JP7531507B2 - ソバ由来c-配糖化酵素遺伝子及びその使用 - Google Patents
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- C12Y114/14—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14) with reduced flavin or flavoprotein as one donor, and incorporation of one atom of oxygen (1.14.14)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y201/00—Transferases transferring one-carbon groups (2.1)
- C12Y201/01—Methyltransferases (2.1.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
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- C12Y204/01—Hexosyltransferases (2.4.1)
-
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Description
[1] ソバ由来C-配糖化酵素(CGT)遺伝子又はそのホモログであって、
前記ソバ由来CGT遺伝子又はそのホモログが、
(1-a)配列番号11の塩基配列からなるポリヌクレオチド;
(1-b)配列番号11の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、(1-a)に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するポリヌクレオチド;
(1-c)配列番号12のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
からなる群から選択される、ソバ由来CGT遺伝子又はそのホモログ。
[2]シロイヌナズナADH遺伝子由来非翻訳領域(5’-UTR)(配列番号15)又はシロイヌナズナHSPRO遺伝子由来非翻訳領域(5’-UTR)(配列番号13)が付加されている、1に記載のソバ由来CGT遺伝子又はそのホモログ。
[3] ソバ由来CGT遺伝子又はそのホモログを含むベクターであって、
前記ソバ由来CGT遺伝子又はそのホモログが、
(1-a)配列番号11の塩基配列からなるポリヌクレオチド;
(1-b)配列番号11の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、(1-a)に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するポリヌクレオチド;
(1-c)配列番号12のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(1-d)配列番号12のアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び/又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、(1-c)に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(1-e)配列番号12のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、(1-c)に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
からなる群から選択される、ベクター。
[4] 前記ソバ由来CGT遺伝子又はそのホモログにシロイヌナズナADH遺伝子由来非翻訳領域(5’-UTR)(配列番号15)又はシロイヌナズナHSPRO遺伝子由来非翻訳領域(5’-UTR)(配列番号13)が付加されている、3に記載のベクター。
[5] フラバノン 2-水酸化酵素(F2H)遺伝子又はそのホモログ、及び脱水酵素(FDH)遺伝子又はそのホモログをさらに含む、3又は4に記載のベクター。
[6] 前記F2H遺伝子又はそのホモログが、
(2-a)配列番号5の塩基配列からなるポリヌクレオチド;
(2-b)配列番号5の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、(2-a)に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するポリヌクレオチド;
(2-c)配列番号6のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(2-d)配列番号6のアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び/又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、(2-c)に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(2-e)配列番号6のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、(2-c)に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、からなる群から選択され、
前記FDH遺伝子又はそのホモログが、
(3-a)配列番号9の塩基配列からなるポリヌクレオチド;
(3-b)配列番号9の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、(3-a)に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するポリヌクレオチド;
(3-c)配列番号10のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(3-d)配列番号10のアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び/又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、(3-c)に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(3-e)配列番号10のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、(3-c)に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、からなる群から選択される、5に記載のベクター。
