JP7569847B2 - 検出装置及び検出方法 - Google Patents

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Description

本発明は、液体試料中の被検出物質を検出する検出装置及び検出方法に関する。
近年、抗原抗体反応などを用いることで、感染症への罹患や妊娠を検査したり、血糖値などを測定したりする、Ｐｏｉｎｔ ｏｆ Ｃａｒｅ Ｔｅｓｔ（ＰＯＣＴ）試薬が注目を集めている。ＰＯＣＴ試薬を用いた検査・測定では、短時間での結果の判別が可能である。また、ＰＯＣＴ試薬の使用方法は簡便であり、ＰＯＣＴ試薬は安価である。ＰＯＣＴ試薬は、これらの特徴を有するため、症状が軽度である段階での診察や定期診察などに多く使用されている。また今後増加することが予想される在宅医療においてもＰＯＣＴ試薬は重要な診察ツールとなる。
ＰＯＣＴ試薬の一種である検査キットを用いた検査または診断では、血液などの液体試料を検査キットに導入し、液体試料に含まれる特定の被検出物質を検出する。液体試料から特定の被検出物質を検出する方法として、イムノクロマトグラフィー法がよく用いられている。イムノクロマトグラフィー法では、検査キットが備える膜担体上に液体試料を滴下して、液体試料が膜担体上を移動する過程で、液体試料中の被検出物質が標識物質と結合する。さらに被検出物質が、検査キット中に固定された物質（以下、検出物質という）と特異的・選択的に結合する。その結果検査キットに生じた色や重量の変化などを検出する。検出物質は、試薬（ｒｅａｇａｎｔ）と言い換えてもよい。
液体試料を移動させるための膜担体としては、ニトロセルロース膜がよく用いられている（下記特許文献１参照。）。ニトロセルロース膜は、直径が数μｍ程度の微細な孔を多数有しており、その孔の中を液体試料が毛細管力によって移動する。
しかしニトロセルロース膜は天然物由来であり、膜における孔径や孔同士のつながり方が一様ではないため、膜における液体試料の流速が膜によって異なる。流速に差異が生じると、被検出物質の検出にかかる時間も変化してしまう。その結果、被検出物質が標識物質または試薬と結合する前に、被検出物質が検出されない、という誤った判断がなされてしまう可能性がある。
上記の課題を解決するため、液体試料の微細流路を人工的に作製する手法が考案されている（下記特許文献２、３参照。）。この手法を用いることで、均一な構造を有する膜担体を作製することができる。その結果、被検出物質が標識物質または試薬と結合する前に、被検出物質が検出されない、という誤った判断がなされる可能性を低減することができる。
特開２０１４－０６２８２０号公報 特許第４５９７６６４号 特表２０１２－５２４８９４号公報
ところで、イムノクロマトグラフィー法では、検査キットが備える膜担体上に液体試料を滴下して、液体試料が膜担体上を移動する過程で、液体試料中の被検出物質が標識物質と結合する。さらに被検出物質が、検査キット中に固定された検出物質と特異的・選択的に結合する。その結果検査キットに生じた色や重量の変化などを検出する。被検出物質を検出する手法として、着色ラテックス粒子、蛍光粒子、または金属コロイド粒子などの標識物質と結合した被検出物質が、検知ゾーンに固定された試薬と結合することによって生じる検知ゾーンの色変化を、吸光度測定器などの光学測定機器によって検知する方法（色変化検出手法）がよく知られている。また、バイオマーカーの濃度を電気化学的活性な物質濃度に変換して検出する手法（電気化学イムノクロマトグラフィー法）もある。
電気化学イムノクロマトグラフィー法では、反応液や洗浄液、二次反応液などの複数種類の溶液を展開する必要があり、これは使用時の手間が増大し、検出時間が長くなってしまうという課題があり、電気化学イムノクロマトグラフィー法を用いた検査キットの普及への障害となっていた。すなわち、電気化学イムノクロマトグラフィー法を用いた検査キットにおいて、短時間での結果の判別が可能であり、使用方法が簡便であり、安価である、というＰＯＣＴ試薬（検査キット）が求められていた。なお、色変化検出手法を用いた場合でも、複数種類の溶液を展開する必要がある手法では、同様の課題があった。
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、イムノクロマトグラフィー法を用いた検査キットにおいて、反応液や洗浄液、二次反応液などの複数種類の溶液を展開する場合に、使用時の手間を省き、検出時間を短縮させることが可能な技術を提供することを目的とする。
本発明の検査装置（「検査キット」ともいう）は、樹脂で形成された基板上に設けられ、液体試料を一端側から他端側へ輸送する流路と、
前記流路の他端側に設けられた、抗体を固相した固相部と、
電極部が設けられ前記液体試料の前記抗体に対する反応を検出する検出部と、
前記流路に一体に形成された複数の凸部を有する微細凹凸構造と、
を有し、
前記微細凹凸構造は、
前記複数の凸部が相対的に粗に設けられた第１の凹凸部と、
前記複数の凸部が相対的に密に設けられた第２の凹凸部と、
を有し、
前記第１の凹凸部と前記第２の凹凸部は、前記固相部よりも前記流路の一端側に設けられている。
本発明の検査装置は、液体試料中の被検出物質を検出する検出装置であって、
前記液体試料を一端側から他端側へ輸送する流路と、
前記流路の他端側に設けられた、抗体を固相した固相部と、
前記液体試料の前記抗体に対する反応を検出する検出部と、
前記流路に一体に形成された複数の凸部を有する微細凹凸構造と、
を有し、
前記微細凹凸構造は、
前記複数の凸部が相対的に粗に設けられた第１の凹凸部と、
前記複数の凸部が相対的に密に設けられた第２の凹凸部と、
を有し、
前記第１の凹凸部と前記第２の凹凸部は、前記固相部よりも前記流路の一端側に設けられている。
本発明の検出方法は、上記の検出装置を用いて液体試料の抗体に対する反応を検出する。
本発明によれば、イムノクロマトグラフィー法を用いた検査キットにおいて、反応液や洗浄液、二次反応液などの複数種類の溶液を展開する場合に、使用時の手間を省き、検出時間を短縮させることが可能な技術を提供することができる。
第１の実施形態の検査キットの上面図である。 第１の実施形態の膜担体の上面図である。 第１の実施形態の微細構造及び凸部を示す図である。 第１の実施形態の凸部の斜視図である。 第１の実施形態の微細構造の各領域の境界を拡大して示す図である。 第１の実施形態の検査キットを用いた検査手法の例を示すチャート図である。 第２の実施形態の膜担体の上面図である。 第２の実施形態の微細構造の各領域の境界を拡大して示す図である。 第２の実施形態の微細構造における溶液の逆流防止構造の例を示した図である。 実施例１の試験片の写真を示す図である。 実施例１の試験開始から３０、１４０、３１０秒後画像の試験片を示す図である。 実施例１の経過時間と測定ポイントのＲＧＢ成分割合のプロットをしたグラフを示す図である。 実施例１の図１２のデータを解析した結果から各溶液の混合割合を計算した結果を示すグラフを示す図である。 比較例２のインプリントシートの代わりにニトロセルロースを用いた条件での各溶液の混合割合を計算した結果を示すグラフを示す図である。 実施例２の試験片の構成を示す図である。 実施例２の試験結果のグラフを示す図である。 実施例２のＡＢ部－ＢＧ部蛍光強度のグラフを示す図である。 実施例２の蛍光写真の例である。 第１の実施形態の二電極方式の電極部の配置例を示す図である。 第１の実施形態の三電極方式の電極部の配置例を示す図である。 実施例３の試験片の構成を示す図である。 実施例３の試験結果のグラフを示す図である。 実施例４の溶液滴下タイミングを示したチャート図である。 実施例４の試験結果のグラフを示す図である。
＜＜第１の実施形態＞＞
以下では、本発明の実施形態について説明する。
＜検査キットの概要＞
図１は、本実施形態に係る検査キット１８の平面図である。図２は、膜担体３を模式的に示した平面図を示す。図３は、膜担体３の微細構造（「微細凹凸構造」ともいう）及びそれを構成する凸部８を示す。図４は凸部８の斜視図（ＳＥＭ像）を示す。
