるような、腫瘍内のＣＤ８陽性Ｔ細胞の機能を高める方法も記載されている。本明細書には、該組換え抗体若しくはその抗原結合断片又は医薬組成物の治療有効量を個体に投与する工程を含む、個体におけるがんの処置法も記載されている。いくつかの実施態様では、がんは、神経膠芽腫、膵臓がん、乳がん、膀胱がん、腎臓がん、頭頸部がん、卵巣がん、皮膚がん、胃がん、中皮腫、肝臓がん、子宮内膜がん、大腸がん、子宮頸がん、前立腺がん、又は肺がんを含む。本明細書には、該組換え抗体又はその抗原結合断片と薬学的に許容される賦形剤、担体、又は希釈剤とを混合する工程を含む、腫瘍内のコラーゲン含量を減少させるための組成物を作製する方法も記載されている。本明細書には、該組換え抗体又はその抗原結合断片と薬学的に許容される賦形剤、担体、又は希釈剤とを混合する工程を含む、腫瘍内のＭ１マクロファージ表現型を増加させるための及び／又はＭ２マクロファージ表現型を減少させるための組成物を作製する方法も記載されている。本明細書には、該組換え抗体又はその抗原結合断片と薬学的に許容される賦形剤、担体、又は希釈剤とを混合する工程を含む、個体における抑制性顆粒球系骨髄球系細胞及び／又は腫瘍関連マクロファージの蓄積を減少させるための組成物を作製する方法も記載されている。本明細書には、該組換え抗体又はその抗原結合断片と薬学的に許容される賦形剤、担体、又は希釈剤とを混合する工程を含む、個体の腫瘍内におけるＣＤ４陽性及び／又はＣＤ８陽性Ｔ細胞の出現頻度を増加させるための組成物を作製する方法も記載されている。本明細書には、該組換え抗体又はその抗原結合断片と薬学的に許容される賦形剤、担体、又は希釈剤とを混合する工程を含む、個体におけるＣＤ８陽性Ｔ細胞によるインターフェロンγの発現及び／又は放出によって測定されるような、腫瘍内のＣＤ８陽性Ｔ細胞の機能を高めるための組成物を作製する方法も記載されている。本明細書には、該組換え抗体又はその抗原結合断片と薬学的に許容される賦形剤、担体、又は希釈剤とを混合する工程を含む、がんを処置するための組成物を作製する方法も記載されている。いくつかの実施態様では、がんは、神経膠芽腫、膵臓がん、乳がん、膀胱がん、腎臓がん、頭頸部がん、卵巣がん、皮膚がん、胃がん、中皮腫、肝臓がん、子宮内膜がん、大腸がん、子宮頸がん、前立腺がん、又は肺がんを含む。

本明細書には、ペリオスチンに結合する組換え抗体又はその抗原結合断片も記載され、ここではペリオスチンに結合した場合、該組換え抗体又はその抗原結合断片は、ペリオスチンのファシクリン２（ＦＡＳ２）ドメインに結合する。いくつかの実施態様では、該組換え抗体又はその抗原結合断片は、ペリオスチン（配列番号１５）のアミノ酸残基２７６～３０２の間の（境界の数字を含む）、任意の残基に結合する。いくつかの実施態様では、該組換え抗体又はその抗原結合断片は、ペリオスチンに結合すると、ペリオスチン（配列番号１５）の以下の残基（Ｎ２７６、Ｒ２８４、Ｅ２８８、Ｌ２８７、Ｖ２９５又はＫ３０２）の少なくとも１つに結合する。いくつかの実施態様では、該組換え抗体又はその抗原結合断片は、ペリオスチンに結合すると、ペリオスチン（配列番号１５）の以下の残基（Ｎ２７６、Ｒ２８４、Ｅ２８８、Ｌ２８７、Ｖ２９５又はＫ３０２）の中の２つ、３つ、４つ、又は５つに結合する。いくつかの実施態様では、該組換え抗体又はその抗原結合断片は、ペリオスチンに結合すると、ペリオスチン（配列番号１５）の以下の残基（Ｎ２７６、Ｒ２８４、Ｅ２８８、Ｌ２８７、Ｖ２９５又はＫ３０２）の全部に結合する。いくつかの実施態様では、該組換え抗体又はその抗原結合断片は、免疫グロブリン重鎖可変領域及び免疫グロブリン軽鎖可変領域を含み、ここでの免疫グロブリン重鎖可変領域は、配列番号１３に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％、９５％、９７％、９９％同一であるか、又は１００％同一である、アミノ酸配列を含み；そして、ここでの免疫グロブリン軽鎖可変領域は、配列番号１４に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％、９５％、９７％、９９％同一であるか、又は１００％同一である、アミノ酸配列を含み、ここでの配列番号１３のアミノ酸残基番号５５は、アスパラギン、セリン、グルタミン、トレオニン、又はアスパラギン酸であり、ここでの配列番号１３のアミノ酸残基番号１００は、メチオニン、イソロイシン、又はバリンである。いくつかの実施態様では、該抗体又はその抗原結合断片は、配列番号１（GYTFTSYG）に示されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖ＣＤＲ１（ＣＤＲ－Ｈ１）；配列番号２（ISAYNGNT）、３（ISAYSGNT）、４（ISAYQGNT）、５（ISAYTGNT）、又は６（ISAYDGNT）のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖ＣＤＲ２（ＣＤＲ－Ｈ２）；配列番号７（DILVVPFDY）、８（DVLVVPFDY）、又は９（DMLVVPFDY）のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖ＣＤＲ３（ＣＤＲ－Ｈ３）；配列番号１０（SSDIGSNR）に示されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖ＣＤＲ１（ＣＤＲ－Ｌ１）；配列番号１１（SND）に示されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖ＣＤＲ２（ＣＤＲ－Ｌ２）；及び配列番号１２（AAWDDSLSTYV）に示されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖ＣＤＲ３（ＣＤＲ－Ｌ３）を含む。いくつかの実施態様では、該抗体は、ヒト肺線維芽細胞及び／又はマウス線維芽細胞を用いて実施された細胞接着アッセイにおいて、約５０ナノモル未満のＩＣ５０を有する。本明細書には、該組換え抗体又はその抗原結合断片と、薬学的に許容される賦形剤、担体、又は希釈剤とを含む、医薬組成物も記載されている。いくつかの実施態様では、該医薬組成物は、静脈内投与用に製剤化されている。いくつかの実施態様では、該医薬組成物は、皮下投与用に製剤化されている。いくつかの実施態様では、該医薬組成物は、腫瘍内投与用に製剤化されている。本明細書には、腫瘍内のコラーゲン含量を減少させるのに使用するための、該組換え抗体若しくはその抗原結合断片又は医薬組成物も記載されている。いくつかの実施態様では、該組換え抗体若しくはその抗原結合断片又は医薬組成物は、がんを処置するのに使用するためのものである。いくつかの実施態様では、がんは、神経膠芽腫、膵臓がん、乳がん、膀胱がん、腎臓がん、頭頸部がん、卵巣がん、皮膚がん、胃がん、中皮腫、肝臓がん、子宮内膜がん、大腸がん、子宮頸がん、前立腺がん、又は肺がんを含む。本明細書には、該組換え抗体若しくはその抗原結合断片又は医薬組成物を個体に投与する工程を含む、個体の腫瘍内のコラーゲン含量を減少させる方法も記載されている。本明細書には、該組換え抗体若しくはその抗原結合断片又は医薬組成物を個体に投与する工程を含む、個体の腫瘍内のＭ１マクロファージ表現型を増加させる及び／又はＭ２マクロファージ表現型を減少させる方法も記載されている。本明細書には、該組換え抗体若しくはその抗原結合断片又は医薬組成物を個体に投与する工程を含む、個体における抑制性顆粒球系骨髄球系細胞及び／又は腫瘍関連マクロファージの蓄積を減少させる方法も記載されている。本明細書には、該組換え抗体若しくはその抗原結合断片又は医薬組成物を個体に投与する工程を含む、個体の腫瘍内におけるＣＤ４陽性及び／又はＣＤ８陽性Ｔ細胞の出現頻度を増加させる方法も記載されている。本明細書には、該組換え抗体若しくはその抗原結合断片又は医薬組成物を個体に投与する工程を含む、個体におけるＣＤ８陽性Ｔ細胞によるインターフェロンγの発現及び／又は放出によって測定されるような、腫瘍内のＣＤ８陽性Ｔ細胞の機能を高める方法も記載されている。本明細書には、該組換え抗体若しくはその抗原結合断片又は医薬組成物の治療有効量を個体に投与する工程を含む、個体におけるがんの処置法も記載されている。いくつかの実施態様では、がんは、神経膠芽腫、膵臓がん、乳がん、膀胱がん、腎臓がん、頭頸部がん、卵巣がん、皮膚がん、胃がん、中皮腫、肝臓がん、子宮内膜がん、大腸がん、子宮頸がん、前立腺がん、又は肺がんを含む。本明細書には、該組換え抗体又はその抗原結合断片と薬学的に許容される賦形剤、担体、又は希釈剤とを混合する工程を含む、腫瘍内のコラーゲン含量を減少させるための組成物を作製する方法も記載されている。本明細書には、該組換え抗体又はその抗原結合断片と薬学的に許容される賦形剤、担体、又は希釈剤とを混合する工程を含む、腫瘍内のＭ１マクロファージ表現型を増加させるための及び／又はＭ２マクロファージ表現型を減少させるための組成物を作製する方法も記載されている。本明細書には、該組換え抗体又はその抗原結合断片と薬学的に許容される賦形剤、担体、又は希釈剤とを混合する工程を含む、個体における抑制性顆粒球系骨髄球系細胞及び／又は腫瘍関連マクロファージの蓄積を減少させるための組成物を作製する方法も記載されている。本明細書には、該組換え抗体又はその抗原結合断片と薬学的に許容される賦形剤、担体、又は希釈剤とを混合する工程を含む、個体の腫瘍内におけるＣＤ４陽性及び／又はＣＤ８陽性Ｔ細胞の出現頻度を増加させるための組成物を作製する方法も記載されている。本明細書には、該組換え抗体又はその抗原結合断片と薬学的に許容される賦形剤、担体、又は希釈剤とを混合する工程を含む、個体におけるＣＤ８陽性Ｔ細胞によるインターフェロンγの発現及び／又は放出によって測定されるような、腫瘍内のＣＤ８陽性Ｔ細胞の機能を高めるための組成物を作製する方法も記載されている。本明細書には、該組換え抗体又はその抗原結合断片と薬学的に許容される賦形剤、担体、又は希釈剤とを混合する工程を含む、がんを処置するための組成物を作製する方法も記載されている。いくつかの実施態様では、がんは、神経膠芽腫、膵臓がん、乳がん、膀胱がん、腎臓がん、頭頸部がん、卵巣がん、皮膚がん、胃がん、中皮腫、肝臓がん、子宮内膜がん、大腸がん、子宮頸がん、前立腺がん、又は肺がんを含む。

本明細書には、上記の組換え抗体又はその抗原結合断片のいずれか１つをコードしている核酸も記載されている。

本明細書には、上記の核酸を含む細胞株も記載されている。いくつかの実施態様では、該細胞株は、チャイニーズハムスター卵巣細胞株である。本明細書には、該組換え抗体又はその抗原結合断片のいずれか１つの発現及び分泌を可能とするに十分な条件下で、細胞培養培地中で該細胞株をインキュベートする工程を含む、該組換え抗体又はその抗原結合断片を産生する方法も記載されている。

本明細書に記載の新規な特色は特に、添付の特許請求の範囲に示されている。本明細書に記載の特色及び特色の利点のより良い理解は、例示的な実施例（本明細書に記載の特色の原理が利用されている）を示す以下の詳細な説明、及び添付図面を参照することによって得られるだろう。
図１は、５００nMという単一の濃度で試験された、７８個の配列の特有なＩｇＧによる、ペリオスチン（ＰＯＳＴＮ）により媒介される細胞接着の阻害を示す。 図２は、ＮＢ０８２８又はビヒクル対照を用いての処置後の、マウスＭＢ４９膀胱がんモデルにおける腫瘍の増殖を示す。 図３は、腫瘍内骨髄球系細胞の蓄積に対する、ＮＢ０８２８による処置の影響を示す。ＭＢ４９担がんマウスを、図２に記載のように、ＮＢ０８２８又はビヒクルを用いて処置した。データは、総ＣＤ４５陽性免疫浸潤物に対する比率として提示される。 図４は、ＮＢ０８２８を用いての処置後の、腫瘍コラーゲン総含量の変化を示す。ＭＢ４９担がんマウスを、図２に記載のように処置し、終点のＭＢ４９腫瘍の腫瘍内総コラーゲン含量を、方法に記載のように評価した。 図５は、ＮＢ０８２８又はビヒクル対照を用いての処置後の、マウスＣＴ２６大腸がんモデルにおける腫瘍の増殖を示す。 図６は、ＮＢ０８２８により処置されたＣＴ２６担がんマウスにおける、顆粒球細胞／ＴＡＭ（腫瘍関連マクロファージ）の減少した腫瘍内蓄積、及びマクロファージのＭ１表現型への偏向を示す。 図７は、ＮＢ０８２８により処置されたＣＴ２６担がんマウスにおける、ＣＤ８陽性及びＣＤ４陽性浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の増加した蓄積、並びに増強されたＣＤ８陽性腫瘍浸潤リンパ球機能を示す。 図８は、ＮＢ０８２８又はビヒクル対照を用いての処置後の、マウスＭＣ３８大腸がんモデルにおける腫瘍の増殖を示す。 図９Ａ～９Ｄは、ＭＣ３８大腸がんモデルにおいて、ＮＢ０８２８が、炎症誘発性Ｉ型マクロファージの出現頻度（９Ｂ）及びＣＤ８陽性Ｔ細胞の出現頻度（９Ｃ）を増加させつつ、腫瘍関連マクロファージの総量を減少させること（９Ａ）、並びに、ＮＢ０８２８の腫瘍に対する有効性が、ＣＤ８陽性Ｔ細胞に依存すること（９Ｄ）を示す。 図９Ａ～９Ｄは、ＭＣ３８大腸がんモデルにおいて、ＮＢ０８２８が、炎症誘発性Ｉ型マクロファージの出現頻度（９Ｂ）及びＣＤ８陽性Ｔ細胞の出現頻度（９Ｃ）を増加させつつ、腫瘍関連マクロファージの総量を減少させること（９Ａ）、並びに、ＮＢ０８２８の腫瘍に対する有効性が、ＣＤ８陽性Ｔ細胞に依存すること（９Ｄ）を示す。 図９Ａ～９Ｄは、ＭＣ３８大腸がんモデルにおいて、ＮＢ０８２８が、炎症誘発性Ｉ型マクロファージの出現頻度（９Ｂ）及びＣＤ８陽性Ｔ細胞の出現頻度（９Ｃ）を増加させつつ、腫瘍関連マクロファージの総量を減少させること（９Ａ）、並びに、ＮＢ０８２８の腫瘍に対する有効性が、ＣＤ８陽性Ｔ細胞に依存すること（９Ｄ）を示す。 図９Ａ～９Ｄは、ＭＣ３８大腸がんモデルにおいて、ＮＢ０８２８が、炎症誘発性Ｉ型マクロファージの出現頻度（９Ｂ）及びＣＤ８陽性Ｔ細胞の出現頻度（９Ｃ）を増加させつつ、腫瘍関連マクロファージの総量を減少させること（９Ａ）、並びに、ＮＢ０８２８の腫瘍に対する有効性が、ＣＤ８陽性Ｔ細胞に依存すること（９Ｄ）を示す。 図１０は、エピトープマッピング研究のための、形質転換増殖因子β誘導タンパク質（ＢＩＧＨ３）／ペリオスチンキメラを作製するための図を示す。 図１１Ａ～１１Ｃは、ペリオスチンのＦＡＳ２ドメインに対するＮＢ０８２８の結合を示す。１１Ａは、図１０で作製されたキメラタンパク質に対するＮＢ０８２８の結合を示し、一方、図１１Ｂ及び１１Ｃは、ＰＯＳＴＮ ＥＭＩ－ＦＡＳ４のＦＡＳ２ドメイン内のアラニン突然変異に対するＮＢ０８２８の結合を示す。 図１１Ａ～１１Ｃは、ペリオスチンのＦＡＳ２ドメインに対するＮＢ０８２８の結合を示す。１１Ａは、図１０で作製されたキメラタンパク質に対するＮＢ０８２８の結合を示し、一方、図１１Ｂ及び１１Ｃは、ＰＯＳＴＮ ＥＭＩ－ＦＡＳ４のＦＡＳ２ドメイン内のアラニン突然変異に対するＮＢ０８２８の結合を示す。 図１１Ａ～１１Ｃは、ペリオスチンのＦＡＳ２ドメインに対するＮＢ０８２８の結合を示す。１１Ａは、図１０で作製されたキメラタンパク質に対するＮＢ０８２８の結合を示し、一方、図１１Ｂ及び１１Ｃは、ＰＯＳＴＮ ＥＭＩ－ＦＡＳ４のＦＡＳ２ドメイン内のアラニン突然変異に対するＮＢ０８２８の結合を示す。 図１２は、二量体ＰＯＳＴＮ ＥＭＩ－ＦＡＳ４の結晶構造を示し、ＮＢ０８２８エピトープの位置が、下半分の箇所に四角で囲まれ拡大されている。 図１３Ａ及び１３Ｂは、ペリオスチンに対するヒトテネイシンＣの結合ＥＣ８０、及びＮＢ０８２８の機能遮断活性（１３Ａ）、及びペリオスチンに対するヒトＩ型コラーゲンの結合ＥＣ８０、及びＮＢ０８２８の機能遮断活性（１３Ｂ）を示す。 図１３Ａ及び１３Ｂは、ペリオスチンに対するヒトテネイシンＣの結合ＥＣ８０、及びＮＢ０８２８の機能遮断活性（１３Ａ）、及びペリオスチンに対するヒトＩ型コラーゲンの結合ＥＣ８０、及びＮＢ０８２８の機能遮断活性（１３Ｂ）を示す。 図１４Ａは、免疫組織化学検査によって測定されるような、様々な種類の腫瘍におけるペリオスチンの発現の広がりを示す。 図１４Ｂは、ペリオスチンを低度に、中程度に、及び高度に発現している乳がん試料上の免疫組織化学的検査の染色の代表的な図を示す。