[7] フラボノイドF3’5’水酸化酵素(F3’5’H)遺伝子又はそのホモログ、及びメチル基転移酵素(MT)遺伝子又はそのホモログをさらに含む、3~6のいずれかに記載のベクター。
[8] 前記F3’5’H遺伝子又はそのホモログが、
(4-a)配列番号1の塩基配列からなるポリヌクレオチド;
(4-b)配列番号1の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、(4-a)に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するポリヌクレオチド;
(4-c)配列番号2のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(4-d)配列番号2のアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び/又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、(4-c)に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(4-e)配列番号2のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、(4-c)に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、からなる群から選択され、そして
前記MT遺伝子又はそのホモログが、
(5-a)配列番号3の塩基配列からなるポリヌクレオチド;
(5-b)配列番号3の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、(5-a)に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するポリヌクレオチド;
(5-c)配列番号4のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(5-d)配列番号4のアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び/又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、(5-c)に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(5-e)配列番号4のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、(5-c)に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、からなる群から選択される、7に記載のベクター。
[9] 1又は2に記載のソバ由来CGT遺伝子又はそのホモログ、あるいは3~8のいずれかに記載のベクターを含む形質転換植物、又はその自殖もしくは他殖後代。
[10] 前記植物がバラ、キク、カーネーション又はユリから選択される、9に記載の形質転換植物、又はその自殖もしくは他殖後代。
[11] 前記植物がバラである、10に記載の形質転換植物、又はその自殖もしくは他殖後代。
[12] 9~11のいずれかに記載の形質転換植物、又はその自殖もしくは他殖後代の栄養繁殖体、植物体の一部、組織、又は細胞。
[13] 9~11のいずれかに記載の形質転換植物、又はその自殖もしくは他殖後代の切り花、又は該切り花から作成された加工品。
[14] 青系花色を有する形質転換植物を作出するための方法であって、ソバ由来C-配糖化酵素(CGT)遺伝子又はそのホモログを宿主植物に導入することにより、デルフィニジン型アントシアニンとフラボン モノ-C-配糖体を植物の細胞内で共存させる工程を含む、方法。
[15] 前記フラボン モノ-C-配糖体が、アピゲニン 6-C-グルコシド、ルテオリン 6-C-グルコシド、トリセチン 6-C-グルコシド、アピゲニン 8-C-グルコシド、ルテオリン 8-C-グルコシド、トリセチン 8-C-グルコシド又はそれらの誘導体である、14に記載の方法。
[16] 前記デルフィニジン型アントシアニンが、マルビジン、デルフィニジン、ペチュニジン及びそれらの組み合せから成る群から選択される、14又は15に記載の方法。
[17] 1又は2に記載のソバ由来CGT遺伝子又はそのホモログ、あるいは3~8のいずれかに記載のベクターを宿主植物の細胞内に導入する工程を含む、14~16のいずれかに記載の方法。
[18] 前記植物がバラ、キク、カーネーション又はユリから選択される、14~17のいずれかに記載の方法。
[19] 前記植物がバラである、18に記載の方法。
(1-a)配列番号11の塩基配列からなるポリヌクレオチド;
(1-b)配列番号11の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、(1-a)に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するポリヌクレオチド;
(1-c)配列番号12のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(1-d)配列番号12のアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び/又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、(1-c)に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(1-e)配列番号12のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、(1-c)に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、からなる群から選択される。
(2-a)配列番号5の塩基配列からなるポリヌクレオチド;
(2-b)配列番号5の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、(2-a)に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するポリヌクレオチド;
(2-c)配列番号6のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(2-d)配列番号6のアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び/又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、(2-c)に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(2-e)配列番号6のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、(2-c)に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、からなる群から選択される。
