JP7431450B2 - ヘリコバクター・スイス感染の診断法 - Google Patents
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Description
これまでに,本発明者らは,カニクイサルから単離されたH.スイスのゲノム解析情報に基づき,F2R2タンパク質及びその遺伝子配列を標的としたH.スイス感染の診断方法を報告している(特許文献3)。
(1) HsvA抗原ペプチド又はその免疫学的に同等な変異体。
(2) H.スイス由来である,(1)に記載の抗原ペプチド又はその免疫学的変異体免疫学的に同等な変異体。
(3) HsvA抗原ペプチドが,配列番号2,配列番号28,配列番号30,及び配列番号78~83のいずれか1つに記載のアミノ酸配列に含まれる5~50アミノ酸からなる配列を有する,(1)に記載の抗原ペプチド又はその免疫学的変異体免疫学的に同等な変異体。
(4) HsvA抗原ペプチドが,配列番号78~83のいずれか1つに記載のアミノ酸配列に含まれる,5~50アミノ酸からなる配列を有する,(3)に記載のペプチド又はその免疫学的に同等な変異体。
(5) HsvA抗原ペプチドが,以下の群から選択されるいずれか1つのアミノ酸配列を有するペプチド又はその免疫学的に同等な変異体である,(1)に記載のペプチド又はその免疫学的に同等な変異体:
EKX1AVX2X3X4X5NSNX6X7(ペプチドNo.11:配列番号24),
NQGTLEFLSNDVSX8(ペプチドNo.19:配列番号25),
X9SX10KLQX11X12LKSX13X14X15(ペプチドNo.33:配列番号26),
TNGQEVSASIDYNK(ペプチドNo.16:配列番号12),
AKLSNFASNDALPD(ペプチドNo.23:配列番号13),
PTTSSGASPDSSNP(ペプチドNo.10:配列番号14),
GLGRDLFVHSMGDK(ペプチドNo.21:配列番号15),
QIGKIKLSDVLSAS(ペプチドNo.15:配列番号16),
YGAIDKELHFSGGK(ペプチドNo.34:配列番号17),
NVDNILNMPSTTSG(ペプチドNo.20:配列番号18),
GNLKGVYYPKSSTT(ペプチドNo.22:配列番号19),
ITEKIQSGKLTITI(ペプチドNo.14:配列番号20),
FHDFLVSLKGKKFA(ペプチドNo.26:配列番号21),
TTGGEVRLFRSFYV(ペプチドNo.31:配列番号22),及び
及びIGARFGLDYQDINI(ペプチドNo.35:配列番号23)
ここで,X1はK又はDであり,X2はQ,E又はTであり,X3はQ又はSであり,X4はM又はLであり,X5はE又はKであり,X6はP又はSであり,X7はD又はGであり,X8はN又はTであり,X9はL又はFであり,X10はN又はDであり,X11はG,D又はNであり,X12はQ又はMであり,X13はM又はLであり,X14はG又はNであり,かつX15はL又はMである。
(6) HsvA抗原ペプチドが,以下の群から選択されるいずれか1つのアミノ酸配列を有するペプチド又はその免疫学的に同等な変異体である,(5)に記載のペプチド又はその免疫学的に同等な変異体:
EKKAVQQMENSNPD(ペプチドNo.11:配列番号3),
EKKAVEQMENSNPD(ペプチドNo.11(TKY):配列番号4),
EKDAVTSLKNSNSG(ペプチドNo.11(SH8):配列番号5),
EKDAVTSLENSNSG(ペプチドNo.11(SH10):配列番号6),
NQGTLEFLSNDVSN(ペプチドNo.19:配列番号7),
NQGTLEFLSNDVST(ペプチドNo.19(TKY):配列番号8),
LSNKLQGQLKSMGL(ペプチドNo.33:配列番号9),
LSNKLQDQLKSMGL(ペプチドNo.33(TKY):配列番号10),
FSDKLQNMLKSLNM(ペプチドNo.33(SH10):配列番号11),
TNGQEVSASIDYNK(ペプチドNo.16:配列番号12),
AKLSNFASNDALPD(ペプチドNo.23:配列番号13),
PTTSSGASPDSSNP(ペプチドNo.10:配列番号14),
GLGRDLFVHSMGDK(ペプチドNo.21:配列番号15),
QIGKIKLSDVLSAS(ペプチドNo.15:配列番号16),
YGAIDKELHFSGGK(ペプチドNo.34:配列番号17),
NVDNILNMPSTTSG(ペプチドNo.20:配列番号18),
GNLKGVYYPKSSTT(ペプチドNo.22:配列番号19),
ITEKIQSGKLTITI(ペプチドNo.14:配列番号20),
FHDFLVSLKGKKFA(ペプチドNo.26:配列番号21),
TTGGEVRLFRSFYV(ペプチドNo.31:配列番号22),
IGARFGLDYQDINI(ペプチドNo.35:配列番号23)、
KQLPQPKRSELKPK(ペプチドNo.8:配列番号86)、
TNIKQYMQNNHRSQ(ペプチドNo.31N:配列番号87)、
TLTLEGTETFAQNS(ペプチドNo.81:配列番号88)、
EAYAKNQGDIWSTI(ペプチドNo.63:配列番号89)、
VIGSKSSITLNSAN(ペプチドNo.73:配列番号90)、及び
ADIQSSQTTFANSV(ペプチドNo.61:配列番号91)。
(7) (1)~(6)のいずれか1項のペプチド又はその免疫学的に同等な変異体に特異的に結合する抗体又はその免疫反応性断片。
(8) hsvA遺伝子とストリンジェントな条件下で結合可能である,5~40ヌクレオチドからなる核酸分子。
(9) hsvA遺伝子が,配列番号1,配列番号27又は配列番号29に記載の塩基配列を有する,(8)に記載の核酸分子。
(10) 以下の群から選択されるいずれか1つの塩基配列を有する,(9)に記載の核酸分子:
CTTTTAGCGTGGTATCCTTC(配列番号31),TTACAAAGACCACCAACGGA(配列番号32),TACCATAGAAAGCGGAAAC(配列番号33),AGCTATAGCTTTGCACCTGA(配列番号34),ACTAACAGCATAGAAGTTGGGGA(配列番号35),AACAACATTACAGGCATGAG(配列番号36),CAAATAGTAACAGGACAATT(配列番号37),CAGGATTTAAGAGGCACTTA(配列番号38),TCTTAACCAATCTGAGCAA(配列番号39),GTCAAACACGTTATTGATGGCTT(配列番号40),GGGGTTTAATAGCATAGGG(配列番号41),TAGAGCTCTACACCAGTCTT(配列番号42),ATAAAGCCCATGAATTCTTAGGCATGCGTGCTCTG(配列番号43),TGCTATTGATAAAGAGTTACATTTCTCAGG(配列番号44),ATTTCTCAGGGGGAAAGTC(配列番号45),GGCTAATAATTTAACCACAATAAGCGCCTTTAA(配列番号46),GATGGGCGCTTCTGGTTTA(配列番号47),ATGAATTCTTAGGCATGCGTGCTCT(配列番号48),TTTTGGAGGTGTAGGAGTAGAT(配列番号49),AGCGCGCATTTAAAACAGGT(配列番号50),AGAAACGAGATTACAGGAAG(配列番号51),AGGAGCAAGTTTTGTAGCAG(配列番号52),AAAATGCGACTGATTGGATG(配列番号53),TTGAAATTTGGCCACGCT(配列番号54),TCACCCATAGAATGGACGAA(配列番号55),CTAGCGCATTAACCACAGACTG(配列番号56),TAGAAGTTGTAGACACGGT(配列番号57),GTGATATTGCCTTTCTGAAC(配列番号58),GCAAGTTTTGTGCGGATT(配列番号59),ATGTGATACACATCTGACC(配列番号60),AGTGCCGTTACCATCGTGAA(配列番号61),TATTCAAGGAAAGTCCCTGGAGAAACTCCAGAGAC(配列番号62),TTAAAGGCGCTTATTGTGGTTAAATTATTAGCC(配列番号63),ATTAGCCTTAAGGGTGCTATC(配列番号64),CTGGTAATGCATCATTAGAAGCAAA(配列番号65),TACGCGCAAAATAGGTTCTT(配列番号66),TGGAGAAACTCCAGAGACTA(配列番号67),TTGTTCGCTGTAGTGCCGTGG(配列番号68),GAAGGATACCACGCTAAAAG(配列番号69),AAGCTAGAGTTTTGGTTGAG(配列番号70),TTGCTCAGATTGGTTAAGA(配列番号71),ATCGAAATAAGCGAACCTCA(配列番号72),TTGAAAGCTTAGCTAAACGG(配列番号73),TGGTATTGCTGGTTAAGAGG(配列番号74),CAAACAGATGAGCCGT(配列番号75),ATGAAAAAGTTTAGTTCTCTCACATTGAAATTTGGCCACGCTC(配列番号76),及びCTAAAAAGCATAGCGCATCCCGACATTGCCTGTAATATTAATATC(配列番号77)。
