JP7434609B2 - 改変された免疫グロブリンFc領域 - Google Patents
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Description
この発明で使用される特定の用語の意味は、文献で使用される類似の用語の意味と異なっている場合がある。このような用語の定義は、この発明の文脈において、以下に提供される。
本明細書にわたり、簡単かつ明確にするために、様々な位置(EU番号付けシステムに従って)に1つ又は複数のアミノ酸の変更を含むヒトIgG1抗体のバリアントFc領域への言及が頻繁になされる。これは、本発明の範囲を限定することをまったく意図していない。IgG2、IgG3及びIgG4を含むヒトIgGの他のサブクラス又は他の種からのIgGのあらゆるサブクラスにおける等価な位置におけるアミノ酸残基が、所望の作用をもたらすために、同じようにして変更することができる。他の種としては、例えば、鳥類及び哺乳動物、例えば:霊長類、げっ歯類、ウサギ目、肉食動物、偶蹄類等が挙げられる。また、IgGの天然に存在するアロタイプ、加えて他の突然変異を含むバリアント、例えば、ヒトFcRnへの結合を改変するために、又は他の構造的又は機能的特性、例えば、安定性又は不要な不均質性の排除を改善するために導入され得るものも、本明細書の範囲内に含まれる。更に、本明細書は、無傷の抗体のバリアントFc領域に限定されず、他のあらゆるタンパク質、例えば:融合タンパク質、イムノアドヘシン、イムノサイトカイン、単鎖抗体、二重特異性抗体、多重特異性抗体、二重特異性T細胞エンゲージャー、抗体-薬物コンジュゲート及び酵素置換-Fc融合タンパク質(enzyme replacement-Fc fusion protein)内に含まれるバリアントFc領域も含む。加えて、本明細書は、無傷の、又は完全なバリアントFc領域に限定されず、その野生型の形態でFcγ受容体に結合することが可能と予想されるFc領域のいずれか一部を含むバリアント、例えばCγ2ドメイン、又はヒンジ領域とCγ2ドメインとの組合せも含む。したがって、文脈上可能であればどのような場合でも、用語「Fc領域」は、無傷のFc領域だけでなく、その野生型の形態でFcγ受容体に結合することが可能であると予想されるFc領域のあらゆる部分を含むと理解されるべきである。
多くの状況において、IgGのFcγ受容体への結合を低減させる、又は好ましくはなくすことが望ましく、これはそれらが媒介する生物学的作用が不要であり、有害な可能性があるためである(例えばWang 2018を参照)。例えば、抗体が抗原の活性を中和するのに使用される場合、細胞の応答の併存する活性化は、望ましくない可能性がある。しかしながら、Fc領域は、他の有用な特性、とりわけFcRnへの結合に基づいて長い半減期を提供するその能力を有する。この特色は、融合タンパク質の開発において使用され、それにおいてFc領域は、他の生物活性タンパク質に半減期の延長を付与する。それにもかかわらず、細胞の応答の活性化が望ましくない場合がある。それゆえに、研究者は、FcγRへの結合を選択的に低減させる突然変異を有するFcのバリアント形態を開発した。
様々な研究者が、ヒトIgG1 Fc領域のヒトFcγRへの結合における個々のアミノ酸残基の役割を探求するために、部位特異的変異誘発を使用してきた。表1に結果の非限定的な選択をまとめる。
したがって、前述のものから、IgG1 Fc領域において、突然変異によりFcγRへの結合が低減する可能性がある少なくとも30個の位置がある。しかしながら、受容体の全てへの結合が完全になくなっていることが示されたものは一つもなかった。より効果的に結合がなくなっているバリアントを同定する目的で、研究者は、異なる位置における突然変異の組合せを試験した。例えば、WO199958572、WO2006076594、WO2006047350、WO2006053301、WO2011066501、WO2013165690、WO2012130831、WO2014108483、US20060235208、US6194551、US8969526、US10011660;Xu 2000;Hezarah 2001、Shields 2001、Lin 2013;Dall'Acqua 2006、Oganesyan 2008、Schlothauer 2016、Tam 2017を参照されたい。
新生児Fc受容体(FcRn)は、上皮細胞で広く発現され、そこでFcRnは、IgGの輸送及び再利用の媒介に関与する(Kuo 2011)。IgGのFcRn媒介輸送は、細胞膜におけるIgGの流体相のピノサイトーシスから始まり、FcRnへの結合は、エンドソームの酸性条件下で起こる。そこからIgGは、逆の膜表面に経細胞輸送される場合もあるし(例えば胎盤を通過する輸送のために)、又は再利用されて元の膜表面に戻される場合もある。FcRnの活動の結果として、IgGは、それ以外の状況でそれが有するであろう半減期より一層長い半減期を有する。これは、Fc領域を含む治療剤の使用にとって明確な利点であり、Fcγ受容体(又はC1q)に結合するIgGの能力を低減し、FcRnへの結合に有害作用を与えないあらゆる改変が望ましい。実際に、多くの研究者が、薬物の半減期を増加させる目的でFcRnへの結合を強化しようとした(例えばDall'Acqua 2006;Zalevsky 2010)。FcRnの結合部位はCH2-CH3ドメインに配置されており、Fcγ受容体及びC1qの結合部位とは異なるため、受容体の一方のタイプの結合に影響を与えるが他方のタイプの結合に影響を与えない異なるアミノ酸の変更を同定することが考えられる。
バリアント免疫グロブリンの、FcγR及びFcRn等のFc受容体への結合を測定するのに、様々な異なる技術が使用されてきた。それらの例としては、可溶性組換えFc受容体を使用する酵素結合免疫検査法(ELISA)(例えばWO2000042072;Shields 2001)、Fc受容体をコードする遺伝子でトランスフェクトされた哺乳類細胞を使用するフローサイトメトリー(例えばWO2000042072;Shields 2001)、タグを有する可溶性組換えFc受容体を使用するAlphaScreen(登録商標)(ビーズベースの発光近接アッセイ)(例えばUS20060235208;WO2006047350、WO2011066501)、マルチプレックスマイクロスフェア(Luminex(登録商標))アッセイ(例えばBoesch)、可溶性組換えFc受容体と共にProteon(登録商標)システムを使用する表面プラズモン共鳴(例えばWO2013165690)、可溶性組換えFc受容体と共にBiacore(登録商標)システムを使用する表面プラズモン共鳴(例えばWO2011066501、WO2012130831;Schlothauer2016)が挙げられる。他の実験技術、及び前述の技術の他のインプリメンテーションもまた当業界において公知である。バリアント免疫グロブリン及びFc受容体の多種多様の実験技術、実験条件及び様々な調製が、FcγRへの結合をサイレンシングする目的に関して、突然変異の1つの特定の組合せが実際に別のものより有効かどうかを決定するために、異なる研究からの結果を確実に比較することを難しくするか又は不可能にしている。
補体成分1q(C1q)は、軸に取り付けられた球状のヘッドにアセンブルされた、それぞれ3つのタンパク質鎖の6つのコピーで構成されるタンパク質複合体である。これは、抗体に結合して、補体系の活性化をもたらす反応のカスケードを開始させる。
様々な研究者が、ヒトIgG1 Fc領域のヒトC1qへの結合における個々のアミノ酸残基の役割を探求するために、部位特異的変異誘発を使用してきた。表3に結果の非限定的な選択をまとめる。
したがって、前述のものから、IgG1 Fc領域において、突然変異によりC1qへの結合を低減する可能性がある少なくとも14個の位置がある。しかしながら、結合が完全になくなっていることが示されたものは一つもなかった。より効果的に結合がなくなっているバリアントを同定する目的で、研究者は、異なる位置における突然変異の組合せを試験した。例えば、Borrok 2017;Lin 2013;Vafa 2014;Schlothauer 2016を参照されたい。
バリアント免疫グロブリンのC1qへの結合を測定するために、様々な異なる技術が使用されてきた。それらの例としては、酵素結合免疫検査法(ELISA)(例えばHezarah 2001;Dall'Acqua 2006;Oganesyan 2008;Schlothauer 2016)、フローサイトメトリー(例えばKanda 2006)、マルチプレックスマイクロスフェア(Luminex)アッセイ(例えばBoesch 2014)、表面プラズモン共鳴(例えばBorrock 2017;Dall'Acqua 2006;Moore 2010)が挙げられる。他の実験技術、及び前述の技術の他のインプリメンテーションもまた当業界において公知である。バリアント免疫グロブリン及びFc受容体の多種多様の実験技術、実験条件及び様々な調製が、C1qへの結合をサイレンシングする目的に関して、突然変異の1つの特定の組合せが実際に別のものより有効であるかどうかを決定するために、異なる研究からの結果を確実に比較することを不可能にしている。
Fcバリアントの比較
FcγR又はC1qへの結合をサイレンシングする目的に関して、突然変異の1つの特定の組合せが実際に別のものより有効かどうかを決定するために、異なる公開された研究からの結果を確実に比較することは不可能である。それゆえに、実施例1に記載された通り、本発明者らは、当業界において公知の、ただし全て同じIgG1抗体に基づいたバリアントを表すバリアント免疫グロブリンのセットを調製した(表4)。ヒトFcγRへのへの結合を、実施例2に記載された通りに表面プラズモン共鳴によって測定した。驚くべきことに、これまでに公知のバリアントの全てが、これまでに、FcγRへの結合が、「完全に排除され、・・・検出不能なレベルに低減した」(WO2013165690)、「完全に不活性」(WO2014108483)、「完全に壊滅された」(Schlothauer 2016;Hezarah 2001)、「サイレント」(Tam 2017)又は「検出可能な結合がない」(Vafa 2014)のように記載された場合であっても、バックグラウンドを著しく超える応答で測定可能な程度のヒトFcγRIへの結合をもたらした(表8)。更に、実施例6で示されるように、L234A/L235A、L234F/L235E/P331S及びL234F/L235Q/K322Qを含むこれまでに公知のバリアントの一部もまた、ADCC及びADCPアッセイにおいて、バックグラウンドを著しく超える応答をもたらした(表20及び表21)。