詳細な説明
本明細書には、ペリオスチンに結合する組換え抗体又はその抗原結合断片が記載され、ここでの該抗体又はその抗原結合断片は、（ａ）配列番号１（GYTFTSYG）に示されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖ＣＤＲ１（ＣＤＲ－Ｈ１）；（ｂ）配列番号２（ISAYNGNT）、３（ISAYSGNT）、４（ISAYQGNT）、５（ISAYTGNT）、又は６（ISAYDGNT）のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖ＣＤＲ２（ＣＤＲ－Ｈ２）；（ｃ）配列番号７（DILVVPFDY）、８（DVLVVPFDY）、又は９（DMLVVPFDY）のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖ＣＤＲ３（ＣＤＲ－Ｈ３）；（ｄ）配列番号１０（SSDIGSNR）に示されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖ＣＤＲ１（ＣＤＲ－Ｌ１）；（ｅ）配列番号１１（SND）に示されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖ＣＤＲ２（ＣＤＲ－Ｌ２）；及び（ｆ）配列番号１２（AAWDDSLSTYV）に示されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖ＣＤＲ３（ＣＤＲ－Ｌ３）を含む。

本明細書には、ペリオスチンに結合する組換え抗体又はその抗原結合断片が記載され、ここでの該抗体又はその抗原結合断片は、（ａ）配列番号１（GYTFTSYG）に示されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖ＣＤＲ１（ＣＤＲ－Ｈ１）；（ｂ）配列番号１６（ISAYXGNT）に示されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖ＣＤＲ２（ＣＤＲ－Ｈ２）；（ｃ）配列番号１７（DXLVVPFDY）に示されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖ＣＤＲ３（ＣＤＲ－Ｈ３）；（ｄ）配列番号１０（SSDIGSNR）に示されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖ＣＤＲ１（ＣＤＲ－Ｌ１）；（ｅ）配列番号１１（SND）に示されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖ＣＤＲ２（ＣＤＲ－Ｌ２）；及び（ｆ）配列番号１２（AAWDDSLSTYV）に示されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖ＣＤＲ３（ＣＤＲ－Ｌ３）、のいずれか１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つを含み、ここでのＸは任意のアミノ酸残基である。

本明細書には、免疫グロブリン重鎖可変領域及び免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む、ペリオスチンに結合する組換え抗体又はその抗原結合断片が記載され、（ａ）ここでの免疫グロブリン重鎖可変領域は、配列番号１３に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％、９５％、９７％、９９％同一であるか、又は１００％同一である、アミノ酸配列を含み；そして、（ｂ）ここでの免疫グロブリン軽鎖可変領域は、配列番号１４に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％、９５％、９７％、９９％同一であるか、又は１００％同一である、アミノ酸配列を含み、ここでの配列番号１３のアミノ酸残基番号５５は、アスパラギン、セリン、グルタミン、トレオニン、若しくはアスパラギン酸であるか、又は配列番号１３のアミノ酸残基番号１００は、メチオニン、イソロイシン、若しくはバリンである。

本明細書には、免疫グロブリン重鎖可変領域及び免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む、ペリオスチンに結合する組換え抗体又はその抗原結合断片も記載され、（ａ）ここでの免疫グロブリン重鎖可変領域は、配列番号１３に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％、９５％、９７％、９９％同一であるか、又は１００％同一である、アミノ酸配列を含み；そして、（ｂ）ここでの免疫グロブリン軽鎖可変領域は、配列番号１４に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％、９５％、９７％、９９％同一であるか、又は１００％同一である、アミノ酸配列を含む。

本明細書には、免疫グロブリン重鎖可変領域及び免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む、ペリオスチンに結合する組換え抗体又はその抗原結合断片が記載され、（ａ）ここでの免疫グロブリン重鎖可変領域は、配列番号１３に示されるアミノ酸配列に対して同一であるアミノ酸配列を含み；そして、（ｂ）ここでの免疫グロブリン軽鎖可変領域は、配列番号１４に示されるアミノ酸配列に対して同一であるアミノ酸配列を含む。

本明細書には、ペリオスチンのファシクリン２（ＦＡＳ２）ドメインに結合する組換え抗体又はその抗原結合断片が記載されている。特定の実施態様では、該組換え抗体又はその抗原結合断片は、ペリオスチンに結合した場合、配列番号１５のアミノ酸２７６～３０２から選択されたアミノ酸残基と接触する。特定の実施態様では、該組換え抗体又はその抗原結合断片は、ペリオスチンに結合した場合、配列番号１５の以下のアミノ酸残基（Ｎ２７６、Ｒ２８４、Ｅ２８８、Ｌ２８７、Ｖ２９５、又はＫ３０２）の１つと接触する。

以下の記載において、特定の具体的な詳細が、様々な実施態様の完全な理解を提供するために示されている。しかしながら、当業者は、提供されている実施例が、これらの詳細を用いることなく実施され得ることを理解しているだろう。内容からそうではないことが必要とされない限り、明細書及び続く特許請求の範囲の全体を通して、「含む（comprise）」という単語及びその変化形、例えば「含む（comprises）」及び「含んでいる（comprising）」は、オープンで包含的な意味で、すなわち「を含むがこれらに限定されない」と捉えられるべきである。本明細書及び添付の特許請求の範囲に使用されているように、単数形の「１つの（ａ）」、「１つの（an）」及び「その（the）」は、内容から明らかにそうではないことが示されない限り、複数の対象物も含む。また、「又は」という用語は、一般的に、内容から明らかにそうではないことが示されない限り、「及び／又は」を含むその意味で使用されることが注記されるべきである。さらに、本明細書に提供される見出しは、単に簡便のためであり、請求された実施態様の範囲又は意味を解釈するものではない。

本明細書において使用する「約」という用語は、記載の量に１０％以下だけ近い量を指す。

本明細書において使用する「個体」、「患者」又は「被験者」という用語は、記載の組成物及び方法が処置のために有用である少なくとも１つの疾患と診断されたか、罹患していることが疑われているか、又は発症するリスクのある個体を指す。特定の実施態様では、該個体は哺乳動物である。特定の実施態様では、該哺乳動物はマウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ラマ、アルパカ、又はヤクである。特定の実施態様では、該個体はヒトである。

本明細書において使用する「処置する」又は「処置している」という用語は、個体の生理学的状態又は疾患状態に伴う少なくとも１つの兆候又は症状を寛解するように設計されたか又は寛解することを目的とした、個体の生理学的状態又は疾患状態への介入を指す。当業者は、疾患に罹患している不均一な個体の集団を考えると、全ての個体が所与の処置に対して等しく応答しないであろうか、又は全く応答しないであろうことを認識しているだろう。個体は、任意の客観的な応答基準に関わらず、処置されるべきと考えられる。

提供される抗体には、モノクロ―ナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異的抗体（例えば、二重特異的抗体及び多反応性抗体）、及び抗体断片がある。該抗体としては、抗体コンジュゲート、及び抗体を含む分子、例えばキメラ分子が挙げられる。したがって、抗体は、完全長抗体及び天然抗体、並びに、その結合特異性を保持しているその断片及び部分、例えば、任意の特異的なその結合部分、例えば任意の数の免疫グロブリンクラス及び／又はアイソタイプ（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、及びＩｇＭ）を有するもの；並びに、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ、及びｓｃＦｖ（一本鎖又は関連した実体）を含むがこれらに限定されない、その生物学的に関連した（抗原結合性の）断片又は特異的な結合部分、を含むがこれらに限定されない。モノクロ―ナル抗体は一般的に、実質的に均一な抗体の組成物内の抗体であり；したがって、該モノクローナル抗体組成物内に含まれる任意の個々の抗体は、少数存在する可能性のある天然に生じる可能性のある突然変異を除いて同一である。ポリクローナル抗体は、２つ以上の異なる決定基（エピトープ）に対して一般的に指向される、様々な配列の異なる抗体を含む調製物である。該モノクロ―ナル抗体は、ヒトＩｇＧ１定常領域を含んでいてもよい。該モノクロ―ナル抗体は、ヒトＩｇＧ４定常領域を含んでいてもよい。

本明細書における「抗体」という用語は、最も広義な意味で使用され、これには、ポリクローナル抗体及びモノクロ―ナル抗体、例えばインタクトな抗体及びその機能的（抗原結合性）抗体断片、例えば抗原結合性断片（Ｆａｂ）、Ｆ（ａｂ’）_２断片、Ｆａｂ’断片、Ｆｖ断片、組換えＩｇＧ（ｒＩｇＧ）断片、一本鎖抗体断片、例えば一本鎖可変断片（ｓＦｖ又はｓｃＦｖ）、及び単一ドメイン抗体（例えばｓｄＡｂ、ｓｄＦｖ、ナノボディ）断片が含まれる。該用語は、遺伝子工学操作された及び／又は他の方法で修飾された形の免疫グロブリン、例えばイントラボディ、ペプチボディ（peptibodies）、キメラ抗体、完全ヒト抗体、ヒト化抗体、及びヘテロコンジュゲート抗体、多重特異的抗体、例えば二重特異的抗体、ディアボディーズ、トリアボディーズ、及びテトラボディーズ、直列型ｄｉ－ｓｃＦｖ、直列型ｔｒｉ－ｓｃＦｖを包含する。特記されない限り、「抗体」という用語は、その機能的な抗体断片を包含すると理解されるべきである。該用語はまた、インタクトな抗体又は完全長の抗体、例えば、任意のクラス又はサブクラスの抗体、例えばＩｇＧ及びそのサブクラス、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、及びＩｇＤも包含する。該抗体は、ヒトＩｇＧ１定常領域を含んでいてもよい。該抗体は、ヒトＩｇＧ４定常領域を含んでいてもよい。

「相補性決定領域」及び「ＣＤＲ」という用語は、「超可変領域」すなわち「ＨＶＲ」と同義語であるが、これは当技術分野において、抗原特異性及び／又は結合親和性を付与する、抗体可変領域内の非連続的なアミノ酸配列を指すことが知られている。一般的に、各々の重鎖可変領域には３つのＣＤＲ（ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３）があり、各々の軽鎖可変領域には３つのＣＤＲ（ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、ＣＤＲ－Ｌ３）がある。「フレームワーク領域」及び「ＦＲ」は当技術分野において、重鎖及び軽鎖の可変領域のＣＤＲではない部分を指すことが知られている。一般的には、各々の完全長重鎖可変領域には４つのＦＲ（ＦＲ－Ｈ１、ＦＲ－Ｈ２、ＦＲ－Ｈ３、及びＦＲ－Ｈ４）があり、各々の完全長軽鎖可変領域には４つのＦＲ（ＦＲ－Ｌ１、ＦＲ－Ｌ２、ＦＲ－Ｌ３、及びＦＲ－Ｌ４）がある。所与のＣＤＲ又はＦＲの正確なアミノ酸配列の境界は、Kabat et al. (1991), “Sequences of Proteins of Immunological Interest,”第５版,公衆衛生局,国立衛生研究所,ベセスダ,ＭＤ州（「Ｋａｂａｔ」番号付け体系)、Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273,927-948 (「Ｃｈｏｔｈｉａ」番号付け体系)；MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996), “Antibody-antigen interactions: Contact analysis and binding site topography,” J. Mol. Biol. 262, 732-745. (「Ｃｏｎｔａｃｔ」番号付け体系)；Lefranc MP et al.,“IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains,” Dev Comp Immunol, 2003 Jan;27(1):55-77 (「ＩＭＧＴ」番号付け体系)；Honegger A and Pluckthun A, “Yet another numbering scheme for immunoglobulin variable domains: an automatic modeling and analysis tool,” J Mol Biol, 2001 Jun 8;309(3):657-70, (「Ａｈｏ」番号付け体系)；及びWhitelegg NR and Rees AR, “WAM: an improved algorithm for modelling antibodies on the WEB,” Protein Eng. 2000 Dec;13(12):819-24（「ＡｂＭ」番号付け体系）によって記載されたスキームを含む、多くの周知のスキームのいずれかを使用して容易に決定され得る。

所与のＣＤＲ又はＦＲの境界は、同定のために使用されるスキームに応じて変化し得る。例えば、Ｋａｂａｔスキームは構造的アラインメントに基づき、一方、Ｃｈｏｔｈｉａスキームは構造的情報に基づく。Ｋａｂａｔ及びＣｈｏｔｈｉａの両方のスキームの番号付けは、最も一般的な抗体領域の配列長に基づき、これは挿入文字、例えば「３０ａ」によって収容される挿入、及びいくつかの抗体内に出現する欠失を伴う。２つのスキームは異なる位置に特定の挿入及び欠失（「挿入欠失」）を配置し、その結果、異なる番号付けとなる。Ｃｏｎｔａｃｔスキームは、複雑な結晶構造の分析に基づき、多くの点においてＣｈｏｔｈｉａ番号付け体系に類似している。

「可変領域」又は「可変ドメイン」という用語は、抗原に対する抗体の結合に関与する、抗体の重鎖又は軽鎖のドメインを指す。天然抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（それぞれＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ）は一般的に、類似した構造を有し、各ドメインは、４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）及び３つのＣＤＲを含んでいる（例えば、Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91（2007）参照）。単一のＶ_Ｈドメイン又はＶ_Ｌドメインは、抗原結合特異性を付与するのに十分であり得る。さらに、特定の抗原に結合する抗体は、抗原に結合する抗体に由来するＶ_Ｈドメイン又はＶ_Ｌドメインを使用して、それぞれ、相補的なＶ_Ｌドメイン又はＶ_Ｈドメインのライブラリーをスクリーニングすることによって単離され得る（例えば、Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628（1991）参照）。

提供された抗体の中には、抗体断片がある。「抗体断片」は、インタクトな抗体が結合する抗原に結合する、インタクトな抗体の部分を含む、インタクトな抗体ではない分子を指す。抗体断片の例としては、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、 Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）_２；ディアボディーズ；リニア抗体；一本鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ又はｓｃＦｖ）；及び、抗体断片から形成された多重特異的抗体が挙げられるがこれらに限定されない。特定の実施態様では、該抗体は、重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域を含む一本鎖抗体断片、例えばｓｃＦｖである。

本明細書において使用される場合の「特異的結合」又は「結合」という用語は、言及されている抗体若しくは断片のＣＤＲの１つ以上のアミノ酸残基、又は言及されている抗体若しくは断片の１つ以上の可変領域アミノ酸残基によって媒介される、結合を指す。特異的な標的への抗体の結合又は結合していることに関連した、本明細書において使用する「接触する」又は「接触」という用語は、列挙されている接触している残基の５Å、４Å、３Å、又はそれ以下の範囲内に、可変領域又はＣＤＲのアミノ酸残基がくることを指す。接触には、抗体の可変領域又はＣＤＲのアミノ酸残基と列挙された残基との間の、水素結合、ファンデルワールス相互作用、及び塩橋形成を含む。

抗体断片は、インタクトな抗体のタンパク質分解的消化、並びに、組換え宿主細胞の産生を含むがこれらに限定されない、様々な技術によって作製され得る。いくつかの実施態様では、該抗体は、組換え産生された断片、例えば、天然には起こらない整列を含む断片、例えば、合成リンカー、例えばポリペプチドリンカーによって接続された２つ以上の抗体領域若しくは抗体鎖を有する断片、及び／又は、天然に存在するインタクトな抗体の酵素消化によって産生されない断片である。いくつかの態様では、抗体断片はｓｃＦｖである。

