JP2024012505A - ヘリコバクター・スイス感染の診断法 - Google Patents
ヘリコバクター・スイス感染の診断法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2024012505A JP2024012505A JP2023188569A JP2023188569A JP2024012505A JP 2024012505 A JP2024012505 A JP 2024012505A JP 2023188569 A JP2023188569 A JP 2023188569A JP 2023188569 A JP2023188569 A JP 2023188569A JP 2024012505 A JP2024012505 A JP 2024012505A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- seq
- hsva
- peptide
- antibody
- swiss
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 title description 58
- 241001490623 Helicobacter suis Species 0.000 title description 31
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 title description 5
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 abstract description 265
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 193
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 146
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 98
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 abstract description 68
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 abstract description 68
- 239000000427 antigen Substances 0.000 abstract description 67
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 abstract description 60
- 238000012360 testing method Methods 0.000 abstract description 19
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 abstract description 17
- 101710116435 Outer membrane protein Proteins 0.000 abstract description 9
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 abstract description 7
- 241000670091 Haematopinus suis Species 0.000 abstract 7
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 108
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 97
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 72
- 238000009739 binding Methods 0.000 description 71
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 69
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 69
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 69
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 61
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 55
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 50
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 50
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 50
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 49
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 45
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 42
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 39
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 32
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 31
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 31
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 29
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 27
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 27
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 26
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 24
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 23
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 23
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 21
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 19
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 18
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 17
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 17
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 17
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 17
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 17
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 16
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 15
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 15
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 15
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 15
- 208000007882 Gastritis Diseases 0.000 description 14
- 241001495142 Helicobacter heilmannii Species 0.000 description 14
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 14
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 13
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 13
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 13
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 12
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 12
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 11
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 11
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 11
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 11
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 11
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 11
- 241000589989 Helicobacter Species 0.000 description 10
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 10
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 10
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 10
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 10
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 10
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 10
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 10
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 10
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 10
- -1 T and S or A Chemical class 0.000 description 9
- 230000002788 anti-peptide Effects 0.000 description 9
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 9
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 9
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 8
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 8
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 8
- 108010046334 Urease Proteins 0.000 description 7
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 7
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 7
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 7
- 239000013076 target substance Substances 0.000 description 7
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 6
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 6
- 230000008859 change Effects 0.000 description 6
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 6
- 210000001156 gastric mucosa Anatomy 0.000 description 6
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 6
- KIGJWIPKAWAGCE-UHFFFAOYSA-L gun blue Chemical compound Cl.[Cu+2].O[Se](=O)=O.[O-]S([O-])(=O)=O KIGJWIPKAWAGCE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 5
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 5
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 5
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 5
- 108010073429 Type V Secretion Systems Proteins 0.000 description 5
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 5
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 5
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 5
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 5
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 5
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 5
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 5
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 5
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 5
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 5
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 5
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 description 5
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 5
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 4
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 4
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 4
- 241000048052 Helicobacter cynogastricus Species 0.000 description 4
- 241000590017 Helicobacter felis Species 0.000 description 4
- 241000590006 Helicobacter mustelae Species 0.000 description 4
- 208000031671 Large B-Cell Diffuse Lymphoma Diseases 0.000 description 4
- 206010035039 Piloerection Diseases 0.000 description 4
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 description 4
- 208000007107 Stomach Ulcer Diseases 0.000 description 4
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 4
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 4
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 4
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 4
- 239000011545 carbonate/bicarbonate buffer Substances 0.000 description 4
- 208000023652 chronic gastritis Diseases 0.000 description 4
- 206010012818 diffuse large B-cell lymphoma Diseases 0.000 description 4
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 4
- 208000000718 duodenal ulcer Diseases 0.000 description 4
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 4
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 4
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 4
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 description 4
- 208000017215 gastric mucosa-associated lymphoid tissue lymphoma Diseases 0.000 description 4
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N isoamylol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 4
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 4
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 4
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 description 4
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 4
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 4
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 4
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241001379776 Helicobacter baculiformis Species 0.000 description 3
- 241001473947 Helicobacter pylori SS1 Species 0.000 description 3
- 241000417247 Homotherium serum Species 0.000 description 3
- 206010021245 Idiopathic thrombocytopenic purpura Diseases 0.000 description 3
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 3
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 3
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 3
- 102000003939 Membrane transport proteins Human genes 0.000 description 3
- 108090000301 Membrane transport proteins Proteins 0.000 description 3
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 3
- 241000194021 Streptococcus suis Species 0.000 description 3
- 208000031981 Thrombocytopenic Idiopathic Purpura Diseases 0.000 description 3
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 3
- 108010004469 allophycocyanin Proteins 0.000 description 3
- 201000003710 autoimmune thrombocytopenic purpura Diseases 0.000 description 3
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 3
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 3
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 239000006196 drop Substances 0.000 description 3
- 201000006549 dyspepsia Diseases 0.000 description 3
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical class O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 201000005917 gastric ulcer Diseases 0.000 description 3
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 3
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 230000009061 membrane transport Effects 0.000 description 3
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 3
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 3
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 3
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 3
- 238000003118 sandwich ELISA Methods 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 3
- 101150080234 vacA gene Proteins 0.000 description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 241000589562 Brucella Species 0.000 description 2
- 238000011740 C57BL/6 mouse Methods 0.000 description 2
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 2
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000557057 Helicobacter bizzozeronii Species 0.000 description 2
- 241000590002 Helicobacter pylori Species 0.000 description 2
- 241001473949 Helicobacter pylori NCTC 11637 = CCUG 17874 = ATCC 43504 Species 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 description 2
- KPKZJLCSROULON-QKGLWVMZSA-N Phalloidin Chemical compound N1C(=O)[C@@H]([C@@H](O)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C[C@@](C)(O)CO)NC(=O)[C@H](C2)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]3C[C@H](O)CN3C(=O)[C@@H]1CSC1=C2C2=CC=CC=C2N1 KPKZJLCSROULON-QKGLWVMZSA-N 0.000 description 2
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 2
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 2
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 2
- SESFRYSPDFLNCH-UHFFFAOYSA-N benzyl benzoate Chemical compound C=1C=CC=CC=1C(=O)OCC1=CC=CC=C1 SESFRYSPDFLNCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 238000012767 chemiluminescent enzyme immunoassay Methods 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 2
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 2
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 2
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 2
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091008053 gene clusters Proteins 0.000 description 2
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 2
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940037467 helicobacter pylori Drugs 0.000 description 2
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 2
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 2
- 238000003317 immunochromatography Methods 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 2
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 2
- 108010045069 keyhole-limpet hemocyanin Proteins 0.000 description 2
- 229960003907 linezolid Drugs 0.000 description 2
- TYZROVQLWOKYKF-ZDUSSCGKSA-N linezolid Chemical compound O=C1O[C@@H](CNC(=O)C)CN1C(C=C1F)=CC=C1N1CCOCC1 TYZROVQLWOKYKF-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 2
- HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N luminol Chemical compound O=C1NNC(=O)C2=C1C(N)=CC=C2 HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 2
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 2
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 2
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 229940124531 pharmaceutical excipient Drugs 0.000 description 2
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 2
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 2
- 238000002731 protein assay Methods 0.000 description 2
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 2
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 2
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 2
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 2
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 2
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 2
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 2
- GXYLXFITCXXCQV-UHFFFAOYSA-N 10-methylacridin-10-ium Chemical compound C1=CC=C2[N+](C)=C(C=CC=C3)C3=CC2=C1 GXYLXFITCXXCQV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PNDPGZBMCMUPRI-HVTJNCQCSA-N 10043-66-0 Chemical compound [131I][131I] PNDPGZBMCMUPRI-HVTJNCQCSA-N 0.000 description 1