本発明者らはここで、実施例1に記載された通りにFcバリアントの新規のセットを調製し、それらを公知のバリアントと比較した。結果から、本発明者らは、アミノ酸置換を組み合わせて、公知のバリアントよりヒトFcγRIへの結合のレベルが著しく低いバリアントFc領域をもたらすことができる少数のアミノ酸残基を同定することができた。本発明者らは、表面プラズモン共鳴(例えば実施例2を参照)を使用して、又はADCC又はADCPについては細胞ベースのアッセイ(例えば実施例6を参照)によって測定した場合に、ヒトFcγ受容体への検出可能な結合を実質的に低減させるか又は完全に壊滅させる2又は3つのアミノ酸置換を含むバリアントFc領域を同定した。ほとんどの場合、同じアミノ酸置換はまた、ELISA(例えば実施例4を参照)を使用して測定した場合に、ヒトC1qへの検出可能な結合も実質的に低減させるか又は完全に壊滅させる。記載しようとする実験的試験の一部のにおいて、アミノ酸置換を含むバリアントFc領域を含むタンパク質は、緩衝液のみを含有するブランク試料と比較されることになる。他の試験において、アミノ酸置換を含むバリアントFc領域を含むタンパク質は、参照タンパク質と比較されることになる。このようなケースにおいて、比較しようとするタンパク質は、比較試験の結果が有効であり得るためには、本質的に同じ細胞株及び本質的に同じ培養条件を使用して製造され、本質的に同じ方法で精製される。好ましくは、Fc領域以外の試験タンパク質及び参照タンパク質のあらゆる構成部分は、本質的に同一である。例えば、試験タンパク質が抗体である場合、試験タンパク質と参照タンパク質の両方は、好ましくは、同じ可変領域を有する。試験の目的に応じて、参照タンパク質は、天然に存在する(野生型)Fc領域(例えば配列番号1)を含んでいてもよいし、又はこれまでに記載されたFcバリアント、好ましくはL234A/L235A/P329G(LALAPG)(例えば配列番号2)に対応するアミノ酸の変更を有するバリアントFc領域を含んでいてもよい。
したがって、一部の態様において、
a)234位におけるアミノ酸置換若しくは235位におけるアミノ酸置換又は234位と235位の両方におけるアミノ酸置換、及び
b)236位におけるアルギニン(R)へのアミノ酸の変更
を含むバリアントFc領域を含むタンパク質であって、
タンパク質のヒトFcγRIへの結合は、参照タンパク質の結合と比較して有意に低減され、参照タンパク質は、アミノ酸置換L234A、L235A及びP329Gを含むバリアントヒトIgG1 Fc領域を含む、タンパク質が提供される。
a)234位におけるアミノ酸置換又は234位と235位の両方におけるアミノ酸置換;及び
b)236位におけるアルギニン(R)へのアミノ酸の変更
を含むバリアントFc領域を含むタンパク質であって、
タンパク質のヒトFcγRIへの結合は、参照タンパク質の結合と比較して有意に低減され、参照タンパク質は、アミノ酸置換L234A、L235A及びP329Gを含むバリアントヒトIgG1 Fc領域を含む、タンパク質
が提供される。
a)234位におけるアミノ酸置換若しくは235位におけるアミノ酸置換又は234位と235位の両方におけるアミノ酸置換、及び
b)236位におけるアルギニン(R)へのアミノ酸置換
を含み、
タンパク質のヒトFcγRIへの結合は、参照タンパク質の結合と比較して有意に低減され、参照タンパク質は、アミノ酸置換L234A、L235A及びP329Gを含むバリアントヒトIgG1 Fc領域を含む、タンパク質が提供される。
a)234位におけるアミノ酸置換又は234位と235位の両方におけるアミノ酸置換、及び
b)236位におけるアルギニン(R)へのアミノ酸置換
を含み、
タンパク質のヒトFcγRIへの結合は、参照タンパク質の結合と比較して有意に低減され、参照タンパク質は、アミノ酸置換L234A、L235A及びP329Gを含むバリアントヒトIgG1 Fc領域を含む、タンパク質が提供される。
一部の実施態様において、バリアントFc領域を含むタンパク質は、対応する野生型参照タンパク質と比較して、実質的に低減したADCC活性を呈示する。一部の実施態様において、バリアントFc領域を含むタンパク質のADCC活性は、対応する野生型参照タンパク質のADCC活性の、20%未満、好ましくは10%未満、5%未満、2%未満又は1%未満である。一部の実施態様において、バリアントFc領域を含むタンパク質のADCC活性は、アッセイ緩衝液のADCC活性と有意に異なっていない。一部の実施態様において、バリアントFc領域を含むタンパク質は、最大10μg/mLの濃度で、検出可能なADCC活性を有さない。一部の実施態様において、バリアントFc領域を含むタンパク質のADCC活性は、アミノ酸置換L234A、L235A及びP329Gを含むLALAPG参照タンパク質のADCC活性と有意に異なっていない。一部の実施態様において、バリアントFc領域を含むタンパク質のADCC活性は、アミノ酸置換L234A及びL235Aを含む参照タンパク質のADCC活性より有意に低い。一部の実施態様において、バリアントFc領域を含むタンパク質のADCC活性は、アミノ酸置換L234A及びL235Aを含む参照タンパク質のADCC活性の、50%未満、好ましくは20%未満、10%未満、5%未満、2%未満又は1%未満である。ADCC活性は、活性における差を検出するのに十分な感受性を有するあらゆる好適な方法によってしてもよく、例えば、実施例6に記載されたような細胞ベースの発光アッセイによって測定してもよい。
一部の実施態様において、バリアントFc領域を含むタンパク質は、対応する野生型参照タンパク質と比較して、実質的に低減したADCP活性を呈示する。一部の実施態様において、バリアントFc領域を含むタンパク質のADCP活性は、対応する野生型参照タンパク質のADCP活性の、20%未満、好ましくは10%未満、5%未満、2%未満又は1%未満である。一部の実施態様において、バリアントFc領域を含むタンパク質のADCP活性は、アッセイ緩衝液のADCP活性と有意に異なっていない。一部の実施態様において、バリアントFc領域を含むタンパク質は、最大10μg/mLの濃度で、検出可能なADCP活性を有さない。一部の実施態様において、バリアントFc領域を含むタンパク質のADCP活性は、アミノ酸置換L234A、L235A及びP329Gを含む参照タンパク質のADCP活性と有意に異なっていない。一部の実施態様において、バリアントFc領域を含むタンパク質のADCP活性は、アミノ酸置換L234A及びL235Aを含む参照タンパク質のADCP活性より有意に低い。一部の実施態様において、バリアントFc領域を含むタンパク質のADCP活性は、アミノ酸置換L234A及びL235Aを含む参照タンパク質のADCP活性の、50%未満、好ましくは20%未満、10%未満、5%未満、2%未満又は1%未満である。ADCP活性は、活性における差を検出するのに十分な感受性を有するあらゆる好適な方法によってしてもよく、例えば、実施例6に記載されたような細胞ベースの発光アッセイによって測定してもよい。
一部の実施態様において、バリアントFc領域を含むタンパク質は、対応する野生型参照タンパク質と比較して、実質的に低減したCDC活性を呈示する。一部の実施態様において、バリアントFc領域を含むタンパク質のCDC活性は、対応する野生型参照タンパク質のCDC活性の、20%未満、好ましくは10%未満、5%未満、2%未満又は1%未満である。一部の実施態様において、バリアントFc領域を含むタンパク質のCDC活性は、アッセイ緩衝液のCDC活性と有意に異なっていない。一部の実施態様において、バリアントFc領域を含むタンパク質は、最大10μg/mLの濃度で、検出可能なCDC活性を有さない。一部の実施態様において、バリアントFc領域を含むタンパク質のCDC活性は、アミノ酸置換L234A、L235A及びP329Gを含む参照タンパク質のCDC活性と有意に異なっていない。CDC活性は、活性における差を検出するのに十分な感受性を有するあらゆる好適な方法によって測定してもよく、例えば、51Cr放出アッセイ(例えばHale 1983)又は発光アッセイ(例えばNiles 2007)によって測定してもよい。
Fc領域を含む特定のタンパク質、とりわけ、特定のモノクローナル抗体(例えばムロモナブ、アレムツズマブ、セラリズマブ)は、ヒトにおいて、炎症性サイトカイン(例えばガンマ-インターフェロン、腫瘍壊死因子、インターロイキン-6)の放出に関連する毒物学的作用を誘発することが公知である。このような毒物学的作用(時には「サイトカインストーム」と呼ばれる)はしばしば、Fc領域のFcγ受容体への結合によって引き起こされるか、又はそれによって悪化する可能性がある。このような毒物学的作用を(程度の差はあっても)予測する様々なインビトロのアッセイが当業界において公知である(例えばFinco 2014;Grimaldi 2016;Vessilier 2015)。例えば、いわゆる「全血」アッセイにおいて、試験試料は、未分画の血液(好ましくはヘパリンで抗凝血処理された)とインキュベートされ、炎症性サイトカインの放出が測定される(例えばWing 1995;Wolf 2012)。代替として、試験試料は、末梢血単核細胞(PBMC)とインキュベートされてもよく、炎症性サイトカインの放出が測定される(例えばVessilier 2015)。炎症性サイトカインとしては、GM-CSF、IFNγ、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、TNFα又は炎症性応答に関連することが公知の他のサイトカインの一部又は全てを挙げることができる。一部のアッセイにおいて、試験試料は、例えば、マイクロプレートに結合させることによって(例えばFindlay 2010)又は上皮細胞上に(例えばFindlay 2011)固定させてもよい。他のアッセイにおいて、感受性は、高い密度でのPBMCの予備培養によって増加させることができる(例えばRomer 2011)。サイトカイン放出活性は、1時間~72時間の期間にわたり試験試料に曝露された細胞の培養上清中の1種又は複数のサイトカインの濃度を決定することによって測定してもよい。サイトカイン放出活性は、単一のドナー、又は1人より多くのドナーを使用して測定してもよいし、又はあらゆる人数のドナーの平均であってもよい。一部の実施態様において、バリアントFc領域を含むタンパク質は、野生型参照タンパク質と比較して、実質的に低減したサイトカイン放出活性を呈示する。一部の実施態様において、バリアントFc領域を含むタンパク質のサイトカイン放出活性は、対応する野生型参照タンパク質のサイトカイン放出活性の、20%未満、好ましくは10%未満、5%未満、2%未満又は1%未満である。一部の実施態様において、バリアントFc領域を含むタンパク質のサイトカイン放出活性は、希釈剤のサイトカイン放出活性より低いか又は有意に異なっていない。一部の実施態様において、バリアントFc領域を含むタンパク質のサイトカイン放出活性は、LALAPG参照タンパク質のサイトカイン放出活性と有意に異なっていない。サイトカイン放出活性は、例えば実施例9に記載された通りに、活性における差を検出するのに十分な感受性を有するあらゆる好適な方法によって測定してもよい。