「ヒト化」抗体は、全て又は実質的に全てのＣＤＲアミノ酸残基が非ヒトＣＤＲに由来し、全て又は実質的に全てのＦＲアミノ酸残基がヒトＦＲに由来する、抗体である。ヒト化抗体は場合により、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも部分を含んでいてもよい。「ヒト化形態」の非ヒト抗体は、典型的には親非ヒト抗体の特異性及び親和性を保持しつつ、ヒトに対する免疫原性を低減するために、ヒト化を受けている、非ヒト抗体の変異体を指す。いくつかの実施態様では、ヒト化抗体内のいくつかのＦＲ残基は、例えば、抗体の特異性又は親和性を回復又は改善するために、非ヒト抗体（例えば、ＣＤＲ残基が由来する抗体）に由来する対応する残基で置換されている。

提供される抗体の中にはヒト抗体がある。「ヒト抗体」は、ヒト、又はヒト細胞、又は、ヒト抗体レパートリー若しくは他のヒト抗体コード配列、例えばヒト抗体ライブラリーを利用するヒト以外の起源によって産生される、抗体のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列を有する抗体である。該用語は、非ヒト抗原結合領域を含むヒト化形態の非ヒト抗体、例えば全て又は実質的に全てのＣＤＲが非ヒトである抗体を除外する。

ヒト抗体は、抗原による攻撃に応答して、インタクトなヒト抗体又はヒト可変領域を有するインタクトな抗体を産生するように改変されているトランスジェニック動物に免疫原を投与することによって調製され得る。このような動物は典型的には、内因性免疫グロブリン遺伝子座を置き換えているか、又は染色体外に存在するか、又は動物の染色体に無作為に組み込まれている、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の全て又は一部を含有している。このようなトランスジェニック動物では、内因性免疫グロブリン遺伝子座は一般的に不活性化されている。ヒト抗体はまた、ヒトレパートリーに由来する抗体コード配列を含有している、ファージディスプレイライブラリー及び無細胞ライブラリーを含む、ヒト抗体ライブラリーに由来していても、又はそれから選択されてもよい。特定の実施態様では、ヒト抗体は、ファージディスプレイなどの方法による連続回の選択によって、配列の障害箇所が除去されていてもよいか、又はその親和性が高められていてもよい。

「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は、同義語として使用され、アミノ酸残基のポリマーを指し、最小の長さに限定されない。ポリペプチド（提供される抗体及び抗体鎖及び他のペプチド、例えばリンカー及び結合性ペプチドを含む）は、天然及び／又は非天然アミノ酸残基を含む、アミノ酸残基を含み得る。該用語はまた、ポリペプチドの発現後修飾、例えばグリコシル化、シアル化、アセチル化、リン酸化などを含む。いくつかの態様では、該ポリペプチドは、該タンパク質が所望の活性を維持する限りにおいて、生得の又は天然の配列に関して修飾を含有していてもよい。これらの修飾は、部位特異的突然変異誘発などを通した意図的なものであっても、又は、タンパク質を産生する宿主の突然変異、若しくはＰＣＲ増幅に起因するエラーなどを通した偶発的なものであってもよい。

本明細書において、特定の実施態様では、エフェクター機能の減少した抗体が提供される。本明細書において使用する「エフェクター機能」という語句は、ＦｃγＲに結合した時にＦｃ含有タンパク質によって付与される機能的能力を含むことを意味する。いずれか１つの理論に拘りたくはないが、Ｆｃ／ＦｃγＲ複合体の形成は、様々なエフェクター細胞を、結合した抗原部位に動員し、典型的にはその結果として、細胞内に多様なシグナル伝達事象及び重要な後続の免疫応答が起こる。エフェクター機能は、抗体依存性細胞障害及び補体依存性細胞障害の両方を指す。インビトロ及び／又はインビボでの細胞障害アッセイを実施して、補体依存性細胞障害活性及び／又は抗体依存性細胞障害活性の減少／除去を確認することができる。例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合アッセイを実施して、該抗体はＦｃγＲへの結合を欠失している（したがって、抗体依存性細胞障害活性を欠失している可能性がある）が、ＦｃＲｎへの結合能は保持していることを確認することができる。関心対象の分子の抗体依存性細胞障害活性を評価するためのインビトロアッセイの非制限的な例は、米国特許第５，５００，３６２号及び第５，８２１，３３７号に記載されている。あるいは、非放射性アッセイ法を使用してもよい（例えば、ＡＣＴＩ（商標）及びＣｙｔｏＴｏｘ９６（商標）非放射性細胞障害アッセイ）。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞としては、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、単球、マクロファージ、及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。

基準ポリペプチド配列に対する配列同一率（％）は、配列をアラインさせ、必要であれば、最大の配列同一率を達成するためにギャップを導入した後の、配列同一性の一部として保存的な置換を全く考慮しない、基準ポリペプチド配列内のアミノ酸残基と同一である、候補配列内のアミノ酸残基の比率である。アミノ酸配列同一率を決定する目的でのアラインメントは、公知である様々な方法で、例えば公共的に利用できるコンピューターソフトウェア、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアを使用して達成され得る。比較する配列の完全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要とされるアルゴリズムを含む、配列をアラインさせるための適切なパラメーターを決定することができる。しかしながら、本明細書での目的のために、アミノ酸配列同一率値％は、配列比較コンピュータープログラムＡＬＩＧＮ－２を使用して算出される。ＡＬＩＧＮ－２配列比較コンピュータープログラムは、ジェネンテック社によって作成され、ソースコードがユーザー文書と共にワシントンＤ.Ｃ.２０５５９のアメリカ合衆国著作権局に提出され、そこでアメリカ合衆国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７として登録されている。ＡＬＩＧＮ－２プログラムは、ジェネンテック社（サウスサンフランシスコ、カリフォルニア州）から公共的に入手可能であるか、又は、ソースコードからコンパイルしてもよい。ＡＬＩＧＮ－２プログラムは、デジタルＵＮＩＸ（登録商標） Ｖ４．０Ｄを含むＵＮＩＸ（登録商標）オペレーティングシステム上での使用のためにコンパイルされるべきである。全ての配列比較パラメーターはＡＬＩＧＮ－２プログラムによって設定され、変更されない。

ＡＬＩＧＮ－２がアミノ酸配列の比較のために使用される状況では、所与のアミノ酸配列Ａの、所与のアミノ酸配列Ｂに対するアミノ酸配列同一率％（あるいは、所与のアミノ酸配列Ｂに対して、特定のアミノ酸配列同一率％を有する又は含む、所与のアミノ酸配列Ａとして表現されてもよい）は、以下のように計算され：Ｘ／Ｙの分率×１００、ここで、Ｘは、プログラムによるＡとＢのアラインメントにおいて、配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ－２によって同一な一致としてスコアリングされたアミノ酸残基の数であり、Ｙは、Ｂ内のアミノ酸残基の総数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さとは等しくない場合、Ｂに対するＡのアミノ酸配列同一率％は、Ａに対するＢのアミノ酸配列同一率％とは等しくないであろうことが理解されるだろう。具体的に特記しない限り、本明細書において使用する全てのアミノ酸配列同一率値％は、ＡＬＩＧＮ－２コンピュータープログラムを使用して直前の段落で記載されているように得られる。

いくつかの実施態様では、本明細書において提供される抗体のアミノ酸配列変異体が考えられる。変異体は典型的には、１つ以上の置換、欠失、付加、及び／又は挿入において、本明細書において具体的に開示されたポリペプチドとは異なる。このような変異体は、天然に起こるものであっても、又は例えば本発明の上記の１つ以上のポリペプチド配列を修飾し、本明細書に記載のように及び／又は多くの公知の技術のいずれかを使用して、該ポリペプチドの１つ以上の生物学的活性を評価することによって、合成的に作製されてもよい。例えば、抗体の結合親和性及び／又は他の生物学的特性を改善することが望ましくあり得る。抗体のアミノ酸配列変異体は、該抗体をコードしているヌクレオチド配列に適切な改変を導入することによって、又はペプチド合成によって調製され得る。このような改変としては、例えば、該抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失、及び／又は該残基への挿入、及び／又は該残基の置換が挙げられる。欠失、挿入、及び置換のあらゆる組合せを行なって最終構築物に到達することができる。ただし、最終構築物は、所望の特徴、例えば抗原への結合を有する。

いくつかの実施態様では、１つ以上のアミノ酸の置換を有する抗体変異体が提供される。置換による突然変異誘発のための関心対象の部位はＣＤＲ及びＦＲを含む。アミノ酸の置換を関心対象の抗体に導入し得、産物を所望の活性、例えば保持された／改善された抗原への結合、低減された免疫原性、又は改善されたＡＤＣＣ（抗体依存性細胞障害）若しくはＣＤＣ（補体依存性細胞障害）についてスクリーニングし得る。

いくつかの実施態様では、置換、挿入、又は欠失は、１つ以上のＣＤＲ内で起こり得、ここでの置換、挿入、又は欠失は、抗原に対する抗体の結合を実質的に低減させない。例えば、実質的に結合親和性を低減させない保存的置換は、ＣＤＲ内で行なわれてもよい。このような改変は、ＣＤＲの「ホットスポット」の外にあってもよい。変異体のＶ_Ｈ配列及びＶ_Ｌ配列のいくつかの実施態様では、各ＣＤＲは改変されていない。

改変（例えば置換）は、例えば抗体の親和性を改善するために、ＣＤＲ内で行なわれ得る。このような改変は、体細胞の成熟中に高い突然変異率を有する、ＣＤＲをコードするコドンにおいて行なわれ得（例えば、Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196（2008）参照）、結果として得られた変異体を結合親和性について試験することができる。親和性成熟（例えば、エラープローンＰＣＲ、鎖シャッフリング、ＣＤＲの無作為化、又はオリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発を使用した）を使用して、抗体の親和性を改善することができる（例えば、Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37（2001）参照）。抗原との結合に関与するＣＤＲ残基を、例えば、アラニン走査突然変異誘発又はモデリングを使用して具体的に同定し得る（例えば、Cunningham and Wells Science, 244:1081-1085（1989）参照）。ＣＤＲ－Ｈ３及びＣＤＲ－Ｌ３が特に標的化されることが多い。代わりに又は追加して、抗体と抗原との間の接触点を同定するための抗原－抗体複合体の結晶構造。このような接触残基及び隣接残基を、置換のための候補として標的化又は排除し得る。変異体をスクリーニングして、それらが所望の特性を含有しているかどうかを決定し得る。

アミノ酸配列の挿入及び欠失は、１残基から１００以上の残基を含有しているポリペプチドまでの長さにおよぶアミノ末端及び／又はカルボキシル末端への融合、並びに、１つ又は複数のアミノ酸残基の配列間への挿入及び欠失を含む。末端への挿入例としては、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体が挙げられる。抗体分子の他の挿入変異体は、抗体のＮ末端又はＣ末端への酵素（例えば抗体指向酵素プロドラッグ療法用）又は抗体の血清中半減期を延長させるポリペプチドへの融合を含む。抗体分子の配列内挿入変異体の例は、軽鎖への３アミノ酸の挿入を含む。末端欠失の例としては、軽鎖の末端における７個以下のアミノ酸の欠失した抗体が挙げられる。

いくつかの実施態様では、抗体はそのグリコシル化を増加又は減少させるために、改変されている（例えば、１つ以上のグリコシル化部位が作り出されるか又は除去されるように、アミノ酸配列を改変することによって）。抗体のＦｃ領域に付着した糖鎖が改変されてもよい。哺乳動物細胞に由来する天然抗体は典型的には、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７にＮ結合によって付着している分岐した、二分岐のオリゴ糖を含む（例えば、Wright et al. TIBTECH 15:26-32（1997）参照）。オリゴ糖は、様々な糖鎖、例えばマンノース、Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース、シアル酸、二分岐オリゴ糖構造の「基部」にあるＧｌｃＮＡｃに付着したフコースであり得る。抗体内のオリゴ糖の修飾は、例えば、特定の改善された特性を有する抗体変異体を作製するために行なわれ得る。抗体グリコシル化変異体は、改善されたＡＤＣＣ及び／又はＣＤＣ機能を有し得る。いくつかの実施態様では、Ｆｃ領域に（直接的に又は間接的に）付着したフコースを欠失している糖鎖構造を有する抗体変異体が提供される。例えば、このような抗体内のフコースの量は、１％～８０％、１％～６５％、５％～６５％、又は２０％～４０％であり得る。フコースの量は、Ａｓｎ２９７に付着した全ての糖構造の合計と比較した、Ａｓｎ２９７における糖鎖内のフコースの平均量を計算することによって決定される（例えば、国際公開公報第０８/０７７５４６号参照）。Ａｓｎ２９７は、Ｆｃ領域内のおよそ２９７位に位置するアスパラギン残基を指す（Ｆｃ領域残基のＥＵ番号付け；例えば、Edelman et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 1969 May; 63(1):78-85参照）。しかしながら、Ａｓｎ２９７はまた、抗体内の小さな配列の変化に因り、２９７位の約±３アミノ酸上流又は下流、すなわち、２９４位から３００位に位置し得る。このようなフコシル化変異体は、改善されたＡＤＣＣ機能を有し得る（例えば、Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004)；及びYamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614（2004）参照）。細胞株、例えばノックアウト細胞株、例えば、タンパク質フコシル化の欠失したＬｅｃ１３ＣＨＯ細胞、及びα－１，６－フコシルトランスフェラーゼ遺伝子（ＦＵＴ８）ノックアウトＣＨＯ細胞、並びにそれらの使用法を使用して、脱フコシル化抗体を産生することができる（例えば、Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986); Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688（2006）参照）。他の抗体グルコシル化変異体も含まれる（例えば、米国特許第６，６０２，６８４号参照）。

いくつかの実施態様では、１つ以上のアミノ酸の改変を、本明細書において提供された抗体のＦｃ領域に導入し得、これによりＦｃ領域変異体を作製し得る。本明細書のＦｃ領域は、定常領域の少なくとも部分を含有している、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域である。Ｆｃ領域は、天然配列のＦｃ領域及び変異Ｆｃ領域を含む。Ｆｃ領域変異体は、１つ以上のアミノ酸位置においてアミノ酸の改変（例えば置換）を含む、ヒトＦｃ領域の配列（例えばヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４のＦｃ領域）を含み得る。

抗体は、延長された半減期及び改善された胎児性Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合を有し得る（例えば米国特許出願第２００５/００１４９３４号参照）。このような抗体は、ＦｃＲｎに対するＦｃ領域の結合を改善する１つ以上の置換をＦｃ領域内に有するＦｃ領域を含み得、これには、Ｆｃ領域残基（ＥＵ番号付け体系による、２３８、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４又は４３４）の１つ以上において置換を有するものが含まれる（例えば、米国特許第７，３７１，８２６号参照）。Ｆｃ領域変異体の他の例も考えられる（例えばDuncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988)；米国特許第５，６４８，２６０号及び第５，６２４，８２１号；及び国際公開公報第９４／２９３５１号参照）。

いくつかの実施態様では、システインで工学操作された抗体、例えば「チオモノクロ―ナル抗体」（ここでは抗体の１つ以上の残基が、システイン残基で置換されている）を作製することが望ましくあり得る。いくつかの実施態様では、置換された残基は、抗体が近づくことのできる部位で起こる。反応性チオール基は、他の部分、例えば薬物部分又はリンカー薬物部分へのコンジュゲーションのための部位に位置し得、これにより免疫コンジュゲートが作製され得る。いくつかの実施態様では、以下の残基のいずれか１つ以上がシステインで置換されていてもよい：軽鎖のＶ２０５（Ｋａｂａｔの番号付け）；重鎖のＡ１１８（ＥＵ番号付け）；及び重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵ番号付け）。

いくつかの実施態様では、本明細書に提供された抗体は、公知であり入手可能である、追加の非タンパク質性部分を含有するようにさらに修飾されていてもよい。抗体の誘導体化に適した部分としては水溶性ポリマーが挙げられるがこれらに限定されない。水溶性ポリマーの非制限的な例としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ－１，３－ジオキソラン、ポリ－１，３，６－トリオキサン、エチレン／マレイン酸無水物コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマー又はランダムコポリマーのいずれか）、及びデキストラン又はポリ（ｎビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えばグリセロール）、ポリビニルアルコール、及びその混合物が挙げられるがこれらに限定されない。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中におけるその安定性に因り、製造において利点を有し得る。ポリマーは、任意の分子量であり得、分岐していても分岐していなくてもよい。抗体に付着したポリマーの数は変更され得、２つ以上のポリマーが付着している場合、それらは同じ分子であっても、又は異なる分子であってもよい。