(11) hsvA遺伝子の全部又は一部を増幅可能なプライマーである,(8)~(10のいずれか1項に記載の核酸分子。
(12) hsvA遺伝子を検出するためのプローブである,(8)~(10)のいずれか1項に記載の核酸分子。
(13) サンプル中のhsvA遺伝子の全部又は一部を検出することを含む,H.スイスの存在を判定する方法,ここで,hsvA遺伝子の全部又は一部が検出されたサンプルをH.スイスが存在すると判定される。
(14) (13)に記載のH.スイスの存在を判定する方法であって,
サンプル中のDNAを鋳型として用いて,(11)に記載のプライマーを用いてhsvA遺伝子の全部又は一部を増幅させること,
増幅されたDNAを検出すること,及び
DNAの増幅が検出されたサンプルをH.スイスが存在すると判定すること,を含む方法。
(15) (13)に記載のH.スイスの存在を判定する方法であって,
サンプル中のDNAと(12)に記載のプローブとを接触させること,
(12)に記載のプローブと結合したDNAを検出すること,及び
(11)に記載のプローブと結合したDNAが検出されたサンプルをH.スイスが存在すると判定すること,を含む方法。
(16) サンプル中のHsvAタンパク質又はその断片を検出すること,前記HsvAタンパク質又はその断片が検出されたサンプルをH.スイスが存在すると判定することを含む,H.スイスの存在の判定方法。
(17) (16)に記載のH.スイスの存在の判定方法であって:
サンプルと(7)に記載の抗体又はその免疫反応性断片とを接触させること,
前記抗体又はその免疫反応性断片と結合した,前記サンプル中のHsvAタンパク質又はその断片を検出すること,及び
前記抗体又はその免疫反応性断片と結合したHsvAタンパク質又はその断片が検出されたサンプルをH.スイスが存在するサンプルと判定すること,を含む方法。
(18) 被験者のH.スイスへの感染を判定する方法であって,
被験者由来のサンプルをサンプルとして用いて(12)~(17)のいずれか1項に記載の方法を行うこと,及び,
当該方法においてH.スイスが存在すると判定されたサンプルが由来する被験者をH.スイスに感染していると判定することを含む方法。
(19) 被験者のH.スイスへの感染を判定する方法であって,
被験者由来の血液サンプル中のHsvA抗原ペプチドと結合する抗体を検出すること,及び
前記ペプチドと結合する抗体が検出された被験者をH.スイスに感染していると判定することを含む方法。
(20) 以下の工程を含む,(19)に記載のH.スイスへの感染を判定する方法:
被験者由来のサンプルと(1)~(6)のいずれか1項に記載のペプチドとを接触させること,
前記ペプチドと結合した,前記血液サンプル中の抗体を検出すること,及び
前記ペプチドと結合した抗体が検出された被験者をH.スイスに感染していると判定すること。
(21) (1)~(6)のいずれか1項に記載のペプチド,(8)~(10)のいずれか1項に記載の核酸分子,及び(7)に記載の抗体又はその免疫反応性断片から選択されるいずれか一つを含有するH.スイス感染判定用組成物。
(22) (1)~(6)のいずれか1項に記載のペプチド,(8)~(10)のいずれか1項に記載の核酸分子,及び(7)に記載の抗体又はその免疫反応性断片から選択されるいずれか一つを含有する医薬組成物。
(23) H.スイス除菌療法用である,(22)に記載の医薬組成物。
(24) 胃炎,胃潰瘍や十二指腸潰瘍,胃癌,慢性胃炎,胃MALTリンパ腫,鳥肌胃炎,特発性血小板減少紫斑病,機能性ディスペプシア,又はびまん性大細胞型B細胞性リンパ腫の治療用又は予防用である,(22)に記載の医薬組成物。
本明細書において,「H.スイス」とは,H.ハイルマニイ(広義)に含まれる,H.ハイルマニータイプ1に属する菌株を意味する。H.スイスは,ヒト以外にイヌ,ネコ,ブタ,サルなどの胃に感染することが知られている。本明細書におけるH.スイスが単離された感染哺乳動物は特に限定されるものではなく,例えば,ヒト,サル,又はブタであってよい。好ましくは,H.スイスはヒトから単離されたH.スイス(例えば,SNTW101株)である。
本明細書において,「hsvA遺伝子」及び「HsvAタンパク質」とは,H.スイスに由来する,ヘリコバクター属細菌の外膜タンパク質のアミノ末端側のシグナルペプチド領域と,カルボキシ末端側のオートトランスポーター(タンパク質の外膜輸送機構)βドメイン及び,機能発現に関与するdisorder領域を有する遺伝子及びアミノ酸を意味する。限定されない例の一つとして,hsvA遺伝子及びHsvAタンパク質は,それぞれH.スイス SNTW101株に由来する,配列番号1に記載の塩基配列(又は,図2に記載の塩基配列,本明細書において同様)を有する遺伝子,及び配列番号2に記載のアミノ酸配列(又は,図2に記載のアミノ酸配列,本明細書において同様)を有するタンパク質を挙げることができる。配列番号2に記載のアミノ酸配列において,1番目~27番目のアミノ酸はシグナル配列をコードし,2273~2475番目のアミノ酸はdisorder領域をコードし,2686~2992番目のアミノ酸は,オートトランスポーターβ領域をコードする。よって,本明細書においてHsvAタンパク質とは,配列番号2に記載のアミノ酸配列のうちシグナル配列を除く28番目から2992番目のアミノ酸からなるタンパク質を含む。H.スイスの他の株に由来する他のhsvA遺伝子及びHsvAタンパク質も本明細書のhsvA遺伝子及びHsvAタンパク質に含まれる。一例として,HsvAタンパク質は,H.スイスに由来するタンパク質であって,配列番号2に記載のアミノ酸配列(又は,配列番号2に記載のアミノ酸配列のうち28番目から2992番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列)と80%,85%,90%,95%,98%,又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質を含む。同様に,hsvA遺伝子は,H.スイスに由来する遺伝子であって,配列番号2に記載のアミノ酸配列(又は,配列番号2に記載のアミノ酸配列のうち28番目から2992番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列)と80%,85%,90%,95%,98%,又は99%の同一性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子を含む。ここで,アミノ酸配列の同一性は,例えば,BLAST,FASTA等の公知のプログラムを用いて当業者が通常用いる方法により決定することができる。あるいは,hsvA遺伝子は,H.スイスに由来する遺伝子であって,配列番号1に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を有するDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAを含む遺伝子を含む。また,HsvAタンパク質は当該遺伝子でコードされたタンパク質を含む。さらに,HsvAタンパク質は,H.スイスに由来するタンパク質であって,配列番号2に記載のアミノ酸配列(又は,配列番号2に記載のアミノ酸配列のうち28番目から2992番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列)において,1~50個(例えば,1~40個,1~30個,1~25個,1~20個,1~15個,1~10個,1~8個,1~6個,1~5個,1~4個,1~3個,又は1~2個であってもよい。本明細書において,以下同じ)のアミノ酸が他のアミノ酸と置換され,欠失し,付加され,又は挿入されたアミノ酸配列を有するタンパク質を含む。同様に,hsvA遺伝子は,H.スイスに由来する遺伝子であって,配列番号2に記載のアミノ酸配列(又は,配列番号2に記載のアミノ酸配列のうち28番目から2992番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列)において,1~50個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換され,欠失し,付加され,又は挿入されたたアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子を含む。