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LJCNDNBULVLKSG-UHFFFAOYSA-N 2-aminoacetic acid;butane Chemical compound CCCC.CCCC.NCC(O)=O LJCNDNBULVLKSG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KJDSORYAHBAGPP-UHFFFAOYSA-N 4-(3,4-diaminophenyl)benzene-1,2-diamine;hydron;tetrachloride Chemical compound Cl.Cl.Cl.Cl.C1=C(N)C(N)=CC=C1C1=CC=C(N)C(N)=C1 KJDSORYAHBAGPP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HUDPLKWXRLNSPC-UHFFFAOYSA-N 4-aminophthalhydrazide Chemical compound O=C1NNC(=O)C=2C1=CC(N)=CC=2 HUDPLKWXRLNSPC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000004925 Acrylic resin Substances 0.000 description 1
- 229920000178 Acrylic resin Polymers 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-N Adenosine triphosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- 108010025188 Alcohol oxidase Proteins 0.000 description 1
- 239000012103 Alexa Fluor 488 Substances 0.000 description 1
- 239000012109 Alexa Fluor 568 Substances 0.000 description 1
- APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N Amphotericin-B Natural products O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1C=CC=CC=CC=CC=CC=CC=C[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N 0.000 description 1
- 102100033897 Ankyrin repeat and SOCS box protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 241000272814 Anser sp. Species 0.000 description 1
- 108020004491 Antisense DNA Proteins 0.000 description 1
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 1
- 241001550224 Apha Species 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 240000003291 Armoracia rusticana Species 0.000 description 1
- 235000011330 Armoracia rusticana Nutrition 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000036170 B-Cell Marginal Zone Lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 229920000049 Carbon (fiber) Polymers 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-NJFSPNSNSA-N Carbon-14 Chemical compound [14C] OKTJSMMVPCPJKN-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- BVTJGGGYKAMDBN-UHFFFAOYSA-N Dioxetane Chemical compound C1COO1 BVTJGGGYKAMDBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283074 Equus asinus Species 0.000 description 1
- PIICEJLVQHRZGT-UHFFFAOYSA-N Ethylenediamine Chemical compound NCCN PIICEJLVQHRZGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000012895 Gastric disease Diseases 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 239000004366 Glucose oxidase Substances 0.000 description 1
- 108010015776 Glucose oxidase Proteins 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 241000303608 Helicobacter felis ATCC 49179 Species 0.000 description 1
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 1
- 241000039246 Heterogaster chinensis Species 0.000 description 1
- 101000925496 Homo sapiens Ankyrin repeat and SOCS box protein 1 Proteins 0.000 description 1
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical group NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical group CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 108010073450 Lactate 2-monooxygenase Proteins 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NNJVILVZKWQKPM-UHFFFAOYSA-N Lidocaine Chemical compound CCN(CC)CC(=O)NC1=C(C)C=CC=C1C NNJVILVZKWQKPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 229920000433 Lyocell Polymers 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 229920001407 Modal (textile) Polymers 0.000 description 1
- 102000010909 Monoamine Oxidase Human genes 0.000 description 1
- 108010062431 Monoamine oxidase Proteins 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N O-Xylene Chemical compound CC1=CC=CC=C1C CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 238000002944 PCR assay Methods 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 108010009711 Phalloidine Proteins 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-OUBTZVSYSA-N Phosphorus-32 Chemical compound [32P] OAICVXFJPJFONN-OUBTZVSYSA-N 0.000 description 1
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 108010093965 Polymyxin B Proteins 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 229920001328 Polyvinylidene chloride Polymers 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710130181 Protochlorophyllide reductase A, chloroplastic Proteins 0.000 description 1
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 229920000297 Rayon Polymers 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 1
- 208000037065 Subacute sclerosing leukoencephalitis Diseases 0.000 description 1
- 206010042297 Subacute sclerosing panencephalitis Diseases 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- NINIDFKCEFEMDL-AKLPVKDBSA-N Sulfur-35 Chemical compound [35S] NINIDFKCEFEMDL-AKLPVKDBSA-N 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 1
- YZCKVEUIGOORGS-NJFSPNSNSA-N Tritium Chemical compound [3H] YZCKVEUIGOORGS-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000025865 Ulcer Diseases 0.000 description 1
- 101800000970 Vacuolating cytotoxin Proteins 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010059993 Vancomycin Proteins 0.000 description 1
- 229920002978 Vinylon Polymers 0.000 description 1
- 244000195452 Wasabia japonica Species 0.000 description 1
- 235000000760 Wasabia japonica Nutrition 0.000 description 1
- 239000006096 absorbing agent Substances 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N acridine Chemical class C1=CC=CC2=CC3=CC=CC=C3N=C21 DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N acrylic acid group Chemical group C(C=C)(=O)O NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000122 acrylonitrile butadiene styrene Polymers 0.000 description 1
- 125000005073 adamantyl group Chemical group C12(CC3CC(CC(C1)C3)C2)* 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 239000000956 alloy Substances 0.000 description 1
- 229910045601 alloy Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N amphotericin B Chemical compound O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N 0.000 description 1
- 229960003942 amphotericin b Drugs 0.000 description 1
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 1
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940124350 antibacterial drug Drugs 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003816 antisense DNA Substances 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 210000001742 aqueous humor Anatomy 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 229960002903 benzyl benzoate Drugs 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 239000004917 carbon fiber Substances 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 239000004359 castor oil Substances 0.000 description 1
- 235000019438 castor oil Nutrition 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 1
- 229910052804 chromium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011651 chromium Substances 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000005515 coenzyme Substances 0.000 description 1
- 238000004040 coloring Methods 0.000 description 1
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- 229940039227 diagnostic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000000032 diagnostic agent Substances 0.000 description 1
- 210000002249 digestive system Anatomy 0.000 description 1
- 230000006806 disease prevention Effects 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000001804 emulsifying effect Effects 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 230000008029 eradication Effects 0.000 description 1
- 230000003628 erosive effect Effects 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 239000003889 eye drop Substances 0.000 description 1
- 229940012356 eye drops Drugs 0.000 description 1
- 210000003495 flagella Anatomy 0.000 description 1
- FVTCRASFADXXNN-SCRDCRAPSA-N flavin mononucleotide Chemical compound OP(=O)(O)OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O FVTCRASFADXXNN-SCRDCRAPSA-N 0.000 description 1
- 238000001215 fluorescent labelling Methods 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 239000003365 glass fiber Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 229940116332 glucose oxidase Drugs 0.000 description 1
- 235000019420 glucose oxidase Nutrition 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000404 glutamine group Chemical group N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- ZEMPKEQAKRGZGQ-XOQCFJPHSA-N glycerol triricinoleate Natural products CCCCCC[C@@H](O)CC=CCCCCCCCC(=O)OC[C@@H](COC(=O)CCCCCCCC=CC[C@@H](O)CCCCCC)OC(=O)CCCCCCCC=CC[C@H](O)CCCCCC ZEMPKEQAKRGZGQ-XOQCFJPHSA-N 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 239000005337 ground glass Substances 0.000 description 1
- 150000003278 haem Chemical class 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 1
- 238000011532 immunohistochemical staining Methods 0.000 description 1
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 238000007373 indentation Methods 0.000 description 1
- PCKPVGOLPKLUHR-UHFFFAOYSA-N indoxyl Chemical group C1=CC=C2C(O)=CNC2=C1 PCKPVGOLPKLUHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 238000005305 interferometry Methods 0.000 description 1
- 238000001361 intraarterial administration Methods 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 229940044173 iodine-125 Drugs 0.000 description 1
- ZCYVEMRRCGMTRW-YPZZEJLDSA-N iodine-125 Chemical compound [125I] ZCYVEMRRCGMTRW-YPZZEJLDSA-N 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- 239000000644 isotonic solution Substances 0.000 description 1
- 229960004194 lidocaine Drugs 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 1
- KNJDBYZZKAZQNG-UHFFFAOYSA-N lucigenin Chemical compound [O-][N+]([O-])=O.[O-][N+]([O-])=O.C12=CC=CC=C2[N+](C)=C(C=CC=C2)C2=C1C1=C(C=CC=C2)C2=[N+](C)C2=CC=CC=C12 KNJDBYZZKAZQNG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000003563 lymphoid tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000007923 nasal drop Substances 0.000 description 1
- 229940100662 nasal drops Drugs 0.000 description 1
- 238000004848 nephelometry Methods 0.000 description 1
- 238000007857 nested PCR Methods 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 1
- 210000001711 oxyntic cell Anatomy 0.000 description 1
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 229940023041 peptide vaccine Drugs 0.000 description 1
- 229940021222 peritoneal dialysis isotonic solution Drugs 0.000 description 1
- 125000000864 peroxy group Chemical group O(O*)* 0.000 description 1
- WVDDGKGOMKODPV-ZQBYOMGUSA-N phenyl(114C)methanol Chemical compound O[14CH2]C1=CC=CC=C1 WVDDGKGOMKODPV-ZQBYOMGUSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 229940097886 phosphorus 32 Drugs 0.000 description 1
- 108060006184 phycobiliprotein Proteins 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 229920001308 poly(aminoacid) Polymers 0.000 description 1
- 229920000728 polyester Polymers 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920000024 polymyxin B Polymers 0.000 description 1
- 229960005266 polymyxin b Drugs 0.000 description 1
- 229920000098 polyolefin Polymers 0.000 description 1
- 239000000244 polyoxyethylene sorbitan monooleate Substances 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 229940068977 polysorbate 20 Drugs 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 229940068968 polysorbate 80 Drugs 0.000 description 1
- 229920002635 polyurethane Polymers 0.000 description 1
- 239000004814 polyurethane Substances 0.000 description 1
- 229920002689 polyvinyl acetate Polymers 0.000 description 1
- 239000011118 polyvinyl acetate Substances 0.000 description 1
- 229920000915 polyvinyl chloride Polymers 0.000 description 1
- 239000004800 polyvinyl chloride Substances 0.000 description 1
- 239000005033 polyvinylidene chloride Substances 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 229940043274 prophylactic drug Drugs 0.000 description 1
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 231100000654 protein toxin Toxicity 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 239000002096 quantum dot Substances 0.000 description 1
- 239000002964 rayon Substances 0.000 description 1
- 238000007894 restriction fragment length polymorphism technique Methods 0.000 description 1
- MYIOYATURDILJN-UHFFFAOYSA-N rhodamine 110 Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(N)=CC2=[O+]C2=CC(N)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O MYIOYATURDILJN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical class [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YVSWPCCVTYEEHG-UHFFFAOYSA-N rhodamine B 5-isothiocyanate Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=C(N=C=S)C=C1C(O)=O YVSWPCCVTYEEHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003303 ruthenium Chemical class 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 239000008159 sesame oil Substances 0.000 description 1
- 235000011803 sesame oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000002924 silencing RNA Substances 0.000 description 1
- 229920002379 silicone rubber Polymers 0.000 description 1
- 239000004945 silicone rubber Substances 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- 239000003549 soybean oil Substances 0.000 description 1
- 235000012424 soybean oil Nutrition 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 1
- 208000018556 stomach disease Diseases 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 150000005846 sugar alcohols Polymers 0.000 description 1
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-L sulfite Chemical class [O-]S([O-])=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 1
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- WGTODYJZXSJIAG-UHFFFAOYSA-N tetramethylrhodamine chloride Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(N(C)C)=CC2=[O+]C2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O WGTODYJZXSJIAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N texas red Chemical compound [O-]S(=O)(=O)C1=CC(S(Cl)(=O)=O)=CC=C1C(C1=CC=2CCCN3CCCC(C=23)=C1O1)=C2C1=C(CCC1)C3=[N+]1CCCC3=C2 MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940126585 therapeutic drug Drugs 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 125000000341 threoninyl group Chemical group [H]OC([H])(C([H])([H])[H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K trisodium citrate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229940038773 trisodium citrate Drugs 0.000 description 1
- 229910052722 tritium Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000000430 tryptophan group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C2=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C12 0.000 description 1
- 238000004879 turbidimetry Methods 0.000 description 1