(3-a)配列番号9の塩基配列からなるポリヌクレオチド;
(3-b)配列番号9の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、(3-a)に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するポリヌクレオチド;
(3-c)配列番号10のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(3-d)配列番号10のアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び/又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、(3-c)に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(3-e)配列番号10のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、(3-c)に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、からなる群から選択される。
(4-a)配列番号1の塩基配列からなるポリヌクレオチド;
(4-b)配列番号1の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、(4-a)に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するポリヌクレオチド;
(4-c)配列番号2のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(4-d)配列番号2のアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び/又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、(4-c)に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(4-e)配列番号2のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、(4-c)に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、からなる群から選択される。
(5-a)配列番号3の塩基配列からなるポリヌクレオチド;
(5-b)配列番号3の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、(5-a)に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するポリヌクレオチド;
(5-c)配列番号4のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(5-d)配列番号4のアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び/又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、(5-c)に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(5-e)配列番号4のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、(5-c)に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、からなる群から選択される。
本明細書中、用語「ストリンジェント条件」とは、ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドと、ゲノムDNAとの選択的かつ検出可能な特異的結合を可能とする条件である。ストリンジェント条件は、塩濃度、有機溶媒(例えば、ホルムアミド)、温度、及びその他公知の条件の適当な組み合わせによって定義される。すなわち、塩濃度を減じるか、有機溶媒濃度を増加させるか、又はハイブリダイゼーション温度を上昇させるかによってストリンジェンシー(stringency)は増加する。さらに、ハイブリダイゼーション後の洗浄の条件もストリンジェンシーに影響する。この洗浄条件もまた、塩濃度と温度によって定義され、塩濃度の減少と温度の上昇によって洗浄のストリンジェンシーは増加する。したがって、用語「ストリンジェント条件」とは、各塩基配列間の「同一性」の程度が、例えば、全体の平均で約80%以上、好ましくは約90%以上、より好ましくは約95%以上、さらに好ましくは97%以上、最も好ましくは98%以上であるような、高い同一性を有する塩基配列間のみで、特異的にハイブリダイズするような条件を意味する。「ストリンジェント条件」としては、例えば、温度60℃~68℃において、ナトリウム濃度150~900mM、好ましくは600~900mM、pH6~8であるような条件を挙げることができ、具体例としては、5×SSC(750mM NaCl、75mM クエン酸三ナトリウム)、1%SDS、5×デンハルト溶液50%ホルムアルデヒド、及び42℃の条件でハイブリダイゼーションを行い、0.1×SSC(15mM NaCl、1.5mM クエン酸三ナトリウム)、0.1%SDS、及び55℃の条件で洗浄を行うものを挙げることができる。
また、ポリヌクレオチドは、当業者に公知の方法、例えば、ホスホアミダイド法等により化学的に合成する方法、植物の核酸試料を鋳型とし、目的とする遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて設計したプライマーを用いる核酸増幅法などによって得ることができる。
あるいは短縮されたアミノ酸配列からなる酵素をコードするDNAを得るには、例えば、目的とするアミノ酸配列より長いアミノ酸配列、例えば、全長アミノ酸配列をコードするDNAを所望の制限酵素により切断し、その結果得られたDNA断片が目的とするアミノ酸配列の全体をコードしていない場合は、不足部分の配列からなるDNA断片を合成し、連結すればよい。