本明細書に記載の抗体は、核酸によってコードされ得る。核酸は、２つ以上のヌクレオチド塩基を含んでいる、一種のポリヌクレオチドである。特定の実施態様では、核酸は、ポリヌクレオチドをコードしているポリペプチドを細胞内に導入するために使用され得る、ベクターの成分である。本明細書において使用する「ベクター」という用語は、核酸分子が連結されている別の核酸を輸送することのできる、該核酸分子を指す。ある種類のベクターは、ゲノムに組み込まれるベクター、すなわち「組込み型ベクター」であり、これは、宿主細胞の染色体ＤＮＡに組み込まれるようになることが可能である。別の種類のベクターは、「エピソーム」ベクター、例えば、染色体外での複製が可能な核酸である。作動可能に連結されている遺伝子の発現を指令することのできるベクターは、本明細書において「発現ベクター」と称される。適切なベクターは、プラスミド、細菌人工染色体、酵母人工染色体、ウイルスベクターなどを含む。発現ベクター内における、転写の制御に使用するための、調節配列、例えばプロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナルは、哺乳動物、微生物、ウイルス、又は昆虫の遺伝子に由来し得る。通常、複製起点によって付与される、宿主における複製能、及び形質転換体の認識を容易にする選択用遺伝子が追加的に取り込まれてもよい。ウイルス、例えばレンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスなどに由来するベクターが使用され得る。プラスミドベクターは、染色体の位置への組込みのために直鎖状化されていてもよい。ベクターは、ゲノム内の所定の位置又は限定された部位のセットへの部位特異的組込みを指令する配列を含み得る（例えばＡｔｔＰ－ＡｔｔＢの組換え）。さらに、ベクターは、転移因子に由来する配列を含み得る。

本明細書において基準配列と比較してアミノ酸配列又は核酸配列を記載するために使用される場合の、本明細書において使用する「相同な」、「相同性」又は「相同率」という用語は、Karlin及びAltschul（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264-2268, 1990, modified as in Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877, 1993）によって記載される式を使用して決定され得る。このような式は、Altschul et al.（J. Mol. Biol. 215: 403-410, 1990）の基本的な局所的アラインメント探索ツール（ＢＬＡＳＴ）プログラムに取り込まれる。配列の相同率は、本出願の出願日の日付において、最新版のＢＬＡＳＴを使用して決定され得る。

本明細書に記載の抗体をコードしている核酸を使用して、適した細胞に感染させるか、トランスフェクトさせるか、形質転換させるか、又は別の方法で核酸の遺伝子を導入させることができ、よって、商業的使用又は治療的使用のための抗体の産生が可能となる。標準的な細胞株、及び大規模細胞培養液からの抗体の産生法は当技術分野において公知である。例えば、Li et al., “Cell culture processes for monoclonal antibody production.” Mabs. 2010 Sep-Oct; 2(5): 466-477を参照されたい。特定の実施態様では、該細胞は真核細胞である。特定の実施態様では、該真核細胞は哺乳動物細胞である。特定の実施態様では、該哺乳動物細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＳ０マウス骨髄腫細胞、又はＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞である。特定の実施態様では、抗体をコードしている核酸は、抗体の産生に有用な細胞のゲノム遺伝子座に組み込まれる。特定の実施態様では、本明細書には、抗体の産生及び分泌を可能とするに十分なインビトロでの条件下で、該抗体をコードしている核酸を含む細胞を培養する工程を含む、抗体の作製法が記載されている。

特定の実施態様では、本明細書には、（ａ）ゲノム位置に組み込まれた本明細書に記載の抗体をコードしている１つ以上の核酸を含む哺乳動物細胞株；及び（ｂ）凍結保護剤を含む、マスターセルバンクが記載されている。特定の実施態様では、凍結保護剤は、グリセロール、ＤＭＳＯ、又はその組合せを含む。特定の実施態様では、マスターセルバンクは、（ａ）（ｉ）配列番号１３によって示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一である重鎖アミノ酸配列；及び（ｉｉ）配列番号１４によって示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一である軽鎖アミノ酸配列、を有する抗体をコードしている核酸を、ゲノム位置に組み込まれて含むＣＨＯ細胞株；及び（ｂ）凍結保護剤を含む。特定の実施態様では、凍結保護剤は、グリセロール、ＤＭＳＯ、又はその組合せを含む。特定の実施態様では、マスターセルバンクは、液体窒素による凍結に耐えることのできる適切なバイアル又は容器に含まれる。

また本明細書には、本明細書に記載の抗体を作製する方法が記載されている。このような方法は、抗体をコードしている核酸を含む細胞又は細胞株を、該抗体の発現及び分泌を可能とするに十分な条件下で細胞培養培地中でインキュベートし、細胞培養培地から該抗体をさらに収集する工程を含む。収集はさらに、生細胞、細胞片、非抗体タンパク質又はポリペプチド、所望ではない塩、緩衝液、及び培地成分を除去するための、１回以上の精製工程を含み得る。特定の実施態様では、追加の精製工程（群）としては、遠心分離、超遠心分離、透析、脱塩、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＡ/Ｇ、若しくはプロテインＬによる精製、及び／又はイオン交換クロマトグラフィーが挙げられる。

抗ペリオスチン抗体
本明細書には、ペリオスチン（ＰＯＳＴＮ）機能を阻害する抗体が記載されている。このような抗体は、がんの処置に有用である。本明細書に記載の抗体は、腫瘍のコラーゲン含量を減少させ、マクロファージのＭ１表現型への極性化を増加させつつ、顆粒球及び腫瘍関連マクロファージの浸潤を減少させ、そして腫瘍浸潤Ｔ細胞の蓄積及び抗腫瘍特性を増加させる。特定の実施態様では、抗ペリオスチン抗体は、全く処置しないもの又は対照の処置と比較して、腫瘍コラーゲン含量を少なくとも約５％、１０％、１５％。２０％、２５％、３０％、３５％、又は４０％減少させる。特定の実施態様では、抗ペリオスチン抗体は、全く処置しないもの又は対照の処置と比較して、顆粒球及び腫瘍関連マクロファージの浸潤を少なくとも約２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、又は５０％減少させる。特定の実施態様では、抗ペリオスチン抗体は、全く処置しないもの又は対照の処置と比較して、ＣＤ１１ｂ陽性細胞の浸潤を少なくとも約２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、又は５０％減少させる。特定の実施態様では、抗ペリオスチン抗体は、全く処置しないもの又は対照の処置と比較して、腫瘍関連マクロファージのＭ１型（ＣＤ１１ｂ陽性、ＭＨＣクラスＩＩ陽性、ＣＤ２０６陰性）への極性化を少なくとも約２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、又は５０％増加させる。特定の実施態様では、抗ペリオスチン抗体は、全く処置しないもの又は対照の処置と比較して、腫瘍内のＣＤ４陽性及び／又はＣＤ８陽性Ｔ細胞の蓄積を、少なくとも約２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、又は５０％増加させる。特定の実施態様では、抗ペリオスチン抗体は、全く処置しないもの又は対照の処置と比較して、腫瘍浸潤ＣＤ８陽性Ｔ細胞のインターフェロンγの産生を、少なくとも約２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、又は５０％増加させる。

本明細書には、ペリオスチンに結合する組換え抗体又はその抗原結合断片が記載され、ここでの該抗体又はその抗原結合断片は、（ａ）配列番号１（GYTFTSYG）に示されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖ＣＤＲ１（ＣＤＲ－Ｈ１）；（ｂ）配列番号１６（ISAYXGNT）に示されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖ＣＤＲ２（ＣＤＲ－Ｈ２）；（ｃ）配列番号１７（DXLVVPFDY）に示されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖ＣＤＲ３（ＣＤＲ－Ｈ３）；（ｄ）配列番号１０（SSDIGSNR）に示されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖ＣＤＲ１（ＣＤＲ－Ｌ１）；（ｅ）配列番号１１（SND）に示されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖ＣＤＲ２（ＣＤＲ－Ｌ２）；又は（ｆ）配列番号１２（AAWDDSLSTYV）に示されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖ＣＤＲ３（ＣＤＲ－Ｌ３）を含み、ここでのＸは任意のアミノ酸である。

本明細書には、ペリオスチンに結合する組換え抗体又はその抗原結合断片が記載され、ここでの該抗体又はその抗原結合断片は、（ａ）配列番号１（GYTFTSYG）に示されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖ＣＤＲ１（ＣＤＲ－Ｈ１）；（ｂ）配列番号１６（ISAYXGNT）に示されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖ＣＤＲ２（ＣＤＲ－Ｈ２）；（ｃ）配列番号１７（DXLVVPFDY）に示されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖ＣＤＲ３（ＣＤＲ－Ｈ３）；（ｄ）配列番号１０（SSDIGSNR）に示されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖ＣＤＲ１（ＣＤＲ－Ｌ１）；（ｅ）配列番号１１（SND）に示されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖ＣＤＲ２（ＣＤＲ－Ｌ２）；及び（ｆ）配列番号１２（AAWDDSLSTYV）に示されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖ＣＤＲ３（ＣＤＲ－Ｌ３）、から選択されたいずれか１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つの相補性決定領域を含み、ここでのＸは任意のアミノ酸である。

本明細書には、ペリオスチンに結合する組換え抗体又はその抗原結合断片が記載され、ここでの該抗体又はその抗原結合断片は、（ａ）配列番号１（GYTFTSYG）に示されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖ＣＤＲ１（ＣＤＲ－Ｈ１）；（ｂ）配列番号２（ISAYNGNT）、３（ISAYSGNT）、４（ISAYQGNT）、５（ISAYTGNT）、又は６（ISAYDGNT）のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖ＣＤＲ２（ＣＤＲ－Ｈ２）；（ｃ）配列番号７（DILVVPFDY）、８（DVLVVPFDY）、又は９（DMLVVPFDY）のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖ＣＤＲ３（ＣＤＲ－Ｈ３）；（ｄ）配列番号１０（SSDIGSNR）に示されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖ＣＤＲ１（ＣＤＲ－Ｌ１）；（ｅ）配列番号１１（SND）に示されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖ＣＤＲ２（ＣＤＲ－Ｌ２）；（ｆ）及び配列番号１２（AAWDDSLSTYV）に示されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖ＣＤＲ３（ＣＤＲ－Ｌ３）を含む。特定の実施態様では、該抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体、又はキメラ抗体である。特定の実施態様では、該抗体はＩｇＧ抗体である。特定の実施態様では、本明細書に記載の抗体は、エフェクター機能の欠失した又は減少したＦｃ部分を含み得る。特定の実施態様では、該抗体は、ヒト肺線維芽細胞及び／又はマウス線維芽細胞を用いて実施された細胞接着アッセイにおいて、約５０ナノモル未満のＩＣ５０を有する。特定の実施態様では、該抗体は、ヒト肺線維芽細胞及び／又はマウス線維芽細胞を用いて実施された細胞接着アッセイにおいて、約４０ナノモル未満のＩＣ５０を有する。特定の実施態様では、該抗体は、ヒト肺線維芽細胞及び／又はマウス線維芽細胞を用いて実施された細胞接着アッセイにおいて、約３０ナノモル未満のＩＣ５０を有する。

本明細書には、組換え抗体又はその抗原結合断片も記載され、ここでの該抗体又はその抗原結合断片は、（ａ）配列番号１（GYTFTSYG）に示されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖ＣＤＲ１（ＣＤＲ－Ｈ１）；（ｂ）配列番号２（ISAYNGNT）に示されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖ＣＤＲ２（ＣＤＲ－Ｈ２）；（ｃ）配列番号９（DMLVVPFDY）に示されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖ＣＤＲ３（ＣＤＲ－Ｈ３）；（ｄ）配列番号１０（SSDIGSNR）に示されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖ＣＤＲ１（ＣＤＲ－Ｌ１）；（ｅ）配列番号１１（SND）に示されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖ＣＤＲ２（ＣＤＲ－Ｌ２）；及び（ｆ）配列番号１２（AAWDDSLSTYV）に示されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖ＣＤＲ３（ＣＤＲ－Ｌ３）を含む。特定の実施態様では、該抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体、又はキメラ抗体である。特定の実施態様では、該抗体はＩｇＧ抗体である。特定の実施態様では、本明細書に記載の抗体は、エフェクター機能の欠失した又は減少したＦｃ部分を含み得る。特定の実施態様では、該抗体は、ヒト肺線維芽細胞及び／又はマウス線維芽細胞を用いて実施された細胞接着アッセイにおいて、約５０ナノモル未満のＩＣ５０を有する。特定の実施態様では、該抗体は、ヒト肺線維芽細胞及び／又はマウス線維芽細胞を用いて実施された細胞接着アッセイにおいて、約４０ナノモル未満のＩＣ５０を有する。特定の実施態様では、該抗体は、ヒト肺線維芽細胞及び／又はマウス線維芽細胞を用いて実施された細胞接着アッセイにおいて、約３０ナノモル未満のＩＣ５０を有する。

本明細書には、免疫グロブリン重鎖及び免疫グロブリン軽鎖を含む、ペリオスチンに結合する組換え抗体又はその抗原結合断片も記載され、（ａ）ここでの免疫グロブリン重鎖は、配列番号１３に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％、９５％、９７％、９９％同一であるか、又は１００％同一である、アミノ酸配列を含み；そして、（ｂ）ここでの免疫グロブリン軽鎖は、配列番号１４に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％、９５％、９７％、９９％同一であるか、又は１００％同一である、アミノ酸配列を含み、ここでの配列番号１３のアミノ酸残基番号５５は、アスパラギン、セリン、グルタミン、トレオニン、又はアスパラギン酸であり、ここでの配列番号１３のアミノ酸残基番号１００は、メチオニン、イソロイシン、又はバリンである。特定の実施態様では、該抗体はＩｇＧ抗体である。特定の実施態様では、本明細書に記載の抗体は、エフェクター機能の欠失した又は減少したＦｃ部分を含み得る。特定の実施態様では、該抗体は、ヒト肺線維芽細胞及び／又はマウス線維芽細胞を用いて実施された細胞接着アッセイにおいて、約５０ナノモル未満のＩＣ５０を有する。特定の実施態様では、該抗体は、ヒト肺線維芽細胞及び／又はマウス線維芽細胞を用いて実施された細胞接着アッセイにおいて、約４０ナノモル未満のＩＣ５０を有する。特定の実施態様では、該抗体は、ヒト肺線維芽細胞及び／又はマウス線維芽細胞を用いて実施された細胞接着アッセイにおいて、約３０ナノモル未満のＩＣ５０を有する。

本明細書に記載の可変領域及びＣＤＲ領域を含む、抗体結合領域は、エフェクター機能の減少した抗体の一部として適切にフォーマット化され得る。特定の実施態様では、該抗体は、Ｆｃ領域を欠失した、Ｆ（ａｂ'）_２であり得る。特定の実施態様では、該抗体は、抗体依存性細胞障害又は補体依存性細胞障害などのエフェクター機能を減少させる、抗体重鎖の定常領域に対する１つ以上の突然変異を含み得る。特定の実施態様では、該抗体は、ＩｇＧ４定常領域を含み得る。特定の実施態様では、該組換え抗体又はその抗原結合断片の１つ以上のエフェクター機能を減少させる１つ以上の突然変異は、ＥＵの番号付け体系による、ＩｇＧ４のＮ４３４Ａ、Ｎ４３４Ｈ、Ｔ３０７Ａ／Ｅ３８０Ａ／Ｎ４３４Ａ、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ、４３３Ｋ／４３４Ｆ／４３６Ｈ、Ｔ２５０Ｑ、Ｔ２５０Ｆ、Ｍ４２８Ｌ、Ｍ４２８Ｆ、Ｔ２５０Ｑ／Ｍ４２８Ｌ、Ｎ４３４Ｓ、Ｖ３０８Ｗ、Ｖ３０８Ｙ、Ｖ３０８Ｆ、Ｍ２５２Ｙ／Ｍ４２８Ｌ、Ｄ２５９Ｉ／Ｖ３０８Ｆ、Ｍ４２８Ｌ／Ｖ３０８Ｆ、Ｑ３１１Ｖ／Ｎ４３４Ｓ、Ｔ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ａ、Ｅ２５８Ｆ／Ｖ４２７Ｔ、Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、Ｓ２２８Ｐ／Ｌ２３５Ｅ／Ｒ４０９Ｋ、Ｓ２２８Ｐ／Ｌ２３５Ｅ、Ｋ３７０Ｑ、Ｋ３７０Ｅ、Ｇ４４６の欠失、Ｋ４４７の欠失、及びその組合せから選択された突然変異又は突然変異のセットを含む。特定の実施態様では、該抗体は、ＥＵの番号付け体系による重鎖のＳ２２８Ｐに対応する突然変異を有する、ＩｇＧ４定常領域を含む。特定の実施態様では、該抗体は、ＥＵの番号付け体系による重鎖のＳ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、及びＬ２３５Ａに対応する突然変異を有する、ＩｇＧ４ＰＡＡ定常領域を含み得る。Parekh et al. “Development and validation of an antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity-reporter gene assay.” MAbs 2012 May 1; 4(3): 310-318を参照されたい。

