JP7614844B2 - Ｂａｇ３遺伝子治療の最適化 - Google Patents

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Description

[0003]本発明の実施形態は、非虚血性又は虚血性拡張型心筋症などの心疾患を有する患者の転帰にＢＡＧ３の機能の調節を通じて悪影響を与える、アフリカ系の個体におけるＢＡＧ３の遺伝的バリアントの、同定を対象とする。組成物は、Ｂｃｌ２関連アサノジーン３（Ｂｃｌ２－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ａｎｔｈａｎｏｇｅｎｅ３）（ＢＡＧ３）発現及び／又は機能を正常化する薬剤を含む。
[0004]拡張型心筋症（ＤＣＭ）に続発する心不全（ＨＦ）は、２０歳以上のアメリカ人の概算で２５０万人が罹患する１。ＤＣＭの疫学は、アフリカ系のアメリカ人が最も高いＨＦの発生率及び有病率を有し、特発性拡張型心筋症（ＩＤＣ）が優勢で、人種及び民族で異なっている２、３。これは虚血性心臓疾患に続発するＤＣＭを最も一般的に有するヨーロッパ系の患者とは対照的である４～７。アフリカ系のアメリカ人でのＩＤＣの疫学と一致して、米国において又はヨーロッパにおいてよりもサハラ以南のアフリカにおいてＩＤＣははるかに一般的であり、疾患が始めて認識される年齢は実質的に低い８、９。
[0005]アフリカ系のアメリカ人におけるＤＣＭの有病率の増加は、地域１０並びに心血管系リスク因子の高い負荷：糖尿病、高血圧、コレステロール、喫煙状況及び心室肥大、を含む多様な医学的及び社会的要因が原因である１１。しかし、いくつかの観察は、ＩＤＣの発生率の増加も遺伝的リスク因子に起因し得ることを示唆している。例えば、ＨＦホットスポットは、サハラ以南のアフリカを横断する地理的領域に見出されている１２。サハラ以南のアフリカ人において高血圧とＤＣＭとの存在の間に強い相関関係はない１３。ＤＣＭと最も一般的に関連している遺伝子、ＴＴＮにおける短縮型バリアント１４は、産後心筋症を有するヨーロッパ系の女性においてよりも産後心筋症を有するアフリカ系の女性においてさらに蔓延している１５。
[0006]ＢＡＧ３（Ｂｃｌ２関連アサノジーン３）遺伝的バリアントの同定は、アフリカ系の個体において非虚血性又は虚血性拡張型心筋症（ＤＣＭ）の有病率及びＤＣＭの転帰と関連していた。死亡又は心不全入院加療のリスクの顕著な増加が、変異を有する患者において見出された。
[0007]したがって、ある特定の実施形態では、心疾患を有する患者を処置する方法であって、前記患者が対照ＢＡＧ３核酸配列と比較して少なくとも１つのＢｃｌ２関連アサノジーン３（ＢＡＧ３）ヌクレオチドバリアント（ＮＶ）インフレーム挿入を有する方法は、患者に薬剤の治療有効量を投与するステップであって、前記薬剤が標的細胞又は組織においてＢＡＧ３分子、そのタンパク質又はペプチドの発現又は量を調節するステップを含む。
[0008]ある特定の実施形態では、インフレーム挿入は、アミノ酸をコードしている。ある特定の実施形態では、インフレーム挿入は、非極性アミノ酸をコードしている。ある特定の実施形態では、インフレーム挿入は、１６０位にアラニンを付加する３ヌクレオチド挿入を含む（ｐ．Ａｌａ１６０ｄｕｐ、１０：１２１４２９６４７Ａ／ＡＧＣＧ；ｒｓ１３９４３８７２７）。
[0009]
[0010]ある特定の実施形態では、心疾患を有する患者を診断及び処置する方法は、対照ＢＡＧ３核酸配列と比較して患者試料中の少なくとも１つのＢｃｌ２関連アサノジーン３（ＢＡＧ３）遺伝的バリアントを同定するステップであって、ある特定のバリアントの検出が、ＢＡＧ３レベルの増加が前記患者に治療的であるかどうかを予測するステップ、及びかかるバリアントを有するとして同定された患者に、薬剤の治療有効量を投与するステップであって、前記薬剤がＢＡＧ３分子、そのタンパク質又はペプチドの標的細胞又は組織における発現又は量を正常対照と比較して調節するステップを含む。ほとんどアフリカ系の個体においてのみ見出されるＢＡＧ３における遺伝的バリアントは、疾患の原因ではなかったが、ＢＡＧ３の機能の調節を通じて非虚血性又は虚血性拡張型心筋症を有する患者の転帰に悪影響を与えた。
[0011]ある特定の実施形態では、心疾患を有する患者を診断及び処置する方法は、対照ＢＡＧ３核酸配列と比較して患者試料中の少なくとも１つのＢｃｌ２関連アサノジーン３（ＢＡＧ３）遺伝的バリアントを同定するステップ、及びＢＡＧ３遺伝的多様性を有するとして同定された患者に、薬剤の治療有効量を投与するステップであって、前記薬剤がＢＣｌ２関連アサノジーン３（ＢＡＧ３）分子、そのタンパク質又はペプチドの標的細胞又は組織における発現又は量を正常対照と比較して調節するステップを含む。
[0012]ある特定の実施形態では、遺伝的バリアントはインフレーム挿入である。ある特定の実施形態では、インフレーム挿入はアミノ酸をコードしている。ある特定の実施形態では、インフレーム挿入は非極性アミノ酸をコードしている。ある特定の実施形態では、インフレーム挿入は、１６０位にアラニンを付加する３ヌクレオチド挿入を含む（ｐ．Ａｌａ１６０ｄｕｐ、１０：１２１４２９６４７Ａ／ＡＧＣＧ；ｒｓ１３９４３８７２７）。
[0013]ある特定の実施形態では、心不全のリスクがある又はそれを罹患している対象を処置する方法は、ＢＣＬ２関連アサノジーン３（ＢＡＧ３）分子の発現又は量を調節する少なくとも１つの薬剤の治療有効量を含む医薬組成物を対象に投与するステップであって、前記対象が対照ＢＡＧ３核酸配列と比較して少なくとも１つのＢＡＧ３遺伝的バリアントを有し、前記ＢＡＧ３遺伝的バリアントがインフレーム挿入であり、前記薬剤がＢＣＬ２関連アサノジーン３（ＢＡＧ３）分子をコードしている発現ベクターを含むステップを含む。
[0014]ある特定の実施形態では、インフレーム挿入は、アミノ酸をコードしている。ある特定の実施形態では、インフレーム挿入は非極性アミノ酸をコードしている。ある特定の実施形態では、インフレーム挿入は、１６０位にアラニンを付加する３ヌクレオチド挿入を含む（ｐ．Ａｌａ１６０ｄｕｐ、１０：１２１４２９６４７Ａ／ＡＧＣＧ；ｒｓ１３９４３８７２７）。
[0015]ある特定の実施形態では、遺伝的バリアントは、単一ヌクレオチドバリアント（ＳＮＶ）インフレーム挿入、欠失、置換又はこれらの組合せである。ある特定の実施形態では、ＳＮＶは：ｐ．Ｐｒｏ６３Ａｌａ（１０：１２１４２９３６９Ｃ／Ｇ；ｒｓ１３３０３１９９９）；ｐ．Ｈｉｓ８３Ｇｌｎ（１０：１５１３３１９７２；ｒｓ１５１３３１９７２）；Ｐｒｏ３８０Ｓｅｒ（１０：１２１４３６２０４Ｃ／Ｔ；ｒｓ１４４６９２９５４）；Ａｌａ４７９Ｖａｌ（１０：１２１４３６５０２Ｃ／Ｔ、ｒｓ３４６５６２３９）又はこれらの組合せを含む。ある特定の実施形態では、インフレーム挿入は、アミノ酸をコードしている。ある特定の実施形態では、インフレーム挿入は非極性アミノ酸をコードしている。ある特定の実施形態では、インフレーム挿入は、１６０位にアラニンをコードしている。
[0016]ある特定の実施形態では、ＢＣＬ２関連アサノジーン３（ＢＡＧ３）遺伝子に遺伝的バリアントを有するとして同定された患者を処置する薬剤であって、遺伝的バリアントはインフレーム挿入、インフレーム欠失、短縮化、置換又はこれらの組合せを含む単一ヌクレオチドバリアント（ＳＮＶ）である。
[0017]ある特定の実施形態では、薬剤は、標的細胞又は組織におけるＢＣＬ２関連アサノジーン３（ＢＡＧ３）分子、そのタンパク質又はペプチドの発現又は量を正常対照と比較して調節し、ＢＡＧ３タンパク質又はその活性断片を発現する発現ベクター、オリゴヌクレオチド又はこれらの組合せを含む。
[0018]ある特定の実施形態では、心不全のリスクがある又はこれを罹患している対象を処置する方法は、ＢＡＧ３レベルの増加が対象に治療的であるかどうかを予測する、ＢＡＧ３バリアントを生物学的試料において同定すること、及びかかるバリアントを有するとして同定された患者に、薬剤の治療有効量を投与することを含む。ある特定の実施形態では、薬剤は、ＢＡＧ３分子、そのタンパク質又はペプチドの標的細胞又は組織における発現又は量を正常対照と比較して調節する。
[0019]ある特定の実施形態では、悪い予後を有する心臓疾患患者を同定する方法は、対照ＢＡＧ３核酸配列と比較してＢｃｌ２－関連アサノジ－ン３（ＢＡＧ３）ヌクレオチドバリアント（ＮＶ）インフレーム挿入の存在について患者試料をスクリーニングするステップであって、ＢＡＧ３ヌクレオチドバリアント（ＮＶ）インフレーム挿入の検出が悪い予後を有するとして心臓疾患患者を同定するステップを含む。
[0020]ある特定の実施形態では、心臓疾患のリスクがある患者を同定する方法は、対照ＢＡＧ３核酸配列と比較してＢｃｌ２関連アサノジーン３（ＢＡＧ３）ヌクレオチドバリアント（ＮＶ）インフレーム挿入の存在について患者試料をスクリーニングするステップであって、ＢＡＧ３ヌクレオチドバリアント（ＮＶ）インフレーム挿入の検出が患者を心臓疾患のリスクがあるとして同定するステップを含む。
[0021]ある特定の実施形態では、インフレーム挿入は、アミノ酸をコードしている。ある特定の実施形態では、インフレーム挿入は非極性アミノ酸をコードしている。ある特定の実施形態では、インフレーム挿入は、１６０位にアラニンを付加する３ヌクレオチド挿入を含む（ｐ．Ａｌａ１６０ｄｕｐ、１０：１２１４２９６４７Ａ／ＡＧＣＧ；ｒｓ１３９４３８７２７）。
[0022]ある特定の実施形態では、心臓疾患のリスクがある患者を同定する方法は、患者試料をＢｃｌ２関連アサノジーン３（ＢＡＧ３）遺伝的バリアントの存在についてスクリーニングするステップであって、ＢＡＧ３遺伝的バリアントが、ｐ．Ａｌａ１６０ｄｕｐ（１０：１２１４２９６４７Ａ／ＡＧＣＧ；ｒｓ１３９４３８７２７）；ｐ．Ｐｒｏ６３Ａｌａ（１０：１２１４２９３６９Ｃ／Ｇ；ｒｓ１３３０３１９９９）；ｐ．Ｈｉｓ８３Ｇｌｎ（１０：１５１３３１９７２；ｒｓ１５１３３１９７２）；Ｐｒｏ３８０Ｓｅｒ（１０：１２１４３６２０４Ｃ／Ｔ；ｒｓ１４４６９２９５４）；Ａｌａ４７９Ｖａｌ（１０：１２１４３６５０２Ｃ／Ｔ、ｒｓ３４６５６２３９）又はこれらの組合せを含むステップを含む。
[0023]ある特定の実施形態では、生物学的試料中のＢＣＬ２関連アサノジーン３（ＢＡＧ３）バリアントを同定するために検出可能な標識にコンジュゲートされた１つ又は複数のプローブを含むキット。ある特定のバリアントの検出は、対象が処置から利益を得るかどうかを予測する。
[0024]本明細書において開示されるすべての遺伝子、遺伝子名及び遺伝子産生物は、本明細書において開示される組成物及び方法が適用可能である任意の種由来のホモログに対応することが意図される。したがって用語は、これだけに限らないがヒト及びマウス由来の遺伝子及び遺伝子産生物を含む。特定の種由来の遺伝子又は遺伝子産生物が開示される場合、本開示は、例示的のみを目的とし、内容が明確に示すと考えられる場合を除いて限定として解釈されないことは、理解される。したがって、例えば、一部の実施形態では、哺乳動物の核酸及びアミノ酸配列に関する本開示の遺伝子又は遺伝子産生物について、これだけに限らないが他の哺乳動物、魚類、両生類、は虫類及び鳥類が挙げられる他の動物由来の相同及び／又はオルソログ遺伝子並びに遺伝子産生物を包含することが意図される。ある特定の実施形態では、遺伝子、核酸配列、アミノ酸配列、ペプチド、ポリペプチド及びタンパク質は、ヒトである。
[0025]他の態様は以下に記載される。
[0026]定義
[0027]他に定義する場合を除いて、本明細書で使用するすべての技術的及び科学的用語は、本発明が関連する当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似の又は同等の任意の方法及び材料は、本発明の検査のための実施において使用され得るが、ある特定の材料及び方法が本明細書に記載される。本発明の記載及び特許請求において、以下の用語が使用される。
[0028]冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、冠詞の文法的目的語の１つ又は１つより多く（すなわち、少なくとも１つ）を言及して本明細書において使用される。例示の方法により「エレメント（ａｎ ｅｌｅｍｅｎｔ）」は、１つのエレメント又は１つより多いエレメントを意味する。したがって、「細胞（ａ ｃｅｌｌ）」の記述は、例えば、同じ種類の複数の細胞を含む。さらに、用語「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「有している（ｈａｖｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「含む（ｗｉｔｈ）」又はこれらの変化形が、詳細な記載及び／又は特許請求の範囲のいずれかで使用される場合、かかる用語は、用語「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と同様の様式で包括的であることが意図される。
[0029]本明細書において使用される場合、用語「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」又は「含まれる（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ）」及びこれらの変化形は、物品、組成物、装置、方法、工程、システムなどの定義された又は記載されたエレメントを参照して、追加的エレメントを容認して包括的又は拡張可能であることを意味し、それにより定義された又は記載された物品、組成物、装置、方法、工程、システムなどが明確に述べたエレメント又はその適切な等価物を含むこと、並びに他のエレメントが含まれてもよく、定義された物品、組成物、装置、方法、工程、システムなどの範囲／定義のいまだ範囲内であることを示している。
[0030]量、時間的継続期間などの測定可能な値を指して本明細書において使用される場合「約（Ａｂｏｕｔ）」は、指定した値の＋／－２０％、＋／－１０％、＋／－５％、＋／－１％、又は＋／－０．１％の変動を包含することが意味され、かかる変動は、開示された方法を実施するために適切である。代替的に、特に生物学的システム又は工程に関して、用語は、値の１０倍以内、５倍以内及び同様に２倍以内であることを意味してもよい。出願書類及び特許請求の範囲において具体的な値が記載される場合、他に述べる場合を除いて、用語「約」が具体的な値についての許容可能な誤差範囲内を意味することは想定されるべきである。
[0031]本明細書において使用される場合「ＢＡＧ３」、「ＢＡＧ３分子」、「ＢＣＬ２関連アサノジーン３（ＢＡＧ３）遺伝子」、「ＢＣＬ２関連アサノジーン３（ＢＡＧ３）分子」は、すべてのファミリーメンバー、変異体、ｃＤＮＡ配列、対立遺伝子、断片、種、コード及び非コード配列、センス及びアンチセンスポリヌクレオチド鎖などを含む（ＨＧＮＣ（９３９）Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ（９５３１）Ｅｎｓｅｍｂｌ（ＥＮＳＧ０００００１５１９２９）ＯＭＩＭ（６０３８８３）ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ（Ｏ９５８１７））。同様に、「ＢＡＧ３」、「ＢＡＧ３分子」、「ＢＣＬ２関連アサノジーン３（ＢＡＧ３）分子」もＢＡＧ３ポリペプチド又はその断片、タンパク質、バリアント、誘導体などを指す。したがって用語「分子」は、ＢＡＧ３の核酸配列及びアミノ酸配列の両方を包含する。
[0032]本明細書において使用される場合、「生物学的試料」は、固形及び体液試料を含む。本発明において使用される生物学的試料として、細胞、細胞のタンパク質又は膜抽出物、血液又は生物学的液体、例えば腹水又は脳液（例えば、脳脊髄液）が挙げられる。固形生物学的試料の例として、これだけに限らないが、中枢神経系、骨、乳房、腎臓、子宮頸部、子宮内膜、頭／頸部、胆嚢、耳下腺、前立腺、脳下垂体、筋肉、食道、胃、小腸、結腸、肝臓、脾臓、膵臓、甲状腺、心臓、肺、膀胱、脂肪、リンパ節、子宮、卵巣、副腎、精巣、扁桃腺、胸腺及び皮膚の組織から採取された試料、又は腫瘍から採取された試料が挙げられる。「体液試料」の例として、これだけに限らないが血液、血清、精液、前立腺液、精漿、尿、大便、唾液、痰、粘液、骨髄、リンパ液及び涙が挙げられる。
[0033]本明細書において使用される場合、「心疾患」は、心不全、心筋疾患、心筋症、肥大性心筋症、拡張型心筋症、粥状動脈硬化、環状動脈疾患、非虚血性心臓疾患、虚血性心臓疾患、心筋炎、ウイルス感染、創傷、高血圧性心臓疾患、弁膜疾患、先天性心臓疾患、心筋梗塞、うっ血性心不全、不整脈、心臓のリモデリングを生じる疾患などが挙げられる任意の種類の心臓疾患を指す。心臓の疾患は、例えば、収縮力の喪失（例えば、駆出率の減少によって実証され得る）などの心臓組織への損傷などの何らかの理由による可能性がある。不十分な心機能によって特徴付けられる心臓の損傷又は障害として、正常な心機能の障害若しくは欠如又は異常な心機能の存在が挙げられる。異常な心機能は、疾患、傷害及び／又は加齢の結果である場合がある。本明細書において使用される場合「異常な心機能」として、心筋細胞、心筋細胞の集団又は心臓自体の形態学的及び／又は機能的異常が挙げられる。形態学的及び機能的異常の非限定的例として、心筋細胞の物理的劣化及び／又は死、心筋細胞の異常な増殖パターン、心筋細胞間の物理的接続における異常、心筋細胞による１つ又は複数の物質の過少又は過剰産生、心筋細胞が通常産生する１つ又は複数の物質を産生する心筋細胞の欠如及び、異常なパターン又は異常な時期の電気的刺激の伝達が挙げられる。さらに全体的なレベルでの異常として、ジスキネジア、駆出率の低減、心エコーによって観察される変化（例えば、拡張）、ＥＫＧにおける変化、運動負荷における変化、キャピラリー灌流の低減、及び血管造影によって観察される変化が挙げられる。異常な心機能は、例えば、非虚血性又は虚血性心臓疾患、例えば、狭心症、心筋梗塞、慢性虚血性心臓疾患、高血圧性心臓疾患、肺心症（肺性心）、心臓弁膜症、例えば、リウマチ熱、僧帽弁逸脱症、僧帽弁輪の石灰化、カルチノイド心臓疾患、感染性心内膜炎、先天性心臓疾患、心筋疾患、例えば、心筋炎、拡張型心筋症、高血圧性心筋症、うっ血性心不全を生じる心臓障害及び心臓の腫瘍、例えば、原発性肉腫及び二次腫瘍が挙げられる多数の障害と共に見られる。心臓損傷は、例えば、ナイフ創；生物学的（例えばウイルス性；自己免疫疾患）又は化学的（例えば、化学療法、薬物）；手術；移植などの創傷も含む。
[0034]本明細書において使用される場合、句「診断する」は、疾患又は症状を分類すること、疾患の重症度を決定すること、疾患の進行をモニタリングすること、疾患の転帰及び／又は回復の見込みを予測することを指す。用語「検出する」は、上記のいずれかを任意選択で包含してもよい。本発明による疾患の診断は、対象から得られた生物学的試料における本発明のポリヌクレオチド又はポリペプチドのレベルを決定することによってもたらされ、決定されるレベルは、疾患の素因又は存在若しくは不在と相関する場合がある。「対象から得られた生物学的試料」が、対象から身体的に除去されていない試料も任意選択で含み得ることは、注目されるべきである。
[0035]本明細書において使用される場合、句「診断」は、病的な状態の存在又は性質を同定することを意味する。診断方法は、その感度及び特異性において異なっている。診断アッセイの「感度」は、検査陽性の罹患した個体の百分率である（「真の陽性」のパーセント）。アッセイによって検出されなかった罹患した個体は、「偽陰性」である。罹患しておらず、アッセイにおいて検査陰性の対象は、「真の陰性」と呼ばれる。診断アッセイの「特異性」は、１引く偽陽性率であり「偽陽性」率は、検査陽性で疾患を有さない者の割合として定義される。一方、具体的な診断方法は、状態の確定診断を提供せず、方法が診断の助けになる陽性の指標を提供すれば十分である。
[0036]「有効量」は、本明細書において使用される場合、治療的又は予防的利益を提供する量を意味する。
[0037]「コードしている」は、ヌクレオチドの規定の配列（すなわち、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ及びｍＲＮＡ）又はアミノ酸の規定の配列のいずれかを有し、生物学的工程において他のポリマー及び高分子の合成のための鋳型として役立つ遺伝子、ｃＤＮＡ又はｍＲＮＡなどのポリヌクレオチド中のヌクレオチドの特異的配列の固有の特性、並びにそれから生じる生物学的特性を指す。したがって、遺伝子は、その遺伝子に対応するｍＲＮＡの転写及び翻訳が、細胞又は他の生物学的システムにおいてタンパク質を産生する場合に、タンパク質をコードしている。ヌクレオチド配列が、ｍＲＮＡ配列と同一であり、通常配列表に提供されるコード鎖、及び遺伝子又はｃＤＮＡの転写のための鋳型として使用される非コード鎖の両方がその遺伝子又はｃＤＮＡのタンパク質又は他の産生物をコードしていると称され得る。
[0038]本明細書において使用される場合、用語「発現」は、そのプロモーターによって駆動される具体的なヌクレオチド配列の転写及び／又は翻訳として定義される。
[0039]「発現ベクター」は、発現されるヌクレオチド配列に作動可能に連結された発現調節配列を含む組換えポリヌクレオチドを含むベクターを指す。発現ベクターは、発現のために十分なシス作用エレメントを含み；発現のための他のエレメントは、宿主細胞によって又はｉｎ ｖｉｔｒｏ発現系において供給されてもよい。発現ベクターは、コスミド、プラスミド（例えば、ネイキッド又はリポソームに含有される）及び組換えポリヌクレオチドを組み込むウイルス（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルス）などの当技術分野において周知のすべてのものを含む。
[0040]「抑制核酸」によって、哺乳動物細胞に投与された場合に標的遺伝子の発現の減少（例えば、１０％、２５％、５０％、７５％又はさらに９０～１００％まで）を生じる２本鎖ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ若しくはアンチセンスＲＮＡ又はこれらの一部又はこれら模倣物が意味される。典型的には、核酸抑制物は、標的核酸分子の少なくとも一部若しくはそのオルソログを含む、又は標的核酸分子の相補鎖の少なくとも一部を含む。例えば、抑制核酸分子は、本明細書で説明する任意の又はすべての核酸の少なくとも一部を含む。
[0041]「単離された」は、天然状態からの変更又は除去を意味する。例えば、生存している動物に天然で存在する核酸又はペプチドは、「単離されて」いないが、その天然の状態で同時に存在する物質から部分的に又は完全に分離されている同じ核酸又はペプチドは「単離されている」。単離された核酸又はタンパク質は、実質的に精製された形態で存在する場合がある、又は例えば、宿主細胞などの非天然環境中に存在する場合がある。
[0042]「単離された核酸」は、天然に存在する状態で隣接する配列から分離されている核酸セグメント又は断片、すなわち、断片に通常近接している配列、すなわちそれが天然で存在するゲノムにおいて断片に近接する配列から除去されているＤＮＡ断片を指す。用語は、核酸に天然で付随する他の構成成分、すなわち、細胞においてそれに天然で付随するＲＮＡ又はＤＮＡ又はタンパク質から実質的に精製されている核酸にも適用する。したがって用語は、例えば、ベクターに、自己複製するプラスミド若しくはウイルスに、又は原核生物若しくは真核生物のゲノムＤＮＡに組み込まれている、或いは他の配列と無関係に別個の分子として（すなわち、ｃＤＮＡ又はゲノム又はＰＣＲ若しくは制限酵素消化によって産生されたｃＤＮＡ断片として）存在する組換えＤＮＡを含む。デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシド、これらの置換及びアルファ－アノマー形態、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ホスホロチオエート、メチルホスホネートなどが挙げられる、追加的ポリペプチド配列をコードしているハイブリッド遺伝子の一部である組換えＤＮＡ、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、天然及び／又は修飾モノマー又は連結の直鎖状又は環状オリゴマー又はポリマーも含む。
[0043]核酸配列は、異なる領域からなる「キメラ」である場合もある。本発明の文脈では「キメラ」化合物は、２つ以上の化学的領域、例えば、ＤＮＡ領域（複数可）、ＲＮＡ領域（複数可）、ＰＮＡ領域（複数可）などを含有するオリゴヌクレオチドである。各化学領域は、少なくとも１つのモノマー単位、すなわちヌクレオチドから構成されている。これらの配列は、配列が１つ又は複数の望ましい特性を示すために改変されている少なくとも１つの領域を典型的には含む。
[0044]本明細書において使用される場合、用語「キット」は、材料を送達するための任意の送達システムを指す。反応アッセイの文脈では、かかる送達システムは、反応試薬（例えば、適切な容器中のオリゴヌクレオチド、酵素など）及び／又は補助材料（例えば、緩衝剤、アッセイを実施するための書面の説明書など）の保存、ある場所から別への輸送又は送達を可能にするシステムを含む。例えば、キットは、関連する反応試薬及び／又は補助材料を含む１つ又は複数の封入物（例えば、箱）を含む。本明細書において使用される場合、用語「断片化キット」は、キット全体の構成成分の一部をそれぞれ含有する２つ以上の別個の容器を備える送達システムを指す。容器は、目的のレシピエントに一緒に又は別々に送達され得る。例えば、第１の容器は、アッセイにおける使用のための酵素を含有し、一方第２の容器はオリゴヌクレオチドを含有する。用語「断片化キット」は、Ｆｅｄｅｒａｌ Ｆｏｏｄ、Ｄｒｕｇ、ａｎｄ Ｃｏｓｍｅｔｉｃ Ａｃｔのセクション５２０（ｅ）の下で規制される分析物特異的試薬（ＡＳＲ）を含有するキットを包含することを意図するがこれに限定されない。実際に、キット全体の構成成分の一部をそれぞれ含有する２つ以上の別個の容器を含む任意の送達システムは、用語「断片化キット」に含まれる。対照的に「複合キット」は、単一の容器に（例えば、所望の各構成成分を入れた単一の箱に）反応アッセイのすべての構成成分を含有する送達システムを指す。用語「キット」は、断片化及び複合キットの両方を含む。