タンパク質に対する免疫応答における重要な工程は、抗原提示細胞の表面上への提示のための、タンパク質分解性プロセシング及び主要組織適合複合体(MHC)クラスIIへのペプチドの結合を含む。このようなペプチド-MHC複合体は、CD4+T細胞上の特異的な受容体によって認識される可能性があり、その結果としてT細胞の活性化が引き起こされ、B細胞による抗体応答の補助が提供される。MHCクラスIIへの結合の高い可能性を有する新しいペプチドを作り出す傾向は、様々な方法によって決定することができる、このような決定としては、「インシリコ」の方法(例えばJensen 2018;Nielson 2007;Sidney 2008;Sturniolo 1999;Bryson 2010;Jawa 2013;King 2014)又は「インビトロ」の方法(例えばBrinks 2013;Jawa、2013;Joubert 2016)の両方が挙げられる。
哺乳類細胞によって発現される免疫グロブリンFc領域は、通常、N297でグリコシル化されており、製造プロセス、並びに特に宿主細胞の選択及び細胞培養条件に特徴的な異なるグリコフォームのスペクトルを呈示する(例えばJefferis 2005;Costa 2014;Werner 2007)。Fc領域を含むタンパク質によって呈示されるグリコフォームのスペクトルを特徴付けるための、当業界において公知の多くの方法がある(例えばReutsch 2015a ; Reutsch 2015bを参照)。一部の実施態様において、バリアントFc領域を含むタンパク質によって呈示されるグリコフォームのスペクトルは、対応する野生型参照タンパク質によって呈示されるグリコフォームのスペクトルと区別できない程度である。一部の実施態様において、バリアントFc領域を含むタンパク質によって呈示されるグリコフォームのスペクトルは、対応する野生型参照タンパク質によって呈示されるグリコフォームのスペクトルと有意に異なっていない。一部の実施態様において、バリアントFc領域を含むタンパク質によって呈示されるグリコフォームのスペクトルは、対応する野生型参照タンパク質によって呈示されるグリコフォームのスペクトルと実質的に異ならない。それぞれのケースにおいて、比較しようとするタンパク質は、本質的に同じ細胞株及び本質的に同じ培養条件を使用して製造され、本質的に同じ方法で精製される。実施例11に例を提供する。
医薬品の製造で使用しようとするタンパク質は、長期間均一であり安定であることが望ましい。アスパラギン(N)、システイン(C)、メチオニン(M)を含む特定のアミノ酸残基は、アスパラギンの脱アミド又はシステイン若しくはメチオニンの酸化等の翻訳後修飾に供される可能性があり、これが、望ましくない不均質性又は不安定を引き起こす可能性がある。特に脱アミドしやすいモチーフとしては、NG、NS、NH及びQGが挙げられる。他のアミノ酸置換、すなわちグリシン(G)及びプロリン(P)は、タンパク質主鎖を不安定化し、3次元構造を崩壊させる可能性がある。アスパラギン酸を異性化する傾向があるモチーフとしては、DG、DP及びDSが挙げられる。ペプチド結合を切断する傾向があるモチーフとしては、TS、KK、RK及びKRが挙げられる。一部の実施態様において、タンパク質は、アスパラギン(N)、システイン(C)又はメチオニン(M)を含まないアミノ酸置換を含む。一部の実施態様において、タンパク質は、グリシン(G)又はプロリン(P)を含まないアミノ酸置換を含む。一部の実施態様において、タンパク質は、NG、NS、NH、QG、DG、DP、DS、TS、KK、RK又はKR等の2アミノ酸のモチーフを作り出さないアミノ酸置換を含む。
)。又は更なる実施例として、抗原又は他のリガンド又は受容体への結合は、表面プラズモン共鳴、酵素結合免疫検査法、NanoBiT(登録商標)イムノアッセイ又は他の多くのタイプのリガンド結合アッセイによって測定することができる。安定性測定の例は、実施例7、実施例8及び実施例12に提供される。
Fc領域を含むタンパク質は、一般的に、FcRn受容体への結合により、インビボにおいて延長された半減期を有する。インビボにおける半減期を測定するための様々な方法は当業界において周知である(例えばLiu 2018を参照)。典型的には、それらは、好適な動物(例えばマウス又はラット)へのタンパク質の注射、好適なインターバルでの血液試料の収集、血漿(又は血清)におけるタンパク質の濃度の測定、及び得られたデータの数学的な分析を含む。半減期の他にも、例えば、分布容積、最大血漿濃度、曲線下面積及びクリアランス等の他の薬物動態パラメーターを決定してもよい。
一部の態様において、以下:1つ又は複数のFcγ受容体への結合、C1qへの結合、ADCC、ADCP、CDCのいずれか1つ又は複数を実質的に低減させることによって、Fc領域を含むタンパク質のFcによって誘導されるエフェクター機能を実質的に低減させる方法が提供される。この方法は、
a)234位におけるアミノ酸又は235位におけるアミノ酸又は234位と235位の両方におけるアミノ酸を置換する工程、及び
b)236位におけるアミノ酸をアルギニン(R)に変更する工程
を含み、タンパク質のヒトFcγRIへの結合は、アミノ酸置換L234A、L235A及びP329Gを含む参照タンパク質の結合と比較して有意に低減される。一部の実施態様において、得られたバリアントFc領域を含むタンパク質は、上記でより詳細に列挙された所望の特性、すなわち、(a)野生型参照タンパク質と比較して、FcRnと類似した、又はそれより大きい結合活性、(b)野生型参照タンパク質と比較して、実質的に低減したADCC、(c)野生型参照タンパク質と比較して、実質的に低減したCDC、(d)野生型参照タンパク質と比較して、実質的に低減した毒性、(e)野生型参照タンパク質と比較して、最小の免疫原性、(f)野生型参照タンパク質と比較して、不変のグリコシル化、(g)野生型参照タンパク質と比較して、類似した又は改善された、製造及び/又は貯蔵中の均一性及び/又は安定性、(h)野生型参照タンパク質と比較して、類似した薬物動態パラメーターの1つ又は複数を有する。
実施例2及び表8で示されるように、本発明者らは、驚くべきことに、同等なLALAPG参照タンパク質で見られるものより著しく低いFcγRIへの結合をもたらすアミノ酸置換の新しいセットを含むバリアントFc領域を含有するタンパク質を同定した(これまでFcγR及びC1q相互作用が「完全に壊滅された」と報告されているにもかかわらず。Schlothauer 2016を参照)。これらのアミノ酸置換の新しいセットはいずれも、LALAPG参照と比較してFcγRIへの結合を低減させるのに使用することができる。
一部の実施態様において、バリアントFc領域を作り出すように変更されているFc領域は、IgG1、IgG2、IgG3又はIgG4から選択することができる。一部の実施態様において、Fc領域は、IgG1である。ヒトにおいて、IgG1におけるL234、L235及びG236(EUの番号付け)に対応する野生型残基は、IgG2においてV234、A235、Δ236;IgG3においてL234、L235及びG236、並びにIgG4においてF234、L235及びG236である。IgG2は、236位に欠失を有し、これは、FcRnへの低減した結合及び低減した経胎盤輸送に関与する(Stapleton 2018)。一部の実施態様において、236に挿入されたArg残基は、IgG1の結合により類似するようにIgG2のFcRnへの結合を回復させるため、循環中のIgG2の半減期増加させることができる。他の実施態様において、236における欠失の保持は、IgG2のFcRnへの結合の低減を維持する。
一部の実施態様において、バリアントFc領域を作り出すように変更されているFc領域は、あらゆる哺乳類種からのものであってもよい。一部の実施態様において、変更されるFc領域は、マウス、ラット、ウサギ、アカゲザル又はカニクイザルから選択される。一部の実施態様において、変更されるFc領域は、あらゆるIgGサブクラスから選択される。一部の実施態様において、変更されるFc領域は、マウスIgG1、マウスIgG2a、マウスIgG2b、マウスIgG3、ラットIgG1、ラットIgG2a、ラットIgG2b又はラットIgG2cから選択される。
一部の実施態様において、上述した通りの、又は上述した方法から得られるバリアントFc領域を含むタンパク質のいずれかはまた、追加のアミノ酸の変更を含んでいてもよく、このような変更は、挿入、欠失又は置換であってもよいし、他の所望の特性、例えば(a)変更されたFcRnへの結合活性であって、より高くてもよいし、又はより低くてもよい、結合活性、(b)変更された薬物動態パラメーターであって、より遅いクリアランス又はより迅速なクリアランスを挙げることができる、薬物動態パラメーター、(c)変更された免疫原性であって、より高くてもよいし、又はより低くてもよい、免疫原性、(d)グリコシル化の変更又はグリコシル化の消失(e)製造及び/又は貯蔵中の改善された均一性及び/又は安定性、(f)ヘテロ二量体構造を形成する能力(例えば二重特異性抗体の生成のための)、(g)単量体構造のみを形成する能力、(h)多量体構造(例えば六量体)を形成する能力、(i)部位特異的なコンジュゲートを形成する能力、(j)抗原に結合する能力、又は当業界において公知の他のあらゆる所望の特性のいずれか1つ又は複数等をもたらすものでもよい。適切なアミノ酸の変更の組合せによって、これらの所望の特性の1つ又は複数を、バリアントFc領域を含むタンパク質と組み合わせることができることが想定される。
L351Y/T366Y/L368A/P395R/F405R/Y407M/K409A;L351S/T366R/L368H/P395K/F405E/Y407K/K409A;
L351K/T366S/P395K/F405R/Y407A/K409Y(Ying 2012);L351S/T366R/L368H/P395K(Ying 2014);S364N/Y407N/K409T、F405N/Y407T(Ishino 2013)等が挙げられる。したがって、一部の実施態様において、残基234、235及び236の1つ又は複数においてアミノ酸の変更を含むこれまでに記載されたバリアントFc領域のいずれかはまた、T394D、F408R、L351F/T366R/P395K/F405R/Y407E;F405Q、L351Y/T366Y/L368A/P395R/F405R/Y407M/K409A;L351S/T366R/L368H/P395K/F405E/Y407K/K409A、