検査キット１８は、液体試料中の被検出物質を検出する機能を有する。
詳細は後述するが、検査キット１８は、ＰＯＣＴ試薬の一種である。血液などの液体試料を検査キット１８に導入し、液体試料に含まれる特定の被検出物質を検出する。液体試料から特定の被検出物質を検出する方法として、イムノクロマトグラフィー法が適用される。
本実施形態では、バイオマーカーの濃度を電気化学的活性な物質濃度に変換して検出する電気化学イムノクロマトグラフィー法を用いた構成の検査キット１８について説明する。
上述のように、電気化学イムノクロマトグラフィー法では、反応液や洗浄液、二次反応液などの複数種類の溶液（液体試料）を展開する必要があり、一般には、使用時の手間が増大し、検出時間が長くなってしまう。本実施形態では、膜担体３の流路２を複数のエリア（ここでは、第１～第３微細構造領域３１～３３の３エリア）に分割し、エリア毎に溶液の流速が異なるように制御した。流速を異なるようにするための構造として、膜担体３に形成される微細構造、すなわち溶液を輸送する速度を決める毛細管作用を起こす構造をエリア毎に設定した。
以下詳細に説明する。
＜検査キット１８の詳細＞
図１に示すように、検査キット１８は、膜担体３と、膜担体３を収容する筐体１８ａと、を備える。本図では、図示で左側の上流から右側の下流へ向く方向を溶液の進行方向ｄ（「流路方向」ともいう）として説明する。
膜担体３の表面には、図示で左側から順に、洗浄液が滴下される洗浄液ゾーン３ｘと、液体試料が滴下される液滴ゾーン３ｚと、液体試料中の被検出物質を検出するための検知ゾーン３ｙとを有する。なお、ここでは図示しないが、膜担体３より下流側（図示では右側）に、余分な溶液を吸収する吸収パッドが設けられる。
洗浄液ゾーン３ｘは、筐体１８ａの第一開口部１８ｂにおいて露出している。液滴ゾーン３ｚは、筐体１８ａの第三開口部１８ｄにおいて露出している。検知ゾーン３ｙは、筐体１８ａの第二開口部１８ｃにおいて露出している。なお、洗浄液を液滴ゾーン３ｚで滴下してもよく、その場合は、第一開口部１８ｂを省いてもよい。溶液が複数種類である場合、それら溶液に応じて導入口（開口）が設けられる。すなわち、どのような溶液を、どのようなタイミングで、どのような速度で移動させるかに応じて、導入口が設けられる。ある導入口において、複数の溶液が滴下されてもよいし、そのタイミングは同じでも異なってもよい。
検知ゾーン３ｙに、電気化学的検出手法による検出のために、電極部２０が設けられる。電極部２０は、例えば進行方向ｄの上流側の作用極２５と下流側の対極２６からなる二電極（二電極方式）である。なお、電極部２０は後述するように、参照極２７を有する三電極方式であってもよい。電極部２０には、計測装置２１が接続される。計測装置２１は、一般的な計測装置でもよいし、スマートホン等のモバイル端末に所定のアプリケーションが導入された装置として構成されてもよい。
＜膜担体３の詳細＞
図２に示すように、膜担体３には、液体試料を輸送する少なくとも一つの流路２が設けられている。図３に示すように、流路２の底面には、微細構造７が設けられている。本実施形態では、膜担体３の表面全体にわたり、微細構造７が設けられており、膜担体３の表面全体が、液体試料の流路２として機能する。
図３（ａ）は微細構造７の上面図であり、図３（ｂ）は微細構造を構成する凸部８の斜視図である。微細構造７は、凸部８の総体である。つまり、膜担体３は、液体試料の流路２の底面に相当する平坦部９と、平坦部９から突出する複数の凸部８と、を備える。
毛細管作用により、複数の凸部８の間の空間が、液体試料を膜担体３の表面に沿って輸送する流路２として機能する。換言すれば、毛細管作用により、微細構造７における空隙が、液体試料を膜担体３の表面に沿って輸送する流路２として機能する。複数の凸部８は、格子状配置（例えば菱形格子状配置や正格子状配置）のように規則的に、または並進対称的に、膜担体３の表面上に規則的に整列して並んで形成される。
凸部８は、例えば、錐体を呈し、ここでは、図３（ｂ）や図４に示すように、凸部８は円錐形状である。そのほかに、角錐であってもよいし、錐体の上部が切り取られた形状（截頭錐体）であってもよい。いずれにしても、凸部８によって構成される微細構造７が毛細管作用を発生させ、液体試料を輸送できればよい。
微細構造７は、毛細管作用を生じさせる。微細構造７の毛細管作用により、液体試料は、微細構造７を介して、図示左側の洗浄液ゾーン３ｘまたは液滴ゾーン３ｚから検知ゾーン３ｙへ向かって（図２の進行方向ｄに沿って）、輸送される。
本実施形態では、図２に示すように、膜担体３は、左側から第１微細構造領域３１（第１の凹凸部）と、第２微細構造領域３２（第２の凹凸部）と、第３微細構造領域３３（第３の凹凸部）との３つのエリアに分かれている。第１微細構造領域３１と、第２微細構造領域３２と、第３微細構造領域３３では、微細構造７が異なっており、その結果、エリア毎に溶液を輸送する速度が異なる。
溶液を輸送する速度は、平行平板間での流れを説明するPoiseuilleの式から理解される。例えば、毛細管現象を生じさせる微細構造７、例えば複数の凸部８が配置された構造における、凸部８間の距離５が狭いほど、溶液の輸送速度が大きくなる。すなわち、微細構造（図３に示す凸部８の配置）の粗密を適当に設定することで、エリア毎の速度を制御できる。
図５に微細構造７を上面からみた図を示す。図５（ａ）は第１微細構造領域３１と第２微細構造領域３２の境界（第１境界４１）の領域を示す。図５（ｂ）は第２微細構造領域３２と第３微細構造領域３３との境界（第２境界４２）の領域を示す。全ての領域で、凸部８は同じ形状・大きさとして設けられている。図５では、凸部８は円錐であり、底面の径が３０μｍ、高さが３０μｍである。図示のように、凸部８の配置（粗密の程度）は、図左側の第１微細構造領域３１が最も粗に、右側の第３微細構造領域３３が最も密になっている。すなわち、第１微細構造領域３１の凸部８間の距離５が最も広く、第３微細構造領域３３の凸部８間の距離５が最も狭い。図示の例では、第１微細構造領域３１の凸部８間の距離５は２５μｍであり、第２微細構造領域３２の凸部８間の距離５は１５μｍであり、第３微細構造領域３３の凸部８間の距離は２μｍである。
液体試料中の被検出物質が検知ゾーン３ｙに達すると、検知ゾーン３ｙに設けられた電極部２０（作用極２５、対極２６）により計測装置２１で電流値として検知される。すなわち、電極部２０の作用極２５と対極２６との間に電位差を与えておき、計測装置２１で酸化電流を測定する。なお、色変化検出手法を用いる場合には、検知ゾーン３ｙの色の変化により、被検出物質を検出する。
＜膜担体３の材料＞
微細構造７（複数の凸部８）を含む膜担体３は、例えば熱可塑性プラスチックからなる。すなわち、熱可塑性プラスチックからなる膜状の基材を熱インプリントによって加工することにより、微細構造７を有する膜担体３を作製することができる。膜担体３を構成する熱可塑性プラスチックは、例えば、ポリエステル系樹脂、ポリオレフィン系樹脂、ポリスチレン系樹脂、ポリカーボネート系樹脂、フッ素系樹脂、及びアクリル系樹脂からなる群より選ばれる少なくとも一種であってよい。具体的な熱可塑性プラスチックは、例えば、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、シクロオレフィンポリマー（ＣＯＰ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、及びポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）からなる少なくとも一種であってよい。
上記の熱可塑性プラスチックのガラス転移点Ｔｇまたは融点Ｔｍは、８０～１８０℃であってよい。ガラス転移点Ｔｇより２０℃高い温度での熱可塑性プラスチックの貯蔵弾性率は、１．０Ｐａ以上１．０×１０７Ｐａ以下であってよい。融点Ｔｍより２０℃高い温度での熱可塑性プラスチックの貯蔵弾性率は、１．０Ｐａ以上１．０×１０７Ｐａ以下であってよい。