[0045]用語「標的核酸」配列は、オリゴヌクレオチドが特異的にハイブリダイズするように設計された核酸（しばしば生物学的試料に由来する）を指す。検出される標的核酸の存在若しくは不在、又は定量される標的核酸の量のいずれでもよい。標的核酸は、標的に向けられた対応するオリゴヌクレオチドの核酸配列に相補的である配列を有する。用語、標的核酸は、オリゴヌクレオチドが方向付けられる大きな核酸の特定の部分配列、又は配列全体（例えば、遺伝子又はｍＲＮＡ）を指す場合がある。使用法における差異は、文脈から明らかである。
[0046]本発明の文脈では、一般に存在する核酸塩基について以下の略号が使用される。「Ａ」はアデノシンを指す、「Ｃ」はシトシンを指す、「Ｇ」はグアノシンを指す、「Ｔ」はチミジンを指す、及び「Ｕ」はウリジンを指す。
[0047]他に特に規定のない限り、アミノ酸配列を「コードしているヌクレオチド配列」は、互いの縮重バージョンであり、同じアミノ酸配列をコードしているすべてのヌクレオチド配列を含む。句、タンパク質又はＲＮＡをコードしているヌクレオチド配列は、タンパク質をコードしているヌクレオチド配列が一部のバージョンでイントロン（複数可）を含有する限り、イントロンも含み得る。
[0048]免疫原性組成物の「非経口」投与として、例えば、皮下（ｓ．ｃ．）、静脈内（ｉ．ｖ．）、筋肉内（ｉ．ｍ．）若しくは胸骨下（ｉｎｔｒａｓｔｅｒｎａｌ）注射又は注入技術が挙げられる。
[0049]用語「患者」又は「個体」又は「対象」は、本明細書において互換的に用いられ、ヒト患者が一例で処置される哺乳動物対象を指す。一部の場合では、本発明の方法は、実験動物において、獣医学的応用において並びにこれだけに限らないがマウス、ラット及びハムスターを含むげっ歯類並びに霊長類が挙げられる疾患についての動物モデルの開発において使用される。
[0050]用語「配列同一性パーセント」又は「配列同一性」を有するは、所与の問い合わせ配列と対象配列との間の同一性の程度を指す。
[0051]用語「薬学的に許容できる」（又は「薬理学的に許容できる」）は、動物又はヒトに必要に応じて投与された場合に、有害な、アレルギー性の又は他の不都合な反応を生じない分子実体及び組成物を指す。本明細書において使用される場合、用語「薬学的に許容できる担体」は、薬学的に許容できる物質のための媒体として使用され得る任意の及びすべての溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌剤、等張剤及び吸収遅延剤、緩衝剤、賦形剤、結合剤、滑沢剤、ゲル、界面活性剤などを含む。
[0052]用語「ポリヌクレオチド」は、「核酸」又は「核酸配列」としても周知であるヌクレオチドの鎖であり、これだけに限らないが、当技術分野において利用可能な任意の手段によって得られるすべての核酸配列、天然に存在する及び合成の両方の核酸、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、天然及び／若しくは修飾モノマー又は連結の直鎖状若しくは環状オリゴマー又はポリマーを含み、デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシド、その置換及びアルファアノマー形態、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ホスホロチオエート、メチルホスホネートなどが挙げられる。核酸配列は、異なる領域からなる「キメラ」である場合がある。本発明の文脈では「キメラ」化合物は、オリゴヌクレオチドであり、２つ以上の化学領域、例えば、ＤＮＡ領域（複数可）、ＲＮＡ領域（複数可）、ＰＮＡ領域（複数可）などを含有する。各化学領域は、少なくとも１つのモノマー単位、すなわちヌクレオチドから構成される。これらの配列は、配列が１つ又は複数の所望の特性を示すように改変されている少なくとも１つの領域を典型的には含む。
[0053]用語「ペプチド」、「ポリペプチド」及び「タンパク質」は、互換的に用いられ、ペプチド結合によって共有結合で連結されたアミノ酸残基からなる化合物を指す。タンパク質又はペプチドは、少なくとも２つのアミノ酸を含まなければならず、タンパク質の又はペプチドの配列を含むアミノ酸の最大数に制限はない。ポリペプチドとして、ペプチド結合によって互いに接続された２つ以上のアミノ酸を含む任意のペプチド又はタンパク質が挙げられる。本明細書において使用される場合、用語は、例えば当技術分野においてペプチド、オリゴペプチド及びオリゴマーと一般に称される短い鎖、並びに当技術分野においてタンパク質と一般に称され、多数の種類がある長い鎖の両方を指す。「ポリペプチド」として、例えば、生物学的活性断片、実質的に相同性のポリペプチド、オリゴペプチド、ホモ二量体、ヘテロ二量体、ポリペプチドのバリアント、改変ポリペプチド、誘導体、類似物、融合タンパク質がとりわけ挙げられる。ポリペプチドとして、天然ペプチド、組換えペプチド、合成ペプチド又はこれらの組合せが挙げられる。
[0054]用語「トランスフェクトされた」又は「形質転換された」又は「形質導入された」は、それにより外来性核酸が宿主細胞に移行又は導入される工程を意味する。「トランスフェクトされた」又は「形質転換された」又は「形質導入された」細胞は、外来性核酸をトランスフェクトされた、形質転換された又は形質導入されたものである。トランスフェクトされた／形質転換された／形質導入された細胞は、初代の対象細胞及びその後代を含む。
[0055]本明細書において用語が使用される場合、疾患を「処置する」は、対象によって経験される疾患又は障害の少なくとも１つの徴候又は症状の頻度又は重症度を低減することを意味する。疾患又は障害の処置は、ウイルスの根絶を含む。
[0056]「処置」は、障害の病態又は症状の発症を予防する又は変化させる意図で実施される介入である。したがって、「処置」は、治療的処置及び予防的又は防止的手段の両方を指す。「処置」は、対症療法的ケアとして特定される場合もある。処置の必要があるものは、既に障害を有するもの及び障害が予防されるものを含む。したがって、状況、障害又は状態の「処置すること」又は「処置」は：（１）ウイルスを根絶すること；（２）状況、障害又は状態に苦しんでいる又はかかりやすいが、状況、障害又は状態の臨床又は亜臨床症状をまだ経験又は示していないヒト又は他の哺乳動物において発症する状況、障害又は状態の臨床症状の出現を予防する又は遅延させること；（３）状況、障害又は状態を抑制すること、すなわち、疾患若しくはその再発（維持処置の場合）又はその少なくとも１つの臨床若しくは亜臨床症状の発症を停止させる、低減する又は遅延させること；或いは（４）疾患を軽減する、すなわち、状況、障害若しくは状態又はその少なくとも１つの臨床又は亜臨床症状の退縮を生じること、を含む。処置される個体への利益は、統計的に有意である又は患者若しくは医師に少なくとも知覚できる、のいずれかである。
[0057]ポリヌクレオチド配列の文脈において使用される場合、用語「バリアント」は、野生型遺伝子に関連するポリヌクレオチド配列を包含し得る。この定義は、例えば「対立遺伝子」、「スプライス」、「種」又は「多型」バリアントも含み得る。スプライスバリアントは、参照分子に顕著な同一性を有し得るが、ｍＲＮＡプロセシングの際のエクソンの代替的スプライシングのために、さらに多い又は少ない数のポリヌクレオチドを一般に有する。対応するポリペプチドは、追加的な機能的ドメイン又はドメインの欠如を有する場合がある。種バリアントは、ある種から別で変動するポリヌクレオチド配列である。本発明における特別な有用性は、野生型遺伝子産生物のバリアントである。バリアントは、核酸配列中の少なくとも１つの変異から生じる場合があり、その構造また機能が変化している場合としていない場合がある変化したｍＲＮＡ又はポリペプチドを生じ得る。任意の所与の天然又は組換え遺伝子は、１つ又は多数の対立遺伝子形態を有する場合と有さない場合がある。バリアントを生じる一般的な変異変化は、一般にヌクレオチドの天然の欠失、付加又は置換が原因である。これらの種類の各変化は、単独で又は他との組合せで、１回又は複数回、所与の配列に生じる場合がある。
[0058]「ベクター」は、単離された核酸を含み、単離された核酸を細胞の内部に送達するために使用され得る物質の組成物である。ベクターの例として、これだけに限らないが、直鎖ポリヌクレオチド、イオン性又は両親媒性化合物と会合したポリヌクレオチド、プラスミド及びウイルスが挙げられる。したがって、用語「ベクター」は、自己複製プラスミド又はウイルスを含む。用語は、核酸の細胞への移行を促進する、例えば、ポリリジン化合物、リポソームなどの、非プラスミド及び非ウイルス性化合物を含むとも解釈される。ウイルスベクターの例として、これだけに限らないが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクターなどが挙げられる。
[0059]範囲：本開示全体を通じて、本発明の種々の態様は、範囲の形式で示される場合がある。範囲の形式での記載は、単に便宜上及び簡潔さのためであり、本発明の範囲での変更できない限定として解釈されるべきでないことは理解されるべきである。したがって、範囲の記載は、具体的に開示された可能なすべての部分範囲及び範囲内の個々の数値を有すると見なされるべきである。例えば、１～６などの範囲の記載は、１～３、１～４、１～５、２～４、２～６、３～６などの具体的に開示された部分範囲、並びに範囲内の個々の値、例えば、１、２、２．７、３、４、５、５．３、及び６を有すると見なされるべきである。このことは、範囲の幅に関わらず適用される。
[0060]任意の核酸配列又はアミノ酸配列が、Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ．又はＧＥＮＢＡＮＫ受託番号によって具体的に参照される場合、配列は、参照により本明細書に組み込まれる。シグナルペプチド、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、プロモーター配列及び翻訳開始の同定などの受託番号と関連する情報は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
図１は、単一の非同義バリアントのタンパク質結合ドメイン及び部位、単一の３ヌクレオチド挿入及び二重ヘテロ接合体非同義バリアントを示すＢＡＧ３の模式図である。ブロックは、複数の哺乳動物種にわたるアミノ酸の保存を示す。ＷＷドメインは、ＢＡＧ３の３次元構造を改変するようにＰＸＸＰ領域と相互作用し、シャペロン支援選択的オートファジー（ＣＡＳＡ）にも関与する；ＩＰＶモチーフは、マクロオートファジーを支持するように低分子熱ショックタンパク質ＨｓｐＢ８及びＨｓｐＢ６と相互作用する；ＰＸＸＰ領域は、がん細胞の遊走及び転移を促進するようにＳｒｃ相同３（ＳＨ３）ドメインへの結合を促進し、核周囲アグリソームへの細胞内タンパク質輸送を促進するようにダイニン複合体にも結合する；並びにＢＡＧドメインは、Ｂｃｌ－２と相互作用し、アポトーシスの阻害を生じる。 図２Ａ～２Ｃは、ＢＡＧ３遺伝的バリアントを有する又は有さない患者における無イベント生存率を示すカプラン・マイヤー曲線を示す図である。図２Ａは、ＢＡＧ３バリアントを有する又は有さないすべての患者における無イベント生存率を示す。図２Ｂは、ＢＡＧ３バリアントを有する又は有さない非虚血性ＨＦを有する患者における無イベント生存率を示す。図２Ｃは、虚血性拡張型心筋症を有する患者における無イベント生存率を示す。統計的有意性は、各比較について示されている。各群の患者の数は、ｘ軸に沿って示されている。 図２Ａ～２Ｃは、ＢＡＧ３遺伝的バリアントを有する又は有さない患者における無イベント生存率を示すカプラン・マイヤー曲線を示す図である。図２Ａは、ＢＡＧ３バリアントを有する又は有さないすべての患者における無イベント生存率を示す。図２Ｂは、ＢＡＧ３バリアントを有する又は有さない非虚血性ＨＦを有する患者における無イベント生存率を示す。図２Ｃは、虚血性拡張型心筋症を有する患者における無イベント生存率を示す。統計的有意性は、各比較について示されている。各群の患者の数は、ｘ軸に沿って示されている。 図２Ａ～２Ｃは、ＢＡＧ３遺伝的バリアントを有する又は有さない患者における無イベント生存率を示すカプラン・マイヤー曲線を示す図である。図２Ａは、ＢＡＧ３バリアントを有する又は有さないすべての患者における無イベント生存率を示す。図２Ｂは、ＢＡＧ３バリアントを有する又は有さない非虚血性ＨＦを有する患者における無イベント生存率を示す。図２Ｃは、虚血性拡張型心筋症を有する患者における無イベント生存率を示す。統計的有意性は、各比較について示されている。各群の患者の数は、ｘ軸に沿って示されている。 図３Ａは、空プラスミド又は野生型ＢＡＧ３若しくはｃ．１８７Ｃ＞Ｇ＋ｃ．１１３８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｐｒｏ６３Ａｌａ＋ｐ．Ｐｒｏ３８０Ｓｅｒ）、ｃ．２４９Ｃ＞Ａ（ｐ．Ｈｉｓ８３Ｇｌｎ）、ｃ．４７４＿４７６ｄｕｐＧＧＣ（ｐ．Ａｌａ１６０ｄｕｐ）若しくはｃ．１４３６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｌａ４７９Ｖａｌ）を含有するプラスミドを用いてトランスフェクトされ、Ａｄｖ－ＲＦＰ－ＧＦＰ－ＬＣ３を用いて同時トラスフェクトされたＡＣ１６細胞からの代表的共焦点画像である。赤色の点は、ＧＦＰがライソソームのオートファゴソーム（ａｕｔｏｐｈａｇａｓｏｍｅ）融合後の酸性度の増加によって消光された、オートファゴリソソームでのＬＣ３の増加を示す。図３Ｂは、条件あたり８～４２個の間の細胞からの画像の定量である。図３Ｃは、アポトーシス細胞から生細胞を識別するためにアネキシン－Ｖ（緑色）及びヨウ化プロピジウム（赤色）を用いて染色されたＡＣ１６細胞の代表的共焦点画像である。アポトーシス細胞は、緑色に見え、後期アポトーシス性（ｌａｔｅ ａｐｏｐｔｏｔｉｃ）及び／又は壊死性細胞は赤色に見え、非生細胞は緑色及び赤色の両方に見える。図３Ｄは、緑色でも赤色でもなかった細胞の数を表す、条件あたりおよそ２００個の細胞からの画像の定量である。 図４Ａは、特発性拡張型心筋症に続発する重度の左心室機能障害（ｎ＝２３）又は虚血性心臓疾患（ｎ＝１６）又は非不全対照（ｎ＝４）のヒト心臓から単離されたタンパク質の代表的ウエスタンブロットを示す図である。ＢＡＧ３バリアントを保有することが見出された心臓から得られた試料は、ａからｃを付けられた赤色四角によって示される。図４Ｂは、複数のウエスタンブロットの定量を示す。図４Ｃは、内部対照としてＧＡＰＤＨを用いた不全虚血性拡張型心筋症（ｎ＝１３）、ＩＤＣ（ｎ＝１８）及び非不全ヒト心臓（ｎ＝４）におけるＢＡＧ３についてのｑＰＣＲの定量を示す。 図５Ａ～５Ｃは、ヒト不全心臓におけるＢＡＧ３レベルの代表的ウエスタンブロット（図５Ａ）、複数のウエスタンブロットの定量（図５Ｂ）、ヒト不全心臓でのｍＲＮＡレベルの定量（図５Ｃ）を示す図である。データは、ＢＡＧ３変異を有さない、特発性拡張型心筋症又は虚血性心筋症のいずれかの患者において、ＢＡＧ３のレベルが非不全ヒト心臓よりも一貫して低いことを示す。Ａ１６０Ａｄｕｐインフレーム挿入の場合は、ＢＡＧ３レベルも低い。対照的に、ＢＡＧ３のレベルは、Ｐ６３Ａ＋Ｐ３８０Ｓ（シスでバリアントを有する二重ヘテロ接合体）及びＡｌａ４７９Ｖａｌの両方において実際に上昇しており、遺伝子治療を介する外来性ＢＡＧ３の付加がこの遺伝子型では有益な影響を有さない場合があることを示唆している。 図５Ａ～５Ｃは、ヒト不全心臓におけるＢＡＧ３レベルの代表的ウエスタンブロット（図５Ａ）、複数のウエスタンブロットの定量（図５Ｂ）、ヒト不全心臓でのｍＲＮＡレベルの定量（図５Ｃ）を示す図である。データは、ＢＡＧ３変異を有さない、特発性拡張型心筋症又は虚血性心筋症のいずれかの患者において、ＢＡＧ３のレベルが非不全ヒト心臓よりも一貫して低いことを示す。Ａ１６０Ａｄｕｐインフレーム挿入の場合は、ＢＡＧ３レベルも低い。対照的に、ＢＡＧ３のレベルは、Ｐ６３Ａ＋Ｐ３８０Ｓ（シスでバリアントを有する二重ヘテロ接合体）及びＡｌａ４７９Ｖａｌの両方において実際に上昇しており、遺伝子治療を介する外来性ＢＡＧ３の付加がこの遺伝子型では有益な影響を有さない場合があることを示唆している。 図５Ａ～５Ｃは、ヒト不全心臓におけるＢＡＧ３レベルの代表的ウエスタンブロット（図５Ａ）、複数のウエスタンブロットの定量（図５Ｂ）、ヒト不全心臓でのｍＲＮＡレベルの定量（図５Ｃ）を示す図である。データは、ＢＡＧ３変異を有さない、特発性拡張型心筋症又は虚血性心筋症のいずれかの患者において、ＢＡＧ３のレベルが非不全ヒト心臓よりも一貫して低いことを示す。Ａ１６０Ａｄｕｐインフレーム挿入の場合は、ＢＡＧ３レベルも低い。対照的に、ＢＡＧ３のレベルは、Ｐ６３Ａ＋Ｐ３８０Ｓ（シスでバリアントを有する二重ヘテロ接合体）及びＡｌａ４７９Ｖａｌの両方において実際に上昇しており、遺伝子治療を介する外来性ＢＡＧ３の付加がこの遺伝子型では有益な影響を有さない場合があることを示唆している。 図６Ａ、６Ｂは、ＢＡＧ３ハプロ不全及びＷｔＢＡＧ３の再構成を有する心臓の機能を示すグラフである。一般的な（＞１％）ＢＡＧ３遺伝的バリアントの機能的影響を評価するために、マウスは、ＢＡＧ３の対立遺伝子での欠失に続いてＢＡＧ３の野生型又は変異形態のいずれかのトランスフェクションを駆動するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）血清型９を用いて、ＢＡＧ３のハプロ不全を感染させた。ＢＡＧ３の１つの対立遺伝子の欠失を有するマウスが野生型マウスにおいて見出されるＢＡＧ３の半量を有することから、ＡＡＶ－ＢＡＧ３を用いて感染させた場合にＢＡＧ３の正常レベルは完全になり、１つのＢＡＧ対立遺伝子を欠失しているマウス（ｃＢＡＧ３＋／－）において見出される左心室機能障害を回復させた。同じマウスは、ＡＡＶ９－ＭＵＴＡＮＴ対立遺伝子も注射された。マウスは、左心室機能を決定するために隔週の心エコー図を用いて経過観察された。図６Ａは、ｃＢＡＧ３＋／＋又はｃＢＡＧ３＋／－マウスへのＡＡＶ９－ＧＦＰの注射（対照）後の左心室機能の経時的測定を示す。ｃＢＡＧ３＋／＋マウスは、ＡＡＶ９－ＧＦＰの存在下で正常な収縮力を示した一方で、ｃＢＡＧ３＋／－マウスは、本発明者らのグループからの早期の報告と一致して、左心室機能の進行性の減少を実証した。図６Ｂは、正常ｃＢＡＧ３＋／＋マウスと比較した、ｃＢＡＧ３＋／－マウスでのＡＡＶ９－ＢＡＧ３を用いた感染の効果を示している。本明細書において、ＡＡＶ９－ＢＡＧ３を用いたＢＡＧ３の正常レベルの回復が、単一のＢＡＧ３対立遺伝子を欠失しているｃＢＡＧ３＋／－マイナスマウスにおいて見られるＢＡＧ３レベルの減少を回復できることが初めて示されている。 図６Ａ、６Ｂは、ＢＡＧ３ハプロ不全及びＷｔＢＡＧ３の再構成を有する心臓の機能を示すグラフである。一般的な（＞１％）ＢＡＧ３遺伝的バリアントの機能的影響を評価するために、マウスは、ＢＡＧ３の対立遺伝子での欠失に続いてＢＡＧ３の野生型又は変異形態のいずれかのトランスフェクションを駆動するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）血清型９を用いて、ＢＡＧ３のハプロ不全を感染させた。ＢＡＧ３の１つの対立遺伝子の欠失を有するマウスが野生型マウスにおいて見出されるＢＡＧ３の半量を有することから、ＡＡＶ－ＢＡＧ３を用いて感染させた場合にＢＡＧ３の正常レベルは完全になり、１つのＢＡＧ対立遺伝子を欠失しているマウス（ｃＢＡＧ３＋／－）において見出される左心室機能障害を回復させた。同じマウスは、ＡＡＶ９－ＭＵＴＡＮＴ対立遺伝子も注射された。マウスは、左心室機能を決定するために隔週の心エコー図を用いて経過観察された。図６Ａは、ｃＢＡＧ３＋／＋又はｃＢＡＧ３＋／－マウスへのＡＡＶ９－ＧＦＰの注射（対照）後の左心室機能の経時的測定を示す。ｃＢＡＧ３＋／＋マウスは、ＡＡＶ９－ＧＦＰの存在下で正常な収縮力を示した一方で、ｃＢＡＧ３＋／－マウスは、本発明者らのグループからの早期の報告と一致して、左心室機能の進行性の減少を実証した。図６Ｂは、正常ｃＢＡＧ３＋／＋マウスと比較した、ｃＢＡＧ３＋／－マウスでのＡＡＶ９－ＢＡＧ３を用いた感染の効果を示している。本明細書において、ＡＡＶ９－ＢＡＧ３を用いたＢＡＧ３の正常レベルの回復が、単一のＢＡＧ３対立遺伝子を欠失しているｃＢＡＧ３＋／－マイナスマウスにおいて見られるＢＡＧ３レベルの減少を回復できることが初めて示されている。 図７Ａ、７Ｂは、ｐ．Ｐｒｏ６３Ａｌａ＋Ｐｒｏ３８０Ｓｅｒ発現を有する心臓機能を示すグラフである。一般的なｐ．Ｐｒｏ６３Ａｌａ＋Ｐｒｏ３８０Ｓｅｒの機能的効果を評価するために、遺伝的バリアントマウスをＡＡＶ９－ＢＡＧ３－ＷＴ又はＡＡＶ９－ＢＡＧ３－６３／３８０を用いて感染させた。図７Ａは、ｃＢＡＧ３＋／＋マウス（対照）と比較した場合のｃＢＡＧ３＋／－マウスにおける左心室機能へのＡＶ９－ＢＡＧ３－６３／３８０の効果を示す。ＡＡＶ９－ＢＡＧ３－６３／３８０の注射は、左心室機能の劇的な減少を生じた－単一のＢＡＧ３対立遺伝子のみの欠失によって生じるより大きかった減少。図７Ｂは、正常ＢＡＧ３遺伝子型（＋／＋）を有するマウスへのｃＢＡＧ３－６３／３８０の注射は、野生型マウスにおいてみられるより悪いが、ＡＡＶ９－ＢＡＧ３－６３／３８０を注射されたｃＢＡＧ３＋／－マウスにおいてみられるより有意に良好な左心室機能を生じる。総合すると、これらの結果は、ｃＢＡＧ３－６３／３８０変異を保有するマウスへのＡＡＶ９－ＢＡＧ３－ＷＴの投与がドミナントネガティブ効果を生じやすく、左心室機能の減少を強めるとの仮定を強く支持している。したがって、重要なことは、ＢＡＧ３遺伝子治療を受けている患者は、治療を最適化するために彼らのＢＡＧ３遺伝子を配列決定されるべきであることである。 図７Ａ、７Ｂは、ｐ．Ｐｒｏ６３Ａｌａ＋Ｐｒｏ３８０Ｓｅｒ発現を有する心臓機能を示すグラフである。一般的なｐ．Ｐｒｏ６３Ａｌａ＋Ｐｒｏ３８０Ｓｅｒの機能的効果を評価するために、遺伝的バリアントマウスをＡＡＶ９－ＢＡＧ３－ＷＴ又はＡＡＶ９－ＢＡＧ３－６３／３８０を用いて感染させた。図７Ａは、ｃＢＡＧ３＋／＋マウス（対照）と比較した場合のｃＢＡＧ３＋／－マウスにおける左心室機能へのＡＶ９－ＢＡＧ３－６３／３８０の効果を示す。ＡＡＶ９－ＢＡＧ３－６３／３８０の注射は、左心室機能の劇的な減少を生じた－単一のＢＡＧ３対立遺伝子のみの欠失によって生じるより大きかった減少。図７Ｂは、正常ＢＡＧ３遺伝子型（＋／＋）を有するマウスへのｃＢＡＧ３－６３／３８０の注射は、野生型マウスにおいてみられるより悪いが、ＡＡＶ９－ＢＡＧ３－６３／３８０を注射されたｃＢＡＧ３＋／－マウスにおいてみられるより有意に良好な左心室機能を生じる。総合すると、これらの結果は、ｃＢＡＧ３－６３／３８０変異を保有するマウスへのＡＡＶ９－ＢＡＧ３－ＷＴの投与がドミナントネガティブ効果を生じやすく、左心室機能の減少を強めるとの仮定を強く支持している。したがって、重要なことは、ＢＡＧ３遺伝子治療を受けている患者は、治療を最適化するために彼らのＢＡＧ３遺伝子を配列決定されるべきであることである。 図８Ａ、８Ｂは、ｐ．Ａｌａ４７９Ｖａｌ発現を有する心臓の機能を示すグラフである。Ａｌａ４７９Ｖａｌの機能的影響を評価するために、後眼窩腔にＡＡＶ９－ＢＡＧ３－Ａｌａ４７９Ｖａｌが注射された。図８Ａ：ＡＡＶ９－ＢＡＧ３－６３／３８０とは対照的に、ＡＡＶ９－ＢＡＧ３－Ａ４７９Ｖの後眼窩注射は、正常遺伝子型（ＢＡＧ３＋／＋）を有するマウスにおいて又は４７９変異（Ａ４７９Ｖ）を有するマウスにおいてのいずれでも望ましくない影響を有さなかった。図８Ｂ：同様に、ＡＡＶ９－ＢＡＧ３－６３／３８０とは対照的に、ｃＢＡＧ３－Ａ４７９Ｖの注射は、左心室機能に望ましくない影響を有さなかった。したがって、Ａ４７９Ｖは、心不全を有し、ＢＡＧ３のレベルが減少している患者を処置するために使用される場合にドミナントネガティブ効果を有する可能性は低い。 図８Ａ、８Ｂは、ｐ．Ａｌａ４７９Ｖａｌ発現を有する心臓の機能を示すグラフである。Ａｌａ４７９Ｖａｌの機能的影響を評価するために、後眼窩腔にＡＡＶ９－ＢＡＧ３－Ａｌａ４７９Ｖａｌが注射された。図８Ａ：ＡＡＶ９－ＢＡＧ３－６３／３８０とは対照的に、ＡＡＶ９－ＢＡＧ３－Ａ４７９Ｖの後眼窩注射は、正常遺伝子型（ＢＡＧ３＋／＋）を有するマウスにおいて又は４７９変異（Ａ４７９Ｖ）を有するマウスにおいてのいずれでも望ましくない影響を有さなかった。図８Ｂ：同様に、ＡＡＶ９－ＢＡＧ３－６３／３８０とは対照的に、ｃＢＡＧ３－Ａ４７９Ｖの注射は、左心室機能に望ましくない影響を有さなかった。したがって、Ａ４７９Ｖは、心不全を有し、ＢＡＧ３のレベルが減少している患者を処置するために使用される場合にドミナントネガティブ効果を有する可能性は低い。
[0069]ある特定の実施形態の以下の記載は、本質的に単に例示的であり、本発明、その応用又は使用を限定することを全く意図しない。本発明の実施形態は、理論的態様が表されることなく実施され得る。さらに、理論的態様は、出願者らが、示される理論によって束縛されるように努めないことが理解されて表される。
[0070]本発明は、ほとんどアフリカ系アメリカ人においてのみ見出されるＢＡＧ３における固有の遺伝的バリアントの存在が、有害転帰を有する２倍近く高いリスクを予測するという発見に一部基づいている。加えて、遺伝的バリアントの病原性を評価する重要性及び、可能な場合、ヒト心臓におけるタンパク質レベルとそれらとの関連が示される。したがって、ＢＡＧ３変異は、アフリカ系の個体において心血管系病理生物学で重要な役割を演じている。
[0071]ＢＣＬ２関連アサノジーン３；ＭＦＭ６；Ｂｃｌ－２－結合タンパク質Ｂｉｓ；ＣＡＩＲ－１；ドッキングタンパク質ＣＡＩＲ－１；ＢＡＧファミリー分子シャペロン制御因子３；ＢＡＧ－３；ＢＣＬ２－結合アサノジーン３；又はＢＩＳとしても周知なＢｃｌ－２関連アサノジーン－３（ＢＡＧ３）は、ＨＳＰ７０への結合についてＨｉｐ－１と競合する細胞保護ポリペプチドである。ＢＡＧ３についてのＮＣＢＩ参照アミノ酸配列は、受託番号ＮＰ＿００４２７２．２；Ｐｕｂｌｉｃ ＧＩ：１４０４３０２４でＧｅｎｂａｎｋにおいて見出され得る。Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿００４２７２．２；Ｐｕｂｌｉｃ ＧＩ：１４０４３０２４のアミノ酸配列は、本明細書において配列番号１と称される。ＢＡＧ３についてのＮＣＢＩ参照核酸配列は、受託番号ＮＭ＿００４２８１．３ ＧＩ：６２５３０３８２でＧｅｎｂａｎｋにおいて見出され得る。Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿００４２８１．３ ＧＩ：６２５３０３８２の核酸配列は、配列番号２と称される。他のＢＡＧ３アミノ酸配列として、例えば、非限定的に、０９５８１７．３ ＧＩ：１２６４３６６５（配列番号３）；ＥＡＷ４９３８３．１ ＧＩ：１１９５６９７６８（配列番号４）；ＥＡＷ４９３８２．１ ＧＩ：１１９５６９７６７（配列番号５）；及びＣＡＥ５５９９８．１ ＧＩ：３８５０２１７０（配列番号６）が挙げられる。本発明のＢＡＧ３ポリペプチドは、それが機能を保持している限り、本明細書に記載されるポリペプチドのバリアントであり得る。