いくつかの実施態様では、本明細書に記載の抗体は、対応する野生型抗体と比較して、Ｃ１ｑに対して低下した親和性を示す。いくつかの実施態様では、抗体は、対応する野生型抗体よりも少なくとも２倍、又は少なくとも３倍、又は少なくとも５倍、又は少なくとも７倍、又は少なくとも１０倍、又は少なくとも２０倍、又は少なくとも３０倍、又は少なくとも４０倍、又は少なくとも５０倍、又は少なくとも６０倍、又は少なくとも７０倍、又は少なくとも８０倍、又は少なくとも９０倍、又は少なくとも１００倍、又は少なくとも２００倍低い、Ｃ１ｑ受容体に対する親和性を示す。

いくつかの実施態様では、本明細書に記載の抗体は、対応する野生型抗体よりも、少なくとも９０％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、少なくとも５０％、少なくとも４０％、少なくとも３０％、少なくとも２０％、少なくとも１０％、又は少なくとも５％低い、Ｃ１ｑ対する親和性を示す。いくつかの実施態様では、本明細書に記載の抗体は、約１００nMから約１００μM、又は約１００nMから約１０μM、又は約１００nMから約１μM、又は約１nMから約１００μM、又は約１０nMから約１００μM、又は約１μMから約１００μM、又は約１０μMから約１００μMのＣ１ｑ対する親和性を示す。いくつかの実施態様では、本明細書に記載の抗体は、１μMより大きい、５μMより大きい、１０μMより大きい、２５μMより大きい、５０μMより大きい、又は１００μMより大きい、Ｃ１ｑ対する親和性を示す。

いくつかの実施態様では、本明細書に記載の抗体は、対応する野生型Ｆｃ抗体と比較して、低下した補体依存性細胞障害活性を示す。いくつかの実施態様では、本明細書に記載の抗体は、対応する野生型抗体よりも少なくとも２倍、又は少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも５０倍、又は少なくとも１００倍低い補体依存性細胞障害活性を示す。いくつかの実施態様では、本明細書に記載の抗体は、対応する野生型と比較して、少なくとも１０％、又は少なくとも２０％、又は少なくとも３０％、又は少なくとも４０％、又は少なくとも５０％、又は少なくとも６０％、又は少なくとも７０％、又は少なくとも８０％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも１００％、又は少なくとも２００％、又は少なくとも３００％、又は少なくとも４００％、又は少なくとも５００％減少した補体依存性細胞障害活性を示す。いくつかの実施態様では、本明細書に記載の抗体は、検出可能な補体依存性細胞障害活性を全く示さない。いくつかの実施態様では、補体依存性細胞障害活性の減少及び／又は除去は、Ｆｃリガンド及び／又は受容体に対する本明細書に記載の抗体の減少した親和性に起因し得る。

当技術分野において、生物学的療法は、望んでいない細胞及び／又は標的を認識し攻撃するように免疫系が指令するという複雑な性質に伴う、有害毒性問題を有し得ることが理解される。処置が必要とされる場所で攻撃のための認識及び／又は標的化が行なわれない場合、有害毒性などの結果が起こり得る。例えば、非標的化組織の抗体による染色は、毒性問題の可能性を示し得る。いくつかの実施態様では、本明細書に記載の抗体は、対応する野生型抗体と比較して低減した非標的化組織の染色を示す。いくつかの実施態様では、本明細書に記載の抗体は、対応する野生型抗体よりも少なくとも２倍、又は少なくとも３倍、又は少なくとも５倍、又は少なくとも７倍、又は少なくとも１０倍、又は少なくとも２０倍、又は少なくとも３０倍、又は少なくとも４０倍、又は少なくとも５０倍、又は少なくとも６０倍、又は少なくとも７０倍、又は少なくとも８０倍、又は少なくとも９０倍、又は少なくとも１００倍、又は少なくとも２００倍低い、低減した非標的化組織の染色を示す。いくつかの実施態様では、本明細書に記載の抗体は、対応する野生型抗体と比較して、少なくとも１０％、又は少なくとも２０％、又は少なくとも３０％、又は少なくとも４０％、又は少なくとも５０％、又は少なくとも６０％、又は少なくとも７０％、又は少なくとも８０％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも１００％、又は少なくとも２００％、又は少なくとも３００％、又は少なくとも４００％、又は少なくとも５００％低減した、低減した非標的化組織の染色を示す。

いくつかの実施態様では、本明細書に記載の抗体は、対応する野生型抗体と比較して、低減した抗体に関連した毒性を示す。いくつかの実施態様では、本明細書に記載の抗体は、対応する野生型抗体よりも少なくとも２倍、又は少なくとも３倍、又は少なくとも５倍、又は少なくとも７倍、又は少なくとも１０倍、又は少なくとも２０倍、又は少なくとも３０倍、又は少なくとも４０倍、又は少なくとも５０倍、又は少なくとも６０倍、又は少なくとも７０倍、又は少なくとも８０倍、又は少なくとも９０倍、又は少なくとも１００倍、又は少なくとも２００倍低い毒性を示す。いくつかの実施態様では、本明細書に記載の抗体は、対応する野生型抗体と比較して、少なくとも１０％、又は少なくとも２０％、又は少なくとも３０％、又は少なくとも４０％、又は少なくとも５０％、又は少なくとも６０％、又は少なくとも７０％、又は少なくとも８０％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも１００％、又は少なくとも２００％、又は少なくとも３００％、又は少なくとも４００％、又は少なくとも５００％低減した毒性を示す。

当技術分野において、生物学的療法は、有害作用の血小板凝集を有し得ることが理解される。インビトロ及びインビボでのアッセイを、血小板凝集の測定のために使用することができる。いくつかの実施態様では、本明細書に記載の抗体は、インビトロアッセイにおいて、対応する野生型抗体と比較して低減した血小板凝集を示す。いくつかの実施態様では、本明細書に記載の抗体は、インビトロアッセイにおいて、対応する野生型抗体よりも少なくとも２倍、又は少なくとも３倍、又は少なくとも５倍、又は少なくとも７倍、又は少なくとも１０倍、又は少なくとも２０倍、又は少なくとも３０倍、又は少なくとも４０倍、又は少なくとも５０倍、又は少なくとも６０倍、又は少なくとも７０倍、又は少なくとも８０倍、又は少なくとも９０倍、又は少なくとも１００倍、又は少なくとも２００倍低い、低減した血小板凝集を示す。いくつかの実施態様では、本明細書に記載の抗体は、インビトロアッセイにおいて、対応する野生型抗体と比較して、少なくとも１０％、又は少なくとも２０％、又は少なくとも３０％、又は少なくとも４０％、又は少なくとも５０％、又は少なくとも６０％、又は少なくとも７０％、又は少なくとも８０％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも１００％、又は少なくとも２００％、又は少なくとも３００％、又は少なくとも４００％、又は少なくとも５００％低減した、低減した血小板凝集を示す。

いくつかの実施態様では、本明細書に記載の抗体は、対応する野生型抗体と比較して、低減したインビボでの血小板凝集を示す。いくつかの実施態様では、本明細書に記載の抗体は、インビボアッセイにおいて、対応する野生型抗体よりも少なくとも２倍、又は少なくとも３倍、又は少なくとも５倍、又は少なくとも７倍、又は少なくとも１０倍、又は少なくとも２０倍、又は少なくとも３０倍、又は少なくとも４０倍、又は少なくとも５０倍、又は少なくとも６０倍、又は少なくとも７０倍、又は少なくとも８０倍、又は少なくとも９０倍、又は少なくとも１００倍、又は少なくとも２００倍低い、低減した血小板凝集を示す。いくつかの実施態様では、本明細書に記載の抗体は、インビボアッセイにおいて、対応する野生型抗体と比較して、少なくとも１０％、又は少なくとも２０％、又は少なくとも３０％、又は少なくとも４０％、又は少なくとも５０％、又は少なくとも６０％、又は少なくとも７０％、又は少なくとも８０％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも１００％、又は少なくとも２００％、又は少なくとも３００％、又は少なくとも４００％、又は少なくとも５００％低減した、低減した血小板凝集を示す。

いくつかの実施態様では、本明細書に記載の抗体は、対応する野生型抗体と比較して、低減した血小板活性化及び／又は血小板凝集を示す。

治療に有用なペリオスチン抗体によって結合されるエピトープ
本明細書には、結合した場合に、ペリオスチンの生物学的活性（例えばインテグリンにより媒介される細胞接着）を阻害し、腫瘍の微小環境を変化させる（コラーゲン再構築及び免疫細胞の変化）、ヒトペリオスチンの特有のエピトープ又は領域が記載されている。この結合は、抗体のＣＤＲアミノ酸残基と、ペリオスチン内のアミノ酸残基（例えば接触残基）との間の弱い（ファンデルワールス引力）、中程度の（水素結合）、及び強力な（塩橋）相互作用の組合せである。特定の実施態様では、接触残基は、抗ペリオスチン抗体上の残基と水素結合を形成するペリオスチン上の残基である。特定の実施態様では、接触残基は、抗ペリオスチン抗体上の残基と塩橋を形成するペリオスチン上の残基である。特定の実施態様では、接触残基は、抗ペリオスチン抗体上の残基とファンデルワールス引力を生じ、抗ペリオスチン抗体上の残基の少なくとも５Å、４Å、又は３Å以内である、ペリオスチン上の残基である。

特定の実施態様では、本明細書に記載の抗ペリオスチン抗体は、テネイシンＣ又はＩ型コラーゲンに結合しない。

特定の実施態様では、本明細書には、ペリオスチン（配列番号１５）の以下の残基（Ｎ２７６、Ｒ２８４、Ｅ２８８、Ｌ２８７、Ｖ２９５、又はＫ３０２）のいずれか１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つに結合する、単離された抗体が記載されている。特定の実施態様では、本明細書には、配列番号１５の以下の残基（Ｎ２７６、Ｒ２８４、Ｅ２８８、Ｌ２８７、Ｖ２９５、又はＫ３０２）の全部に結合する、単離された抗体が記載されている。特定の実施態様では、該抗体は、強力な又は中程度の相互作用で抗体と関与する残基にのみ結合する。特定の実施態様では、該抗体は、強力な相互作用で抗体と関与する残基にのみ結合する。いくつかの実施態様では、該抗体は、腫瘍部位における、ＣＤ８陽性Ｔ細胞による、インターフェロンγの発現及び／又は放出を増加させる。いくつかの実施態様では、該抗体は、浸潤腫瘍において抑制性顆粒球系骨髄球系細胞及び／又は腫瘍関連マクロファージの蓄積を減少させる。いくつかの実施態様では、該抗体は、浸潤腫瘍において、炎症誘発性Ｍ１マクロファージ表現型を増加させ、及び／又は、Ｍ２マクロファージ表現型を減少させる。いくつかの実施態様では、該抗体は、腫瘍部位へのＣＤ８陽性Ｔ細胞を増加させ、腫瘍関連マクロファージを減少させ、そして浸潤腫瘍における炎症誘発性Ｍ１マクロファージ表現型を増加させる。

特定の実施態様では、本明細書には、配列番号１５の以下の残基（Ｎ２７６、Ｒ２８４、Ｅ２８８、Ｌ２８７、Ｖ２９５、又はＫ３０２）のいずれか１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つに結合する、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、及び１２のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲを含む抗体が記載されている。特定の実施態様では、本明細書には、配列番号１５の以下の残基（Ｎ２７６、Ｒ２８４、Ｅ２８８、Ｌ２８７、Ｖ２９５、又はＫ３０２）の全てに結合する、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、及び１２のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲを含む抗体が記載されている。特定の実施態様では、該抗体は、強力な又は中程度の相互作用で抗体と関与する残基にのみ結合する。特定の実施態様では、該抗体は、強力な相互作用で抗体と関与する残基にのみ結合する。

特定の実施態様では、本明細書には、配列番号１５の以下の残基（Ｎ２７６、Ｒ２８４、Ｅ２８８、Ｌ２８７、Ｖ２９５、又はＫ３０２）のいずれか１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つに結合する、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、及び１２のいずれか１つに示されるアミノ酸配列とは異なるＣＤＲを含む抗体が記載されている。特定の実施態様では、本明細書には、配列番号１５の以下の残基（Ｎ２７６、Ｒ２８４、Ｅ２８８、Ｌ２８７、Ｖ２９５、又はＫ３０２）のいずれか１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つに結合する、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、及び１２のいずれか１つに示されるアミノ酸配列とは異なるＣＤＲを含む抗体が記載されている。特定の実施態様では、該抗体は、強力な又は中程度の相互作用で抗体と関与する残基にのみ結合する。特定の実施態様では、該抗体は、強力な相互作用で抗体と関与する残基にのみ結合する。

特定の実施態様では、本明細書には、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、及び１２のいずれか１つに示されるアミノ酸配列とは、１、２、３、４、又は５つのアミノ酸残基だけ異なり、そして配列番号１５の以下の残基（Ｎ２７６、Ｒ２８４、Ｅ２８８、Ｌ２８７、Ｖ２９５、又はＫ３０２）のいずれか１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つに結合する、ＣＤＲを含む抗体が記載されている。特定の実施態様では、本明細書には、配列番号１５の以下の残基（Ｎ２７６、Ｒ２８４、Ｅ２８８、Ｌ２８７、Ｖ２９５、又はＫ３０２）のいずれか１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つに結合する、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、及び１２のいずれか１つに示されるアミノ酸配列とは異なるＣＤＲを含む抗体が記載されている。特定の実施態様では、該抗体は、強力な又は中程度の相互作用で抗体と関与する残基にのみ結合する。特定の実施態様では、該抗体は、強力な相互作用で抗体と関与する残基にのみ結合する。

特定の実施態様では、本明細書には、配列番号１３に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％、約９０％、約９５％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一であるヒト又はヒト化重鎖可変領域アミノ酸配列；及び、配列番号１４に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％、約９０％、約９５％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一であるヒト又はヒト化軽鎖可変領域アミノ酸配列を含み、そして、配列番号１５の以下の残基（Ｎ２７６、Ｒ２８４、Ｅ２８８、Ｌ２８７、Ｖ２９５又はＫ３０２）の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つに結合する、ペリオスチンに特異的に結合する抗体が記載されている。特定の実施態様では、本明細書には、配列番号１３に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％、約９０％、約９５％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一であるヒト又はヒト化重鎖可変領域アミノ酸配列；及び、配列番号１４に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％、約９０％、約９５％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一であるヒト又はヒト化軽鎖可変領域アミノ酸配列を含み、そして、配列番号１５の以下の残基（Ｎ２７６、Ｒ２８４、Ｅ２８８、Ｌ２８７、Ｖ２９５又はＫ３０２）の全部に結合する、ペリオスチンに特異的に結合する抗体が記載されている。特定の実施態様では、該抗体は、強力な又は中程度の相互作用で抗体と関与する残基のみに結合する。特定の実施態様では、該抗体は、強力な相互作用で抗体と関与する残基のみに結合する。

特定の実施態様では、本明細書には、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、及び１２のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲを含み、配列番号１３に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％、約９０％、約９５％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一であるヒト又はヒト化重鎖可変領域アミノ酸配列；及び、配列番号１４に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％、約９０％、約９５％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一であるヒト又はヒト化軽鎖可変領域アミノ酸配列を含み、配列番号１５の以下の残基（Ｎ２７６、Ｒ２８４、Ｅ２８８、Ｌ２８７、Ｖ２９５又はＫ３０２）のいずれか１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つに結合する、抗体が記載されている。特定の実施態様では、本明細書には、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、及び１２のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲを含み、配列番号１５の以下の残基（Ｎ２７６、Ｒ２８４、Ｅ２８８、Ｌ２８７、Ｖ２９５又はＫ３０２）の全部に結合する、抗体が記載されている。特定の実施態様では、該抗体は、強力な又は中程度の相互作用で抗体と関与する残基のみに結合する。特定の実施態様では、該抗体は、強力な相互作用で抗体と関与する残基のみに結合する。