熱可塑性プラスチックのガラス転移または融解が８０℃未満の温度で起こり、さらにガラス転移点または融点よりも２０℃高い温度での熱可塑性プラスチックの貯蔵弾性率が１．０×１０７Ｐａ以下である場合、熱可塑性プラスチックを、室温で固体として使用するのは実用上困難であり、熱インプリントによって膜担体を作製し難くなる。
熱可塑性プラスチックのガラス転移または融解が１８０℃より高い温度で起こる場合、熱インプリント時の成型温度が高くなり、膜担体の生産性が低下する。つまり、熱インプリント時に熱可塑性プラスチックを柔らかくするために要する温度が１８０℃より高い場合、膜担体の生産性が低下する。
ガラス転移点または融点よりも２０℃高い温度での熱可塑性プラスチックの貯蔵弾性率が１．０×１０７Ｐａ以下である場合、微細構造を作製する際に必要な成型圧力を小さく抑えることができ、比較的温和な条件で作製できるため生産効率が向上する。
錐体（ここでは円錐）の凸部８は、モールドを用いた熱インプリントによって形成することができる。モールドを用いて錐体を形成する場合、モールドを用いて溝状の流路（ラインａｎｄスペース構造）を形成する場合に比べて、モールドの作製時に金属部材の表面から削り出す金属の体積が大幅に低減され、モールドの加工費が低減する。対照的に、ラインａｎｄスペース構造を形成するためのモールドの作製では、多量の金属を金属部材から削り取らなくてはならない。
また錐体の上部は、錐体の底面に比べて細い。したがって、モールドを用いて錐体を形成する場合、錐体と同じ底面を有する柱体をモールドで形成する場合に比べて、モールドの作製時に金属部材の表面から削り出す金属の体積が大幅に低減され、モールドの加工費が低減する。
さらに錐体が規則的に整列した微細構造の空隙率は、ラインａｎｄスペース構造の空隙率よりも大きい。また、錐体が規則的に整列した微細構造の空隙率は、錐体と同じ底面を有する複数の柱体が規則的に整列した構造よりも空隙率が大きい。そのため、錐体が規則的に整列した微細構造によれば、液体試料の流量を増加させることが可能であり、被検出物質の検出に有利となる。
＜膜担体３の形状・寸法＞
上述のように錐体（凸部８）の底面１０の形状は自由に選択することができ、図３（ｂ）や図４に示すように円錐であってもよいし、角錐（四角錐や六角錐等）であってもよい。モールドの加工の容易さ、及び加工費用の抑制のためには、錐体（凸部８）の底面１０は、円形、または多角形（例えば、正方形、ひし形、長方形、三角形、若しくは六角形など）であることが望ましい。
凸部８の底面１０の径４は、例えば１０～１０００μｍである。凸部８の底面１０の径４が１０μｍよりも小さい場合、モールドの微細加工費が高くなり、また面積の大きい膜担体３の表面に無数の微細構造７を均一に作製し難い。したがって、小さ過ぎる微細構造７は、実用に向かない。また微細構造７の底面１０の径４が１０μｍよりも小さい場合、液体試料を移動させるのに必要な毛細管力が弱まる傾向がある。微細構造７の底面１０の径４が１０００μｍよりも大きい場合、モールドの作製時に金属部材から削りだす金属の体積が大きくなり、モールド及び膜担体３の作製費用が高くなってしまう。また微細構造７の底面１０の径４が１０００μｍよりも大きい場合、膜担体３における流路２の面積も大きくしなければならず、検査キット１８が巨大化して、検査キット１８自体の輸送に不利となる。凸部８（微細構造７）が円錐である場合、凸部８の底面１０の径４は、円錐の底面１０（円）の直径４であってよい。
凸部８の高さ６は、例えば１０～５００μｍである。凸部８の高さ６が１０μｍよりも低い場合、液体試料を移動させるのに必要な毛細管力が弱まる傾向がある。凸部８の高さ６が５００μｍよりも高い場合、熱インプリントの際に熱可塑性プラスチックを金型の凹部（微細構造７の凸部８の形状に対応する窪み）へ完全に充填し難い。
膜担体３の全体の形状は、特に限定されないが、例えば、四角形等の多角形、円形、または楕円形であってよい。膜担体３が四角形である場合、膜担体３の縦幅Ｌ１は、例えば、２～１００ｍｍであってよく、膜担体３の横幅Ｌ２は、例えば、３～１００ｍｍであってよい。また、第１～第３微細構造領域３１～３３の横幅Ｌ２１～Ｌ２３は、それぞれ例えば１～５０ｍｍであってもよい。微細構造７（すなわち凸部８）の高さ６を除く膜担体３の厚みは、例えば、０．１～１０ｍｍであってよい。
凸部８のアスペクト比Ｌｖ／Ｌｈは、１／１０以上２／１以下であってよい。アスペクト比Ｌｖ／Ｌｈが１／１０よりも小さい場合、液体試料と流路２との接触面積が小さく、毛細管力が減少するため、液体試料を移動させ難い傾向がある。アスペクト比Ｌｖ／Ｌｈが２／１よりも大きい場合、熱インプリントによる膜担体３の生産性が低下してしまう。本実施形態のように、凸部８が錐体（より具体的には円錐）である場合、凸部８の水平方向における長さＬｈは、凸部８の底面１０の直径４であってよい。また、凸部８の垂直方向における長さＬｖは、膜担体３の平坦部９からの凸部８の高さ６であってよい。
凸部８の底面の径４（Ｄ１）と、凸部８同士の最近接中心間距離（Ｄ２）との比Ｄ２／Ｄ１は、１より大きく５以下であってよい。比Ｄ２／Ｄ１は１以下でありえない。比Ｄ２／Ｄ１が５より大きい場合、液体試料と流路２との接触面積が減少し、毛細管力が減少し、液体試料を移動させ難い傾向がある。本実施形態のように凸部８が円錐である場合、凸部８の底面１０の径４（Ｄ１）は、円錐の底面の直径であってよく、最近接中心間距離Ｄ２は、隣り合う一対の凸部８（円錐）の頂点間の距離であってよい。凸部８の底面１０の径４（Ｄ１）は、上述した凸部８の水平方向における長さＬｈと一致してもよい。したがって、アスペクト比Ｌｖ／Ｌｈは、Ｌｖ／Ｄ１と表されてもよい。
また、微細凹凸構造の凸部８間のピッチ（頂点間の距離）は、隣接するゾーン間で比較した場合、相対的に粗に構成された微細凹凸構造のゾーンのピッチＰ１と、相対的に密に構成された微細凹凸構造のゾーンのピッチＰ２との比（Ｐ１／Ｐ２）は１．１以上５以下である。ここでは、第１微細構造領域３１の凸部８間のピッチをＰ１１と、第２微細構造領域３２の凸部８間のピッチをＰ２１と、第３微細構造領域３３の凸部８間のピッチをＰ２３とした場合、比（Ｐ１１／Ｐ２１）は１．１以上５以下であり、また、比（Ｐ２１／Ｐ２３）は１．１以上５以下である。比（Ｐ１／Ｐ２）は、溶液をどのような速度で移動させたいかに応じて設定される。なお、比（Ｐ１／Ｐ２）の下限については、小さい場合、ゾーン間の速度差が無くなってしまい、微細凹凸構造の粗密の程度に差を設ける意義が低下してしまう。このような観点から、比（Ｐ１／Ｐ２）は、好ましくは１．２以上であり、より好ましくは１．３以上である。上限については、大きくなりすぎると、ゾーン間の溶液の移動速度の差が大きくなりすぎて、検査キット１８全体での速度の調整が難しくなる。このような観点から、好ましくは４以下であり、より好ましくは３以下である。
＜電極部の配置＞
図１９及び図２０を参照して、電極部２０の配置例を説明する。
図１９（ａ）～図１９（ｃ）は電極部２０が二電極方式である場合の作用極２５と対極２６の配置例を示している。作用極２５と対極２６とは離間して設けられている。ここでは、作用極２５は、進行方向ｄに対して、対極２６と同じ位置または対極２６より上流側に設けられている。作用極２５は、例えば、くし形電極として構成されてもよい。
図１９（ａ）に示す配置例では、作用極２５は、流路２の幅方向の全体に亘って設けられている。対極２６は、作用極２５より下流側に所定距離離れた領域において、流路２の幅方向の全体に亘って設けられている。なお、作用極２５及び対極２６は、上面視で矩形形状であるが、この形状に限らず、楕円や半円など各種の形状とすることができる。また、作用極２５、対極２６は、流路２の幅方向を塞ぐように設けられているが、これに限らず、図１や図２に示すように、幅方向に対して一部領域のみに設けられてもよい。なお、作用極２５や対極２６の両方またはいずれか一方の幅を短くしてもよい。
図１９（ｂ）に示す配置例では、対極２６が上面視で上流側が凹状となった「コ」字状に設けられている。さらに、作用極２５が、対極２６の凹状となっている領域に矩形に設けられている。作用極２５の最も上流側の位置と、対極２６の上流側の位置が同じ位置となっている。