本明細書において,「HsvA抗原ペプチド」とは,上述のHsvAタンパク質に含まれるアミノ酸配列を有するペプチドであって、生体内において抗原として機能し得るペプチドを意味し,好ましくは,複数のH.スイス株間で保存されているアミノ酸配列を有するペプチドである。また,HsvA抗原ペプチドは,好ましくは,H.スイスに特異的で,H.ピロリ又は他のH.ハイルマニイには存在しないアミノ酸配列からなる。HsvAは膜タンパク質であることから,好ましくは,HsvA抗原ペプチドはHsvAタンパク質の細胞外ドメインを構成するアミノ酸配列を含む。例えば,HsvA抗原ペプチドは,配列番号2に記載のH.スイス SNTW101株由来HsvAタンパク質のアミノ酸配列のうち,1467~2992番目,1467~2685番目,1535~2135番目,又は2008~2135番目に含まれるアミノ酸配列からなる。本発明者らは,HsvAに特異的でかつこのような条件を満たすアミノ酸配列について解析を行った結果,配列番号78~83に示す部分アミノ酸配列を見出すことに成功した。配列番号78~83に記載されたアミノ酸配列は異なる種に感染した異なる株のH.スイスに由来するHsvAタンパク質が有するものであるが,そのアミノ酸配列は比較的保存されており,76.7%の同一性を有する。よって,本発明のHsvAタンパク質抗原ペプチドは,配列番号78~83のいずれか1つの配列に記載のアミノ酸配列と70%,75%,80%,85%,90%,95%,98%,又は99%の同一性を有するアミノ酸配列;又は,配列番号78~83のいずれか1つの配列に記載のアミノ酸配列のうち1~50個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換され,欠失し,付加され,又は挿入されたたアミノ酸配列を有するか,当該アミノ酸配列に含まれるアミノ酸配列を有することができる。本明細書全体にわたって,「(特定の)アミノ酸配列を有する」との表現は,当該アミノ酸配列からなる場合を含むと解されることを意図している。
他の態様において,本発明は,HsvAタンパク質を特異的に認識する抗体(本明細書において「抗HsvA抗体」という)若しくはその免疫反応性断片に関する。本発明の抗HsvA抗体は好ましくは,上述において定義されたHsvAタンパク質抗原ペプチドのいずれかと結合する。例えば,抗HsvA抗体は,配列番号78~83のいずれか1つの配列に記載のアミノ酸配列;配列番号78~83のいずれか1つの配列に記載のアミノ酸配列と80%,85%,90%,95%,98%,又は99%の同一性を有するアミノ酸配列;又は,配列番号78~83のいずれか1つの配列に記載のアミノ酸配列のうち1~50個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換され,欠失し,付加され,又は挿入されたたアミノ酸配列を有するペプチドと結合する。「抗体の免疫反応性断片」とは,抗体の一部分(部分断片)または抗体の一部分を含むペプチドであって,抗体の抗原への結合作用を保持するものを意味する。このような抗体の断片としては,例えば,F(ab’)2,Fab’,Fab,一本鎖Fv(以下,「scFv」という),ジスルフィド結合Fv(以下,「dsFv」という)若しくはこれらの重合体,二量体化V領域(以下,「Diabody」という),またはCDRを含むペプチドを挙げることができる。好ましくは,本発明の抗体若しくはその免疫反応性断片は,HsvA抗原ペプチドを特異的に認識する。本明細書において,抗体又はその免疫反応性断片が「特異的に」認識する(結合する)とは,その抗体又はその免疫反応性断片が他のアミノ酸配列や立体構造に対する親和性よりも,HsvA抗原ペプチドに対して実質的に高い親和性で結合することを意味する。本発明の抗体とHsvA抗原との結合における結合定数(Ka)としては,例えば,少なくとも107M-1,少なくとも108M-1,少なくとも109M-1,少なくとも1010M-1,少なくとも1011M-1,少なくとも1012M-1,少なくとも1013M-1を挙げることができる。
別の態様において,本発明は,hsvA遺伝子と特異的に結合可能な核酸分子に関する。好ましくは,hsvA遺伝子と特異的に結合可能な核酸分子は,hsvA遺伝子特異的塩基配列若しくは該塩基配列と相補的な配列を有する核酸分子,又は,hsvA遺伝子特異的塩基配列若しくは該塩基配列と相補的な配列とストリンジェントな条件下で結合可能な核酸分子(以下,「hsvA遺伝子特異的塩基配列を有する核酸分子等」という)に関する。前記hsvA特異的核酸分子は,用途に応じてプライマー又はプローブであってもよい。ここで,プライマーはPCR等によりDNAを増幅させる目的で使用される核酸分子である。プライマーは相補的な配列を有するDNAとハイブリダイズして,当該DNAを伸長させることにより,当該DNAを増幅することができる核酸分子であり,増幅されたDNAを検出することにより当該DNAを検出することを可能とする。プローブは,標的DNAと結合することで標的DNAの存在を検出する目的で用いられる核酸分子である。本発明のhsvA遺伝子と結合可能な核酸分子は,hsvA遺伝子が有する塩基配列のうち,H.ピロリ及びH.ハイルマニイ(ただし,H.スイスを除く)が同一又は類似する配列を持たない限り,hsvAに由来しない塩基配列を有していてもよい。選択した塩基配列がhsvA遺伝子特異的であるか否かは,例えば,当該配列について既に公開されているデータベースを検索して,H.ピロリ及びH.ハイルマニイ(H.スイスを除く)が同一又は類似する配列を持つか否かを調べ,持つ場合には特異的ではなく,持たない場合には特異的であると決定することができる。ここで,「類似しない」とは,同一性が10%以下,20%以下,30%以下,40%以下,又は50%以下であることを意味してもよい。hsvA遺伝子と特異的に結合可能な核酸分子は例えば配列番号1から任意の配列を上記方法に従って選択することができる。また,本発明のhsvA遺伝子と結合可能な核酸分子は,例えば,5~50ヌクレオチド,5~45ヌクレオチド,5~40ヌクレオチド,5~35ヌクレオチド,5~30ヌクレオチド,5~25ヌクレオチド,5~20ヌクレオチド,5~15ヌクレオチド,5~10ヌクレオチド,10~50ヌクレオチド,10~45ヌクレオチド,10~40ヌクレオチド,10~35ヌクレオチド,10~30ヌクレオチド,10~25ヌクレオチド,10~20ヌクレオチド,10~15ヌクレオチド,15~50ヌクレオチド,15~45ヌクレオチド,15~40ヌクレオチド,15~35ヌクレオチド,15~30ヌクレオチド,15~25ヌクレオチド,15~20ヌクレオチド,又は17~25ヌクレオチドとすることができる。好ましくは,hsvA遺伝子特異的塩基配列としては,例えば,CTTTTAGCGTGGTATCCTTC(配列番号31),TTACAAAGACCACCAACGGA(配列番号32),TACCATAGAAAGCGGAAAC(配列番号33),AGCTATAGCTTTGCACCTGA(配列番号34),ACTAACAGCATAGAAGTTGGGGA(配列番号35),AACAACATTACAGGCATGAG(配列番号36),CAAATAGTAACAGGACAATT(配列番号37),CAGGATTTAAGAGGCACTTA(配列番号38),TCTTAACCAATCTGAGCAA(配列番号39),GTCAAACACGTTATTGATGGCTT(配列番号40),GGGGTTTAATAGCATAGGG(配列番号41),TAGAGCTCTACACCAGTCTT(配列番号42),ATAAAGCCCATGAATTCTTAGGCATGCGTGCTCTG(配列番号43),TGCTATTGATAAAGAGTTACATTTCTCAGG(配列番号44),ATTTCTCAGGGGGAAAGTC(配列番号45),GGCTAATAATTTAACCACAATAAGCGCCTTTAA(配列番号46),GATGGGCGCTTCTGGTTTA(配列番号47),ATGAATTCTTAGGCATGCGTGCTCT(配列番号48),TTTTGGAGGTGTAGGAGTAGAT(配列番号49),AGCGCGCATTTAAAACAGGT(配列番号50),AGAAACGAGATTACAGGAAG(配列番号51),AGGAGCAAGTTTTGTAGCAG(配列番号52),AAAATGCGACTGATTGGATG(配列番号53),TTGAAATTTGGCCACGCT(配列番号54),TCACCCATAGAATGGACGAA(配列番号55),CTAGCGCATTAACCACAGACTG(配列番号56),TAGAAGTTGTAGACACGGT(配列番号57),GTGATATTGCCTTTCTGAAC(配列番号58),GCAAGTTTTGTGCGGATT(配列番号59),ATGTGATACACATCTGACC(配列番号60),AGTGCCGTTACCATCGTGAA(配列番号61),TATTCAAGGAAAGTCCCTGGAGAAACTCCAGAGAC(配列番号62),TTAAAGGCGCTTATTGTGGTTAAATTATTAGCC(配列番号63),ATTAGCCTTAAGGGTGCTATC(配列番号64),CTGGTAATGCATCATTAGAAGCAAA(配列番号65),TACGCGCAAAATAGGTTCTT(配列番号66),TGGAGAAACTCCAGAGACTA(配列番号67),TTGTTCGCTGTAGTGCCGTGG(配列番号68),GAAGGATACCACGCTAAAAG(配列番号69),AAGCTAGAGTTTTGGTTGAG(配列番号70),TTGCTCAGATTGGTTAAGA(配列番号71),ATCGAAATAAGCGAACCTCA(配列番号72),TTGAAAGCTTAGCTAAACGG(配列番号73),TGGTATTGCTGGTTAAGAGG(配列番号74),CAAACAGATGAGCCGT(配列番号75),ATGAAAAAGTTTAGTTCTCTCACATTGAAATTTGGCCACGCTC(配列番号76),CTAAAAAGCATAGCGCATCCCGACATTGCCTGTAATATTAATATC(配列番号77)を挙げることができる。