[0072]組成物
[0073]４０を超える遺伝子における遺伝的バリアントは、ＤＣＭと関連付けられている。かかる遺伝子の１つは、心臓、骨格筋において及び多数のがんにおいて主に発現されている進化的に保存されたタンパク質、ＢＡＧ３（Ｂｃｌ関連アサノジーン３）をコードしている。ＢＡＧ３は、多面的な（ｐｌｅｏｔｒｏｐｉｃ）効果を心臓に有する：それは、アポトーシスを阻害し、オートファジーを促進し、興奮収縮連関を調節し、筋節の完全性を維持し１７、１８、主なＤＣＭ遺伝子座として出現した１９。いくつかの観察は、ＢＡＧ３変異がアフリカ系アメリカ人において蔓延している可能性を示唆している：１）ＢＡＧ３遺伝的バリアントは、隔離集団において最も蔓延している２０；及び２）Ｇｅｎｏｍｅ Ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ Ｄａｔａｂａｓｅ（ｇｎｏｍＡＤ）は、ヨーロッパ系の個体におけるＢＡＧ３バリアントの対立遺伝子頻度と比較した場合に、アフリカ系個体において一般に見出されるＢＡＧ３バリアントの対立遺伝子頻度との間に著しい差異を示している２１。いかなる特定の理論にも束縛されることを望むものではないが、ＢＡＧ３バリアントがアフリカ系アメリカ人におけるＩＤＣの有病率の増加の原因である可能性があることが仮定された。実施例セクションにおいて詳細に記載されるとおり、まれな例外を除いてアフリカ系の個体において見出される機能性ＢＡＧ３バリアントの群がＩＤＣを有する患者における転帰不良と関連しており、治療的介入のための正確な標的を提供する可能性があることが初めて見出された。
[0074]したがって、ある特定の実施形態では、心疾患を有する患者を診断及び処置する方法は、対照ＢＡＧ３核酸配列と比較して患者試料中の少なくとも１つのＢｃｌ２関連アサノジーン３（ＢＡＧ３）遺伝的バリアントを同定するステップであって、ある特定のバリアントの検出が、ＢＡＧ３レベルの増加が前記患者に治療的であるかどうかを予測するステップ、及びかかるバリアントを有するとして同定された患者に薬剤の治療有効量を投与するステップであって、前記薬剤がＢＡＧ３分子、そのタンパク質又はペプチドの標的細胞又は組織における発現又は量を正常対照と比較して調節するステップを含む。
[0075]ある特定の実施形態では、遺伝的バリアントは、単一ヌクレオチドバリアント（ＳＮＶ）インフレーム挿入、欠失、置換又はこれらの組合せである。ある特定の実施形態では、ＳＮＶは：ｐ．Ｐｒｏ６３Ａｌａ（１０：１２１４２９３６９Ｃ／Ｇ；ｒｓ１３３０３１９９９）；ｐ．Ｈｉｓ８３Ｇｌｎ（１０：１５１３３１９７２；ｒｓ１５１３３１９７２）；Ｐｒｏ３８０Ｓｅｒ（１０：１２１４３６２０４Ｃ／Ｔ；ｒｓ１４４６９２９５４）；Ａｌａ４７９Ｖａｌ（１０：１２１４３６５０２Ｃ／Ｔ、ｒｓ３４６５６２３９）又はこれらの組合せを含む。ある特定の実施形態では、インフレーム挿入は、アミノ酸をコードしている。ある特定の実施形態では、インフレーム挿入は、非極性アミノ酸をコードしている。ある特定の実施形態では、インフレーム挿入は、１６０位にアラニンをコードしている。
[0076]さらなる実施形態では、患者が少なくとも１つのＢｃｌ２関連アサノジーン３（ＢＡＧ３）ヌクレオチドバリアント（ＮＶ）インフレーム挿入を対照ＢＡＧ３核酸配列と比較して有する、心疾患を有する患者を処置する方法は、薬剤の治療有効量を患者に投与するステップであって、前記薬剤が標的細胞又は組織におけるＢＡＧ３分子、タンパク質又はそのペプチドの発現又は量を調節するステップを含む。
[0077]ある特定の実施形態では、インフレーム挿入は、アミノ酸をコードしている。ある特定の実施形態では、インフレーム挿入は非極性アミノ酸をコードしている。ある特定の実施形態では、インフレーム挿入は、１６０位にアラニンを付加する３ヌクレオチド挿入を含む（ｐ．Ａｌａ１６０ｄｕｐ、１０：１２１４２９６４７Ａ／ＡＧＣＧ；ｒｓ１３９４３８７２７）。
[0078]ある特定の実施形態では、ＩＤＣを有し、ＢＣＬ２関連アサノジーン３（ＢＡＧ３）遺伝子に遺伝的バリアントを有するとして同定された患者を処置するための薬剤であって、ある特定のバリアントの検出がＢＡＧ３レベルの増加が患者に治療的であるかどうかを予測する遺伝的バリアント。
[0079]ある特定の実施形態では、対象におけるＢＡＧ３並びにその関連分子及び経路と関連する疾患の処置のための治療剤は、細胞においてＢＡＧ３の発現又は量を調節する。一部の実施形態では、組成物は非限定的にＢＡＧ３のｃＤＮＡ、センス及び／又はアンチセンス配列が挙げられるＢＣＬ２関連アサノジーン３（ＢＡＧ３）の核酸配列を含む。
[0080]ある特定の実施形態では、薬剤は、対象において遺伝的バリアントを欠失又は編集するための１つ又は複数の遺伝子編集又はヌクレアーゼシステムを含み、ここでＢＡＧ３の増加は治療的でなく、又はさらに対象に有害でさえある場合もある。
[0081]任意の好適なヌクレアーゼシステムを使用することができ、例えば、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）ヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼのアルゴノートファミリー、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクタヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、他のエンド若しくはエキソヌクレアーゼ又はこれらの組合せが挙げられる。参照により組み込まれるＳｃｈｉｆｆｅｒ、２０１２Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８８（１７）：８９２０～８９３６を参照されたい。ある特定の実施形態では、システムは、アルゴノートヌクレアーゼシステムである。
[0082]ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ：ある特定の実施形態では、遺伝子編集剤は、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連エンドヌクレアーゼ／Ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）を含む。
[0083]ある特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓは、触媒欠損Ｃａｓタンパク質（ｄＣａｓ）、オルソログ、ホモログ、変異体バリアント又はこれらの断片を含む。
[0084]本明細書で開示される組成物は、Ｃａｓ９などのＣＲＩＳＰＲ－関連エンドヌクレアーゼをコードしている核酸を含み得る。細菌では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子座は、可動遺伝エレメント（ウイルス、転位因子及び接合性プラスミド）に対するＲＮＡガイド適応免疫システムをコードしている。ＣＲＩＳＰＲシステムの３つの型（Ｉ－ＩＩＩ）は、同定されている。ＣＲＩＳＰＲクラスターは、スペーサー、先行する可動エレメントに相補的な配列を含有する。ＣＲＩＳＰＲクラスターは、転写され、成熟ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）にプロセスされる。ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ９は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムに属し、標的ＤＮＡを切断する強いエンドヌクレアーゼ活性を有する。Ｃａｓ９は、固有の標的配列（スペーサーと呼ばれる）の約２０塩基対（ｂｐ）及び、プレ－ｃｒＲＮＡのリボヌクレアーゼＩＩＩ－補助プロセシングのためのガイドとして作用するトランス活性化低分子ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含有する成熟ｃｒＲＮＡによってガイドされる。ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ二重鎖は、Ｃａｓ９を標的ＤＮＡにｃｒＲＮＡ上のスペーサーと標的ＤＮＡ上の相補性配列（プロトスペーサーと呼ばれる）との間の相補性塩基対合を介して方向付ける。Ｃａｓ９は、切断部位（ＰＡＭから３番目のヌクレオチド）を特定するためにトリヌクレオチド（ＮＧＧ）プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を認識する。ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡは、別々に発現され得る、又は天然ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ二重鎖を模倣するように合成ステムループ（ＡＧＡＡＡＵ）を介して人工融合低分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）に操作され得る。かかるｓｇＲＮＡは、ｓｈＲＮＡと同様に、合成され得る、又は直接ＲＮＡトランスフェクションのためにｉｎ ｖｉｔｒｏ転写され得る、又はＵ６若しくはＨ１プローモートされたＲＮＡ発現ベクターから発現され得るが、人工ｓｇＲＮＡの切断効率は、別々に発現されたｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを用いたシステムについてのものより低い。
[0085]実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、Ｉ型、ＩＩ型又はＩＩＩ型システムである場合がある。好適なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質の非限定的例として、Ｃａｓ９、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ．１、ＣａｓＹ．２、ＣａｓＹ．３、ＣａｓＹ．４、ＣａｓＹ．５、ＣａｓＹ．６、ｓｐＣａｓ、ｅＳｐＣａｓ、ＳｐＣａｓ９－ＨＦ１、ＳｐＣａｓ９－ＨＦ２、ＳｐＣａｓ９－ＨＦ３、ＳｐＣａｓ９－ＨＦ４、ＡＲＭＡＮ１、ＡＲＭＡＮ４、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ５ｅ（又はＣａｓＤ）、Ｃａｓ６、Ｃａｓ６ｅ、Ｃａｓ６ｆ、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８ａ１、Ｃａｓ８ａ２、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１０ｄ、ＣａｓＦ、ＣａｓＧ、ＣａｓＨ、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１（又はＣａｓＡ）、Ｃｓｅ２（又はＣａｓＢ）、Ｃｓｅ３（又はＣａｓＥ）、Ｃｓｅ４（又はＣａｓＣ）、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｚ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４及びＣｕ１９６６が挙げられる。
[0086]Ｃａｓ９は、オルソログである場合がある。６個の低分子Ｃａｓ９オルソログが使用され、報告は黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）由来のＣａｓ９（ＳａＣａｓ９）が、１キロベースを超えて短い一方で、ＳｐＣａｓ９のものと同様の効率でゲノムを編集できることを示した。
[0087]野生型及び記載されたバリアントＣａｓ９エンドヌクレアーゼに加えて、本発明の実施形態は、オフターゲット切断を劇的に低減する、新たに開発された「特異性が増強された」化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９バリアント（ｅＳｐＣａｓ９）を含むＣＲＩＳＰＲシステムも包含する。これらのバリアントは、ＤＮＡの非標的鎖と相互作用する溝中の正に荷電した部位を中和するためにアラニン置換を用いて操作される。この改変の目的は、Ｃａｓ９の非標的鎖との相互作用を低減することであり、それにより標的と非標的鎖との間の再ハイブリダイゼーションを促す。この改変の効果は、オフターゲット切断を限定するｇＲＮＡと標的ＤＮＡ鎖との間のさらにストリンジェントなワトソンクリック対形成のために必要である（Ｓｌａｙｍａｋｅｒ，Ｉ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．（２０１５）ＤＯＩ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａａｄ５２２７）。
[0088]ある特定の実施形態では、３つのバリアントが、最良の切断効率及び最小のオフターゲット効果を有することが見出された：ＳｐＣａｓ９（Ｋ８５５Ａ）、ＳｐＣａｓ９（Ｋ８１０Ａ／Ｋ１００３Ａ／Ｒ１０６０Ａ）（ａ．ｋ．ａ．ｅＳｐＣａｓ９ １．０）及びＳｐＣａｓ９（Ｋ８４８Ａ／Ｋ１００３Ａ／Ｒ１０６０Ａ）（ａ．ｋ．ａ．ｅＳＰＣａｓ９ １．１）は、組成物において使用される。本発明は、決してこれらのバリアントに限定されず、すべてのＣａｓ９バリアントを包含する（Ｓｌａｙｍａｋｅｒ，Ｉ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．（２０１５））。本発明は、特異性が増強された別の種類のＣａｓ９バリアント、「高フィデリティー」ｓｐＣａｓ９バリアント（ＨＦ－Ｃａｓ９）も含む。高フィデリティーバリアントの例として、ＳｐＣａｓ９－ＨＦ１（Ｎ４９７Ａ／Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ）、ＳｐＣａｓ９－ＨＦ２（Ｎ４９７Ａ／Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｄ１１３５Ｅ）、ＳｐＣａｓ９－ＨＦ３（Ｎ４９７Ａ／Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｌ１６９Ａ）、ＳｐＣａｓ９－ＨＦ４（Ｎ４９７Ａ／Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｙ４５０Ａ）が挙げられる。同様に、Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ又は任意の他の置換のすべての可能な単一、二重、三重及び四重の組合せを保有するすべてのＳｐＣａｓ９バリアントも含まれる（Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ，Ｂ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ｎａｔｕｒｅ．ＤＯＩ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１６５２６）。
[0089]本明細書において使用される場合、用語「Ｃａｓ」は、バリアント、変異体、オルソログ、高フィデリティーバリアントなどを含むすべてのＣａｓ分子を含んで意味する。
[0090]一実施形態では、エンドヌクレアーゼは、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム由来である。他の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９タンパク質由来であり、Ｃａｓ９、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ．１、ＣａｓＹ．２、ＣａｓＹ．３、ＣａｓＹ．４、ＣａｓＹ．５、ＣａｓＹ．６、ｓｐＣａｓ、ｅＳｐＣａｓ、ＳｐＣａｓ９－ＨＦ１、ＳｐＣａｓ９－ＨＦ２、ＳｐＣａｓ９－ＨＦ３、ＳｐＣａｓ９－ＨＦ４、ＡＲＭＡＮ１、ＡＲＭＡＮ４、変異体、バリアント、高フィデリティーバリアント、オルソログ、類似物、断片又はこれらの組合せが挙げられる。Ｃａｓ９タンパク質は、化膿性連鎖球菌、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ストレプトコッカス種（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）、ノカルディオプシス・ダソンビレイ（Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ ｄａｓｓｏｎｖｉｌｌｅｉ）、ストレプトマイセス・プリスチナエスピラリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｒｉｓｔｉｎａｅｓｐｉｒａｌｉｓ）、ストレプトマイセス・ビリドクロモゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトマイセス・ビリドクロモゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトスポランギウム・ロゼウム（Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ）、アリシクロバチルス・アシドカルダリウス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）、バシルス・シュードミコイデス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｓｅｕｄｏｍｙｃｏｉｄｅｓ）、バシルス・セレニチレドゥセンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｅｌｅｎｉｔｉｒｅｄｕｃｅｎｓ）、エクシグオバクテリウム・シビリカム（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｉｂｉｒｉｃｕｍ）、ラクトバチルス・デルブリュッキ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）、ラクトバチルス・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、ミクロシラ・マリーナ（Ｍｉｃｒｏｓｃｉｌｌａ ｍａｒｉｎａ）、バークホルデリア・バクテリウム（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ポラロモナス・ナフタレニボランス（ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｉｖｏｒａｎｓ）、ポラロモナス種（ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）、クロコスファエラ・ワトソニー（Ｃｒｏｃｏｓｐｈａｅｒａ ｗａｔｓｏｎｉｉ）、シアノセイス種（Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ ｓｐ．）、ミクロシスティス・エルギノーサ（Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、シネココッカス種（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）、アセトハロビウム・アラビティカム（Ａｃｅｔｏｈａｌｏｂｉｕｍ ａｒａｂａｔｉｃｕｍ）、アモニフェクス・デジェンシー（Ａｍｍｏｎｉｆｅｘ ｄｅｇｅｎｓｉｉ）、カルジセルロシルプトル・ベクシイ（Ｃａｌｄｉｃｅｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ ｂｅｃｓｃｉｉ）、カンジダタス・デスルフォルディス（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｄｅｓｕｌｆｏｒｕｄｉｓ）、ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、フィネゴルジア・マグナ（Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ ｍａｇｎａ）、ナトラナエロビウス・サーモフィルス（Ｎａｔｒａｎａｅｒｏｂｉｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ペロトマクルム・サーモプロピオニクム（Ｐｅｌｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ）、アシディチオバチルス・カルダス（Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｕｓ）、アシディチオバチルス・フェロオキシダンス（Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ）、アロクロマティウム・ヴィノスム（Ａｌｌｏｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｖｉｎｏｓｕｍ）、マリノバクター種（Ｍａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）、ニトロソコッカス・ハロフィルス（Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、ニトロソコッカス・ワトソニ（Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ ｗａｔｓｏｎｉ）、シュードアルテロモナス・ハロプランクチス（Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ｈａｌｏｐｌａｎｋｔｉｓ）、クテドロバクター・ラセミフェル（Ｋｔｅｄｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｒａｃｅｍｉｆｅｒ）、メタノハロビウム・エベスチガツム（Ｍｅｔｈａｎｏｈａｌｏｂｉｕｍ ｅｖｅｓｔｉｇａｔｕｍ）、アナベナ・バリアビリス（Ａｎａｂａｅｎａ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）、ノドゥラリア・スプミゲナ（Ｎｏｄｕｌａｒｉａ ｓｐｕｍｉｇｅｎａ）、ノストック種（Ｎｏｓｔｏｃ ｓｐ．）、アルスロスピラ・マキシマ（Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｍａｘｉｍａ）、アルスロスピラ・プラテンシス（Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓ）、アルスロスピラ種（Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｓｐ．）、リングビア種（Ｌｙｎｇｂｙａ ｓｐ．）、ミクロコレウス・クソノプラステス（Ｍｉｃｒｏｃｏｌｅｕｓ ｃｈｔｈｏｎｏｐｌａｓｔｅｓ）、オシラトリア種（Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ ｓｐ．）、ペトロトガ・モビリス（Ｐｅｔｒｏｔｏｇａ ｍｏｂｉｌｉｓ）、サーモシフォ・アフリカヌス（Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ ａｆｒｉｃａｎｕｓ）又はアカリオクロリス・マリーナ（Ａｃａｒｙｏｃｈｌｏｒｉｓ ｍａｒｉｎａ）由来である場合がある。ナノアーキア（ｎａｎｏａｒｃｈａｅａ） ＡＲＭＡＮ－１（カンジダタス・ミクラカエウム・アシジフィルム（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｍｉｃｒａｒｃｈａｅｕｍ ａｃｉｄｉｐｈｉｌｕｍ）ＡＲＭＡＮ－１）及びＡＲＭＡＮ－４（カンジダタス・パルバルカエウム・アシジフィルム（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｐａｒｖａｒｃｈａｅｕｍ ａｃｉｄｉｐｈｉｌｕｍ）ＡＲＭＡＮ－４）、ＣａｓＹ（ケルフェルドバクテリア（Ｋｅｒｆｅｌｄｂａｃｔｅｒｉａ）、ヴォゲルバクテリア（Ｖｏｇｅｌｂａｃｔｅｒｉａ）、コメイリバクテリア（Ｋｏｍｅｉｌｉｂａｃｔｅｒｉａ）、カタノバクテリア（Ｋａｔａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ））、ＣａｓＸ（プランクトミセス門（Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓ）、デルタプロテオバクテリア（Ｄｅｌｔａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ））のゲノムにおいてコードされるＣａｓ９タンパク質は含まれる。
[0091]一般に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質は、少なくとも１つのＲＮＡ認識及び／又はＲＮＡ結合ドメインを含む。ＲＮＡ認識及び／又はＲＮＡ結合ドメインは、ガイドＲＮＡと相互作用する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質は、ヌクレアーゼドメイン（すなわち、ＤＮａｓｅ又はＲＮａｓｅドメイン）、ＤＮＡ結合ドメイン、ヘリカーゼドメイン、ＲＮＡｓｅドメイン、タンパク質タンパク質相互作用ドメイン、二量体化ドメイン及び他のドメインも含む場合がある。活性ＤＮＡ－標的化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、自己対非自己識別のために標的配列に隣接して位置付けられた２～４ヌクレオチドプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を使用する。ＡＲＭＡＮ－１は、強い「ＮＧＧ」ＰＡＭ選択性を有する。Ｃａｓ９は、２つの別個の転写物、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）及びトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）も、ＲＮＡガイドＤＮＡ切断のために使用する。推定ｔｒａｃｒＲＮＡは、ＡＲＭＡＮ－１及びＡＲＭＡＮ－４ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムの両方の近傍において同定された。