- 231100000397 ulcer Toxicity 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 125000002987 valine group Chemical group [H]N([H])C([H])(C(*)=O)C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 229960003165 vancomycin Drugs 0.000 description 1
- MYPYJXKWCTUITO-LYRMYLQWSA-N vancomycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=C2C=C3C=C1OC1=CC=C(C=C1Cl)[C@@H](O)[C@H](C(N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H]3C(=O)N[C@H]1C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](C3=CC(O)=CC(O)=C3C=3C(O)=CC=C1C=3)C(O)=O)=O)[C@H](O)C1=CC=C(C(=C1)Cl)O2)=O)NC(=O)[C@@H](CC(C)C)NC)[C@H]1C[C@](C)(N)[C@H](O)[C@H](C)O1 MYPYJXKWCTUITO-LYRMYLQWSA-N 0.000 description 1
- MYPYJXKWCTUITO-UHFFFAOYSA-N vancomycin Natural products O1C(C(=C2)Cl)=CC=C2C(O)C(C(NC(C2=CC(O)=CC(O)=C2C=2C(O)=CC=C3C=2)C(O)=O)=O)NC(=O)C3NC(=O)C2NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(CC(C)C)NC)C(O)C(C=C3Cl)=CC=C3OC3=CC2=CC1=C3OC1OC(CO)C(O)C(O)C1OC1CC(C)(N)C(O)C(C)O1 MYPYJXKWCTUITO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008215 water for injection Substances 0.000 description 1
- 239000008096 xylene Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/205—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Campylobacter (G)
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56983—Viruses
- G01N33/56994—Herpetoviridae, e.g. cytomegalovirus, Epstein-Barr virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
- A61K31/711—Natural deoxyribonucleic acids, i.e. containing only 2'-deoxyriboses attached to adenine, guanine, cytosine or thymine and having 3'-5' phosphodiester links
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/105—Delta proteobacteriales, e.g. Lawsonia; Epsilon proteobacteriales, e.g. campylobacter, helicobacter
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
- A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
- C07K16/081—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from DNA viruses
- C07K16/085—Herpetoviridae, e.g. pseudorabies virus, Epstein-Barr virus
- C07K16/087—Herpes simplex virus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
- C07K16/1203—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria
- C07K16/121—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria from Helicobacter (Campylobacter) (G)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56911—Bacteria
- G01N33/56916—Enterobacteria, e.g. shigella, salmonella, klebsiella, serratia
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56911—Bacteria
- G01N33/56922—Campylobacter
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
- G01N2333/01—DNA viruses
- G01N2333/03—Herpetoviridae, e.g. pseudorabies virus
- G01N2333/035—Herpes simplex virus I or II
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
- G01N2333/24—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Hematology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Virology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
Abstract
【課題】本発明は,H.スイス特異的な診断方法を提供することを目的とする。別の目的として,本発明は,H.スイスに特異的な診断方法であって,非侵襲的な方法を含む簡便な検査法を提供することを目的とする。【解決手段】本発明者らは,H.スイス感染者の体内にH.スイスにのみ特異的に存在する外膜タンパク質(HsvA;本発明者が命名)とそれに対する抗体が存在することを新規に発見し,HsvAタンパク質の抗原部位となるアミノ酸配列を利用する診断法を見出した。よって,本発明は,HsvA抗原ペプチドからなるH.スイス特異的抗原及びhsvA遺伝子由来のH.スイス特異的DNAを利用したH.スイスを特異的に検出可能な方法を提供するものである。【選択図】なし
Description
本発明は,新規に発見したヘリコバクター・スイスに特異的な外膜タンパク質遺伝子及びその遺伝子産物(タンパク質)並びにそれらに対する抗体を利用した,ヘリコバクター・スイス感染の診断方法及び診断薬に関する。
現在,慢性胃炎,胃潰瘍や十二指腸潰瘍,胃癌,胃Mucosa-Associated Lymphoid Tissue(MALT)リンパ腫,びまん性大細胞型B細胞性リンパ腫に,ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori,ヒトの胃に寄生する微好気性のグラム陰性螺旋菌, 以下,「H.ピロリ」という)による感染が関与することが知られている。H.ピロリの感染検査方法として,分離培養法や尿素呼気試験,血清や尿中のH.ピロリ抗体価の測定(ELISAとラッテクス凝集法),便中のH.ピロリ抗原測定(イムノクロマト法)が主に採用されている。
しかし,近年,H.ピロリの診断や除菌薬の普及に伴い,H.ピロリ以外のヒトに重篤な胃疾患を誘発するヘリコバクターとして,広義のヘリコバクター・ハイルマニイが問題となってきた。広義のヘリコバクター・ハイルマニイ(ヘリコバクター・ハイルマニイ・センス・ラト:Helicobacter heilmannii sensu lato,以下,「H.ハイルマニイ」という)には,狭義のヘリコバクター・ハイルマニイ(ヘリコバクター・ハイルマニイ・センス・ストリクト:H.heilmannii sensu stricto),ヘリコバクター・スイス(H.suis),H.bizzozeronnii,H.felis,及びH.salmonisが含まれ,このうちヒトの胃から見つかる大部分のヘリコバクターは,H.suis(以下,H.スイス)であるが,迅速診断法が確立していない(非特許文献1)。
H.ピロリは霊長類にしか感染せず,乳幼児期においてのみ近親者からの感染が想定されるが,H.スイスは年齢に関係なく,豚,猫,医務などの動物から感染する。H.ピロリが全長2.5~5.0μmであるのに対して,H.ハイルマニイは5~10μmである(非特許文献2)。H.ピロリの主要な病原因子であるCagPAI(pathogenicity island)と呼ばれるIV型分泌装置関連タンパク質遺伝子と宿主内に注入され癌を誘発するタンパク質遺伝子を含む遺伝子塊とVacA(Vacuolating cytotoxin A)と呼ばれる胃粘膜にびらんや潰瘍を発症させたり,培養細胞には空砲変性させて死に至らしめたり, アポトーシスを誘発するなど, 広範多岐にわたる作用を示すタンパク質毒素の遺伝子をH.スイスを含むH.ハイルマニイは欠損している(非特許文献3)。
また,H.スイス感染により,リンパ球の集積が主体となる胃MALTリンパ腫を高頻度に発症することが報告されている。更に,マウスを用いた感染実験から,H.スイスの感染力はH.ピロリよりはるかに強いことが示されている他(非特許文献4),H.スイスは両端に鞭毛をもち,運動性が高く胃腺腔深部や壁細胞内に侵入し,抗生物質が効きにくいことが報告されている(非特許文献5)。
実際に,H.ピロリ陰性であるにもかかわらず胃炎や胃疾患の症状を呈する患者の凡そ60%以上はH.スイス感染陽性であると考えられている(非特許文献6)。また,MALTリンパ腫の25~50%はH.スイス感染によるものと考えられている(非特許文献5)。
しかし,H.ピロリがウレアーゼ陽性であるのに対して,ヒトから分離されたH.スイスはウレアーゼ遺伝子を有するにもかかわらずウレアーゼ試験や尿素呼気試験で陰性を示す場合が多い(動物から分離されたH.スイスはウレアーゼ試験や尿素呼気試験に陽性である)。よって,H.スイスは,H.ピロリで用いられているウレアーセ試験や尿素呼気試験により感染を診断することができない。また,豚から分離された株についてin vitro培養に成功した報告(特許文献1)はあるものの,分離寒天培地でのH.スイスのコロニー形成の報告は無く,ヒトから分離された株はin vitroでの培養ができ
ず,ヒト患者の胃バイオプシーに含まれるH.スイスは未だin vitroでの純粋培養ができない(非特許文献7)。このためH.ピロリで用いられている分離培養法による診断も不可能であった。よって,ヒトで見つかるH.スイスは,難培養性の上にウレアーゼ活性が弱いため,通常のピロリの検査法では,検出できなかった。
ず,ヒト患者の胃バイオプシーに含まれるH.スイスは未だin vitroでの純粋培養ができない(非特許文献7)。このためH.ピロリで用いられている分離培養法による診断も不可能であった。よって,ヒトで見つかるH.スイスは,難培養性の上にウレアーゼ活性が弱いため,通常のピロリの検査法では,検出できなかった。
一方で,重症胃炎のネコから単離されたH.heilmannii sensu stricto ASB1株(非特許文献8),ヒト胃粘膜から単離されたH. bizzozeronnii CIII-1株(非特許文献9),ブタの胃粘膜から単離されたH.スイス H1株及びH5株(非特許文献10,H.felis CS1株(非特許文献11),及び鳥肌胃炎の日本人患者から単離されたH.スイスSNTW101株(非特許文献12)の全ゲノムの概要(ドラフトゲノム)が解析され,報告されている。現在は,胃バイオプシーからDNAを調製し,H.ハイルマニイ特異的16S rRNA遺伝子を標的としたPCR法がH.スイス含むH.ハイルマニイ感染の一般的な診断法である。
しかし,既存のH.ハイルマニイの診断方法としては組織検査を要し,かつH.スイスと他のH.ハイルマニイを区別して診断することはできなかった(特許文献2)。このように,H.スイス感染のみを診断可能な方法,また非侵襲的な方法は未だに確立されていない(非特許文献13)。そこで,簡便で高感度のH.スイスの検査法の開発が求められていた。
これまでに,本発明者らは,カニクイサルから単離されたH.スイスのゲノム解析情報に基づき,F2R2タンパク質及びその遺伝子配列を標的としたH.スイス感染の診断方法を報告している(特許文献3)。
これまでに,本発明者らは,カニクイサルから単離されたH.スイスのゲノム解析情報に基づき,F2R2タンパク質及びその遺伝子配列を標的としたH.スイス感染の診断方法を報告している(特許文献3)。
Blaecher Cら,Helicobacter.(2016)22(3):e12369
Overby Aら,Digestion.(2016)93(4):260-5
Vermoote Mら,Vet Res.(2011)42:51
Nakamura Mら,Infect Immun.(2007)75(3):1214-22
Overby Aら,Digestion.(2017)95(1):61-6
中村正彦ら,検査と技術(2016)44(4):278-84
Matsui Hら,Helicobacter.(2014)19(4):260-71
Smet Aら,Genome Announcements(2013)1(1):e00033-12
Schott Tら,Journal of Bacteriology(2011)193(17):4565-6
Vermoote Mら,Veterinary Research(2011)42:51
Arnold I Cら,Genom Biol. Evol. (2011)3:302-8
Matsui Hら,Genome Announcements(2016)4(5):e00934-16
Bento-Miranda Mら,World J Gastroenterol(2014)20(47):17779-87
本発明は,H.スイス特異的な診断方法を提供することを目的とする。別の目的として,本発明は,H.スイスに特異的な診断方法であって,非侵襲的な方法を含む簡易迅速検査法を提供することを目的とする。
今回,本発明者らは,H.スイス感染者の体内にH.スイスにのみ特異的に存在する外膜タンパク質(HsvA;本発明者が命名)とそれに対する抗体が存在することを新規に発見し,HsvAタンパク質の抗原部位となるアミノ酸配列を利用する診断法を見出した。F2R2タンパク質には,本発明で標的となるHsvAタンパク質に存在する菌体の外膜タンパク質に共通なアミノ末端側のシグナルペプチド領域と,カルボキシ末端側のオートトランスポーター(グラム陰性菌に特有なタンパク質の外膜輸送機構),機能発現に関与するdisorder領域などの構造が存在しない(図1参照)。従って,H.スイス感染者は,外膜タンパク質と想定されるHsvAタンパク質に対する抗体価方がF2R2タンパク質に対する抗体価より高いと想定できる。
本発明者らはH.スイス特異的に検出可能な方法について種々検討を行った結果,H.スイス感染した患者の血液中H.スイス特異的な外膜タンパク質であるHsvAに対する抗体が存在することを発見し,HsvAタンパク質の抗原部位となるアミノ酸配列を利用することで,H.スイス感染をH.ピロリ感染と区別して検出可能であることを明らかとした。
hsvA遺伝子は,鳥肌胃炎の患者から分離したH.スイス SNTW101株(Matsui Hら,Genome Announcements(2016)4(5):e00934-16参照)に含まれ,その塩基配列(hsvA遺伝子:配列番号1)は,H.ピロリの空砲化毒素タンパク質VacA(Cover TLら,Nat Rev Microbiol.(2005)3(4):320-32)と分子量が大きく異なり同一性は無いが,H.ピロリの外膜タンパク質の特徴であるアミノ末端側のシグナルペプチド領域と,カルボキシ末端側のオートトランスポーター(グラム陰性菌に特有のタンパク質の外膜輸送機構)βドメインを有している。更に,機能発現に関与するdisorder領域も有している(図1参照)。また,hsvA遺伝子は,ブタから分離されたH.スイス HS1株及びHS5株のドラフトゲノム中にも含まれているが(Vermoote Mら,Vet Res.(2011)42:51),いずれもH.ピロリのVacAタンパク質と同一性は無く,H.ピロリのVacAの機能を有しないだけでなく,そもそも発現しない遺伝子と考えられていた。しかし,本発明者らは,H.スイス感染者の体内にHsvAタンパク質とそれに対する抗体の存在を新規に発見し,HsvAについて更に検討した結果,HsvAタンパク質は,H.スイスの外膜タンパク質として発現していることを初めて見出した。
本発明はかかる知見に基づきなされたものであり,よって,本発明は以下の発明に関する。
(1) HsvA抗原ペプチド又はその免疫学的に同等な変異体。
(2) H.スイス由来である,(1)に記載の抗原ペプチド又はその免疫学的変異体免疫学的に同等な変異体。
(3) HsvA抗原ペプチドが,配列番号2,配列番号28,配列番号30,及び配列番号78~83のいずれか1つに記載のアミノ酸配列に含まれる5~50アミノ酸からなる配列を有する,(1)に記載の抗原ペプチド又はその免疫学的変異体免疫学的に同等な変異体。
(4) HsvA抗原ペプチドが,配列番号78~83のいずれか1つに記載のアミノ酸配列に含まれる,5~50アミノ酸からなる配列を有する,(3)に記載のペプチド又はその免疫学的に同等な変異体。
(5) HsvA抗原ペプチドが,以下の群から選択されるいずれか1つのアミノ酸配列を有するペプチド又はその免疫学的に同等な変異体である,(1)に記載のペプチド又はその免疫学的に同等な変異体:
EKX1AVX2X3X4X5NSNX6X7(ペプチドNo.11:配列番号24),
NQGTLEFLSNDVSX8(ペプチドNo.19:配列番号25),
X9SX10KLQX11X12LKSX13X14X15(ペプチドNo.33:配列番号26),
TNGQEVSASIDYNK(ペプチドNo.16:配列番号12),
AKLSNFASNDALPD(ペプチドNo.23:配列番号13),
PTTSSGASPDSSNP(ペプチドNo.10:配列番号14),
GLGRDLFVHSMGDK(ペプチドNo.21:配列番号15),
QIGKIKLSDVLSAS(ペプチドNo.15:配列番号16),
YGAIDKELHFSGGK(ペプチドNo.34:配列番号17),
NVDNILNMPSTTSG(ペプチドNo.20:配列番号18),
GNLKGVYYPKSSTT(ペプチドNo.22:配列番号19),
ITEKIQSGKLTITI(ペプチドNo.14:配列番号20),
FHDFLVSLKGKKFA(ペプチドNo.26:配列番号21),
TTGGEVRLFRSFYV(ペプチドNo.31:配列番号22),及び
及びIGARFGLDYQDINI(ペプチドNo.35:配列番号23)
ここで,X1はK又はDであり,X2はQ,E又はTであり,X3はQ又はSであり,X4はM又はLであり,X5はE又はKであり,X6はP又はSであり,X7はD又はGであり,X8はN又はTであり,X9はL又はFであり,X10はN又はDであり,X11はG,D又はNであり,X12はQ又はMであり,X13はM又はLであり,X14はG又はNであり,かつX15はL又はMである。
(6) HsvA抗原ペプチドが,以下の群から選択されるいずれか1つのアミノ酸配列を有するペプチド又はその免疫学的に同等な変異体である,(5)に記載のペプチド又はその免疫学的に同等な変異体:
EKKAVQQMENSNPD(ペプチドNo.11:配列番号3),
EKKAVEQMENSNPD(ペプチドNo.11(TKY):配列番号4),
EKDAVTSLKNSNSG(ペプチドNo.11(SH8):配列番号5),
EKDAVTSLENSNSG(ペプチドNo.11(SH10):配列番号6),
NQGTLEFLSNDVSN(ペプチドNo.19:配列番号7),
NQGTLEFLSNDVST(ペプチドNo.19(TKY):配列番号8),
LSNKLQGQLKSMGL(ペプチドNo.33:配列番号9),
LSNKLQDQLKSMGL(ペプチドNo.33(TKY):配列番号10),
FSDKLQNMLKSLNM(ペプチドNo.33(SH10):配列番号11),
TNGQEVSASIDYNK(ペプチドNo.16:配列番号12),
AKLSNFASNDALPD(ペプチドNo.23:配列番号13),
PTTSSGASPDSSNP(ペプチドNo.10:配列番号14),
GLGRDLFVHSMGDK(ペプチドNo.21:配列番号15),
QIGKIKLSDVLSAS(ペプチドNo.15:配列番号16),
YGAIDKELHFSGGK(ペプチドNo.34:配列番号17),
NVDNILNMPSTTSG(ペプチドNo.20:配列番号18),
GNLKGVYYPKSSTT(ペプチドNo.22:配列番号19),
ITEKIQSGKLTITI(ペプチドNo.14:配列番号20),
FHDFLVSLKGKKFA(ペプチドNo.26:配列番号21),
TTGGEVRLFRSFYV(ペプチドNo.31:配列番号22),
IGARFGLDYQDINI(ペプチドNo.35:配列番号23)、
KQLPQPKRSELKPK(ペプチドNo.8:配列番号86)、
TNIKQYMQNNHRSQ(ペプチドNo.31N:配列番号87)、
TLTLEGTETFAQNS(ペプチドNo.81:配列番号88)、
EAYAKNQGDIWSTI(ペプチドNo.63:配列番号89)、
VIGSKSSITLNSAN(ペプチドNo.73:配列番号90)、及び
ADIQSSQTTFANSV(ペプチドNo.61:配列番号91)。
(7) (1)~(6)のいずれか1項のペプチド又はその免疫学的に同等な変異体に特異的に結合する抗体又はその免疫反応性断片。
(8) hsvA遺伝子とストリンジェントな条件下で結合可能である,5~40ヌクレオチドからなる核酸分子。
(9) hsvA遺伝子が,配列番号1,配列番号27又は配列番号29に記載の塩基配列を有する,(8)に記載の核酸分子。
(10) 以下の群から選択されるいずれか1つの塩基配列を有する,(9)に記載の核酸分子:
CTTTTAGCGTGGTATCCTTC(配列番号31),TTACAAAGACCACCAACGGA(配列番号32),TACCATAGAAAGCGGAAAC(配列番号33),AGCTATAGCTTTGCACCTGA(配列番号34),ACTAACAGCATAGAAGTTGGGGA(配列番号35),AACAACATTACAGGCATGAG(配列番号36),CAAATAGTAACAGGACAATT(配列番号37),CAGGATTTAAGAGGCACTTA(配列番号38),TCTTAACCAATCTGAGCAA(配列番号39),GTCAAACACGTTATTGATGGCTT(配列番号40),GGGGTTTAATAGCATAGGG(配列番号41),TAGAGCTCTACACCAGTCTT(配列番号42),ATAAAGCCCATGAATTCTTAGGCATGCGTGCTCTG(配列番号43),TGCTATTGATAAAGAGTTACATTTCTCAGG(配列番号44),ATTTCTCAGGGGGAAAGTC(配列番号45),GGCTAATAATTTAACCACAATAAGCGCCTTTAA(配列番号46),GATGGGCGCTTCTGGTTTA(配列番号47),ATGAATTCTTAGGCATGCGTGCTCT(配列番号48),TTTTGGAGGTGTAGGAGTAGAT(配列番号49),AGCGCGCATTTAAAACAGGT(配列番号50),AGAAACGAGATTACAGGAAG(配列番号51),AGGAGCAAGTTTTGTAGCAG(配列番号52),AAAATGCGACTGATTGGATG(配列番号53),TTGAAATTTGGCCACGCT(配列番号54),TCACCCATAGAATGGACGAA(配列番号55),CTAGCGCATTAACCACAGACTG(配列番号56),TAGAAGTTGTAGACACGGT(配列番号57),GTGATATTGCCTTTCTGAAC(配列番号58),GCAAGTTTTGTGCGGATT(配列番号59),ATGTGATACACATCTGACC(配列番号60),AGTGCCGTTACCATCGTGAA(配列番号61),TATTCAAGGAAAGTCCCTGGAGAAACTCCAGAGAC(配列番号62),TTAAAGGCGCTTATTGTGGTTAAATTATTAGCC(配列番号63),ATTAGCCTTAAGGGTGCTATC(配列番号64),CTGGTAATGCATCATTAGAAGCAAA(配列番号65),TACGCGCAAAATAGGTTCTT(配列番号66),TGGAGAAACTCCAGAGACTA(配列番号67),TTGTTCGCTGTAGTGCCGTGG(配列番号68),GAAGGATACCACGCTAAAAG(配列番号69),AAGCTAGAGTTTTGGTTGAG(配列番号70),TTG
CTCAGATTGGTTAAGA(配列番号71),ATCGAAATAAGCGAACCTCA(配列番号72),TTGAAAGCTTAGCTAAACGG(配列番号73),TGGTATTGCTGGTTAAGAGG(配列番号74),CAAACAGATGAGCCGT(配列番号75),ATGAAAAAGTTTAGTTCTCTCACATTGAAATTTGGCCACGCTC(配列番号76),及びCTAAAAAGCATAGCGCATCCCGACATTGCCTGTAATATTAATATC(配列番号77)。
(11) hsvA遺伝子の全部又は一部を増幅可能なプライマーである,(8)~(10のいずれか1項に記載の核酸分子。
(12) hsvA遺伝子を検出するためのプローブである,(8)~(10)のいずれか1項に記載の核酸分子。
(13) サンプル中のhsvA遺伝子の全部又は一部を検出することを含む,H.スイスの存在を判定する方法,ここで,hsvA遺伝子の全部又は一部が検出されたサンプルをH.スイスが存在すると判定される。
(14) (13)に記載のH.スイスの存在を判定する方法であって,
サンプル中のDNAを鋳型として用いて,(11)に記載のプライマーを用いてhsvA遺伝子の全部又は一部を増幅させること,
増幅されたDNAを検出すること,及び
DNAの増幅が検出されたサンプルをH.スイスが存在すると判定すること,を含む方法。
(15) (13)に記載のH.スイスの存在を判定する方法であって,
サンプル中のDNAと(12)に記載のプローブとを接触させること,
(12)に記載のプローブと結合したDNAを検出すること,及び
(11)に記載のプローブと結合したDNAが検出されたサンプルをH.スイスが存在すると判定すること,を含む方法。
(16) サンプル中のHsvAタンパク質又はその断片を検出すること,前記HsvAタンパク質又はその断片が検出されたサンプルをH.スイスが存在すると判定することを含む,H.スイスの存在の判定方法。
(17) (16)に記載のH.スイスの存在の判定方法であって:
サンプルと(7)に記載の抗体又はその免疫反応性断片とを接触させること,
前記抗体又はその免疫反応性断片と結合した,前記サンプル中のHsvAタンパク質又はその断片を検出すること,及び
前記抗体又はその免疫反応性断片と結合したHsvAタンパク質又はその断片が検出されたサンプルをH.スイスが存在するサンプルと判定すること,を含む方法。
(18) 被験者のH.スイスへの感染を判定する方法であって,
被験者由来のサンプルをサンプルとして用いて(12)~(17)のいずれか1項に記載の方法を行うこと,及び,
当該方法においてH.スイスが存在すると判定されたサンプルが由来する被験者をH.スイスに感染していると判定することを含む方法。
(19) 被験者のH.スイスへの感染を判定する方法であって,
被験者由来の血液サンプル中のHsvA抗原ペプチドと結合する抗体を検出すること,及び
前記ペプチドと結合する抗体が検出された被験者をH.スイスに感染していると判定することを含む方法。
(20) 以下の工程を含む,(19)に記載のH.スイスへの感染を判定する方法:
被験者由来のサンプルと(1)~(6)のいずれか1項に記載のペプチドとを接触させること,
前記ペプチドと結合した,前記血液サンプル中の抗体を検出すること,及び
前記ペプチドと結合した抗体が検出された被験者をH.スイスに感染していると判定すること。
(21) (1)~(6)のいずれか1項に記載のペプチド,(8)~(10)のいずれか1項に記載の核酸分子,及び(7)に記載の抗体又はその免疫反応性断片から選択されるいずれか一つを含有するH.スイス感染判定用組成物。
(22) (1)~(6)のいずれか1項に記載のペプチド,(8)~(10)のいずれか1項に記載の核酸分子,及び(7)に記載の抗体又はその免疫反応性断片から選択されるいずれか一つを含有する医薬組成物。
(23) H.スイス除菌療法用である,(22)に記載の医薬組成物。
(24) 胃炎,胃潰瘍や十二指腸潰瘍,胃癌,慢性胃炎,胃MALTリンパ腫,鳥肌胃炎,特発性血小板減少紫斑病,機能性ディスペプシア,又はびまん性大細胞型B細胞性リンパ腫の治療用又は予防用である,(22)に記載の医薬組成物。
(1) HsvA抗原ペプチド又はその免疫学的に同等な変異体。
(2) H.スイス由来である,(1)に記載の抗原ペプチド又はその免疫学的変異体免疫学的に同等な変異体。
(3) HsvA抗原ペプチドが,配列番号2,配列番号28,配列番号30,及び配列番号78~83のいずれか1つに記載のアミノ酸配列に含まれる5~50アミノ酸からなる配列を有する,(1)に記載の抗原ペプチド又はその免疫学的変異体免疫学的に同等な変異体。
(4) HsvA抗原ペプチドが,配列番号78~83のいずれか1つに記載のアミノ酸配列に含まれる,5~50アミノ酸からなる配列を有する,(3)に記載のペプチド又はその免疫学的に同等な変異体。
(5) HsvA抗原ペプチドが,以下の群から選択されるいずれか1つのアミノ酸配列を有するペプチド又はその免疫学的に同等な変異体である,(1)に記載のペプチド又はその免疫学的に同等な変異体:
EKX1AVX2X3X4X5NSNX6X7(ペプチドNo.11:配列番号24),
NQGTLEFLSNDVSX8(ペプチドNo.19:配列番号25),
X9SX10KLQX11X12LKSX13X14X15(ペプチドNo.33:配列番号26),
TNGQEVSASIDYNK(ペプチドNo.16:配列番号12),
AKLSNFASNDALPD(ペプチドNo.23:配列番号13),
PTTSSGASPDSSNP(ペプチドNo.10:配列番号14),
GLGRDLFVHSMGDK(ペプチドNo.21:配列番号15),
QIGKIKLSDVLSAS(ペプチドNo.15:配列番号16),
YGAIDKELHFSGGK(ペプチドNo.34:配列番号17),
NVDNILNMPSTTSG(ペプチドNo.20:配列番号18),
GNLKGVYYPKSSTT(ペプチドNo.22:配列番号19),
ITEKIQSGKLTITI(ペプチドNo.14:配列番号20),
FHDFLVSLKGKKFA(ペプチドNo.26:配列番号21),
TTGGEVRLFRSFYV(ペプチドNo.31:配列番号22),及び
及びIGARFGLDYQDINI(ペプチドNo.35:配列番号23)
ここで,X1はK又はDであり,X2はQ,E又はTであり,X3はQ又はSであり,X4はM又はLであり,X5はE又はKであり,X6はP又はSであり,X7はD又はGであり,X8はN又はTであり,X9はL又はFであり,X10はN又はDであり,X11はG,D又はNであり,X12はQ又はMであり,X13はM又はLであり,X14はG又はNであり,かつX15はL又はMである。
(6) HsvA抗原ペプチドが,以下の群から選択されるいずれか1つのアミノ酸配列を有するペプチド又はその免疫学的に同等な変異体である,(5)に記載のペプチド又はその免疫学的に同等な変異体:
EKKAVQQMENSNPD(ペプチドNo.11:配列番号3),
EKKAVEQMENSNPD(ペプチドNo.11(TKY):配列番号4),
EKDAVTSLKNSNSG(ペプチドNo.11(SH8):配列番号5),
EKDAVTSLENSNSG(ペプチドNo.11(SH10):配列番号6),
NQGTLEFLSNDVSN(ペプチドNo.19:配列番号7),
NQGTLEFLSNDVST(ペプチドNo.19(TKY):配列番号8),
LSNKLQGQLKSMGL(ペプチドNo.33:配列番号9),
LSNKLQDQLKSMGL(ペプチドNo.33(TKY):配列番号10),
FSDKLQNMLKSLNM(ペプチドNo.33(SH10):配列番号11),
TNGQEVSASIDYNK(ペプチドNo.16:配列番号12),
AKLSNFASNDALPD(ペプチドNo.23:配列番号13),