(フォワードプライマー)
HSVANOFW-2:AGAAACGAGATTACAGGAAG(配列番号51)
HSVANOFW-3:AGGAGCAAGTTTTGTAGCAG(配列番号52)HSVANOFW-5:AAAATGCGACTGATTGGATG(配列番号53)
(リバースプライマー)
HSVANORV-1:ATCGAAATAAGCGAACCTCA(配列番号72)
HSVANORV-3:TTGAAAGCTTAGCTAAACGG(配列番号73)
HSVANORV-4:TGGTATTGCTGGTTAAGAGG(配列番号74)。
別の態様において,本発明は,HsvA抗原ペプチド及びhsvA遺伝子と特異的に結合可能な核酸分子を含有する,H.スイス感染の判定用キット,H.スイスの感染判定用組成物,医薬組成物に関する。本発明のキット及び組成物は,更に,固相,ハプテン,及び不溶性担体からなる群より選択される担体を含んでいてもよい。
被験者がH.スイスに感染しているか否かは,被験者のサンプル中に存在するhsvA遺伝子を検出することにより,その感染の有無を決定することができる。hsvA遺伝子と特異的に結合可能な核酸分子を利用した,H.スイスの検出は,ハイブリダイゼーションを利用した方法;PCRを利用した方法;並びに,インベーダー(登録商標)法として知られる方法(例えば,Kwiatkowski,R.W.ら,Mol.Diagn.(1999)4:353-364参照)により行うことができる。
(a)少なくとも1つのhsvA遺伝子と特異的に結合可能な核酸分子とサンプルを接触させること;
(b)前記hsvA遺伝子と特異的に結合可能な核酸分子への前記サンプル中のポリヌクレオチドの結合を検出すること;及び,
(c)前記結合が検出されたサンプルを,H.スイスが存在するサンプルとして決定し,かつ,前記結合が検出されなかったサンプルを,H.スイスが存在しないサンプルとして決定することにより,H.スイスの存在を判定すること
(a)少なくとも1つのhsvA遺伝子と特異的に結合可能な核酸分子と被験者由来のサンプルを接触させること;
(b)前記hsvA遺伝子と特異的に結合可能な核酸分子への前記サンプル中のポリヌクレオチドの結合を検出すること;及び,
(c)前記結合が検出されたサンプルの由来する被験者を,H.スイスに感染している判定し,かつ/又は,前記結合が測定又は検出されなかったサンプルを,H.スイスが存在しないサンプルとして判定すること。
(a)hsvA遺伝子と特異的に結合可能な核酸分子をプライマーとして用いて,サンプル中のhsvA遺伝子の一部を増幅させること:
(b)増幅された核酸分子を検出すること;並びに,
(c)増幅された核酸分子が検出されたサンプルを,H.スイスが存在するサンプルとして決定し,かつ,増幅された核酸分子が検出されなかったサンプルを,H.スイスが存在しないサンプルとして決定することにより,H.スイスの存在を判定すること。
(a)hsvA遺伝子と特異的に結合可能な核酸分子をプライマーとして用いて,被験者由来のサンプル中のhsvA遺伝子の一部を増幅させること:
(b)増幅された核酸分子を検出すること;並びに,
(c)増幅された核酸分子が検出されたサンプルが由来する被験者を,H.スイスが感染していると判定し,かつ,増幅された核酸分子が検出されなかったサンプルが由来する被験者を,H.スイスに感染していないと判定すること。
(a)hsvA遺伝子特異的核酸分子等をプライマーとして用いて,被験者由来のサンプル中のhsvA遺伝子の一部を増幅させること,
(b)増幅された核酸分子のレベルを測定すること;並びに,
(c)測定された核酸分子のレベルが,同様の方法により陰性対照について測定された核酸分子のレベルよりも高い場合,被験者をH.スイスに感染していると判定し,かつ,測定された核酸分子のレベルが,同様の方法により陰性対照について測定された核酸分子のレベルと同等か低い場合,被験者を,H.スイスに感染していないと判定すること。
(a)以下の(i)及び(ii)に記載の核酸に該試料を接触させて,アレルプローブと相補的なDNAに三重鎖を形成させるステップ:
(i)hsvA遺伝子特異的塩基配列又は該配列と相補的な配列及び消光プローブの一部と相補的な配列(フラップ)を備えるアレル特異的プローブ,及び/又は,hsvA特異的塩基配列または該配列と相補的な配列及び消光プローブの一部と相補的な配列(フラップ)を備えるアレル特異的プローブ,
(ii)hsvA遺伝子特異的塩基配列を備えるインベーダープローブ;
(b)(a)により得られた核酸試料に,三重鎖特異的DNA分解酵素を接触させて三重鎖を形成した核酸からフラップを遊離させるステップ;
(c)遊離されたフラップを,それぞれ当該フラップと相補的な配列及び消光プローブを備える蛍光標識ユニバーサルプローブと接触させるステップ;
(d)(c)により得られた核酸試料に,三重鎖特異的DNA分解酵素を接触させて蛍光標識を遊離させ,蛍光を発色させるステップ;
(e)発色した蛍光を検出することにより,hsvA遺伝子を検出するステップ;ここで,蛍光発色が検出されたサンプルを,H.スイスが存在するサンプルとして決定し,かつ,蛍光発色が検出されなかったサンプルを,H.スイスが存在しないサンプルとして決定することにより,H.スイスの存在を判定するステップ。
被験者がH.スイスに感染しているか否かは,被験者自身の免疫系が生み出したH.スイス由来タンパク質(特には,HsvAタンパク質)に対する抗体の存在を確認することにより決定することができる。HsvA抗原ペプチド,又は抗HsvA抗体又はその免疫反応性断片を利用したH.スイスの検出は,酵素免疫測定法(EIA法),簡易EIA法,酵素結合イムノソルベントアッセイ法(ELISA法),ラジオイムノアッセイ法(RIA法),蛍光免疫測定法(FIA法)等の標識化免疫測定法;ウェスタンブロッティング法等のイムノブロッティング法;金コロイド凝集法等のイムノクロマト法;イオン交換クロマトグラフィ法,アフィニティクロマトグラフィ法等のクロマトグラフィ法;比濁法(TIA法);比ろう法(NIA法);比色法;ラテックス凝集法(LIA法);粒子計数法(CIA法);化学発光測定法(CLIA法,CLEIA法);沈降反応法;表面プラズモン共鳴法(SPR法);レゾナントミラーディテクター法(RMD法);比較干渉法等により行うことができる。
(a)被験者由来のサンプルを本発明のHsvA抗原と接触させること,
(b)前記ペプチドと結合した,前記血液サンプル中の抗体を検出すること,及び
(c)前記ペプチドと結合した抗体が検出された被験者をH.スイスに感染していると判定し,かつ,前記ペプチドと結合した抗体が検出されなかった被験者を,H.スイスに感染していないと判定すること。
すること。
(a)被験者由来のサンプルを,本発明のHsvA抗原ペプチドと接触させること,
(b)前記ペプチドと結合した,前記血液サンプル中の抗体のレベルを測定すること,及び
(c)測定された抗体のレベルが,同様の方法により陰性対照について測定された抗体のレベルよりも高い場合,該被験者をH.スイスに感染していると判定し,かつ,測定された抗体のレベルが,同様の方法により陰性対照について測定された抗体のレベルと同等か低い場合,該被験者を,H.スイスに感染していないと判定すること。
被験者がH.スイスに感染しているか否かは,被験者由来のサンプル中のH.スイス由来タンパク質(特には,HsvAタンパク質)の存在を確認することにより決定することができる。HsvAタンパク質を利用したH.スイスの検出は,上述のHsvAタンパク質特異的抗体を検出することを利用した方法と同様な方法により行うことができる。
例えば,本発明のH.スイスの存在の判定方法は,以下を備えていてもよい:
(a)サンプルを,標識化された抗HsvA抗体又はその免疫反応性断片に接触させること;
(b)結合した抗体の標識を検出すること;
(c)該標識が検出されたサンプルを,H.スイスが存在するサンプルとして決定し,かつ,該結合が検出されなかったサンプルを,H.スイスが存在しないサンプルとして決定することにより,H.スイスの存在を判定すること。
(a)被験者由来のサンプルを,標識化された抗HsvA抗体又はその免疫反応性断片に接触させること;
(b)結合した抗体の標識を検出すること;
(c)該標識が検出されたサンプルが由来する被験者を,H.スイスに感染していると判定し,かつ/又は,該標識が検出されなかったサンプルが由来する被験者を,H.スイスに感染していないと判定すること。
(a)サンプルを,抗HsvA抗体又はその免疫反応性断片に接触させること;
(b)(a)より得られたサンプルを,前記抗HsvA抗体又はその免疫反応性断片とは異なる標識化された抗HsvA抗体若しくはその免疫反応性断片と接触させること;
(c)結合した抗体の標識を測定又は検出すること;
(d)該結合が測定又は検出されたサンプルを,H.スイスが存在するサンプルとして決定し,かつ,該結合が測定又は検出されなかったサンプルを,H.スイスが存在しないサンプルとして決定することにより,H.スイスの存在を判定すること。