[0092]本発明の実施形態は、地下水及び沈降物試料から回収された２種の細菌のゲノムにおいて見出された新たな種類のクラス２ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムも含む。このシステムは、Ｃａｓ１、Ｃａｓ２、Ｃａｓ４及びＣａｓＸと称されるおよそ９８０アミノ酸のタンパク質を含む。異なる門、デルタプロテオバクテリア及びプランクトメケス（Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓ）、に属する２つの生物におけるこのタンパク質の高い保存（６８％タンパク質配列同一性）は、近年の門を超えた移動を示唆している。各ＣａｓＸと関連するＣＲＩＳＰＲアレイは、３７ヌクレオチド（ｎｔ）の高度に類似した反復（８６％同一性）、３３～３４ｎｔのスペーサー及びＣａｓオペロンとＣＲＩＳＰＲアレイの間の推定ｔｒａｃｒＲＮＡを有する。遠位相同検出及びタンパク質モデリングは、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムにおいて見出された組織化を想起させて、ＣａｓＸ Ｃ末端近くにＲｕｖＣドメインを同定した。ＣａｓＸタンパク質の残部（Ｎ末端アミノ酸６３０個）は、いかなる周知のタンパク質にも検出可能な類似性を示さず、これが新規クラス２エフェクターであることを示唆している。ｔｒａｃｒＲＮＡと別個のＣａｓ１、Ｃａｓ２及びＣａｓ４タンパク質との組合せは、Ｖ型システムにおいて固有であり、系統発生解析は、ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓＸシステム由来のＣａｓ１が、他の周知のＶ型のいずれからも離れていることを示している。さらに、ＣａｓＸは、任意の周知のＶ型タンパク質よりも相当小さい：Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１及びＣ２ｃ３の典型的サイズ、約１，２００アミノ酸と比較して９８０ａａ（Ｂｕｒｓｔｅｉｎ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，２０１６、上記）。
[0093]一部の実施形態では、ＢＡＧ３の核酸配列は、少なくとも約５０％配列同一性を野生型ＢＡＧ３又はそのｃＤＮＡ配列に有する。他の実施形態では、ＢＡＧ３核酸配列は、少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％配列同一性を野生型ＢＡＧ３又はそのｃＤＮＡ配列に有する。
[0094]一部の実施形態では、ＢＡＧ３の核酸配列は、１つ又は複数の変異、置換、欠失、バリアント又はこれらの組合せをさらに含む。
[0095]一部の実施形態では、１つ又は複数の変異、置換、欠失、バリアント又はこれらの組合せを含むＢＡＧ３核酸配列とＢＡＧ３の天然又は野生型又はｃＤＮＡ配列との間の相同性、配列同一性又は相補性は、約５０％～約６０％である。一部の実施形態では、相同性、配列同一性又は相補性は、約６０％～約７０％である。一部の実施形態では、相同性、配列同一性又は相補性は、約７０％～約８０％である。一部の実施形態では、相同性、配列同一性又は相補性は、約８０％～約９０％である。一部の実施形態では、相同性、配列同一性又は相補性は、約９０％、約９２％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％又は約１００％である。
[0096]試料において検出されたバリアントがＢＡＧ３レベル又は活性の増加が治療的であることの予測である場合、ＢＡＧ３分子を含む薬剤は、対象に投与される。一実施形態では、発現ベクターは、ＢＣＬ２関連アサノジーン３（ＢＡＧ３）遺伝子又はそのｃＤＮＡ配列又はその改変配列をコードしている。一実施形態では、発現ベクターは、少なくとも約５０％配列同一性を野生型ＢＣＬ２関連アサノジーン３（ＢＡＧ３）又はそのｃＤＮＡ配列に有する核酸配列をコードしている。他の実施形態では、核酸配列は、少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％配列同一性を野生型ＢＣＬ２関連アサノジーン３（ＢＡＧ３）又はそのｃＤＮＡ配列に有する。
[0097]好適な核酸送達システムとして、ウイルスベクター、典型的にはアデノウイルス、アデノウイルス随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ヘルパー依存型アデノウイルス、レトロウイルス又はセンダイウイルスリポソーム（ＨＶＪ）複合体の少なくとも１つ由来の配列が挙げられる。具体的な例では、ウイルスベクターは、ポリヌクレオチドに作動可能に連結された強い真核生物プロモーター、例えばサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターを含む。
[0098]所望により、本発明のポリヌクレオチドは、カチオン性リポソーム及びアデノウイルスベクターなどのマイクロ送達ビヒクルと共にも使用され得る。リポソーム調製、標的化及び内容物の送達の手順の概説について、Ｍａｎｎｉｎｏ ａｎｄ Ｇｏｕｌｄ－Ｆｏｇｅｒｉｔｅ，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，６：６８２（１９８８）を参照されたい。同様にＦｅｌｇｎｅｒ ａｎｄ Ｈｏｌｍ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓ．Ｌａｂ．Ｆｏｃｕｓ，１１（２）：２１（１９８９）及びＭａｕｒｅｒ，Ｒ．Ａ．，Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓ．Ｌａｂ．Ｆｏｃｕｓ，１１（２）：２５（１９８９）も参照されたい。
[0099]複製欠損組換えアデノウイルスベクターは、周知の技術を用いて産生され得る。Ｑｕａｎｔｉｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：２５８１～２５８４（１９９２）；Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ－Ｐｅｒｒｉｃａｄｅｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，９０：６２６～６３０（１９９２）；及びＲｏｓｅｎｆｅｌｄ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，６８：１４３～１５５（１９９２）を参照されたい。
[0100]別の送達方法は、ＢＡＧ３を細胞内に、例えば心臓組織に産生できる１本鎖ＤＮＡ産生ベクターを使用することである。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，３４：１６７～１７１（２００３）を参照されたい。
[0101]ＢＡＧ３の発現は、当技術分野において周知の任意のプロモーター／エンハンサーエレメントによって調節され得るが、これらの制御エレメントは発現のために選択された宿主において機能性でなければならない。一部の実施形態では、プロモーターは、組織特異的プロモーターである。特に興味深いのは、筋肉特異的プロモーターであり、さらに詳細には心臓特異的プロモーターである。これらとして、ミオシン軽鎖２プロモーター（Ｆｒａｎｚ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｃａｒｄｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．５（４）：２３５～４３；Ｋｅｌｌｙ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ．１２９（２）：３８３～３９６）、アルファアクチンプロモーター（Ｍｏｓｓ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２７１（４９）：３１６８８～３１６９４）、トロポニン１プロモーター（Ｂｈａｙｓａｒ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｖｏｌ．３５（１）：１１～２３）；Ｎａ＋／Ｃａ２＋交換輸送体プロモーター（Ｂａｒｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２７２（１７）：１１５１０～１１５１７）、ジストロフィンプロモーター（Ｋｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｄｅｖ．Ｇｒｏｗｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ．，Ｖｏｌ．３９（３）：２５７～２６５）、アルファ７インテグリンプロモーター（Ｚｉｏｂｅｒ ａｎｄ Ｋｒａｍｅｒ（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２７１（３７）：２２９１５～２２）、脳性ナトリウム利尿ペプチドプロモーター（ＬａＰｏｉｎｔｅ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ，Ｖｏｌ．２７（３Ｐｔ２）：７１５～２２）及びアルファＢ－クリスタリン／低分子熱ショックタンパク質プロモーター（Ｇｏｐａｌ－Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ（１９９５）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ．１５（１２）：７０８１～７０９０）、アルファミオシン重鎖プロモーター（Ｙａｍａｕｃｈｉ－Ｔａｋｉｈａｒａ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．８６（１０）：３５０４～３５０８）及びＡＮＦプロモーター（ＬａＰｏｉｎｔｅ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２６３（１９）：９０７５～９０７８）が挙げられる。
[0102]酵母発現システムもＢＡＧ３を発現するために本発明により使用され得る。例えば、２つ述べると、非融合ｐＹＥＳ２ベクター（ＸｂａＩ、ＳｐｈＩ、Ｓｈｏｌ、ＮｏｔＩ、ＧｓｔＸＩ、ＥｃｏＲＩ、ＢｓｔＸＩ、ＢａｍＨ１、ＳａｃＩ、Ｋｐｎ１及びＨｉｎｄＩＩＩクローニング部位；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）又は融合ｐＹＥＳＨｉｓＡ、Ｂ、Ｃ（ＸｂａＩ、ＳｐｈＩ、Ｓｈｏｌ、ＮｏｔＩ、ＢｓｔＸＩ、ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨ１、ＳａｃＩ、ＫｐｎＩ及びＨｉｎｄＩＩＩクローニング部位、プロボンド（ＰｒｏＢｏｎｄ）レジンを用いて精製され、エンテロキナーゼを用いて切断されたＮ末端ペプチド；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）は、本発明により使用され得る。酵母ツーハイブリッド発現システムは、本発明により調製され得る。
[0103]例示的な一送達システムは、１つ又は複数のポリヌクレオチド、例えば、約１つのポリヌクレオチドをその中に組み込む組換えウイルスベクターである。本発明の方法において使用される例示的ウイルスベクターは、約１０８～約５×１０１０ｐｆｕ（プラーク形成単位）のｐｆｕを有する。ポリヌクレオチドが非ウイルスベクターを用いて投与される実施形態では、約０．１ナノグラム～約４０００マイクログラム、例えば、約１ナノグラム～約１００マイクログラムの使用がしばしば有用である。
[0104]一部の実施形態では、ベクターは、アデノ随伴ウイルスウイルスベクター（ＡＡＶ）、例えば、ＡＡＶ９である。用語「ＡＡＶベクター」は、非限定的に、ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７及びＡＡＶ－８が挙げられるアデノ随伴ウイルス血清型由来のベクターを意味する。ＡＡＶベクターは、ｒｅｐ及び／又はｃａｐ遺伝子などの１つ又は複数のＡＡＶ野生型遺伝子の全体又は一部が欠失している場合があるが、機能性隣接ＩＴＲ配列は保持している。高い程度の相同の一方で、異なる血清型は、異なる組織に指向性を有する。ＡＡＶ１に対する受容体は不明である；しかし、ＡＡＶ１は、ＡＡＶ２よりも効率的に骨格筋及び心筋を形質導入することが周知である。大部分の研究は、ＡＡＶ２ ＩＴＲに隣接しているベクターＤＮＡが代替血清型のカプシドにパッケージされている、シュードタイプベクターを用いて行われていることから、生物学的差異がゲノムよりもカプシドに関連することは明らかである。近年の証拠は、ＡＡＶ２カプシドにパッケージされたものよりもＡＡＶ１カプシドにパッケージされたＤＮＡ発現カセットが、心筋細胞を形質導入することに少なくとも１ｌｏｇ１０さらに効率的であることを示している。一実施形態では、ウイルス送達システムは、アデノ随伴ウイルス送達システムである。アデノ随伴ウイルスは、血清型１（ＡＡＶ１）、血清型２（ＡＡＶ２）、血清型３（ＡＡＶ３）、血清型４（ＡＡＶ４）、血清型５（ＡＡＶ５）、血清型６（ＡＡＶ６）、血清型７（ＡＡＶ７）、血清型８（ＡＡＶ８）又は血清型９（ＡＡＶ９）のものである場合がある。
[0105]当業者は、アデノウイルス及び他の種類のウイルス由来の望ましい特性を高度に特異的な特性を有する固有のベクターを生成する手段として組み込む、アデノウイルス「ハイブリッド」ウイルスを使用することによって、アデノウイルスに基づくベクターの一部の制限を回避した。例えば、ウイルスベクターキメラは、アデノウイルスとアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）との間で生成された。本発明のこれらの態様は、本明細書に記載される本発明の範囲から逸脱しない。
[0106]本発明のＢＡＧ３タンパク質をコードしている核酸は、当技術分野において周知の方法によって心筋に送達され得る。例えば、大型哺乳動物の心臓細胞は、核酸を投与する前及び／又は同時に血管拡張性物質を前記哺乳動物に投与することによって冠循環の血管を拡張することを含む方法によってトランスフェクトされ得る。一部の実施形態では、方法は、ｉｎ ｖｉｖｏで冠循環の血管に核酸を投与することを含み、ここで核酸は、少なくとも約３分間にわたって血管に注入され、冠循環は、哺乳動物の全身循環から分離されていない又は実質的に分離されておらず、核酸は哺乳動物の心臓細胞をトランスフェクトする。
[0107]一部の実施形態では、対象は、ヒト、実験動物、例えばラット若しくはマウスなど、飼育動物、例えばイヌ、ウシ、ヒツジ、ブタ若しくはウマなど、又は非ヒト霊長類、例えばサルである場合がある。対象は、心臓障害、例えば心不全、虚血、心筋梗塞、うっ血性心不全、不整脈、移植片拒絶などを罹患している場合がある。一実施形態では、対象は、心不全を罹患している。別の具体的な実施形態では、対象は、不整脈を罹患している。一実施形態では、対象はヒトである。例えば、対象は１８～６５歳である。別の実施形態では、対象は非ヒト動物である。
[0108]一実施形態では、対象は、心不全、例えば非虚血性心筋症、僧帽弁逆流症、虚血性心筋症、又は大動脈狭窄若しくは逆流症などを有する、又はそのリスクがある。
[0109]一部の実施形態では、ＢＡＧ３タンパク質又はエフェクタードメインに融合されたＢＡＧ３タンパク質をコードしている核酸分子を用いた心臓細胞のトランスフェクションは、外側心室内径（ｌａｔｅｒａｌ ｖｅｎｔｒｉｃｌｅ）短縮率を増加させる。一部の実施形態では、哺乳動物は、ヒトであり、疾患は、うっ血性心不全である。一部の実施形態では、心臓細胞のトランスフェクションは、前記融合の約４か月後に測定した場合、ポリヌクレオチドの融合前の外側心室内径短縮率と比較して少なくとも２５％外側心室内径短縮率を増加させる。一部の実施形態では、心臓細胞のトランスフェクションは、ＢＡＧ３タンパク質の発現、短縮率、駆出率、心拍出量、心弛緩の時定数及び逆流量からなる群から選択される心臓機能の測定値における改善を生じる。
[0110]処置は、収縮力に関連するパラメーターへの処置の効果を評価することによって評価され得る。例えば、ＳＲ Ｃａ２＋ＡＴＰａｓｅ活性又は細胞内Ｃａ２＋濃度は、測定され得る。さらに、心臓又は心臓組織によって生じる力は、その内容が参照により本明細書に組み込まれるＳｔｒａｕｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２６２：１４３７～４５，１９９２に記載の方法を使用して測定され得る。
[0111]改変核酸配列：本発明が、使用される核酸の性質によって限定されないことは、意図される。核酸は、ＤＮＡ又はＲＮＡである場合があり、２本鎖、１本鎖又は部分的に２本鎖形態で存在してもよい。
[0112]本発明において有用な核酸として、例示の方法により、非限定的に、オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチド、例えばアンチセンスＤＮＡ及び／又はＲＮＡなど；リボザイム；ｓｈＲＮＡ；阻害性核酸；遺伝子治療のためのＤＮＡ；ウイルスＤＮＡ及び／又はＲＮＡを含むウイルス断片；ＤＮＡ及び／又はＲＮＡキメラ；ｍＲＮＡ；プラスミド；コスミド；ゲノムＤＮＡ；ｃＤＮＡ；遺伝子断片；１本鎖ＤＮＡ、２本鎖ＤＮＡ、高次コイルＤＮＡ及び／又は三重らせんＤＮＡが挙げられるＤＮＡの種々の構造形態；Ｚ－ＤＮＡ；などが挙げられる。核酸は、典型的には大量に核酸を調製するために使用される任意の従来の手段によって調製され得る。例えば、ＤＮＡ及びＲＮＡは商業的に入手できる試薬及び合成機を使用して、当技術分野において十分周知である方法（例えば、Ｇａｉｔ，１９８５，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）を参照されたい）によって化学的に合成され得る。ＲＮＡは、ｐＧＥＭ（商標）Ｔベクター又はＳＰ６５（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）などのプラスミドを使用してｉｎ ｖｉｔｒｏ転写を介して高収量で産生され得る。
[0113]したがって、本発明のある特定の核酸配列は、キメラ核酸配列である。「キメラ核酸配列」又は「キメラ」は、本発明の文脈では、少なくとも１つのヌクレオチドでそれぞれ構成される２つ以上の化学的に異なる領域を含有する。これらの配列は、１つ又は複数の有利な特性（例えば、ヌクレアーゼ耐性の増加、細胞への取り込みの増加、標的に対する結合親和性の増加など）を付与する改変ヌクレオチドの少なくとも１つの領域を典型的には含有する。
[0114]本発明のキメラ核酸配列は、２つ以上のオリゴヌクレオチド、改変オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド及び／又はオリゴヌクレオチド模倣物の複合構造として形成されてもよい。かかる化合物は、当技術分野においてハイブリッド又はギャップマーとも称される。かかるハイブリッド構造の調製を教示する代表的米国特許は、これだけに限らないが、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，０１３，８３０号；第５，１４９，７９７号；第５，２２０，００７号；第５，２５６，７７５号；第５，３６６，８７８号；第５，４０３，７１１号；第５，４９１，１３３号；第５，５６５，３５０号；第５，６２３，０６５号；第５，６５２，３５５号；第５，６５２，３５６号；及び第５，７００，９２２号を含む。
[0115]本発明のために想定されるいくつかの改変核酸配列の具体的な例として、修飾された骨格、例えば、ホスホロチオエート、ホスホトリエステル、メチルホスホネート、短鎖アルキル若しくはシクロアルキル糖間連結又は短鎖ヘテロ原子若しくは複素環糖間連結を含むものが挙げられる。一部の実施形態では、改変オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート骨格を有するもの及びヘテロ原子骨格、ＣＨ２－－ＮＨ－－Ｏ－－ＣＨ２、ＣＨ，－－Ｎ（ＣＨ３）－－Ｏ－－ＣＨ２［メチレン（メチルイミノ）又はＭＭＩ骨格として周知］、ＣＨ２－－Ｏ－－Ｎ（ＣＨ３）－－ＣＨ２、ＣＨ２－－Ｎ（ＣＨ３）－－Ｎ（ＣＨ３）－－ＣＨ２及びＯ－－Ｎ（ＣＨ３）－－ＣＨ２－－ＣＨ２骨格を有するものを含み、ここで天然ホスホジエステル骨格は、Ｏ－－Ｐ－－Ｏ－－ＣＨと表される）。Ｄｅ Ｍｅｓｍａｅｋｅｒ ｅｔ ａｌ．Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．１９９５，２８：３６６～３７４）によって開示されたアミド骨格も本明細書に具現化されている。一部の実施形態では、モルホリノ骨格構造を有する核酸配列（Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ ａｎｄ Ｗｅｌｌｅｒ，米国特許第５，０３４，５０６号）、オリゴヌクレオチドのホスホジエステル骨格がポリアミド骨格を用いて置き換えられているペプチド核酸（ＰＮＡ）骨格、ポリアミド骨格のアザ窒素原子に直接又は間接的に結合されている核酸塩基（Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９１，２５４，１４９７）。核酸配列は、１つ又は複数の置換された糖成分も含む場合がある。核酸配列は、ペントフラノシル基の代わりにシクロブチルなどの糖模倣物を有する場合もある。
[0116]例示的な修飾オリゴヌクレオチド骨格は、これだけに限らないが、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、３’アルキレンホスホネート及びキラルホスホネートを含むメチル及び他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’－アミノホスホロアミデート及びアミノアルキルホスホロアミデートを含むホスホロアミデート、チオノホスホロアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル並びに通常の３’－５’結合を有するボラノホスフェート、これらの２’－５’結合類似物並びに、ヌクレオシド単位の隣接対が３’－５’から５’－３’又は２’－５’から５’－２’に結合されている逆位極性を有するものを含む。種々の塩、混合塩及び遊離酸形態も含まれる。
[0117]その中にリン原子を含まない例示的な修飾オリゴヌクレオチド骨格は、短鎖アルキル若しくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合ヘテロ原子及びアルキル若しくはシクロアルキルヌクレオシド間連結又は１つ若しくは複数の短鎖ヘテロ原子若しくはヘテロサイクリックヌクレオシド間連結によって形成された骨格を有する。これらは、モルホリノ連結（ヌクレオシドの糖部分から一部形成されている）；シロキサン骨格；スルフィド、スルホキシド及びスルホン骨格；ホルムアセチル（ｆｏｒｍａｃｅｔｙｌ）及びチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファメート骨格；メチレンイミノ及びメチレンヒドラジノ骨格；スルホネート及びスルホンアミド骨格；アミド骨格を有するもの；並びに他のＮ、Ｏ、Ｓ及びＣＨ２構成成分部分を混合して有するものを含む。
[0118]核酸配列は、追加的に又は代替的に、核酸塩基（当技術分野においてしばしば単に「塩基」と称される）改変又は置換も含み得る。本明細書において使用される場合、「未改変」又は「天然」ヌクレオチドは、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）及びウラシル（Ｕ）を含む。改変ヌクレオチドは、天然核酸においてまれに又は一時的に見られるだけのヌクレオチド、例えば、ヒポキサンチン、６－メチルアデニン、５－Ｍｅピリミジン、特に５－メチルシトシン（５－メチル－２’デオキシシトシンとも称され、当技術分野においてしばしば５－Ｍｅ－Ｃと称される）、５－ヒドロキシメチルシトシン（ＨＭＣ）、グリコシルＨＭＣ及びゲントビオシル（ｇｅｎｔｏｂｉｏｓｙｌ）ＨＭＣ並びに合成ヌクレオチド、例えば、２－アミノアデニン、２－（メチルアミノ）アデニン、２－（イミダゾリルアルキル）アデニン、２－（アミノアルキルアミノ）アデニン又は他のヘテロ置換アルキルアデニン、２－チオウラシル、２－チオチミン、５－ブロモウラシル、５－ヒドロキシメチルウラシル、８－アザグアニン、７－デアザグアニン、Ｎ６（６－アミノヘキシル）アデニン及び２，６－ジアミノプリン．（Ｋｏｒｎｂｅｒｇ，Ａ．，ＤＮＡ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，１９８０，ｐｐ７５～７７；Ｇｅｂｅｙｅｈｕ，Ｇ．，（１９８７）ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：４５１３）を含む。当技術分野において周知の「ユニバーサル」塩基、例えばイノシンも含まれ得る。
[0119]別の改変は、オリゴヌクレオチドの活性又は細胞取り込みを増強する１つ又は複数の成分又はコンジュゲートをオリゴヌクレオチドに化学的に連結することを含む。かかる成分として、これだけに限らないが、脂質成分、例えばコレステロール成分、コレステリル成分、コール酸など、チオエーテル、例えばヘキシル－５－トリチルチオールなど、脂肪族鎖、例えばドデカンジオール若しくはウンデシル残基など、リン脂質、例えば、ジ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセリン若しくはトリエチルアンモニウムなど、１，２－ジ－Ｏ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロ－３－Ｈ－ホスホネート、ポリアミン若しくはポリエチレングリコール鎖又はアダマンタン酢酸が挙げられる。親油性成分を含む核酸配列及びかかるオリゴヌクレオチドを調製するための方法は、当技術分野において周知である、例えば、米国特許第５，１３８，０４５号、第５，２１８，１０５号及び第５，４５９，２５５号。