PTTSSGASPDSSNP(ペプチドNo.10:配列番号14),
GLGRDLFVHSMGDK(ペプチドNo.21:配列番号15),
QIGKIKLSDVLSAS(ペプチドNo.15:配列番号16),
YGAIDKELHFSGGK(ペプチドNo.34:配列番号17),
NVDNILNMPSTTSG(ペプチドNo.20:配列番号18),
GNLKGVYYPKSSTT(ペプチドNo.22:配列番号19),
ITEKIQSGKLTITI(ペプチドNo.14:配列番号20),
FHDFLVSLKGKKFA(ペプチドNo.26:配列番号21),
TTGGEVRLFRSFYV(ペプチドNo.31:配列番号22),
IGARFGLDYQDINI(ペプチドNo.35:配列番号23)、
KQLPQPKRSELKPK(ペプチドNo.8:配列番号86)、
TNIKQYMQNNHRSQ(ペプチドNo.31N:配列番号87)、
TLTLEGTETFAQNS(ペプチドNo.81:配列番号88)、
EAYAKNQGDIWSTI(ペプチドNo.63:配列番号89)、
VIGSKSSITLNSAN(ペプチドNo.73:配列番号90)、及び
ADIQSSQTTFANSV(ペプチドNo.61:配列番号91)。
(7) (1)~(6)のいずれか1項のペプチド又はその免疫学的に同等な変異体に特異的に結合する抗体又はその免疫反応性断片。
(8) hsvA遺伝子とストリンジェントな条件下で結合可能である,5~40ヌクレオチドからなる核酸分子。
(9) hsvA遺伝子が,配列番号1,配列番号27又は配列番号29に記載の塩基配列を有する,(8)に記載の核酸分子。
(10) 以下の群から選択されるいずれか1つの塩基配列を有する,(9)に記載の核酸分子:
CTTTTAGCGTGGTATCCTTC(配列番号31),TTACAAAGACCACCAACGGA(配列番号32),TACCATAGAAAGCGGAAAC(配列番号33),AGCTATAGCTTTGCACCTGA(配列番号34),ACTAACAGCATAGAAGTTGGGGA(配列番号35),AACAACATTACAGGCATGAG(配列番号36),CAAATAGTAACAGGACAATT(配列番号37),CAGGATTTAAGAGGCACTTA(配列番号38),TCTTAACCAATCTGAGCAA(配列番号39),GTCAAACACGTTATTGATGGCTT(配列番号40),GGGGTTTAATAGCATAGGG(配列番号41),TAGAGCTCTACACCAGTCTT(配列番号42),ATAAAGCCCATGAATTCTTAGGCATGCGTGCTCTG(配列番号43),TGCTATTGATAAAGAGTTACATTTCTCAGG(配列番号44),ATTTCTCAGGGGGAAAGTC(配列番号45),GGCTAATAATTTAACCACAATAAGCGCCTTTAA(配列番号46),GATGGGCGCTTCTGGTTTA(配列番号47),ATGAATTCTTAGGCATGCGTGCTCT(配列番号48),TTTTGGAGGTGTAGGAGTAGAT(配列番号49),AGCGCGCATTTAAAACAGGT(配列番号50),AGAAACGAGATTACAGGAAG(配列番号51),AGGAGCAAGTTTTGTAGCAG(配列番号52),AAAATGCGACTGATTGGATG(配列番号53),TTGAAATTTGGCCACGCT(配列番号54),TCACCCATAGAATGGACGAA(配列番号55),CTAGCGCATTAACCACAGACTG(配列番号56),TAGAAGTTGTAGACACGGT(配列番号57),GTGATATTGCCTTTCTGAAC(配列番号58),GCAAGTTTTGTGCGGATT(配列番号59),ATGTGATACACATCTGACC(配列番号60),AGTGCCGTTACCATCGTGAA(配列番号61),TATTCAAGGAAAGTCCCTGGAGAAACTCCAGAGAC(配列番号62),TTAAAGGCGCTTATTGTGGTTAAATTATTAGCC(配列番号63),ATTAGCCTTAAGGGTGCTATC(配列番号64),CTGGTAATGCATCATTAGAAGCAAA(配列番号65),TACGCGCAAAATAGGTTCTT(配列番号66),TGGAGAAACTCCAGAGACTA(配列番号67),TTGTTCGCTGTAGTGCCGTGG(配列番号68),GAAGGATACCACGCTAAAAG(配列番号69),AAGCTAGAGTTTTGGTTGAG(配列番号70),TTG
CTCAGATTGGTTAAGA(配列番号71),ATCGAAATAAGCGAACCTCA(配列番号72),TTGAAAGCTTAGCTAAACGG(配列番号73),TGGTATTGCTGGTTAAGAGG(配列番号74),CAAACAGATGAGCCGT(配列番号75),ATGAAAAAGTTTAGTTCTCTCACATTGAAATTTGGCCACGCTC(配列番号76),及びCTAAAAAGCATAGCGCATCCCGACATTGCCTGTAATATTAATATC(配列番号77)。
(11) hsvA遺伝子の全部又は一部を増幅可能なプライマーである,(8)~(10のいずれか1項に記載の核酸分子。
(12) hsvA遺伝子を検出するためのプローブである,(8)~(10)のいずれか1項に記載の核酸分子。
(13) サンプル中のhsvA遺伝子の全部又は一部を検出することを含む,H.スイスの存在を判定する方法,ここで,hsvA遺伝子の全部又は一部が検出されたサンプルをH.スイスが存在すると判定される。
(14) (13)に記載のH.スイスの存在を判定する方法であって,
サンプル中のDNAを鋳型として用いて,(11)に記載のプライマーを用いてhsvA遺伝子の全部又は一部を増幅させること,
増幅されたDNAを検出すること,及び
DNAの増幅が検出されたサンプルをH.スイスが存在すると判定すること,を含む方法。
(15) (13)に記載のH.スイスの存在を判定する方法であって,
サンプル中のDNAと(12)に記載のプローブとを接触させること,
(12)に記載のプローブと結合したDNAを検出すること,及び
(11)に記載のプローブと結合したDNAが検出されたサンプルをH.スイスが存在すると判定すること,を含む方法。
(16) サンプル中のHsvAタンパク質又はその断片を検出すること,前記HsvAタンパク質又はその断片が検出されたサンプルをH.スイスが存在すると判定することを含む,H.スイスの存在の判定方法。
(17) (16)に記載のH.スイスの存在の判定方法であって:
サンプルと(7)に記載の抗体又はその免疫反応性断片とを接触させること,
前記抗体又はその免疫反応性断片と結合した,前記サンプル中のHsvAタンパク質又はその断片を検出すること,及び
前記抗体又はその免疫反応性断片と結合したHsvAタンパク質又はその断片が検出されたサンプルをH.スイスが存在するサンプルと判定すること,を含む方法。
(18) 被験者のH.スイスへの感染を判定する方法であって,
被験者由来のサンプルをサンプルとして用いて(12)~(17)のいずれか1項に記載の方法を行うこと,及び,
当該方法においてH.スイスが存在すると判定されたサンプルが由来する被験者をH.スイスに感染していると判定することを含む方法。
(19) 被験者のH.スイスへの感染を判定する方法であって,
被験者由来の血液サンプル中のHsvA抗原ペプチドと結合する抗体を検出すること,及び
前記ペプチドと結合する抗体が検出された被験者をH.スイスに感染していると判定することを含む方法。
(20) 以下の工程を含む,(19)に記載のH.スイスへの感染を判定する方法:
被験者由来のサンプルと(1)~(6)のいずれか1項に記載のペプチドとを接触させること,
前記ペプチドと結合した,前記血液サンプル中の抗体を検出すること,及び
前記ペプチドと結合した抗体が検出された被験者をH.スイスに感染していると判定すること。
(21) (1)~(6)のいずれか1項に記載のペプチド,(8)~(10)のいずれか1項に記載の核酸分子,及び(7)に記載の抗体又はその免疫反応性断片から選択されるいずれか一つを含有するH.スイス感染判定用組成物。
(22) (1)~(6)のいずれか1項に記載のペプチド,(8)~(10)のいずれか1項に記載の核酸分子,及び(7)に記載の抗体又はその免疫反応性断片から選択されるいずれか一つを含有する医薬組成物。
(23) H.スイス除菌療法用である,(22)に記載の医薬組成物。
(24) 胃炎,胃潰瘍や十二指腸潰瘍,胃癌,慢性胃炎,胃MALTリンパ腫,鳥肌胃炎,特発性血小板減少紫斑病,機能性ディスペプシア,又はびまん性大細胞型B細胞性リンパ腫の治療用又は予防用である,(22)に記載の医薬組成物。
(H.スイス)
本明細書において,「H.スイス」とは,H.ハイルマニイ(広義)に含まれる,H.ハイルマニータイプ1に属する菌株を意味する。H.スイスは,ヒト以外にイヌ,ネコ,ブタ,サルなどの胃に感染することが知られている。本明細書におけるH.スイスが単離された感染哺乳動物は特に限定されるものではなく,例えば,ヒト,サル,又はブタであってよい。好ましくは,H.スイスはヒトから単離されたH.スイス(例えば,SNTW101株)である。
本明細書において,「H.スイス」とは,H.ハイルマニイ(広義)に含まれる,H.ハイルマニータイプ1に属する菌株を意味する。H.スイスは,ヒト以外にイヌ,ネコ,ブタ,サルなどの胃に感染することが知られている。本明細書におけるH.スイスが単離された感染哺乳動物は特に限定されるものではなく,例えば,ヒト,サル,又はブタであってよい。好ましくは,H.スイスはヒトから単離されたH.スイス(例えば,SNTW101株)である。
(hsvA遺伝子及びHsvAタンパク質)
本明細書において,「hsvA遺伝子」及び「HsvAタンパク質」とは,H.スイスに由来する,ヘリコバクター属細菌の外膜タンパク質のアミノ末端側のシグナルペプチド領域と,カルボキシ末端側のオートトランスポーター(タンパク質の外膜輸送機構)βドメイン及び,機能発現に関与するdisorder領域を有する遺伝子及びアミノ酸を意味する。限定されない例の一つとして,hsvA遺伝子及びHsvAタンパク質は,それぞれH.スイス SNTW101株に由来する,配列番号1に記載の塩基配列(又は,図2に記載の塩基配列,本明細書において同様)を有する遺伝子,及び配列番号2に記載のアミノ酸配列(又は,図2に記載のアミノ酸配列,本明細書において同様)を有するタンパク質を挙げることができる。配列番号2に記載のアミノ酸配列において,1番目~27番目のアミノ酸はシグナル配列をコードし,2273~2475番目のアミノ酸はdisorder領域をコードし,2686~2992番目のアミノ酸は,オートトランスポーターβ領域をコードする。よって,本明細書においてHsvAタンパク質とは,配列番号2に記載のアミノ酸配列のうちシグナル配列を除く28番目から2992番目のアミノ酸からなるタンパク質を含む。H.スイスの他の株に由来する他のhsvA遺伝子及びHsvAタンパク質も本明細書のhsvA遺伝子及びHsvAタンパク質に含まれる。一例として,HsvAタンパク質は,H.スイスに由来するタンパク質であって,配列番号2に記載のアミノ酸配列(又は,配列番号2に記載のアミノ酸配列のうち28番目から2992番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列)と80%,85%,90%,95%,98%,又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質を含む。同様に,hsvA遺伝子は,H.スイスに由来する遺伝子であって,配列番号2に記載のアミノ酸配列(又は,配列番号2に記載のアミノ酸配列のうち28番目から2992番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列)と80%,85%,90%,95%,98%,又は99%の同一性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子を含む。ここで,アミノ酸配列の同一性は,例えば,BLAST,FASTA等の公知のプログラムを用いて当業者が通常用いる方法により決定することができる。あるいは,hsvA遺伝子は,H.スイスに由来する遺伝子であって,配列番号1に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を有するDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAを含む遺伝子を含む。また,HsvAタンパク質は当該遺伝子でコードされたタンパク質を含む。さらに,HsvAタンパク質は,H.スイスに由来するタンパク質であって,配列番号2に記載のアミノ酸配列(又は,配列番号2に記載のアミノ酸配列のうち28番目から2992番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列)において,1~50個(例えば,1~40個,1~30個,1~25個,1~20個,1~15個,1~10個,1~8個,1~6個,1~5個,1~4個,1~3個,又は1~2個であってもよい。本明細書において,以下同じ)のアミノ酸が他のアミノ酸と置換され,欠失し,付加され,又は挿入されたアミノ酸配列を有するタンパク質を含む。同様に,hsvA遺伝子は,H.スイスに由来する遺伝子であって,配列番号2に記載のアミノ酸配列(又は,配列番号2に記載のアミノ酸配列のうち28番目から2992番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列)において,1~50個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換され,欠失し,付加され,又は挿入されたたアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子を含む。
本明細書において,「hsvA遺伝子」及び「HsvAタンパク質」とは,H.スイスに由来する,ヘリコバクター属細菌の外膜タンパク質のアミノ末端側のシグナルペプチド領域と,カルボキシ末端側のオートトランスポーター(タンパク質の外膜輸送機構)βドメイン及び,機能発現に関与するdisorder領域を有する遺伝子及びアミノ酸を意味する。限定されない例の一つとして,hsvA遺伝子及びHsvAタンパク質は,それぞれH.スイス SNTW101株に由来する,配列番号1に記載の塩基配列(又は,図2に記載の塩基配列,本明細書において同様)を有する遺伝子,及び配列番号2に記載のアミノ酸配列(又は,図2に記載のアミノ酸配列,本明細書において同様)を有するタンパク質を挙げることができる。配列番号2に記載のアミノ酸配列において,1番目~27番目のアミノ酸はシグナル配列をコードし,2273~2475番目のアミノ酸はdisorder領域をコードし,2686~2992番目のアミノ酸は,オートトランスポーターβ領域をコードする。よって,本明細書においてHsvAタンパク質とは,配列番号2に記載のアミノ酸配列のうちシグナル配列を除く28番目から2992番目のアミノ酸からなるタンパク質を含む。H.スイスの他の株に由来する他のhsvA遺伝子及びHsvAタンパク質も本明細書のhsvA遺伝子及びHsvAタンパク質に含まれる。一例として,HsvAタンパク質は,H.スイスに由来するタンパク質であって,配列番号2に記載のアミノ酸配列(又は,配列番号2に記載のアミノ酸配列のうち28番目から2992番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列)と80%,85%,90%,95%,98%,又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質を含む。同様に,hsvA遺伝子は,H.スイスに由来する遺伝子であって,配列番号2に記載のアミノ酸配列(又は,配列番号2に記載のアミノ酸配列のうち28番目から2992番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列)と80%,85%,90%,95%,98%,又は99%の同一性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子を含む。ここで,アミノ酸配列の同一性は,例えば,BLAST,FASTA等の公知のプログラムを用いて当業者が通常用いる方法により決定することができる。あるいは,hsvA遺伝子は,H.スイスに由来する遺伝子であって,配列番号1に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を有するDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAを含む遺伝子を含む。また,HsvAタンパク質は当該遺伝子でコードされたタンパク質を含む。さらに,HsvAタンパク質は,H.スイスに由来するタンパク質であって,配列番号2に記載のアミノ酸配列(又は,配列番号2に記載のアミノ酸配列のうち28番目から2992番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列)において,1~50個(例えば,1~40個,1~30個,1~25個,1~20個,1~15個,1~10個,1~8個,1~6個,1~5個,1~4個,1~3個,又は1~2個であってもよい。本明細書において,以下同じ)のアミノ酸が他のアミノ酸と置換され,欠失し,付加され,又は挿入されたアミノ酸配列を有するタンパク質を含む。同様に,hsvA遺伝子は,H.スイスに由来する遺伝子であって,配列番号2に記載のアミノ酸配列(又は,配列番号2に記載のアミノ酸配列のうち28番目から2992番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列)において,1~50個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換され,欠失し,付加され,又は挿入されたたアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子を含む。
例えば,hsvA遺伝子及びHsvAタンパク質は,それぞれH.スイス HS1株又はHS5に由来する,配列番号27又は29に記載の塩基配列を有する遺伝子,及び配列番号28又は30に記載のアミノ酸配列を含む。
好ましくは,HsvAタンパク質は,配列番号78~83のいずれか1つの配列に記載のアミノ酸配列;配列番号78~83のいずれか1つの配列に記載のアミノ酸配列と80%,85%,90%,95%,98%,又は99%の同一性を有するアミノ酸配列;又は,配列番号78~83のいずれか1つの配列に記載のアミノ酸配列のうち1~50個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換され,欠失し,付加され,又は挿入されたたアミノ酸配列を有する。
(HsvA抗原ペプチド)
本明細書において,「HsvA抗原ペプチド」とは,上述のHsvAタンパク質に含まれるアミノ酸配列を有するペプチドであって、生体内において抗原として機能し得るペプチドを意味し,好ましくは,複数のH.スイス株間で保存されているアミノ酸配列を有するペプチドである。また,HsvA抗原ペプチドは,好ましくは,H.スイスに特異的で,H.ピロリ又は他のH.ハイルマニイには存在しないアミノ酸配列からなる。HsvAは膜タンパク質であることから,好ましくは,HsvA抗原ペプチドはHsvAタンパク質の細胞外ドメインを構成するアミノ酸配列を含む。例えば,HsvA抗原ペプチドは,配列番号2に記載のH.スイス SNTW101株由来HsvAタンパク質のアミノ酸配列のうち,1467~2992番目,1467~2685番目,1535~2135番目,又は2008~2135番目に含まれるアミノ酸配列からなる。本発明者らは,HsvAに特異的でかつこのような条件を満たすアミノ酸配列について解析を行った結果,配列番号78~83に示す部分アミノ酸配列を見出すことに成功した。配列番号78~83に記載されたアミノ酸配列は異なる種に感染した異なる株のH.スイスに由来するHsvAタンパク質が有するものであるが,そのアミノ酸配列は比較的保存されており,76.7%の同一性を有する。よって,本発明のHsvAタンパク質抗原ペプチドは,配列番号78~83のいずれか1つの配列に記載のアミノ酸配列と70%,75%,80%,85%,90%,95%,98%,又は99%の同一性を有するアミノ酸配列;又は,配列番号78~83のいずれか1つの配列に記載のアミノ酸配列のうち1~50個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換され,欠失し,付加され,又は挿入されたたアミノ酸配列を有するか,当該アミノ酸配列に含まれるアミノ酸配列を有することができる。本明細書全体にわたって,「(特定の)アミノ酸配列を有する」との表現は,当該アミノ酸配列からなる場合を含むと解されることを意図している。
本明細書において,「HsvA抗原ペプチド」とは,上述のHsvAタンパク質に含まれるアミノ酸配列を有するペプチドであって、生体内において抗原として機能し得るペプチドを意味し,好ましくは,複数のH.スイス株間で保存されているアミノ酸配列を有するペプチドである。また,HsvA抗原ペプチドは,好ましくは,H.スイスに特異的で,H.ピロリ又は他のH.ハイルマニイには存在しないアミノ酸配列からなる。HsvAは膜タンパク質であることから,好ましくは,HsvA抗原ペプチドはHsvAタンパク質の細胞外ドメインを構成するアミノ酸配列を含む。例えば,HsvA抗原ペプチドは,配列番号2に記載のH.スイス SNTW101株由来HsvAタンパク質のアミノ酸配列のうち,1467~2992番目,1467~2685番目,1535~2135番目,又は2008~2135番目に含まれるアミノ酸配列からなる。本発明者らは,HsvAに特異的でかつこのような条件を満たすアミノ酸配列について解析を行った結果,配列番号78~83に示す部分アミノ酸配列を見出すことに成功した。配列番号78~83に記載されたアミノ酸配列は異なる種に感染した異なる株のH.スイスに由来するHsvAタンパク質が有するものであるが,そのアミノ酸配列は比較的保存されており,76.7%の同一性を有する。よって,本発明のHsvAタンパク質抗原ペプチドは,配列番号78~83のいずれか1つの配列に記載のアミノ酸配列と70%,75%,80%,85%,90%,95%,98%,又は99%の同一性を有するアミノ酸配列;又は,配列番号78~83のいずれか1つの配列に記載のアミノ酸配列のうち1~50個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換され,欠失し,付加され,又は挿入されたたアミノ酸配列を有するか,当該アミノ酸配列に含まれるアミノ酸配列を有することができる。本明細書全体にわたって,「(特定の)アミノ酸配列を有する」との表現は,当該アミノ酸配列からなる場合を含むと解されることを意図している。
HsvA抗原ペプチドを構成するアミノ酸数は,目的に応じて適宜選択することができるが,例えば,5~50アミノ酸,5~45アミノ酸,5~40アミノ酸,5~35アミノ酸,5~30アミノ酸,5~25アミノ酸,5~20アミノ酸,5~15アミノ酸,10~50アミノ酸,10~45アミノ酸,10~40アミノ酸,10~35アミノ酸,10~30アミノ酸,10~25アミノ酸,又は10~20アミノ酸であってもよい。HsvA抗原ペプチドの一例として,EKX1AVX2X3X4X5NSNX6X7(ペプチドNo.11(mix):配列番号24)(ここで,X1はK又はDであり,X2はQ,E又はTであり,X3はQ又はSであり,X4はM又はLであり,X5はE又はKであり,X6はP又はSであり,かつX7はD又はGである),EKKAVQQMENSNPD(ペプチドNo.11(SNTW101;HS1;HS5):配列番号3),EKKAVEQMENSNPD(ペプチドNo.11(TKY):配列番号4),EKDAVTSLKNSNSG(ペプチドNo.11(SH8):配列番号5),EKDAVTSLENSNSG(ペプチドNo.11(SH10):配列番号6),NQGTLEFLSNDVSX8(ペプチドNo.19:配列番号25)(ここで,X8はN又はTである),NQGTLEFLSNDVSN(ペプチドNo.19:配列番号7),NQGTLEFLSNDVST(ペプチドNo.19(TKY):配列番号8),X9SX10KLQX11X12LKSX13X14X15(ペプチドNo.33:配列番号26)(ここで,X9はL又はFであり,X10はN又はDであり,X11はG,D又はNであり,X12はQ又はMであり,X13はM又はLであり,X14はG又はNであり,かつX15はL又はMである),LSNKLQGQLKSMGL(ペプチドNo.33:配列番号9),LSNKLQDQLKSMGL(ペプチドNo.33(TKY):配列番号10),FSDKLQNMLKSLNM(ペプチドNo.33(SH10):配列番号11),TNGQEVSASIDYNK(ペプチドNo.16:配列番号12),AKLSNFASNDALPD(ペプチドNo.23:配列番号13),PTTSSGASPDSSNP(ペプチドNo.10:配列番号14),GLGRDLFVHSMGDK(ペプチドNo.21:配列番号15),QIGKIKLSDVLSAS(ペプチドNo.15:配列番号16),YGAIDKELHFSGGK(ペプチドNo.34:配列番号17),NVDNILNMPSTTSG(ペプチドNo.20:配列番号18),GNLKGVYYPKSSTT(ペプチドNo.22:配列番号19),ITEKIQSGKLTITI(ペプチドNo.14:配列番号20),FHDFLVSLKGKKFA(ペプチドNo.26:配列番号21),TTGGEVRLFRSFYV(ペプチドNo.31:配列番号22),IGARFGLDYQDINI(ペプチドNo.35:配列番号23)、KQLPQPKRSELKPK(ペプチドNo.8:配列番号86)、TNIKQYMQNNHRSQ(ペプチドNo.31N:配列番号87)、TLTLEGTETFAQNS(ペプチドNo.81:配列番号88)、EAYAKNQGDIWSTI(ペプチドNo.63:配列番号89)、VIGSKSSITLNSAN(ペプチドNo.73:配列番号90)、及びADIQSSQTTFANSV(ペプチドNo.61:配列番号91)に含まれるアミノ酸配列の全て又は一部を有するペプチドを挙げることができる。前記HsvA抗原ペプチドは,目的のHsvA抗原としての機能を果たす限り,前記ペプチド配列中に1~数個のアミノ酸が置換され,欠失し,付加され又は挿入されていてもよい。アミノ酸が置換される場合,好ましくは,類似するアミノ酸残基に保存的に置換され,例えば,GとP,GとA又はV,LとI,EとQ,DとN,CとT,TとS又はA,KとR等のアミノ酸の間での置換を挙げることができる。
本明細書において,アミノ酸は一文字表記にて記載される。すなわち,Cはシステイン,Aはアラニン,Yはチロシン,Hはヒスチジン,Rはアルギニン,Gはグリシン,Eはグルタミン酸,Lはロイシン,Vはバリン,Wはトリプトファン,Tはスレオニン,Yはチロシン,Iはイソロイシン,Fはフェニルアラニン,Dはアスパラギン酸,Nはアスパラギン,Qはグルタミン,Mはメチオニン,Kはリジン,及びPはプロリンを表す。また,本明細書においてXn(nは自然数)は,各々定義された複数のアミノ酸からなる群から選択される1種類のアミノ酸を表す。例えば,EKX1AVX2X3X4X5NSNX6X7(配列番号24)において「X1」がK又はDであるとは,X1で表されるアミノ酸がリジン又はアスパラギン酸のいずれかであることを意味する。
一態様において,本発明はHsvA抗原ペプチドの免疫学的に同等な変異体に関する。
本明細書において,「ペプチドの免疫学的に同等な変異体」とは,天然のHsvAタンパク質由来の配列を有するペプチドと結合する抗体と結合可能なペプチドであって,天然のHsvAタンパク質由来の配列を有するペプチドとは異なるアミノ酸配列を有するペプチドを意味する。例えば,該変異体は,ペプチド配列中の1~数個のアミノ酸が,天然又は人工のアミノ酸と置換され,欠失し,付加され,又は挿入されたペプチドであってもよい。あるいは,該変異体は,天然のHsvAタンパク質由来の配列を有するペプチドを構成するアミノ酸の一部が修飾されたペプチドであってもよい。あるいは,アミノ酸変異と修飾の両方の変異が導入されていてもよい。天然のHsvAタンパク質由来の配列を有するペプチドと結合する抗体と結合するとは,言い換えれば,抗HsvA抗体と結合することを意味する。例えば,H.スイスに感染した患者の血中に存在する抗HsvA抗体と結合可能なペプチドは,本発明のペプチドの免疫学的に同等な変異体に含まれる。天然のHsvAタンパク質由来の配列を有するペプチドと結合する抗体,又は,H.スイスに感染した患者の血中に存在する抗HsvA抗体と,被検ペプチド変異体が結合可能であるか否かは,当該ペプチド変異体を結合させた固相に当該抗体を反応させ,洗浄後に更に標識化抗IgG抗体と反応させることにより判定することができる。標識化IgGを洗浄後に固相に結合した標識化IgGが検出された場合,当該ペプチドは,本発明のペプチドの免疫学的に同等な変異体であると判定される。なお、本願明細書全体にわたって、特にそのように解することが不整合である場合を除き、「HsvA抗原ペプチド」の語はHsvA抗原ペプチドの免疫学的に同等な変異体を含む。
本明細書において,「ペプチドの免疫学的に同等な変異体」とは,天然のHsvAタンパク質由来の配列を有するペプチドと結合する抗体と結合可能なペプチドであって,天然のHsvAタンパク質由来の配列を有するペプチドとは異なるアミノ酸配列を有するペプチドを意味する。例えば,該変異体は,ペプチド配列中の1~数個のアミノ酸が,天然又は人工のアミノ酸と置換され,欠失し,付加され,又は挿入されたペプチドであってもよい。あるいは,該変異体は,天然のHsvAタンパク質由来の配列を有するペプチドを構成するアミノ酸の一部が修飾されたペプチドであってもよい。あるいは,アミノ酸変異と修飾の両方の変異が導入されていてもよい。天然のHsvAタンパク質由来の配列を有するペプチドと結合する抗体と結合するとは,言い換えれば,抗HsvA抗体と結合することを意味する。例えば,H.スイスに感染した患者の血中に存在する抗HsvA抗体と結合可能なペプチドは,本発明のペプチドの免疫学的に同等な変異体に含まれる。天然のHsvAタンパク質由来の配列を有するペプチドと結合する抗体,又は,H.スイスに感染した患者の血中に存在する抗HsvA抗体と,被検ペプチド変異体が結合可能であるか否かは,当該ペプチド変異体を結合させた固相に当該抗体を反応させ,洗浄後に更に標識化抗IgG抗体と反応させることにより判定することができる。標識化IgGを洗浄後に固相に結合した標識化IgGが検出された場合,当該ペプチドは,本発明のペプチドの免疫学的に同等な変異体であると判定される。なお、本願明細書全体にわたって、特にそのように解することが不整合である場合を除き、「HsvA抗原ペプチド」の語はHsvA抗原ペプチドの免疫学的に同等な変異体を含む。
(抗HsvA抗体又はその免疫反応性断片)
他の態様において,本発明は,HsvAタンパク質を特異的に認識する抗体(本明細書において「抗HsvA抗体」という)若しくはその免疫反応性断片に関する。本発明の抗HsvA抗体は好ましくは,上述において定義されたHsvAタンパク質抗原ペプチドのいずれかと結合する。例えば,抗HsvA抗体は,配列番号78~83のいずれか1つの配列に記載のアミノ酸配列;配列番号78~83のいずれか1つの配列に記載のアミノ酸配列と80%,85%,90%,95%,98%,又は99%の同一性を有するアミノ酸配列;又は,配列番号78~83のいずれか1つの配列に記載のアミノ酸配列のうち1~50個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換され,欠失し,付加され,又は挿入されたたアミノ酸配列を有するペプチドと結合する。「抗体の免疫反応性断片」とは,抗体の一部分(部分断片)または抗体の一部分を含むペプチドであって,抗体の抗原への結合作用を保持するものを意味する。このような抗体の断片としては,例えば,F(ab’)2,Fab’,Fab,一本鎖Fv(以下,「scFv」という),ジスルフィド結合Fv(以下,「dsFv」という)若しくはこれらの重合体,二量体化V領域(以下,「Diabody」という),またはCDRを含むペプチドを挙げることができる。好ましくは,本発明の抗体若しくはその免疫反応性断片は,HsvA抗原ペプチドを特異的に認識する。本明細書において,抗体又はその免疫反応性断片が「特異的に」認識する(結合する)とは,その抗体又はその免疫反応性断片が他のアミノ酸配列や立体構造に対する親和性よりも,HsvA抗原ペプチドに対して実質的に高い親和性で結合することを意味する。本発明の抗体とHsvA抗原との結合における結合定数(Ka)としては,例えば,少なくとも107M-1,少なくとも108M-1,少なくとも109M-1,少なくとも1010M-1,少なくとも1011M-1,少なくとも1012M-1,少なくとも1013M-1を挙げることができる。