(a)被験者由来のサンプルを,抗HsvA抗体又はその免疫反応性断片に接触させること;
(b)(a)より得られたサンプルを,前記抗HsvA抗体又はその免疫反応性断片とは異なる標識化された抗HsvA抗体若しくはその免疫反応性断片と接触させること;
(c)結合した抗体の標識を測定又は検出すること;
(d)該結合が測定又は検出されたサンプルが由来する被験者を,H.スイスに感染していると判定し,かつ/又は,該結合が測定又は検出されなかったサンプルが由来する被験者を,H.スイスに感染していないと判定すること。
(1)DNAの調製
(1)-1.H.ピロリ
H.ピロリとして,11株(SS1,TN2GF4,RC-1,ATCC43579,NCTC11637,TK1029,TK1081,TY1289,TY281)を用いた。ニッスイプレート・ヘリコバクター寒天培地(日水製薬,東京)に-80℃で保存していた菌液を塗布し,微好気条件下(5%O2,10%CO2,85%N2,湿度100%),37℃で3日間培養した。生じたコロニーを滅菌蒸留水に懸濁し,95℃5分間処理後の遠心上清を粗精製染色体DNAとした。粗精製染色体DNAは, 等量のフェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール(25:24:1)で抽出後,エタノール沈殿で精製し,少量の滅菌蒸留水に溶解させた。最終産物のDNA濃度は,260nmの吸光度(Absorbance)(A260)を測定し,以下の式により決定した。
DNA濃度(μg/mL)=A260×50(光路長10mm)
H.スイスとして,2株(TKY, SNTW101)を用いた。H.スイスを感染させた雌のC57BL/6マウス(チャールズリバージャパン,横浜)を解剖し,胃の大湾部を切開した。内容物をPBSで洗浄し,スライドガラスを用いて,粘膜をかき取った。粘膜は2枚のスライドガラスのすりガラス部分でこすり合わせて懸濁液を調製した。DNeasy Blood & Tissue kit(Qiagen,Hilden,Germany)を用いて,菌を含むマウス胃粘膜のDNAを調製した。最終産物のDNA濃度は,260nmの吸光度(A260)を測定し,以下の式により決定した。
DNA濃度(μg/mL)=A260×50(光路長10mm)
-80℃で保存していた菌液を滅菌蒸留水に懸濁し,95℃5分間処理後の遠心上清を粗精製染色体DNAとした。粗精製染色体DNAは,等量のフェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール(25:24:1)で抽出後,エタノール沈殿で精製し,少量の滅菌蒸留水に溶解させた。
(2)-1.PCR
Dream Taq DNA Polymerase(Thermo Fisher Sci.)を用いて,以下の組成の反応液(合計25μL)についてPCR反応をデュプリケートで行った:10×緩衝液 2.5μL,10mM dNTP mix 0.5μL,フォワード(FW)プライマー(5μM)1μL,リバース(RV)プライマー1μL,鋳型DNA 1μL(H.ピロリ(SS1株,TN2GF4株,RC-1株,ATCC43579株,NCTC11637株,TK1029株,TK1081株,TY1289株,及びTY281株)DNA各々1ng,及び10ng,H.スイス(SNTW101株及びTKY株)感染マウスの胃生検から調製したDNA各々10-3ng,10-2ng,10-1ng,1ng,10ng,及び100ng),DNA polymerase 0.25μL,及び滅菌蒸留水16.75μL。PCRの反応条件は,95℃1分でホールドした後,1サイクル95℃30秒,55℃30秒,及び72℃1分を35サイクル行い,その後72℃で5分維持した。
(フォワードプライマー)
HSVANOFW-2:AGAAACGAGATTACAGGAAG(配列番号51)
HSVANOFW-3:AGGAGCAAGTTTTGTAGCAG(配列番号52)HSVANOFW-5:AAAATGCGACTGATTGGATG(配列番号53)
(リバースプライマー)
HSVANORV-1:ATCGAAATAAGCGAACCTCA(配列番号72)
HSVANORV-3:TTGAAAGCTTAGCTAAACGG(配列番号73)
HSVANORV4:TGGTATTGCTGGTTAAGAGG(配列番号74)
VAC3624F(フォワード):GAGCGAGCTATGGTTATGAC(配列番号84)
VAC4041R(リバース):CATTCCTAAATTGGAAGCGAA(配列番号85)
IDT社に委託して,以下の配列を有するダブルクエンチャープローブ(PrimeTime(登録商標)qPCR Probes)を合成した。プライマーは,上述のFW5とRW3がH.スイスの菌株間で同一性が高いことから,同じ領域に新たなプライマーとして設計した。
プローブ:FAM/TGTACACAC/ZEN/CAAACAGATGAGCCGT(配列番号75)/3IABkFQ
フォワード:
GATGGGCGCTTCTGGTTTA(配列番号47)
リバース:
CTGGTAATGCATCATTAGAAGCAAA(配列番号65)
95℃ 3分,1サイクル
95℃ 15秒-60℃ 1分,40サイクル
事前に対象領域をクローニングしたプラスミドを用いて検量線を作成した。その結果,102コピーから107コピーの間で良好な増幅効率,定量性を示した(結果非図示)。H.ピロリ及びH.スイス感染マウス胃生検組織DNAを用いたPCRの結果を図5に示す。設計されたHSVANOFW-2/HSVANORV-4、HSVANOFW-3/HSVANORV-4、HSVANOFW-5/HSVANORV-4のプライマーの組み合わせは,いずれもH.スイス特異的に増幅し,H.ピロリのDNAの増幅は見られなかった。一方で,H.ピロリのvacAに対して設計されたプライマーは,H.ピロリのDNAのみを増幅し,H.スイスのDNAは増幅しなかった。
PCRによるH.スイスの特異的検出に成功したことから,HsvAが発現している可能性を考慮し,HsvAを標的としたH.スイス感染の診断が可能であるかに関する検討を行った。
HsvAがコードしていると想定されるアミノ酸配列(配列番号2;図2)のうち,菌種の特異性及び株間での保存性から,抗原性が予測されるペプチド配列を以下の通り選択し,合成した。
No.11:EKKAVQQMENSNPD(配列番号3)
No.11(TKY):EKKAVEQMENSNPD(配列番号4)
No.11(SH8):EKDAVTSLKNSNSG(配列番号5)
No.11(SH10):EKDAVTSLENSNSG(配列番号6)
No.19:NQGTLEFLSNDVSN(配列番号7)
No.19(TKY):NQGTLEFLSNDVST(配列番号8)
No.33:LSNKLQGQLKSMGL(配列番号9)
No.33(TKY):LSNKLQDQLKSMGL(配列番号10)
No.33(SH10):FSDKLQNMLKSLNM(配列番号11)
No.16:TNGQEVSASIDYNK(配列番号12)
No.23:AKLSNFASNDALPD(配列番号13)
No.10:PTTSSGASPDSSNP(配列番号14)
No.21:GLGRDLFVHSMGDK(配列番号15)
No.15:QIGKIKLSDVLSAS(配列番号16)
No.34:YGAIDKELHFSGGK(配列番号17)
No.20:NVDNILNMPSTTSG(配列番号18)
No.22:GNLKGVYYPKSSTT(配列番号19)
No.14:ITEKIQSGKLTITI(配列番号20)
No.26:FHDFLVSLKGKKFA(配列番号21)
No.31:TTGGEVRLFRSFYV(配列番号22)
No.35:IGARFGLDYQDINI(配列番号23)
No.8:KQLPQPKRSELKPK(配列番号86)
No.31N:TNIKQYMQNNHRSQ(配列番号87)
No.81:TLTLEGTETFAQNS(配列番号88)
No.63:EAYAKNQGDIWSTI(配列番号89)
No.73:VIGSKSSITLNSAN(配列番号90)
No.61:ADIQSSQTTFANSV(配列番号91)
以上の選択された配列のうち,No.10、No.11,No.16、No.19,No.33、及びNo.61それぞれ14-merのペプチドのアミノ末端にシステイン(C)を付加したペプチドを合成した。キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)をキャリアとして,ウサギ(ニュージーランドホワイト)へ免疫し,ELISA力価1:512,000以上を得た。免疫ウサギ血清をProtein Gを結合したアフィニティーカラムにて精製し,回収したIgG分画を抗ペプチドウサギ抗体(ポリクローナル抗体)として以下の実験において用いた。。
H.ピロリは,10%牛胎児血清(FCS)を含むブルセラブロスで温度37℃,湿度100%,微好気条件(5%O2,10%CO2,85%N2)で48時間振とう培養を行った後で,培養液を遠心分離により菌体を集めた。菌体は滅菌した蒸留水で3回洗浄し,リポ多糖成分を除き,少量の菌体は滅菌した蒸留水で懸濁した。