[0120]所与の核酸配列のすべての位置について均一に修飾される必要はなく、実際に１つより多い前述の修飾が単一の核酸配列に、又はかかる配列内の単一のヌクレオシド内にさえ組み込まれてもよい。本発明は、本明細書で既に定義されたキメラオリゴヌクレオチドであるオリゴヌクレオチドも含む。
[0121]別の実施形態では、本発明のＢＡＧ３核酸分子は、これだけに限らないが脱塩基ヌクレオチド、ポリエーテル、ポリアミン、ポリアミド、ペプチド、炭水化物、脂質又はポリ炭水化物化合物が挙げられる別の成分とコンジュゲートされる。当業者は、これらの分子が核酸分子を含む任意の１つ又は複数のヌクレオチドに糖、塩基又はリン酸基のいくつかの位置で連結され得ることを認識する。
[0122]別の実施形態では、ＢＡＧ３核酸配列は、ロックド核酸（ＬＮＡ）を用いて置換された１つ又は複数のヌクレオチドを含む。ＬＮＡ改変核酸配列は、親若しくは天然配列と同様のサイズを有する場合がある、またさらに長い若しくは短い場合がある。かかるＬＮＡ改変オリゴヌクレオチドは、約７０％未満、又は約６０％未満、又は約５０％未満のＬＮＡモノマーを含有する場合があり、それらのサイズは、約１～２５ヌクレオチドの間である。
[0123]アンチセンスＢＡＧ３－オリゴヌクレオチド：別の実施形態では、ＢＡＧ３の発現を調節するオリゴヌクレオチド、例えば、転写制御エレメントによって、細胞又は患者における治療的転帰の予測である１つ又は複数のバリアントを含むＢＡＧ３の発現を減少させる必要がある場合がある。
[0124]一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、核酸配列に相補的な少なくとも５つの連続した塩基を含み、オリゴヌクレオチドは、ｉｎ ｖｉｖｏ又は ｉｎ ｖｉｔｒｏでＢＡＧ３に特異的にハイブリダイズし、発現を調節する。別の実施形態では、本発明のオリゴマー化合物は、異なる塩基が化合物中の１つ又は複数のヌクレオチド位置に存在するバリアントも含む。例えば、第１のヌクレオチドがアデノシンである場合、バリアントは、この位置にチミジン、グアノシン又はシチジンを含有して産生される場合がある。これは、オリゴヌクレオチドの任意の位置で行われ得る。次にこれらの化合物は、標的核酸の発現を阻害するそれらの能力を決定するために本明細書に記載される方法を使用して検査される。
[0125]一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドと標的との間の相同性、配列同一性又は相補性は、約５０％～約６０％である。一部の実施形態では、相同性、配列同一性又は相補性は、約６０％～約７０％である。一部の実施形態では、相同性、配列同一性又は相補性は、約７０％～約８０％である。一部の実施形態では、相同性、配列同一性又は相補性は、約８０％～約９０％である。一部の実施形態では、相同性、配列同一性又は相補性は、約９０％、約９２％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％又は約１００％である。
[0126]別の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結と：アルキルホスホネート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホノチオエート、ホスホロアミデート、カルバメート、カーボネート、リン酸トリエステル、アセトアミデート（ａｃｅｔａｍｉｄａｔｅ）、カルボキシメチルエステル及び／又はこれらの組合せからなる群から選択される少なくとも１つのヌクレオチド間連結との組合せを含む。
[0127]別の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ペプチド核酸、ロックド核酸（ＬＮＡ）分子、類似物、誘導体及び／又はこれらの組合せを含む少なくとも１つの修飾核酸塩基を任意選択で含む。
[0128]化合物の標的核酸への結合が活性の減少を生じるように標的核酸の通常の機能を干渉し、特異的結合が望ましい条件下でオリゴヌクレオチドの非標的核酸配列への非特異的結合を回避するために十分な程度の相補性がある場合に、オリゴヌクレオチドは、特異的にハイブリダイズ可能である。かかる条件として、すなわちｉｎ ｖｉｖｏアッセイ又は治療処置の場合では生理的条件、及びｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイの場合ではアッセイが実施される条件が挙げられる。
[0129]ＤＮＡ、ＲＮＡ、キメラ、置換などであるかに関わらず、化合物の標的ＤＮＡ又はＲＮＡ分子への結合が有用性の減少を生じるように標的ＤＮＡ又はＲＮＡ分子の通常の機能を干渉し、特異的結合が望ましい条件下、すなわち、ｉｎ ｖｉｖｏアッセイ又は治療処置の場合では生理的条件、及びｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイの場合ではアッセイが実施される条件下で、オリゴヌクレオチドの非標的配列への非特異的結合を回避するために十分な程度の相補性がある場合に、オリゴヌクレオチドは、特異的にハイブリダイズ可能である。
[0130]アンチセンスの特異性及び感度も治療的使用のために当業者によって利用される。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、動物及びヒトの疾患状態の処置において治療成分として使用される。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヒトに安全かつ効果的に投与されており、多数の臨床試験が現在進行中である。したがって、オリゴヌクレオチドが細胞、組織及び動物、特にヒトの処置のための治療レジメンにおいて有用であるように構成され得る有用な治療成分であり得ことは確立されている。
[0131]本発明の実施形態では、オリゴマーオリゴヌクレオチド、特にオリゴヌクレオチドは、標的核酸分子に結合し、ＢＡＧ３の増加から利益を受ける又は欠失、置換若しくは薬剤が使用されるいくつかの他の機序が具体的な対象に治療的に有益であるかどうかである、１つ又は複数のバリアントを含むＢＡＧ３遺伝子によってコードされる分子の発現を調節する。干渉されるＤＮＡの機能は、例えば複製及び転写を含む。干渉されるＲＮＡの機能は、例えば、ＲＮＡのタンパク質翻訳部位への移行、ＲＮＡからのタンパク質の翻訳、１つ又は複数のｍＲＮＡ種を生じるＲＮＡのスプライシング及びＲＮＡによって関与又は促進され得る触媒活性などのすべての生体機能を含む。機能は、望ましい機能に応じて、上方制御又は抑制され得る。
[0132]オリゴヌクレオチドとして、アンチセンスオリゴマー化合物、アンチセンスオリゴヌクレオチド、外部カイド配列（ＥＧＳ）オリゴヌクレオチド、代替スプライサー、プライマー、プローブ及び標的核酸の少なくとも一部にハイブリダイズする他のオリゴマー化合物が挙げられる。このようにこれらの化合物は、１本鎖、２本鎖、部分的に１本鎖又は環状オリゴマー化合物の形態で導入され得る。
[0133]本発明の文脈では、オリゴヌクレオチドの特定の核酸分子への標的化は、複数ステップ工程であり得る。工程は、その機能が調節される標的核酸の同定で一般に開始する。この標的核酸は、その発現が具体的な障害又は疾患状態と関連する、例えば細胞の遺伝子（又は遺伝子から転写されたｍＲＮＡ）であり得る。
[0134]標的化工程は、望ましい効果、例えば、発現の調節がもたらされるアンチセンス相互作用が生じるような標的核酸内の少なくとも１つの標的領域、セグメント又は部位の決定も一般に含む。本発明の文脈において、用語「領域」は、少なくとも１つの同定可能な構造、機能又は特徴を有する標的核酸の部分として定義される。標的核酸の領域内は、セグメントである。「セグメント」は、標的核酸内の領域の小さなまた一部の部分として定義される。本発明において使用される場合「部位」は、標的核酸内の位置として定義される。
[0135]別の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドのコード及び／又は非コード領域に結合し、標的分子の発現及び／又は機能を調節する。
[0136]別の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは天然アンチセンスポリヌクレオチドに結合し、標的分子の発現及び／又は機能を調節する。「機能」の例は、転写の負の制御因子を阻害するものであってもよく、それにより所望の分子、例えば、ＢＡＧ３などの発現の増加を可能にする。
[0137]別の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、センスポリヌクレオチドに結合し、標的分子の発現及び／又は機能を調節する。
[0138]本発明の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、具体的な標的のアンチセンス鎖に結合する。オリゴヌクレオチドは、長さ少なくとも５ヌクレオチドであり、各オリゴヌクレオチドが重複する配列を標的化するように合成されてもよく、それによりオリゴヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドの全長を網羅するように合成される。標的は、コード及び非コード領域も含む。
[0139]本発明によるアンチセンス化合物として、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、外部ガイド配列（ＥＧＳ）オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ化合物、ｓｉＲＮＡ化合物などの１本又は２本鎖ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）化合物及び、標的核酸の少なくとも一部にハイブリダイズし、その機能を調節する他のオリゴマー化合物が挙げられる。これにより、それらは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ様、ＲＮＡ様若しくはこれらの混合物である場合がある、又はこれらの１つ若しくは複数の模倣物である場合がある。これらの化合物は、１本鎖、２本鎖、環状又はヘアピンオリゴマー化合物である場合があり、内部若しくは末端バルジ、ミスマッチ又はループなどの構造エレメントを含有する場合がある。アンチセンス化合物は、日常的に直鎖状に調製されるが、環状及び／又は分枝状に接続又はそうでなければ調製され得る。アンチセンス化合物は、例えば、完全に若しくは部分的に２本鎖の化合物を形成するようにハイブリダイズする２本の鎖、又はハイブリダイゼーション及び完全に若しくは部分的に２本鎖の化合物の形成を可能にするように十分な自己相補性を有する１本の鎖などの構築物を含む。２本の鎖は、遊離３’又は５’末端を残したまま内部で連結されてもよく、連続的なヘアピン構造又はループを形成するように連結されてもよい。ヘアピン構造は、５’又は３’末端のいずれかに１本鎖の特徴の伸展を生じるオーバーハングを含有する場合がある。２本鎖化合物は、末端にオーバーハングを任意選択で含んでもよい。さらなる改変として、一方の末端、選択された核酸塩基位置、糖位置又はヌクレオシド間連結の１つに結合されたコンジュゲート基を含む場合がある。代替的に、２本の鎖は、非核酸成分又はリンカー基を介して連結され得る。１本の鎖だけから形成される場合、ｄｓＲＮＡは、二重鎖を形成するようにそれ自体に折り返す自己相補性ヘアピン型分子の形態をとる場合がある。したがってｄｓＲＮＡは、完全に又は部分的に２本鎖である場合がある。遺伝子発現の特異的な調節は、トランスジェニック細胞株におけるｄｓＲＮＡヘアピンの安定な発現によって達成され得るが、ある特定の実施形態では、遺伝子発現は上方制御される。２本の鎖から形成される、又は二重鎖を形成するようにそれ自体に折り返す自己相補性ヘアピン型分子の形態をとる１本鎖の場合、２本鎖（又は、１本鎖の二重形成領域）は、塩基がＷａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ様式で対になる相補性ＲＮＡ鎖である。
[0140]別の実施形態では、所望のオリゴヌクレオチド又はアンチセンス化合物は：アンチセンスＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、キメラアンチセンスオリゴヌクレオチド、修飾連結を含むアンチセンスオリゴヌクレオチド、干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）；マイクロ干渉ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）；低分子一過性ＲＮＡ（ｓｔＲＮＡ）；又は短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）；低分子ＲＮＡ誘導遺伝子活性化（ＲＮＡａ）；低分子活性化ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）又はこれらの組合せの少なくとも１つを含む。
[0141]ｄｓＲＮＡは、遺伝子発現、「低分子ＲＮＡ誘導遺伝子活性化」又はＲＮＡａと呼ばれる機構も活性化できる。ｄｓＲＮＡｓ標的化遺伝子プロモーターは、関連遺伝子の強力な転写活性化を誘導する。ＲＮＡａは、「低分子活性化ＲＮＡ」（ｓａＲＮＡ）と呼ばれる合成ｄｓＲＮＡを使用してヒト細胞において実証された。
[0142]低分子２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）は、低分子活性化ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）としても作用できる。理論に束縛されることなく、遺伝子プロモーター中の配列を標的化することによって、ｓａＲＮＡは、ｄｓＲＮＡ誘導転写活性化（ＲＮＡａ）と称される現象において標的遺伝子発現を誘導する。
[0143]一部の実施形態では、リボ核酸配列は、ＢＡＧ３の転写を調節するゲノムの制御セグメントに特異的である。そのため候補治療剤は、細胞においてＢＡＧ３の発現を活性化するｄｓＲＮＡである場合があり、処置を必要とする患者に投与される。
[0144]ペプチド：別の実施形態では、ＢＡＧ３ペプチドは、ＢＣＬ２関連アサノジーン３（ＢＡＧ３）野生型、キメラ又はそのｃＤＮＡ配列を含む核酸によってコードされる。ペプチドは、ＢＣＬ２関連アサノジーン３（ＢＡＧ３）の合成ペプチドであってもよい。
[0145]ペプチド配列がＢＣＬ２関連アサノジーン３（ＢＡＧ３）分子の天然又はそのｃＤＮＡ配列に限定されないことは理解される。当業者は、タンパク質又はペプチドの一次配列を変更するが、その機能を通常変更しない保存的アミノ酸変化が作製され得ることを認識する。保存的アミノ酸置換として、典型的には、次の群：グリシン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、リシン、アルギニン、フェニルアラニン、チロシンの内での置換が挙げられる。
[0146]保存的置換は、アミノ酸の種類に基づいても作製され得る：脂肪族（バリン、イソロイシン、ロイシン及びアラニン）；荷電（アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン及びヒスチジン）；芳香族残基（フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファン）；並びに含硫（メチオニン及びシステイン）。ポリペプチド配列は、少なくとも約６８％同一性、少なくとも約７０％同一性又は少なくとも約７１％同一性をＢＣＬ２関連アサノジーン３（ＢＡＧ３）核酸配列、又はそのｃＤＮＡ配列に有する。
[0147]２つのヌクレオチド又はアミノ酸配列間の同一性百分率の決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成できる。例えば、２つの配列を比較するために有用な数学アルゴリズムは、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２２６４～２２６８）のアルゴリズムであり、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３～５８７７）のとおり改変される。このアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ ａｌ．（１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３～４１０）のＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれ、例えば、ウェブページアドレスｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ（ｄｏｔ）ｎｃｂｉ（ｄｏｔ）ｎｌｍ（ｄｏｔ）ｎｉｈ（ｄｏｔ）ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ／を有する、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のワールドワイドウェブサイトで接続できる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、ＮＢＬＡＳＴプログラム（ＮＣＢＩウェブサイトで「ｂｌａｓｔｎ」と指定される）で、次のパラメーター：ギャップペナルティ＝５；ギャップ伸長ペナルティ＝２；ミスマッチペナルティ＝３；マッチリワード＝１；期待値１０．０；及び本明細書に記載される核酸とのヌクレオチド配列相同性を得るためのワードサイズ＝１１を使用して実施され得る。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、次のパラメーター：期待値１０．０、本明細書に記載されるタンパク質分子へのアミノ酸配列相同性を得るための、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリクスを使用してＸＢＬＡＳＴプログラム又はＮＣＢＩ「ｂｌａｓｔｐ」プログラム、で実施され得る。比較目的のためのギャップを作った配列比較を得るために、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９～３４０２）に記載のとおり利用され得る。代替的に、ＰＳＩ－Ｂｌａｓｔ又はＰＨＩ－Ｂｌａｓｔは、分子間の遠縁及び共通パターンを共有する分子の関係を検出する繰り返し検索を実施するために使用され得る。ＢＬＡＳＴ、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ、ＰＳＩ－Ｂｌａｓｔ及びＰＨＩ－Ｂｌａｓｔプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴ）の初期設定パラメーターは、使用され得る。同一性百分率を算出することにおいて、典型的には正確なマッチが計数される。
[0148]本発明の実施形態は、直接又はペプチドリンカーを介して間接的に第２のポリペプチド配列に作動可能に融合されたＢＣＬ２関連アサノジーン３（ＢＡＧ３）ポリペプチドを含むハイブリッドタンパク質をコードしているポリヌクレオチドも含む。リンカー配列は、当技術分野において十分周知である。一実施形態では、ハイブリッドタンパク質は、ＢＡＧ３ポリペプチド又はレポーターポリペプチドなどの検出可能な成分に作動可能に連結されたＢＡＧ３ポリペプチドを含み、ここでレポーターポリペプチドは、ＢＡＧ３ポリペプチドのＮ又はＣ末端に直接又は間接的に融合されている。例示的レポーターポリペプチドとして、ルシフェラーゼ（ＬＵＣ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）及びＧＦＰ誘導体が挙げられる。
[0149]ＢＡＧ３ポリペプチド又はその断片を含むハイブリッドタンパク質は、レポーターポリペプチドに加えて、又はレポーターポリペプチドに代えて、別の種類のポリペプチドに連結され得る。これらの追加的ポリペプチドは、ペプチドの精製、同定、及び／又は治療的若しくは予防的適用のために有用である任意のアミノ酸配列であり得る。加えて、追加的ポリペプチドは、シグナルペプチド又は標的化ペプチドなどであってもよい。
[0150]一部の場合では、他の付加、置換又は欠失は、ポリペプチドの安定性（これだけに限らないが、タンパク質分解への抵抗性が挙げられる）を増加させる、又は適切な受容体、リガンド及び／若しくは結合タンパク質に対するポリペプチドの親和性を増加させる場合がある。一部の場合では、他の付加、置換又は欠失は、ポリペプチドの溶解度を増加させる場合がある。一部の実施形態では、部位は、非天然アミノ酸の組み込みのための別の部位に加えて、組換え宿主細胞での発現後にポリペプチド溶解度を増加させる目的のための天然でコードされる又は非天然アミノ酸を用いた置換のために選択される。一部の実施形態では、ポリペプチドは、関連するリガンド、結合タンパク質、及び／又は受容体に対する親和性を調節する、受容体二量体化を調節する（これだけに限らないが、増加させる又は減少させることが挙げられる）、受容体二量体を安定化させる、循環半減期を調節する、放出若しくは生物学的利用率を調節する、精製を促進する、又は投与の具体的な経路を改善若しくは変更する、別の付加、置換又は欠失を含む。同様に、非天然アミノ酸ポリペプチドは、化学的若しくは酵素切断配列、プロテアーゼ切断配列、反応基、抗体結合ドメイン（これだけに限らないが、ＦＬＡＧ若しくはポリ－Ｈｉｓが挙げられる）又は他の親和性に基づく配列（これだけに限らないが、ＦＬＡＧ、ポリ－Ｈｉｓ、ＧＳＴなどが挙げられる）又は、検出（これだけに限らないが、ＧＦＰが挙げられる）、精製、組織若しくは細胞膜を通じた輸送、プロドラッグ放出又は活性化、サイズ低減又はポリペプチドの他の特性、を改善する連結された分子（これだけに限らないが、ビオチンが挙げられる）を含み得る。
[0151]本明細書に記載される方法及び組成物は、１つ又は複数の非天然アミノ酸のポリペプチドへの組み込みを含む。１つ又は複数の非天然アミノ酸は、ポリペプチドの活性を破壊しない１つ又は複数の具体的な位置に組み込まれ得る。これは、「保存的」置換を作製すること、これだけに限らないが、疎水性アミノ酸を非天然若しくは天然の疎水性アミノ酸を用いて置換すること、かさ高いアミノ酸を非天然若しくは天然のかさ高いアミノ酸を用いて置換すること、親水性アミノ酸を非天然若しくは天然の親水性アミノ酸を用いて置換することが挙げられる）及び／又は、活性に必要ない位置に非天然アミノ酸を挿入すること、によって達成され得る。
[0152]種々の生化学及び構造的アプローチは、ポリペプチド内の非天然アミノ酸を用いた置換のための望ましい位置を選択するために使用され得る。ポリペプチド鎖の任意の位置は、非天然アミノ酸を組み込むための選択のために好適であり、選択は、合理的な設計に基づいて、又は具体的な望ましい目的のための若しくは目的のない無作為選択によってであり得る。望ましい位置の選択は、これだけに限らないが、アゴニスト、スーパーアゴニスト、部分アゴニスト、逆アゴニスト、アンタゴニスト、受容体結合モジュレーター、受容体活性モジュレーター、結合パートナーへの結合のモジュレーター、結合パートナー活性モジュレーター、結合パートナーコンホメーションモジュレーター、二量体若しくは多量体形成、天然分子と比較して活性若しくは特性に変化がないことが挙げられる、任意の望ましい特性又は活性を有する非天然アミノ酸ポリペプチド（さらに改変され得る又は未改変のままであり得る）を産生すること、又は溶解度、凝集又は安定性などのポリペプチドの任意の物理的若しくは化学的特性を操作することに基づき得る。例えば、ポリペプチドの生物学的活性のために必要なポリペプチド中の位置は、これだけに限らないが、点変異分析、アラニンスキャンニング又はホモログスキャンニング法が挙げられる方法を使用して同定され得る。これだけに限らないが、アラニン又はホモログスキャンニング変異導入が挙げられる方法によって生物学的活性に重要であると同定されたもの以外の残基は、ポリペプチドに求められる望ましい活性に応じた非天然アミノ酸を用いた置換のための良好な候補である可能性がある。代替的に、生物学的活性に重要であると同定された部位は、この場合も、ポリペプチドに求められる望ましい活性に応じた非天然アミノ酸を用いた置換のための良好な候補である可能性がある。別の選択肢は、ポリペプチド鎖上の各位置に系列置換を非天然アミノ酸を用いて作製し、ポリペプチドの活性への効果を観察することである。任意のポリペプチドへの非天然アミノ酸を用いた置換のための位置を選択するための任意の手段、技術又は方法は、本明細書に記載される方法、技術及び組成物における使用のために好適である。
[0153]候補薬剤及びスクリーニングアッセイ
[0154]本明細書で具現化される組成物は、創薬及び標的の検証の領域においても適用され得る。本発明は、Ｂｃｌ－２関連アサノジーン－３（ＢＡＧ３）ポリヌクレオチドと疾患状態、表現型又は状態との間に存在する関係を明らかにする創薬の努力における本明細書において具現化される核酸配列及びペプチドの使用を包含する。方法は、患者試料中において、対照ＢＡＧ３核酸配列と比較して少なくとも１つのＢｃｌ２関連アサノジーン３（ＢＡＧ３）遺伝的バリアントを同定すること；及び、ＢＡＧ３遺伝的多様性を有するとして同定された患者に薬剤の治療有効量を投与することを含み、ここで薬剤は、正常対照と比較して、ＢＣＬ２関連アサノジーン３（ＢＡＧ３）分子、そのタンパク質又はペプチドの標的細胞又は組織における発現又は量を調節する。ある特定の実施形態では、遺伝的バリアントは、単一ヌクレオチドバリアント（ＳＮＶ）インフレーム挿入、欠失、置換又はこれらの組合せである。ある特定の実施形態では、ＳＮＶは：ｐ．Ｐｒｏ６３Ａｌａ（１０：１２１４２９３６９Ｃ／Ｇ；ｒｓ１３３０３１９９９）；ｐ．Ｈｉｓ８３Ｇｌｎ（１０：１５１３３１９７２；ｒｓ１５１３３１９７２）；Ｐｒｏ３８０Ｓｅｒ（１０：１２１４３６２０４Ｃ／Ｔ；ｒｓ１４４６９２９５４）；Ａｌａ４７９Ｖａｌ（１０：１２１４３６５０２Ｃ／Ｔ、ｒｓ３４６５６２３９）又はこれらの組合せを含む。ある特定の実施形態では、インフレーム挿入は、アミノ酸をコードしている。ある特定の実施形態では、インフレーム挿入は、非極性アミノ酸をコードしている。ある特定の実施形態では、インフレーム挿入は、１６０位にアラニンをコードしている。