L351K/T366S/P395K/F405R/Y407A/K409Y、L351S/T366R/L368H/P395K、S364N/Y407N/K409T、F405N/Y407Tから選択される置換を含んでいてもよい。
一部の実施態様において、上述した通りの、又は上述した方法から得られるバリアントFc領域を含むタンパク質のいずれかはまた、抗原-結合ドメインも含む。抗原-結合ドメインは、全長抗体、例えばキメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、非ヒト抗体又はそれらの断片であり得る。抗原-結合ドメインは、重鎖及び軽鎖可変領域の組合せを含んでいてもよいし、又は単鎖可変領域(scFv)を含んでいてもよいし、又は単一の可変領域を含んでいてもよい。抗原-結合ドメインは、ダイアボディ、Fab断片又はF(ab」)2断片であり得る。バリアントFc領域を含むタンパク質は、それ自体、全長抗体、例えばキメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体であり得る。このようなタンパク質は、Fc領域を含むという条件で、二重特異性抗体、多重特異性抗体、又は当業界において公知の他のあらゆる種類の抗体であり得る。抗原-結合ドメインは、非免疫グロブリン足場(例えばアドネクチン、affibody(登録商標)、affilin(登録商標)、affimer(登録商標)、alphabody(登録商標)、anticalin(登録商標)、アビマー(avimer)、darpin(登録商標)、fynomer(登録商標)、グルボディ(glubody)、ノッチン(knottin)、クニッツドメイン、monobody(登録商標)、ナノクランプ(nanoclamp)、テトラネクチン(例えばSimeon 2018を参照)から得てもよい。
一部の実施態様において、上述した通りの、又は上述した方法から得られるバリアントFc領域を含むタンパク質のいずれかは、融合タンパク質である。このような融合タンパク質は、いずれかの所望の特性を有する1つ又は複数の追加のドメインを含んでいてもよい。例えば、追加のドメインは、結合タンパク質、受容体、酵素又はサイトカインであり得る。追加のドメインは、例えば原核生物、真核生物、植物、動物、哺乳動物、ヒト等のあらゆる源から得てもよいし、又は合成的に得てもよい。多数のこのような融合タンパク質は、当業界において公知であり、その例としては、例えば、エタネルセプト、アレファセプト、アバタセプト、リロナセプト、ロミプロスチム、ベラタセプト、アフリベルセプトが挙げられる(Beck 2011;Jafari 2017)。一部の実施態様において、バリアントFc領域は、サイズ、溶解性、発現収量、及び/又は血清中半減期を増加させることが望ましいポリペプチドに融合されている。一部の実施態様において、バリアントFc領域は、ポリペプチドの精製及び/又は検出のためのタグとしてポリペプチドに融合されている。
一部の実施態様において、上述した通りの、又は上述した方法から得られるバリアントFc領域を含むタンパク質のいずれかは、コンジュゲートしたタンパク質であってもよい。このようなコンジュゲートしたタンパク質は、いずれかの所望の特性を有する1つ又は複数の追加の成分を含んでいてもよい。例えば、追加の成分は、結合タンパク質、受容体、酵素、サイトカイン、毒素、薬物、ハプテン、標識、キレート剤、放射性同位体、親和性タグ、リンカー、ペプチド、核酸又は炭水化物であってもよい。このような追加の成分は、当業界において公知のあらゆる方法によってバリアントFc領域を含むタンパク質に付着されていてもよい。
一部の実施態様において、上述した通りの、又は上述した方法から得られるバリアントFc領域を含むタンパク質のいずれかは、化学合成によって生産してもよいし、又は好ましくは組換え発現技術によって生産してもよい。
a)組換えタンパク質のアミノ酸配列を設計する工程。それが抗体、抗体断片又は抗体ミメティックからの抗原-結合ドメインを含むようになされる場合、抗原-結合ドメインの配列は、タンパク質のシーケンシング、又はそれをコードするDNA又はRNAのシーケンシングのいずれかによって決定される。組換えタンパク質が、自然源由来の1つ又は複数のドメインを含むことになる場合、このようなドメインの配列は、適切なデータベースから得てもよい。タンパク質ドメインは、好適なペプチドリンカー、典型的にはアミノ酸の短いフレキシブルなストリングによって接続されてもよい。所望のアミノ酸の変更は、設計された配列に導入されてもよい。
一部の態様において、残基234及び/又は235におけるアミノ酸置換及び残基236におけるArgのアミノ酸置換又は挿入を含むバリアントFc領域を含むタンパク質をコードする核酸が提供される。コードされたタンパク質はまた、上述した機能特性及び/若しくは追加のアミノ酸の変更のいずれか又はそれらのあらゆる組合せを有していてもよい。核酸は、DNAであってもよいし、又はRNAであってもよい。これは、当業界において公知のあらゆる好適な方法によって得てもよく、そのヌクレオチド配列は、当業界において公知のあらゆる好適な方法によって決定してもよい。
一部の態様において、残基234及び/又は235におけるアミノ酸置換並びに残基236におけるArgのアミノ酸置換又は挿入を含むバリアントFc領域を含むタンパク質をコードする核酸を含むベクターが提供される。コードされたタンパク質はまた、上述した機能特性及び/又は追加のアミノ酸の変更のいずれか又はそれらのあらゆる組合せを有していてもよい。一部の実施態様において、ベクターは、好適な宿主細胞に導入されると、タンパク質の発現を引き起こすことができる。一部の実施態様において、ベクターは、自己複製する染色体外ベクターである。一部の実施態様において、ベクターは、宿主細胞ゲノムに統合することができる。発現ベクターは、宿主細胞型に適合するように構築される。したがって、発現ベクターは、本発明において利用され、その例としては、これらに限定されないが、細菌、酵母、植物、昆虫又は哺乳類細胞における、加えて、例えばトランスジェニック動物又は植物の生成によるインビボの系における、バリアントFc領域を含むタンパク質の発現を可能にするものが挙げられる。当業界において公知のように、本発明のタンパク質の発現にを利用することができる様々な発現ベクターが、商業的に、又はそれ以外の方法で入手可能である。一部の実施態様において、ベクターは、ウイルスである。一部の実施態様において、ベクターは、インビボでヒト細胞に感染して、本発明のタンパク質の発現を引き起こすことが可能なウイルスである。一部の実施態様において、ベクターは、腫瘍溶解性ウイルスである。当業界において周知の通り、あらゆる発現ベクターを、あらゆる好適なプロモーター、エンハンサー又は他の発現を容易にするエレメントと関連させることができる。
一部の態様において、残基234及び/又は235におけるアミノ酸置換及び残基236におけるArgのアミノ酸置換又は挿入を含むバリアントFc領域を含むタンパク質を生産することができる細胞が提供される。好適な宿主細胞の例としては、細菌、酵母、植物若しくは昆虫細胞、又はNS0、CHO、PER.C6又はHEK等の哺乳類細胞が挙げられる。代替として、宿主細胞は、組換えタンパク質の生産に適した他のあらゆる細胞型であってもよい。一部の実施態様において、宿主細胞は、細胞ゲノムに安定して組み込まれる、バリアントFc領域を含むタンパク質をコードする核酸を含む。他の実施態様において、宿主細胞は、バリアントFc領域を含むタンパク質をコードする、統合されていない核酸、例えばプラスミド、コスミド、ファージミド、又は直鎖状発現エレメントを含む。
一部の態様において、本発明は、本明細書において態様及び実施態様のいずれかで定義されたバリアントFc領域を含むタンパク質を含む医薬組成物を提供する。医薬組成物は、当業界において公知の従来の技術(例えばRemington 1995;Shire 2009を参照)に従って、医薬的に許容される担体、希釈剤、アジュバント及び/又は賦形剤を用いて製剤化されてもよい。医薬的に許容される担体、希釈剤、アジュバント及び賦形剤は、本発明のタンパク質及び選ばれた投与様式にとって好適なものであるべきである。適性は、所望の生物学的な特性(例えば抗原又は受容体のいずれかへの結合活性、安定性、薬物動態パラメーター)に著しい負の影響がないこと、及び組成物が投与されることになる対象に対して毒性がないことに基づいて決定される。医薬組成物における活性成分(この発明のタンパク質を含む)の量は、所望の治療応答を達成するのに効果的な量が得られるように変更することができる。選択された量は、活性成分の薬物動態学的特性、投与の経路及びタイミング、処置されている患者の年齢、性別、体重及び医学的状態、並びに当業界において周知の類似した要因によって決めることができる。医薬組成物は、あらゆる非経口経路(例えばによる注射又は輸注)によって投与されてもよい。
一部の態様において、本発明は、医薬として使用するための、本明細書に記載されるあらゆる態様又は実施態様で定義されるタンパク質、例えば抗体、又は医薬組成物を提供する。別の態様において、本発明は、疾患の処置における使用のための、本明細書に記載されるあらゆる態様又は実施態様で定義されるタンパク質、例えば抗体、又は医薬組成物を提供する。別の態様において、疾患を有する対象を処置する方法であって、有効量の本明細書に記載されるあらゆる態様又は実施態様で定義されるタンパク質、例えば抗体、又は医薬組成物を対象に投与する工程を含む、方法が提供される。この発明の抗体又はタンパク質は、いずれの特定の詳細又は様式に限定されないため、処置され得る疾患の範囲は極めて広範囲である。しかしながら、好適な疾患の適応症の選択における共通の要因は、Fcγ受容体に結合し、炎症反応を引き起こしたり、又は有害作用を引き起こす可能性がある他のエフェクター機能と関与したりする可能性があることが、医薬にとって望ましくないと予想されるという点である。このような疾患としては、例えば、血管浮腫、関節炎、喘息、アトピー性皮膚炎、自己免疫疾患、がん、キャッスルマン病、凝血障害、クローン病、クリオピリン関連周期性症候群、糖尿病、薬物毒性、湿疹、移植片対宿主病、高コレステロール血症、低リン酸血症、感染性疾患、虚血性心疾患、黄斑変性症、多発性硬化症、筋肉の喪失、骨粗鬆症、発作性夜間ヘモグロビン尿症、原発性血球貪食性リンパ組織球症、乾癬、敗血症、鎌状赤血球症、卒中、全身性エリテマトーデス、血小板減少性紫斑病、移植、潰瘍性大腸炎、又はヒト対象において治療用モノクローナル抗体又はFc融合タンパク質が使用若しくは試験されたことがあるか、又は現在使用若しくは試験されている他の疾患適応症が挙げられる。一部の環境において、この発明のタンパク質の使用により得られる望ましくない反応又は有害反応における低減(この発明のアミノ酸の変更を有さない類似したタンパク質と比較して)は、それ以外の状況で、この発明のアミノ酸の変更を有さない類似したタンパク質に関して安全又は慎重であるとみなされると予想される用量より、本発明のタンパク質の、より高い用量、より高頻度の用量又はより多くの用量の使用を許容する。したがってこの発明のタンパク質は、この発明のアミノ酸の変更を有さない類似したタンパク質より高い治療指数を有することが予測される。