96-wellプレートを使用するBio-Radプロテインアッセイキットを用いてタンパク質を定量した。検量線作成には,牛血清アルブミン(BSA)を標準タンパク質として用いた。
0.2M炭酸-重炭酸緩衝液(pH9.4)に溶解したペプチド又は実施例2(4)で調製したH.ピロリ全菌体(4μg/mL)100μL/wellを96-well NUNC-Immuno Plate #439454へ滴下し,4℃に一夜置いた。翌日,ペプチド溶液を廃棄し,PBS-T(0.05%(V/V)Tween20を含むリン酸緩衝食塩水,pH7.4)200μL/wellで3回洗浄した。滅菌蒸留水で5倍希釈したNacalai Tesque ブロッキング溶液(PBS系pH7.2)を200μL/well滴下し,37℃に1時間置いた。ブロッキング溶液を廃棄し,PBS-T(0.05%(V/V)Tween20を含む燐酸緩衝食塩水,pH7.4)200μL/wellで3回洗浄した。
0.2M炭酸-重炭酸緩衝液(pH9.4)に溶解したペプチド抗体Nos.11,19,及び33(1μg/mL)100 μL/wellを96-well NUNC-Immuno Plate #439454へ滴下し,4℃に一夜置いた。翌日,抗体溶液を廃棄し,PBS-T(0.05%(V/V)Tween20を含むリン酸緩衝食塩水、pH7.4)200μL/wellで3回洗浄した。滅菌蒸留水で5倍希釈したNacalai Tesqueブロッキング溶液(リン酸緩衝液系pH7.2)を200μL/well滴下し,37℃に1時間置いた。ブロッキング溶液を廃棄し,PBS-T (0.05%(V/V)Tween20を含むリン酸緩衝食塩水、pH7.4)200μL/wellで3回洗浄した。滅菌蒸留水で10倍希釈のNacalai Tesque ブロッキング溶液(リン酸緩衝液系pH7.2)を用いて希釈したペプチドNos.11,19,33(4μg/mL)を100μL/well滴下し,37℃に1時間置いた。ペプチド溶液を廃棄し,PBS-T(0.05%(V/V)Tween20を含むリン酸緩衝食塩水、pH7.4)200μL/wellで3回洗浄した。交換水で10倍希釈のNacalai Tesqueブロッキング溶液(PBS系pH7.2)を用いて希釈したマウス血清を100μL/well滴下し,37℃に1時間置いた。血清溶液を廃棄し,PBS-T(0.05%(V/V)Tween20を含むリン酸緩衝食塩水、pH7.4)200μL/wellで3回洗浄した。滅菌蒸留水で10倍希釈のNacalai Tesqueブロッキング溶液(リン酸緩衝液系pH7.2)を用いて100,000倍希釈した西洋わさびペルオキシダーゼ標識二次抗体(Donkey Anti-Mouse IgG, Jackson Immuno Research)を100 μL/well滴下し,37℃に1時間置いた。二次抗体溶液を廃棄し,PBS-T (0.05%(V/V)Tween20を含むリン酸緩衝食塩水、pH7.4)200μL/wellで3回洗浄した。SuperBlue TMB Microwell Peroxidase Substrate(1-Component),KPL社を100μL/well滴下し青く発色後に,1N塩酸を100 μL/well滴下し黄色へ変色させた。プレートリーダーを用いて450 nmの吸光度を測定した。
0.2M炭酸-重炭酸緩衝液(pH9.4)に溶解したNos.11,19及び33の各種ペプチド(4μg/mL)あるいは,H.ピロリ全菌体100μL/wellを96-well NUNC-Immuno Plate #439454へ滴下し,4℃に一夜置いた。翌日,ペプチド溶液を廃棄し,PBS-T(0.05%(V/V)Tween20を含むリン酸緩衝食塩水、pH7.4)200μL/wellで3回洗浄した。滅菌蒸留水で5倍希釈のNacalai Tesque ブロッキング溶液(リン酸緩衝液系系pH 7.2)を200μL/well滴下し,37℃に1時間置いた。ブロッキング溶液を廃棄し,PBS-T(0.05%(V/V)Tween 20を含む燐酸緩衝食塩水、pH7.4)200μL/wellで3回洗浄した。交換水で10倍希釈のNacalai Tesque ブロッキング溶液(リン酸緩衝液系pH7.2)を用いて希釈した実施例2(2)で得られた各抗ペプチド抗体(1μg/mL)100 μL/well滴下し,37℃に1時間置いた。血清溶液を廃棄し,PBS-T (0.05%(V/V)Tween20を含む燐酸緩衝食塩水、pH7.4)200μL/wellで3回洗浄した。交換水で10倍希釈のNacalai Tesque ブロッキング溶液(PBS系pH7.2)を用いて100,000倍希釈した西洋わさびペルオキシダーゼ標識二次抗体(Goat anti-Rabbit IgG,Jackson Immuno Research)を100μL/well滴下し,37℃に1時間置いた。二次抗体溶液を廃棄し,PBS-T(0.05%(V/V)Tween20を含むリン酸緩衝食塩水、pH7.4)200μL/wellで3回洗浄した。SuperBlue TMB Microwell Peroxidase Substrate(1-Component),KPL社を100μL/well滴下し青く発色後に,1N塩酸を100 μL/well滴下し黄色へ変色させた。プレートリーダーを用いて450nmの吸光度を測定した。
H.スイス感染ヒト胃パラフィン切片を,キシレン3回,無水エタノール1回,90%エタノール1回,80%エタノール1回,純水1回の順に浸し(それぞれ5分間),脱パラフィン処理した。脱パラフィン処理のスライドガラスを1% (W/V)スキムミルクを含むリン酸緩衝食塩水pH7.2を滴下し,室温30分置いてブロッキング処理した。次にスライドガラスをリン酸緩衝食塩水pH7.2で室温5分間,3回洗浄した。抗No. 11ペプチド抗体をリン酸緩衝食塩水pH7.2で2μg/mLに希釈し,スライドガラスへ滴下し室温3時間反応させた。スライドガラスから抗体溶液を除き,リン酸緩衝食塩水pH7.2で室温5分間,3回洗浄した。リン酸緩衝食塩水pH7.2で400倍希釈したAlexa-Fluor 488抗ウサギIgG(Thermo Fisher)(二次抗体)をスライドガラスに滴下し,室温3時間反応させた。スライドガラスから二次抗体溶液を除き,リン酸緩衝食塩水pH7.2で室温5分間,3回洗浄した。リン酸緩衝食塩水pH7.2で400倍希釈したAlexa-Fluor 568ファロイジン(Thermo Fisher)をスライドガラスに滴下し,室温30分反応させて対比染色した(Fアクチンを染色)。スライドガラスから二次抗体溶液を除き,リン酸緩衝食塩水pH7.2で室温5分間,3回洗浄した。スライドガラスをパーマ フロー(Therma Fisher)で封入した。共焦点レーザー蛍光顕微鏡,Leica TCS-SP5にて観察した。写真Aは,200倍,Bは,Aの囲んだ部分を760倍に拡大した写真である。矢印は,H.スイス菌体を示す。
実施例2で作製したペプチドNos.8,31N,81,63,73,61,11+11(TKY),11(SH8),11(SH10),19+19(TKY),33+33(TKY),33(SH10),16,23,10,21,20,22,31,35ペプチドあるいはH.pylori TN2GF4及びSS1全菌体(4μg/mL)を0.1M炭酸―重炭酸緩衝液(pH9.4)に溶解し、100μL/wellを96-wellプレート(NUNC-Immuno plate #439454)へ滴下し、4℃で一晩静置した。翌日、ペプチド溶液を廃棄し、PBS-T(0.05%(V/V)Tween20を含むリン酸緩衝食塩水、pH7.4)200μLで3回洗浄した。ブロッキング溶液(BSA,1%(W/V)リン酸緩衝液系、pH7.4)を200μL/well滴下し、37℃で1時間静置した。ブロッキング溶液を廃棄し、PBS-T 200μLで3回洗浄した。
実施例2において作製したNos.8,31N,81,63,73,61,11+11(TKY),11(SH8),11(SH10),19+19(TKY),33+33(TKY),33(SH10),16,23,10,21,20,22,31,35ペプチドを0.1M炭酸―重炭酸緩衝液(pH9.4)に溶解し(4μg/mL )100μL/wellを、96-wellプレート(NUNC-Immuno plate #439454)へ滴下し、4℃で一晩静置した。翌日、ペプチド溶液を廃棄し、PBS-T(0.05%(V/V)Tween20を含むリン酸緩衝食塩水、pH7.4)200μLで3回洗浄した。ブロッキング溶液(BSA,1%(W/V)リン酸緩衝液系、pH7.4)を200μL/wellで滴下し、37℃で1時間静置した。ブロッキング溶液を廃棄し、PBS-T 200μLで3回洗浄した。蒸留水で10倍希釈のNacalai Tesqueブロッキング溶液(リン酸緩衝液系pH7.2)を用いて、実施例2において抗ペプチドウサギポリクローナル抗体(IgG,0.2μg/mL)を50μL/wellで滴下し、37℃で1時間静置した(n=2)。血清溶液を廃棄し、PBS-T 200μL/wellで3回洗浄した。蒸留水で10倍希釈のNacalai Tesqueブロッキング溶液(リン酸緩衝液系(pH7.2)を用いて100,000倍希釈した西洋わさびペルオキシダーゼ標識二次抗体(Peroxidase-conjugated AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L),Jackson ImmunoResearch)を50μL滴下し、37℃で1時間静置した。二次抗体溶液を廃棄し、PBS-Tで3回洗浄した。SuperBlue TMB Microwell Perpxidase Substrate(1-Component,KPL)を50μL/well滴下し、青く発色後に、1N塩酸を50μL滴下して黄色へと変色させた。プレートリーダーを用いて450nm(リファレンス630nm)の吸光度を測定した。