他の態様において,本発明は,HsvAタンパク質を特異的に認識する抗体(本明細書において「抗HsvA抗体」という)若しくはその免疫反応性断片に関する。本発明の抗HsvA抗体は好ましくは,上述において定義されたHsvAタンパク質抗原ペプチドのいずれかと結合する。例えば,抗HsvA抗体は,配列番号78~83のいずれか1つの配列に記載のアミノ酸配列;配列番号78~83のいずれか1つの配列に記載のアミノ酸配列と80%,85%,90%,95%,98%,又は99%の同一性を有するアミノ酸配列;又は,配列番号78~83のいずれか1つの配列に記載のアミノ酸配列のうち1~50個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換され,欠失し,付加され,又は挿入されたたアミノ酸配列を有するペプチドと結合する。「抗体の免疫反応性断片」とは,抗体の一部分(部分断片)または抗体の一部分を含むペプチドであって,抗体の抗原への結合作用を保持するものを意味する。このような抗体の断片としては,例えば,F(ab’)2,Fab’,Fab,一本鎖Fv(以下,「scFv」という),ジスルフィド結合Fv(以下,「dsFv」という)若しくはこれらの重合体,二量体化V領域(以下,「Diabody」という),またはCDRを含むペプチドを挙げることができる。好ましくは,本発明の抗体若しくはその免疫反応性断片は,HsvA抗原ペプチドを特異的に認識する。本明細書において,抗体又はその免疫反応性断片が「特異的に」認識する(結合する)とは,その抗体又はその免疫反応性断片が他のアミノ酸配列や立体構造に対する親和性よりも,HsvA抗原ペプチドに対して実質的に高い親和性で結合することを意味する。本発明の抗体とHsvA抗原との結合における結合定数(Ka)としては,例えば,少なくとも107M-1,少なくとも108M-1,少なくとも109M-1,少なくとも1010M-1,少なくとも1011M-1,少なくとも1012M-1,少なくとも1013M-1を挙げることができる。
本発明の抗体は,HsvA抗原ペプチドを特異的に認識することができる限り,ポリクローナルであってもモノクローナルであってもよいが,好ましくはモノクローナル抗体である。ここで,「モノクローナル抗体」は,単一クローンに由来する抗体であることを意味する。本発明の抗体は,完全抗体の他,抗原との結合活性を保持する限り,バイスペシフィック抗体,及び一本鎖抗体を含む。完全抗体は,非ヒト動物の抗体,非ヒト動物の抗体のアミノ酸配列とヒト由来の抗体のアミノ酸配列を有する抗体,及び,ヒト抗体を包含する。非ヒト動物の抗体としては,例えば,マウス,ラット,ハムスター,ラビットなどの抗体を挙げることができ,好ましくは,ハイブリドーマを作製することができる動物の抗体であり,より好ましくはマウスの抗体である。非ヒト動物の抗体のアミノ酸配列とヒト由来の抗体のアミノ酸配列を有する抗体としては,ヒト抗体に動物由来のモノクローナル抗体の抗原結合ドメインFvを入れ替えたヒト型キメラ抗体,動物由来抗体モノクローナル抗体の抗原結合に直接関わるFvドメイン上の配列であるCDRをヒト抗体のフレームに組み込んだヒト化抗体を挙げることができる。また,ヒト抗体とは,完全にヒト由来の抗体遺伝子の発現産物であるヒト抗体のことである。また,本発明の抗体のイムノグロブリンクラスは特に限定されるものではなく,IgG,IgM,IgA,IgE,IgD,IgYのいずれのイムノグロブリンクラスであってもよく,好ましくはIgGである。また,本発明の抗体はいずれのアイソタイプの抗体をも包含するものである。
また,HsvA抗原ペプチド,抗HsvA抗体又はその免疫反応性断片は,必要に応じて標識化されていてもよい。当該標識としては,放射能標識,酵素,蛍光標識,生物発光標識,化学発光標識金属等の検出可能な標識を用いることができる。このような標識としては,これに限定されるものではないが例として,35S(イオウ35),32P(リン32),3H(トリチウム),125I(ヨウ素125),131I(ヨウ素131),14C(炭素14)等の放射能標識;βガラクトシダーゼ,ペルオキシダーゼ,アルカリフォスファターゼ,グルコースオキシダーゼ,乳酸オキシダーゼ,アルコールオキシダーゼ,モノアミンオキシダーゼ,ホースラディッシュペルオキシダーゼ等の酵素;FAD,FMN,ATP,ビオチン,ヘム等の補酵素又は補欠分子族;フルオレセイン誘導体(フルオレセインイソチオシアネート(FITC),フルオレセインチオフルバミル等),ローダミン誘導体(テトラメチルローダミン,トリメチルローダミン(RITC),テキサスレッド,ローダミン110等),Cy色素(Cy3,Cy5,Cy5.5,Cy7),Cy-クロム,スペクトラムグリーン,スペクトラムオレンジ,プロピジウムイオダイド,アロフィコシアニン(APC),R-フィコエリスリン(R-PE)、Alexa-Flour(登録商標)488及びAlexa-Flour(登録商標)568等のAlexa-Flour(登録商標)蛍光色素(Molecular Probes, Inc.社、米国)、Alexa-Flour(登録商標)568等の蛍光標識;ルシフェラーゼ等の生物発光標識;あるいは,ルミノール,イソルミノール,N-(4-アミノブチル)-N-エチルイソルミノースエステル等のルミノール誘導体,N-メチルアクリジニウムエステル,N-メチルアクリジニウムアシルスルホンアミドエステル等のアクリジニウム誘導体,ルシゲニン,アダマンチルジオキセタン,インドキシル誘導体,ルテニウム錯体等の化学発光標識;金コロイド等の金属等の検出可能な標識を挙げることができる。
(hsvA遺伝子特異的塩基配列を有する核酸分子・プライマー・プローブ)
別の態様において,本発明は,hsvA遺伝子と特異的に結合可能な核酸分子に関する。好ましくは,hsvA遺伝子と特異的に結合可能な核酸分子は,hsvA遺伝子特異的塩基配列若しくは該塩基配列と相補的な配列を有する核酸分子,又は,hsvA遺伝子特異的塩基配列若しくは該塩基配列と相補的な配列とストリンジェントな条件下で結合可能な核酸分子(以下,「hsvA遺伝子特異的塩基配列を有する核酸分子等」という)に関する。前記hsvA特異的核酸分子は,用途に応じてプライマー又はプローブであってもよい。ここで,プライマーはPCR等によりDNAを増幅させる目的で使用される核酸分子である。プライマーは相補的な配列を有するDNAとハイブリダイズして,当該DNAを伸長させることにより,当該DNAを増幅することができる核酸分子であり,増幅されたDNAを検出することにより当該DNAを検出することを可能とする。プローブは,標的DNAと結合することで標的DNAの存在を検出する目的で用いられる核酸分子である。本発明のhsvA遺伝子と結合可能な核酸分子は,hsvA遺伝子が有する塩基配列のうち,H.ピロリ及びH.ハイルマニイ(ただし,H.スイスを除く)が同一又は類似する配列を持たない限り,hsvAに由来しない塩基配列を有していてもよい。選択した塩
基配列がhsvA遺伝子特異的であるか否かは,例えば,当該配列について既に公開されているデータベースを検索して,H.ピロリ及びH.ハイルマニイ(H.スイスを除く)が同一又は類似する配列を持つか否かを調べ,持つ場合には特異的ではなく,持たない場合には特異的であると決定することができる。ここで,「類似しない」とは,同一性が10%以下,20%以下,30%以下,40%以下,又は50%以下であることを意味してもよい。hsvA遺伝子と特異的に結合可能な核酸分子は例えば配列番号1から任意の配列を上記方法に従って選択することができる。また,本発明のhsvA遺伝子と結合可能な核酸分子は,例えば,5~50ヌクレオチド,5~45ヌクレオチド,5~40ヌクレオチド,5~35ヌクレオチド,5~30ヌクレオチド,5~25ヌクレオチド,5~20ヌクレオチド,5~15ヌクレオチド,5~10ヌクレオチド,10~50ヌクレオチド,10~45ヌクレオチド,10~40ヌクレオチド,10~35ヌクレオチド,10~30ヌクレオチド,10~25ヌクレオチド,10~20ヌクレオチド,10~15ヌクレオチド,15~50ヌクレオチド,15~45ヌクレオチド,15~40ヌクレオチド,15~35ヌクレオチド,15~30ヌクレオチド,15~25ヌクレオチド,15~20ヌクレオチド,又は17~25ヌクレオチドとすることができる。好ましくは,hsvA遺伝子特異的塩基配列としては,例えば,CTTTTAGCGTGGTATCCTTC(配列番号31),TTACAAAGACCACCAACGGA(配列番号32),TACCATAGAAAGCGGAAAC(配列番号33),AGCTATAGCTTTGCACCTGA(配列番号34),ACTAACAGCATAGAAGTTGGGGA(配列番号35),AACAACATTACAGGCATGAG(配列番号36),CAAATAGTAACAGGACAATT(配列番号37),CAGGATTTAAGAGGCACTTA(配列番号38),TCTTAACCAATCTGAGCAA(配列番号39),GTCAAACACGTTATTGATGGCTT(配列番号40),GGGGTTTAATAGCATAGGG(配列番号41),TAGAGCTCTACACCAGTCTT(配列番号42),ATAAAGCCCATGAATTCTTAGGCATGCGTGCTCTG(配列番号43),TGCTATTGATAAAGAGTTACATTTCTCAGG(配列番号44),ATTTCTCAGGGGGAAAGTC(配列番号45),GGCTAATAATTTAACCACAATAAGCGCCTTTAA(配列番号46),GATGGGCGCTTCTGGTTTA(配列番号47),ATGAATTCTTAGGCATGCGTGCTCT(配列番号48),TTTTGGAGGTGTAGGAGTAGAT(配列番号49),AGCGCGCATTTAAAACAGGT(配列番号50),AGAAACGAGATTACAGGAAG(配列番号51),AGGAGCAAGTTTTGTAGCAG(配列番号52),AAAATGCGACTGATTGGATG(配列番号53),TTGAAATTTGGCCACGCT(配列番号54),TCACCCATAGAATGGACGAA(配列番号55),CTAGCGCATTAACCACAGACTG(配列番号56),TAGAAGTTGTAGACACGGT(配列番号57),GTGATATTGCCTTTCTGAAC(配列番号58),GCAAGTTTTGTGCGGATT(配列番号59),ATGTGATACACATCTGACC(配列番号60),AGTGCCGTTACCATCGTGAA(配列番号61),TATTCAAGGAAAGTCCCTGGAGAAACTCCAGAGAC(配列番号62),TTAAAGGCGCTTATTGTGGTTAAATTATTAGCC(配列番号63),ATTAGCCTTAAGGGTGCTATC(配列番号64),CTGGTAATGCATCATTAGAAGCAAA(配列番号65),TACGCGCAAAATAGGTTCTT(配列番号66),TGGAGAAACTCCAGAGACTA(配列番号67),TTGTTCGCTGTAGTGCCGTGG(配列番号68),GAAGGATACCACGCTAAAAG(配列番号69),AAGCTAGAGTTTTGGTTGAG(配列番号70),TTGCTCAGATTGGTTAAGA(配列番号71),ATCGAAATAAGCGAACCTCA(配列番号72),TTGAAAGCTTAGCTAAACGG(配列番号73),TGGTATTGCTGGTTAAGAGG(配列番号74),CAAACAGATGAGCCGT(配列番号75),A
TGAAAAAGTTTAGTTCTCTCACATTGAAATTTGGCCACGCTC(配列番号76),CTAAAAAGCATAGCGCATCCCGACATTGCCTGTAATATTAATATC(配列番号77)を挙げることができる。
別の態様において,本発明は,hsvA遺伝子と特異的に結合可能な核酸分子に関する。好ましくは,hsvA遺伝子と特異的に結合可能な核酸分子は,hsvA遺伝子特異的塩基配列若しくは該塩基配列と相補的な配列を有する核酸分子,又は,hsvA遺伝子特異的塩基配列若しくは該塩基配列と相補的な配列とストリンジェントな条件下で結合可能な核酸分子(以下,「hsvA遺伝子特異的塩基配列を有する核酸分子等」という)に関する。前記hsvA特異的核酸分子は,用途に応じてプライマー又はプローブであってもよい。ここで,プライマーはPCR等によりDNAを増幅させる目的で使用される核酸分子である。プライマーは相補的な配列を有するDNAとハイブリダイズして,当該DNAを伸長させることにより,当該DNAを増幅することができる核酸分子であり,増幅されたDNAを検出することにより当該DNAを検出することを可能とする。プローブは,標的DNAと結合することで標的DNAの存在を検出する目的で用いられる核酸分子である。本発明のhsvA遺伝子と結合可能な核酸分子は,hsvA遺伝子が有する塩基配列のうち,H.ピロリ及びH.ハイルマニイ(ただし,H.スイスを除く)が同一又は類似する配列を持たない限り,hsvAに由来しない塩基配列を有していてもよい。選択した塩
基配列がhsvA遺伝子特異的であるか否かは,例えば,当該配列について既に公開されているデータベースを検索して,H.ピロリ及びH.ハイルマニイ(H.スイスを除く)が同一又は類似する配列を持つか否かを調べ,持つ場合には特異的ではなく,持たない場合には特異的であると決定することができる。ここで,「類似しない」とは,同一性が10%以下,20%以下,30%以下,40%以下,又は50%以下であることを意味してもよい。hsvA遺伝子と特異的に結合可能な核酸分子は例えば配列番号1から任意の配列を上記方法に従って選択することができる。また,本発明のhsvA遺伝子と結合可能な核酸分子は,例えば,5~50ヌクレオチド,5~45ヌクレオチド,5~40ヌクレオチド,5~35ヌクレオチド,5~30ヌクレオチド,5~25ヌクレオチド,5~20ヌクレオチド,5~15ヌクレオチド,5~10ヌクレオチド,10~50ヌクレオチド,10~45ヌクレオチド,10~40ヌクレオチド,10~35ヌクレオチド,10~30ヌクレオチド,10~25ヌクレオチド,10~20ヌクレオチド,10~15ヌクレオチド,15~50ヌクレオチド,15~45ヌクレオチド,15~40ヌクレオチド,15~35ヌクレオチド,15~30ヌクレオチド,15~25ヌクレオチド,15~20ヌクレオチド,又は17~25ヌクレオチドとすることができる。好ましくは,hsvA遺伝子特異的塩基配列としては,例えば,CTTTTAGCGTGGTATCCTTC(配列番号31),TTACAAAGACCACCAACGGA(配列番号32),TACCATAGAAAGCGGAAAC(配列番号33),AGCTATAGCTTTGCACCTGA(配列番号34),ACTAACAGCATAGAAGTTGGGGA(配列番号35),AACAACATTACAGGCATGAG(配列番号36),CAAATAGTAACAGGACAATT(配列番号37),CAGGATTTAAGAGGCACTTA(配列番号38),TCTTAACCAATCTGAGCAA(配列番号39),GTCAAACACGTTATTGATGGCTT(配列番号40),GGGGTTTAATAGCATAGGG(配列番号41),TAGAGCTCTACACCAGTCTT(配列番号42),ATAAAGCCCATGAATTCTTAGGCATGCGTGCTCTG(配列番号43),TGCTATTGATAAAGAGTTACATTTCTCAGG(配列番号44),ATTTCTCAGGGGGAAAGTC(配列番号45),GGCTAATAATTTAACCACAATAAGCGCCTTTAA(配列番号46),GATGGGCGCTTCTGGTTTA(配列番号47),ATGAATTCTTAGGCATGCGTGCTCT(配列番号48),TTTTGGAGGTGTAGGAGTAGAT(配列番号49),AGCGCGCATTTAAAACAGGT(配列番号50),AGAAACGAGATTACAGGAAG(配列番号51),AGGAGCAAGTTTTGTAGCAG(配列番号52),AAAATGCGACTGATTGGATG(配列番号53),TTGAAATTTGGCCACGCT(配列番号54),TCACCCATAGAATGGACGAA(配列番号55),CTAGCGCATTAACCACAGACTG(配列番号56),TAGAAGTTGTAGACACGGT(配列番号57),GTGATATTGCCTTTCTGAAC(配列番号58),GCAAGTTTTGTGCGGATT(配列番号59),ATGTGATACACATCTGACC(配列番号60),AGTGCCGTTACCATCGTGAA(配列番号61),TATTCAAGGAAAGTCCCTGGAGAAACTCCAGAGAC(配列番号62),TTAAAGGCGCTTATTGTGGTTAAATTATTAGCC(配列番号63),ATTAGCCTTAAGGGTGCTATC(配列番号64),CTGGTAATGCATCATTAGAAGCAAA(配列番号65),TACGCGCAAAATAGGTTCTT(配列番号66),TGGAGAAACTCCAGAGACTA(配列番号67),TTGTTCGCTGTAGTGCCGTGG(配列番号68),GAAGGATACCACGCTAAAAG(配列番号69),AAGCTAGAGTTTTGGTTGAG(配列番号70),TTGCTCAGATTGGTTAAGA(配列番号71),ATCGAAATAAGCGAACCTCA(配列番号72),TTGAAAGCTTAGCTAAACGG(配列番号73),TGGTATTGCTGGTTAAGAGG(配列番号74),CAAACAGATGAGCCGT(配列番号75),A
TGAAAAAGTTTAGTTCTCTCACATTGAAATTTGGCCACGCTC(配列番号76),CTAAAAAGCATAGCGCATCCCGACATTGCCTGTAATATTAATATC(配列番号77)を挙げることができる。
hsvA遺伝子特異的塩基配列を有する核酸分子をプライマーとして使用する場合、フォワードプライマー及びリバースプライマーとしては、以下のプライマーから選択されるプライマーの組み合わせを使用することができる。
(フォワードプライマー)
HSVANOFW-2:AGAAACGAGATTACAGGAAG(配列番号51)
HSVANOFW-3:AGGAGCAAGTTTTGTAGCAG(配列番号52)HSVANOFW-5:AAAATGCGACTGATTGGATG(配列番号53)
(リバースプライマー)
HSVANORV-1:ATCGAAATAAGCGAACCTCA(配列番号72)
HSVANORV-3:TTGAAAGCTTAGCTAAACGG(配列番号73)
HSVANORV-4:TGGTATTGCTGGTTAAGAGG(配列番号74)。
(フォワードプライマー)
HSVANOFW-2:AGAAACGAGATTACAGGAAG(配列番号51)
HSVANOFW-3:AGGAGCAAGTTTTGTAGCAG(配列番号52)HSVANOFW-5:AAAATGCGACTGATTGGATG(配列番号53)
(リバースプライマー)
HSVANORV-1:ATCGAAATAAGCGAACCTCA(配列番号72)
HSVANORV-3:TTGAAAGCTTAGCTAAACGG(配列番号73)
HSVANORV-4:TGGTATTGCTGGTTAAGAGG(配列番号74)。
hsvA遺伝子特異的塩基配列を有する核酸分子をプライマーとして使用する場合、フォワードプライマー及びリバースプライマーの組み合わせとして、好ましくは、HSVANOFW-2/HSVANORV-4(101bp)、HSVANOFW-3/HSVANORV-4(291bp)、HSVANOFW-5/HSVANORV-4(556bp)、HSVANOFW-2/HSVANORV-1(508bp)、及びHSVANOFW-5/HSVANORV-3(108bp)の組み合わせである(カッコ内は当該プライマーを用いたPCRによる増幅により得られるDNA断片の長さを表す)。
本明細書において,「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズ」するとは,当業者に通常用いられるハイブリダイゼーション条件でハイブリダイズすることを意味する。例えば,Molecular Cloning,a Laboratory Mannual,Fourth Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press(2012)又は, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Online Library等に記載の方法によりハイブリダイズするか否かを決定することができる。例えば,ハイブリダイズの条件は,6×SSC(0.9M NaCl,0.09M クエン酸三ナトリウム)又は6×SSPE(3M NaCl,0,2M NaH2PO4,20mM EDTA・2Na,pH7.4)中42℃でハイブリダイズさせ,その後42℃で0.5×SSCで洗浄する条件であってもよい。
本明細書全体に亘って,ある配列が「特異的」であるとは,当該タンパク質,ペプチド,又は核酸分子に特徴的であることを意味し,他のタンパク質,ペプチド,又は核酸分子には実質的に存在しないことを意味する。ここで,「実質的に存在しない」とは,完全に一致する配列が存在しない場合の他,区別して検出しようとする他の分子(例えば,H.ピロリ由来成分)において目的の分子(hsvA遺伝子又はHsvAタンパク質)と類似する配列が存在していても,生物学的結合反応において区別可能な程度存在する場合を含む。
また,「特異的に認識する」又は,「特異的に結合する」とは,目的の物質と結合するが,他の物質とは実質的に結合しないことを意味する。候補物質が目的の物質と結合するか否か,及び/又は,その他の物質と実質的に結合しないか否かは,候補物質(核酸か抗体かなど)及び目的の物質の種類(核酸かタンパク質かなど)に応じて,サザンハイブリダイゼーション,PCR,ウェスタンブロッティング,及びELISAなど,当業者周知の方法を採用して確認することができる。例えば,タンパク質をウェスタンブロッティン
グにより確認する場合,該タンパク質を2%SDS,10%グリセロール,50mM Tris-HCl(pH6.8),100mMジチオスレイトール溶液中に溶解し,煮沸して抗His抗体及び被検抗体によりウェスタンブロット分析を行うことにより確認することができる。サザンハイブリダイゼーション,PCR,又はELISAにより確認する場合,後述の方法を利用して確認することができる。ここで,「実質的に結合しない」とは,目的の物質への結合との比較において,結合しない(又は認識しない)とされる核酸,タンパク質又はペプチドへの被検物質の結合が十分区別可能な程度低い場合を含む。例えば,目的の物質と比較した,その他の物質との交差反応率が,1%以下,0.5%以下,0.3%以下,0.1%以下,0.05%以下,0.03%以下であってもよい。交差反応性は,{(比較対象となるその他の物質への結合に関する実測値(濃度)/(比較対象となるその他の物質の添加サンプル濃度)×100%}として計算して得ることができる。特に,本明細書において,抗体又はその免疫反応性断片が「特異的に」認識する(結合する)とは,該抗体又はその免疫反応性断片が,他のアミノ酸配列に対する親和性と比較して,実質的に高い親和性で当該抗原と結合すること,あるいは,該抗原が,他の抗体又はその免疫反応性断片に対する親和性と比較して,実質的に高い親和性で当該抗体又はその免疫反応性断片と結合することを意味する。本明細書において,「実質的に高い親和性」とは,所望の測定装置または方法によって,その特定のアミノ酸配列を他のアミノ酸配列から区別して検出することが可能な程度に高い親和性を意味する。例えば,実質的に高い親和性は,ELISA又はEIAにより検出された強度(例えば,蛍光強度)として,3倍以上,4倍以上,5倍以上,6倍以上,7倍以上,8倍以上,9倍以上,10倍以上であってもよい。
グにより確認する場合,該タンパク質を2%SDS,10%グリセロール,50mM Tris-HCl(pH6.8),100mMジチオスレイトール溶液中に溶解し,煮沸して抗His抗体及び被検抗体によりウェスタンブロット分析を行うことにより確認することができる。サザンハイブリダイゼーション,PCR,又はELISAにより確認する場合,後述の方法を利用して確認することができる。ここで,「実質的に結合しない」とは,目的の物質への結合との比較において,結合しない(又は認識しない)とされる核酸,タンパク質又はペプチドへの被検物質の結合が十分区別可能な程度低い場合を含む。例えば,目的の物質と比較した,その他の物質との交差反応率が,1%以下,0.5%以下,0.3%以下,0.1%以下,0.05%以下,0.03%以下であってもよい。交差反応性は,{(比較対象となるその他の物質への結合に関する実測値(濃度)/(比較対象となるその他の物質の添加サンプル濃度)×100%}として計算して得ることができる。特に,本明細書において,抗体又はその免疫反応性断片が「特異的に」認識する(結合する)とは,該抗体又はその免疫反応性断片が,他のアミノ酸配列に対する親和性と比較して,実質的に高い親和性で当該抗原と結合すること,あるいは,該抗原が,他の抗体又はその免疫反応性断片に対する親和性と比較して,実質的に高い親和性で当該抗体又はその免疫反応性断片と結合することを意味する。本明細書において,「実質的に高い親和性」とは,所望の測定装置または方法によって,その特定のアミノ酸配列を他のアミノ酸配列から区別して検出することが可能な程度に高い親和性を意味する。例えば,実質的に高い親和性は,ELISA又はEIAにより検出された強度(例えば,蛍光強度)として,3倍以上,4倍以上,5倍以上,6倍以上,7倍以上,8倍以上,9倍以上,10倍以上であってもよい。
(キット及び組成物)
別の態様において,本発明は,HsvA抗原ペプチド及びhsvA遺伝子と特異的に結合可能な核酸分子を含有する,H.スイス感染の判定用キット,H.スイスの感染判定用組成物,医薬組成物に関する。本発明のキット及び組成物は,更に,固相,ハプテン,及び不溶性担体からなる群より選択される担体を含んでいてもよい。
別の態様において,本発明は,HsvA抗原ペプチド及びhsvA遺伝子と特異的に結合可能な核酸分子を含有する,H.スイス感染の判定用キット,H.スイスの感染判定用組成物,医薬組成物に関する。本発明のキット及び組成物は,更に,固相,ハプテン,及び不溶性担体からなる群より選択される担体を含んでいてもよい。
本発明のキット及び組成物がhsvA遺伝子と特異的に結合可能な核酸分子を含有する場合,核酸を用いた公知の方法に基づくことができる。このような方法としては,例えばハイブリダイゼーションを利用した方法;PCRを利用した方法;並びに,インベーダー(登録商標)法として知られる方法(例えば,Kwiatkowski,R.W.ら,Mol.Diagn.(1999)4:353-364参照)を挙げることができる。
例えば,本発明のキット及び組成物は,標識化されたhsvA遺伝子と特異的に結合可能な核酸分子が固定化した固相又はハプテン,及び,任意でハプテンと特異的に結合する物質が固定化した固相を含んでいてもよい。また,本発明のキット及び組成物は,hsvA遺伝子と特異的に結合可能な核酸分子をプライマー(又はプライマーペア),又はプローブとして含んでいてもよい。あるいは,本発明のキット及び組成物は,hsvA遺伝子特異的塩基配列等及び消光プローブの一部と相補的な配列(フラップ)を備えるアレル特異的プローブ,hsvA遺伝子特異的塩基配列等を備えるインベーダープローブ,三重鎖特異的DNA分解酵素,及び,消光プローブを備える蛍光標識ユニバーサルプローブを備えることができる。上記フラップは,各アレル特異的プローブ間で異なっていることが好ましい。上記蛍光標識は,当業者周知のプローブを適宜選択することができ,各蛍光標識ユニバーサルプローブ間で異なっていることが好ましい。例えば,蛍光標識として,FAM及びVICを使用することができる。
HsvA抗原ペプチド又は,該ペプチドを認識する抗体若しくはその免疫反応性断片を含有するキット及び組成物は,抗体分子を用いた公知の方法に基づくことができる。このような方法としては,例えば,標識化免疫測定法;イムノブロッティング法;イムノクロ
マト法;クロマトグラフィ法;比濁法(TIA法);比ろう法(NIA法);比色法;ラテックス凝集法(LIA法);粒子計数法(CIA法);化学発光測定法(CLIA法,CLEIA法);沈降反応法;表面プラズモン共鳴法(SPR法);レゾナントミラーディテクター法(RMD法);比較干渉法等を挙げることができる。本発明のキットが,所望の測定を実施することが可能であるか否かは,当該サンプル又は当該濃度のサンプルを用いて,各測定法を当業者周知の方法により実施することにより,検出可能であるか否かを測定することにより確認することができる。
マト法;クロマトグラフィ法;比濁法(TIA法);比ろう法(NIA法);比色法;ラテックス凝集法(LIA法);粒子計数法(CIA法);化学発光測定法(CLIA法,CLEIA法);沈降反応法;表面プラズモン共鳴法(SPR法);レゾナントミラーディテクター法(RMD法);比較干渉法等を挙げることができる。本発明のキットが,所望の測定を実施することが可能であるか否かは,当該サンプル又は当該濃度のサンプルを用いて,各測定法を当業者周知の方法により実施することにより,検出可能であるか否かを測定することにより確認することができる。
例えば,本発明のキット及び組成物は,(i)HsvA抗原ペプチド,あるいは,該ペプチドを認識する抗体若しくはその免疫反応性断片が固定化した固相又はハプテン,及び(ii)標識化された第二抗体を含むことができる。第二抗体は,固定化された物質及び検出対象に応じて,抗IgG抗体(HsvA抗原ペプチドを固定化),又は抗HsvA抗体(抗HsvA抗体若しくはその免疫反応性断片を固定化)とすることができる。また,本発明のキット及び組成物がハプテンを含む場合,ハプテンと特異的に結合する物質が固定化した固相をさらに含んでいてもよい。
本発明のキット及び組成物において,固相は免疫化学測定に使用できる固相であれば特に限定されないが,例えば,ニトロセルロース,セファロース,ナイロン,ビニロン,ポリエステル,アクリル,ポリオレフィン,ポリウレタン,レーヨン,ポリノジック,キュプラ,リヨセル,アセテート,ポリビニリデンジフルオリド,シリコンラバー,ラテックス,ポリスチレン,ポリプロピレン,ポリエチレン,ポリ塩化ビニル,ポリ塩化ビニリデン,ポリスチレン,ポリ酢酸ビニル,フッ素加工樹脂,ABS樹脂,AS樹脂,アクリル樹脂,ポリマーアロイ,ガラス繊維,炭素繊維,ガラス,ゼラチン,ポリアミノ酸及び/又は磁気感応性素材等を含有する,プレート,チューブ,チップ(例えば,プロテインチップ,ラボチップ等),ビーズ,膜,吸収体及び/又は粒子等を挙げることができ,好ましくは,プレート及び磁気ビーズである。本明細書において不溶性担体とは,ビーズ等の懸濁可能な不溶性の固相を意味し,例えば,ラテックスビーズや磁気ビーズを挙げることができる。
本発明のキット及び組成物は,必要に応じて,発色試薬,反応停止用試薬,標準抗原試薬,サンプル前処理用試薬,ブロッキング試薬等を含んでいてもよい。また,本発明のキット及び組成物が標識化された抗体を含む場合,更に標識と反応する基質を含んでいてもよい。更に,本発明のキットは,添付文書,説明書,及びキットや組成物を格納する容器等を適宜含んでいてもよい。
HsvA抗原ペプチド及びhsvA遺伝子と特異的に結合可能な核酸分子は,H.スイス感染診断対象者由来血液中の抗H.スイス抗体の有無又は抗体価を測定するために使用することができる。また,HsvA抗原ペプチドは,H.スイス感染予防又は治療のための,ペプチドワクチンとして利用することが考えられる。更に,HsvA抗原ペプチドは,抗HsvA抗体取得のための抗原として用いることができる。また,抗HsvA抗体又はその免疫反応性断片は,HsvA抗原ペプチドの検出に用いることができる。更に,抗HsvA抗体又はその免疫反応性断片は,H.スイス感染治療のための治療薬として用いることができる。
一態様において,本発明は,サンプル中のhsvA遺伝子若しくはその一部,HsvAタンパク質若しくはその一部,又は,HsvAタンパク質に対する抗体を検出することを含む,当該サンプル中のH.スイスの存在を判定する方法に関する。特に,本発明は,被験者由来のサンプル中のhsvA遺伝子若しくはその一部,HsvAタンパク質若しくはその一部,又は,HsvAタンパク質に対する抗体を検出することを含む,被験者におけるH.スイスの感染を判定する方法に関する。本方法において,hsvA遺伝子若しくはその一部,HsvAタンパク質若しくはその一部,又は,HsvAタンパク質に対する抗体が検出されたサンプル又は被験者は,それぞれH.スイスが存在する又はH.スイスに感染していると判定される。
本発明の方法が,前記サンプル中のポリヌクレオチド,タンパク質又はその一部,抗体又はその一部と,被検試薬との結合を測定することにより行われる場合,判定において「検出された」か否かは,絶対的な検出の有無である必要はなく,他のサンプルとの比較において決定してもよい。すなわち,±の検出結果に基づくものではなく,測定値から検出の有無を決定してもよい。すなわち,本発明の方法において,「検出する」工程は,必要に応じて「測定する」と置き換えることができ,「検出された」か否かは,対象物質の測定値に基づき陰性対象との比較において決定してもよい。例えば,陰性対象,即ち,H.スイスを含まないサンプル又はH.スイスに感染していないことが明らかな被験者由来のサンプル等において目的の物質が検出される場合,検被者の測定値が当該陰性対象の測定値と同等であれば,微量ながら検出されていても,本発明の方法においては「検出されなかった」としてH.スイスが存在しない又はH.スイスに感染していないと判定される。一方で,陰性対象の測定値と比較して,被験者の測定値が高い場合には,「検出された」としてH.スイスが存在する又はH.スイスに感染していると判定される。よって,本発明の方法において,陰性である対象についてわずかな測定値が認められることは,本発明が予め許容する範囲内である。