[0155]本発明のスクリーニングアッセイは、動物モデル、細胞に基づくシステム及び細胞に基づかないシステムを好適に含み、具現化する。本明細書において具現化される核酸配列及びペプチドは、例えば化合物のライブラリーをスクリーニングすることによって治療目的の薬剤を同定するために、又は他に種々の薬物スクリーニング若しくは分析技術若しくは新規化合物の合成によって目的の化合物を同定するために使用される。かかるスクリーニングにおいて使用される遺伝子、対立遺伝子、断片又はそのオリゴペプチドは、溶液中で遊離、固体支持体に着けて、細胞表面由来又は細胞内に位置付けられている場合がある。測定は、以下の実施例セクションに詳細に記載されるとおり実施される。実施形態では、候補薬剤のスクリーニングは、ＢＡＧ３の翻訳を調節するものを同定するために実施される。
[0156]アッセイは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏ形式のものであり得る。目的のｉｎ ｖｉｔｒｏ形式は、例えば細胞が存在する水性媒体などの培地中に基質を導入することによって接触が生じる細胞ベース形式を含む。さらに他の実施形態では、アッセイは、細胞を含む多細胞生物が使用されるｉｎ ｖｉｖｏである場合がある。本明細書において具現化される核酸配列をコードしている標的化ベクターと標的細胞（複数可）との接触は、任意の従来のプロトコールを使用して達成され得る。標的細胞が多細胞生物、例えば動物の一部として存在するこれらの実施形態では、ベクターは、多細胞生物、例えば動物全体に好都合に投与され（例えば、注射される、給餌されるなど）、投与は、全身性又は局所性、例えば多細胞生物の特定の組織（複数可）及び／又は器官（複数可）に直接であり得る。
[0157]目的の多細胞生物として、これだけに限らないが：昆虫、鳥類種などの脊椎動物、例えばニワトリ；哺乳動物、げっ歯類、例えば、マウス、ラットを含む；有蹄動物、例えばブタ、ウシ、ウマ；イヌ、ネコ、霊長類、例えばサル、類人猿、ヒト；などが挙げられる。したがって目的の標的細胞として、これだけに限らないが：昆虫細胞、脊椎動物細胞、特に鳥類細胞、例えば、ニワトリ細胞；哺乳動物細胞、例えばマウス、ブタ、有蹄動物、ヒツジ、ウマ、ラット、イヌ、ネコ、サル及びヒト細胞；などが挙げられる。
[0158]ある特定の実施形態では、対象の方法は、ハイスループット（ＨＴ）形式で実施される。対象の発明の対象のＨＴ実施形態では、複数の異なる細胞は、同時にアッセイ又は検査される。同時に検査によって、複数の細胞それぞれが実質的に同時に検査されることが意味される。一般に、対象ＨＴ方法において同時に検査される細胞の数は、約１０～１０，０００個、通常約１００～１０，０００個、ある特定の実施形態では、約１０００～５０００個の範囲である。候補薬剤の活性を決定するための種々のハイスループットスクリーニングアッセイは、当技術分野において周知であり、本発明に容易に適応され、例えば、その開示が参照により本明細書に組み込まれるＳｃｈｕｌｔｚ（１９９８）Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔ ８：２４０９－２４１４；Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ（１９９８）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ ２：５９７～６０３に記載のもの；及び米国特許第６，１２７，１３３号に記載のものが挙げられる。
[0159]実施形態では、検出可能な成分は、目的の薬剤にコンジュゲートされ、ここで検出可能な成分は：発光成分、化学発光成分、蛍光成分、生物発光成分、酵素、天然又は合成成分を含む。
[0160]候補薬剤：方法は、候補薬剤として任意の検査化合物を用いて実行され得る。本発明の方法を実行することに有用な検査化合物は、生物学的ライブラリー、空間的にアドレス可能な平行固相又は溶液相ライブラリー、逆重畳積分を必要とする合成ライブラリー法、「１ビーズ１化合物」ライブラリー法、及び親和性クロマトグラフィー選択を使用する合成ライブラリー法が挙げられる当技術分野において周知のコンビナトリアルライブラリー法における多数のアプローチのいずれかを使用して得ることができる。生物学的ライブラリーアプローチは、ペプチドライブラリーに限定される一方で、他の４つのアプローチは、ペプチド、非ペプチドオリゴマー又は化合物の小分子ライブラリーに適用可能である（Ｌａｍ，１９９７，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ．１２：１４５）。
[0161]分子ライブラリーの合成のための方法の例は、当技術分野において、例えば：ＤｅＷｉｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６９０９～６９１３；Ｅｒｂ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：１１４２２～１１４２６；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：２６７８～２６８５；Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１：１３０３～１３０５；Ｃａｒｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０５９～２０６１；Ｃａｒｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０６１～２０６４；及びＧａｌｌｏｐ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：１２３３～１２５１、において見出すことができる。
[0162]化合物のライブラリーは、溶液（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，１９９２，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １３：４１２～４２１）、又はビーズ（Ｌａｍ，１９９１，Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８２～８４）、チップ（Ｆｏｄｏｒ，１９９３，Ｎａｔｕｒｅ ３６４：５５５～５５６）、細菌（米国特許第５，２２３，４０９号）、胞子（米国特許第５，５７１，６９８号；第５，４０３，４８４号；及び第５，２２３，４０９号）、プラスミド（Ｃｕｌｌ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１８６５～１８６９）、又はファージ（Ｓｃｏｔｔ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３８６～３９０；Ｄｅｖｌｉｎ，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：４０４～４０６；Ｃｗｉｒｌａ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：６３７８～６３８２；及びＦｅｌｉｃｉ，１９９１，Ｊ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：３０１～３１０）で提示される場合がある。
[0163]スクリーニングされ得る商業的に入手可能なライブラリーとして、これだけに限らないが、ＴｉｍＴｅｃ Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｌｉｂｒａｒｙ（ＮＰＬ）、ＮＰＬ－６４０及びＴｉｍＴｅｃ ＮＤＬ－３０００Ｌｉｂｒａｒｙが挙げられる。ポリアミンをモデルにした化合物（すなわち、ポリアミン類似物）を含むライブラリーもスクリーニングされ得る。
[0164]ある特定の実施形態では、候補薬剤は、小分子又は大分子リガンドである。小分子リガンドによって、約５０～約１０，０００ダルトン、一般的に約５０～約５，０００ダルトン及びさらに一般的に約１００～約１０００ダルトンのサイズの範囲のリガンドが意味される。大分子によって、分子量で約１０，０００ダルトン又はこれを超えるサイズの範囲のリガンドが意味される。
[0165]方法は、さまざまな濃度の検査候補及び／又は、反応の持続時間などのさまざまな検査条件を使用して反復して実施され得る。方法によって同定され得る検査候補は、特異性、用量依存性、ｉｎ ｖｉｖｏでの有効性などを検証するための当技術分野の従来の方法を使用してさらに検査され得る。検査候補は、追加的検査候補を開発するためのリード化合物として役立ち得る。
[0166]プロトタイプ化合物又は薬剤は、当業者に利用可能な任意の情報に基づいて治療活性を有すると考えられている。例えば、プロトタイプ剤は、Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅにある情報に基づいて治療活性を有すると考えられている。非限定的な例の方法に加えて、化合物は、臨床医の経験、化合物の構造、構造活性関連性データ、ＥＣ５０、アッセイデータ、ＩＣ５０アッセイデータ、動物若しくは臨床研究又は任意の他の根拠、又はそのような根拠の組合せに基づいて治療活性を有すると考えられている。
[0167]治療的に活性な化合物又は薬剤は、例えば、対象に投与される、又はｉｎ ｖｉｔｒｏで検査される場合に特定の応答を誘導する薬剤の能力が挙げられる治療活性を有する薬剤である。治療活性として、予防的及び寛解性の処置の両方が挙げられる疾患又は状態の処置を含む。疾患又は状態の処置は、疾患又は状態の予防、回復及び消失を含む、疾患又は状態の任意の程度の改善を含み得る。治療活性は、一実施形態では反応性酸素中間体による損傷を伴う任意の疾患又は障害に対してを含む、任意の疾患又は状態に対して行われ得る。治療活性を判定するために、化合物の治療活性が評価され得る任意の方法が使用され得る。例えば、例えば臨床評価、ＥＣ５０及びＩＣ５０アッセイ並びに用量応答曲線を含むｉｎ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｔｒｏ法の両方が使用され得る。
[0168]本発明のアッセイでの使用のための、又は有用な薬理学的薬剤として本発明のアッセイにおいて同定された候補化合物は、当技術分野において既に周知の薬理学的薬剤若しくはそのバリアントであり得る、又は薬理学的活性を有することがそれ以前に周知でない化合物であってもよい。候補化合物は、天然に存在してもよく、又は研究所において設計されてもよい。候補化合物は、単一のジアステレオマー、１つより多いジアステレオマー又は単一の鏡像異性体若しくは１つより多い鏡像異性体を有する場合がある。
[0169]候補化合物は、微生物、動物又は植物から単離され得る、例えば、組換え的に産生され得る、又は当技術分野において周知の化学的方法によって合成され得る。所望により、本発明の候補化合物は、これだけに限らないが、生物学的ライブラリー、空間的にアドレス可能な平行固相又は溶液相ライブラリー、逆重畳積分を必要とする合成ライブラリー法、「１ビーズ１化合物」ライブラリー法、及び親和性クロマトグラフィー選択を使用する合成ライブラリー法が挙げられる当技術分野において周知の多数のコンビナトリアルライブラリー法のいずれかを使用して得ることができる。生物学的ライブラリーアプローチは、ポリペプチドライブラリーに限定される。他の４つのアプローチは、ポリペプチド、非ペプチドオリゴマー又は化合物の小分子ライブラリーに適用可能であり、本発明における例示的アプローチである。Ｌａｍ，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ．１２：１４５～１６７（１９９７）を参照されたい。
[0170]一実施形態では、本発明は、好適なプロドラッグとして候補化合物を同定する方法を提供する。好適なプロドラッグは、本発明の方法によって同定され得る任意のプロドラッグを含む。当業者に明らかな任意の方法は、好適なプロドラッグとして候補化合物を同定するために使用され得る。
[0171]別の態様では、本発明は、治療剤としての適合性について候補化合物をスクリーニングする方法を提供する。治療剤の適合性についてのスクリーニングは、治療剤としての化合物の能力に影響を与え得る化合物に関連する１つ、数個の又は多数の判断基準の評価を含み得る。例えば、有効性、安全性、効率、保持率、局所性、組織選択性、分解又は細胞内残留性などの因子も検討され得る。一実施形態では、治療剤としての適合性についての候補化合物をスクリーニングする方法は提供され、ここで方法は、好適なプロドラッグとして同定された候補化合物を提供すること、候補化合物の治療活性を判定すること、候補化合物の細胞内残留性を判定することを含む。細胞内残留性は、例えば、放射性トレーサー、重同位元素標識又はＬＣＭＳによってなど当業者に明らかな任意の技術によって測定され得る。
[0172]治療剤としての適合性についての化合物のスクリーニングにおいて、候補化合物の細胞内残留性が評価される。一実施形態では、薬剤は、本明細書において具現化される組成物の翻訳を調節するその能力に関して、候補治療剤への応答について経時的に評価される。
[0173]別の実施形態では、本明細書において具現化される組成物の可溶性及び／又は膜結合形態、例えばタンパク質、変異体又はこれらの生物学的に活性な部分は、候補薬剤をスクリーニングするためのアッセイにおいて使用され得る。タンパク質の膜結合形態が使用される場合、可溶化剤を利用することは望ましい場合がある。かかる可溶化剤の例として、非イオン性界面活性剤、例えば、ｎ－オクチルグルコシド、ｎ－ドデシルグルコシド、ｎ－ドデシルマルトシド、オクタノイル－Ｎ－メチルグルカミド、デカノイル－Ｎ－メチルグルカミド、トリトン（ＴＲＩＴＯＮ）（商標）Ｘ－１００、トリトン（商標）Ｘ－１１４、ＴＨＥＳＩＴ（商標）、イソトリデシポリ（Ｉｓｏｔｒｉｄｅｃｙｐｏｌｙ）（エチレングリコールエーテル）ｎ、３－［（３－コールアミドプロピル）ジメチルアンミニオ（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｉｎｉｏ）］－１－プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）、３－［（３－コールアミドプロピル）ジメチルアンミニオ］－２－ヒドロキシ－１－プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳＯ）又はＮ－ドデシル＝Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アンモニオ－１－プロパンスルホネートなどが挙げられる。
[0174]無細胞アッセイが使用される場合もあり、生物発光成分を含むＢＡＧ３分子（核酸又はペプチド）及び検査化合物を含む反応混合物を、翻訳及び／又は転写活性の経時的な測定を可能にする条件及び期間並びに検査薬剤の濃度で調製することを含む。
[0175]マイクロアレイ：標的分子に結合できる核酸配列又はペプチドの同定は、核酸のライブラリーを固有の各核酸がアレイを形成するように規定の位置に位置付けて基質表面に固定することによって達成され得る。一般に、核酸又はペプチドの固定化ライブラリーは、生体分子の核酸又はペプチドへの結合を支持する条件下で生体分子又は候補薬剤に曝露される。次いでアレイは、どの核酸配列又はペプチドが生体分子に結合するかを判定するために本明細書において具現化される方法によって分析される。かかる生体分子は、結合核酸又はペプチドの位置の検出における使用のために予め決定された標識を保有してもよい。
[0176]ＢＡＧ３核酸配列の固定化アレイを使用するアッセイは、未知の核酸の配列；単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）分析；特定の種、組織、細胞型など由来のＢＡＧ３遺伝子発現パターンの分析；遺伝子同定；などを決定するために使用され得る。
[0177]さらなる実施形態では、オリゴヌクレオチド又はいずれかのＢＡＧ３ポリヌクレオチド配列由来の長い断片は、マイクロアレイにおいて標的として使用され得る。マイクロアレイは、標的遺伝子又はその産生物が相互作用する遺伝子を同定するため、及び／又は例えば、神経学的障害を媒介する遺伝子の発現産生物を制御することにおける候補治療剤の有効性を評価するのと同時に、多数の遺伝子及び遺伝子転写物の同一性及び／又は発現レベルをモニターするために使用され得る。この情報は、遺伝子機能を決定し、治療剤を開発し、活性をモニターするために使用され得る。
[0178]マイクロアレイは、当技術分野において周知の方法を使用して調製、使用及び分析され得る（例えば、Ｂｒｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５，米国特許第５，４７４，７９６号；Ｓｃｈｅｎａ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９３：１０６１４～１０６１９；Ｈｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９４：２１５０～２１５５；及びＨｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９７、米国特許第５，６０５，６６２号を参照されたい）。他の実施形態では、マイクロアレイは、ＢＡＧ３ペプチド又は、候補薬剤を同定するためにアッセイされ得る他の望ましい分子を含む。
[0179]別の実施形態では、心疾患又は障害の処置又は予防のための候補薬剤をスクリーニングするための方法は、試料を候補治療剤と接触させること、及び薬剤が標的に有する効果を測定することを含む。例えば、薬剤は、ＢＡＧ３発現を制御でき、次いで薬剤は、治療効果の可能性（モニターされるパラメーター、例えば発現、の増加又は減少）についてさらに研究され得る。異常な発現状態は、心不全、疾患、がん、遺伝的欠陥及び／又は毒素などの病態によって生じる場合がある。
[0180]抗体。有用な診断アッセイは、ＢＡＧ３に特異的に結合する１つ又は複数の抗体を含む場合がある。一部の実施形態では、抗体は、変異体ＢＡＧ３に特異的に結合する。用語抗体は、免疫グロブリンに基づく結合分子を広範に指して使用され、用語は、従来の抗体（例えば、クラスＧの四量体抗体（例えば、ＩｇＧ１））、それらの目的の標的に結合する能力を保持しているその断片（例えば、Ｆａｂ’断片）及び１本鎖抗体（ｓｃＦｖｓ）を包含する。抗体は、ポリクローナル又はモノクローナルであってもよく、ヒト、マウス、ウサギ、ヒツジ若しくはヤギ細胞によって、又はこれらの細胞由来の融合細胞によって産生され得る。抗体は、ヒト化、キメラ又は二重特異性であってもよい。
[0181]抗体は、種々の立体配置を想定でき、免疫グロブリン遺伝子によって実質的にコードされる１つ又は複数のポリペプチドからなるタンパク質を包含できる。未処置抗体、抗体多量体若しくは抗体断片又は、抗体の機能性、抗原結合領域を含むその他のバリアントを含む種々の抗体構造にいずれか１つが使用され得る。本発明者らは、用語「免疫グロブリン」を「抗体」と同意語として使用する場合がある。抗体は、起源においてモノクローナル又はポリクローナルであってもよい。抗体の供給源にかかわらず、好適な抗体として、未処置抗体、例えば２本の重（Ｈ）鎖及び２本の軽（Ｌ）鎖を有するＩｇＧ四量体、１本鎖抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、相補性決定領域（ＣＤＲ）移植抗体及び抗体断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、及びかかる断片由来の組換え抗体、例えば、ラクダ抗体、マイクロ抗体、二重特異性抗体及び二特異性抗体が挙げられる。
[0182]未処置抗体は、抗原結合可変領域（ＶＨ及びＶＬ）並びに軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）及び重鎖定常ドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含むものである。定常ドメインは、天然配列定常ドメイン（例えばヒト天然配列定常ドメイン）又はそのアミノ酸配列バリアントであってもよい。当技術分野において十分周知であるとおり、ＶＨ及びＶＬ領域は、さらに保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）が組み入れられた、「相補性決定領域」（ＣＤＲ）と称される超変異性の領域にさらに細分される。
[0183]抗ＢＡＧ３抗体は、任意のクラスの免疫グロブリン、例えば、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＭ（並びにそのサブタイプ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４））由来であってもよく、免疫グロブリンの軽鎖は、カッパ又はラムダ型であってもよい。認められているヒト免疫グロブリン遺伝子は、カッパ、ラムダ、アルファ（ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）、ガンマ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、デルタ、イプシロン及びミュー定常領域遺伝子並びに多数の免疫グロブリン可変領域遺伝子を含む。
[0184]用語、免疫グロブリン又は抗体の「抗原結合部分」は、一般に標的、この場合ＢＡＧ３ポリペプチド上のアミノ酸残基を含むエピトープ、に特異的に結合する免疫グロブリンの部分を指す。免疫グロブリンの抗原結合部分は、したがって、１つ又は複数の免疫グロブリン鎖が全長ではないが細胞性標的に特異的に結合する分子である。抗原結合部分又は断片の例として：（ｉ）Ｆａｂ断片、ＶＬＣ、ＶＨＣ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインからなる一価断片；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２個のＦａｂ断片を含む二価断片；（ｉｉｉ）抗体の単一の腕のＶＬＣ及びＶＨＣドメインからなるＦｖ断片、並びに（ｖ）例えば可変領域の抗原結合部分に特異的に結合するために十分なフレームワークを有する単離されたＣＤＲが挙げられる。軽鎖可変領域の抗原結合部分及び重鎖可変領域の抗原結合部分、例えば、Ｆｖ断片の２つのドメイン、ＶＬＣ及びＶＨＣは、組換え方法を使用して、ＶＬＣ及びＶＨＣ領域が一価分子（１本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として周知、を形成するように対になる単一のタンパク質鎖として作製され得るようにする合成リンカーによって、接続され得る。かかるｓｃＦｖは、本発明の標的剤である場合があり、用語、抗体の「抗原結合部分」によって包含される。
[0185]「Ｆｖ」断片は、完全な抗原認識及び結合部位を含有する最小の抗体断片である。この領域は、固く非共有結合的に会合している１個の重鎖及び１個の軽鎖可変ドメインの二量体からなる。各可変ドメインの３個の高頻度可変性領域がＶＨ－ＶＬ二量体の表面上の抗原結合部位を規定するように相互作用する立体配置にある。６個の高頻度可変性領域が抗原結合特異性を付与する一方で、単一の可変ドメイン（又は、抗原に特異的な高頻度可変性領域を３個だけ含むＦｖの半分）でさえ、完全な結合部位よりも低い親和性であるが、抗原を認識し結合する能力を有する。安定性を改善するために、ＶＨ－ＶＬドメインは、１本鎖Ｆｖ又はｓｃＦＶ抗体断片を形成するように（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３などの可動性ペプチドリンカーによって接続され得る、又はジスルフィド安定化Ｆｖ（ｄｓＦｖ）を生じるようにフレームワーク領域に２個のシステイン残基を導入することによってジスルフィド結合を形成するように操作される場合がある。抗体の断片は、それらが全長抗体の望ましい特異性及び／又はＢＡＧ３ポリペプチドに特異的に結合するために十分な特異性を保持している限り、提供される方法における使用のために好適である。
[0186]本発明の組成物は、（１）閾値レベルの結合活性を示す；及び／又は（２）周知の関連ポリペプチド分子と顕著に交差反応しない、抗体を含む。抗体の結合親和性は、当業者によって、例えばＳｃａｔｃｈａｒｄ分析（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ，ＡｎｎＮＹ Ａｃａｄ，Ｓｃｉ．５１：６６０～６７２（１９４９））によって容易に決定され得る。
[0187]一部の実施形態では、抗ＢＡＧ３抗体は、ＢＡＧ３にいくらかの相同性を有することが予測される他のタンパク質によりも標的抗ＢＡＧ３について少なくとも１．５倍、２倍、５倍、１０倍、１００倍、１０３倍、１０４倍、１０５倍、１０６倍又はそれより多くそれらの標的エピトープ又は模倣物デコイに結合できる。
[0188]一部の実施形態では、抗ＢＡＧ３抗体は、１０－４Ｍ以下、１０－７Ｍ以下、１０－９Ｍ以下の高親和性、又はナノモル以下の親和性（０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３、０．２、０．１ｎＭ又はさらに少なく）を有して結合する。一部の実施形態では、抗ＢＡＧ３抗体のそれらそれぞれの標的に対する結合親和性は、少なくとも１×１０６Ｋａである。一部の実施形態では、抗ＢＡＧ３抗体のＢＡＧ３に対する結合親和性は、少なくとも５×１０６Ｋａ、少なくとも１×１０７Ｋａ、少なくとも２×１０７Ｋａ、少なくとも１×１０８Ｋａ又はそれを超える。抗体は、ＢＡＧ３に対するそれらの結合親和性の観点からも記載又は指定され得る。一部の実施形態では結合親和性として、５×１０－２Ｍ、１０－２Ｍ、５ｘ１０－３Ｍ、１０－３Ｍ、５ｘ１０－３Ｍ、１０－４Ｍ、５ｘ１０－５Ｍ、１０－５Ｍ、５ｘ１０－６Ｍ、１０－６Ｍ、５ｘ１０－７Ｍ、１０－７Ｍ、５ｘ１０－８Ｍ、１０－８Ｍ、５ｘ１０－９Ｍ、５ｘ１０－１０Ｍ、１０－１０Ｍ、５ｘ１０－１１Ｍ、１０－１１Ｍ、５ｘ１０－１２Ｍ、１０－１２Ｍ、５ｘ１０－１３Ｍ、１０－１３Ｍ、５ｘ１０－１４Ｍ、１０－１４Ｍ、５ｘ１０－１５Ｍ未満又は１０－１５Ｍ以下のＫｄを有するものを含む。