一部の態様において、本発明は、調査又は診断試験又は品質管理試験における使用のための、本明細書に記載されるあらゆる態様又は実施態様で定義されたタンパク質、例えば抗体、又は組成物を提供する。したがって、本発明は、本明細書に記載されるタンパク質を使用する、調査及び診断方法並びに品質管理方法並びに組成物を提供する。このような方法及び組成物は、疾患を検出又は同定するため、処置の進行をモニターするため、処置後のステータスを評価するため、処置後に再発をモニターするため、疾患を発症させるリスクを評価するため、インビトロにおける生物学的薬物の活性に関する試験等のために、使用することができる。一部の態様において、診断方法又は組成物は、例えばこの発明の抗体又はタンパク質によって認識された抗原のレベルを検出又は測定するために、エクスビボで使用される。他の態様において、診断方法又は組成物は、例えばこの発明の抗体又はタンパク質によって認識された抗原の体内への内在化を決定するために、インビボにおいて使用される。この発明の抗体又はタンパク質は、いずれの特定の詳細又は様式に限定されないため、調査、品質管理及び診断試験の範囲は極めて広範囲であり、公知の、又はまだ発見されていないほとんど全ての抗原性標的を包含していてもよく、当業界において公知のあらゆる関連技術、例えば、酵素結合免疫検査法、細胞ベースのアッセイ、ラジオイムノアッセイ、蛍光アッセイ、フローサイトメトリー、表面プラズモン共鳴、化学発光、電気化学発光、クロマトグラフアッセイ、均一系イムノアッセイ(例えばAlphaLISA(登録商標)、Lumit(登録商標)、CEDIA(登録商標))、免疫組織学的アッセイ、ウェスタンブロット、免疫沈降、ラテラルフロー試験等を利用することができる。一部の態様において、本発明の抗体又はタンパク質は、選択された試験システムでの検出に好適な成分を含むコンジュゲートしたタンパク質である。一部の態様において、本発明の抗体又はタンパク質は、インビボの画像診断試験における使用のために放射標識されている。しかしながら、試験又は組成物の選択及び設計における共通の要因は、本発明の抗体又はタンパク質のFcγ受容体又はC1qへの不要な結合、又はそれ以外の理由でアッセイ干渉又は偽陽性若しくは偽陰性応答を引き起こす可能性がある他のエフェクター機能に携わることを回避することへの切望である。この発明のタンパク質に関する調査、品質管理及び診断用途としては、例えば、細胞への結合を測定するあらゆる種類の試験、又はFcγ受容体を提示させることができるタンパク質アレイが挙げられる。このような受容体への結合は、「偽陽性」応答を生じる可能性がある。このような不要な結合は、この発明のタンパク質の使用によって低減したり又はなくしたりすることができる。この発明のタンパク質の他の試験用途としては、例えば、この発明のタンパク質が、そのFcγ受容体又はC1qへの結合が欠如しているために対照試料として使用されるあらゆる種類の試験が挙げられる。
バリアントFc領域を含む抗体の生産
1.1 設計、発現及び精製
野生型ヒトIgG1重鎖定常領域(配列番号4)又はそのバリアントをコードするコドン最適化された合成遺伝子を、Genewiz(登録商標)によってpUC57-Kanベクター中に提供した。精製されたDNAをNheI/NotI制限酵素で消化し、pUV哺乳類発現ベクターへのライゲーションのために遺伝子を抽出した。同様に、ヒトカッパ軽鎖定常領域(配列番号5)のためのコドン最適化された合成遺伝子をpUVベクターにライゲートした。抗CD20リツキシマブのVH及びVL可変領域(配列番号6及び配列番号7)、抗CD3ムロモナブ(配列番号8及び配列番号9)又は抗CD52アレムツズマブ(配列番号10及び配列番号11)をコードする合成遺伝子を、Genewiz(登録商標)によって、クローニングのために5'及び3'末端におけるNheI及びAvaI制限部位と共に提供した。VH遺伝子を消化し、切り出し、野生型ヒトIgG1重鎖pUVベクターにライゲートした。VL遺伝子を消化し、切り出し、ヒトカッパ軽鎖pUVベクターにライゲートした。バリアントを作り出すために、バリアントFc領域を含有する合成遺伝子を、5'及び3'末端におけるKasI及びSacII制限部位と共に合成し、消化し、切り出し、抗CD20の免疫グロブリン重鎖(配列番号12)をコードする現存するベクターにライゲートした。抗CD3重鎖(配列番号14)又は抗CD52重鎖(配列番号16)のバリアントを、適切なVH可変領域をNheI及びAvaIで消化し、続いて切り出し、同様にNheI及びAvaIで消化して、抗CD3又は抗CD52での置き換えのために抗CD20(canti-CD20)VH配列を除去した抗CD20バリアント重鎖ベクターにライゲートすることによって生成した。類似したプロセスを使用して、野生型ヒトIgG2(配列番号18)、ヒトIgG4(配列番号19)、マウスIgG2a(配列番号20)、ラットIgG2b(配列番号22)又はウサギIgG(配列番号24)のバリアントを作り出した。ヒトIgG4のケースにおいて、Fc受容体への結合を改変するためになされたアミノ酸の変更に加えて、抗体構造を安定化するために追加のアミノ酸置換S228Pを導入した(Angal 1993)。マウス、ラット又はウサギ抗体の発現のために、抗CD20VL遺伝子を、関連カッパ軽鎖定常領域をコードする遺伝子(配列番号21、配列番号23又は配列番号25)とライゲートした。図1に、本明細書において使用される野生型IgG Fc領域のアミノ酸配列及びアミノ酸の変更の部位を例示する。最終的な挿入物の配列を、サンガーシーケンシングによって確認した。
代表的なCD3及びCD52抗体の抗原結合特性を、酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)によって試験した。全ての工程を室温(18~22℃)で行った。96ウェルマイクロプレート(Sigma社カタログ番号M9410-ICS)に、(a)PBS中1μg/mLの、CD3D/CD3Eヘテロ二量体(Sino Biologicals社カタログ番号CT038-H2508H)、又は(b)PBS中5μg/mLの、ヒツジFc-CD52融合タンパク質(Absolute Antibody社カタログ番号PR00205)のいずれかの50μLを添加し、およそ2時間振盪しながらインキュベートした。コーティング抗原を除去し、200μLの1%(w/v)カゼイン及び0.05%(v/v)プロクリンを含有するPBS(ブロック緩衝液)を添加し、およそ3時間インキュベートした。プレートを、0.05%(v/v)のTween 20を含有するPBS(洗浄緩衝液)で濯ぎ、ブロック緩衝液で希釈して5μg/mLの最終濃度にした試験試料を添加した。プレートをおよそ1時間振盪しながらインキュベートし、次いで洗浄緩衝液で濯いだ。HRP標識ウサギ抗ヒトIgG(Sigma社カタログ番号A8972)を、ブロック緩衝液で1:10,000に希釈し、100μLを各ウェルに添加した。プレートを、およそ2.5時間振盪しながらインキュベートし、次いで洗浄緩衝液で4回、水で2回洗浄した。100μLの3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン液体基質、超高感度(TMB)(Abcam社カタログ番号ab171523)を添加し、プレートをおよそ10分間インキュベートした。50μLの1M硫酸を添加して、反応を止め、マイクロプレート分光光度計(Anthos Labtec HT)を使用して、吸光度を、450nmで、620nmを引いて読んだ。各試料を4連で試験した。平均を計算し、陰性対照(緩衝液単独)の平均応答を引いた。表6に結果を示す。CD3バリアント抗体の全てが、CD3抗原への陽性結合をもたらし、CD52バリアント抗体の全てが、CD52抗原への陽性結合をもたらした。特異性対照として、野生型CD3抗体のCD52への、又は野生型CD52抗体のCD3への有意な結合はなかった。
Fcγ受容体への結合
2.1 ヒトFcγRIへの結合に関するバリアントのパネルのスクリーニング
結合分析を、Biacore(登録商標)T200対照ソフトウェアを備えたBiacore(登録商標)T200装置を使用した25℃での表面プラズモン共鳴によって行った。泳動緩衝液(HBS-EP+)は、0.15MのNaCl、3mMのEDTA、及び0.05%v/vの界面活性剤P20を含有する0.01MのHEPES pH7.4からなっていた。分析中、試料区画を4℃で保持した。方法を、Biacore(登録商標)T200装置ハンドブックに記載された通りの製造元の標準的な方法ウィザードを使用して試行した。
培養上清のスクリーニングの結果に基づいて、低いレベルのFcγRIへの結合をもたらすバリアントを、精製された抗体としての更なる分析のために選択した。結合分析を、Biacore(登録商標)T200対照ソフトウェアを備えたBiacore(登録商標)T200装置を使用した25℃での表面プラズモン共鳴によって行った。試料区画を5℃で保持した。泳動緩衝液(HBS-EP+)は、0.15MのNaCl、3mMのEDTA、及び0.05%v/vの界面活性剤P20を含有する0.01MのHEPES pH7.4からなっていた。方法を、Biacore(登録商標)T200装置ハンドブックに記載された通りの製造元の標準的な方法ウィザードを使用して試行した。
非常に低いヒトFcγRIへの結合をもたらした新しいバリアントを代表するアミノ酸の変更L234Q/L235S/G236Rを有するバリアント抗体を、マウス、ラット及びウサギFcγRIへの結合に関して対照のセットと比較した。結合分析を、ヒトFcγRI、マウスFcγRI(Sino Biological社カタログ番号50086-M08H)、ラットFcγRI(Sino Biological社カタログ番号80016-R08H)又はウサギFcγRI(Sino Biological社カタログ番号65010-T08H)のいずれかを各5μg/mLでチップに入れたことを除いて実施例2.2に記載された通りに行った。前述したように、結合応答を、泳動緩衝液単独からなるブランク試料によって得られた応答を引くことによって補正した。表10に結果を示す。前述したように、L234Q/L235S/G236Rバリアントは、ヒトFcγRIへの結合に関して、LALAPG参照より実質的に低い応答をもたらした(72.9RUと比較して、2.0RU)。これはまた、それより実質的に低いウサギFcγRIへの結合ももたらした(5.6RUと比較して0.9RU)。いずれの試料もマウス又はラットFcγRIへの測定可能な結合を示さなかった。