アントシアニン(マルビン)に対するフラボン C-配糖体のコピグメント効果のシミユレーションを行うため、マルビン及びフラボン C-配糖体を調整した。本実験に用いたマルビン(マルビジン3,5-ジグルコシド)及びフラボン C-配糖体(ビテキシン(アピゲニン 8-C-グルコシド)、イソビテキシン(アピゲニン 6-C-グルコシド)、オリエンチン(ルテオリン 8-C-グルコシド)、イソオリエンチン(ルテオリン 6-C-グルコシド)、ビセニン-2(アピゲニン6,8-ジ-C-グルコシド))はナカライテスク株式会社より購入した。
このようにして入手したマルビンに対して各フラボン C-配糖体(ビテキシン、イソビテキシン、オリエンチン、イソオリエンチン、ビセニン-2)を、pH5.0の緩衝液中、5当量のモル濃度比で添加し、吸収スペクトルを測定した。マルビンの濃度は0.5mMとした。
pSPB6486は、pBINPLUSを基本骨格とし、以下の5つの発現カセットが含まれている。
(1)El235Sプロモーターとカンパニュラ由来F3’5’H完全長cDNA(配列番号1)とD8ターミネーター
(2)El235Sプロモーターとトレニア由来MT完全長cDNA(配列番号3)とNOSターミネーター
(3)35Sプロモーターとカンゾウ由来F2H完全長cDNA(配列番号5)とシソ由来ATターミネーター
(4)35Sプロモーターとイネ由来コドンUsage改変CGT完全長cDNA(配列番号7)とシロイヌナズナ由来HSPターミネーター
(5)35Sプロモーターとミヤコグサ由来FDH完全長cDNA(配列番号9)とシロイヌナズナ由来HSPターミネーター
本プラスミドは植物においてはカンパニュラのF3’5’H遺伝子とトレニアのMT遺伝子、カンゾウのF2H遺伝子、イネのコドンUsage改変CGT遺伝子、ミヤコグサのFDH遺伝子を構成的に発現する。
Del:デルフィニジン、Cya:シアニジン、Pet:ペチュニジン、Pel:ペラルゴニジン、Mal:マルビジン
M:ミリセチン、Q:クェルセチン、K:ケンフェロール
Tri:トリセチン、Lut:ルテオリン、Api:アピゲニン、Vic2:ビセニン-2、VX:ビテキシン、IVX:イソビテキシン、Ori:オリエンチン、Iori:イソオリエンチン
Mal(%):総アントシアニジン中のマルビジンの割合
pSPB7473は、pBINPLUSを基本骨格とし、以下の5つの発現カセットが含まれている。
(1)El235Sプロモーターとカンパニュラ由来F3’5’H完全長cDNA(配列番号1)とD8ターミネーター
(2)El235Sプロモーターとトレニア由来MT完全長cDNA(配列番号3)(5’位側にシロイヌナズナHSPRO遺伝子由来5’-UTR(配列番号13)を付加)とシロイヌナズナ由来HSPターミネーター
(3)El235Sプロモーターとカンゾウ由来F2H完全長cDNA(配列番号5)とシソ由来ATターミネーター
(4)El235Sプロモーターとソバ由来コドンUsage改変CGT完全長cDNA(配列番号11)(5’位側にシロイヌナズナHSPRO遺伝子由来5’-UTR(配列番号13)を付加)とシロイヌナズナ由来HSPターミネーター
(5)El235Sプロモーターとミヤコグサ由来FDH完全長cDNA(配列番号9)とシロイヌナズナ由来HSPターミネーター
本プラスミドは植物においてはカンパニュラのF3’5’H遺伝子とトレニアのMT遺伝子、カンゾウのF2H遺伝子、ソバのコドンUsage改変CGT遺伝子、ミヤコグサのFDH遺伝子を構成的に発現する。
Del:デルフィニジン、Cya:シアニジン、Pet:ペチュニジン、Pel:ペラルゴニジン、Mal:マルビジン
M:ミリセチン、Q:クェルセチン、K:ケンフェロール
Tri:トリセチン、Lut:ルテオリン、Api:アピゲニン、Vic2:ビセニン-2、VX:ビテキシン、IVX:イソビテキシン、Ori:オリエンチン、Iori:イソオリエンチン
Mal(%):総アントシアニジン中のマルビジンの割合
pSPB7472は、pBINPLUSを基本骨格とし、以下の5つの発現カセットが含まれている。
(1)El235Sプロモーターとカンパニュラ由来F3’5’H完全長cDNA(配列番号1)とD8ターミネーター
(2)El235Sプロモーターとトレニア由来MT完全長cDNA(配列番号3)(5’位側にシロイヌナズナHSPRO遺伝子由来5’-UTR(配列番号13)を付加)とシロイヌナズナ由来HSPターミネーター
(3)El235Sプロモーターとカンゾウ由来F2H完全長cDNA(配列番号5)とシソ由来ATターミネーター
(4)El235Sプロモーターとソバ由来CGT完全長cDNA(配列番号14)(5’位側にシロイヌナズナHSPRO遺伝子由来5’-UTR(配列番号13)を付加)とシロイヌナズナ由来HSPターミネーター
(5)El235Sプロモーターとミヤコグサ由来FDH完全長cDNA(配列番号9)とシロイヌナズナ由来HSPターミネーター
本プラスミドは植物においてはカンパニュラのF3’5’H遺伝子とトレニアのMT遺伝子、カンゾウのF2H遺伝子、ソバのCGT遺伝子、ミヤコグサのFDH遺伝子を構成的に発現する。
Del:デルフィニジン、Cya:シアニジン、Pet:ペチュニジン、Pel:ペラルゴニジン、Mal:マルビジン
M:ミリセチン、Q:クェルセチン、K:ケンフェロール
Tri:トリセチン、Lut:ルテオリン、Api:アピゲニン、Vic2:ビセニン-2、VX:ビテキシン、IVX:イソビテキシン、Ori:オリエンチン、Iori:イソオリエンチン
Mal(%):総アントシアニジン中のマルビジンの割合
pSPB7808は、pBINPLUSを基本骨格とし、以下の5つの発現カセットが含まれている。
(1)El235Sプロモーターとカンパニュラ由来F3’5’H完全長cDNA(配列番号1)とD8ターミネーター
(2)El235Sプロモーターとトレニア由来MT完全長cDNA(配列番号3)とシロイヌナズナ由来HSPターミネーター
(3)El235Sプロモーターとカンゾウ由来F2H完全長cDNA(配列番号5)とシソ由来ATターミネーター
(4)El235Sプロモーターとソバ由来CGT完全長cDNA(配列番号14)(5’位側にシロイヌナズナ アルコールデヒドロゲナーゼ(ADH)遺伝子由来5’-UTR(配列番号15)を付加)とシロイヌナズナ由来HSPターミネーター
(5)El235Sプロモーターとミヤコグサ由来FDH完全長cDNA(配列番号9)とシロイヌナズナ由来HSPターミネーター
本プラスミドは植物においてはカンパニュラのF3’5’H遺伝子とトレニアのMT遺伝子、カンゾウのF2H遺伝子、ソバのCGT遺伝子、ミヤコグサのFDH遺伝子を構成的に発現する。
Del:デルフィニジン、Cya:シアニジン、Pet:ペチュニジン、Pel:ペラルゴニジン、Mal:マルビジン
M:ミリセチン、Q:クェルセチン、K:ケンフェロール
Tri:トリセチン、Lut:ルテオリン、Api:アピゲニン、Vic2:ビセニン-2、VX:ビテキシン、IVX:イソビテキシン、Ori:オリエンチン、Iori:イソオリエンチン
Mal(%):総アントシアニジン中のマルビジンの割合