図１９（ｃ）に示す配置例では、それぞれ矩形形状の作用極２５と対極２６が幅方向に対称に設けられている。
図２０（ａ）～図１２（ｆ）は電極部２０が三電極方式である場合の作用極２５、対極２６及び参照極２７の配置例を示している。
図２０（ａ）に示す配置例では、上流側から下流側に向かって、作用極２５、参照極２７、対極２６が並んで、かつ流路２の幅方向の全体に亘って設けられている。図１９（ａ）で示した配置において、作用極２５と対極２６の間に参照極２７を配置した構成ともいえる。
図２０（ｂ）に示す配置例では、図２０（ａ）に示した配置において、参照極２７の幅を短くして流路２の幅方向の中央に矩形として設けた構成である。
図２０（ｃ）に示す配置例では、図示で流路２の左側に上流側から作用極２５、対極２６が設けられ、流路２の右側に参照極２７が設けられている。参照極２７は、作用極２５の上流側の位置から対極２６の下流側の位置まで進行方向ｄに細長く設けられている。
図２０（ｄ）に示す配置例では、作用極２５と対極２６とが、図１９（ｂ）で示した配置と同様となっており、さらに、作用極２５より図示左側上流位置に参照極２７が設けられている。
図２０（ｅ）に示す配置例では、図１９（ｂ）で示した配置の対極２６の凹状の右側端部が下流側に短くなっており、短くなった領域に参照極２７が設けられている。
図２０（ｆ）に示す配置例では、対極２６が流路２の幅方向の全体に亘って設けられている。さらに、流路２の左側に作用極２５が、右側に参照極２７が左右対称に設けられている。
＜電極部の構成＞
電極部２０（二電極方式の場合は作用極２５と対極２６、三極電極の場合はさらに参照極２７）は、微細構造７の凸部８に導体の物質が設けられて形成されてもよい。導体の物質としては、特に限定はしないが、例えば、金や銀、白金、パラジウム、カーボン、グラフェン、カーボンナノチューブ（ＣＮＴ）及びそれらの複合材などが挙げられる。参照極２７として、特に限定しないが、例えばＡｇ／ＡｇＣｌ電極が挙げられる。
凸部８の導体の物質は、例えば、スパッタリング、真空蒸着、レーザアブレーション及びＣＶＤ（chemical vapor deposition）の少なくとも１種を用いて形成された導体膜や、導体の粒子を含むペースト（インク）をインクジェット印刷やスクリーン印刷等の手法により形成した印刷層とすることができる。作用極２５は、抗体固定化のために、チオールなどで表面修飾されてもよい。
この場合、電極部２０の粗さ曲線の最大山高さＲｐが０．００５μｍ以上１０μｍ以下であり、かつ、粗さ曲線要素の平均長さＲＳｍが０．０１μｍ以上１５μｍ以下である。このような表面粗さとすることで、良好な毛細管力を発生させることができ、また電極部２０の表面積が増大するため得られるシグナル量を増大させることができる。なお、これら表面粗さは、図４に示したようなＳＥＭ画像を解析することで算出することができる。
＜検査キット１８の製造方法＞
検査キット１８の製造方法は次の工程によって得られる。
工程１…熱インプリント工程
複数の凹部が形成された金型（モールド）の表面を、熱可塑性プラスチックからなる膜状の基材に当てて、且つ基材を加熱することにより、凹部の形状に対応する微細構造（複数の凸部８）と１９とを有する膜担体３を作製する工程を備える。
検査キット１８の製造方法は、試薬または標識物質を、微細構造７がある膜担体３の表面のうち検知ゾーン３ｙへ、より具体的には第３微細構造領域３３の固相部５０に固定する工程をさらに備える。
熱インプリント工程で用いるモールドの微細加工法は、例えば、エッチング、フォトリソグラフィー、機械切削、またはレーザー加工等であってよい。加工サイズや加工範囲に適した微細加工法を選択することができる。
熱インプリントを行う前に、モールドの離型処理を行うことが望ましい。離型処理では、例えば、モールド表面に単分子膜を作製し、表面エネルギーを小さくすればよい。その結果、熱インプリント後に、熱可塑性プラスチックからなる膜担体３をモールド１の表面から剥離し易くなる。
熱インプリントの方式は、平板プレス式及びロール式のいずれであってもよい。平板プレス式では、平行に対面する上下のステージの間で、モールドを、熱可塑性プラスチックからなる基材と重ねて、これらをステージ間に挟む。そして、ステージを介して、モールド及び基材を加熱し、且つ加圧する。このような平板プレス式は、成型の精度が良い点において優れている。ロール式は、加熱したロール式モールドを用い、ロール同士の挟み圧によって成型を行う方式である。ロール式は、生産性に優れている。
熱インプリントを行う際の成型温度、成型圧力、転写時間等の条件は、微細加工のサイズ、微細構造（凸部８）の形状、加工範囲の大きさなどに応じて、選択すればよい。例えば、平板プレス式の場合、成型温度は、ガラス転移点Ｔｇよりも２０～５０℃高い温度、または融点Ｔｍよりも２０～５０℃高い温度であってよい。成型圧力は、１～１０ＭＰａであってよい。転写時間（モールド及び基材を加圧しながら保持する時間）は、３～１０分であってよい。以上の諸条件下での熱インプリントにより、モールドの微細構造を基材の表面へ正確に転写し易くなる。
膜担体３を構成する熱可塑性プラスチックの種類、及び試薬（検出物質）の種類によっては、試薬（検出物質）を膜担体３の固相部５０に固定し難いことがある。この場合、予め検知ゾーン３ｙのみに適当な表面処理を施すことにより、試薬（検出物質）を膜担体３の検知ゾーン３ｙ（すなわち固相部５０）に固定し易くなる。
検知ゾーン３ｙの表面処理手法は、何ら限定されるものではなく、例えば、各種プラズマ処理、ＵＶ処理、ＵＶ／オゾン処理、または、３－Ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌｔｒｉｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ若しくはＧｌｕｔａｒａｌｄｅｈｙｄｅによる表面修飾など種々の手法であってよい。
検知ゾーン３ｙに固定される試薬（検出物質）は、例えば、抗体であってよい。例えば図２では、第３微細構造領域３３の固相部５０に抗体が固定される。固相部５０は、電極部２０より溶液の進行方向ｄの上流側に設けられる。
抗体は、被検出物質との抗原抗体反応を起こす物質である。抗体は、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい。被検出物質は、何ら限定されるものではなく、各種病原体、各種臨床マーカー等、抗体との抗原抗体反応を起こすことが可能な如何なる物質であってもよい。具体例な被検出物質は、例えば、インフルエンザウイルス、ノロウイルス、アデノウイルス、ＲＳウイルス、ＨＡＶ、ＨＢｓ、ＨＩＶ等のウイルス抗原であってよい。被検出物質は、ＭＲＳＡ、Ａ群溶連菌、Ｂ群溶連菌、レジオネラ属菌等の細菌抗原、細菌等が産生する毒素であってもよい。被検出物質は、マイコプラズマ、クラミジア・トラコマティス、ヒト絨毛性ゴナドトロピン等のホルモンであってもよい。被検出物質は、Ｃ反応性タンパク質、ミオグロビン、心筋トロポニン、各種腫瘍マーカー、農薬、及び環境ホルモン等であってもよい。特に、インフルエンザウイルス、ノロウイルス、Ｃ反応性タンパク質、ミオグロビン、及び心筋トロポニンのような被検出物質の検出と、これらに起因する病気の治療措置に急を要する場合、本実施形態に係る検査キット１８の有用性が特に大きい。なお、被検出物質は、単独で免疫反応を誘起できる抗原であってもよい。被検出物質は、単独では免疫反応を誘起できないが、抗体と抗原抗体反応により抗体に結合することが可能なハプテンであってもよい。
＜検査キット１８による検査方法＞
図６に示すチャート図及び上述の図１～図５を参照して検査キット１８による検査方法を説明する。図６では、微細構造３０の第３微細構造領域３３に着目して示している。
Ｓ１：デバイス準備工程
まず、検査キット１８及び使用する溶液（反応液、洗浄液、二次反応液）を準備する。上述のように、第３微細構造領域３３の固相部５０には抗体５１が固定されている。
Ｓ２：反応液展開工程
液滴ゾーン３ｚから第２微細構造領域３２に反応液が滴下されると、微細構造７の毛細管作用により第３微細構造領域３３に移動する。