特定の実施態様では、本明細書には、配列番号１３に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％、約９０％、約９５％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一であるヒト又はヒト化重鎖可変領域アミノ酸配列（ここでの配列番号１３のアミノ酸残基番号５５は、アスパラギン、セリン、グルタミン、トレオニン、又はアスパラギン酸であり、ここでの配列番号１３のアミノ酸残基番号１００は、メチオニン、イソロイシン、又はバリンである）；及び、配列番号１４に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％、約９０％、約９５％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一であるヒト又はヒト化軽鎖可変領域アミノ酸配列を含み、配列番号１５の以下の残基（Ｎ２７６、Ｒ２８４、Ｅ２８８、Ｌ２８７、Ｖ２９５又はＫ３０２）の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つに結合する、ペリオスチンに特異的に結合する抗体が記載されている。特定の実施態様では、本明細書には、配列番号１３に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％、約９０％、約９５％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一であるヒト又はヒト化重鎖可変領域アミノ酸配列（ここでの配列番号１３のアミノ酸残基番号５５は、アスパラギン、セリン、グルタミン、トレオニン、又はアスパラギン酸であり、ここでの配列番号１３のアミノ酸残基番号１００は、メチオニン、イソロイシン、又はバリンである）；及び、配列番号１４に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％、約９０％、約９５％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一であるヒト又はヒト化軽鎖可変領域アミノ酸配列を含み、配列番号１５の以下の残基（Ｎ２７６、Ｒ２８４、Ｅ２８８、Ｌ２８７、Ｖ２９５又はＫ３０２）の全部に結合する、ペリオスチンに特異的に結合する抗体が記載されている。特定の実施態様では、該抗体は、強力な又は中程度の相互作用で抗体と関与する残基のみに結合する。特定の実施態様では、該抗体は、強力な相互作用で抗体と関与する残基のみに結合する。

特定の実施態様では、本明細書には、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、及び１２のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ、及び配列番号１３に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％、約９０％、約９５％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一であるヒト又はヒト化重鎖可変領域アミノ酸配列（ここでの配列番号１３のアミノ酸残基番号５５は、アスパラギン、セリン、グルタミン、トレオニン、又はアスパラギン酸であり、ここでの配列番号１３のアミノ酸残基番号１００は、メチオニン、イソロイシン、又はバリンである）；並びに、配列番号１４に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％、約９０％、約９５％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一であるヒト又はヒト化軽鎖可変領域アミノ酸配列を含み、配列番号１５の以下の残基（Ｎ２７６、Ｒ２８４、Ｅ２８８、Ｌ２８７、Ｖ２９５又はＫ３０２）の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つに結合する、ペリオスチンに特異的に結合する抗体が記載されている。特定の実施態様では、本明細書には、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、及び１２のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ、及び配列番号１３に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％、約９０％、約９５％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一であるヒト又はヒト化重鎖可変領域アミノ酸配列（ここでの配列番号１３のアミノ酸残基番号５５は、アスパラギン、セリン、グルタミン、トレオニン、又はアスパラギン酸であり、ここでの配列番号１３のアミノ酸残基番号１００は、メチオニン、イソロイシン、又はバリンである）；並びに、配列番号１４に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％、約９０％、約９５％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一であるヒト又はヒト化軽鎖可変領域アミノ酸配列を含み、配列番号１５の以下の残基（Ｎ２７６、Ｒ２８４、Ｅ２８８、Ｌ２８７、Ｖ２９５又はＫ３０２）の全部に結合する、ペリオスチンに特異的に結合する抗体が記載されている。特定の実施態様では、該抗体は、強力な又は中程度の相互作用で抗体と関与する残基のみに結合する。特定の実施態様では、該抗体は、強力な相互作用で抗体と関与する残基のみに結合する。

特定の実施態様では、本明細書には、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、及び１２のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲを含む抗体と結合について競合し、配列番号１５の以下の残基（Ｎ２７６、Ｒ２８４、Ｅ２８８、Ｌ２８７、Ｖ２９５又はＫ３０２）のいずれか１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つに結合する、抗体が記載されている。特定の実施態様では、本明細書には、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、及び１２のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲを含む抗体と結合について競合し、配列番号１５の以下の残基（Ｎ２７６、Ｒ２８４、Ｅ２８８、Ｌ２８７、Ｖ２９５又はＫ３０２）の全部に結合する、抗体が記載されている。特定の実施態様では、該抗体は、強力な又は中程度の相互作用で抗体と関与する残基のみに結合する。特定の実施態様では、該抗体は、強力な相互作用で抗体と関与する残基のみに結合する。

特定の実施態様では、本明細書には、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、及び１２のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲを含む抗体の結合領域と少なくとも部分的に重複し、配列番号１５の以下の残基（Ｎ２７６、Ｒ２８４、Ｅ２８８、Ｌ２８７、Ｖ２９５又はＫ３０２）のいずれか１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つに結合する、結合領域を含む抗体が記載されている。特定の実施態様では、本明細書には、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、及び１２のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲを含む抗体の結合領域と少なくとも部分的に重複し、配列番号１５の以下の残基（Ｎ２７６、Ｒ２８４、Ｅ２８８、Ｌ２８７、Ｖ２９５又はＫ３０２）の全部に結合する、結合領域を含む抗体が記載されている。特定の実施態様では、該抗体は、強力な又は中程度の相互作用で抗体と関与する残基のみに結合する。特定の実施態様では、該抗体は、強力な相互作用で抗体と関与する残基のみに結合する。

特定の実施態様では、本明細書には、配列番号１３に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％、約９０％、約９５％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一であるヒト又はヒト化重鎖可変領域アミノ酸配列；及び、配列番号１４に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％、約９０％、約９５％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一であるヒト又はヒト化軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む、抗体と結合について競合する抗体が記載されている。

特定の実施態様では、本明細書には、配列番号１３に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％、約９０％、約９５％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一であるヒト又はヒト化重鎖可変領域アミノ酸配列；及び、配列番号１４に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％、約９０％、約９５％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一であるヒト又はヒト化軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む、抗体の結合領域と少なくとも部分的に重複する、結合領域を含む抗体が記載されている。

特定の実施態様では、本明細書には、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、及び１２のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲを含む抗体と結合について競合し、配列番号１３に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％、約９０％、約９５％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一であるヒト又はヒト化重鎖可変領域アミノ酸配列；及び、配列番号１４に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％、約９０％、約９５％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一であるヒト又はヒト化軽鎖可変領域アミノ酸配列を含み、配列番号１５の以下の残基（Ｎ２７６、Ｒ２８４、Ｅ２８８、Ｌ２８７、Ｖ２９５又はＫ３０２）のいずれか１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つに結合する、抗体が記載されている。特定の実施態様では、本明細書には、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、及び１２のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲを含み、配列番号１５の以下の残基（Ｎ２７６、Ｒ２８４、Ｅ２８８、Ｌ２８７、Ｖ２９５又はＫ３０２）の全部に結合する、抗体が記載されている。特定の実施態様では、該抗体は、強力な又は中程度の相互作用で抗体と関与する残基のみに結合する。特定の実施態様では、該抗体は、強力な相互作用で抗体と関与する残基のみに結合する。

特定の実施態様では、本明細書には、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、及び１２のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲを含む抗体の結合領域と少なくとも部分的に重複し、配列番号１３に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％、約９０％、約９５％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一であるヒト又はヒト化重鎖可変領域アミノ酸配列；及び、配列番号１４に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％、約９０％、約９５％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一であるヒト又はヒト化軽鎖可変領域アミノ酸配列を含み、配列番号１５の以下の残基（Ｎ２７６、Ｒ２８４、Ｅ２８８、Ｌ２８７、Ｖ２９５又はＫ３０２）のいずれか１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つに結合する、結合領域を含む抗体が記載されている。特定の実施態様では、本明細書には、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、及び１２のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲを含み、配列番号１５の以下の残基（Ｎ２７６、Ｒ２８４、Ｅ２８８、Ｌ２８７、Ｖ２９５又はＫ３０２）の全部に結合する、抗体が記載されている。特定の実施態様では、該抗体は、強力な又は中程度の相互作用で抗体と関与する残基のみに結合する。特定の実施態様では、該抗体は、強力な相互作用で抗体と関与する残基のみに結合する。

特定の実施態様では、本明細書には、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、及び１２のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲを含む抗体と結合について競合し、配列番号１３に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％、約９０％、約９５％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一であるヒト又はヒト化重鎖可変領域アミノ酸配列（ここでの配列番号１３のアミノ酸残基番号５５は、アスパラギン、セリン、グルタミン、トレオニン、又はアスパラギン酸であり、ここでの配列番号１３のアミノ酸残基番号１００は、メチオニン、イソロイシン、又はバリンである）；及び、配列番号１４に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％、約９０％、約９５％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一であるヒト又はヒト化軽鎖可変領域アミノ酸配列を含み、配列番号１５の以下の残基（Ｎ２７６、Ｒ２８４、Ｅ２８８、Ｌ２８７、Ｖ２９５又はＫ３０２）のいずれか１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つに結合する、抗体が記載されている。特定の実施態様では、本明細書には、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、及び１２のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲを含み、配列番号１５の以下の残基（Ｎ２７６、Ｒ２８４、Ｅ２８８、Ｌ２８７、Ｖ２９５又はＫ３０２）の全部に結合する、抗体が記載されている。特定の実施態様では、該抗体は、強力な又は中程度の相互作用で抗体と関与する残基のみに結合する。特定の実施態様では、該抗体は、強力な相互作用で抗体と関与する残基のみに結合する。

特定の実施態様では、本明細書には、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、及び１２のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲを含む抗体の結合領域と少なくとも部分的に重複し、配列番号１３に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％、約９０％、約９５％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一であるヒト又はヒト化重鎖可変領域アミノ酸配列（ここでの配列番号１３の残基番号５５のアミノ酸は、アスパラギン、セリン、グルタミン、トレオニン、又はアスパラギン酸であり、ここでの配列番号１３の残基１００のアミノ酸は、メチオニン、イソロイシン、又はバリンである）；及び、配列番号１４に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％、約９０％、約９５％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一であるヒト又はヒト化軽鎖可変領域アミノ酸配列を含み、配列番号１５の以下の残基（Ｎ２７６、Ｒ２８４、Ｅ２８８、Ｌ２８７、Ｖ２９５又はＫ３０２）のいずれか１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つに結合する、結合領域を含む抗体が記載されている。特定の実施態様では、本明細書には、配列番号１５の以下の残基（Ｎ２７６、Ｒ２８４、Ｅ２８８、Ｌ２８７、Ｖ２９５又はＫ３０２）の全部に結合し、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、及び１２のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲを含む、抗体が記載されている。特定の実施態様では、該抗体は、強力な又は中程度の相互作用で抗体と関与する残基のみに結合する。特定の実施態様では、該抗体は、強力な相互作用で抗体と関与する残基のみに結合する。

治療法
本明細書に開示された抗体は、がん又は腫瘍の処置に有用な抗体である。処置は、処置される容態を改善又は寛解することを探究した方法を指す。がんに関する処置は、腫瘍体積の低減、腫瘍体積の成長の低減、無進行生存期間又は寿命の延長を含むがこれらに限定されない。特定の実施態様では、処置は、処置されるがんの緩解に影響を及ぼすだろう。特定の実施態様では、処置は、以前に処置されたがん又は腫瘍の再発若しくは進行を予防することを目的とした、予防用量又は維持用量としての使用を包含する。当業者によって、該抗体は、安全かつ有効であり得るが、全ての個体が、投与される処置に等しく応答するわけではなく、それにも関わらずこれらの個体は処置されると判断されることが理解される。

本明細書に記載の抗体によって処置可能な腫瘍としては、ペリオスチンを発現する腫瘍が挙げられる。ペリオスチンは、がん関連線維芽細胞によって分泌される、細胞外マトリックスの一成分であり、よって、大半の腫瘍は、ペリオスチンを発現するか又は含むであろう。特定の実施態様では、処置される腫瘍は、ペリオスチン陽性であり、検出可能なペリオスチンを有するか、又は確率の高い腫瘍の集団分析に基づいて検出可能なペリオスチンを有することが知られている腫瘍である。特定の実施態様では、ペリオスチンの高い腫瘍は、約５０以上のＩＨＣスコアを有するものである。

特定の実施態様では、がん又は腫瘍は、固形がん又は腫瘍である。特定の実施態様では、がん又は腫瘍は、血液がん又は腫瘍である。特定の実施態様では、がん又は腫瘍は、乳腺、心臓、肺、小腸、大腸、脾臓、腎臓、膀胱、頭部、頸部、卵巣、前立腺、脳、膵臓、皮膚、骨、骨髄、血液、胸腺、子宮、精巣、及び肝臓の腫瘍を含む。特定の実施態様では、本発明の抗体を用いて処置され得る腫瘍又はがんは、腺腫、腺がん、血管肉腫、星状細胞腫、上皮がん、胚細胞腫、神経膠芽腫、神経膠腫、血管内皮腫、血管肉腫、血腫、肝芽腫、白血病、リンパ腫、髄芽腫、黒色腫、神経芽細胞腫、骨肉腫、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、肉腫、及び／又は奇形腫を含む。特定の実施態様では、腫瘍／がんは、末端黒子型黒色腫、日光角化症、腺がん、腺様嚢胞がん、腺腫、腺肉腫、腺扁平上皮がん、星細胞腫、バルトリン腺がん、基底細胞がん、気管支腺がん、毛細血管カルチノイド、細胞がん、がん肉腫、胆管細胞がん、軟骨肉腫、嚢胞腺腫、卵黄嚢腫瘍、子宮内膜増殖症、子宮内膜間質肉腫、類内膜腺がん、上衣腫、ユーイング肉腫、限局性結節性過形成、ガストリン産生腫瘍、生殖系列腫瘍、神経膠腫、グルカゴン産生腫瘍、血管芽腫、血管内皮腫、血管腫、肝腺腫、肝腺腫症、肝細胞がん、インスリナイト（insulinite）、上皮内腫瘍、上皮内扁平細胞腫瘍、浸潤性扁平細胞がん、大細胞がん、脂肪肉腫、肺がん、リンパ芽球性白血病、リンパ球性白血病、平滑筋肉腫、黒色腫、悪性黒色腫、悪性中皮腫、神経鞘腫、髄芽腫、髄上皮腫、中皮腫、粘表皮がん、骨髄性白血病、神経芽細胞腫、神経上皮腺がん、結節性黒色腫、骨肉腫、卵巣がん、漿液性乳頭状腺がん、下垂体腫瘍、形質細胞腫、偽肉腫、前立腺がん、肺芽腫、腎細胞がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、肉腫、漿液性がん、扁平細胞がん、小細胞がん、軟組織がん、ソマトスタチン分泌腫瘍、扁平上皮がん、扁平上皮細胞がん、未分化がん、ぶどう膜黒色腫、疣状がん、膣／外陰部がん、ＶＩＰ（血管作動性腸管ペプチド）産生腫瘍、及びウィルムス腫瘍の群から選択される。特定の実施態様では、本発明の１つ以上の抗体を用いて処置される予定の腫瘍／がんは、脳がん、頭頸部がん、頭頸部扁平細胞がん、結腸直腸がん、急性骨髄性白血病、前駆Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病、膀胱がん、星細胞腫、好ましくはグレードＩＩ、ＩＩＩ、又はＩＶの星細胞腫、神経膠芽腫、多形神経膠芽腫、小細胞がん、及び非小細胞がん、好ましくは非小細胞肺がん、肺腺がん、転移性黒色腫、アンドロゲン非依存性転移性前立腺がん、アンドロゲン依存性転移性前立腺がん、前立腺腺がん、及び乳がん、好ましくは乳管がん、及び／又は乳がんを含む。いくつかの実施態様では、がんは、神経膠芽腫、膵臓がん、乳がん、膀胱がん、腎臓がん、頭頸部がん、卵巣がん、皮膚がん、胃がん、中皮腫、肝臓がん、子宮内膜がん、大腸がん、子宮頸がん、前立腺がん、又は肺がんを含む。特定の実施態様では、この開示の抗体を用いて処置されるがんは、神経膠芽腫を含む。特定の実施態様では、この開示の１つ以上の抗体を用いて処置されるがんは、膵臓がんを含む。特定の実施態様では、この開示の１つ以上の抗体を用いて処置されるがんは、卵巣がんを含む。特定の実施態様では、この開示の１つ以上の抗体を用いて処置されるがんは、肺がんを含む。特定の実施態様では、この開示の１つ以上の抗体を用いて処置されるがんは、扁平細胞肺がんを含む。特定の実施態様では、この開示の１つ以上の抗体を用いて処置されるがんは、前立腺がんを含む。特定の実施態様では、この開示の１つ以上の抗体を用いて処置されるがんは、大腸がんを含む。特定の実施態様では、処置されるがんは、神経膠芽腫、膵臓がん、卵巣がん、大腸がん、前立腺がん、又は肺がんを含む。特定の実施態様では、がんは、他の処置に対して難治性である。特定の実施態様では、処置されるがんは、再発している。特定の実施態様では、がんは、再発した／難治性の神経膠芽腫、膵臓がん、卵巣がん、大腸がん、前立腺がん、又は肺がんである。