pSPB7809は、pBINPLUSを基本骨格とし、以下の5つの発現カセットが含まれている。
(1)El235Sプロモーターとカンパニュラ由来F3’5’H完全長cDNA(配列番号1)とD8ターミネーター
(2)El235Sプロモーターとトレニア由来MT完全長cDNA(配列番号3)とシロイヌナズナ由来HSPターミネーター
(3)El235Sプロモーターとカンゾウ由来F2H完全長cDNA(配列番号5)とシソ由来ATターミネーター
(4)El235Sプロモーターとソバ由来コドンUsage改変CGT完全長cDNA(配列番号11)(5’位側にシロイヌナズナ アルコールデヒドロゲナーゼ(ADH)遺伝子由来5’-UTR(配列番号15)を付加)とシロイヌナズナ由来HSPターミネーター
(5)El235Sプロモーターとミヤコグサ由来FDH完全長cDNA(配列番号9)とシロイヌナズナ由来HSPターミネーター
本プラスミドは植物においてはカンパニュラのF3’5’H遺伝子とトレニアのMT遺伝子、カンゾウのF2H遺伝子、ソバのコドンUsage改変CGT遺伝子、ミヤコグサのFDH遺伝子を構成的に発現する。
Del:デルフィニジン、Cya:シアニジン、Pet:ペチュニジン、Pel:ペラルゴニジン、Mal:マルビジン
M:ミリセチン、Q:クェルセチン、K:ケンフェロール
Tri:トリセチン、Lut:ルテオリン、Api:アピゲニン、Vic2:ビセニン-2、VX:ビテキシン、IVX:イソビテキシン、Ori:オリエンチン、Iori:イソオリエンチン
Mal(%):総アントシアニジン中のマルビジンの割合
実施例2及び3において作出された形質転換体(バラ品種「オーシャンソング」を宿主とする)について、それぞれの花弁の色彩について分光測色計CM-2022(ミノルタ株式会社)を用いて10度視野、D65光源で測定し、色彩管理ソフトSpectraMagicTM(ミノルタ株式会社)により解析を行った。
色相角度の平均値の比較ではCGT遺伝子がソバ由来(実施例3)のバラとイネ由来(実施例2)のバラの間で花弁の色相角度に違いは認められなかった。しかしながら、個体別にみるとソバ由来CGT遺伝子を導入したバラでは色相角度が315°以下を示した個体が多く、中でも294.5°を示す、これまでで最も青く変化した個体を取得した。以上の結果から、ソバ由来のCGT遺伝子を利用することにより、フラボン C-配糖体の生成量、特にモノ-C-配糖体の生成量が有意に増加し、これがアントシアニンとの共存により花弁の色彩が青く変化することが確認された。
Claims (11)
- ソバ由来CGT遺伝子又はそのホモログを含むベクターであって、
前記ソバ由来CGT遺伝子又はそのホモログが、
(1-a)配列番号11の塩基配列からなるポリヌクレオチド;
(1-b)配列番号11の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、(1-a)に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質と同様の酵素活性を有するタンパク質をコードし、かつ、(1-a)に記載のポリヌクレオチドと90%以上の同一性を有する、ポリヌクレオチド;
(1-c)配列番号12のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(1-d)配列番号12のアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び/又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、(1-c)に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質と同様の酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(1-e)配列番号12のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、(1-c)に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質と同様の酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
からなる群から選択される、ベクターであって、前記ソバ由来CGT遺伝子又はそのホモログにシロイヌナズナADH遺伝子由来非翻訳領域(5’-UTR)(配列番号15)又はシロイヌナズナHSPRO遺伝子由来非翻訳領域(5’-UTR)(配列番号13)が付加されており、前記ベクターが、
フラバノン 2-水酸化酵素(F2H)遺伝子又はそのホモログ、及びフラバノン 脱水酵素(FDH)遺伝子又はそのホモログ、及びフラボノイドF3’5’水酸化酵素(F3’5’H)遺伝子又はそのホモログ、及びメチル基転移酵素(MT)遺伝子又はそのホモログをさらに含み、ここで、
前記F2H遺伝子又はそのホモログが、
(2-a)配列番号5の塩基配列からなるポリヌクレオチド;
(2-b)配列番号5の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、(2-a)に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質と同様の酵素活性を有するタンパク質をコードし、かつ、(2-a)に記載のポリヌクレオチドと90%以上の同一性を有する、ポリヌクレオチド;
(2-c)配列番号6のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(2-d)配列番号6のアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び/又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、(2-c)に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質と同様の酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(2-e)配列番号6のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、(2-c)に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質と同様の酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、からなる群から選択され、
前記FDH遺伝子又はそのホモログが、
(3-a)配列番号9の塩基配列からなるポリヌクレオチド;