[0189]一部の実施形態では、抗体は、周知の関連ポリペプチド分子に結合せず；例えばそれらは、ＢＡＧ３に結合するが、周知の関連ポリペプチドにしない。一部の実施形態では、抗体は、変異体ＢＡＧ３ポリペプチド、例えば１０個の塩基対欠失を有するＢＡＧ３ポリペプチドに特異的に結合するが、野生型ＢＡＧ３ポリペプチドにしない。抗体はＢＡＧ３に特異的に結合する抗体集団を単離するために周知の関連ポリペプチドに対してスクリーニングされ得る。
[0190]本発明の診断アッセイとして、同時免疫電気泳動、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、放射性免疫沈降法、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ドットブロット又はウエスタンブロットアッセイ、阻害又は競合的アッセイ及びサンドイッチアッセイが挙げられる。抗ＢＡＧ３抗体は、レポーター又はマーカー（例えば、検出可能マーカー）とも称される場合があるタグを含み得る。検出可能マーカーは、タグ付きペプチドの発現又は活性の定性的及び／又は定量的評価を可能にする抗ＢＡＧ３抗体又はその生物学的に活性断片に共有結合で連結される任意の分子であり得る。活性は、生物学的活性、物理化学的活性又はこれらの組合せを含む。検出可能マーカーの形態及び位置の両方は、標識化抗体が生物学的活性を保持している限り、変動する場合がある。多数の異なるマーカーを使用することができ、具体的なマーカーの選択は、望ましい適用に依存する。標識化抗ＢＡＧ３抗体は、例えば、生物学的試料、例えば、尿、唾液、脳脊髄液、血液若しくは生検試料中のＢＡＧ３若しくは変異体ＢＡＧ３のレベルを評価するため、又は心血管系治療剤、例えば上に記載されるＢＡＧ３構築物への臨床応答の評価のために使用され得る。
[0191]薬剤にコンジュゲートされ得る例示的な検出可能な標識として、バリウム、ジアトリゾエート、ヨード化ケシ油エチルエステル、クエン酸ガリウム、イオカルミン酸、イオセタム酸、ヨーダミド、ヨージパミド、ヨードキサム酸、ヨーグラミド、イオヘキソール、イオパミドール、イオパノ酸、イオプロセム酸、イオセファミック酸（ｉｏｓｅｆａｍｉｃ ａｃｉｄ）、イオセリック酸（ｉｏｓｅｒｉｃ ａｃｉｄ）、イオスラミドメグルミン、イオセメチック酸、イオタスル（ｉｏｔａｓｕｌ）、イオテトリック酸、イオタラム酸、イオトロクス酸、イオキサグル酸、イオキソアトリゾイック（ｉｏｘｏｔｒｉｚｏｉｃ）酸、イポダート、メグルミン、メトリザミド、メトリゾエート、プロピリオドン及び塩化タリウムなどの放射線不透過性又は造影剤が挙げられる。代替的に又は付加的に、検出可能な標識は、蛍光標識、例えば、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリテリン（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｅｒｉｎ）、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ－フタアルデヒド（ｏ－ｐｈｔｈａｌｄｅｈｙｄｅ）及びフルオレサミン；ルミノール、イソルミノール、芳香族アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩及びシュウ酸エステルからなる群から選択される化学発光化合物；リポソーム又はデキストラン；又は生物発光化合物、例えばルシフェリン、ルシフェラーゼ及びエクオリン、であり得る。
[0192]好適なマーカーとして、例えば、酵素、光親和性リガンド、放射性同位元素及び蛍光又は化学発光化合物が挙げられる。ペプチドに検出可能マーカーを導入する方法は、当技術分野において十分周知である。マーカーは、合成の際に又は合成後に付加され得る。組換え抗ＢＡＧ３抗体又はその生物学的に活性なバリアントは、形質転換された細胞が増殖する培養培地への標識化前駆体（例えば、放射標識されたアミノ酸）の添加によっても標識化され得る。一部の実施形態では、ペプチドの類似物又はバリアントは、検出可能マーカーの組み込みを促進するために使用され得る。例えば、任意のＮ末端フェニルアラニン残基は、１２５Ｉを用いて容易に標識され得るチロシンなどの近い関連芳香族アミノ酸を用いて置き換えられ得る。一部の実施形態では、有効な標識化を支持する追加的官能基は、抗ＢＡＧ３抗体又はその生物学的に活性なバリアントの断片に付加される場合がある。例えば、３－トリブチルチンベンゾイル基は、天然構造のＮ末端に付加され得る；１２５１を用いたトリブチルチン基の続く置き換えは、放射標識されたヨードベンゾイル基を生じる。
[0193]任意の当技術分野において周知の方法は、かかる標識を検出するために使用され得る、例えば、ポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）、ＳＰＥＣＴ画像法、磁気共鳴画像法、Ｘ線；又は超音波によって検出可能である。
[0194]診断、治療、キット
[0195]本明細書の組成物及び本発明の化合物は、診断、治療及び予防のために、並びに研究試薬として並びにキットの構成成分として利用され得る。
[0196]本明細書において開示される組成物は、心疾患又は障害、例えば、心不全又は拡張型心筋症を有する対象の処置のために一般に及びさまざまに有用である。用語「対象」、「患者」又は「個体」は、互換的に参照される。対象は、臨床的に有益な結果が続いて生じる場合はいつも有効に処置される。これは、例えば、疾患の症状の完全な消散、疾患の症状の重症度の減少又は疾患の進行の遅延を意味する場合がある。これらの方法は、生物学的試料中で、ＢＡＧ３レベルの増加が対象に治療的であるかどうかを予測するＢＡＧ３バリアントを同定すること、及びかかるバリアントを有するとして同定された患者に薬剤の治療有効量を投与することをさらに含み得る。
[0197]ある特定の実施形態では、キットは、生物学的試料中のＢＣＬ２関連アサノジーン３（ＢＡＧ３）バリアントを同定するための検出可能な標識にコンジュゲートされた１つ又は複数のプローブを含む。ある特定のバリアントの検出は、対象が処置から利益を得るかどうかを予測する。
[0198]本発明の治療及び／又は予測方法に適している心血管系障害は、ＢＡＧ３の調節に応答性である障害、又はＢＡＧ３調節剤に応答性でない可能性がある対象を処置することであり得る。本発明の組成物は、具体的な細胞機構のいずれかに影響することによって作動するものに限定されない。ＢＡＧ３の誤制御に関連する任意の形態の心血管系障害は、本発明の範囲内である。
[0199]本発明の方法は、医薬の調製物の観点から表され得る。したがって、本発明は、医薬の調製物における本明細書に記載される薬剤及び組成物の使用を包含する。本明細書に記載される化合物は、治療用組成物及びレジメンにおいて、又は本明細書に記載される疾患若しくは状態（例えば、本明細書において開示される心血管系障害）の処置における使用のための医薬の製造のために有用である。
[0200]本明細書に記載される任意の組成物は、標的細胞への続く送達のために宿主の身体の任意の部分に投与され得る。組成物は、非限定的に、脳、脳脊髄液、関節、鼻粘膜、血液、肺、腸管、筋肉組織、皮膚又は哺乳動物の腹膜腔に送達され得る。送達の経路に関して、組成物は、静脈内、頭蓋内、腹腔内、筋肉内、皮下、筋肉内、直腸内、腟内、くも膜下腔内、気管内、皮内若しくは経皮注射によって、経口若しくは経鼻投与によって、又は時間をかけたゆっくりの灌流によって送達され得る。さらなる例では、組成物のエアロゾル調製物は、吸入によって宿主に与えられ得る。
[0201]必要な投薬量は、投与の経路、製剤の性質、患者の疾病の性質、患者のサイズ、体重、表面積、年齢及び性別、投与される他の薬物並びに担当臨床医の判断に依存する。好適な投薬量は、０．０１～１，０００ｍｇ／ｋｇの範囲である。必要な投薬量の広い多様性は、細胞標的の多様性及び種々の投与経路の異なる効率の観点から予測される。これらの投薬レベルにおける多様性は、最適化のために標準的な経験的ルーチンを使用して調整されてもよく、当技術分野において十分理解される。投与は、単一又は複数（例えば、２～若しくは３～、４～、６～、８～、１０～、２０～、５０～、１００～、１５０～又はこれを超える倍数）であってもよい。好適な送達ビヒクル（例えば、ポリマー性微小粒子又は埋め込み型デバイス）への化合物の封入は、送達の効率を増加させ得る。
[0202]本明細書で提供される任意の組成物を用いる処置の継続期間は、短くは１日から長くは宿主の寿命（例えば、長い年月）の任意の長さの時間であってもよい。例えば、化合物は、１週間に１回（例えば、４週間から複数月若しくは年について）；１か月に１回（例えば、３～１２か月間について又は多数年について）；又は５年間、１０年間又はそれ以上の期間について１年に１回投与され得る。処置の頻度が変動する場合があることも注目される。例えば、本化合物は、１日に、１週間に１カ月に又は１年に１回（又は２回、３回など）投与され得る。
[0203]本明細書で提供される任意の組成物の有効量は、処置を必要とする個体に投与され得る。本明細書において使用される場合、用語「有効」は、望ましい応答を誘導するが、患者において顕著な毒性を誘導しない任意の量を指す。かかる量は、具体的な組成物の既知量の投与後に患者の応答を評価することによって決定され得る。加えて、毒性のレベル、ある場合、は、具体的な組成物の既知量を投与する前後の患者の臨床症状を評価することによって決定され得る。患者に投与される具体的な組成物の有効量が、望ましい転帰及び患者の応答及び毒性のレベルに従って調整され得ることは注目される。顕著な毒性は、具体的な患者それぞれについて変動する場合があり、非限定的に、患者の疾患状態、年齢及び副作用への耐性が挙げられる複数の要因に依存する。
[0204]当業者に周知の任意の方法は、具体的な応答が誘導されるかどうかを判定するために使用され得る。具体的な疾患状態の程度を評価できる臨床的方法は、応答が誘導されるかどうかを判定するために使用され得る。応答を評価するために使用される具体的な方法は、患者の障害の性質、患者の年齢及び性別、投与される他の薬物並びに担当臨床医の判断に依存する。
[0205]２つ以上の治療剤の同時投与は、薬剤がそれらの治療効果を発揮する期間が重複している限り、薬剤が同時に又は同じ経路によって投与される必要はない。異なる日又は週での投与のような同時又は連続的な投与は、検討される。組成物は、心血管疾患の処置のための別の標準的治療剤と共にも投与され得る。かかる関連する疾患又は障害の例は：心疾患又は障害、骨格筋疾患又は障害、多発性硬化症、老人斑、脳アミロイドアンギオパチー、粥状動脈硬化、神経膠芽腫、アミロイド沈着、神経変性疾患、神経原線維変化、認知症、絨毛がん、星状細胞腫、アミロイドーシス、高脂血症、神経変性、腫瘍性形質転換、前立腺がん、動脈硬化プラーク、閉塞症、ＡＩＤＳ、転移、心筋梗塞、肺線維症、壊死、ショック、メラノーマ、結腸直腸がん、遺伝子感受性、乾癬、がん、炎症、神経膠腫、癌腫、乳がん、神経病理、腫瘍、前立腺がん、血管疾患、細胞損傷、脳腫瘍、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、高コレステロール血症を含む。骨格筋疾患の例として、筋肉の原発性（遺伝的）疾患（例えば、筋ジストロフィー及び先天性ミオパチー、代謝ミオパチー）；後天性疾患（例えば、筋炎、中毒性ミオパチー）；筋肉の二次疾患（例えば慢性肺、心臓、腎疾患、ＨＩＶ／ＡＩＤ、がん、サルコペニアなど由来の神経原性萎縮、萎縮症が挙げられる。
[0206]キット：本発明は、本明細書に記載される方法のいずれかを実行するために十分な、必要な又は有用な１つ若しくは複数の又はすべての構成要素を含有する、システム及びキット（例えば、市販の治療用、診断用又は研究用製品、反応混合物など）をさらに提供する。これらのシステム及びキットは、緩衝剤、検出／画像法構成要素、陽性／陰性対照試薬、説明書、ソフトウェア、ハードウェア、パッケージング又は他の所望の構成要素を含み得る。
[0207]キットは、標的分子への化合物の効果を調節することができる検査化合物をスクリーニングするための有用なツールを提供する。キットは、研究、臨床及び試験研究所を補助するために任意の好適な様式で、典型的には、使用のための説明書と共に好適な容器中に種々のパーツを含んで、パッケージされ得る。
[0208]ある特定の実施形態では、キットは、脂質及び／又は溶媒をさらに含み得る。ある特定の実施形態では、キットは、手順のために必要な緩衝剤及び試薬並びにアッセイを実行するための説明書をさらに含み得る。ある特定の実施形態では、キットは、必要に応じて、検査におけるバックグラウンド干渉を低減するための薬剤、陽性及び陰性対照試薬、検査を実行するための装置などをさらに含み得る。
[0209]心血管疾患を有する又は心血管疾患を発症する素因を有する患者を診断するために、対象がＢＡＧ３ポリペプチド中に変異を有するかどうかを判定するためのキットが同様に提供される。キットは、心血管疾患の処置のために使用される薬剤の効率をモニターするためにも利用され得る。
[0210]組成物の投与
[0211]本明細書において具現化される方法によって同定される薬剤は、製剤化され得る、及び本発明の組成物は、１つ又は複数の追加的活性成分、医薬組成物又は他の化合物と併せて投与され得る。本発明の治療剤は、ヒトを含む哺乳動物などの動物に投与され得る。
[0212]他の実施形態では、医薬組成物は、本明細書において具現化される少なくとも１つ又は複数の薬剤及び／又は候補治療剤を含む。
[0213]医薬用製剤は、経口（固体若しくは液体）、非経口（筋肉内、腹腔内、静脈内（ＩＶ）若しくは皮下注射）、心臓内、経皮的（受動的に、又はイオン泳動若しくは電気穿孔法を使用してのいずれかで）、経粘膜及び全身性（経鼻、膣、直腸内若しくは舌下）又は吸入経路投与によって又は生体内分解性の挿入を使用する投与のためである場合があり、投与の各経路のために適切な投薬形態に製剤化され得る。
[0214]薬剤は、生理食塩水又は緩衝塩類溶液などの薬学的に許容できる担体又は希釈剤中に製剤化され得る。好適な担体及び希釈剤は、投与の様式及び経路並びに標準的薬務に基づいて選択され得る。例示的な薬学的に許容できる担体及び希釈剤並びに医薬製剤の記載は、当分野における標準的テキスト、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓにおいて及びＵＳＰ／ＮＦに見出される。他の物質は、組成物を安定化及び／又は保存するために組成物に加えられてもよい。
[0215]本発明の組成物は、任意の従来の技術によって動物に投与され得る。組成物は、標的部位に直接、例えば外科的送達によって内部若しくは外部標的部位に、又は血管によって到達できる部位にカテーテルによって投与され得る。送達の他の方法、例えば、リポソーム送達又は組成物を含む浸透性のデバイスからの拡散は、当技術分野において周知である。組成物は、単一ボーラスで、複数回注射で、又は持続注入によって（例えば、静脈内に）投与され得る。非経口投与のために、組成物は、滅菌発熱物質不含有形態で例えば製剤化される。
[0216]本発明によって同定される化合物は、薬物の濃度が骨吸収を阻害するために、又は本明細書に開示される任意の他の治療指標を達成するために十分であるような様式で、患者に経口でも投与され得る。典型的には、化合物を含有する医薬組成物は、患者の状態と調和する様式で約０．１～約５０ｍｇ／ｋｇの間の経口用量で投与される。例示的経口用量は、約０．５～約２０ｍｇ／ｋｇである。
[0217]水又は通常の生理食塩水中の５％ブドウ糖又は好適な賦形剤を含む同様の製剤での化合物の静脈内注入は、筋肉内ボーラス注射も同様に有用だが、最も有効である。典型的には、非経口用量は、ＢＡＧ３発現を増加させるために有効な濃度に血漿中の薬物の濃度を維持する様式で、約０．１～２０ｍｇ／ｋｇなどの約０．０１～約１００ｍｇ／ｋｇである。化合物は、約０．４～約４００ｍｇ／ｋｇ／日の合計日用量を達成するレベルで１日に１～４回投与され得る。治療的に有効な本発明の化合物の正確な量及びかかる化合物が最良に投与される経路は、薬剤の血中レベルを治療効果を有するために必要な濃度と比較することによって当業者によって容易に決定される。本発明の化合物のプロドラッグは、任意の好適な方法によって調製され得る。
[0218]許容できない毒性学的影響は、本発明の化合物、誘導体、塩、組成物などが本発明により投与される場合に予測されない。良好な生物学的利用率を有し得る本発明の化合物は、所与の薬理学的効果を有するために必要である化合物の濃度を決定するためにいくつかの生物学的アッセイの１つにおいて検査され得る。
[0219]別の実施形態では、１つ又は複数の同定された化合物及び薬学的に又は獣医学的に許容できる担体を含む医薬又は動物用組成物が提供される。他の活性材料も、処置される又は予防される疾患又は状態について適切である又は適していると見なされ得る場合、存在してもよい。
[0220]担体、又は１つより多くが存在する場合、各担体は、製剤の他の成分と適合性であり、レシピエントに有害でないとの意味で許容可能でなければならない。
[0221]本明細書の方法によって同定される化合物は、上に記載される種々の薬物送達システムにおける使用のために好適である。加えて、投与された化合物のｉｎ ｖｉｖｏ血清半減期を増強するために、化合物は、封入され得る、リポソームの腔に導入され得る、コロイドとして調製され得る又は他の従来の技術が使用される場合があり、化合物の血清半減期の延長をもたらす。種々の方法は、リポソームを調製するために利用可能であり、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｓｚｏｋａ、ｅｔ ａｌ．、米国特許第４，２３５，８７１号、第４，５０１，７２８号及び第４，８３７，０２８号に記載のとおり。さらに、薬物を標的化薬物送達システムにおいて、例えば組織特異的抗体を用いてコートしたリポソーム中で投与する場合がある。リポソームは、器官に標的化され、選択的に取り込まれる。
[0222]製剤は、直腸内、経鼻、局所（頬側及び舌下を含む）、膣若しくは非経口（皮下、筋肉内、静脈内及び皮内を含む）投与のために好適なものを含む、又は製剤は、経口で投与される製剤である。製剤は、単位投与形態、例えば錠剤及び徐放カプセルで好都合に提示され得る、並びに薬学の分野において十分周知の任意の方法によって調製され得る。
[0223]かかる方法は、上に定義される活性剤を担体と会合させるステップを含む。一般に、製剤は、活性剤を液体担体若しくは細かく分割された固形担体又は両方と均一によく合わせ、次に必要に応じて産生物を成形することによって調製される。
[0224]これらの方法を使用して同定される化合物は、薬学的に有用な組成物を調製するために周知の方法によって製剤化され得る、それにより化合物は、薬学的に許容できる担体ビヒクルとの混合で組み合わされる。治療用製剤は、所望の程度の純度を有する活性成分を任意選択の生理学的に許容できる担体、賦形剤又は安定化剤と混合することによって保存のために凍結乾燥製剤又は水溶液の形態に調製される（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０））。許容できる担体、賦形剤又は安定化剤は、使用される投薬量及び濃度でレシピエントに無毒性であり、緩衝剤、例えばリン酸塩、クエン酸塩及び他の有機酸など；抗酸化物質、アルコルビン酸を含む；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリンなど；親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドンなど、アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリシンなど；単糖類、二糖類、及びグルコース、マンノース又はデキストリンを含む他の炭水化物；キレート剤、例えばＥＤＴＡなど；糖アルコール、例えばマンニトール又はソルビトールなど；塩形成対イオン、例えばナトリウムなど；並びに／又は非イオン性サーファクタント、例えばツイーン（ＴＷＥＥＮ）（商標）（ＩＣＩ Ａｍｅｒｉｃａｓ Ｉｎｃ．、Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ、Ｎ．Ｊ．）、ピューロニクス（ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ）（商標）（ＢＡＳＦ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｏｕｎｔ Ｏｌｉｖｅ、Ｎ．Ｊ．）又はＰＥＧなどを含む。
[0225]ｉｎ ｖｉｖｏ投与のために使用される製剤は、滅菌、発熱物質不含有でなければならない。これは、凍結乾燥及び再構成の前に又は続いて、滅菌ろ過膜を通したろ過によって容易に達成される。
[0226]本発明の医薬組成物の投薬量及び所望の薬物濃度は、想定される具体的な使用に応じて変動する場合がある。適切な投薬量又は投与経路の決定は、当業者の技術の範囲内である。動物実験は、ヒトの治療のための有効量の決定のために信頼できるガイダンスを提供する。有効用量の種間調整は、Ｍｏｒｄｅｎｔｉ，Ｊ．ａｎｄ Ｃｈａｐｐｅｌｌ，Ｗ．“Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｉｎｔｅｒｓｐｅｃｉｅｓ ｓｃａｌｉｎｇ ｉｎ ｔｏｘｉｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ”Ｉｎ Ｔｏｘｉｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｎｅｗ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、Ｙａｃｏｂｉ ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｓ．，Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９８９，ｐｐ．４２～９６によって記された原理に従って実施され得る。
[0227]本発明における経口投与のための製剤は：予め規定された量の活性剤をそれぞれ含有するカプセル、カシェ剤（ｃａｃｈｅｔｓ）若しくは錠剤などの個別の単位；粉剤若しくは顆粒剤として；水性液体若しくは非水性液体中の活性剤の溶液若しくは懸濁剤として；又は水中油乳剤若しくは油中水乳剤として；又はボーラス剤などとして示され得る。
[0228]経口投与（例えば錠剤及びカプセル）のための組成物について、用語「許容できる担体」として、ビヒクル、例えば、一般的な賦形剤、例えば結合剤、例えばシロップ、アラビアゴム、ゼラチン、ソルビトール、トラガント、ポリビニルピロリドン（ポビドン）、メチルセルロース、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ショ糖及びデンプンなど；注入剤及び担体、例えばコーンデンプン、ゼラチン、乳糖、ショ糖、結晶セルロース、カオリン、マンニトール、リン酸二カルシウム、塩化ナトリウム及びアルギン酸；並びに滑沢剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸ナトリウム及び他の金属ステアリン酸塩、ステアリン酸グリセロール、ステアリン酸、シリコン油、タルクワックス、油及びコロイドシリカなど、が挙げられる。ペパーミント、冬緑油、サクランボ風味剤などの風味付け剤も使用され得る。容易に同定可能な投薬形態を作製するために着色剤を添加することが望ましい場合がある。錠剤は、当技術分野において十分周知の方法によってコートされてもよい。
[0229]錠剤は、任意選択で１つ又は複数の副成分を含んで圧縮又は成形によって作製され得る。圧縮錠剤は、粉末又は顆粒などの流動性の形態の活性剤を、任意選択で、結合剤、滑沢剤、不活性希釈剤、保存剤、表面活性又は分散剤と混合して好適な機械において圧縮することによって調製され得る。成形された錠剤は、不活性液体希釈剤を用いて湿らせた粉末化化合物の混合物を好適な機械で成形することによって作製され得る。錠剤は、任意選択でコート又は刻みを入れられてもよく、活性剤の徐放又は放出制御を提供するように製剤化されてもよい。
[0230]経口投与のために好適な他の製剤として、活性剤を風味付けした基材、通常ショ糖及びアラビアゴム又はトラガント中に含むロゼンジ（ｌｏｚｅｎｇｅｓ）；活性剤を不活性基材、ゼラチン及びグリセリン又はショ糖及びアラビアゴムなど中に含むトローチ（ｐａｓｔｉｌｌｅ）；並びに活性剤を好適な液体担体中に含む口腔洗浄薬が挙げられる。
[0231]非経口製剤は、一般に滅菌される。
[0232]用量：本開示の主題の組成物の有効用量は、それを必要とする対象に投与される。「治療有効量」又は「治療量」は、測定可能な応答（例えば、処置される対象における生物学的又は臨床的に関連する応答）を生じるために十分な治療用組成物の量である。応答は、上に考察したとおり多数の方法、例えばサイトカインプロファイル、細胞型、細胞表面分子などにおいて測定され得る。本開示の主題の組成物中の活性成分の実際の投薬レベルは、具体的な対象に対して望ましい治療応答を達成するために有効である活性化合物（複数可）の量を投与するために変動する場合がある。選択された投薬レベルは、治療用組成物の活性、投与の経路、他の薬物又は処置との組合せ、処置される状態の重症度並びに処置される対象の状態及び前病歴に依存する。しかし、望ましい治療効果を達成するために必要とされるよりも低いレベルで化合物の用量を開始し、望ましい効果が達成されるまで投薬量を徐々に増加させることは当業者の技術の範囲内である。組成物の効力は変動する場合があり、したがって「処置有効量」は、変動する場合がある。しかし、本明細書に記載されるアッセイ法を使用して、当業者は、本開示の主題の候補化合物の効力及び有効性を容易に評価でき、それにより治療レジメンを調整できる。