非常に低いヒトFcγRIへの結合をもたらした新しいバリアントを代表するアミノ酸の変更L234Q/L235S/G236Rを有するバリアント抗体を、ヒトFcγRII及びヒトFcγRIIIの様々な形態への結合に関して対照のセットと比較した。結合分析を、ヒトFcγRIIA(R131、Sino Biological社カタログ番号10374-H08H)、ヒトFcγRIIB(Sino Biological社カタログ番号10259-H08H)、ヒトFcγRIIIA(F158、Sino Biological社カタログ番号10389-H08H)又はヒトFcγRIIIB(NA2アロタイプ、Sino Biological社カタログ番号11046-H08H)のいずれかをチップに入れたことを除いて実施例2.2に記載された通りに行った。前述したように、結合応答を、泳動緩衝液単独からなるブランク試料によって得られた応答を引くことによって補正した。表11に結果を示す。この実験において、L234Q/L235S/G236RバリアントもLALAPG参照抗体も、ヒトFcγRのいずれかへの測定可能な結合を示さなかった。
追加の研究を行って、以下の突然変異:L234G/L235S/G236R、L234S/L235T/G236R、L234S/L235T/G236R、L234S/L235V/G236R、L234T/L235Q/G236R、L234T/L235T/G236R、L234A/L235A(LALA)、L234A/L235A/P329G(LALAPG参照)及びN297Q(アグリコシル)を有するCD20、CD3及びCD52 IgG1抗体の結合を測定した。結合を、セクション2.2に記載された通りに、Biacore(登録商標)分析によって、以下の受容体:ヒトFcγRI、ヒトFcγRIIa R131対立遺伝子、ヒトFcγRIIb、ヒトFcγRIIIa F158対立遺伝子、ヒトFcγRIIIa V158対立遺伝子、ヒトFcγRIIIb NA2対立遺伝子、マウスFcγRI、ラットFcγRIを使用して測定した。前述したように、これまでに公開されたバリアントLALA、LALAPG及びアグリコシルは全て、陰性対照を有意に超えるFcγRIへの結合をもたらした。LALAバリアントも、陰性対照を有意に超える、FcγRII対立遺伝子R131及びFcγRIIIaの両方の対立遺伝子への結合をもたらした。アグリコシルバリアントは、陰性対照を有意に超えるマウス及びラットFcγRIの両方への実質的な結合をもたらした。対照的に、FcγRの全てへの新しいバリアントの全ての結合を陰性対照の結合を有意に超えなかった。
FcRnへの結合
3.1 表面プラズモン共鳴によるFcRnへの結合
非常に低いヒトFcγRIへの結合をもたらした新しいバリアントを代表するアミノ酸の変更L234Q/L235S/G236Rを有するバリアント抗体を、ヒト及びサルFcRnへの結合に関して対照のセットと比較した。結合分析を、5μg/mLでのヒトFcRn(R&D Systems社カタログ番号8639-Fc)又は2μg/mLでのカニクイザルFcRn(Sino Biological社カタログ番号CT031-C08H)、及び全ての試料の希釈にも使用され、酢酸でpH6.0に調整された泳動緩衝液(HBS-EP+)のいずれかをチップに入れたことを除いて実施例2.2に記載された通りに行った。ヒトFcRnの結合を2回測定した。前述したように、結合応答を、泳動緩衝液単独からなるブランク試料によって得られた応答を引くことによって補正した。表13に結果を示す。試料の全ては、ヒト及びカニクイザルFcRnの両方に、実質的な全体的に類似した結合をもたらした。
溶液中のFcRnへの結合を測定する代替の方法は、発光アッセイを使用する。NanoBiT(登録商標)FcRnイムノアッセイ(Promega社)は、ヒトFcRnと抗体を含むFcタンパク質との間の相互作用を測定するための均一系(洗浄なし)競合アッセイである。LgBiT(トレーサー-LgBiT)で標識されたヒトIgGは、トレーサーとして使用される。ストレプトアビジン-SmBiTに付着したC末端ビオチン化FcRn(FcRn-SAv-SmBiT)は、標的として使用される。IgGを含有しない試料の存在下で、トレーサー-LgBiTは、FcRn-SAv-SmBiT標的に結合し、結果として最大の発光シグナルをもたらす。IgGを含有する試料の場合、標識されていないIgGは、標的への結合に関してトレーサー-LgBiTと競合すると予想され、結果として発光シグナルにおける濃度依存性の減少が起こる。NanoBiT(登録商標)FcRnイムノアッセイキット(Promega社カタログ番号CS53019A)を使用して実験を製造元の説明書に従って行った。試料をオフラインプレートで希釈した;25μLの各試験試料(PBS中1mg/mL)を、2.5μLのpH調整緩衝液及び72.5μLのFcRnアッセイ緩衝液と混合して、pH6.0で250μg/mLの濃度を得た。陽性対照抗体(ヒトIgG)の4倍希釈物を4mg/mLから開始して調製した。25μLのトレーサー-LgBiTを、白色のマイクロプレート(Sigma社カタログ番号CLS3912)の各ウェルに、続いて25μLの試料(2連)に添加した。プレートをプレート振盪機上で短時間混合し、50μLのストレプトアビジン-SmBiTに加えてhFcRn-AviTagを各ウェルに添加した。プレートを、振盪機上で、室温で2.5時間インキュベートした。25μLのFcRn NanoGlo(登録商標)基質を添加し、5分後、発光を、Veritasマイクロプレートルミノメーター(Turner BioSystems社)で測定した。図2に検量線を示す。生データを、5-パラメーターロジスティック方程式にフィッティングし、試験試料の基準濃度を、標準曲線での補間法によって計算した。基準濃度は、同じ阻害をもたらすと予想される陽性対照抗体の濃度を示す。平均の結果は、野生型参照の基準濃度のパーセンテージとして表し、表16に示される。
C1qへの結合
ヒトC1q(Sigma社カタログ番号20476)を、Lightning-Link(登録商標)HRPコンジュゲーションキット(Innova Biosciences社カタログ番号701-0003)を以下のように使用してホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)にカップリングした:2μLのLightning-Link(登録商標)モディファイヤーを、1.15mg/mLで20μLのC1qと穏やかに混合した。混合物を、凍結乾燥したLightning-Link(登録商標)HRP(最大40μgのタンパク質まで十分である)に添加し、穏やかに混合した。混合物を4℃で3時間インキュベートした。2μLのLightning-Link(登録商標)クエンチャーを添加し、4℃で30分インキュベートした。得られたHRP標識C1qを、1%カゼインを含有するリン酸緩衝生理食塩水(PBS)(ブロック緩衝液)で20μg/mLに希釈し、4℃で貯蔵した。
MHCクラスIIへの可能性がある結合のインシリコの評価
ヒト主要組織適合複合体クラス2(MHCクラスII)に結合する理論上の能力を有するペプチドを生じるバリアントFc領域の可能性を、http://tools.iedb.org/mhcii/(2019年10月17日にアクセス)で入手可能な免疫エピトープデータベース(Immune Epitope Database;IEDB)(Fleri 2017)によって提供されるMHC-II結合予測ツールを使用して評価した。予測方法は、IEDB推奨のバージョン2.22であった。これは、分子に関して何らかの対応する予測変数が利用可能な場合、NN-アライン(Jensen 2018)、SMM-アライン(Nielson 2007)、CombLib(Sidney 2008)及びSturniolo(Sturniolo 1999)を組み合わせたコンセンサス方法、バージョン2.22を使用しており、それ以外の場合、NetMHCIIpan(Jensen 2018)を使用した。
ADCC及びADCPにおける活性
6.1 FcγRIIIAを使用したADCC
抗体を、ADCCレポーターバイオアッセイ(Promega社カタログ番号G7015)を使用して、ADCCに従事するその能力に関して評価した。このキットは、CD20抗原を発現するRaji標的細胞と、FcγRIIIA受容体、V158(高親和性)バリアント及びホタルルシフェラーゼの発現を駆動できる活性化T細胞核内因子(NFAT)応答エレメントを安定して発現する操作されたJurkatエフェクター細胞とを含有する。これは、ADCC経路における初期応答、すなわちNFATを介した遺伝子転写の活性化の高感度測定を可能にする。実験を製造元の説明書に従って行った。標的細胞(Promega社カタログ番号G960A)及びエフェクター細胞(Promega社カタログ番号G701A)及び試料希釈物を全て、4%低IgG血清(Promega社カタログ番号G711A)を含有するRPMI1640培養培地(Promega社カタログ番号G708A)(アッセイ緩衝液)中で調製した。75μLのアッセイ緩衝液を、白色の平底マイクロプレート(Costar社カタログ番号3912)の端のウェルに添加し、25μLの標的細胞懸濁液を中央のウェルに添加した。必要に応じて試料希釈物をオフラインのプレートで調製した;25μLをアッセイプレートの中央のウェルに移し、プレート振盪機上で混合した。25μLのエフェクター細胞懸濁液を添加し、混合し、プレートを、37℃、5%CO2でおよそ6時間インキュベートし、次いで室温でおよそ15分間平衡化させた。ルシフェラーゼアッセイ基質(Promega社カタログ番号G720A)を、室温に平衡化したルシフェラーゼアッセイ緩衝液(Promega社カタログ番号G719A)の添加によって再構成し、75μLをマイクロプレートの中央のウェルに添加した。10分以内に、発光を、マイクロプレートルミノメーター(Promega社 Glomax(登録商標)96)を使用して測定した。