反応液中の検出対象９１及び検出対象（標識体）９２が抗体５１と反応して固定される。余分な反応液は吸水パッドに吸収されるが、一部の検出対象９１ａ及び検出対象（標識体）９２ａは固定されず第３微細構造領域３３上に残留する。
Ｓ３：洗浄液展開工程
つづいて、洗浄液ゾーン３ｘから洗浄液９３を滴下して、固相部５０に固定されず第３微細構造領域３３に残留している検出対象９１ａ及び検出対象（標識体）９２ａを洗浄する。検出対象（標識体）９２ａは、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）標識体を有している。
Ｓ４：二次反応液展開工程
洗浄後、第２微細構造領域３２に滴下された二次反応液（例えばｐ－アミノフェニルリン酸９４）が、微細構造７の毛細管作用により第３微細構造領域３３に移動する。ｐ－アミノフェニルリン酸９４は、抗体５１に固定された検出対象（標識体）９２と反応して電気的に活性な物質（ここではｐ－アミノフェノール９５）を生成する。この物質は、抗体５１に固定された検出対象（標識体）９２の量（濃度）と相関（比例）する。したがって、電極部２０で測定する酸化電流の値で、測定対象の濃度を正確かつ安定的に測定することができる。
以上、本実施形態によると、イムノクロマトグラフィー法を適用した検査キット１８において、膜担体３の微細構造７の流路２において溶液を移動させる速度（毛細管作用による速度）が異なる複数の領域に設定することができる。その結果、反応液や洗浄液、二次反応液など複数種類の溶液を展開する必要がある場合でも、それら溶液を展開するタイミングを使用態様に合わせて調整することができる。したがって、本来であれば必要とされたタイミング調整等の手間を省くことができ、安定して適切な検査を実施できる。具体的には、所定の治具等を用いて、各溶液が展開されるタイミングを考慮した異なる複数の場所に同時に滴下できる。すなわち一回の操作のみで各溶液を展開できる。
＜＜第２の実施形態＞＞
図７及び図８を参照して、本実施形態の検査キットについて説明する。第１の実施形態と異なる点は、膜担体１０３の構造にあり、おもに異なる点について説明し、同じ構成・機能については説明を適宜省略する。
図７は膜担体１０３を模式的に示した平面図である。図８に各隣接領域同士の境界を拡大した画像を示す。図８（ａ）は第１微細構造領域１３１と第２微細構造領域１３２との第１境界１４１の画像である。
図示のように、膜担体１０３は、所定の縦幅Ｌ１０及び横幅Ｌ２０の長方形形状を呈している。膜担体１０３は、左側から第１微細構造領域１３１（横幅Ｌ２０１）と、第２微細構造領域１３２（横幅Ｌ２０２）と、第３微細構造領域１３３（横幅Ｌ２０３）と、第４微細構造領域１３４（横幅Ｌ２０４）とを備える。これら領域は、第１の実施形態と同様に、微細構造における凸部の粗密が異なっており、その結果、毛細管作用による速度が異なる。
具体的には、第１微細構造領域１３１が最も粗であり（領域Ａ１１）、次に第３微細構造領域１３３が２番目に粗であり（領域Ａ１３）、第２微細構造領域１３２が３番目に粗であり（領域Ａ１２）、そして第４微細構造領域１３４が最も密（領域Ａ１４）に設定されている。また、第４微細構造領域１３４に固相部１５０が設けられている。
また、第２微細構造領域１３２と第３微細構造領域１３３との第２境界１４２には、所定幅Ｌ３１の緩衝領域が設けられている。緩衝領域には微細構造（すなわち凸部）が設けられていない。同様に、第３微細構造領域１３３と第４微細構造領域１３４との第３境界１４３にも所定幅Ｌ３２の緩衝領域が設けられている。このような緩衝領域を設けることで、領域毎の溶液の輸送量の違いを吸収し逆流等が発生することを防止することができる。例えば、第２微細構造領域１３２と第３微細構造領域１３３では、下流側の第３微細構造領域１３３の微細構造が粗で有る。したがって、第２微細構造領域１３２のほうが溶液の移動速度が大きい。その結果、第２境界１４２において緩衝領域が無いと、展開される溶液の量によっては逆流が生じかねない。しかし、本実施形態のように、毛細管力が生じない緩衝領域を設けることで、溶液の移動速度や展開される量による逆流発生を防止できる。
＜＜第３の実施形態＞＞
本実施形態では、溶液の逆流防止構造について６例説明する。なお、ここでは、上述した膜担体３、１０３に相当する構成の一部領域の断面図を抜き出して説明するが、他の領域についても適用できる。
図９（ａ）に示す膜担体２０３では、第１微細構造領域２３１と第２微細構造領域２３２との境界に、第２微細構造領域２３２側が低くなるように段差部２４１が設けられている。
図９（ｂ）に示す膜担体３０３では、第１微細構造領域３３１と第２微細構造領域３３２との境界に、下流方向に低くなる傾斜部３４１が設けられている。傾斜部３４１は、凸部がない緩衝領域でもよいし、凸部を有する微細凹凸構造でもよい。
図９（ｃ）に示す膜担体４０３では、第１微細構造領域４３１と第２微細構造領域４３２との境界に、上流方向に低くなる傾斜部４４１が設けられている。傾斜部４４１と第２微細構造領域４３２との境界は段差部４４２となっている。
図９（ｄ）に示す膜担体５０３では、第１微細構造領域５３１と第２微細構造領域５３２との境界に、凹部５４１が設けられている。
図９（ｅ）に示す膜担体６０３では、第１微細構造領域６３１と第３微細構造領域６３３とは水平に形成されるが、第２微細構造領域６３２が下流側ほど低くなる傾斜を有する。
図９（ｆ）に示す膜担体７０３では、第１微細構造領域７３１、第２微細構造領域７３２及び第３微細構造領域７３３の全てが、下流側ほど低くなる傾斜を有する。ここでは、全て同じ傾斜角の構成を示しているが、領域毎に異なる傾斜角であってもよい。
上記図９（ａ）～（ｆ）の構成を適宜組み合わせて所望の膜担体とすることができ、展開する溶液の種類や量に応じた最適な流路、溶液の移動速度を実現できる。
以上、図面を参照して本発明の実施形態について述べたが、これらは本発明の例示であり、上記以外の様々な構成（変形例）を採用することもできる。例えば、流路２は樹脂で形成された基板上の膜担体３の微細構造（微細凹凸構造）として設けられたが、流路２の領域によって粗密の異なる微細構造（微細凹凸構造）を設けることができれば各種の構成・材料等を採用することができる。
＜実施形態のまとめ＞
以上、本発明の特徴を簡単にまとめると次の通りである。
（１）検査装置（検査キット）は、
樹脂で形成された基板上に設けられ、液体試料を一端側から他端側へ輸送する流路と、
前記流路の他端側に設けられた、抗体を固相した固相部と、
電極部が設けられ前記液体試料の前記抗体に対する反応を検出する検出部と、
前記流路に一体に形成された複数の凸部を有する微細凹凸構造と、
を有し、
前記微細凹凸構造は、
前記複数の凸部が相対的に粗に設けられた第１の凹凸部と、
前記複数の凸部が相対的に密に設けられた第２の凹凸部と、
を有し、
前記第１の凹凸部と前記第２の凹凸部は、前記固相部よりも前記流路の一端側に設けられている。
（２）液体試料中の被検出物質を検出する検出装置であって、
前記液体試料を一端側から他端側へ輸送する流路と、
前記流路の他端側に設けられた、抗体を固相した固相部と、
前記液体試料の前記抗体に対する反応を検出する検出部と、
前記流路に一体に形成された複数の凸部を有する微細凹凸構造と、
を有し、
前記微細凹凸構造は、
前記複数の凸部が相対的に粗に設けられた第１の凹凸部と、
前記複数の凸部が相対的に密に設けられた第２の凹凸部と、
を有し、
前記第１の凹凸部と前記第２の凹凸部は、前記固相部よりも前記流路の一端側に設けられている。
（３）前記検出部は前記固相部より前記流路の他端側に設けられてもよい。
（４）前記第１の凹凸部は、前記第２の凹凸部よりも前記流路の一端側に設けられてもよい。
（５）前記第１の凹凸部と前記第２の凹凸部との境界に前記凸部が設けられていない緩衝領域を有してもよい。
（６）前記第１の凹凸部と前記第２の凹凸部との境界に、段差または傾斜が設けられており、
前記段差または前記傾斜の前記第１の凹凸部側の領域が前記第２の凹凸部側の領域より高くてもよい。