[0233]本発明は、そのある特定の実施形態を参照して詳細に記載されている。しかし、本開示の検討において当業者が、本発明の精神及び範囲内で変更及び改善を行い得ることは明らかである。
[0234]本明細書において述べられるすべての文書は、参照により本明細書に組み込まれる。本出願において引用されるすべての刊行物及び特許文献は、個々の刊行物及び特許文献それぞれが個々に示された場合と同程度に、すべての目的について参照により組み込まれる。本文書における種々の参考文献の引用によって出願者らは、いかなる具体的な参考文献も本発明の「先行技術」であるとして承認しない。
[0235]実施例１：ＢＡＧ３のバリアントは、心筋症を有するアフリカ系アメリカ人におけるさらに悪い転帰を予測する。
[0236]アフリカ系の対象におけるＢＡＧ３遺伝的バリアントとＤＣＭとの間の関連を調査するために、３つの臨床試験の内の１つに登録した対象から得たＤＮＡからＢＡＧ３を配列決定した。結果は、まれな例外を除いてアフリカ系の個体において見出される機能性ＢＡＧ３バリアントの群がＩＤＣを有する患者における転帰不良と関連し、治療的介入のための正確な標的を提供できることを初めて実証した。
[0237]方法
[0238]患者：ゲノムＤＮＡを、３つの米国臨床試験に登録したＤＣＭを有し、そのＤＮＡが預けられた５０９名のアフリカ系アメリカ人から得た：Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｒｉｓｋ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ Ａｆｒｉｃａｎ Ａｍｅｒｉｃａｎｓ ｗｉｔｈ Ｈｅａｒｔ Ｆａｉｌｕｒｅ（ＧＲＡＨＦ）治験からの患者３４２名、（コホートＡ）；２２～２５、Ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ ｉｎ Ｍｙｏｃａｒｄｉｔｉｓ ａｎｄ Ａｃｕｔｅ Ｃａｒｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｙ Ｔｒｉａｌ－２からの患者１０９名（ＩＭＡＣ－２；コホートＢ）；２６及びＧｅｎｅｔｉｃ Ｒｉｓｋ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ Ｃａｒｄｉａｃ Ｅｖｅｎｔｓ（ＧＲＡＣＥ）研究からの患者５８名（コホートＣ）２７、２８。ＤＮＡは、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃｏｌｏｒａｄｏ（コホートＤ）又はＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ（コホートＥ）で心臓移植を受けたアフリカ系の対象の左心室（ＬＶ）心筋からも得た。移植のために使用され得なかった非不全ヒト心臓組織を非不全対照として使用した２９。ＤＮＡ又は組織を前述の研究リポジトリに寄付したすべての患者からインフォームドコンセントを得て、手順は、参加施設それぞれのＩＲＢによって承認された。
[0239]３つの参照集団を使用した。第１に、コホートＡ～Ｃに入れられた、研究に登録した虚血性心筋症を有したアフリカ系の個体からＤＮＡを配列決定した。第２に、ＢＡＧ３配列データを、全米のＨＦ診療所から回収したヨーロッパ系の個体からＢｒｉｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｏｍｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ、Ｂｏｓｔｏｎで回収した家族性及び孤発性ＤＣＭの両方のヨーロッパ系の個体のコホートから、得た３０。第３に、集団遺伝的データを非血縁個体由来の１２３，１３６個のエクソーム配列及び１５，４９６個の全ゲノム配列からのデータを含むｇｎｏｍＡＤ（オンラインで利用可能）から得た。このうち、７，５０９個の全ゲノム及び５５，８６０個のエクソームは、非フィンランドヨーロッパ系の個体からであり、４，３６８個の全ゲノム及び７，６５２個のエクソーム配列は、アフリカ系の個体からである２１。
[0240]ＤＮＡ配列決定及び分析：ＧＲＡＨＦ治験由来のＤＮＡをＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ Ｃｏｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙ、ｔｈｅ ＭｃＫｕｓｉｃｋ－Ｎａｔｈａｎｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、ａｔ Ｔｈｅ Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅで配列決定した。簡潔には、各ＧＲＡＨＦコホート患者由来のゲノムＤＮＡをＰＣＲ増幅し、次いで、サイクル配列決定の蛍光ジデオキシターミネーター法を使用して配列決定した。配列データをＳｅｑｕｅｎｃｈｅｒ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、バージョン５．４．６（Ｇｅｎｅ Ｃｏｄｅｓ、Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ、ＭＩ）を使用して分析した。ＳＮＶをソフトウェア「Ｃａｌｌ Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ Ｐｅａｋｓ」機能を使用して同定し、すべてのデータを手作業で調査した。
[0241]標的化遺伝子型判定をＧＲＡＨＦコホートの結果を確認し、リアルタイムＰＣＲ及びＳＮＰ－特異的試薬を使用して続く各コホートにおいてＳＮＶを同定するために実施した。ＳＮＶを、それらが：１）ＧＲＡＨＦにおいて＞０．００５の対立遺伝子頻度を有した；２）非同義であった；及び３）ヨーロッパ系においてよりもアフリカ系の対象においてさらに一般的であった場合に、確証的遺伝子型判定及び機能性分析のために選択した。同じ試料中の２つのＢＡＧ３ ＳＮＶがシスに配置されていたかどうかを判定するために、ＢＡＧ３遺伝子座を増幅し、プラスミドにクローニングし、サンガー配列決定に供した。
[0242]ヒト心臓組織のウエスタンブロット分析：ウエスタンブロット分析を以前記載のとおり実施した３１。簡潔には、凍結組織を緩衝液中でホモジナイズし、遠心分離し、生じた沈殿を緩衝液に再懸濁した。ブラッドフォードの方法を使用してタンパク質濃度を測定した後、タンパク質をＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分画し、ニトロセルロース膜に移行させた。次いで膜を抗体とインキュベートし、画像化した。シグナル強度をＧＡＰＤＨに標準化した。ｑＰＣＲをそれぞれのＢＡＧ３バリアントに特異的なｍＲＮＡを定量するために使用した。
[0243]オートファジーフラックス及びアポトーシスの測定：方法は、以前詳細に記載されている１８、３２。簡潔には、野生型ＢＡＧ３をＣＭＶプロモーター下でプラスミドに挿入し、次いで目的のそれぞれのＳＮＶを生成させた。ｐ．１６０ＡｌａｄｕｐバリアントをＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ Ｔｏｗｎｓｈｉｐ、ＮＪ）によって合成した。形質転換ヒト心室細胞（ＡＣ１６）３３を３７οＣ、５％ＣＯ２で５％ＦＢＳを含むダルベッコ改変イーグル培地で６０～７０％コンフルエントまで培養した。次いで細胞をｃ．ｎｕｌｌ、ｃ．ＢＡＧ３、ｃ．１８７Ｃ＞Ｇ＋ｃ．１１３８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｐ６３Ａｌａ＋Ｐ３８０Ｓ）、ｃ．２４９Ｃ＞Ａ、（ｐ．Ｈ８３Ｑ）ｃ．４７４＿４７６ｄｕｐＧＧＣ、（ｐ．Ａ１６０ｄｕｐ）又はｃ．１４３６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａ４７９Ｖ）を含有するプラスミドを用いてトランスフェクトし、オートファジーレポーター構築物アデノウイルス赤色蛍光タンパク質緑色蛍光タンパク質－ＬＣ３（Ａｄｖ－ＲＦＰ－ＧＦＰ－ＬＣ３）を用いて同時トランスフェクトした。各トランスフェクションは、３６時間実行し、その後、細胞を４時間の低酸素（５％ＣＯ２／１％Ｎ２Ｏ２）に続いて、２時間の再酸素負荷又は正常酸素圧（５％ＣＯ２：２１％Ｏ２）に供した。細胞を共焦点顕微鏡を用いて画像化し、ＬＣ３点の数を本発明者らが以前記載のとおり計数した３４。各プラスミドの発現レベルをウエスタンブロットによって評価し、同等であった。
[0244]実験の第２の群では、細胞を同じ様式で３６時間トランスフェクトし、低酸素に１２時間及び次いで再酸素負荷に２時間曝露した。細胞をアネキシン－Ｖ及びヨウ化プロピジウムを用いて３０分間染色し、共焦点顕微鏡を用いて画像化した。アネキシン－Ｖ陽性細胞（アポトーシス）は緑色に見える一方で、ヨウ化プロピジウム陽性細胞（後期アポトーシス及び壊死）は赤色に見える。視野あたり細胞少なくとも２０個及び条件あたり１０視野を計数した。調査者は、実験群に盲検であった。
[0245]統計解析：統計解析をＢＡＧ３ ＳＮＶ（ＳＮＶ対ＳＮＶなし）、虚血（虚血性対非虚血性）及び同時相互作用による層別化／分割に基づいて実施した。連続変数は、スチューデントのｔ検定又はＡＮＯＶＡを必要に応じて使用して評価し、カテゴリー変数はカイ二乗又はフィッシャー直接検定を使用して評価した。イベントまでの時間の分析について、イベントは死亡、移植又はＨＦ関連入院加療と定義した。生存率は、カプラン・マイヤー法を使用して評価した；得られた曲線をログランク検定を使用して評価した。ハザード比は、コックス比例ハザードモデルを使用して概算した。すべての統計解析は、ＳＡＳ（登録商標）９．４（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）を使用して実施した。統計的有意性は、ｐ＜０．０５と定義した。すべての報告されたｐ値は、適用可能な場合は両側であり、他に断らない限り、多重比較のために調整されなかった。
[0246]結果
[0247]研究対象：ＤＣＭを有する合計５０９名のアフリカ系アメリカ人由来のゲノムＤＮＡは、３つの独立した研究から得た：ＧＲＡＨＦ（コホートＡ）からの患者３４２名；２３、２４ＧＲＡＣＥ（コホートＢ）からの患者１０９名；２７、２８及びＩＭＡＣ－２（コホートＣ）からの患者５８名２６。急性心筋炎、周産期心筋症又はＤＣＭについての任意の潜在的に改善可能な原因を有する場合、患者は分析から除外された２６。ＧＲＡＨＦ及びＩＭＡＣ－２の患者は、死亡又はＨＦ入院加療の心配のないエンドポイントまで経過観察した。ＧＲＡＣＥの対象は、心臓移植又は死亡のエンドポイントまで経過観察した。
[0248]ＢＡＧ３遺伝的バリアント：
[0249]ＧＲＡＨＦコホートのサンガー配列決定は、１８個のバリアント（表１）を明らかにし、その内８個は、同義であった。４個のＳＮＶは、この研究についての選定基準に合致した：ｐ．Ｐｒｏ６３Ａｌａ（１０：１２１４２９３６９Ｃ／Ｇ；ｒｓ１３３０３１９９９）；ｐ．Ｈｉｓ８３Ｇｌｎ（１０：１５１３３１９７２；ｒｓ１５１３３１９７２）；Ｐｒｏ３８０Ｓｅｒ（１０：１２１４３６２０４Ｃ／Ｔ；ｒｓ１４４６９２９５４）；及びＡｌａ４７９Ｖａｌ（１０：１２１４３６５０２Ｃ／Ｔ、ｒｓ３４６５６２３９）。１６０位でタンパク質にアラニンを付加する３ヌクレオチドインフレーム挿入（ｐ．Ａｌａ１６０ｄｕｐ；１０：１２１４２９６４７Ａ／ＡＧＣＧ）も同定した。サンガーの結果は、標的化配列決定によって確認した。ｐ．Ｐｒｏ６３Ａｌａバリアントを保有するすべての個体は、ｐ．Ｐｒｏ３８０Ｓｅｒバリアントも保有し、ｇｎｏｍＡＤ中のこれら２つのＳＮＶについての対応する対立遺伝子頻度は、ほとんど同一であり、２つのＳＮＶがシスで連結している証拠を提供している。このことは、サンガー配列決定によって確認した。４個の同定されたＢＡＧ３バリアントを有する及び有さないアフリカ系のＨＦ患者の特徴を表１に示す。連結されたＳＮＶは、ｐ．Ｐｒｏ６３Ａｌａ＋Ｐｒｏ３８０Ｓｅｒと称される。図１に見られるとおり、ＢＡＧ３バリアントに影響を与える残基（Ｈｉｓ８３、Ａｌａ１６０、Ｐｒｏ３８０及びＡｌａ４７９）は、哺乳動物にわたって高度に保存されている。
[0250]コホートＡ、Ｂ及びＣのＩＤＣを有する患者４０２名における４個のＢＡＧ３バリアントの有病率（対象４０２の４２名；１０．４５％）は、複数の対立遺伝子について調整した場合、虚血性ＨＦを有する患者における４個のバリアントの有病率（対象１０７名の９名；８．４１％）より大きかった；しかし、差異は統計的に有意でなかった（表２）。同様に、ＩＤＣ及び４個のＢＡＧ３バリアントの内の１個を有するコホートＡ、Ｂ及びＣの患者の割合は、各バリアントについての対応するｇｎｏｍＡＤデータセットの合計において、ＢＡＧ３バリアントを有する対象の割合（９．０６％）と統計的に異ならなかった。対照的に、ＢＡＧ３バリアントを保有する３個のコホートにおける対象の割合（１０．０２％）は、ｇｎｏｍＡＤヨーロッパ系データセットにおけるヨーロッパ系の６０，０００名を超える対象での４個のＢＡＧ３バリアントの有病率（０．０２０％；ｐ＜０．０００１）より有意に（ｐ＜０．０００１）高く、ヨーロッパ系でＢＡＧ３バリアントを有さないＩＤＣの個体３５９名の参照集団（ボストンコホート；０．０００％ＢＡＧ３バリアント；ｐ＜０．０００１）においてより有意に大きかった。
[0251]心不全転帰へのＢＡＧ３バリアントの影響：４個のＢＡＧ３バリアントのいずれか１つの存在が、心不全入院加療、心臓移植又は死亡の組合せ転帰変数によって反映されるさらに悪い転帰と関連したかどうかを判定することが次に求められた。図２Ａに見られるとおり、４個のＢＡＧ３バリアントの内の１個を保有しなかった虚血性及び非虚血性疾患の両方のＨＦ対象を比較した場合、ＢＡＧ３バリアントを有する対象は、有害イベントの発生が有意に（ｐ＝０．０１０）高かった。同様に、ＢＡＧ３バリアントを保有する、非虚血性ＨＦを有する個体は、ＢＡＧ３バリアントを有さない非虚血性患者と比較した場合にさらに悪い転帰を有した（図２Ｂ；ｐ＝０．０１８）。虚血性ＨＦ及びＢＡＧ３ ＳＮＶを有する対象において、さらに悪い転帰への傾向があった；しかし、差異は、統計的に有意でなかった（図２Ｃ、ｐ＝０．１７７）。コックス比例ハザード分析を使用して、本発明者らは、４個のＢＡＧ３バリアントの内の１つの保有者が有害イベントを有するリスクは、ＢＡＧ３バリアントを有さないＨＦを有する個体よりも１．９０６倍高かった（９５％ＣＬ：１．１５７－３．１４１、ｐ＝０．０１１）ことを決定した。
[0252]ＢＡＧ３バリアントの病原性：細胞におけるＢＡＧ３の主な２つの作用：オートファジー及びアポトーシス、へのＢＡＧ３バリアントの影響を評価した。図３Ａに見られるとおり、ＡＣ１６細胞を空プラスミド又は野生型ＢＡＧ３、ｃ．１８７Ｃ＞Ｇ＋ｃ．１１３８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｐｒｏ６３Ａｌａ＋ｐ．Ｐｒｏ３８０Ｓｅｒ）、ｃ．２４９Ｃ＞Ａ（ｐ．Ｈｉｓ８３Ｇｌｎ）、ｃ．４７４＿４７６ｄｕｐＧＧＣ（ｐ．Ａｌａ１６０ｄｕｐ）又はｃ．１４３６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｌａ４７９Ｖａｌ）を含有する血漿のいずれかを用いてトランスフェクトし、Ａｄｖ－ＲＦＰ－ＧＦＰ－ＬＣ３を用いて同時トランスフェクトした。細胞に低酸素－再酸素負荷を用いてストレスを与えた場合、空プラスミド又は野生型ＢＡＧ３のいずれかを用いてトランスフェクトした細胞においてＬＣ３が顕著に増加した；しかし、低酸素－再酸素負荷へのオートファジー応答は、４個のＢＡＧ３バリアントのそれぞれを過発現するＡＣ１６細胞において顕著に減少しており、ＬＣ３において顕著な増加はなかった（図３Ａ及び３Ｂ）。加えて、低酸素－再酸素負荷後に、ＢＡＧ３バリアントを用いてトランスフェクトした細胞は、野生型ＢＡＧ３を発現するプラスミドを用いてトランスフェクトした細胞よりも顕著に多いアネキシン－Ｖ陽性細胞を示した（図３Ｃ及び３Ｄ）。したがって、野生型ＢＡＧ３とは対照的に、ＢＡＧ３バリアントは、低酸素誘導アポトーシスを妨害することができなかった。
[0253]ヒト心臓不全におけるＢＡＧ３レベル：ＢＡＧ３レベルのウエスタンブロット分析及びｑＰＣＲを、アフリカ系の対象（コホートＤ及びＥ）からの不全ヒト心臓及び非不全対照心臓においてＢＡＧ３ ｍＲＮＡを定量するために実施した。図４Ａ～４Ｃに見られるとおり、ＢＡＧ３レベルは、非不全対照（ｎ＝４）と比較した場合に、ＩＤＣ（ｐ＝０．０００１、ｎ＝２３）又は虚血性ＨＦ（ｐ＜０．０００１、ｎ＝１６）を有する移植レシピエントから摘出した心臓において顕著に低減していた。ＩＤＣ心臓（ｎ＝１８）由来、及び虚血性ＤＣＭを有するＤＣＭ心臓（ｎ＝１３）由来のＢＡＧ３ ｍＲＮＡレベルは、対照（ｎ＝４）におけるＢＡＧ３ ｍＲＮＡレベルと異ならなかった。標的化配列分析は、心臓１個がｐ．Ｈｉｓ８３Ｇｌｎバリアントを保有し、２個がｐ．Ｐｒｏ６３Ａｌａ＋Ｐｒｏ３８０Ｓｅｒバリアントを保有し、１個がｐ．Ａｌａ１６０ｄｕｐ挿入を保有したことを見出した。ＢＡＧ３レベルは、２個のｐ．Ｐｒｏ６３Ａｌａ＋Ｐｒｏ３８０心臓において正常を超えており、ＢＡＧ３バリアントの発現がＢＡＧ３発現を支配する固有の制御機構を乗り越える証拠を提供している。対照的に、ＢＡＧ３レベルは、ｐ．Ｈｉｓ８３Ｇｌｎ心臓において変化しておらず、ｐ．Ａｌａ１６０ｄｕｐを保有している心臓において認められず、それらを遺伝子治療のための潜在的な標的にしている。
[0254]
Figure 0007614844000001
[0255]
Figure 0007614844000002
[0256]
Figure 0007614844000003
[0257]考察
[0258]ＢＡＧ３は、タンパク質品質管理、アポトーシス及び興奮／収縮連関を含む重要な細胞機能を制御する１７。ＢＡＧ３のレベルは、ヒト末期ＨＦにおいて、及びＬＶ機能障害の動物モデルにおいて低減している。ＢＡＧ３不全の機能的重要性は、興奮収縮連関を損なうｓｉＲＮＡによるＢＡＧ３のノックダウンによって実証され、ＢＡＧ３ハプロ不全を有するマウスは、顕著なＬＶ機能障害、オートファジーの減少及びアポトーシスの増加を１０週齢までに示す３２、３５。本研究では、ＤＣＭを有するヨーロッパ系の個体においては認識できるレベルで見られなかった（０．００％）、２つの一般的な（＞１％）非同義ＳＮＶ、一般的な二重ヘテロ接合体バリアント及び３ヌクレオチドインフレーム挿入をＤＣＭを有するアフリカの家系の対象において同定した。本研究の結果は、重要なＢＡＧ３機能の減少及びアフリカ系アメリカ人の排他性の両方が示されている以前の研究と異なる。
[0259]４個のＢＡＧ３バリアントは、ＣｌｉｎＶａｒ４０によって良性（ｐ．Ｐｒｏ６３Ａｌａ）、良性／推定良性（ｐ．Ａｌａ１６０ｄｕｐ；ｐ．Ｐｒｏ３８０Ｓｅｒ）又は「病原性の解釈の矛盾」があった（ｐ．Ｈｉｓ８３Ｇｌｎ及びｐ．Ａｌａ４７９Ｖａｌ）のいずれかとして注釈を付けられた。コンピューターでの病原性予測アルゴリズムの統計解析、ソフトウェアの増強及び計算予測は、注釈のためには信頼できない４１。したがって、病原性は：１）それらが、ＢＡＧ３の高度に保存された領域に見出される；２）それらの機能がｉｎ ｖｉｔｒｏで喪失している；３）それらがバリアントの機能的意義と合致するドメインに局在化している；及び４）集合体中の４個のＳＮＶがＤＣＭを有する患者における転帰を顕著に変更する、との発見に基づいた。それにもかかわらず、これらのＳＮＶの病原性を支持する証拠は、家族性再発率及び分離比分析によって強化される４２、４３。
[0260]本研究において同定されたバリアントは、家族性ＤＣＭを有する発端者のコホートにおいて以前認識されなかった。例えば、家族性ＩＤＣを有する独立の初発症例においてＢＡＧ３バリアントを同定した４つの研究において、１６名未満の対象がアフリカ系として同定された２０、４４～４６。大きなエキソームワイドアレイベース関連研究（ｌａｒｇｅ ｅｘｏｍｅ－ｗｉｄｅ ａｒｒａｙ－ｂａｓｅｄ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｓｔｕｄｙ）において、調査者らは、ＤＣＭのリスクを低減するＢＡＧ３遺伝子座（ｃ．４５１Ｔ＞Ｃ、ｐ．Ｃｙｓ１５１Ａｒｇ）を同定した；しかし、バリアントは、ヨーロッパ系（０．２１６３対立遺伝子頻度）及びアフリカ系（０．０３対立遺伝子頻度）の両方において一般的であり、それにより本分析の組み入れの基準に合致しなかった３０。
[0261]ヨーロッパ系の個体における以前の研究は、本研究の結果を支持している。ＢＡＧ３バリアントは、民族的又は地理的に隔離された発端者のコホートにおいて最も一般的であった：ケベックのガスペ領域の隔離集団から集められた初発症例において１５％；２０ポーランドの単一施設研究において６．７％１９、ヨーロッパ集団において３．５％４４及び大規模な米国での研究において２．２５％（７／３１１）４５。
[0262]本明細書の結果は、ＩＤＣを有する患者の転帰及び虚血性ＤＣＭを有する者の転帰にもおそらく悪影響を与える、ほとんどアフリカの家系の個体においてのみ見出されるＢＡＧ３の固有のバリアントの証拠を提供する。アフリカ系アメリカ人に選択的であるＢＡＧ３中の遺伝的多様性の研究は、多様な患者集団にわたって見られる表現型の差異を生じるいくつかの要因の１つとして生物学的差異を考慮する重要性を示している。
[0263]参考文献
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[0264]等価物
当業者は、単に日常的実験を使用して、本明細書に記載される本発明の具体的な実施形態への多数の等価物を認識及び確認できる。かかる等価物は、以下の特許請求の範囲によって包含されることが意図される。
〔関連出願〕
[0001]本出願は、２０１８年６月８日出願の米国特許仮出願第６２／６８２，４０４号に対する優先権を主張する。前述の出願の内容全体は、すべての文章、表、配列表及び図を含んで参照により本明細書に組み込まれる。
〔政府支援〕
[0002]本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈによって承認された助成金番号ＲＯ１ ＨＬ１２３０９３及びＨＬ０９１７９９－０１の政府の支援の下で実施された。政府は、本発明に一定の権利を有する。

Claims (11)

  1. （ａ）心血管疾患を有する又は心血管疾患を発症する素因を有する患者を診断するための、又は
    （ｂ）心血管疾患の処置のために使用される薬剤の効率をモニターするための、
    キットであって、
    対象由来の生物学的試料中のＢＡＧ３バリアントを同定するための検出可能な標識にコンジュゲートされた１つ又は複数のプローブを含み、
    前記バリアントが、ｐ．Ａｌａ１６０ｄｕｐ（１０：１２１４２９６４７Ａ／ＡＧＣＧ；ｒｓ１３９４３８７２７）；ｐ．Ｐｒｏ６３Ａｌａ（１０：１２１４２９３６９Ｃ／Ｇ；ｒｓ１３３０３１９９９）；ｐ．Ｈｉｓ８３Ｇｌｎ（１０：１５１３３１９７２；ｒｓ１５１３３１９７２）；又はＡｌａ４７９Ｖａｌ（１０：１２１４３６５０２Ｃ／Ｔ、ｒｓ３４６５６２３９）の１つ又は複数を含む、
    キット。
  2. 心疾患のリスクがある又は心疾患に罹患している対象を処置するための医薬組成物であって、ＢＡＧ３タンパク質又はＢＡＧ３タンパク質の発現のための発現ベクターを含む治療有効量の薬剤を含み、
    前記対象は、対照ＢＡＧ３核酸配列と比較して少なくとも１つのＢＡＧ３遺伝的バリアントを有し、前記ＢＡＧ３遺伝的バリアントが、ｐ．Ａｌａ１６０ｄｕｐ（１０：１２１４２９６４７Ａ／ＡＧＣＧ；ｒｓ１３９４３８７２７）；ｐ．Ｐｒｏ６３Ａｌａ（１０：１２１４２９３６９Ｃ／Ｇ；ｒｓ１３３０３１９９９）；ｐ．Ｈｉｓ８３Ｇｌｎ（１０：１５１３３１９７２；ｒｓ１５１３３１９７２）；Ａｌａ４７９Ｖａｌ（１０：１２１４３６５０２Ｃ／Ｔ、ｒｓ３４６５６２３９）又はこれらの組み合わせを含む、
    医薬組成物。
  3. 前記ＢＡＧ３遺伝的バリアントが、ｐ．Ａｌａ１６０ｄｕｐ（１０：１２１４２９６４７Ａ／ＡＧＣＧ；ｒｓ１３９４３８７２７）を含む、請求項２に記載の医薬組成物。
  4. 前記ＢＡＧ３遺伝的バリアントが、ｐ．Ｐｒｏ６３Ａｌａ（１０：１２１４２９３６９Ｃ／Ｇ；ｒｓ１３３０３１９９９）；ｐ．Ｈｉｓ８３Ｇｌｎ（１０：１５１３３１９７２；ｒｓ１５１３３１９７２）；Ａｌａ４７９Ｖａｌ（１０：１２１４３６５０２Ｃ／Ｔ、ｒｓ３４６５６２３９）又はこれらの組み合わせを含む、請求項２に記載の医薬組成物。
  5. 前記ＢＡＧ３遺伝的バリアントが、ｐ．Ｐｒｏ６３Ａｌａ（１０：１２１４２９３６９Ｃ／Ｇ；ｒｓ１３３０３１９９９）及びＰｒｏ３８０Ｓｅｒ（１０：１２１４３６２０４Ｃ／Ｔ；ｒｓ１４４６９２９５４）の組み合わせを含む、請求項２に記載の医薬組成物。
  6. 前記発現ベクターが、ウイルスベクター、心臓作用性ベクター、プラスミド、又は酵母ベクターを含む、請求項２に記載の医薬組成物。
  7. 心臓作用性ベクターがアデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）、コクサッキーウイルスベクター、サイトメガロウイルスベクター、エプスタイン・バーウイルスベクター、パルボウイルスベクター又は肝炎ウイルスベクターを含む、請求項６に記載の医薬組成物。
  8. 前記発現ベクターが、心臓作用性偽型ウイルスベクターである、請求項６に記載の医薬組成物。
  9. 前記心疾患が心不全である、請求項２に記載の医薬組成物。
  10. 心疾患を有する対象の診断又は処置のために、対象のＢＡＧ３遺伝的バリアントを同定する方法であって、
    対象試料中の対照ＢＡＧ３核酸配列と比較して少なくとも１つのＢＡＧ３遺伝的バリアントを同定するステップであって、前記遺伝的バリアントが、ｐ．Ａｌａ１６０ｄｕｐ（１０：１２１４２９６４７Ａ／ＡＧＣＧ；ｒｓ１３９４３８７２７）；ｐ．Ｐｒｏ６３Ａｌａ（１０：１２１４２９３６９Ｃ／Ｇ；ｒｓ１３３０３１９９９）；ｐ．Ｈｉｓ８３Ｇｌｎ（１０：１５１３３１９７２；ｒｓ１５１３３１９７２）；Ａｌａ４７９Ｖａｌ（１０：１２１４３６５０２Ｃ／Ｔ、ｒｓ３４６５６２３９）又はこれらの組み合わせを含む、ステップ
    を含む、方法。
  11. 前記バリアントの検出が、対象が処置から利益を得るかどうかを予測する、請求項１０に記載の方法。
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