結果を図15に示す。各ペプチド抗体は、抗原として用いた対応するペプチドとのみ特異的に反応することが示された。
0.1M炭酸/重炭酸緩衝液(pH9.4)に溶解したH.ピロリSS1,H.ピロリTN2GF4,H.ピロリNCTC11637,H.ピロリTY1289,H.ピロリRC-1,H.ピロリTK1029,H.ピロリTY281,H.ピロリATCC43579,H.ピロリTK1081,H.スイスSNTW101(4μg/mL)100μL/wellを96-wellプレート(NUNC-Immuno plate #439454)へ滴下し、4℃で一晩静置した。翌日、ペプチド溶液を廃棄し、PBS-T(0.05%(V/V)Tween20を含むリン酸緩衝食塩水、pH7.4)200μLで3回洗浄した。ブロッキング溶液(BSA,1%(W/V)リン酸緩衝液系、pH7.4)を200μL/well滴下し、37℃で1時間静置した。ブロッキング溶液を廃棄し、PBS-T 200μLで3回洗浄した。蒸留水で10倍希釈のNacalai Tesqueブロッキング溶液(リン酸緩衝液系pH7.2)を用いて、実施例2において調製した抗ペプチドウサギポリクローナル抗体(IgG,0.2μg/mL)又はH.ピロリSS1に対するポリクローナル抗体(ウサギIgG)(非特許文献4に記載)を50μL/well滴下し、37℃で1時間静置した(n=2~4)。血清溶液を廃棄し、PBS-T 200μL/wellで3回洗浄した。蒸留水で10倍希釈のNacalai Tesqueブロッキング溶液(リン酸緩衝液系pH7.2)を用いて100,000倍希釈した西洋わさびペルオキシダーゼ標識二次抗体(Peroxidase-conjugated AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L),Jackson ImmunoResearch)を50μL滴下し、37℃で1時間静置した。二次抗体溶液を廃棄し、PBS-Tで3回洗浄した。SuperBlue TMB Microwell Perpxidase Substrate(1-Component,KPL)を50μL/well滴下し、青く発色後に、1N塩酸を50μL滴下して黄色へ変色させた。プレートリーダーを用いて450nm(リファレンス630nm)の吸光度を測定した。
(1) 感染マウスの胃粘膜中からのH.suis SNTW101の分離・培養
Smet A., et al., International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology (2012), 62, 299-306の方法を基本に培地を改良して培養を行った。Brecella agar plate(skirrow 2vials/L,vancomycin 10mg/L,trimethoprim 5mg/L,polymyxin B 2500IU/L,vitox 2vials/L,amphotericin B 5mg/L,fetal calf serum 20%(V/V))に塩酸0.05%(V/V)とlinezolid 10mg/Lを加えた。37℃、湿度100%、12%CO2,5%O2,83%N2条件下で2週間振とう培養し、1日おきにBrucella broth(skirrow 2vials/L,vitox 2vials/L,linezolid 5mg/L,fetal calf serum 20%(V/V),pH5)を150μL添加した。培養液の遠心沈殿を3回水洗したものをH.スイスSNTW101菌体とした。蛋白質の定量は、Bio-Radプロテインアッセイキットを用いた。牛血清アルブミン(BSA)を標準蛋白質として、検量線を作成した。
H.スイスSNTW101感染C57BL/6マウスの胃を大湾に沿って切開した。内容物をPBSで洗浄し後、垂直方向に切除し、10%中性緩衝ホルマリンで固定した。胃組織をパラフィンに包埋し、切片を4μmで作製した。脱パラフィン後に水洗し、クエン酸緩衝液(pH6.0)を用いて95℃で20分間熱処理し、抗原の賦活化を行った。水洗後、0.3%の過酸化水素水と10分間室温で反応させた。PBSで2回洗浄後、anti-No.16ペプチド抗体(2μg/mL PBS)と室温で1時間反応させた。PBSで2回洗浄後に二次抗体としてヒストファインシプルステインマウスMAX-PO(R)(ニチレイ,Code.414341)と30分間室温で反応させた。PBSで2回洗浄後にDAB(3,3’-ジアミノベンジジン四塩酸塩)溶液を用いて5分間室温で発色させた。PBSで2回洗浄後にヘマトキシリンにて後染色を行い、水洗後に脱水、透徹、封入し顕微鏡観察を行った。
Claims (16)
- 配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号2に記載のアミノ酸配列のうち、28~2992番目のアミノ酸からなるタンパク質。
- 被検者のH.スイスへの感染を判定する方法であって,
被験者由来のサンプル中のHsvAタンパク質を検出すること,前記HsvAタンパク質又はその断片が検出されたサンプルをH.スイスが存在すると判定すること,及び
当該方法においてH.スイスが存在すると判定されたサンプルが由来する被験者をH.スイスに感染していると判定することを含み、
前記HsvAタンパク質が、H.スイスに由来する,ヘリコバクター属細菌の外膜タンパク質のアミノ末端側のシグナルペプチド領域と,カルボキシ末端側のオートトランスポーター(タンパク質の外膜輸送機構)βドメイン及び,機能発現に関与するdisorder領域を有するタンパク質である、方法。 - 請求項2に記載の感染判定方法であって:
前記被験者由来のサンプルとH.スイス由来のHsvA抗原ペプチドに特異的に結合する抗体又はその免疫反応性断片とを接触させること,
前記抗体又はその免疫反応性断片と結合した,前記サンプル中のHsvAタンパク質を検出すること,及び
前記抗体又はその免疫反応性断片と結合したHsvAタンパク質が検出されたサンプルをH.スイスが存在するサンプルと判定することを含み、
前記HsvA抗原ペプチドが、HsvAタンパク質の細胞外ドメインを構成するアミノ酸配列である、方法。 - 被験者のH.スイスへの感染を判定する方法であって,
被験者由来の血液サンプル中のHsvA抗原ペプチドと結合する抗体を検出すること,及び
前記ペプチドと結合する抗体が検出された被験者をH.スイスに感染していると判定することを含み、
前記HsvA抗原ペプチドが、HsvAタンパク質の細胞外ドメインを構成するアミノ酸配列である、方法。 - 以下の工程を含む,請求項4に記載のH.スイスへの感染を判定する方法:
被験者由来のサンプルと以下の群から選択されるいずれか1つのペプチドとを接触させること:
配列番号2、配列番号28、配列番号30、及び配列番号78~83のいずれか1つに記載のアミノ酸配列に含まれる5~50アミノ酸からなる配列を有するH.スイス由来のHsvA抗原ペプチド,
EKX1AVX2X3X4X5NSNX6X7(ペプチドNo.11:配列番号24),
EKKAVQQMENSNPD(ペプチドNo.11:配列番号3),
EKKAVEQMENSNPD(ペプチドNo.11(TKY):配列番号4),
EKDAVTSLKNSNSG(ペプチドNo.11(SH8):配列番号5),
EKDAVTSLENSNSG(ペプチドNo.11(SH10):配列番号6),
NQGTLEFLSNDVSX8(ペプチドNo.19:配列番号25),
NQGTLEFLSNDVSN(ペプチドNo.19:配列番号7),
NQGTLEFLSNDVST(ペプチドNo.19(TKY):配列番号8),
X9SX10KLQX11X12LKSX13X14X15(ペプチドNo.33:配列番号26),
LSNKLQGQLKSMGL(ペプチドNo.33:配列番号9),
LSNKLQDQLKSMGL(ペプチドNo.33(TKY):配列番号10),
FSDKLQNMLKSLNM(ペプチドNo.33(SH10):配列番号11),
TNGQEVSASIDYNK(ペプチドNo.16:配列番号12),
AKLSNFASNDALPD(ペプチドNo.23:配列番号13),
PTTSSGASPDSSNP(ペプチドNo.10:配列番号14),
GLGRDLFVHSMGDK(ペプチドNo.21:配列番号15),
QIGKIKLSDVLSAS(ペプチドNo.15:配列番号16),
YGAIDKELHFSGGK(ペプチドNo.34:配列番号17),
NVDNILNMPSTTSG(ペプチドNo.20:配列番号18),