（７）前記第１の凹凸部と前記第２の凹凸部との境界に、凹部が設けられた凹部領域を有してもよい。
（８）前記凸部が菱形格子状に設けられている領域を有してもよい。
（９）前記凸部が正格子状に設けられている領域を有してもよい。
（１０）前記第１の凹凸部と、前記第２の凹凸部とが隣接する場合に、前記第１の凹凸部における前記凸部間のピッチ（Ｐ１）と、前記第２の凹凸部における前記凸部間のピッチ（Ｐ２）との比（Ｐ１／Ｐ２）は１．１以上５以下であってもよい。
（１１）前記凸部は錐体として設けられてもよい。
（１２）前記液体試料を前記流路に導入する導入部を更に有し、
前記液体試料は複数種類の溶液からなり、
前記導入部は、前記複数種類の溶液に応じて複数箇所に設けられてもよい。
（１３）前記電極部は前記微細凹凸構造の凸部に形成されており、電極部の粗さ曲線の最大山高さＲｐが０．００５μｍ以上１０μｍ以下であり、かつ、粗さ曲線要素の平均長さＲＳｍが０．０１μｍ以上１５μｍ以下であってもよい。
（１４）前記電極部は、前記微細凹凸構造の凸部に導体の物質がスパッタリング、真空蒸着、レーザアブレーション及びＣＶＤの少なくとも１種によって形成された導体膜層を有してもよい。
（１５）前記電極部は、前記微細凹凸構造の凸部に導体の粒子を含むペーストの印刷層を有してもよい。
（１６）前記電極部は、作用極と、前記作用極と離間した対極とを有し、
前記作用極は、流路方向に対して、前記対極と同じ位置または前記対極より上流側に設けられてもよい。
（１７）前記対極は、前記流路の幅方向の全体に亘って設けられてもよい。
（１８）前記作用極は、前記流路の幅方向の全体に亘って設けられてもよい。
（１９）前記作用極は、くし形電極として構成されてもよい。
（２０）前記電極部は、更に参照極を有してもよい。
（２１）検出方法は、上述の検出装置を用いて液体試料の抗体に対する反応を検出する。
以下、本発明を実施例（実施例１、２）を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。なお、以下の実施例では、膜担体において、微細構造を粗密の異なる複数の領域を有する構成としたときの溶液の流速制御の評価実験を行った。
［実施例１］
本実施例では、膜担体に三色の水溶液を展開した際に溶液が入れ替わっていく様子の定量評価の実験について説明する。
１． 実験
（１）微細構造の変化により溶液展開をコントロールする技術を確認するため、第１の実施形態の図２に示した構成の膜担体３について、第１微細構造領域３１、第２微細構造領域３２及び第３微細構造領域３３の凸部８間距離がそれぞれ２５μｍ、１５μｍ、２μｍの３つの領域を連続させた流路２をポリカーボネート（帝人社製 PC-2151）に作製した。製作条件（熱インプリント工程）は次の通りである。
＜熱インプリント工程（微細構造の転写）＞
下記の熱インプリント工程によって、モールド表面の微細構造を、熱可塑性プラスチックからなる膜状の基材の表面に転写した。熱インプリント工程では、ＳＣＩＶＡＸ社製のＸ－３００を用いた。熱インプリント工程では、微細構造（複数の凹部）が形成された上記モールドの表面を、熱可塑性プラスチックからなる膜状の基材に当てて、モールド及び基材を加熱しながら加圧した。成型温度は１８０℃であった。印加圧力は５．５ＭＰａであった。転写時間は５分であった。微細構造の転写後、モールド及び基材へ圧力を印加した状態で、モールド及び基材を１４０℃まで冷却した。冷却後に圧力を除いた。以上の熱インプリント工程により、実施例１の膜担体を得た。この膜担体は、複数の円錐（微細構造）と平坦部とを含む表面を有していた。膜担体の表面にある凸部（円錐）の形状及びサイズは、モールドに形成された凹部（逆円錐）の形状及びサイズに一致していた。
凸部８は、径４、高さ６がともに３０μｍの円錐構造である。
膜担体３の縦幅Ｌ１は５ｍｍ、第１～第３微細構造領域３１～３３の各横幅Ｌ２１～Ｌ２３はそれぞれ２０ｍｍである。
（２）第３微細構造領域３３の領域の端部に５ｍｍだけ重ねて、Navi-Fluで用いられている吸水パッドを貼り付けた。さらに、微細構造間距離が変化するポイント（図２の第１境界４１、第２境界４２に対応する位置）にNavi-Fluで用いられているコンジュゲートパッドを固定し試験片を作製した。図１０に作成した試験片の写真を示す。
（３）コンジュゲートパッドは、吸水パッドに近い順に「１」「２」「３」と番号を付け、それぞれのパッドに表１に示した組成の水溶液を滴下した。滴下液量は吸水パッドまでの距離や展開中に途中のコンジュゲートパッドにトラップされる量を考慮して定めた。なお、本実験のオペレーション及び結果検証を簡単にするため１０秒ごとに「１」「２」「３」の順にパッドに滴下した。
Figure 0007569847000001
（４）各色の溶液が展開されていく様子を動画撮影し、滴下箇所１と吸水パッドとの中間点の色変化を画像解析した。
２．結果
撮影した動画を１０秒ごとに画像化し、画像解析ソフト（ソフト名「Image J」）に取り込んだ。試験開始から３０、１４０、３１０秒後の画像を図１１に示す。図１１（ａ）が３０秒後の画像、図１１（ｂ）が１４０秒後の画像、図１１（ｃ）が３１０秒後の画像である。
滴下箇所１と吸水パッドとの中間点に測定点を定め、その点のＲＧＢ表示データを記録した。次に式１に従ってＲＧＢ各色の成分割合を算出した。例として、赤（Ｒ）、緑（Ｇ）、青（Ｂ）の各水溶液の換算データを表２に示す。
（R or G or Bの成分割合）＝（R or G or B数値）／（R数値＋G数値＋B数値）
…式１
Figure 0007569847000002
図１２に、経過時間と測定ポイントのＲＧＢ成分割合のプロットをしたグラフを示す。図１２に示す結果から、時間経過に従って緑→赤→青と変化していく様子を数値化できることが確認できる。
さらに、検査結果と流れの様子を定量的に評価するために、混合割合を定量評価する方法として、次の式２を検討した。これは、各測定点のＲＧＢ成分割合は、表２の単色の成分割合をどの程度ずつ混合すると実現できるかを求めたものである。実測値と計算値の誤差εを最小とするために表計算ソフトExcelのソルバー機能を用いた。
ε=|R_r x+G_r y+B_r z-r|+|R_g x+G_g y+B_g z-g|+|R_b x+G_b y+B_b z-b|
…式2
式２で表されるεを最小化するようなｘ、ｙ、ｚを求める。
ここでR_r, R_g, R_bはそれぞれ赤溶液のＲ、Ｇ、Ｂ成分割合を示す。Ｇ、Ｂはそれぞれ緑溶液、青溶液について同様の意味である。r、g、bはそれぞれ測定ポイントのＲ、Ｇ、Ｂ成分割合実測値である。x、y、zはそれぞれ測定ポイントでの赤、緑、青溶液の混合割合であり、x+y+z=1となるよう制限した。
式２を用いて図１２のデータを解析した結果、各溶液の混合割合を図１３のようにあらわすことができた。
以上の結果から、画像解析によって溶液の混合割合の時間変化を定量的に評価した。すなわち、膜担体の各領域の微細構造の粗密状態（凸部の間隔）を適切に設定することで、膜担体の流路の溶液の移動速度を調整でき、複数の溶液を展開できることが確認できた。
インプリントシートの代わりにニトロセルロースを用いて同様の試験及び評価を実施した結果（比較例）を図１４に示す。インプリントシートの場合は構造（凸部）が円錐状であるため直上から流路内の溶液を観察可能だが、ニトロセルロースは不織布状であり最表面の色変化しか観察できていない点に留意して結果を考察する。
図１３（インプリントシートの実施例）と比較すると、試験時間が大きく異なることが分かる。これはインプリントシートとニトロセルロースの展開流速の違いが表れたものであり、迅速に展開溶液を入れ替えるという点については流速の大きなインプリントシートが有利であることが確認できた。ニトロセルロースの全長を調整することで試験時間の短縮を図ることができるが、その場合同時に滴下した溶液同士が混ざり合ってしまうリスクが高まってしまう。実際に全長と滴下液量を半分にした試験では溶液が混合した。構造を工夫することで短時間判定かつ溶液の混ざり合わないデバイスを作製できる可能性はあるが、流速の調整などが行えないため設計自由度が低い。その点、実施例１で示したようなインプリントシートで膜担体を構成した場合、流速の調整等の自由度が高い。