(3-b)配列番号9の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、(3-a)に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質と同様の酵素活性を有するタンパク質をコードし、かつ、(3-a)に記載のポリヌクレオチドと90%以上の同一性を有する、ポリヌクレオチド;
(3-c)配列番号10のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(3-d)配列番号10のアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び/又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、(3-c)に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質と同様の酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(3-e)配列番号10のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、(3-c)に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質と同様の酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、からなる群から選択され、
前記F3’5’H遺伝子又はそのホモログが、
(4-a)配列番号1の塩基配列からなるポリヌクレオチド;
(4-b)配列番号1の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、(4-a)に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質と同様の酵素活性を有するタンパク質をコードし、かつ、(4-a)に記載のポリヌクレオチドと90%以上の同一性を有する、ポリヌクレオチド;
(4-c)配列番号2のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(4-d)配列番号2のアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び/又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、(4-c)に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質と同様の酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(4-e)配列番号2のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、(4-c)に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質と同様の酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、からなる群から選択され、そして
前記MT遺伝子又はそのホモログが、
(5-a)配列番号3の塩基配列からなるポリヌクレオチド;
(5-b)配列番号3の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、(5-a)に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質と同様の酵素活性を有するタンパク質をコードし、かつ、(5-a)に記載のポリヌクレオチドと90%以上の同一性を有する、ポリヌクレオチド;
(5-c)配列番号4のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(5-d)配列番号4のアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び/又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、(5-c)に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質と同様の酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(5-e)配列番号4のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、(5-c)に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質と同様の酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、からなる群から選択され、前記MT遺伝子又はそのホモログにシロイヌナズナHSPRO遺伝子由来非翻訳領域(5’-UTR)(配列番号13)が付加されている、ベクター。 - 請求項1に記載のベクターを含む、形質転換植物又はその自殖もしくは他殖後代。
- 前記植物がバラ、キク、カーネーション又はユリから選択される、請求項2に記載の形質転換植物又はその自殖もしくは他殖後代。
- 前記植物がバラである、請求項3に記載の形質転換植物又はその自殖もしくは他殖後代。
- 請求項2~4のいずれか1項に記載の形質転換植物又はその自殖もしくは他殖後代の栄養繁殖体、植物体の一部、組織、又は細胞であって、請求項1に記載のベクターを含む、栄養繁殖体、植物体の一部、組織、又は細胞。
- 請求項2~4のいずれか1項に記載の形質転換植物又はその自殖もしくは他殖後代の切り花、又は該切り花から作成された加工品であって、請求項1に記載のベクターを含む、切り花、又は該切り花から作成された加工品。
- 青系花色を有する形質転換植物を作出するための方法であって、請求項1に記載のベクターを宿主植物に導入することにより、デルフィニジン型アントシアニンとフラボン モノ-C-配糖体を植物の細胞内で共存させる工程を含む、方法。
- 前記フラボン モノ-C-配糖体が、アピゲニン 6-C-グルコシド、ルテオリン 6-C-グルコシド、トリセチン 6-C-グルコシド、アピゲニン 8-C-グルコシド、ルテオリン 8-C-グルコシド、トリセチン 8-C-グルコシド又はそれらの誘導体である、請求項7に記載の方法。
- 前記デルフィニジン型アントシアニンが、マルビジン、デルフィニジン、ペチュニジン及びそれらの組み合せから成る群から選択される、請求項7又は8に記載の方法。
- 前記植物がバラ、キク、カーネーション又はユリから選択される、請求項7~9のいずれか1項に記載の方法。
- 前記植物がバラである、請求項10に記載の方法。
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