GNLKGVYYPKSSTT(ペプチドNo.22:配列番号19),
ITEKIQSGKLTITI(ペプチドNo.14:配列番号20),
FHDFLVSLKGKKFA(ペプチドNo.26:配列番号21),
TTGGEVRLFRSFYV(ペプチドNo.31:配列番号22),
IGARFGLDYQDINI(ペプチドNo.35:配列番号23)、
KQLPQPKRSELKPK(ペプチドNo.8:配列番号86)、
TNIKQYMQNNHRSQ(ペプチドNo.31N:配列番号87)、
TLTLEGTETFAQNS(ペプチドNo.81:配列番号88)、
EAYAKNQGDIWSTI(ペプチドNo.63:配列番号89)、
VIGSKSSITLNSAN(ペプチドNo.73:配列番号90)、及び
ADIQSSQTTFANSV(ペプチドNo.61:配列番号91)
ここで,X1はK又はDであり,X2はQ,E又はTであり,X3はQ又はSであり,X4はM又はLであり,X5はE又はKであり,X6はP又はSであり,X7はD又はGであり,X8はN又はTであり,X9はL又はFであり,X10はN又はDであり,X11はG,D又はNであり,X12はQ又はMであり,X13はM又はLであり,X14はG又はNであり,かつX15はL又はMである,
前記ペプチドと結合した,前記血液サンプル中の抗体を検出すること,及び
前記ペプチドと結合した抗体が検出された被験者をH.スイスに感染していると判定すること。 - 配列番号2、配列番号28、配列番号30、及び配列番号78~83のいずれか1つに記載のアミノ酸配列に含まれる5~50アミノ酸からなる配列を有するH.スイス由来のHsvA抗原ペプチド,及び/又は,配列番号2及び配列番号78~83のいずれか1つに記載のアミノ酸配列に含まれる5~50アミノ酸からなる配列を有するH.スイス由来のHsvA抗原ペプチドに特異的に結合する抗体又はその免疫反応性断片を含有する,H.スイス感染判定用組成物であって,
ここで,前記HsvA抗原ペプチドが,H.スイスに特異的であり、かつ、H.ピロリには存在しないアミノ酸配列からなるペプチドである,組成物。 - 配列番号2,配列番号28,配列番号30,及び配列番号78~83のいずれか1つに記載のアミノ酸配列に含まれる5~50アミノ酸からなる配列を有するH.スイス由来のHsvA抗原ペプチド,及び,配列番号2,配列番号28,配列番号30,及び配列番号78~83のいずれか1つに記載のアミノ酸配列に含まれる5~50アミノ酸からなる配列を有するH.スイス由来のHsvA抗原ペプチドに特異的に結合する抗体又はその免疫反応性断片から選択されるいずれか一つを含有する医薬組成物。
- H.スイス除菌療法用である,請求項7に記載の医薬組成物。
- 胃炎,胃潰瘍や十二指腸潰瘍,胃癌,慢性胃炎,胃MALTリンパ腫,鳥肌胃炎,特発性血小板減少紫斑病,機能性ディスペプシア,又はびまん性大細胞型B細胞性リンパ腫の治療用又は予防用である,請求項7に記載の医薬組成物。
- 前記抗体が,配列番号2、配列番号28、配列番号30、及び配列番号78~83のいずれか1つに記載のアミノ酸配列に含まれる5~50アミノ酸からなる配列を有するH.スイス由来のHsvA抗原ペプチドに特異的に結合する抗体である,請求項3または4に記載の方法。
- H.ピロリ感染が検出されないことを特徴とする、請求項2または3に記載の感染判定方法。
- HsvA抗原ペプチドが,配列番号2、配列番号28、配列番号30、及び配列番号78~83のいずれか1つに記載のアミノ酸配列に含まれる5~50アミノ酸からなる配列を有するペプチドである,請求項2、3及び請求項11のいずれか1項に記載の感染判定方法。
- HsvA抗原ペプチドが,以下の群から選択されるいずれか1つのアミノ酸配列を有するペプチドである,請求項12に記載の感染判定方法:
EKX1AVX2X3X4X5NSNX6X7(ペプチドNo.11:配列番号24),
NQGTLEFLSNDVSX8(ペプチドNo.19:配列番号25),
X9SX10KLQX11X12LKSX13X14X15(ペプチドNo.33:配列番号26),
TNGQEVSASIDYNK(ペプチドNo.16:配列番号12),
AKLSNFASNDALPD(ペプチドNo.23:配列番号13),
PTTSSGASPDSSNP(ペプチドNo.10:配列番号14),
GLGRDLFVHSMGDK(ペプチドNo.21:配列番号15),
QIGKIKLSDVLSAS(ペプチドNo.15:配列番号16),
YGAIDKELHFSGGK(ペプチドNo.34:配列番号17),
NVDNILNMPSTTSG(ペプチドNo.20:配列番号18),
GNLKGVYYPKSSTT(ペプチドNo.22:配列番号19),
ITEKIQSGKLTITI(ペプチドNo.14:配列番号20),
FHDFLVSLKGKKFA(ペプチドNo.26:配列番号21),
TTGGEVRLFRSFYV(ペプチドNo.31:配列番号22),
IGARFGLDYQDINI(ペプチドNo.35:配列番号23)、
KQLPQPKRSELKPK(ペプチドNo.8:配列番号86)、
TNIKQYMQNNHRSQ(ペプチドNo.31N:配列番号87)、
TLTLEGTETFAQNS(ペプチドNo.81:配列番号88)、
EAYAKNQGDIWSTI(ペプチドNo.63:配列番号89)、
VIGSKSSITLNSAN(ペプチドNo.73:配列番号90)、及び
ADIQSSQTTFANSV(ペプチドNo.61:配列番号91)
ここで,X1はK又はDであり,X2はQ,E又はTであり,X3はQ又はSであり,X4はM又はLであり,X5はE又はKであり,X6はP又はSであり,X7はD又はGであり,X8はN又はTであり,X9はL又はFであり,X10はN又はDであり,X11はG,D又はNであり,X12はQ又はMであり,X13はM又はLであり,X14はG又はNであり,かつX15はL又はMである。 - HsvA抗原ペプチドが,以下の群から選択されるいずれか1つのアミノ酸配列を有するペプチドである,請求項12に記載の感染判定方法:
EKKAVQQMENSNPD(ペプチドNo.11:配列番号3),
EKKAVEQMENSNPD(ペプチドNo.11(TKY):配列番号4),
EKDAVTSLKNSNSG(ペプチドNo.11(SH8):配列番号5),
EKDAVTSLENSNSG(ペプチドNo.11(SH10):配列番号6),
NQGTLEFLSNDVSN(ペプチドNo.19:配列番号7),
NQGTLEFLSNDVST(ペプチドNo.19(TKY):配列番号8),
LSNKLQGQLKSMGL(ペプチドNo.33:配列番号9),
LSNKLQDQLKSMGL(ペプチドNo.33(TKY):配列番号10),
FSDKLQNMLKSLNM(ペプチドNo.33(SH10):配列番号11),
TNGQEVSASIDYNK(ペプチドNo.16:配列番号12),
AKLSNFASNDALPD(ペプチドNo.23:配列番号13),
PTTSSGASPDSSNP(ペプチドNo.10:配列番号14),
GLGRDLFVHSMGDK(ペプチドNo.21:配列番号15),
QIGKIKLSDVLSAS(ペプチドNo.15:配列番号16),
YGAIDKELHFSGGK(ペプチドNo.34:配列番号17),
NVDNILNMPSTTSG(ペプチドNo.20:配列番号18),
GNLKGVYYPKSSTT(ペプチドNo.22:配列番号19),
ITEKIQSGKLTITI(ペプチドNo.14:配列番号20),
FHDFLVSLKGKKFA(ペプチドNo.26:配列番号21),
TTGGEVRLFRSFYV(ペプチドNo.31:配列番号22),
IGARFGLDYQDINI(ペプチドNo.35:配列番号23)、
KQLPQPKRSELKPK(ペプチドNo.8:配列番号86)、
TNIKQYMQNNHRSQ(ペプチドNo.31N:配列番号87)、
TLTLEGTETFAQNS(ペプチドNo.81:配列番号88)、
EAYAKNQGDIWSTI(ペプチドNo.63:配列番号89)、
VIGSKSSITLNSAN(ペプチドNo.73:配列番号90)、及び
ADIQSSQTTFANSV(ペプチドNo.61:配列番号91)。 - HsvA抗原ペプチドが,以下の群から選択されるいずれか1つのアミノ酸配列を有するペプチドである,請求項3に記載の感染判定方法:
EKKAVQQMENSNPD(ペプチドNo.11:配列番号3),
EKKAVEQMENSNPD(ペプチドNo.11(TKY):配列番号4),
EKDAVTSLKNSNSG(ペプチドNo.11(SH8):配列番号5),
EKDAVTSLENSNSG(ペプチドNo.11(SH10):配列番号6),
TNGQEVSASIDYNK(ペプチドNo.16:配列番号12)。 - HsvA抗原ペプチドが,以下の群から選択されるいずれか1つのアミノ酸配列を有するペプチドである,請求項3に記載の感染判定方法:
EKKAVQQMENSNPD(ペプチドNo.11:配列番号3),
TNGQEVSASIDYNK(ペプチドNo.16:配列番号12)。
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