好ましくは,本発明におけるH.スイスの存在を判定する方法又は被験者におけるH.スイスの感染を判定する方法は,被験者由来のサンプルにおける,(i)hsvA遺伝子と特異的に結合可能な核酸分子,(ii)HsvA抗原ペプチド,及び,(iii)抗HsvA抗体又はその免疫反応性断片からなる群から選択される少なくとも一つを用いる。
(hsvA遺伝子特異的塩基配列を有する核酸分子を利用した方法)
被験者がH.スイスに感染しているか否かは,被験者のサンプル中に存在するhsvA遺伝子を検出することにより,その感染の有無を決定することができる。hsvA遺伝子と特異的に結合可能な核酸分子を利用した,H.スイスの検出は,ハイブリダイゼーションを利用した方法;PCRを利用した方法;並びに,インベーダー(登録商標)法として知られる方法(例えば,Kwiatkowski,R.W.ら,Mol.Diagn.(1999)4:353-364参照)により行うことができる。
被験者がH.スイスに感染しているか否かは,被験者のサンプル中に存在するhsvA遺伝子を検出することにより,その感染の有無を決定することができる。hsvA遺伝子と特異的に結合可能な核酸分子を利用した,H.スイスの検出は,ハイブリダイゼーションを利用した方法;PCRを利用した方法;並びに,インベーダー(登録商標)法として知られる方法(例えば,Kwiatkowski,R.W.ら,Mol.Diagn.(1999)4:353-364参照)により行うことができる。
ハイブリダイゼーションを利用した方法としては,サザンハイブリダイゼーション,ノーザンハイブリダイゼーション,ドットハイブリダイゼーション,蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH),DNAマイクロアレイ,ASO法等の方法を挙げることができる。例えば,本発明におけるサンプル中のH.スイスの存在を判定する方法は,以下を備えていてもよい:
(a)少なくとも1つのhsvA遺伝子と特異的に結合可能な核酸分子とサンプルを接触させること;
(b)前記hsvA遺伝子と特異的に結合可能な核酸分子への前記サンプル中のポリヌクレオチドの結合を検出すること;及び,
(c)前記結合が検出されたサンプルを,H.スイスが存在するサンプルとして決定し,かつ,前記結合が検出されなかったサンプルを,H.スイスが存在しないサンプルとして決定することにより,H.スイスの存在を判定すること
(a)少なくとも1つのhsvA遺伝子と特異的に結合可能な核酸分子とサンプルを接触させること;
(b)前記hsvA遺伝子と特異的に結合可能な核酸分子への前記サンプル中のポリヌクレオチドの結合を検出すること;及び,
(c)前記結合が検出されたサンプルを,H.スイスが存在するサンプルとして決定し,かつ,前記結合が検出されなかったサンプルを,H.スイスが存在しないサンプルとして決定することにより,H.スイスの存在を判定すること
また,例えば,本発明は,被験者のH.スイスへの感染を判定する方法であって,以下を含む方法であってもよい:
(a)少なくとも1つのhsvA遺伝子と特異的に結合可能な核酸分子と被験者由来のサンプルを接触させること;
(b)前記hsvA遺伝子と特異的に結合可能な核酸分子への前記サンプル中のポリヌクレオチドの結合を検出すること;及び,
(c)前記結合が検出されたサンプルの由来する被験者を,H.スイスに感染している判定し,かつ/又は,前記結合が測定又は検出されなかったサンプルを,H.スイスが存在しないサンプルとして判定すること。
(a)少なくとも1つのhsvA遺伝子と特異的に結合可能な核酸分子と被験者由来のサンプルを接触させること;
(b)前記hsvA遺伝子と特異的に結合可能な核酸分子への前記サンプル中のポリヌクレオチドの結合を検出すること;及び,
(c)前記結合が検出されたサンプルの由来する被験者を,H.スイスに感染している判定し,かつ/又は,前記結合が測定又は検出されなかったサンプルを,H.スイスが存在しないサンプルとして判定すること。
hsvA遺伝子と特異的に結合可能な核酸分子への前記サンプル中のポリヌクレオチドの結合の検出は,例えば,hsvA遺伝子と特異的に結合可能な核酸分子を予め標識しておき,hsvA遺伝子と特異的に結合可能な核酸分子と被験者由来のサンプルを接触させた後に洗浄し,残ったhsvA遺伝子と特異的に結合可能な核酸分子の標識を検出又は測定することにより行うことができる。この場合,好ましくは,被験者由来のサンプルは固相に固定化されている。
また,PCRを利用した方法としては,ARMS(Amplification Refractory Mutation System)法,RT-PCR(Reverse transcription-PCR)法,Nested PCR法等の方法を挙げることができる。例えば,本発明におけるH.スイスの存在を判定する方法は,以下のステップを備えていてもよい:
(a)hsvA遺伝子と特異的に結合可能な核酸分子をプライマーとして用いて,サンプル中のhsvA遺伝子の一部を増幅させること:
(b)増幅された核酸分子を検出すること;並びに,
(c)増幅された核酸分子が検出されたサンプルを,H.スイスが存在するサンプルとして決定し,かつ,増幅された核酸分子が検出されなかったサンプルを,H.スイスが存在しないサンプルとして決定することにより,H.スイスの存在を判定すること。
(a)hsvA遺伝子と特異的に結合可能な核酸分子をプライマーとして用いて,サンプル中のhsvA遺伝子の一部を増幅させること:
(b)増幅された核酸分子を検出すること;並びに,
(c)増幅された核酸分子が検出されたサンプルを,H.スイスが存在するサンプルとして決定し,かつ,増幅された核酸分子が検出されなかったサンプルを,H.スイスが存在しないサンプルとして決定することにより,H.スイスの存在を判定すること。
また,本発明は,以下を有するH.スイス感染の判定方法に関する:
(a)hsvA遺伝子と特異的に結合可能な核酸分子をプライマーとして用いて,被験者由来のサンプル中のhsvA遺伝子の一部を増幅させること:
(b)増幅された核酸分子を検出すること;並びに,
(c)増幅された核酸分子が検出されたサンプルが由来する被験者を,H.スイスが感染していると判定し,かつ,増幅された核酸分子が検出されなかったサンプルが由来する被験者を,H.スイスに感染していないと判定すること。
(a)hsvA遺伝子と特異的に結合可能な核酸分子をプライマーとして用いて,被験者由来のサンプル中のhsvA遺伝子の一部を増幅させること:
(b)増幅された核酸分子を検出すること;並びに,
(c)増幅された核酸分子が検出されたサンプルが由来する被験者を,H.スイスが感染していると判定し,かつ,増幅された核酸分子が検出されなかったサンプルが由来する被験者を,H.スイスに感染していないと判定すること。
また,別の態様において,本発明は,以下を有するH.スイス感染の判定方法に関する:
(a)hsvA遺伝子特異的核酸分子等をプライマーとして用いて,被験者由来のサンプル中のhsvA遺伝子の一部を増幅させること,
(b)増幅された核酸分子のレベルを測定すること;並びに,
(c)測定された核酸分子のレベルが,同様の方法により陰性対照について測定された核酸分子のレベルよりも高い場合,被験者をH.スイスに感染していると判定し,かつ,測定された核酸分子のレベルが,同様の方法により陰性対照について測定された核酸分子のレベルと同等か低い場合,被験者を,H.スイスに感染していないと判定すること。
(a)hsvA遺伝子特異的核酸分子等をプライマーとして用いて,被験者由来のサンプル中のhsvA遺伝子の一部を増幅させること,
(b)増幅された核酸分子のレベルを測定すること;並びに,
(c)測定された核酸分子のレベルが,同様の方法により陰性対照について測定された核酸分子のレベルよりも高い場合,被験者をH.スイスに感染していると判定し,かつ,測定された核酸分子のレベルが,同様の方法により陰性対照について測定された核酸分子のレベルと同等か低い場合,被験者を,H.スイスに感染していないと判定すること。
被験者由来のサンプル中のhsvA遺伝子の一部の増幅は,被験者由来のサンプルを鋳型としてPCR反応等を行うことにより実施することができる。
増幅された核酸は,ドット・ブロット・ハイブリダイゼーション法,表面プラズモン共鳴法(SPR法),PCR-RFLP法,In situ RT-PCR法,PCR-SSO(sequence specific Oligonucleotide)法,PCR-SSP法,AMPFLP(Amplifiable fragment length polymorphism)法,MVR-PCR法,PCR-SSCP(single strand conformation polymorphism)法により判定することができる。
インベーダー(登録商標)法として知られる方法を用いて行う場合,例えば,H.スイスの存在を判定する方法は,以下のステップを備えていてもよい:
(a)以下の(i)及び(ii)に記載の核酸に該試料を接触させて,アレルプローブと相補的なDNAに三重鎖を形成させるステップ:
(i)hsvA遺伝子特異的塩基配列又は該配列と相補的な配列及び消光プローブの一部と相補的な配列(フラップ)を備えるアレル特異的プローブ,及び/又は,hsvA特異的塩基配列または該配列と相補的な配列及び消光プローブの一部と相補的な配列(フラップ)を備えるアレル特異的プローブ,
(ii)hsvA遺伝子特異的塩基配列を備えるインベーダープローブ;
(b)(a)により得られた核酸試料に,三重鎖特異的DNA分解酵素を接触させて三重鎖を形成した核酸からフラップを遊離させるステップ;
(c)遊離されたフラップを,それぞれ当該フラップと相補的な配列及び消光プローブを備える蛍光標識ユニバーサルプローブと接触させるステップ;
(d)(c)により得られた核酸試料に,三重鎖特異的DNA分解酵素を接触させて蛍光標識を遊離させ,蛍光を発色させるステップ;
(e)発色した蛍光を検出することにより,hsvA遺伝子を検出するステップ;ここで,蛍光発色が検出されたサンプルを,H.スイスが存在するサンプルとして決定し,かつ,蛍光発色が検出されなかったサンプルを,H.スイスが存在しないサンプルとして決定することにより,H.スイスの存在を判定するステップ。
(a)以下の(i)及び(ii)に記載の核酸に該試料を接触させて,アレルプローブと相補的なDNAに三重鎖を形成させるステップ:
(i)hsvA遺伝子特異的塩基配列又は該配列と相補的な配列及び消光プローブの一部と相補的な配列(フラップ)を備えるアレル特異的プローブ,及び/又は,hsvA特異的塩基配列または該配列と相補的な配列及び消光プローブの一部と相補的な配列(フラップ)を備えるアレル特異的プローブ,
(ii)hsvA遺伝子特異的塩基配列を備えるインベーダープローブ;
(b)(a)により得られた核酸試料に,三重鎖特異的DNA分解酵素を接触させて三重鎖を形成した核酸からフラップを遊離させるステップ;
(c)遊離されたフラップを,それぞれ当該フラップと相補的な配列及び消光プローブを備える蛍光標識ユニバーサルプローブと接触させるステップ;
(d)(c)により得られた核酸試料に,三重鎖特異的DNA分解酵素を接触させて蛍光標識を遊離させ,蛍光を発色させるステップ;
(e)発色した蛍光を検出することにより,hsvA遺伝子を検出するステップ;ここで,蛍光発色が検出されたサンプルを,H.スイスが存在するサンプルとして決定し,かつ,蛍光発色が検出されなかったサンプルを,H.スイスが存在しないサンプルとして決定することにより,H.スイスの存在を判定するステップ。
(HsvAタンパク質特異的抗体を検出することを利用した方法)
被験者がH.スイスに感染しているか否かは,被験者自身の免疫系が生み出したH.スイス由来タンパク質(特には,HsvAタンパク質)に対する抗体の存在を確認することにより決定することができる。HsvA抗原ペプチド,又は抗HsvA抗体又はその免疫反応性断片を利用したH.スイスの検出は,酵素免疫測定法(EIA法),簡易EIA法,酵素結合イムノソルベントアッセイ法(ELISA法),ラジオイムノアッセイ法(RIA法),蛍光免疫測定法(FIA法)等の標識化免疫測定法;ウェスタンブロッティング法等のイムノブロッティング法;金コロイド凝集法等のイムノクロマト法;イオン交換クロマトグラフィ法,アフィニティクロマトグラフィ法等のクロマトグラフィ法;比濁法(TIA法);比ろう法(NIA法);比色法;ラテックス凝集法(LIA法);粒子計数法(CIA法);化学発光測定法(CLIA法,CLEIA法);沈降反応法;表面プラズモン共鳴法(SPR法);レゾナントミラーディテクター法(RMD法);比較干渉法等により行うことができる。
被験者がH.スイスに感染しているか否かは,被験者自身の免疫系が生み出したH.スイス由来タンパク質(特には,HsvAタンパク質)に対する抗体の存在を確認することにより決定することができる。HsvA抗原ペプチド,又は抗HsvA抗体又はその免疫反応性断片を利用したH.スイスの検出は,酵素免疫測定法(EIA法),簡易EIA法,酵素結合イムノソルベントアッセイ法(ELISA法),ラジオイムノアッセイ法(RIA法),蛍光免疫測定法(FIA法)等の標識化免疫測定法;ウェスタンブロッティング法等のイムノブロッティング法;金コロイド凝集法等のイムノクロマト法;イオン交換クロマトグラフィ法,アフィニティクロマトグラフィ法等のクロマトグラフィ法;比濁法(TIA法);比ろう法(NIA法);比色法;ラテックス凝集法(LIA法);粒子計数法(CIA法);化学発光測定法(CLIA法,CLEIA法);沈降反応法;表面プラズモン共鳴法(SPR法);レゾナントミラーディテクター法(RMD法);比較干渉法等により行うことができる。
一態様において,本発明は,以下を有するH.スイス感染の判定方法に関する:
(a)被験者由来のサンプルを本発明のHsvA抗原と接触させること,
(b)前記ペプチドと結合した,前記血液サンプル中の抗体を検出すること,及び
(c)前記ペプチドと結合した抗体が検出された被験者をH.スイスに感染していると判
定し,かつ,前記ペプチドと結合した抗体が検出されなかった被験者を,H.スイスに感染していないと判定すること。
すること。
(a)被験者由来のサンプルを本発明のHsvA抗原と接触させること,
(b)前記ペプチドと結合した,前記血液サンプル中の抗体を検出すること,及び
(c)前記ペプチドと結合した抗体が検出された被験者をH.スイスに感染していると判
定し,かつ,前記ペプチドと結合した抗体が検出されなかった被験者を,H.スイスに感染していないと判定すること。
すること。
他の態様において,本発明は,以下を有するH.スイス感染の判定方法に関する:
(a)被験者由来のサンプルを,本発明のHsvA抗原ペプチドと接触させること,
(b)前記ペプチドと結合した,前記血液サンプル中の抗体のレベルを測定すること,及び
(c)測定された抗体のレベルが,同様の方法により陰性対照について測定された抗体のレベルよりも高い場合,該被験者をH.スイスに感染していると判定し,かつ,測定された抗体のレベルが,同様の方法により陰性対照について測定された抗体のレベルと同等か低い場合,該被験者を,H.スイスに感染していないと判定すること。
(a)被験者由来のサンプルを,本発明のHsvA抗原ペプチドと接触させること,
(b)前記ペプチドと結合した,前記血液サンプル中の抗体のレベルを測定すること,及び
(c)測定された抗体のレベルが,同様の方法により陰性対照について測定された抗体のレベルよりも高い場合,該被験者をH.スイスに感染していると判定し,かつ,測定された抗体のレベルが,同様の方法により陰性対照について測定された抗体のレベルと同等か低い場合,該被験者を,H.スイスに感染していないと判定すること。
前記ペプチドと被験者由来のサンプル中の抗体が結合したか否かは,例えば,被験者由来のサンプルを,本発明のHsvA抗原ペプチドと接触させた後に,反応液を洗浄して非結合の抗体を除去し,標識化した抗Ig抗体と接触させて前記HsvA抗原ペプチドと結合した被験者由来の抗体と該抗Ig抗体とを結合させ,反応液を洗浄して非結合の抗体を除去して該抗Ig抗体の標識を検出し,該抗Ig抗体の標識が検出された場合に前記ペプチドと被験者由来のサンプル中の抗体が結合したとして,確認することができる。該抗Ig抗体の標識レベルを測定することで,前記ペプチドと被験者由来のサンプル中の抗体との結合レベルを測定することもできる。結合レベルを利用する場合,予め存在量が判明している標準溶液を用いて標準曲線を作成することにより,測定値から抗体量を計算することができる。あるいは,表面プラズモン共鳴センサーを用いて,前記ペプチドと被験者由来のサンプル中の抗体の結合を検出又は測定することもできる。
(HsvA抗原ペプチドの検出を利用したH.スイス感染診断)
被験者がH.スイスに感染しているか否かは,被験者由来のサンプル中のH.スイス由来タンパク質(特には,HsvAタンパク質)の存在を確認することにより決定することができる。HsvAタンパク質を利用したH.スイスの検出は,上述のHsvAタンパク質特異的抗体を検出することを利用した方法と同様な方法により行うことができる。
例えば,本発明のH.スイスの存在の判定方法は,以下を備えていてもよい:
(a)サンプルを,標識化された抗HsvA抗体又はその免疫反応性断片に接触させること;
(b)結合した抗体の標識を検出すること;
(c)該標識が検出されたサンプルを,H.スイスが存在するサンプルとして決定し,かつ,該結合が検出されなかったサンプルを,H.スイスが存在しないサンプルとして決定することにより,H.スイスの存在を判定すること。
被験者がH.スイスに感染しているか否かは,被験者由来のサンプル中のH.スイス由来タンパク質(特には,HsvAタンパク質)の存在を確認することにより決定することができる。HsvAタンパク質を利用したH.スイスの検出は,上述のHsvAタンパク質特異的抗体を検出することを利用した方法と同様な方法により行うことができる。
例えば,本発明のH.スイスの存在の判定方法は,以下を備えていてもよい:
(a)サンプルを,標識化された抗HsvA抗体又はその免疫反応性断片に接触させること;
(b)結合した抗体の標識を検出すること;
(c)該標識が検出されたサンプルを,H.スイスが存在するサンプルとして決定し,かつ,該結合が検出されなかったサンプルを,H.スイスが存在しないサンプルとして決定することにより,H.スイスの存在を判定すること。
また,本発明の被験者のH.スイスへの感染の判定方法は,以下を備えていてもよい:
(a)被験者由来のサンプルを,標識化された抗HsvA抗体又はその免疫反応性断片に接触させること;
(b)結合した抗体の標識を検出すること;
(c)該標識が検出されたサンプルが由来する被験者を,H.スイスに感染していると判定し,かつ/又は,該標識が検出されなかったサンプルが由来する被験者を,H.スイスに感染していないと判定すること。
(a)被験者由来のサンプルを,標識化された抗HsvA抗体又はその免疫反応性断片に接触させること;
(b)結合した抗体の標識を検出すること;
(c)該標識が検出されたサンプルが由来する被験者を,H.スイスに感染していると判定し,かつ/又は,該標識が検出されなかったサンプルが由来する被験者を,H.スイスに感染していないと判定すること。
あるいは,本発明のH.スイスの存在の判定方法は,以下を備えていてもよい:
(a)サンプルを,抗HsvA抗体又はその免疫反応性断片に接触させること;
(b)(a)より得られたサンプルを,前記抗HsvA抗体又はその免疫反応性断片とは異なる標識化された抗HsvA抗体若しくはその免疫反応性断片と接触させること;
(c)結合した抗体の標識を測定又は検出すること;
(d)該結合が測定又は検出されたサンプルを,H.スイスが存在するサンプルとして決定し,かつ,該結合が測定又は検出されなかったサンプルを,H.スイスが存在しないサンプルとして決定することにより,H.スイスの存在を判定すること。
(a)サンプルを,抗HsvA抗体又はその免疫反応性断片に接触させること;
(b)(a)より得られたサンプルを,前記抗HsvA抗体又はその免疫反応性断片とは異なる標識化された抗HsvA抗体若しくはその免疫反応性断片と接触させること;
(c)結合した抗体の標識を測定又は検出すること;
(d)該結合が測定又は検出されたサンプルを,H.スイスが存在するサンプルとして決定し,かつ,該結合が測定又は検出されなかったサンプルを,H.スイスが存在しないサンプルとして決定することにより,H.スイスの存在を判定すること。
本発明の被験者のH.スイスへの感染の判定方法は,以下を備えていてもよい:
(a)被験者由来のサンプルを,抗HsvA抗体又はその免疫反応性断片に接触させること;
(b)(a)より得られたサンプルを,前記抗HsvA抗体又はその免疫反応性断片とは異なる標識化された抗HsvA抗体若しくはその免疫反応性断片と接触させること;
(c)結合した抗体の標識を測定又は検出すること;
(d)該結合が測定又は検出されたサンプルが由来する被験者を,H.スイスに感染していると判定し,かつ/又は,該結合が測定又は検出されなかったサンプルが由来する被験者を,H.スイスに感染していないと判定すること。
(a)被験者由来のサンプルを,抗HsvA抗体又はその免疫反応性断片に接触させること;
(b)(a)より得られたサンプルを,前記抗HsvA抗体又はその免疫反応性断片とは異なる標識化された抗HsvA抗体若しくはその免疫反応性断片と接触させること;
(c)結合した抗体の標識を測定又は検出すること;
(d)該結合が測定又は検出されたサンプルが由来する被験者を,H.スイスに感染していると判定し,かつ/又は,該結合が測定又は検出されなかったサンプルが由来する被験者を,H.スイスに感染していないと判定すること。
抗体又はその断片の標識化は当分野において一般的な方法により行うことができる。例えば,タンパク質又はペプチドを蛍光標識する場合,タンパク質又はペプチドをリン酸緩衝液で洗浄した後,DMSO,緩衝液等で調製した色素を加え,混合した後室温で10分間静置することにより結合させることができる。また,市販の標識キットとして,ビオチン標識キット(Biotin Labeling Kit-NH2,Biotin Labeling Kit-SH:株式会社同仁化学研究所),アルカリフォスファターゼ標識用キット(Alkaline Phosphatase Labeling Kit-NH2,Alkaline Phosphatase Labeling Kit-SH:株式会社同仁化学研究所),ペルオキシダーゼ標識キット(Peroxidase Labering Kit-NH2,Peroxidase Labering Kit-NH2:株式会社同仁化学研究所),フィコビリプロテイン標識キット(Allophycocyanin Labeling Kit-NH2,Allophycocyanin Labeling Kit-SH,B-Phycoerythrin Labeling Kit-NH2,B-Phycoerythrin Labeling Kit-SH,R-Phycoerythrin Labeling Kit-NH2,R-Phycoerythrin Labeling Kit-SH:株式会社同仁化学研究所),蛍光標識キット(Fluorescein Labeling Kit-NH2,HiLyte Fluor(登録商標) 555 Labeling Kit-NH2,HiLyte Fluor(登録商標) 647 Labeling Kit-NH2:株式会社同仁化学研究所),DyLight547,DyLight647(テクノケミカル株式会社),Zenon(登録商標)Alexa Fluor(登録商標)抗体標識キット,Qdot(登録商標)抗体標識キット(インビトロゲン社),EZ-Label Protein Labeling Kit(フナコシ株式会社)等を用いて標識することもできる。また,標識した抗体又はその断片の検出は,適宜標識に適した機器を使用することにより行うことができる。
H.スイスは広く哺乳動物に感染することから,本明細書記載のH.スイスの存在を判定する方法及びH.スイスへの感染を判定する方法における被験者は,ヒト,サル,ブタ,ネコ,イヌ,ウサギ,及びヒツジ等の哺乳動物とすることができ,好ましくは,ヒトであり,より好ましくは,ヒトの胃炎,慢性胃炎,鳥肌胃炎,胃MALTリンパ腫,びまん性大細胞型B細胞性リンパ腫,胃癌,胃・十二指腸潰瘍,特発性血小板減少紫斑病,機能性ディスペプシア患者である。また,本発明の方法は,定性的,定量的または半定量的に行うことができる。
本明細書記載のH.スイス存在を判定する方法において用いるサンプルとしては,例えば,生検として被験者から採取した組織試料または被験者から採取した液体を使用することができる。サンプルは,本発明の方法の対象となるものであれば特に限定はなく,例えば,組織,血液,血漿,血清,リンパ液,尿,便,漿液,髄液,関節液,眼房水,涙液,唾液またはそれらの分画物若しくは処理物を挙げることができる。本明細書記載のH.スイス存在を判定する方法において核酸を検出対象とする場合には,サンプルとして好ましくは組織(特には胃組織(胃バイオプシーサンプル))又は便である。本明細書記載のH.スイス存在を判定する方法において抗体を検出対象とする場合には,サンプルとして好ましくは,血液,血漿,血清,リンパ液,及び尿である。
本発明のペプチド,核酸分子,及び,抗体若しくはその免疫反応性断片は,本明細書の開示を参照して当業者周知の方法により適宜調製することができる。また,本発明の組成物及びキットは,当該技術分野周知の方法により,適宜製造することができる。
更に,本発明の核酸分子,及び,抗体若しくはその免疫反応性断片は,H.スイスと特異的に結合することから,例えば,siRNA,アンチセンスDNA若しくはRNA,中和抗体若しくはその免疫反応性断片,非中和抗体などを選択することにより,H.スイス感染者の体内からH.スイスを除去するための、又はH.スイス感染を防御するための医薬組成物として使用することができる。例えば,本発明の核酸分子,及び,抗体若しくはその免疫反応性断片は,必要により精製した後,常法に従って製剤化することにより,H.スイス感染が発症又は増悪化に寄与する疾患又は障害の治療用又は予防用の医薬組成物として用いることができる。また,本発明は,H.スイス除去剤,又は,H.スイス感染が発症又は増悪化に寄与する疾患又は障害の治療薬又は予防薬を製造するための,本発明の核酸分子,及び,抗体若しくはその免疫反応性断片の使用を含む。あるいは,本発明は,本発明の核酸分子,及び,抗体若しくはその免疫反応性断片の,H.スイスの除去,又は,H.スイス感染が発症又は増悪化に寄与する疾患又は障害の治療若しくは予防のための使用を含む。更に,本発明は,本発明の抗体又はその免疫反応性断片を投与することを含む,H.スイス除去方法,又は,H.スイス感染が発症又は増悪化に寄与する疾患又は障害の治療方法若しくは予防方法に関する。本明細書において,H.スイス感染が発症又は増悪化に寄与する疾患又は障害とは,胃炎,慢性胃炎,鳥肌胃炎,胃MALTリンパ腫,びまん性大細胞型B細胞性リンパ腫,胃癌,胃・十二指腸潰瘍,特発性血小板減少紫斑病,及び機能性ディスペプシアを含む。以上において、「H.スイスの除去」とは、H.スイスに感染した感染者の体内からH.スイスを除去することを意味する。また、医薬組成物として使用する場合、好ましくは、抗体はヒト化されており、又は完全ヒト抗体である。
本発明の医薬組成物は,患者に投与することができる製剤であれば経口又は非経口のいかなる製剤を採用してもよい。非経口投与のための組成物としては,例えば,点眼,注射剤,点鼻剤,坐剤,貼布剤,軟膏等を挙げることができる。好ましくは,注射剤である。本発明の医薬組成物の剤形は,例えば,液剤又は凍結乾燥製剤を挙げることができる。本発明の医薬組成物を注射剤として使用する場合,必要に応じて,プロピレングリコール,エチレンジアミン等の溶解補助剤,リン酸塩等の緩衝材,塩化ナトリウム,グリセリン等の等張化剤,亜硫酸塩等の安定剤,フェノール等の保存剤,リドカイン等の無痛化剤等の添加物(「医薬品添加物事典」薬事日報社,「Handbook of Pharmaceutical Excipients Fifth Edition」APhA Publications社参照)を加えることができる。また,本発明の医薬組成物を注射剤として使用する場合,保存容器としては,アンプル,バイアル,プレフィルドシリンジ,ペン型注射器用カートリッジ,及び,点滴用バッグ等を挙げることができる。
例えば,本発明の医薬組成物(治療薬若しくは予防薬)は,注射剤として利用することができ,静脈注射剤,皮下注射剤,皮内注射剤,筋肉注射剤,硝子体内注射剤,点滴注射剤などの剤形を包含する。このような注射剤は,公知の方法に従って,例えば,上記抗体等を通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解,懸濁または乳化することによって調製することができる。注射用の水性液としては,例えば,生理食塩水,ブドウ糖,ショ糖,マンニトール,その他の補助薬を含む等張液等が用いることができ,適当な溶解補助剤,例えば,アルコール(例,エタノール),ポリアルコール(例,プロピレングリコール,ポリエチレングリコール),非イオン界面活性剤〔例,ポリソルベート80,ポリソルベート20,HCO-50(polyoxyethylene(50mol)adduct of hydrogenated castor oil)〕等と併用することができる。油性液としては,例えば,ゴマ油,大豆油などを用いることができ,溶解補助剤として安息香酸ベンジル,ベンジルアルコール等と併用することができる。調製された注射液は,通常,適当なアンプル,バイアル,シリンジに充填される。また,本発明の抗体又はその免疫反応性断片に適当な賦形剤を添加することにより,凍結乾燥製剤を調製し,用時,注射用水,生理食塩水などで溶解して注射液とすることもできる。なお,一般的に抗体などのタンパク質の経口投与は消化器により分解されるため困難とされるが,抗体断片や修飾した抗体断片と剤形の創意工夫により,経口投与の可能性もある。経口投与の製剤としては,例えば,カプセル剤,錠剤,シロップ剤,顆粒剤等を挙げることができる。
本発明の医薬組成物は,活性成分の投与量に適合するような投薬単位の剤形に調製されることが好適である。このような投薬単位の剤形としては,注射剤(アンプル,バイアル,プレフィルドシリンジ)が例示され,投薬単位剤形当たり通常5~500mg,5~100mg,10~250mgの本発明の抗体又はその免疫反応性断片を含有していても良い。
本発明の医薬組成物(治療薬若しくは予防薬)の投与は,局所的であってもよく,全身的であってもよい。投与方法には特に制限はなく,上述のとおり非経口的又は経口的に投与される。非経口的投与経路としては,眼内,皮下,腹腔内,血中(静脈内,若しくは動脈内)又は脊髄液への注射又は点滴等が挙げられ,好ましくは血中への投与である。本発明の医薬組成物(治療薬若しくは予防薬)は,一時的に投与してもよいし,持続的又は断続的に投与してもよい。例えば,投与は,1分間~2週間の持続投与することもできる。
本発明の医薬組成物の投与量は,所望の治療効果又は予防効果が得られる投与量であれば特に限定は無く,症状,性別,年齢等により適宜決定することができる。本発明の医薬組成物の投与量は,例えば,cAMPが発症又は増悪化に寄与する疾患又は障害の治療効果又は予防効果を指標として決定することができる。例えば,cAMPが発症又は増悪化に寄与する疾患又は障害の患者の予防および/または治療のために使用する場合には,本発明の医薬組成物の有効成分の1回量として,通常0.01~20mg/kg体重程度,好ましくは0.1~10mg/kg体重程度,さらに好ましくは0.1~5mg/kg体重程度を,1月1~10回程度,好ましくは1月1~5回程度,静脈注射により投与するのが好都合である。他の非経口投与および経口投与の場合もこれに準ずる量を投与することができる。症状が特に重い場合には,その症状に応じて増量または投与回数を増加させてもよい。
以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが,本発明はこれに限定されるものではない。なお,本願全体を通して引用される全文献は参照によりそのまま本願に組み込まれる。
(実施例1)PCRによる検出
(1)DNAの調製
(1)-1.H.ピロリ
H.ピロリとして,11株(SS1,TN2GF4,RC-1,ATCC43579,NCTC11637,TK1029,TK1081,TY1289,TY281)を用いた。ニッスイプレート・ヘリコバクター寒天培地(日水製薬,東京)に-80℃で保存していた菌液を塗布し,微好気条件下(5%O2,10%CO2,85%N2,湿度100%),37℃で3日間培養した。生じたコロニーを滅菌蒸留水に懸濁し,95℃5分間処理後の遠心上清を粗精製染色体DNAとした。粗精製染色体DNAは, 等量のフェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール(25:24:1)で抽出後,エタノール沈殿で精製し,少量の滅菌蒸留水に溶解させた。最終産物のDNA濃度は,260nmの吸光度(Absorbance)(A260)を測定し,以下の式により決定した。
DNA濃度(μg/mL)=A260×50(光路長10mm)
(1)DNAの調製
(1)-1.H.ピロリ
H.ピロリとして,11株(SS1,TN2GF4,RC-1,ATCC43579,NCTC11637,TK1029,TK1081,TY1289,TY281)を用いた。ニッスイプレート・ヘリコバクター寒天培地(日水製薬,東京)に-80℃で保存していた菌液を塗布し,微好気条件下(5%O2,10%CO2,85%N2,湿度100%),37℃で3日間培養した。生じたコロニーを滅菌蒸留水に懸濁し,95℃5分間処理後の遠心上清を粗精製染色体DNAとした。粗精製染色体DNAは, 等量のフェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール(25:24:1)で抽出後,エタノール沈殿で精製し,少量の滅菌蒸留水に溶解させた。最終産物のDNA濃度は,260nmの吸光度(Absorbance)(A260)を測定し,以下の式により決定した。