抗体を、ADCPレポーターバイオアッセイ(Promega社カタログ番号G9901)を使用して、ADCPに従事するその能力に関して評価した。このキットは、CD20抗原を発現するRaji標的細胞と、FcγRIIA受容体、H131バリアント及びホタルルシフェラーゼの発現を駆動できる活性化T細胞核内因子(NFAT)応答エレメントを安定して発現する操作されたJurkatエフェクター細胞とを含有する。アッセイを、製造元の説明書に従って、実施例6.1に記載された通りに、FcγRIIA-Hエフェクター細胞(Promega社カタログ番号G988A)を使用して行った。実験を1回行い、各試料は2連で試験した。正規化された応答を、実施例6.1に記載された通りに計算した。図4に野生型参照抗体(試料2-1)の滴定のための用量応答曲線を示す。表21に結果を示す。2-25(L234K/L235T/G236R)、2-30(L234Q/G236R)、2-36(L234R/L235D/G236R)及び2-58(L234T/L235K/G236R)を除いて、新しいバリアント(試料2-2~2-64、それぞれを含む)の全てが、アッセイ緩衝液と有意に異なっていない応答をもたらした。対照的に、これまでに公開されたバリアント2-65(L234A/L235A)、2-75(L234F/L235E/P331S)及び2-76(L234F/L235Q/K322Q)は、アッセイ緩衝液と比較して有意に高い応答をもたらした。
サイズ排除クロマトグラフィー
精製された抗体を、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)によって分析した。SECを、0.2mL/分の流速で、pH7.2のPBS中で平衡化したSuperdex 200 Increase 5/150GLカラムを使用したAgilent 1100シリーズHPLCで実行した。吸光度を280nmで測定し、IgG単量体に対応するピークの面積を、溶出させた総タンパク質のパーセンテージとして測定した。調製の直後に、並びに40℃でのインキュベーション後の7日及び14日に再び、試料を分析した。表22に結果を示す。平均して、40℃で7日後に、単量体の画分において約1.7%の減少及び14日後に約4.4%の減少がみられ、これは、野生型参照試料によって厳密に反映された。
示差走査蛍光測定法
示差走査蛍光測定法(DSF)を使用して抗体を評価して、プロテインサーマルシフトダイキット(Protein Thermal Shift Dye Kit)(ThermoFisherカタログ番号4461146)を製造元の説明書に従って使用して、それらの相対的な熱安定性の指標を提供した。5μLのプロテインサーマルシフトダイ緩衝液をポリプロピレンマイクロプレート(ThermoFisher社カタログ番号N8010560)に添加した。10μLの試験試料(PBS中1mg/mL)を添加し、混合した。プロテインサーマルシフトダイ(1000×)を水で希釈して、8×中間体ストックを得て、2.5μLを各試料に添加し、混合した。580±10nmでの励起及び623±14nmでの放出を用いたOrangeフィルターセットを使用したリアルタイムPCRシステム(ThemoFisher社 QuantStudio 3)を使用して、溶融曲線を測定した。温度を、0.05℃/秒の速度で、25℃からの90℃に連続して段階的に上昇させた。測定は、およそ0.1℃のインターバルでなされた。IgG分子は、異なる温度で溶融すると予想されるいくつかの異なるドメインを含有するため、蛍光応答は、予想通りに、単一の明確に画定された融解温度(Tm)を示さなかった。異なるバリアントの相対的な温度安定性の尺度を得るために、蛍光が25℃~35℃で測定された平均ベースライン蛍光より一貫して(3回の連続した測定にわたり)2000単位高かった温度を決定した。この温度を、融解(変性)プロセスの開始であると解釈した。各試料を2連で測定した。表23に平均の結果を示す。試料2-67(アグリコシル)を除いて、バリアントの全てが、野生型参照試料2-1より2.6℃低く3.8℃高い、61.2℃~67.6℃の範囲内の温度で溶融を開始させた。
サイトカイン放出
抗体を、ヒト末梢血単核細胞(PBMC)からのサイトカインの放出を引き起こすその能力に関して評価した。PBMCを、Ficoll-Paque PLUS(GE Healthcare社カタログ番号11778538)上での遠心分離によって5人の健康なドナーから単離し、1%熱不活性化ウシ胎児血清(FBS)(Fisher Scientific社カタログ番号11550526)及び1%ペニシリン/ストレプトマイシン(PS)(Sigma社カタログ番号4333)を含有するRPMI培地(Sigma社カタログ番号8758)で洗浄した。PBMCを、10%FBS及び1%PSを含有するRPMI(cRPMI)中2×106個/mLで再懸濁した。PBS中1mg/mLの抗CD3抗体をcRPMIで希釈して、200、20、2、0.2又は0.02μg/mLの濃度を得た。陰性対照は、cRPMIで5倍希釈したPBSからなっていた。各試料を3連で試験した。100μLの試験試料を、96ウェルの丸底マイクロプレート中で100μLの細胞懸濁液と混合し、37℃及び5%CO2で24時間培養した。プレートを、400×gで5分遠心分離し、培養上清を収集した。サイトカイン(GM-CSF、IFNγ、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10及びTNFα)を、製造元の説明書に従って、Bio-Plex Managerソフトウェアを備えたBio-Plex(登録商標)200システムでのLuminexアッセイ(Bio-Radカタログ番号M50000007A)によって、細胞培養上清中で定量化した。各サイトカインにつき、全ての5人のドナーから得られた平均濃度を、不等分散と仮定した片側t検定を使用して陰性対照で得られた平均濃度と比較した。結果が陰性対照での応答より有意に高かった場合(p≦0.05)、その結果に印をつけた。陽性応答は、10、1,0.1及び0.01μg/mLの最終濃度で、野生型参照抗体で得られた。
薬物動態学
Tg276トランスジェニックマウスは、強いCAGプロモーターの制御下でヒトFCGRT遺伝子を発現する(Proetzel 2014)。株が高いレベルのヒトFcRnを発現し、マウスFcRnを発現しないように、マウスを類遺伝子FcRn-ヌル株に戻し交配した。これらのマウスは、インビボにおける抗体持続性におけるわずかな差を検出することに好適である。
グリコシル化
親水性相互作用液体クロマトグラフィー(HILIC)による分離後に、N-結合型炭水化物を分析した。N-グリカンを、ラピッドPNGase F(NEB社カタログ番号P07010)を本質的に製造元の説明書に従って用いて放出させた。放出されたグリカンを、2-アミノ安息香酸及びシアノ水素化ホウ素ナトリウムでの還元的アミノ化によって蛍光標識した。標識されたオリゴ糖を、DPA-6S固相抽出カートリッジ(Sigma社カタログ番号52624-U)を使用したHILICによって記載された通りに精製した(Neville 2004)。精製された標識されたオリゴ糖を、アセトニトリル(最終濃度66%のアセトニトリル)で希釈し、30℃でBEHアミドカラム、3.5μm、2.1mm×150mm(Waters社カタログ番号186004861)を使用した、蛍光検出(240nmでの励起、430nmでの放出)でのAgilent社の1260 Quaternary HPLCシステムを使用して分析した。カラムを、0.15mL/分で、85:10:5から50:15:35のアセトニトリル:0.525M酢酸アンモニウムpH3.75:水の勾配で溶出させた。図6Aに各試料の代表的なクロマトグラムを示す。試料のそれぞれにつき同じグリコフォームのスペクトルが見られた。HEK及びCHO細胞の両方から調製された選択されたCD20抗体を使用して実験を繰り返した。図6Bに代表的なクロマトグラムを示す。グリコフォームのスペクトルは、異なる細胞型で調製された抗体間でわずかに異なっていたが、各細胞型内で、スペクトルは同じであった。
熱安定性
Uncle(登録商標)生物学的安定性プラットフォーム(Unchained Labs社、Pleasanton CA、USA)を製造元の説明書に従って使用して、抗体を評価した。試料を、25℃から開始して0.3℃/分の速度で95℃に増加させること熱勾配実験に供した。実験にわたり固有のタンパク質蛍光及び静的光散乱(266nm)を、それぞれタンパク質のアンフォールディング及び凝集のインジケーターとして測定した。各試料を、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)1mg/mLの濃度及び9μLの試料体積で試験した。48個の個々の試料を同時に試験し、実験全体を3回行って、各試験試料につき3連の独立した温度プロファイルを得た。「融解温度」Tmを、蛍光対温度プロットにおける主要な変曲点、すなわち蛍光の変化の速度が最大に達した温度と定義した。「凝集温度」Taggを、光散乱が増加し始めた温度と定義した。バリアントを、両側t検定によって野生型参照と比較した。表25に結果を示す。
インビトロにおける不要な免疫原性の評価
ProMap(登録商標)免疫原性システムは、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル(CFSE)で標識された細胞を追跡することによって細胞増殖を分析するフローサイトメトリー方法に基づく。CD4+T細胞に対する抗原提示細胞によって提示されたタンパク質又はペプチド抗原は、CFSEで標識した細胞の蛍光強度における減少によって測定できる細胞増殖をもたらす。研究は、Proimmune社(Oxford、UK)によって、それらの標準的なPromap(登録商標)T細胞増殖アッセイ手順に従って行われた。試験試料は、精製された20-merペプチド(Kendall Scientific Inc社、Lincolnshire、IL、USA)からなっていた。表26にペプチドの配列を示す。
Claims (19)
- バリアントFc領域を含む抗体であって、バリアントFc領域は、
(a)234位と235位の両方におけるアミノ酸置換;及び
(b)236位におけるアルギニン(R)へのアミノ酸の変更
を含み;
(i)234位で置換されるアミノ酸は、D、E、G、H、K、Q、R、S、Tから選択され;
(ii)235位で置換されるアミノ酸は、A、D、E、G、H、I、K、Q、R、S、T、Vから選択され;
(iii)アミノ酸の番号付けは、Kabatに記載の通りのEUインデックスに従い;且つ
(iv)前記抗体のヒトFcγRIへの結合は、表面プラズモン共鳴によって測定した場合、そのFc領域が配列番号2を含むことを除いて前記抗体と本質的に同一であるLALAPG参照タンパク質の結合の50%未満である、抗体。 - 前記アミノ酸置換及び変更の結果としての荷電アミノ酸残基の正味の変化は、1つ以下である、請求項1に記載の抗体。
- 表面プラズモン共鳴によって測定した場合、LALAPG参照タンパク質の結合が40応答単位より大きい条件下で、抗体のヒトFcγRIへの結合が、20応答単位未満である、請求項1又は2に記載の抗体。