３．まとめ
実施例１によると、インプリントシートの膜担体の場合、微細構造や材質の調整で流速が制御可能であり、市場のニーズに対して柔軟に対応することができる。
［実施例２］
１． 実験
（１）微細構造の変化により溶液展開をコントロールする技術を確認するため、第２の実施形態の図７に示した構成の膜担体１０３について、第１微細構造領域１３１、第２微細構造領域１３２、第３微細構造領域１３３及び第４微細構造領域１３４の凸部８の頂点間距離がそれぞれ１０５μｍ、６０μｍ、８０μｍ、３０μｍとした４つの領域を有する流路をポリカーボネート（帝人社製 PC-2151）に作製した。製作条件は実施例１と同じである。図１５（ａ）に流路を側面から見た模式図を、図１５（ｂ）に実際に作成した試験片の上面図（写真）を示す。
凸部８は、径４、高さ６がともに３２μｍの円錐構造である。
膜担体１０３の縦幅Ｌ１は５ｍｍ、第１微細構造領域１３１の横幅Ｌ２０１＝１５ｍｍ、第２微細構造領域１３２の横幅Ｌ２０２＝３０ｍｍ、第３微細構造領域１３３の横幅Ｌ２０３＝４５ｍｍ、第４微細構造領域１３４の横幅Ｌ２０４＝４０ｍｍである。
側面視で、第２微細構造領域１３２、第３微細構造領域１３３及び第４微細構造領域１３４は、傾斜角度２．２°の傾斜を付けている。
第１境界１４１は、緩衝領域が無い第１微細構造領域１３１と第２微細構造領域１３２とが連続した境界である。
第２境界１４２は、緩衝領域（未加工領域）の幅Ｌ３１＝０．１５ｍｍである。
第３境界１４３は、緩衝領域（未加工領域）の幅Ｌ３２＝０．２０ｍｍである。
（２）実験１（ＲＧＢ画像解析）：
実験１では、実施例１と同様の実験・解析方法により、所定のポイントの色変化をＲＧＢ成分から解析して、液体が入れ替わっていく様子を定量的に確認した。
具体的には、最下流（図示の第４微細構造領域１３４の右側端部）から５ｍｍのポイントの色変化をＲＧＢ成分から解析した。すなわち、各溶液のＲＧＢ成分割合をもとに、展開中の溶液混合割合を評価した。図１６に評価結果のグラフを示す。これは実施例１の図１３に対応するものであり、時間の経過とともに、割合が大きい成分が、緑成分（Ｇ）、赤成分（Ｒ）、青成分（Ｂ）と変化していくことが確認できた。
（３）実験２（ＣＲＰ検出性能評価）：
本実験では、図１５（ａ）に示すように、溶液の展開工程として次のような、洗浄液１０μＬを第４微細構造領域１３４に滴下し、１０秒後にＣＲＰ溶液１０μＬを第３微細構造領域１３３に滴下し、１分後に蛍光標識液１５μＬを第２微細構造領域１３２に滴下し、最後に２分後に洗浄液３０μＬを第１微細構造領域１３１に滴下した。最後の溶液（洗浄液）を滴下して１０分後に蛍光強度を測定した。
使用した溶液は次の通りである。
洗浄液：２ｗｔ％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００入りＰＢＳ
ＣＲＰ溶液：洗浄液とＣＲＰ溶液を所定の濃度で混合した溶液
蛍光標識液：洗浄液と蛍光標識抗ＣＲＰ抗体溶液を抗体濃度３０μｇ／ｍＬとなるように混合した溶液
図１７にＣＲＰ濃度ごとの蛍光体強度を示す。また、図１８に蛍光強度を観察したときの画像を示す。図１８（ａ）はＣＲＰ濃度が０ｎｇ／ｍＬのときのもので、図１８（ｂ）はＣＲＰ濃度が１０ｎｇ／ｍＬのときのものである。図１７及び図１８で示す結果から、ＣＲＰ濃度が１ｎｇ／ｍＬ以上の濃度で、ＣＲＰ濃度依存的な蛍光強度が得られた。このことから、上記のような複数の微細構造を有する膜担体を電気化学検出（電気化学イムノクロマト）に適用することで、所望の検出対象物質を電気的に測定することができる。
［実施例３］
１． 実験
（１）試験片（膜担体１０３）
実施例３では、試験系を実際の使用状態に近づける目的で、実施例２の実験２の試験条件を一部変更し、検体溶液にヒト血清を混合させたＣＲＰ検出試験を実施した。
図７に対応する試験片（膜担体１０３）の構造は、第１微細構造領域１３１、第２微細構造領域１３２、第３微細構造領域１３３及び第４微細構造領域１３４の凸部８の頂点間距離がそれぞれ１００μｍ、６０μｍ、９５μｍ、３０μｍとした４つの領域を有する流路をポリカーボネート（帝人社製 PC-2151）に作製した。製作条件は実施例１及び実施例２と同じである。
図２１に試験片（流路）を側面から見た模式図を示す。試験片として、３６サンプル用意した。凸部８は、径４、高さ６がともに３２μｍの円錐構造である。
膜担体１０３の縦幅Ｌ１は５ｍｍ、第１微細構造領域１３１の横幅Ｌ２０１＝３６．９５ｍｍ、第２微細構造領域１３２の横幅Ｌ２０２＝５ｍｍ、第３微細構造領域１３３の横幅Ｌ２０３＝４０ｍｍ、第４微細構造領域１３４の横幅Ｌ２０４＝４０ｍｍである。
側面視で、第２微細構造領域１３２、第３微細構造領域１３３及び第４微細構造領域１３４は、傾斜角度２．１°の傾斜を付けている。
第１境界１４１は、緩衝領域が無い第１微細構造領域１３１と第２微細構造領域１３２とが連続した境界である。
第２境界１４２は、緩衝領域（未加工領域）の幅Ｌ３１＝０．１５ｍｍである。
第３境界１４３は、緩衝領域（未加工領域）の幅Ｌ３２＝０．１５ｍｍである。
（２）抗体固相
試験片の最下流端から１７．５ｍｍ位置に抗ＣＲＰ抗体固相溶液を１μL滴下し、４５℃雰囲気で１時間乾燥させることで抗ＣＲＰ抗体を２５ｎｇ固相した。
図２１のように流路に２．１°の傾斜を設け、異なる滴下箇所からＣＲＰ溶液、蛍光標識抗ＣＲＰ抗体溶液（展開溶液中、蛍光標識抗ＣＲＰ抗体濃度４５μｇ／ｍＬ）、展開溶液（２ｗｔ％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００入りＰＢＳ）の順に展開した。使用したＣＲＰ溶液の組成は表３に示す。展開液量と溶液滴下の間隔は表４に示す。また各試験はｎ＝３で実施した。
すべての溶液を展開してから１０分後、吸水パッドとインプリントシート（膜担体１０３）を切り離して溶液の逆流を防止してから、抗体固相部の蛍光強度を測定した。
２．結果
各試験の蛍光強度測定結果を図２２に示す。ここに示した蛍光強度は、抗体固相部の蛍光強度からその周囲のバックグラウンド蛍光強度を差し引いた値である。なお図２２（ａ）では蛍光強度測定時の露光時間を１秒とし、図２２（ｂ）では１／６秒とした。
血清の有無にかかわらず、同等の最小検出感度と３ケタ以上の測定レンジ（検出レンジ）を達成できた。
なお、血清の存在により蛍光強度が小さくなる傾向があった。これは、血清中のたんぱく質（～８０ｍｇ／ｍL）が、抗体とＣＲＰとの反応を阻害したと推測される。
Figure 0007569847000003
Figure 0007569847000004
［実施例４］
実施例４では、実施例１から３の結果を踏まえ、インプリントシート上での電気化学検出試験を実施した。なお、本実施例では、電気化学検出が適切に行えるかいなかを確認する観点から、全ての溶液を第４微細構造領域１３４の同じ位置に滴下タイミングを変えて滴下した。
１． 実験
（１）試験片（膜担体１０３）
実施例３で作成した試験片と同じ構造の膜担体１０３を用意した。膜担体１０３の縦幅Ｌ１は５ｍｍ、第１微細構造領域１３１の横幅Ｌ２０１＝３６．９５ｍｍ、第２微細構造領域１３２の横幅Ｌ２０２＝５ｍｍ、第３微細構造領域１３３の横幅Ｌ２０３＝４０ｍｍ、第４微細構造領域１３４の横幅Ｌ２０４＝４０ｍｍである。
（２）電極部（作用極、対極）
ＳＵＳ板にポリイミドテープを貼った基板上にインプリントシートを貼り、電極部２０として電極形状に加工したマスク越しに金を真空蒸着した。
電極形状は次の通りである。
作用電極・・・ １ｍｍ×５ｍｍ（流路幅）
対極・・・ ３ｍｍ×５ｍｍ（流路幅）
電極間のギャップ・・・ ０．５ｍｍ
電極位置・・・対極の下流端が、流路の最下流端から１５．５ｍｍ位置
（３）抗体固相
作用電極より５ｍｍ上流位置に、実施例３と同様に、抗ＣＲＰ抗体固相溶液を１μL滴下し、４５℃雰囲気で１時間乾燥させることで抗ＣＲＰ抗体を２５ｎｇ固相した。
（４）測定装置