DNA濃度(μg/mL)=A260×50(光路長10mm)
(1)-2. H.スイス
H.スイスとして,2株(TKY, SNTW101)を用いた。H.スイスを感染させた雌のC57BL/6マウス(チャールズリバージャパン,横浜)を解剖し,胃の大湾部を切開した。内容物をPBSで洗浄し,スライドガラスを用いて,粘膜をかき取った。粘膜は2枚のスライドガラスのすりガラス部分でこすり合わせて懸濁液を調製した。DNeasy Blood & Tissue kit(Qiagen,Hilden,Germany)を用いて,菌を含むマウス胃粘膜のDNAを調製した。最終産物のDNA濃度は,260nmの吸光度(A260)を測定し,以下の式により決定した。
DNA濃度(μg/mL)=A260×50(光路長10mm)
H.スイスとして,2株(TKY, SNTW101)を用いた。H.スイスを感染させた雌のC57BL/6マウス(チャールズリバージャパン,横浜)を解剖し,胃の大湾部を切開した。内容物をPBSで洗浄し,スライドガラスを用いて,粘膜をかき取った。粘膜は2枚のスライドガラスのすりガラス部分でこすり合わせて懸濁液を調製した。DNeasy Blood & Tissue kit(Qiagen,Hilden,Germany)を用いて,菌を含むマウス胃粘膜のDNAを調製した。最終産物のDNA濃度は,260nmの吸光度(A260)を測定し,以下の式により決定した。
DNA濃度(μg/mL)=A260×50(光路長10mm)
(1)-3.H.フェリス(H.felis),H.ムステーレ(H.mustelae),H.ハイルマニイs.s.(H.heilmannii sensu stricto),H.バクリフォルミス(H.baculiformis),H.ビゼゾロニー(H.bizzozeronii),H.シノガストリクス(H.cynogastricus),H.サルモニス(H.salmonis)
-80℃で保存していた菌液を滅菌蒸留水に懸濁し,95℃5分間処理後の遠心上清を粗精製染色体DNAとした。粗精製染色体DNAは,等量のフェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール(25:24:1)で抽出後,エタノール沈殿で精製し,少量の滅菌蒸留水に溶解させた。
-80℃で保存していた菌液を滅菌蒸留水に懸濁し,95℃5分間処理後の遠心上清を粗精製染色体DNAとした。粗精製染色体DNAは,等量のフェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール(25:24:1)で抽出後,エタノール沈殿で精製し,少量の滅菌蒸留水に溶解させた。
(2)PCR
(2)-1.PCR
Dream Taq DNA Polymerase(Thermo Fisher Sci.)を用いて,以下の組成の反応液(合計25μL)についてPCR反応をデュプリケートで行った:10×緩衝液 2.5μL,10mM dNTP mix 0.5μL,フォワード(FW)プライマー(5μM)1μL,リバース(RV)プライマー1μL,鋳型DNA 1μL(H.ピロリ(SS1株,TN2GF4株,RC-1株,ATCC43579株,NCTC11637株,TK1029株,TK1081株,TY1289株,及びTY281株)DNA各々1ng,及び10ng,H.スイス(SNTW101株及びTKY株)感染マウスの胃生検から調製したDNA各々10-3ng,10-2ng,10-1ng,1ng,10ng,及び100ng),DNA polymerase 0.25μL,及び滅菌蒸留水16.75μL。PCRの反応条件は,95℃1分でホールドした後,1サイクル95℃30秒,55℃30秒,及び72℃1分を35サイクル行い,その後72℃で5分維持した。
(2)-1.PCR
Dream Taq DNA Polymerase(Thermo Fisher Sci.)を用いて,以下の組成の反応液(合計25μL)についてPCR反応をデュプリケートで行った:10×緩衝液 2.5μL,10mM dNTP mix 0.5μL,フォワード(FW)プライマー(5μM)1μL,リバース(RV)プライマー1μL,鋳型DNA 1μL(H.ピロリ(SS1株,TN2GF4株,RC-1株,ATCC43579株,NCTC11637株,TK1029株,TK1081株,TY1289株,及びTY281株)DNA各々1ng,及び10ng,H.スイス(SNTW101株及びTKY株)感染マウスの胃生検から調製したDNA各々10-3ng,10-2ng,10-1ng,1ng,10ng,及び100ng),DNA polymerase 0.25μL,及び滅菌蒸留水16.75μL。PCRの反応条件は,95℃1分でホールドした後,1サイクル95℃30秒,55℃30秒,及び72℃1分を35サイクル行い,その後72℃で5分維持した。
H.スイスのhsvA遺伝子とH.フェリス,H.ビゼゾロニー,H.ピロリに存在するVacA類似のオートトランスポータータンパク質を比較し,H.スイスの菌株間で同一性が高く,他の菌種と同一性のない領域にプライマーを設計した。設計されたプライマーは以下の通りであった。
(フォワードプライマー)
HSVANOFW-2:AGAAACGAGATTACAGGAAG(配列番号51)
HSVANOFW-3:AGGAGCAAGTTTTGTAGCAG(配列番号52)HSVANOFW-5:AAAATGCGACTGATTGGATG(配列番号53)
(リバースプライマー)
HSVANORV-1:ATCGAAATAAGCGAACCTCA(配列番号72)
HSVANORV-3:TTGAAAGCTTAGCTAAACGG(配列番号73)
HSVANORV4:TGGTATTGCTGGTTAAGAGG(配列番号74)
(フォワードプライマー)
HSVANOFW-2:AGAAACGAGATTACAGGAAG(配列番号51)
HSVANOFW-3:AGGAGCAAGTTTTGTAGCAG(配列番号52)HSVANOFW-5:AAAATGCGACTGATTGGATG(配列番号53)
(リバースプライマー)
HSVANORV-1:ATCGAAATAAGCGAACCTCA(配列番号72)
HSVANORV-3:TTGAAAGCTTAGCTAAACGG(配列番号73)
HSVANORV4:TGGTATTGCTGGTTAAGAGG(配列番号74)
また,H.ピロリのvacA遺伝子を増幅するプライマーとして,以下のプライマーを用いた(Matsui Hら,Helicobacter.(2014)19(4):260-71.)。
VAC3624F(フォワード):GAGCGAGCTATGGTTATGAC(配列番号84)
VAC4041R(リバース):CATTCCTAAATTGGAAGCGAA(配列番号85)
VAC3624F(フォワード):GAGCGAGCTATGGTTATGAC(配列番号84)
VAC4041R(リバース):CATTCCTAAATTGGAAGCGAA(配列番号85)
得られた増副産物の10μLを1.5%アガロースゲル電気泳動に流し,エチジウムブロマイドで染色により増幅したバンドを確認した。
(2)-2.リアルタイムPCR
IDT社に委託して,以下の配列を有するダブルクエンチャープローブ(PrimeTime(登録商標)qPCR Probes)を合成した。プライマーは,上述のFW5とRW3がH.スイスの菌株間で同一性が高いことから,同じ領域に新たなプライマーとして設計した。
プローブ:FAM/TGTACACAC/ZEN/CAAACAGATGAGCCGT(配列番号75)/3IABkFQ
フォワード:
GATGGGCGCTTCTGGTTTA(配列番号47)
リバース:
CTGGTAATGCATCATTAGAAGCAAA(配列番号65)
IDT社に委託して,以下の配列を有するダブルクエンチャープローブ(PrimeTime(登録商標)qPCR Probes)を合成した。プライマーは,上述のFW5とRW3がH.スイスの菌株間で同一性が高いことから,同じ領域に新たなプライマーとして設計した。
プローブ:FAM/TGTACACAC/ZEN/CAAACAGATGAGCCGT(配列番号75)/3IABkFQ
フォワード:
GATGGGCGCTTCTGGTTTA(配列番号47)
リバース:
CTGGTAATGCATCATTAGAAGCAAA(配列番号65)
PCR反応は,上記プローブ(終濃度0.25μM),上記プライマー(終濃度0.5μM),及びPCR master mix: PrimeTime Gene Expression Master Mix(Integrated DNA Technologies)を用いて,QuantStudio(Applied Biosystems)で,IDT社添付のプロトコルに従い,以下の条件で行った。
95℃ 3分,1サイクル
95℃ 15秒-60℃ 1分,40サイクル
95℃ 3分,1サイクル
95℃ 15秒-60℃ 1分,40サイクル
(3)結果
事前に対象領域をクローニングしたプラスミドを用いて検量線を作成した。その結果,102コピーから107コピーの間で良好な増幅効率,定量性を示した(結果非図示)。H.ピロリ及びH.スイス感染マウス胃生検組織DNAを用いたPCRの結果を図5に示す。設計されたHSVANOFW-2/HSVANORV-4、HSVANOFW-3/HSVANORV-4、HSVANOFW-5/HSVANORV-4のプライマーの組み合わせは,いずれもH.スイス特異的に増幅し,H.ピロリのDNAの増幅は見られなかった。一方で,H.ピロリのvacAに対して設計されたプライマーは,H.ピロリのDNAのみを増幅し,H.スイスのDNAは増幅しなかった。
事前に対象領域をクローニングしたプラスミドを用いて検量線を作成した。その結果,102コピーから107コピーの間で良好な増幅効率,定量性を示した(結果非図示)。H.ピロリ及びH.スイス感染マウス胃生検組織DNAを用いたPCRの結果を図5に示す。設計されたHSVANOFW-2/HSVANORV-4、HSVANOFW-3/HSVANORV-4、HSVANOFW-5/HSVANORV-4のプライマーの組み合わせは,いずれもH.スイス特異的に増幅し,H.ピロリのDNAの増幅は見られなかった。一方で,H.ピロリのvacAに対して設計されたプライマーは,H.ピロリのDNAのみを増幅し,H.スイスのDNAは増幅しなかった。
H.スイス感染マウス胃生検組織DNAを用いた定量PCRの結果,DNA量100ngから10-2ngまで,良好な増幅効率を示した(結果非図示)。また,H.スイス SNTW101株は10ngDNAあたり6.9×105コピーであり,H.スイス TKY株は10ngDNAあたり3.7×105コピーであり、H.スイスSH8株は10ngDNAあたり1.5×103コピーであり、H.スイスSH10株は10ngDNAあたり4.2×103コピーであった。一方,H.ピロリ DNA(SS1株,TN2GF4株,RC-1株,ATCC43579株,NCTC11637株,TK1029株,TK1081株,TY1289株,及びTY281株)では増幅は観察されなかった。同様にH.フェリス,H.ムステーレ,H.ハイルマニイs.s.ASB1.4,H.バクリフォルミス,H.ビゼゾロニー,H.シノガストリクス,H.サルモニスの染色体DNAを鋳型とした場合は増殖が認められなかった。H.ピロリ(SS1株,TN2GF4株,NCTC11637株,ATCC43579株,RC-1株,TK1029株, TK1081株,TY1289株,及びTY281株),H.felis(H.フェリス),H. mustelae(H.ムステーレ),H. heilmannii sensu stricto(H.ハイルマニイs.s.ASB1.4),H. baculiformis(H.バクリフォルミス),H. bizzozeronii(H.ビゼゾロニー),H. cynogastricus(H.シノガストリクス),H. salmonis(H.サルモニス)では増幅が認められず,H.スイス感染マウス由来胃粘膜DNAにおいてのみ増幅が認められた。
以上より,設計されたプライマーセットはいずれもH.ピロリ,H.フェリス,H.ムステーレ,H.ハイルマニイs.s.ASB1.4,H.バクリフォルミス,H.ビゼゾロニー,H.シノガストリクス,及びH.サルモニスと区別してH.スイス感染の診断ができることが明らかとなった。
(実施例2)ペプチド合成および抗体作製
PCRによるH.スイスの特異的検出に成功したことから,HsvAが発現している可能性を考慮し,HsvAを標的としたH.スイス感染の診断が可能であるかに関する検討を行った。
PCRによるH.スイスの特異的検出に成功したことから,HsvAが発現している可能性を考慮し,HsvAを標的としたH.スイス感染の診断が可能であるかに関する検討を行った。
(1)ペプチド合成
HsvAがコードしていると想定されるアミノ酸配列(配列番号2;図2)のうち,菌種の特異性及び株間での保存性から,抗原性が予測されるペプチド配列を以下の通り選択し,合成した。
No.11:EKKAVQQMENSNPD(配列番号3)
No.11(TKY):EKKAVEQMENSNPD(配列番号4)
No.11(SH8):EKDAVTSLKNSNSG(配列番号5)
No.11(SH10):EKDAVTSLENSNSG(配列番号6)
No.19:NQGTLEFLSNDVSN(配列番号7)
No.19(TKY):NQGTLEFLSNDVST(配列番号8)
No.33:LSNKLQGQLKSMGL(配列番号9)
No.33(TKY):LSNKLQDQLKSMGL(配列番号10)
No.33(SH10):FSDKLQNMLKSLNM(配列番号11)
No.16:TNGQEVSASIDYNK(配列番号12)
No.23:AKLSNFASNDALPD(配列番号13)
No.10:PTTSSGASPDSSNP(配列番号14)
No.21:GLGRDLFVHSMGDK(配列番号15)
No.15:QIGKIKLSDVLSAS(配列番号16)
No.34:YGAIDKELHFSGGK(配列番号17)
No.20:NVDNILNMPSTTSG(配列番号18)
No.22:GNLKGVYYPKSSTT(配列番号19)
No.14:ITEKIQSGKLTITI(配列番号20)
No.26:FHDFLVSLKGKKFA(配列番号21)
No.31:TTGGEVRLFRSFYV(配列番号22)
No.35:IGARFGLDYQDINI(配列番号23)
No.8:KQLPQPKRSELKPK(配列番号86)
No.31N:TNIKQYMQNNHRSQ(配列番号87)
No.81:TLTLEGTETFAQNS(配列番号88)
No.63:EAYAKNQGDIWSTI(配列番号89)
No.73:VIGSKSSITLNSAN(配列番号90)
No.61:ADIQSSQTTFANSV(配列番号91)
HsvAがコードしていると想定されるアミノ酸配列(配列番号2;図2)のうち,菌種の特異性及び株間での保存性から,抗原性が予測されるペプチド配列を以下の通り選択し,合成した。
No.11:EKKAVQQMENSNPD(配列番号3)
No.11(TKY):EKKAVEQMENSNPD(配列番号4)
No.11(SH8):EKDAVTSLKNSNSG(配列番号5)
No.11(SH10):EKDAVTSLENSNSG(配列番号6)
No.19:NQGTLEFLSNDVSN(配列番号7)
No.19(TKY):NQGTLEFLSNDVST(配列番号8)
No.33:LSNKLQGQLKSMGL(配列番号9)
No.33(TKY):LSNKLQDQLKSMGL(配列番号10)
No.33(SH10):FSDKLQNMLKSLNM(配列番号11)
No.16:TNGQEVSASIDYNK(配列番号12)
No.23:AKLSNFASNDALPD(配列番号13)
No.10:PTTSSGASPDSSNP(配列番号14)
No.21:GLGRDLFVHSMGDK(配列番号15)
No.15:QIGKIKLSDVLSAS(配列番号16)
No.34:YGAIDKELHFSGGK(配列番号17)
No.20:NVDNILNMPSTTSG(配列番号18)
No.22:GNLKGVYYPKSSTT(配列番号19)
No.14:ITEKIQSGKLTITI(配列番号20)
No.26:FHDFLVSLKGKKFA(配列番号21)
No.31:TTGGEVRLFRSFYV(配列番号22)
No.35:IGARFGLDYQDINI(配列番号23)
No.8:KQLPQPKRSELKPK(配列番号86)
No.31N:TNIKQYMQNNHRSQ(配列番号87)
No.81:TLTLEGTETFAQNS(配列番号88)
No.63:EAYAKNQGDIWSTI(配列番号89)
No.73:VIGSKSSITLNSAN(配列番号90)
No.61:ADIQSSQTTFANSV(配列番号91)
(2)抗体作製
以上の選択された配列のうち,No.10、No.11,No.16、No.19,No.33、及びNo.61それぞれ14-merのペプチドのアミノ末端にシステイン(C)を付加したペプチドを合成した。キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)をキャリアとして,ウサギ(ニュージーランドホワイト)へ免疫し,ELISA力価1:512,000以上を得た。免疫ウサギ血清をProtein Gを結合したアフィニティーカラムにて精製し,回収したIgG分画を抗ペプチドウサギ抗体(ポリクローナル抗体)として以下の実験において用いた。。
以上の選択された配列のうち,No.10、No.11,No.16、No.19,No.33、及びNo.61それぞれ14-merのペプチドのアミノ末端にシステイン(C)を付加したペプチドを合成した。キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)をキャリアとして,ウサギ(ニュージーランドホワイト)へ免疫し,ELISA力価1:512,000以上を得た。免疫ウサギ血清をProtein Gを結合したアフィニティーカラムにて精製し,回収したIgG分画を抗ペプチドウサギ抗体(ポリクローナル抗体)として以下の実験において用いた。。
(4)ELISA用H.ピロリ抗原の調製
H.ピロリは,10%牛胎児血清(FCS)を含むブルセラブロスで温度37℃,湿度100%,微好気条件(5%O2,10%CO2,85%N2)で48時間振とう培養を行った後で,培養液を遠心分離により菌体を集めた。菌体は滅菌した蒸留水で3回洗浄し,リポ多糖成分を除き,少量の菌体は滅菌した蒸留水で懸濁した。
H.ピロリは,10%牛胎児血清(FCS)を含むブルセラブロスで温度37℃,湿度100%,微好気条件(5%O2,10%CO2,85%N2)で48時間振とう培養を行った後で,培養液を遠心分離により菌体を集めた。菌体は滅菌した蒸留水で3回洗浄し,リポ多糖成分を除き,少量の菌体は滅菌した蒸留水で懸濁した。
(5)タンパク質の定量
96-wellプレートを使用するBio-Radプロテインアッセイキットを用いてタンパク質を定量した。検量線作成には,牛血清アルブミン(BSA)を標準タンパク質として用いた。
96-wellプレートを使用するBio-Radプロテインアッセイキットを用いてタンパク質を定量した。検量線作成には,牛血清アルブミン(BSA)を標準タンパク質として用いた。
(実施例3)ELISA(EnzymeLinked ImmunoSorbent Assay; 酵素免疫測定法)用いた感染者(ヒト)の抗H.スイス抗体価の測定
0.2M炭酸-重炭酸緩衝液(pH9.4)に溶解したペプチド又は実施例2(4)で調製したH.ピロリ全菌体(4μg/mL)100μL/wellを96-well NUNC-Immuno Plate #439454へ滴下し,4℃に一夜置いた。翌日,ペプチド溶液を廃棄し,PBS-T(0.05%(V/V)Tween20を含むリン酸緩衝食塩水,pH7.4)200μL/wellで3回洗浄した。滅菌蒸留水で5倍希釈したNacalai Tesque ブロッキング溶液(PBS系pH7.2)を200μL/well滴下し,37℃に1時間置いた。ブロッキング溶液を廃棄し,PBS-T(0.05%(V/V)Tween20を含む燐酸緩衝食塩水,pH7.4)200μL/wellで3回洗浄した。
0.2M炭酸-重炭酸緩衝液(pH9.4)に溶解したペプチド又は実施例2(4)で調製したH.ピロリ全菌体(4μg/mL)100μL/wellを96-well NUNC-Immuno Plate #439454へ滴下し,4℃に一夜置いた。翌日,ペプチド溶液を廃棄し,PBS-T(0.05%(V/V)Tween20を含むリン酸緩衝食塩水,pH7.4)200μL/wellで3回洗浄した。滅菌蒸留水で5倍希釈したNacalai Tesque ブロッキング溶液(PBS系pH7.2)を200μL/well滴下し,37℃に1時間置いた。ブロッキング溶液を廃棄し,PBS-T(0.05%(V/V)Tween20を含む燐酸緩衝食塩水,pH7.4)200μL/wellで3回洗浄した。
H.ピロリ感染者,及びH.スイス感染者からの血清をそれぞれ採取した。また,対照として,いずれにも感染していない健常人からの血清を採取した(非感染)。滅菌蒸留水で10倍希釈したNacalai Tesqueブロッキング溶液(PBS系pH 7.2)を用いて希釈したヒト血清を100μL/well滴下し,37℃に1時間置いた。血清溶液を廃棄し,PBS-T(0.05%(V/V)Tween 20を含む燐酸緩衝食塩水,pH7.4)200μL/wellで3回洗浄した。滅菌蒸留水で10倍希釈のNacalai Tesqueブロッキング溶液(PBS系pH 7.2)を用いて100,000倍希釈した西洋わさびペルオキシ標識二次抗体(Goat anti-Human IgG,Jackson Immuno Research)を100μL/well滴下し,37℃に1時間置いた。二次抗体溶液を廃棄し,PBS-T(0.05%(V/V)Tween20を含む燐酸緩衝食塩水,pH7.4)200μL/wellで3回洗浄した。SuperBlue TMB Microwell Peroxidase Substrate(1-Component),KPL社を100μL/well滴下し青く発色後に,1N塩酸を100 μL/well滴下し黄色へ変色させた。プレートリーダーを用いて450nmの吸光度を測定した。
ヒト血清を用いたELISAの結果を図6~図9に示す。H.スイス陽性の対象はHsvA抗原ペプチドに対する抗体価が高く,H.スイスに感染していないH.ピロリ感染者及び非感染者のHsvA抗原ペプチドに対する抗体価は低かった。また,H.ピロリ全菌体に対する抗体価はH.ピロリ感染者において高く,H.スイス感染者及び非感染者では低かった。このことから,H.スイスはヒト体内においてhsvA遺伝子を発現していること,及び,H.スイスに感染したヒト血液中にHsvAタンパク質に対する抗体が産生されていることが初めて示された。これにより,HsvA抗原ペプチドを用いることにより,ヒトにおいてH.ピロリ感染と区別してH.スイス感染の診断ができることが明らかとなった。
(実施例4)サンドイッチELISAを用いた感染マウスの抗H.スイス抗体価の測定
0.2M炭酸-重炭酸緩衝液(pH9.4)に溶解したペプチド抗体Nos.11,19,及び33(1μg/mL)100 μL/wellを96-well NUNC-Immuno Plate #439454へ滴下し,4℃に一夜置いた。翌日,抗体溶液を廃棄し,PBS-T(0.05%(V/V)Tween20を含むリン酸緩衝食塩水、pH7.4)200μL/wellで3回洗浄した。滅菌蒸留水で5倍希釈したNacalai Tesqueブロッキング溶液(リン酸緩衝液系pH7.2)を200μL/well滴下し,37℃に1時間置いた。ブロッキング溶液を廃棄し,PBS-T (0.05%(V/V)Tween20を含むリン酸緩衝食塩水、pH7.4)200μL/wellで3回洗浄した。滅菌蒸留水で10倍希釈のNacalai Tesque ブロッキング溶液(リン酸緩衝液系pH7.2)を用いて希釈したペプチドNos.11,19,33(4μg/mL)を100μL/well滴下し,37℃に1時間置いた。ペプチド溶液を廃棄し,PBS-T(0.05%(V/V)Tween20を含むリン酸緩衝食塩水、pH7.4)200μL/wellで3回洗浄した。交換水で10倍希釈のNacalai Tesqueブロッキング溶液(PBS系pH7.2)を用いて希釈したマウス血清を100μL/well滴下し,37℃に1時間置いた。血清溶液を廃棄し,PBS-T(0.05%(V/V)Tween20を含むリン酸緩衝食塩水、pH7.4)200μL/wellで3回洗浄した。滅菌蒸留水で10倍希釈のNacalai Tesqueブロッキング溶液(リン酸緩衝液系pH7.2)を用いて100,000倍希釈した西洋わさびペルオキシダーゼ標識二次抗体(Donkey Anti-Mouse IgG, Jackson Immuno Research)を100 μL/well滴下し,37℃に1時間置いた。二次抗体溶液を廃棄し,PBS-T (0.05%(V/V)Tween20を含むリン酸緩衝食塩水、pH7.4)200μL/wellで3回洗浄した。SuperBlue TMB Microwell Peroxidase Substrate(1-Component),KPL社を100μL/well滴下し青く発色後に,1N塩酸を100 μL/well滴下し黄色へ変色させた。プレートリーダーを用いて450 nmの吸光度を測定した。
0.2M炭酸-重炭酸緩衝液(pH9.4)に溶解したペプチド抗体Nos.11,19,及び33(1μg/mL)100 μL/wellを96-well NUNC-Immuno Plate #439454へ滴下し,4℃に一夜置いた。翌日,抗体溶液を廃棄し,PBS-T(0.05%(V/V)Tween20を含むリン酸緩衝食塩水、pH7.4)200μL/wellで3回洗浄した。滅菌蒸留水で5倍希釈したNacalai Tesqueブロッキング溶液(リン酸緩衝液系pH7.2)を200μL/well滴下し,37℃に1時間置いた。ブロッキング溶液を廃棄し,PBS-T (0.05%(V/V)Tween20を含むリン酸緩衝食塩水、pH7.4)200μL/wellで3回洗浄した。滅菌蒸留水で10倍希釈のNacalai Tesque ブロッキング溶液(リン酸緩衝液系pH7.2)を用いて希釈したペプチドNos.11,19,33(4μg/mL)を100μL/well滴下し,37℃に1時間置いた。ペプチド溶液を廃棄し,PBS-T(0.05%(V/V)Tween20を含むリン酸緩衝食塩水、pH7.4)200μL/wellで3回洗浄した。交換水で10倍希釈のNacalai Tesqueブロッキング溶液(PBS系pH7.2)を用いて希釈したマウス血清を100μL/well滴下し,37℃に1時間置いた。血清溶液を廃棄し,PBS-T(0.05%(V/V)Tween20を含むリン酸緩衝食塩水、pH7.4)200μL/wellで3回洗浄した。滅菌蒸留水で10倍希釈のNacalai Tesqueブロッキング溶液(リン酸緩衝液系pH7.2)を用いて100,000倍希釈した西洋わさびペルオキシダーゼ標識二次抗体(Donkey Anti-Mouse IgG, Jackson Immuno Research)を100 μL/well滴下し,37℃に1時間置いた。二次抗体溶液を廃棄し,PBS-T (0.05%(V/V)Tween20を含むリン酸緩衝食塩水、pH7.4)200μL/wellで3回洗浄した。SuperBlue TMB Microwell Peroxidase Substrate(1-Component),KPL社を100μL/well滴下し青く発色後に,1N塩酸を100 μL/well滴下し黄色へ変色させた。プレートリーダーを用いて450 nmの吸光度を測定した。
H.スイス TKY株又はH.ピロリ SS1株を感染させたマウスの血清中の抗体のペプチドに対する結合価をEELISAで測定した結果を図10に,サンドイッチELISAで測定した結果を図11に示す。いずれの系においても,H.スイス感染マウス血清においてHsvAタンパク質由来ペプチドに対して特異的に高い抗体価が認められた。このことから,H.スイスはマウス体内においてHsvAタンパク質を発現していること,及び,H.スイスに感染したマウス血液中にHsvAタンパク質に対する抗体が産生されていることが初めて示された。これにより,HsvA特異的抗原ペプチドを用いることにより,マウスにおいてもH.ピロリ感染と区別してH.スイス感染の診断ができることが明らかとなった。
(実施例5)ELISA(EnzymeLinked ImmunoSorbent Assay; 酵素免疫測定法)用いたペプチド抗体の特異性の測定
0.2M炭酸-重炭酸緩衝液(pH9.4)に溶解したNos.11,19及び33の各種ペプチド(4μg/mL)あるいは,H.ピロリ全菌体100μL/wellを96-well NUNC-Immuno Plate #439454へ滴下し,4℃に一夜置いた。翌日,ペプチド溶液を廃棄し,PBS-T(0.05%(V/V)Tween20を含むリン酸緩衝食塩水、pH7.4)200μL/wellで3回洗浄した。滅菌蒸留水で5倍希釈のNacalai Tesque ブロッキング溶液(リン酸緩衝液系系pH 7.2)を200μL/well滴下し,37℃に1時間置いた。ブロッキング溶液を廃棄し,PBS-T(0.05%(V/V)Tween 20を含む燐酸緩衝食塩水、pH7.4)200μL/wellで3回洗浄した。交換水で10倍希釈のNacalai Tesque ブロッキング溶液(リン酸緩衝液系pH7.2)を用いて希釈した実施例2(2)で得られた各抗ペプチド抗体(1μg/mL)100 μL/well滴下し,37℃に1時間置いた。血清溶液を廃棄し,PBS-T (0.05%(V/V)Tween20を含む燐酸緩衝食塩水、pH7.4)200μL/wellで3回洗浄した。交換水で10倍希釈のNacalai Tesque ブロッキング溶液(PBS系pH7.2)を用いて100,000倍希釈した西洋わさびペルオキシダーゼ標識二次抗体(Goat anti-Rabbit IgG,Jackson Immuno Research)を100μL/well滴下し,37℃に1時間置いた。二次抗体溶液を廃棄し,PBS-T(0.05%(V/V)Tween20を含むリン酸緩衝食塩水、pH7.4)200μL/wellで3回洗浄した。SuperBlue TMB Microwell Peroxidase Substrate(1-Component),KPL社を100μL/well滴下し青く発色後に,1N塩酸を100 μL/well滴下し黄色へ変色させた。プレートリーダーを用いて450nmの吸光度を測定した。
0.2M炭酸-重炭酸緩衝液(pH9.4)に溶解したNos.11,19及び33の各種ペプチド(4μg/mL)あるいは,H.ピロリ全菌体100μL/wellを96-well NUNC-Immuno Plate #439454へ滴下し,4℃に一夜置いた。翌日,ペプチド溶液を廃棄し,PBS-T(0.05%(V/V)Tween20を含むリン酸緩衝食塩水、pH7.4)200μL/wellで3回洗浄した。滅菌蒸留水で5倍希釈のNacalai Tesque ブロッキング溶液(リン酸緩衝液系系pH 7.2)を200μL/well滴下し,37℃に1時間置いた。ブロッキング溶液を廃棄し,PBS-T(0.05%(V/V)Tween 20を含む燐酸緩衝食塩水、pH7.4)200μL/wellで3回洗浄した。交換水で10倍希釈のNacalai Tesque ブロッキング溶液(リン酸緩衝液系pH7.2)を用いて希釈した実施例2(2)で得られた各抗ペプチド抗体(1μg/mL)100 μL/well滴下し,37℃に1時間置いた。血清溶液を廃棄し,PBS-T (0.05%(V/V)Tween20を含む燐酸緩衝食塩水、pH7.4)200μL/wellで3回洗浄した。交換水で10倍希釈のNacalai Tesque ブロッキング溶液(PBS系pH7.2)を用いて100,000倍希釈した西洋わさびペルオキシダーゼ標識二次抗体(Goat anti-Rabbit IgG,Jackson Immuno Research)を100μL/well滴下し,37℃に1時間置いた。二次抗体溶液を廃棄し,PBS-T(0.05%(V/V)Tween20を含むリン酸緩衝食塩水、pH7.4)200μL/wellで3回洗浄した。SuperBlue TMB Microwell Peroxidase Substrate(1-Component),KPL社を100μL/well滴下し青く発色後に,1N塩酸を100 μL/well滴下し黄色へ変色させた。プレートリーダーを用いて450nmの吸光度を測定した。
各種抗原(H.スイスHsvA抗原ペプチド(Nos.11,19及び33),又はH.ピロリ全菌体(TN2GF4株及びSS1株)を結合したウェル上への実施例2で作製した抗ペプチドウサギ抗体への結合を測定した結果を図12示す。ペプチドNo.11(配列番号3),ペプチドNo.33(配列番号9),ペプチドNo.19(配列番号7)に対する抗体は,それぞれの抗体の作製において抗原として使用したペプチドに対して特異的に強い結合を示す一方,H.ピロリ全菌体に対しては弱い結合しか示さなかった。特にNo.11ペプチドに対する抗体のH.ピロリ全菌体に対する非特異的結合力の低さが示された。