- バリアントFc領域が、ヒトIgG1、ヒトIgG2、ヒトIgG3又はヒトIgG4であるか、又はそれから誘導される、請求項1から3のいずれか一項に記載の抗体。
- バリアントIgG Fc領域又はバリアントCγ2ドメインを含む抗体であって、バリアントIgG Fc領域又はバリアントCγ2ドメインは、(a)L234A/L235A/G236R、L234A/L235S/G236R、L234A/L235T/G236R、L234D/L235H/G236R、L234D/L235K/G236R、L234D/L235Q/G236R、L234D/L235S/G236R、L234D/L235T/G236R、L234E/L235D/G236R、L234E/L235H/G236R、L234E/L235I/G236R、L234E/L235V/G236R、L234G/L235H/G236R、L234G/L235Q/G236R、L234G/L235S/G236R、L234H/L235I/G236R、L234H/L235S/G236R、L234K/L235Q/G236R、L234K/L235R/G236R、L234K/L235S/G236R、L234K/L235T/G236R、L234K/L235V/G236R、L234Q/L235A/G236R、L234Q/L235D/G236R、L234Q/L235H/G236R、L234Q/L235Q/G236R、L234Q/L235R/G236R、L234Q/L235S/G236R、L234Q/L235T/G236R、L234Q/L235V/G236R、L234R/L235D/G236R、L234R/L235E/G236R、L234R/L235H/G236R、L234R/L235I/G236R、L234R/L235K/G236R、L234R/L235Q/G236R、L234R/L235R/G236R、L234R/L235T/G236R、L234S/L235D/G236R、L234S/L235E/G236R、L234S/L235G/G236R、L234S/L235H/G236R、L234S/L235I/G236R、L234S/L235R/G236R、L234S/L235T/G236R、L234S/L235V/G236R、L234T/L235A/G236R、L234T/L235I/G236R、L234T/L235K/G236R、L234T/L235Q/G236R、L234T/L235R/G236R、L234T/L235S/G236R、L234T/L235T/G236R、L234T/L235V/G236Rから選択されるアミノ酸置換の組合せを含むバリアントFc領域若しくはバリアントCγ2ドメイン;(b)V234A/A235S/Δ236R、V234A/A235T/Δ236R、V234D/A235H/Δ236R、V234D/A235K/Δ236R、V234D/A235Q/Δ236R、V234D/A235S/Δ236R、V234D/A235T/Δ236R、V234E/A235D/Δ236R、V234E/A235H/Δ236R、V234E/A235I/Δ236R、V234E/A235V/Δ236R、V234G/A235H/Δ236R、V234G/A235Q/Δ236R、V234G/A235S/Δ236R、V234H/A235I/Δ236R、V234H/A235S/Δ236R、V234K/A235Q/Δ236R、V234K/A235R/Δ236R、V234K/A235S/Δ236R、V234K/A235T/Δ236R、V234K/A235V/Δ236R、V234Q/A235D/Δ236R、V234Q/A235H/Δ236R、V234Q/A235Q/Δ236R、V234Q/A235R/Δ236R、V234Q/A235S/Δ236R、V234Q/A235T/Δ236R、V234Q/A235V/Δ236R、V234R/A235D/Δ236R、V234R/A235E/Δ236R、V234R/A235H/Δ236R、V234R/A235I/Δ236R、V234R/A235K/Δ236R、V234R/A235L/Δ236R、V234R/A235Q/Δ236R、V234R/A235R/Δ236R、V234R/A235T/Δ236R、V234S/A235D/Δ236R、V234S/A235E/Δ236R、V234S/A235G/Δ236R、V234S/A235H/Δ236R、V234S/A235I/Δ236R、V234S/A235L/Δ236R、V234S/A235R/Δ236R、V234S/A235T/Δ236R、V234S/A235V/Δ236R、V234T/A235I/Δ236R、V234T/A235K/Δ236R、V234T/A235Q/Δ236R、V234T/A235R/Δ236R、V234T/A235S/Δ236R、V234T/A235T/Δ236R、V234T/A235V/Δ236Rから選択されるアミノ酸の変更の組合せを含むバリアントヒトIgG2 Fc領域若しくはバリアントIgG2 Cγ2ドメイン;又は(c)F234A/L235A/G236R、F234A/L235S/G236R、F234A/L235T/G236R、F234D/L235H/G236R、F234D/L235K/G236R、F234D/L235Q/G236R、F234D/L235S/G236R、F234D/L235T/G236R、F234E/L235D/G236R、F234E/L235H/G236R、F234E/L235I/G236R、F234E/L235V/G236R、F234G/L235H/G236R、F234G/L235Q/G236R、F234G/L235S/G236R、F234H/L235I/G236R、F234H/L235S/G236R、F234K/L235Q/G236R、F234K/L235R/G236R、F234K/L235S/G236R、F234K/L235T/G236R、F234K/L235V/G236R、F234Q/L235A/G236R、F234Q/L235D/G236R、F234Q/L235H/G236R、F234Q/L235Q/G236R、F234Q/L235R/G236R、F234Q/L235S/G236R、F234Q/L235T/G236R、F234Q/L235V/G236R、F234R/L235D/G236R、F234R/L235E/G236R、F234R/L235H/G236R、F234R/L235I/G236R、F234R/L235K/G236R、F234R/L235Q/G236R、F234R/L235R/G236R、F234R/L235T/G236R、F234S/L235D/G236R、F234S/L235E/G236R、F234S/L235G/G236R、F234S/L235H/G236R、F234S/L235I/G236R、F234S/L235R/G236R、F234S/L235T/G236R、F234S/L235V/G236R、F234T/L235A/G236R、F234T/L235I/G236R、F234T/L235K/G236R、F234T/L235Q/G236R、F234T/L235R/G236R、F234T/L235S/G236R、F234T/L235T/G236R、F234T/L235V/G236Rから選択されるアミノ酸置換の組合せを含むバリアントヒトIgG4 Fc領域若しくはバリアントIgG4 Cγ2ドメインのいずれかであり;(i)アミノ酸の番号付けは、Kabatに記載の通りのEUインデックスに従い;(ii)前記抗体のヒトFcγRIへの結合は、表面プラズモン共鳴によって測定した場合、そのFc領域が配列番号2を含むことを除いて前記抗体と本質的に同一であるLALAPG参照タンパク質の結合の50%未満である、抗体。
- バリアントFc領域又はバリアントCγ2ドメインが、L234G/L235S/G236R、L234S/L235T/G236R、L234S/L235V/G236R、L234T/L235Q/G236R、L234T/L235T/G236Rから選択されるアミノ酸置換の組合せを含む、請求項5に記載の抗体。
- 請求項1から6のいずれか一項に記載の抗体をコードする配列を含む核酸。
- 請求項7に記載の核酸を含む組成物。
- 請求項7に記載の核酸を含むベクター。
- 請求項7に記載の核酸;請求項8に記載の組成物;又は請求項9に記載のベクターを含む宿主細胞。
- 請求項1から6のいずれか一項に記載の抗体を作製する方法であって、(a)請求項10に記載の細胞を培養する工程;及び(b)抗体を単離する工程を含む、方法。
- 請求項1から6のいずれか一項に記載の抗体を含むコンジュゲート。
- 請求項1から6のいずれか一項に記載の抗体又は請求項12に記載のコンジュゲートを含む組成物。
- IgG Fc領域又はCγ2ドメインを含む抗体の、Fcによって媒介される結合又はFcによって媒介されるエフェクター機能を低減させる方法であって、(a)請求項1から6のいずれか一項に記載の抗体をコードする遺伝子を、設計し、合成し、発現させる工程;及び(b)抗体を単離する工程を含む、方法。
- 請求項1から6のいずれか一項に記載の抗体;又は請求項12に記載のコンジュゲート;又は請求項8若しくは13に記載の組成物;又は請求項9に記載のベクターを含む、哺乳動物を処置するための医薬。
- 医薬として使用するための、請求項1から6のいずれか一項に記載の抗体、又は請求項12に記載のコンジュゲート、又は請求項8若しくは13に記載の組成物、又は請求項9に記載のベクターであって、前記抗体の低減されたエフェクター機能は、(a)有害な臨床作用の可能性を低減させるか;(b)有益な臨床作用の可能性を増加させるか;又は(c)参照タンパク質と比較して、より高い用量、より高頻度の用量又はより多くの用量の使用を容易にする、抗体、又はコンジュゲート、又は組成物、又はベクター。
- Fcγ受容体への結合を達成するリスクをなくすか又は低減させるための調査又は診断又は品質管理のための試験システムにおける使用のための、請求項1から6のいずれか一項に記載の抗体、又は請求項12に記載のコンジュゲート、又は請求項8若しくは13に記載の組成物、又は請求項9に記載のベクター。
- 酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)、蛍光ベースのアッセイ、免疫組織化学試験又は画像診断試験における使用のための、請求項17に記載の抗体、コンジュゲート、組成物、又はベクター。
- 請求項1から6のいずれか一項に記載の抗体、又は請求項12に記載のコンジュゲート、又は請求項8若しくは13に記載の組成物、又は請求項9に記載のベクターを含む、調査又は診断又は品質管理における使用のための試験システム又はキット。
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