特定の実施態様では、前記抗体は、それを必要とする被験者に、抗体を含有している医薬組成物の投与に適した任意の経路、例えば、皮下、腹腔内、静脈内、筋肉内、腫瘍内、又は脳内などの経路によって投与され得る。特定の実施態様では、該抗体は静脈内に投与される。特定の実施態様では、該抗体は皮下に投与される。特定の実施態様では、該抗体は腫瘍内に投与される。特定の実施態様では、該抗体は、適切な投薬計画で、例えば週１回、週２回、月１回、月２回、２週間毎に１回、３週間毎に１回、又は月１回などで投与される。特定の実施態様では、該抗体は３週間毎に１回投与される。該抗体は、任意の治療有効量で投与され得る。特定の実施態様では、治療に許容される量は、約０．１mg/kgから約５０mg/kgである。特定の実施態様では、治療に許容される量は、約１mg/kgから約４０mg/kgである。特定の実施態様では、治療に許容される量は、約５mg/kgから約３０mg/kgである。治療有効量は、処置される予定の疾患又は苦痛に伴う１つ以上の症状を寛解するに十分な量を含む。

本明細書に記載の抗ペリオスチン抗体はまた、個体の腫瘍内のコラーゲン含量を減少させる方法において有用である。

本明細書に記載の抗ペリオスチン抗体はまた、個体の腫瘍内のＭ１マクロファージ表現型を増加させる及び／又はＭ２マクロファージ表現型を減少させる方法において有用である。

本明細書に記載の抗ペリオスチン抗体はまた、個体における抑制性顆粒球系骨髄球系細胞及び／又は腫瘍関連マクロファージの蓄積を減少させる方法において有用である。

本明細書に記載の抗ペリオスチン抗体はまた、個体の腫瘍内のＣＤ４陽性及び／又はＣＤ８陽性Ｔ細胞の出現頻度を増加させる方法において有用である。

本明細書に記載の抗ペリオスチン抗体はまた、個体の腫瘍内のＣＤ８陽性Ｔ細胞によるインターフェロンγの発現及び／又は放出を増加させる方法において有用である。

本明細書に記載の抗体は、個体の腫瘍内のコラーゲン含量を減少させるための医薬品の製造において有用である。

本明細書に記載の抗体は、個体の腫瘍内のＭ１マクロファージ表現型を増加させるための及び／又はＭ２マクロファージ表現型を減少させるための医薬品の製造において有用である。

本明細書に記載の抗体は、個体における抑制性顆粒球系骨髄球系細胞及び／又は腫瘍関連マクロファージの蓄積を減少させるための医薬品の製造において有用である。

本明細書に記載の抗体は、個体の腫瘍内のＣＤ４陽性及び／又はＣＤ８陽性Ｔ細胞の出現頻度を増加させるための医薬品の製造において有用である。

本明細書に記載の抗体は、個体の腫瘍内のＣＤ８陽性Ｔ細胞によるインターフェロンγの発現及び／又は放出を増加させるための医薬品の製造において有用である。

薬学的に許容される賦形剤、担体、及び希釈剤
本明細書に記載の抗体は、ヒト個体への投与に十分なほど純粋な、単離され精製された形態で提供され得る。

特定の実施態様では、今回の開示の抗ペリオスチン抗体は、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤、担体、及び希釈剤を含む医薬組成物に含まれる。特定の実施態様では、今回の開示の抗体は、無菌溶液中に懸濁して投与される。特定の実施態様では、該溶液は、約０．９％のＮａＣｌ又は約５％のデキストロース、グルコース、又はショ糖を含む。特定の実施態様では、該溶液はさらに、緩衝液、例えば酢酸塩、クエン酸塩、ヒスチジン、コハク酸塩、リン酸塩、重炭酸塩、及びヒドロキシメチルアミノメタン（トリス）；界面活性剤、例えばポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）、ポリソルベート２０（Ｔｗｅｅｎ２０）、及びポロキサマー１８８；ポリオール／二糖／多糖、例えばグルコース、デキストロース、マンノース、マンニトール、ソルビトール、ショ糖、トレハロース、及びデキストラン４０；アミノ酸、例えば、グリシン又はアルギニン；抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸、メチオニン；又は、キレート剤、例えばＥＤＴＡ若しくはＥＧＴＡ、の中の１つ以上を含む。

特定の実施態様では、今回の開示の抗体は、凍結乾燥して発送／保存され、投与前に復元される。特定の実施態様では、凍結乾燥した抗体製剤は、増量剤、例えばマンニトール、ソルビトール、ショ糖、トレハロース、デキストラン４０、又はその組合せを含む。凍結乾燥製剤は、ガラス又は他の適切な非反応性材料のバイアルに含まれて含有され得る。製剤化された場合、復元されるか否かに関わらず、該抗体は、特定のｐＨで、一般的には７．０未満で緩衝化され得る。特定の実施態様では、ｐＨは、４．５～６．５、４．５～６．０、４．５～５．５、４．５～５．０、又は５．０～６．０であり得る。

本明細書には、適切な容器内の本明細書に記載の１つ以上の抗体と、使用説明書、希釈剤、賦形剤、担体、及び投与用の器具から選択された１つ以上の追加の成分とを含む、キットも記載されている。

特定の実施態様では、本明細書には、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤、担体、又は希釈剤と、今回の開示の抗体とを混合する工程を含む、がん処置を調製する方法が記載されている。特定の実施態様では、本明細書には、今回の開示の１つ以上の抗体を凍結乾燥させる工程を含む、保存又は発送のためのがん処置を調製する方法が記載されている。

実施例
以下の例示的な実施例は、本明細書に記載の組成物及び方法の実施態様の代表であり、いずれにしても限定することを意味するものではない。

実施例１－抗体の作製及びスクリーニング
完全ヒトファージライブラリーを使用して、ファージディスプレイ抗体発見キャンペーンを実施し、ペリオスチンに対する結合物を単離した。簡潔に言えば、３回のパンニングを、組換えヒトペリオスチン、組換えマウスペリオスチン、又はその組合せのいずれかを使用して行ない、マウス交差反応性結合物の同定に重点が置かれた。このパンニング戦略から、マウスペリオスチンと交差反応する７８個の配列の特有なＳｃＦｖが同定され、細胞接着アッセイにおける機能スクリーニングのためにヒトＩｇＧ１フォーマットで生成された。図１を参照されたい。

組換えヒト又はマウスのペリオスチンを、９６ウェルプレート上に４℃で一晩かけてコーティングした。翌日、プレートをＰＢＳで洗浄し、２％ウシ血清アルブミンを用いて３７℃で１時間かけてブロッキングした。ブロッキング後、抗体をプレートに加え、３７℃で３０分間インキュベートした。次いで、インキュベーション後、５０，０００個のＩＭＲ９０ヒト肺線維芽細胞又は５０，０００個のＭＬＧマウス線維芽細胞をウェルに加え、３７℃で２時間のインキュベートを可能とした。その後、プレートをＰＢＳで２回洗浄し、ウェルの集密度を、ＩｎｃｕＣｙｔｅプラットフォームを使用して測定した。５００nMでの高濃度の単一用量のスクリーニングから、２１個のＩｇＧが、図１に示されるように、５０％を超える阻害を有するとして同定され、結合スクリーニングへと進めて、以下の表１に示されるように、ヒト及びマウスのペリオスチンに対する相対的親和性を決定した。

組換えヒト又はマウスのペリオスチンに対する相対的親和性を決定するために、これらのタンパク質を、マキシソーププレート上に４℃で一晩かけてコーティングした。翌日、プレートを、カゼインブロッキング緩衝液を用いて３７℃で１時間かけてブロッキングした。各抗体の滴定液をプレートに加え、室温で１時間かけて結合させた。プレートをＰＢＳＴで４回洗浄し、その後、セイヨウワサビペルオキシダーゼにコンジュゲートさせた抗ヒトＦｃ二次抗体と共に室温で３０分間インキュベートした。その後、プレートを再度、４×ＰＢＳＴで洗浄し、その後、ＴＭＢ基質及び１Ｍ ＨＣｌを使用して展開した。このスクリーニングから、ヒトペリオスチン及びマウスペリオスチンの両方に対して１nM未満の結合ＥＣ５０値を有する、４つのクローンが選択された（表１に太字及びイタリック体によって印が付けられている）。

実施例２－ＮＢ０８２８及び配列変異体の作製
４つの候補を、細胞接着アッセイにおいて用量反応で再試験し、ＩＣ５０値を決定した。このスクリーニングから、ＮＢ０６２７は、特に適したＩｇＧとして同定された（表２）。

その後、ＮＢ０６２７を、エフェクターサイレントなＩｇＧ４ＰＡＡアイソタイプに変換して、リード候補のＮＢ０８２８が作製された。ＮＢ０８２８の配列分析は、ＶＨ領域における２つの翻訳後修飾の障害箇所を同定した。最初の脱アミド化部位は、ＣＤＲ－Ｈ２に位置し、第二の酸化部位は、ＣＤＲ－Ｈ３に位置する。それ故、これらの障害箇所を除去する試みにおいて、いくつかの単一突然変異体及び二重突然変異体を作製し、それらの結合及び活性を測定した。ＮＢ０８２８及びその変異体についてのＩＣ５０値及びＥＣ５０値の結果の要約を表３に列挙する。

実施例３－マウス膀胱ＭＢ４９及び大腸ＣＴ２６腫瘍モデルにおけるＮＢ０８２８のインビボにおける有効性
ＮＢ０８２８の有効性を、２つの別々の腫瘍モデルである膀胱ＭＢ４９及び大腸ＣＴ２６の腫瘍モデルにおいて試験した。簡潔に言えば、２５０，０００個のＭＢ４９細胞を、雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスの脇腹に皮内注射したか、又は、５０，０００個のＣＴ２６細胞を、雌Ｂａｌｂ／ｃマウスの脇腹に皮内注射した。腫瘍の移植から３日後、マウスを、ＮＢ０８２８（５０mg/kg、週３回）又はビヒクル対照（ＰＢＳ）のいずれかを用いて腹腔内に処置した。腫瘍体積を、カリパスによる測定により週２回評価し、（長さ×幅^２）/２として計算した。マウスを、腫瘍のサイズがいずれかの単一の方向で１５mmを超えた場合、又は人道的終点としての腫瘍の潰瘍化に因り安楽死させた。

図２（ＭＢ４９）及び図５（ＣＴ２６）に示されるように、ＮＢ０８２８は、両方のモデルにおいて腫瘍の増殖を低減させるのに効果を示した。ＭＢ４９モデルにおける腫瘍増殖のこの低減は、図３に示されるような腫瘍内顆粒球系骨髄球系細胞のより低い出現頻度、及び図４に示されるようなより低いコラーゲン含量を伴っていた。ＭＢ４９モデルと同様に、ＣＴ２６モデルは、顆粒球系骨髄球系細胞の低減を示した。さらに、ＮＢ０８２８は、図６に示されるように、ＮＢ０８２８による処置の結果として、腫瘍浸潤マクロファージの出現頻度を低減させ、存在していたマクロファージは、Ｍ１表現型へと偏向した。ＣＴ２６マウスモデルにおいて、ＮＢ０８２８による処置はまた、図７に示されるように、腫瘍浸潤ＣＤ８陽性及びＣＤ４陽性Ｔ細胞のより高い出現頻度、並びにインターフェロンγのより高い発現によって測定されるような高められたＣＤ８陽性Ｔ細胞機能も伴っていた。

免疫表現型検査
ＭＢ４９又はＣＴ２６の担がんマウスを、ＮＢ０８２８又はビヒクル対照を用いて、記載のように３日目から開始して処置した。示されるデータについて、免疫表現型検査は、ＭＢ４９及びＣＴ２６についてそれぞれ、腫瘍の移植後２０日目及び１８日目に実施された。腫瘍を切除し、皮膚を除去し、手術用のメスの刃を使用して機械的に破壊し、その後、ミルテニー社のマウス腫瘍解離酵素混液を使用して酵素消化した。消化された試料を、４０μmのろ過器を通し、ＲＰＭＩで洗浄し、その後、ＲＰＭＩ＋１０％のウシ胎児血清で２回目の洗浄を行なった。その後、細胞を、計数のために再懸濁し、１試料あたり最大で２×１０^６個の白血球を蒔き、フローサイトメトリーによる分析のために染色した。ＣＴ２６モデルにおけるＣＤ８陽性腫瘍浸潤リンパ球の機能の評価のために、消化された腫瘍の単一細胞懸濁液を、抗ＣＤ２８抗体及びブレフェルディンＡの存在下で、ＡＨ１ペプチド［Ｈ２－Ｌ^ｄ拘束性ｇｐ７０（４２３～４３１）ＭｕＬＶエピトープ、ＣＴ２６細胞によって発現される免疫優性ＣＤ８陽性Ｔ細胞エピトープ］を用いて３７℃で５時間刺激した。刺激後、標準的な表面／細胞内染色法によって、細胞を染色して、フローサイトメトリーを使用して、ＣＤ８陽性Ｔ細胞によるＩＦＮ－γの産生を検出した。示された細胞集団を評価するために使用されたフロー染色パネルは、以下の表４に含まれる。生存率判定染色（サーモフィッシャー社、Live/Dead Fixable Violet Stain）を使用して、生細胞イベントのみを調べることが可能となり、汎白血球マーカーＣＤ４５が、免疫コンパートメント内の集団の標準化を可能とするために含められた。関心対象の免疫集団は、以下のように表現型的に／機能的に定義された：全骨髄球系細胞（ＣＤ４５陽性ＣＤ１１ｂ陽性）、顆粒球（ＣＤ４５陽性ＣＤ１１ｂ陽性Ｇｒ－１ ｈｉ又はＣＤ４５陽性ＣＤ１１ｂ陽性Ｌｙ６Ｇ陽性Ｌｙ６Ｃ ｌｏ）、マクロファージ（ＣＤ４５陽性ＣＤ１１ｂ陽性Ｌｙ６Ｇ陰性Ｌｙ６Ｃ ｌｏ／陰性Ｆ４/８０陽性）、Ｍ１マクロファージ（ＭＨＣ ＩＩ陽性ＣＤ２０６陰性）、Ｍ２マクロファージ（ＭＨＣ ＩＩ陰性ＣＤ２０６陽性）、ＣＤ８陽性腫瘍浸潤リンパ球（ＣＤ４５陽性ＣＤ１１ｂ陰性ＣＤ３陽性ＣＤ９０．２陽性ＣＤ８陽性）、ＣＤ４陽性腫瘍浸潤リンパ球（ＣＤ４５陽性ＣＤ１１ｂ陰性ＣＤ３陽性ＣＤ９０．２陽性ＣＤ４陽性）、ＩＦＮ－γ陽性ＣＤ８陽性腫瘍浸潤リンパ球（ＣＤ４５陽性ＣＤ１１ｂ陰性ＣＤ３陽性ＣＤ８陽性ＩＦＮ－γ陽性）。蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）を、ＩＦＮ－γ陽性ＣＤ８陽性腫瘍浸潤リンパ球に由来するＩＦＮ－γ染色強度の決定のために使用した。

コラーゲン含量
腫瘍のコラーゲン総含量を、クイックザイム社の総コラーゲンアッセイを使用したヒドロキシプロリンの定量によって評価した。試料の調製のために、ＭＢ４９腫瘍を、腫瘍が終点に達した時に担がんマウスから切除し、液体窒素中で瞬間凍結させ、－８０℃で保存し、その後、分析した。腫瘍材料を秤量し、６Ｍ ＨＣｌに１mlのＨＣｌあたり２００mgの腫瘍の割合で再懸濁し、ボルテックスにかけ、９５℃で２０時間インキュベートした。チューブを冷却し、１３，０００ＲＰＭで１０分間遠心分離にかけ、上清を回収した。上清を、製造業者の推奨するプロトコールに従って、ミリＱ水で希釈し、その後、４Ｍ ＨＣｌで希釈し、供給された緩衝液及び検出試薬を使用してヒドロキシプロリンの検出のために蒔き、技術的反復実験を行なった。５７０nmにおける吸光度の数値を測定し、供給されたコラーゲンを使用して作成された標準曲線と比較して、各試料中のコラーゲンの量を計算した。各試料の計算された総コラーゲン量（μg）を、腫瘍投入量の総質量（mg）で割り、腫瘍試料間のデータを標準化した。