銀ペースト（ドータイトD-550）で電極部２０（作用極、対極）と基板の導通をとり、基板を電気化学測定装置（Solartron製1252A）のワニ口クリップで挟んで測定した。作用極と対極との間に＋５０ｍＶの電位をかけて溶液展開し、電流値を時間に対しプロットした（図２４参照）。
（５）溶液滴下タイミング及び滴下溶液
図２３は実施例４の溶液滴下タイミングを示したチャート図である。
まず、洗浄液１０μＬを滴下した（第１工程Ｓ１１）。第１工程Ｓ１１から２分後、ＣＲＰ、ＡＬＰ標識ＣＲＰ混合溶液１０μＬを滴下した（第２工程Ｓ１２）。さらに、第２工程Ｓ１２から２分後、洗浄液（４％）１０μＬを滴下した（第３工程Ｓ１３）。最後に、第３工程Ｓ１３から３分後、p-アミノフェニルリン酸Ｎａ溶液１０μＬを滴下した（第４工程Ｓ１４）。
滴下した溶液は以下の通りである。
洗浄液…２ｗｔ％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００入りＰＢＳ
ＡＬＰ標識ＣＲＰ…市販のＣＲＰを標識キット（同仁化学研究所製LK13）で標識
ＣＲＰ、ＡＬＰ標識ＣＲＰ混合溶液…ＣＲＰ及びＡＬＰ標識ＣＲＰを所定の濃度になるように洗浄液に懸濁
洗浄液（４％）…４wt％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００入りＰＢＳ
p-アミノフェニルリン酸Ｎａ溶液…p-アミノフェニルリン酸Ｎａを５ｍＭ濃度となるよう洗浄液に溶解
２．結果
図２４に測定結果を示す。図２４（ａ）はＣＲＰ、ＡＬＰ標識ＣＲＰ混合溶液のＣＲＰ濃度を０μg／ｍＬ、ＡＬＰ-ＣＲＰ濃度を１．２５μｇ／ｍＬとしたときの結果であり、図２４（ｂ）は上記混合溶液のＣＲＰ濃度を１２．５μｇ／ｍＬ、ＡＬＰ-ＣＲＰ濃度を１．２５μｇ／ｍＬとしたときの結果である。図示のように、溶液の滴下タイミング及びＣＲＰ濃度を反映した電流値が検出された。
この出願は、２０２０年４月２８日に出願された日本出願特願２０２０－０７９３６７号を基礎とする優先権を主張し、その開示の全てをここに取り込む。
２ 流路
３、１０３、２０３、３０３、４０３、５０３、６０３、７０３ 膜担体
３ｘ 洗浄液ゾーン
３ｙ 検知ゾーン
３ｚ 液滴ゾーン
８ 凸部
１８ 検査キット
１８ａ 筐体
１８ｂ 第一開口部
１８ｃ 第二開口部
１８ｄ 第三開口部
２０ 電極部
２１ 計測装置
２５ 作用極
２６ 対極
２７ 参照極
３１、１３１、２３１、３３１、４３１、５３１、６３１、７３１ 第１微細構造領域
３２、１３２、２３２、３３２、４３２、５３２、６３２、７３２ 第２微細構造領域
３３、１３３ 第３微細構造領域
１３４ 第４微細構造領域
４１、１４１、２４１ 第１境界
４２、１４２ 第２境界
１４３ 第３境界
５０、１５０ 固相部
５１ 抗体
３４１、４４１ 傾斜部
５４１ 凹部

Claims (20)

  1. 樹脂で形成された基板上に設けられ、液体試料を一端側から他端側へ輸送する流路と、
    前記流路の他端側に設けられた、抗体を固相した固相部と、
    電極部が設けられ前記液体試料の前記抗体に対する反応を検出する検出部と、
    前記流路に一体に形成された複数の凸部を有する微細凹凸構造と、
    を有し、
    前記微細凹凸構造は、
    前記複数の凸部が相対的に粗に設けられた第１の凹凸部と、
    前記複数の凸部が相対的に密に設けられた第２の凹凸部と、
    を有し、
    前記第１の凹凸部と前記第２の凹凸部は、前記固相部よりも前記流路の一端側に設けられており、
    前記液体試料を前記流路に導入する導入部を更に有し、
    前記液体試料は複数種類の溶液からなり、
    前記導入部は、前記複数種類の溶液に応じて複数箇所に設けられており、
    前記流路中において、前記第１の凹凸部と前記第２の凹凸部のそれぞれに液滴を滴下する開口が設けられている、検出装置。
  2. 液体試料中の被検出物質を検出する検出装置であって、
    前記液体試料を一端側から他端側へ輸送する流路と、
    前記流路の他端側に設けられた、抗体を固相した固相部と、
    前記液体試料の前記抗体に対する反応を検出する検出部と、
    前記流路に一体に形成された複数の凸部を有する微細凹凸構造と、
    を有し、
    前記微細凹凸構造は、
    前記複数の凸部が相対的に粗に設けられた第１の凹凸部と、
    前記複数の凸部が相対的に密に設けられた第２の凹凸部と、
    を有し、
    前記第１の凹凸部と前記第２の凹凸部は、前記固相部よりも前記流路の一端側に設けられており、
    前記液体試料を前記流路に導入する導入部を更に有し、
    前記液体試料は複数種類の溶液からなり、
    前記導入部は、前記複数種類の溶液に応じて複数箇所に設けられており、
    前記流路中において、前記第１の凹凸部と前記第２の凹凸部のそれぞれに液滴を滴下する開口が設けられている、検出装置。
  3. 前記検出部は前記固相部より前記流路の他端側に設けられる、請求項１または２に記載の検出装置。
  4. 前記第１の凹凸部は、前記第２の凹凸部よりも前記流路の一端側に設けられている、請求項１から３までのいずれか１項に記載の検出装置。
  5. 前記第１の凹凸部と前記第２の凹凸部との境界に前記凸部が設けられていない緩衝領域を有する、請求項１から４までのいずれか１項に記載の検出装置。
  6. 前記第１の凹凸部と前記第２の凹凸部との境界に、段差または傾斜が設けられており、
    前記段差または前記傾斜の前記第１の凹凸部側の領域が前記第２の凹凸部側の領域より高い、請求項１から５までのいずれか１項に記載の検出装置。
  7. 前記第１の凹凸部と前記第２の凹凸部との境界に、凹部が設けられた凹部領域を有する、請求項１から６までのいずれか１項に記載の検出装置。
  8. 前記凸部が菱形格子状に設けられている領域を有する、請求項１から７までのいずれか１項に記載の検出装置。
  9. 前記凸部が正格子状に設けられている領域を有する、請求項１から８までのいずれか１項に記載の検出装置。
  10. 前記第１の凹凸部と、前記第２の凹凸部とが隣接する場合に、前記第１の凹凸部における前記凸部間のピッチ（Ｐ１）と、前記第２の凹凸部における前記凸部間のピッチ（Ｐ２）との比（Ｐ１／Ｐ２）は１．１以上５以下である、請求項１から９までのいずれか１項に記載の検出装置。
  11. 前記凸部は錐体として設けられている、請求項１から１０までのいずれか１項に記載の検出装置。
  12. 前記電極部は、前記微細凹凸構造の凸部に形成されており、電極部の粗さ曲線の最大山高さＲｐが０．００５μｍ以上１０μｍ以下であり、かつ、粗さ曲線要素の平均長さＲＳｍが０．０１μｍ以上１５μｍ以下である、請求項１から１１までのいずれか１項に記載の検出装置。
  13. 前記電極部は、前記微細凹凸構造の凸部に導体の物質がスパッタリング、真空蒸着、レーザアブレーション及びＣＶＤの少なくとも１種によって形成された導体膜層を有する、請求項１から１２までのいずれか１項に記載の検出装置。
  14. 前記電極部は、前記微細凹凸構造の凸部に導体の粒子を含むペーストの印刷層を有する、請求項１から１２までのいずれか１項に記載の検出装置。
  15. 前記電極部は、作用極と、前記作用極と離間した対極とを有し、
    前記作用極は、流路方向に対して、前記対極と同じ位置または前記対極より上流側に設けられている、請求項１から１４までのいずれか１項に記載の検出装置。
  16. 前記対極は、前記流路の幅方向の全体に亘って設けられている、請求項１５に記載の検出装置。
  17. 前記作用極は、前記流路の幅方向の全体に亘って設けられている、請求項１５または１６に記載の検出装置。
  18. 前記作用極は、くし形電極として構成されている、請求項１５から１７までのいずれか１項に記載の検出装置。
  19. 前記電極部は、更に参照極を有する、請求項１５から１８までのいずれか１項に記載の検出装置。
  20. 請求項１から１９までのいずれか１項に記載の検出装置を用いて液体試料の抗体に対する反応を検出する検出方法。
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