(実施例6)抗No.11 ペプチド抗体を用いた免疫染色
H.スイス感染ヒト胃パラフィン切片を,キシレン3回,無水エタノール1回,90%エタノール1回,80%エタノール1回,純水1回の順に浸し(それぞれ5分間),脱パラフィン処理した。脱パラフィン処理のスライドガラスを1% (W/V)スキムミルクを含むリン酸緩衝食塩水pH7.2を滴下し,室温30分置いてブロッキング処理した。次にスライドガラスをリン酸緩衝食塩水pH7.2で室温5分間,3回洗浄した。抗No. 11ペプチド抗体をリン酸緩衝食塩水pH7.2で2μg/mLに希釈し,スライドガラスへ滴下し室温3時間反応させた。スライドガラスから抗体溶液を除き,リン酸緩衝食塩水pH7.2で室温5分間,3回洗浄した。リン酸緩衝食塩水pH7.2で400倍希釈したAlexa-Fluor 488抗ウサギIgG(Thermo Fisher)(二次抗体)をスライドガラスに滴下し,室温3時間反応させた。スライドガラスから二次抗体溶液を除き,リン酸緩衝食塩水pH7.2で室温5分間,3回洗浄した。リン酸緩衝食塩水pH7.2で400倍希釈したAlexa-Fluor 568ファロイジン(Thermo Fisher)をスライドガラスに滴下し,室温30分反応させて対比染色した(Fアクチンを染色)。スライドガラスから二次抗体溶液を除き,リン酸緩衝食塩水pH7.2で室温5分間,3回洗浄した。スライドガラスをパーマ フロー(Therma Fisher)で封入した。共焦点レーザー蛍光顕微鏡,Leica TCS-SP5にて観察した。写真Aは,200倍,Bは,Aの囲んだ部分を760倍に拡大した写真である。矢印は,H.スイス菌体を示す。
H.スイス感染ヒト胃パラフィン切片を,キシレン3回,無水エタノール1回,90%エタノール1回,80%エタノール1回,純水1回の順に浸し(それぞれ5分間),脱パラフィン処理した。脱パラフィン処理のスライドガラスを1% (W/V)スキムミルクを含むリン酸緩衝食塩水pH7.2を滴下し,室温30分置いてブロッキング処理した。次にスライドガラスをリン酸緩衝食塩水pH7.2で室温5分間,3回洗浄した。抗No. 11ペプチド抗体をリン酸緩衝食塩水pH7.2で2μg/mLに希釈し,スライドガラスへ滴下し室温3時間反応させた。スライドガラスから抗体溶液を除き,リン酸緩衝食塩水pH7.2で室温5分間,3回洗浄した。リン酸緩衝食塩水pH7.2で400倍希釈したAlexa-Fluor 488抗ウサギIgG(Thermo Fisher)(二次抗体)をスライドガラスに滴下し,室温3時間反応させた。スライドガラスから二次抗体溶液を除き,リン酸緩衝食塩水pH7.2で室温5分間,3回洗浄した。リン酸緩衝食塩水pH7.2で400倍希釈したAlexa-Fluor 568ファロイジン(Thermo Fisher)をスライドガラスに滴下し,室温30分反応させて対比染色した(Fアクチンを染色)。スライドガラスから二次抗体溶液を除き,リン酸緩衝食塩水pH7.2で室温5分間,3回洗浄した。スライドガラスをパーマ フロー(Therma Fisher)で封入した。共焦点レーザー蛍光顕微鏡,Leica TCS-SP5にて観察した。写真Aは,200倍,Bは,Aの囲んだ部分を760倍に拡大した写真である。矢印は,H.スイス菌体を示す。
結果を図13に示す。H.スイス感染患者胃組織切片中の菌体が抗No.11ペプチド抗体により染色された。抗No.11ペプチド抗体を用いた免疫組織化学により,H.スイス感染の診断ができることが明らかとなった。
(実施例7)
実施例2で作製したペプチドNos.8,31N,81,63,73,61,11+11(TKY),11(SH8),11(SH10),19+19(TKY),33+33(TKY),33(SH10),16,23,10,21,20,22,31,35ペプチドあるいはH.pylori TN2GF4及びSS1全菌体(4μg/mL)を0.1M炭酸-重炭酸緩衝液(pH9.4)に溶解し、100μL/wellを96-wellプレート(NUNC-Immuno plate #439454)へ滴下し、4℃で一晩静置した。翌日、ペプチド溶液を廃棄し、PBS-T(0.05%(V/V)Tween20を含むリン酸緩衝食塩水、pH7.4)200μLで3回洗浄した。ブロッキング溶液(BSA,1%(W/V)リン酸緩衝液系、pH7.4)を200μL/well滴下し、37℃で1時間静置した。ブロッキング溶液を廃棄し、PBS-T 200μLで3回洗浄した。
実施例2で作製したペプチドNos.8,31N,81,63,73,61,11+11(TKY),11(SH8),11(SH10),19+19(TKY),33+33(TKY),33(SH10),16,23,10,21,20,22,31,35ペプチドあるいはH.pylori TN2GF4及びSS1全菌体(4μg/mL)を0.1M炭酸-重炭酸緩衝液(pH9.4)に溶解し、100μL/wellを96-wellプレート(NUNC-Immuno plate #439454)へ滴下し、4℃で一晩静置した。翌日、ペプチド溶液を廃棄し、PBS-T(0.05%(V/V)Tween20を含むリン酸緩衝食塩水、pH7.4)200μLで3回洗浄した。ブロッキング溶液(BSA,1%(W/V)リン酸緩衝液系、pH7.4)を200μL/well滴下し、37℃で1時間静置した。ブロッキング溶液を廃棄し、PBS-T 200μLで3回洗浄した。
血清サンプルとして、H.スイス感染患者から得られた血清(n=4)、H.ピロリ感染患者から得られた血清(n=5)、及び非感染者から得られた血清(n=3)を用いた。蒸留水で10倍希釈したNacalai Tesqueブロッキング溶液(リン酸緩衝液系pH7.2)を用いて各血清を1,800倍希釈(H.ピロリ検体との反応用のみ、600倍と1800倍希釈)し、50μL/wellで上述の方法で調製したプレートに滴下し、37℃で1時間静置した。血清溶液を廃棄し、PBS-T 200μL/wellで3回洗浄した。蒸留水で10倍希釈のNacalai Tesqueブロッキング溶液(リン酸緩衝液系pH7.2)を用いて100,000倍希釈した西洋わさびペルオキシダーゼ標識二次抗体(Peroxidase-conjugated AffiniPure Goat Anti-Human IgG(H+L),Jackson ImmunoResearch)を50μL滴下し、37℃で1時間静置した。二次抗体溶液を廃棄し、PBS-Tで3回洗浄した。SuperBlue TMB Microwell Perpxidase Substrate(1-Component,KPL)を50μL/well滴下し青く発色後に、1N塩酸を50μL滴下し黄色へ変色させた。プレートリーダーを用いて450nm(リファレンス630nm)の吸光度を測定した。
結果を図14に示す。本ELISA法により、1800倍希釈ヒト血清(H.suis陽性4検体(患者5,6,7,8);H.pylori陽性5検体(患者4,5,6,7,8);非感染3検体(健常人4,5,6)について、吸光度0.5以上を陽性、以下を陰性として区別することができた。ペプチドNos.81,61,20,11+11(TKY),11(SH8),11(SH10),19+19(TKY),10,16,及び23の10本がH.スイス陽性患者血清に高い反応性が認められた(A)。一方H.ピロリ陽性患者血清(B)と非感染血清(C)は全てのペプチドと反応しなかった。また、H.ピロリ全菌体とはH.ピロリ感染血清が強い反応性を示したが、H.スイス感染血清では反応を示さなかった(D)。このことから、これらのペプチドがH.ピロリに対する抗体とは反応せず、H.スイスに対する抗体に極めて特異的であることが示された。よって、血清中の抗体を利用した特異的な感染診断に有用である。
(実施例8)Nos.61,11,33,19,10,及び16の各ペプチドに対する抗ペプチド抗体の対応抗原ペプチドに対する特異性
実施例2において作製したNos.8,31N,81,63,73,61,11+11(TKY),11(SH8),11(SH10),19+19(TKY),33+33(TKY),33(SH10),16,23,10,21,20,22,31,35ペプチドを0.1M炭酸-重炭酸緩衝液(pH9.4)に溶解し(4μg/mL )100μL/wellを、96-wellプレート(NUNC-Immuno plate #439454)へ滴下し、4℃で一晩静置した。翌日、ペプチド溶液を廃棄し、PBS-T(0.05%(V/V)Tween20を含むリン酸緩衝食塩水、pH7.4)200μLで3回洗浄した。ブロッキング溶液(BSA,1%(W/V)リン酸緩衝液系、pH7.4)を200μL/wellで滴下し、37℃で1時間静置した。ブロッキング溶液を廃棄し、PBS-T 200μLで3回洗浄した。蒸留水で10倍希釈のNacalai Tesqueブロッキング溶液(リン酸緩衝液系pH7.2)を用いて、実施例2において抗ペプチドウサギポリクローナル抗体(IgG,0.2μg/mL)を50μL/wellで滴下し、37℃で1時間静置した(n=2)。血清溶液を廃棄し、PBS-T 200μL/wellで3回洗浄した。蒸留水で10倍希釈のNacalai Tesqueブロッキング溶液(リン酸緩衝液系(pH7.2)を用いて100,000倍希釈した西洋わさびペルオキシダーゼ標識二次抗体(Peroxidase-conjugated AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L),Jackson ImmunoResearch)を50μL滴下し、37℃で1時間静置した。二次抗体溶液を廃棄し、PBS-Tで3回洗浄した。SuperBlue TMB Microwell Perpxidase Substrate(1-Component,KPL)を50μL/well滴下し、青く発色後に、1N塩酸を50μL滴下して黄色へと変色させた。プレートリーダーを用いて450nm(リファレンス630nm)の吸光度を測定した。
結果を図15に示す。各ペプチド抗体は、抗原として用いた対応するペプチドとのみ特異的に反応することが示された。
実施例2において作製したNos.8,31N,81,63,73,61,11+11(TKY),11(SH8),11(SH10),19+19(TKY),33+33(TKY),33(SH10),16,23,10,21,20,22,31,35ペプチドを0.1M炭酸-重炭酸緩衝液(pH9.4)に溶解し(4μg/mL )100μL/wellを、96-wellプレート(NUNC-Immuno plate #439454)へ滴下し、4℃で一晩静置した。翌日、ペプチド溶液を廃棄し、PBS-T(0.05%(V/V)Tween20を含むリン酸緩衝食塩水、pH7.4)200μLで3回洗浄した。ブロッキング溶液(BSA,1%(W/V)リン酸緩衝液系、pH7.4)を200μL/wellで滴下し、37℃で1時間静置した。ブロッキング溶液を廃棄し、PBS-T 200μLで3回洗浄した。蒸留水で10倍希釈のNacalai Tesqueブロッキング溶液(リン酸緩衝液系pH7.2)を用いて、実施例2において抗ペプチドウサギポリクローナル抗体(IgG,0.2μg/mL)を50μL/wellで滴下し、37℃で1時間静置した(n=2)。血清溶液を廃棄し、PBS-T 200μL/wellで3回洗浄した。蒸留水で10倍希釈のNacalai Tesqueブロッキング溶液(リン酸緩衝液系(pH7.2)を用いて100,000倍希釈した西洋わさびペルオキシダーゼ標識二次抗体(Peroxidase-conjugated AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L),Jackson ImmunoResearch)を50μL滴下し、37℃で1時間静置した。二次抗体溶液を廃棄し、PBS-Tで3回洗浄した。SuperBlue TMB Microwell Perpxidase Substrate(1-Component,KPL)を50μL/well滴下し、青く発色後に、1N塩酸を50μL滴下して黄色へと変色させた。プレートリーダーを用いて450nm(リファレンス630nm)の吸光度を測定した。
結果を図15に示す。各ペプチド抗体は、抗原として用いた対応するペプチドとのみ特異的に反応することが示された。
(実施例9)Nos.61,11,33,19,10,及び16の各ペプチドに対する抗ペプチド抗体の菌体に対する特異性
0.1M炭酸/重炭酸緩衝液(pH9.4)に溶解したH.ピロリSS1,H.ピロリTN2GF4,H.ピロリNCTC11637,H.ピロリTY1289,H.ピロリRC-1,H.ピロリTK1029,H.ピロリTY281,H.ピロリATCC43579,H.ピロリTK1081,H.スイスSNTW101(4μg/mL)100μL/wellを96-wellプレート(NUNC-Immuno plate #439454)へ滴下し、4℃で一晩静置した。翌日、ペプチド溶液を廃棄し、PBS-T(0.05%(V/V)Tween20を含むリン酸緩衝食塩水、pH7.4)200μLで3回洗浄した。ブロッキング溶液(BSA,1%(W/V)リン酸緩衝液系、pH7.4)を200μL/well滴下し、37℃で1時間静置した。ブロッキング溶液を廃棄し、PBS-T 200μLで3回洗浄した。蒸留水で10倍希釈のNacalai Tesqueブロッキング溶液(リン酸緩衝液系pH7.2)を用いて、実施例2において調製した抗ペプチドウサギポリクローナル抗体(IgG,0.2μg/mL)又はH.ピロリSS1に対するポリクローナル抗体(ウサギIgG)(非特許文献4に記載)を50μL/well滴下し、37℃で1時間静置した(n=2~4)。血清溶液を廃棄し、PBS-T 200μL/wellで3回洗浄した。蒸留水で10倍希釈のNacalai Tesqueブロッキング溶液(リン酸緩衝液系pH7.2)を用いて100,000倍希釈した西洋わさびペルオキシダーゼ標識二次抗体(Peroxidase-conjugated AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L),Jackson ImmunoResearch)を50μL滴下し、37℃で1時間静置した。二次抗体溶液を廃棄し、PBS-Tで3回洗浄した。SuperBlue TMB Microwell Perpxidase Substrate(1-Component,KPL)を50μL/well滴下し、青く発色後に、1N塩酸を50μL滴下して黄色へ変色させた。プレートリーダーを用いて450nm(リファレンス630nm)の吸光度を測定した。
0.1M炭酸/重炭酸緩衝液(pH9.4)に溶解したH.ピロリSS1,H.ピロリTN2GF4,H.ピロリNCTC11637,H.ピロリTY1289,H.ピロリRC-1,H.ピロリTK1029,H.ピロリTY281,H.ピロリATCC43579,H.ピロリTK1081,H.スイスSNTW101(4μg/mL)100μL/wellを96-wellプレート(NUNC-Immuno plate #439454)へ滴下し、4℃で一晩静置した。翌日、ペプチド溶液を廃棄し、PBS-T(0.05%(V/V)Tween20を含むリン酸緩衝食塩水、pH7.4)200μLで3回洗浄した。ブロッキング溶液(BSA,1%(W/V)リン酸緩衝液系、pH7.4)を200μL/well滴下し、37℃で1時間静置した。ブロッキング溶液を廃棄し、PBS-T 200μLで3回洗浄した。蒸留水で10倍希釈のNacalai Tesqueブロッキング溶液(リン酸緩衝液系pH7.2)を用いて、実施例2において調製した抗ペプチドウサギポリクローナル抗体(IgG,0.2μg/mL)又はH.ピロリSS1に対するポリクローナル抗体(ウサギIgG)(非特許文献4に記載)を50μL/well滴下し、37℃で1時間静置した(n=2~4)。血清溶液を廃棄し、PBS-T 200μL/wellで3回洗浄した。蒸留水で10倍希釈のNacalai Tesqueブロッキング溶液(リン酸緩衝液系pH7.2)を用いて100,000倍希釈した西洋わさびペルオキシダーゼ標識二次抗体(Peroxidase-conjugated AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L),Jackson ImmunoResearch)を50μL滴下し、37℃で1時間静置した。二次抗体溶液を廃棄し、PBS-Tで3回洗浄した。SuperBlue TMB Microwell Perpxidase Substrate(1-Component,KPL)を50μL/well滴下し、青く発色後に、1N塩酸を50μL滴下して黄色へ変色させた。プレートリーダーを用いて450nm(リファレンス630nm)の吸光度を測定した。
結果を図16に示す。抗ペプチド抗体は、H.ピロリ菌体と反応しなかった。一方で、抗H.ピロリポリクローナル抗体は、H.ピロリおよびH.スイス菌体と反応した。
(実施例10)H.スイスSNTW101の培養法
(1) 感染マウスの胃粘膜中からのH.suis SNTW101の分離・培養
Smet A., et al., International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology (2012), 62, 299-306の方法を基本に培地を改良して培養を行った。Brecella agar plate(skirrow 2vials/L,vancomycin 10mg/L,trimethoprim 5mg/L,polymyxin B 2500IU/L,vitox 2vials/L,amphotericin B 5mg/L,fetal calf serum 20%(V/V))に塩酸0.05%(V/V)とlinezolid 10mg/Lを加えた。37℃、湿度100%、12%CO2,5%O2,83%N2条件下で2週間振とう培養し、1日おきにBrucella broth(skirrow 2vials/L,vitox 2vials/L,linezolid 5mg/L,fetal calf serum 20%(V/V),pH5)を150μL添加した。培養液の遠心沈殿を3回水洗したものをH.スイスSNTW101菌体とした。蛋白質の定量は、Bio-Radプロテインアッセイキットを用いた。牛血清アルブミン(BSA)を標準蛋白質として、検量線を作成した。
(1) 感染マウスの胃粘膜中からのH.suis SNTW101の分離・培養
Smet A., et al., International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology (2012), 62, 299-306の方法を基本に培地を改良して培養を行った。Brecella agar plate(skirrow 2vials/L,vancomycin 10mg/L,trimethoprim 5mg/L,polymyxin B 2500IU/L,vitox 2vials/L,amphotericin B 5mg/L,fetal calf serum 20%(V/V))に塩酸0.05%(V/V)とlinezolid 10mg/Lを加えた。37℃、湿度100%、12%CO2,5%O2,83%N2条件下で2週間振とう培養し、1日おきにBrucella broth(skirrow 2vials/L,vitox 2vials/L,linezolid 5mg/L,fetal calf serum 20%(V/V),pH5)を150μL添加した。培養液の遠心沈殿を3回水洗したものをH.スイスSNTW101菌体とした。蛋白質の定量は、Bio-Radプロテインアッセイキットを用いた。牛血清アルブミン(BSA)を標準蛋白質として、検量線を作成した。
(実施例11)抗No.16ペプチド(配列番号12)抗体を用いた免疫組織化学
H.スイスSNTW101感染C57BL/6マウスの胃を大湾に沿って切開した。内容物をPBSで洗浄し後、垂直方向に切除し、10%中性緩衝ホルマリンで固定した。胃組織をパラフィンに包埋し、切片を4μmで作製した。脱パラフィン後に水洗し、クエン酸緩衝液(pH6.0)を用いて95℃で20分間熱処理し、抗原の賦活化を行った。水洗後、0.3%の過酸化水素水と10分間室温で反応させた。PBSで2回洗浄後、anti-No.16ペプチド抗体(2μg/mL PBS)と室温で1時間反応させた。PBSで2回洗浄後に二次抗体としてヒストファインシプルステインマウスMAX-PO(R)(ニチレイ,Code.414341)と30分間室温で反応させた。PBSで2回洗浄後にDAB(3,3’-ジアミノベンジジン四塩酸塩)溶液を用いて5分間室温で発色させた。PBSで2回洗浄後にヘマトキシリンにて後染色を行い、水洗後に脱水、透徹、封入し顕微鏡観察を行った。
H.スイスSNTW101感染C57BL/6マウスの胃を大湾に沿って切開した。内容物をPBSで洗浄し後、垂直方向に切除し、10%中性緩衝ホルマリンで固定した。胃組織をパラフィンに包埋し、切片を4μmで作製した。脱パラフィン後に水洗し、クエン酸緩衝液(pH6.0)を用いて95℃で20分間熱処理し、抗原の賦活化を行った。水洗後、0.3%の過酸化水素水と10分間室温で反応させた。PBSで2回洗浄後、anti-No.16ペプチド抗体(2μg/mL PBS)と室温で1時間反応させた。PBSで2回洗浄後に二次抗体としてヒストファインシプルステインマウスMAX-PO(R)(ニチレイ,Code.414341)と30分間室温で反応させた。PBSで2回洗浄後にDAB(3,3’-ジアミノベンジジン四塩酸塩)溶液を用いて5分間室温で発色させた。PBSで2回洗浄後にヘマトキシリンにて後染色を行い、水洗後に脱水、透徹、封入し顕微鏡観察を行った。
結果を図17に示すNo.16ペプチド(配列番号12)抗体によりH.スイス菌体の免疫染色が可能であることが示された。
Claims (1)
- 明細書に記載の発明。
Applications Claiming Priority (6)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2018098504 | 2018-05-23 | ||
JP2018098504 | 2018-05-23 | ||
JP2018099903 | 2018-05-24 | ||
JP2018099903 | 2018-05-24 | ||
PCT/JP2019/020248 WO2019225639A1 (ja) | 2018-05-23 | 2019-05-22 | ヘリコバクター・スイス感染の診断法 |
JP2020521277A JP7431450B2 (ja) | 2018-05-23 | 2019-05-22 | ヘリコバクター・スイス感染の診断法 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2020521277A Division JP7431450B2 (ja) | 2018-05-23 | 2019-05-22 | ヘリコバクター・スイス感染の診断法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2024012505A true JP2024012505A (ja) | 2024-01-30 |
Family
ID=68615823
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2020521277A Active JP7431450B2 (ja) | 2018-05-23 | 2019-05-22 | ヘリコバクター・スイス感染の診断法 |
JP2023188569A Pending JP2024012505A (ja) | 2018-05-23 | 2023-11-02 | ヘリコバクター・スイス感染の診断法 |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2020521277A Active JP7431450B2 (ja) | 2018-05-23 | 2019-05-22 | ヘリコバクター・スイス感染の診断法 |
Country Status (4)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20210292375A1 (ja) |
EP (1) | EP3798309A4 (ja) |
JP (2) | JP7431450B2 (ja) |
WO (1) | WO2019225639A1 (ja) |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2023145788A1 (ja) * | 2022-01-25 | 2023-08-03 | 学校法人北里研究所 | 菌体外膜画分を用いた、ヘリコバクター・スイス抗体の検出法 |
WO2023145787A1 (ja) * | 2022-01-25 | 2023-08-03 | 学校法人北里研究所 | 菌体可溶化画分を用いた、ヘリコバクター・スイス抗体の検出法 |
WO2023145789A1 (ja) * | 2022-01-25 | 2023-08-03 | 学校法人北里研究所 | 全菌体を用いた、ヘリコバクター・スイス抗体の検出法 |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20060078919A1 (en) | 2004-09-08 | 2006-04-13 | Harry C. Gurney Janice Gurney | Diagnostic test kit and methods of diagnosis and treatment of helicobacter SPP. associated infections |
JP2011015664A (ja) | 2009-07-10 | 2011-01-27 | Kobe Univ | 難培養性細菌の培養方法 |
JP2016010331A (ja) | 2014-06-27 | 2016-01-21 | 学校法人北里研究所 | ヘリコバクター・スイス特異的配列、及び当該配列及び当該配列にコードされているタンパク質を標的とした診断方法 |
-
2019
- 2019-05-22 US US17/057,499 patent/US20210292375A1/en active Pending
- 2019-05-22 EP EP19807063.3A patent/EP3798309A4/en not_active Withdrawn
- 2019-05-22 JP JP2020521277A patent/JP7431450B2/ja active Active
- 2019-05-22 WO PCT/JP2019/020248 patent/WO2019225639A1/ja active Search and Examination
-
2023
- 2023-11-02 JP JP2023188569A patent/JP2024012505A/ja active Pending
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2019225639A1 (ja) | 2019-11-28 |
US20210292375A1 (en) | 2021-09-23 |
EP3798309A4 (en) | 2022-03-23 |
JP7431450B2 (ja) | 2024-02-15 |
JPWO2019225639A1 (ja) | 2021-08-12 |
EP3798309A1 (en) | 2021-03-31 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP2024012505A (ja) | ヘリコバクター・スイス感染の診断法 | |
WO2016092096A1 (en) | Anti-carbapenemase antibodies and uses thereof | |
Mohammadian et al. | The diagnostic tests for detection of Helicobacter pylori infection | |
US10722571B2 (en) | Rabies virus G protein epitope, and rabies virus neutralising binding molecule that binds specifically thereto | |
JP2018058852A (ja) | 多発性硬化症の診断および治療のための手段および方法 | |
CN102351947B (zh) | Ev71早期诊断方法及试剂盒 | |
US20130251749A1 (en) | Methods and compositions for chlamydial antigens as reagents/strategies for diagnosis and treatment of chlamydial infection and disease | |
JP6080850B2 (ja) | 改善されたワクチン診断法 | |
JP2023099009A (ja) | 新規な重症熱性血小板減少症候群ウイルス | |
Rafeek et al. | Characterization of an experimental model to determine streptococcal M protein–induced autoimmune cardiac and neurobehavioral abnormalities | |
Cham et al. | Determination of the cell tropism of serotype 1 feline infectious peritonitis virus using the spike affinity histochemistry in paraffin‐embedded tissues | |
EP3583424B1 (fr) | Methode de dosage immunologique d'anticorps specifiques d'antigenes de virus de la famille despoxviridae | |
US20230168247A1 (en) | Specificity enhancing reagents for covid-19 antibody testing | |
Onouchi et al. | Application of an enzyme‐labeled antigen method for visualizing plasma cells producing antibodies against Strep A, a carbohydrate antigen of Streptococcus pyogenes, in recurrent tonsillitis | |
WO2022081568A1 (en) | DETECTION OF ACE2 IgM AUTOANTIBODIES AS MARKERS OF SEVERITY AND MECHANISM IN COVID19 PATIENTS | |
CA3199237A1 (en) | Methods for identifying and treating antibody-mediated acquired primary or recurrent idiopathic nephrotic syndrome | |
JP3638731B2 (ja) | 多剤耐性ブドウ球菌抗原の抽出方法 | |
US20220196672A1 (en) | Rocky Mountain Spotted Fever Detection and Treatment | |
Green | The Development of Diagnostic Immunoassays for Melioidosis and Ebola Virus Disease | |
US20230075982A1 (en) | Antibodies and assays for detection of burkholderia mallei | |
WO2020158811A1 (ja) | ヘリコバクター・ピロリ菌株の同定方法、および同定用キット | |
Sharma et al. | Production and characterization of biologicals for disease diagnosis and pathological evaluation of elephant endotheliotropic herpesvirus (EEHV) | |
JP2016010331A (ja) | ヘリコバクター・スイス特異的配列、及び当該配列及び当該配列にコードされているタンパク質を標的とした診断方法 | |
WO2021252722A1 (en) | Sars-cov-2 polypeptides, ant-sars-cov-2 antibodies and uses thereof | |
WO2017204349A1 (en) | Methods and assays for estimating acid-fast bacteria viability, and kits therefor |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20231127 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20231127 |