実施例４－マウス大腸ＭＣ３８腫瘍モデルにおけるＮＢ０８２８のインビボでの有効性
ＮＢ０８２８を、マウス大腸ＭＣ３８腫瘍モデルにおける腫瘍増殖を低減させるその有効性について試験し、結果を図８に示した。簡潔に言えば、２００，０００個のＭＣ３８細胞を、雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスの脇腹に皮内注射した。腫瘍の移植から３日後、マウスを、ＮＢ０８２８（５０mg/kg、週３回）又はビヒクル対照（ＰＢＳ）のいずれかを用いて腹腔内に処置した。ＣＤ８陽性Ｔ細胞の除去のために、抗マウスＣＤ８ａ抗体（クローン２．４３）又はＩｇＧアイソタイプ対照（クローンＬＴＦ－２）を、最初の６回の投薬（１０mg/kg、週３回）についてはＮＢ０８２８と共に送達した。血液中のＴ細胞の除去は、表５に列挙されたフロー染色パネルを使用したフローサイトメトリーによって確認された。腫瘍体積を、ＭＢ４９及びＣＴ２６のモデルについて記載されているのと同じ方法を使用して測定した。ＮＢ０８２８は、ＭＣ３８モデルにおいて腫瘍増殖を低減するのに効果的であった（図８）。ＮＢ０８２８はまた、図９Ａ及び９Ｃに示されているように、腫瘍微小環境を変化させることにより、ＣＤ８陽性Ｔ細胞を増加させ、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）の出現頻度を減少させ、炎症誘発性マクロファージの比を増加させるのに効果的であった。ＮＢ０８２８のこのモデルにおける腫瘍増殖を低減させる効力は、ＣＤ８陽性Ｔ細胞に依存していた。なぜなら、ＮＢ０８２８による処置中のＣＤ８陽性Ｔ細胞の除去は、図９Ｄに示されるように、ＮＢ０８２８の有益な効果を元に戻したからである。要するに、このデータは、ＮＢ０８２８が、効果的に腫瘍増殖を低減させ、腫瘍部位へのＣＤ８陽性Ｔ細胞を増加させ、腫瘍関連マクロファージを減少させ、浸潤腫瘍における炎症誘発性Ｍ１マクロファージ表現型を増加させることを示す。

免疫表現型検査
腫瘍を切除し、皮膚を除去し、手術用のメスを使用して機械的に破壊し、その後、ミルテニー社のマウス腫瘍解離酵素混液を使用して酵素消化した（３７℃で振盪プラットフォーム上で４５分間のインキュベーション）。消化された試料を、４０μmのろ過器を通し、ＲＰＭＩで洗浄し、その後、ＲＰＭＩ＋１０％のウシ胎児血清で２回目の洗浄を行なった。その後、細胞を、計数のために再懸濁し、１試料あたり最大で２×１０^６個の白血球を蒔き、フローサイトメトリーによる分析のために染色した。ＭＣ３８モデルにおけるＣＤ８陽性腫瘍浸潤リンパ球（ＣＤ８陽性ＴＩＬ）機能の評価のために、消化された腫瘍の単一細胞懸濁液（１試料あたり最大２×１０^６個の白血球）を、抗ＣＤ２８抗体及びブレフェルディンＡの存在下で、ｐ１５Ｅペプチド［ＭＣ３８腫瘍によって発現される、Ｈ２－Ｋ^ｂ拘束性ｐ１５Ｅ（６０４～６１１）ＭｕＬＶエピトープ］を用いて３７℃で５時間刺激した。刺激後、細胞を染色して、eBioscience社の細胞内固定及び透過緩衝液セットを使用した標準的な表面／細胞内染色法によるフローサイトメトリーを使用して、ＣＤ８陽性Ｔ細胞によるＩＦＮ－γの産生を検出した。示された細胞集団を評価するために使用されたフロー染色パネルは、以下の表に含まれる。生存率判定染色（サーモフィッシャー社、生死判別のための固定可能なバイオレット染色（Live/Dead Fixable Violet Stain））を使用して、生細胞イベントのみを調べることが可能となり、汎白血球マーカーＣＤ４５が、免疫コンパートメント内の集団の標準化を可能とするために含められた。ＭＣ３８における研究のために、関心対象の報告された免疫集団は、以下のように表現型的に／機能的に定義された：総骨髄球系細胞（ＣＤ４５陽性ＣＤ１１ｂ陽性）、マクロファージ（ＣＤ４５陽性ＣＤ１１ｂ陽性Ｌｙ６Ｇ陰性Ｌｙ６Ｃ ｌｏ/陰性Ｆ４/８０陽性）、Ｍ１マクロファージ（ＭＨＣ ＩＩ陽性）、Ｍ２マクロファージ（ＭＨＣ ＩＩ陰性）、ＣＤ８陽性腫瘍浸潤リンパ球（ＣＤ４５陽性ＣＤ１１ｂ陰性ＣＤ３陽性ＳＳＣ ｌｏ ＣＤ８陽性）、ＩＦＮ－γ陽性ＣＤ８陽性腫瘍浸潤リンパ球（ＣＤ４５陽性ＣＤ１１ｂ陰性ＣＤ３陽性ＳＳＣ ｌｏＣＤ８陽性ＩＦＮ－γ陽性）。

実施例５－ＮＢ０８２８は、ペリオスチン（ＰＯＳＴＮ）のＦＡＳ２ドメインに結合する
ＮＢ０８２８の結合領域を調べて、抗体をさらに特徴付けた。

ＢＩＧＨ３／ＰＯＳＴＮキメラタンパク質の作製
配列的にペリオスチンに最も近い相同タンパク質は、形質転換増殖因子β誘導タンパク質（ＢＩＧＨ３）であり、これは、該タンパク質のＥＭＩ－ＦＡＳ４領域内に４８％の配列相同率を有する。２つのタンパク質間の配列相同率は低いが、全体的なドメイン構造は非常に類似しており、１つのＥＭＩドメインと４つの直列ファシクリン（ＦＡＳ）ドメインを含んでいる。ＮＢ０８２８は、高い親和性で、ペリオスチンに結合するが、ＢＩＧＨ３には結合しない。ＮＢ０８２８の結合ドメインをさらに特徴付けるために、ＢＩＧＨ３／ＰＯＳＴＮキメラタンパク質を作製し、ここで、ペリオスチンの各ドメインを、ＢＩＧＨ３の対応するドメインと置き換え、５つのＢＩＧＨ／ＰＯＳＴＮキメラを作製した（図１０）。ＮＢ０８２８結合研究を、これらのタンパク質に対してＥＬＩＳＡによって実施した。図１１Ａに示されているように、ＮＢ０８２８は、ＦＡＳ２キメラを除いて、全てのＢＩＧＨ３／ＰＯＳＴＮキメラへの結合を保持している。ＰＯＳＴＮ ＦＡＳ２ドメインをＢＩＧＨ３ ＦＡＳ２ドメインで置き換えた場合の、この観察可能な結合の減少は、ＮＢ０８２８がＰＯＳＴＮのＦＡＳ２ドメインに結合することを示す。

ＰＯＳＴＮ ＦＡＳ２変異体の作製
ペリオスチンのＦＡＳ２ドメインは、１３２アミノ酸から構成される立体配座構造である。ＦＡＳ２ドメイン間の様々な位置における単一のアミノ酸置換（アラニン）変異体を作製して、ＮＢ０８２８エピトープ又は結合領域をさらに規定し、重要な接触残基を同定した（表５）。公開されている結晶構造（Liu et al, 2018; PDB # 5YJG）を使用して、コンピューター分析ツールであるＭＯＥにおける表面露出に基づいて、突然変異誘発のための残基を同定した。

全ＦＡＳ２ドメインにわたる残基にわたる２３個のアラニン変異体を、初回に作製した。ＮＢ０８２８の結合研究を、これらの変異体に対して実施し、アッセイ内の最大のシグナルから５０％を超えて減少した変異体を、結合にとって重要な残基として同定した。図１１Ｂは、そのスクリーニングの結果を示す。ＮＢ０８２８の結合にとって重要なアミノ酸を示した２つの変異体を同定した：ＮＢ１２０５（Ｒ２８４Ａ）及びＮＢ１２０７（Ｅ２８８Ａ）。これらの２つのアミノ酸が近接していることから（図１２）、２回目の１１個の追加の変異体を作製し、この領域内の残基により特に焦点を当てた。図１１Ｃは、２回目のスクリーニングの結果を示す。２回目のスクリーニングのＥＬＩＳＡ結果に基づいて、ＮＢ０８２８の結合にとって重要なアミノ酸を示した追加の４つの変異体を同定した：ＮＢ１２４３（Ｌ２８７Ａ）、ＮＢ１２４６（Ｖ２９５Ａ）、ＮＢ１２４８（Ｋ３０２Ａ）及びＮＢ１２０２（Ｎ２７６Ａ）。特に、ＮＢ１１９０（Ｄ２４５Ａ）（これは、最大シグナルカットオフ値から５０％を超える減少に非常に近かったが、これより下回らなかった）は、残りの残基とは別のループに位置するが、ＦＡＳドメイン内にありＮＢ０８２８の結合するループ上にあり、Ｎ２７６と接触点を形成する（図１２）。Ｎ２７６は、ＮＢ０８２８への結合にとって重要な残基として同定されたことから、Ｄ２４５残基もまた、ＮＢ０８２８に対する接触残基であり得るか、又は結合にとって重要であるＮＢ０８２８エピトープループに対し構造的整合性を提供し得るかのいずれかである。

種間のＮＢ０８２８の親和性の決定
ヒト、マウス、ラット、及びカニクイザルの種間のＮＢ０８２８の結合親和性が決定された。ＮＢ０８２８の親和性は、octet redシステムを使用して決定された。簡潔に言えば、抗ヒトＦｃ抗体（ＡＨＣ）バイオセンサーを使用して、ＮＢ０８２８を捕捉し、その後、滴定量の組換えヒト、マウス、ラット、又はカニクイザルのペリオスチンと会合させた（１００nM→０nM；１：２の希釈率）。組換えヒト、マウス、及びラットのペリオスチンは、Ｒ＆Ｄシステム社から商業的に購入し、カニクイザルのペリオスチンは社内で作製された。結果は、４つの種間のペリオスチンに対するＮＢ０８２８の親和性が、非常に類似し、０．１～０，５nMの範囲内であることを示す。このデータは、上記に詳述されたエピトープマッピング実験を強く支持する。なぜなら、記載のＮＢ０８２８の結合ループにおける配列同一率が、４つの種間で１００％であったからである。

実施例６－ＮＢ０８２８は、テネイシンＣ及びＩ型コラーゲンに対するペリオスチンの結合を遮断しないが、細胞の接着は遮断する
ＮＢ０８２８が、細胞外タンパク質であるテネイシンＣ及びＩ型コラーゲンに対するペリオスチンの結合を遮断するかどうかを決定するために、競合的ＥＬＩＳＡアッセイを実施した。組換えヒトペリオスチン（２ng/mL）を、マキシソーププレート上に４℃で一晩かけてコーティングした。翌日、プレートをカゼインブロッキング緩衝液を用いて３７℃で１時間かけてブロッキングした。組換えヒトテネイシンＣ及びヒトＩ型コラーゲンについての結合ＥＣ_８０を決定するために、タンパク質を、ＥＺ－Ｌｉｎｋ（商標）ＮＨＳ－ＰＥＧ４－ビオチン（フィッシャー社）を使用して１０：１でビオチニル化し、各ビオチニル化タンパク質の滴定液をプレートに加え、室温で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴで４回洗浄し、その後、アビジン－ＨＲＰ（セイヨウワサビペルオキシダーゼ）を使用して３０分間かけて検出した。その後、プレートを、再度、４×ＰＢＳＴで洗浄し、ＴＭＢ基質及び１Ｍ ＨＣｌを使用して展開した。各タンパク質のＥＣ_８０は、グラフパッドプリズム７ソフトウェアを使用して決定された。競合的ＥＬＩＳＡのために、ＮＢ０８２８の滴定液、対照ＩｇＧ、又はＰＢＳＴをプレートに加え、室温で３０分間振盪しながらインキュベートした。その後、プレートをＰＢＳＴで４回洗浄し、ビオチニル化テネイシンＣ（０．９nM、１３Ａ、左）、又はコラーゲン（１００nM、１３Ｂ、左）のいずれかのＥＣ_８０結合濃度、又は予め混合された遮断対照をプレートに加えた。予め混合された遮断対照は、ＥＣ_８０濃度のビオチニル化タンパク質を、組換えヒトペリオスチンの滴定液と混合することによって調製され、室温で３０分間振盪しながらインキュベートし、その後、プレートに加えた。その後、プレートを室温で１時間振盪しながらインキュベートし、洗浄し、検出し、上記のように展開した。

テネイシンＣ及びＩ型コラーゲンは、それぞれ０．９nM及び１００nMの結合ＥＣ_８０でペリオスチンに結合した（図１３Ａ及び１３Ｂ）。図１３Ａ及び１３Ｂに示されているように、ＮＢ０８２８は、予め混合された陽性対照とは対照的に、テネイシンＣ及びＩ型コラーゲンへのペリオスチンの結合を阻害しなかった。要するに、これらのデータは、ＮＢ０８２８が、細胞外マトリックスタンパク質であるテネイシンＣ及びＩ型コラーゲンに対するペリオスチンの相互作用を遮断しないことを示す。

実施例７－ヒト腫瘍の徴候間のペリオスチン発現の免疫組織化学的検査（ＩＨＣ）による評価
様々なヒトのがん間のペリオスチンの発現レベルを評価するために、免疫組織化学的検査（ＩＨＣ）による有病率の研究を実施した。１８個の腫瘍の徴候及び約７５０個の個々の試料を含んでいる、組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）を、ペリオスチンの発現について評価した。試料を、１：５０に希釈された、抗ペリオスチン抗体のＥＰＲ２０８０６（アブカム社の製造識別番号：ａｂ２１５１９９、ロット識別番号：ＧＲ３１９２９７４－３）を用いて染色した。染色を、デジタル病理学法（ＨＡＬＯ、Indica labs社）を使用して定量して、ＩＨＣスコアを計算した（ＩＨＣスコア＝［低い強度の染色領域％^＊１］＋［中程度の強度の染色領域％^＊２］＋［高い強度の染色領域％^＊３］）。低い／高いペリオスチンの染色についての切点は、全試料間のおよそのペリオスチンＩＨＣスコア平均値に基づいて、ペリオスチンのＩＨＣスコアは５０であるとして計算された。有病率の研究は、試験された徴候間及び徴候内における、一連のペリオスチンの染色を示し、膵がん、乳がん、及び扁平細胞肺がんが最も高いレベルのペリオスチン染色を示した（図１４Ａ）。ペリオスチンの高い腫瘍は、全ての徴候において存在したが、出現頻度は異なっていた（図１４Ａ）。乳がんにおける代表的なペリオスチン発現の免疫組織化学的検査画像が、図１４Ｂに示されている。要するに、これらのデータは、ペリオスチンが、複数の種類の腫瘍の間で広く発現されていることを実証する。

本発明の好ましい実施態様が本明細書において示され記載されているが、このような実施態様が、単なる例として提供されることが当業者には明らかであろう。数多くの変種、変化、及び置換がすぐに、本発明から逸脱することなく、当業者には思いつくであろう。本明細書に記載の本発明の実施態様に対する様々な代替選択肢が、本発明の実施に使用されてもよいことが理解されるべきである。

全ての刊行物、特許出願、交付済特許、及び本明細書に言及された他の文書は、各々の個々の刊行物、特許出願、交付済特許、及び他の文書のその全体が、参照により具体的かつ個々に組み込まれることが示されているかのように、参照により本明細書に組み込まれる。参照によって組み込まれた文書中に含まれる定義は、それらが本開示の定義と矛盾する範囲では除外される。

Claims (6)

1. ペリオスチンに結合する組換え抗体又はその抗原結合断片であって、ここでの該抗体又はその抗原結合断片は、
   ａ）配列番号１（GYTFTSYG）に示されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖ＣＤＲ１（ＣＤＲ－Ｈ１）；
   ｂ）配列番号２（ISAYNGNT）に示されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖ＣＤＲ２（ＣＤＲ－Ｈ２）；
   ｃ）配列番号９（DMLVVPFDY）に示されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖ＣＤＲ３（ＣＤＲ－Ｈ３）；
   ｄ）配列番号１０（SSDIGSNR）に示されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖ＣＤＲ１（ＣＤＲ－Ｌ１）；
   ｅ）配列番号１１（SND）に示されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖ＣＤＲ２（ＣＤＲ－Ｌ２）；及び
   ｆ）配列番号１２（AAWDDSLSTYV）に示されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖ＣＤＲ３（ＣＤＲ－Ｌ３）
   を含み、
   組換え抗体又はその抗原結合断片が、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）_２ 、又は一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）であるか、又は含む、組換え抗体又はその抗原結合断片。
2. 免疫グロブリン重鎖可変領域及び免疫グロブリン軽鎖可変領域：
   ａ）ここでの免疫グロブリン重鎖可変領域は、配列番号１３に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％同一であるか、又は１００％同一である、アミノ酸配列を含み；そして
   ｂ）ここでの免疫グロブリン軽鎖可変領域は、配列番号１４に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％同一であるか、又は１００％同一である、アミノ酸配列を含み；
   を含む、請求項１に記載の組換え抗体又はその抗原結合断片。
3. 請求項１又は２に記載の組換え抗体又はその抗原結合断片をコードしている核酸。
4. 請求項３に記載の核酸を含む、細胞株。
5. 請求項１又は２に記載の組換え抗体又はその抗原結合断片と、薬学的に許容される賦形剤、担体、又は希釈剤とを含む、医薬組成物。
6. がんの処置に使用するための、請求項１又は２に記載の組換え抗体若しくはその抗原結合断片、又は請求項５に記載の医薬組成物。
   

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