JP7424055B2

JP7424055B2 - 核酸回収用カラム

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Publication number: JP7424055B2
Application number: JP2019561200A
Authority: JP
Inventors: 翔太関口; 崇光本白水; 正照伊藤
Original assignee: Toray Industries Inc
Current assignee: Toray Industries Inc
Priority date: 2018-10-31
Filing date: 2019-10-30
Publication date: 2024-01-30
Anticipated expiration: 2039-10-30
Also published as: US20210340522A1; EP3875571A4; US11795449B2; WO2020090900A1; KR20210088540A; EP3875571A1; JPWO2020090900A1

Description

本発明は、核酸回収用カラムに関する。

核酸を用いた実験技術の発展により、新規遺伝子探索や、その解析が可能となってきている。癌などの疾患を特定するためにヒトのゲノムが解析され、病原体の感染を特定するためにそれらのゲノムが解析されるなど、医療現場においても遺伝子解析を利用したスクリーニング検査や臨床検査などが行われている。

遺伝子解析を行う際には、まず核酸を含む試料から核酸を回収する工程が実施される。この際には、核酸を吸着する担体を収容したカラムが用いられる。例えば、特許文献１では、担体が収容されているカラムが開示されている。特許文献１において、担体が収容される空間は、円柱状の空間を形成しており、開口（上面又は下面）の径に対して高さが小さい、広くて薄い空間となっている。

国際公開第２０１６／０５２３８６号

ところで、上述したカラムでは、核酸を担体に吸着させた後、吸着した核酸を担体から剥がして溶出液に溶出させている。核酸を効率的に回収して、回収率を向上させるには、担体への吸着率と、溶出液への溶出性とを高くする必要がある。

また、核酸を回収した溶液を用いて、その遺伝子情報等を解析するためには、一定以上の核酸濃度が必要となるため、少量の溶出液で核酸を回収する必要がある。特に医療現場等では、核酸を含む試料の量が少ない場合であっても、効率的に核酸を回収して検査したいとのニーズがある。

本発明は、上記課題に鑑みてなされたものであり、核酸を高効率で回収することができる核酸回収用カラムを提供することを目的とするものであり、特に少量の核酸を含む試料から、少量の溶出液を用いて核酸を回収することを可能とするものである。

上記課題を解決するため、本発明にかかる核酸回収用カラムは、核酸を含む液状の試料から前記核酸を回収する核酸回収用カラムであって、前記核酸を含む液状の試料が注入される開口を形成する試料注入部と、前記核酸に吸着する担体を収容して、前記核酸が前記担体に吸着する担体吸着部と、前記担体吸着部を通過した液体を排出する排出部と、を備え、前記担体は、水溶性の中性ポリマーが表面に吸着した酸化アルミニウムからなり、前記担体吸着部において前記担体を収容する空間は、円柱状の空間を形成し、該空間の体積が、０．１３μｌ以上１３．５μｌ以下であり、前記空間の軸方向の長さをｄ₁、軸方向と直交する方向の直径をｄ₂としたとき、該空間のアスペクト比（ｄ₁／ｄ₂）は、１．０≦ｄ₁／ｄ₂＜１５．０を満たすことを特徴とする。

また、本発明にかかる核酸回収用カラムは、上記の発明において、前記排出部は、前記担体吸着部に収容される前記担体を保持する担体保持シートと、前記担体保持シートを固定するリングと、を備え、前記リングは、内径が、前記担体吸着部の前記排出部側の開口の直径よりも大きいことを特徴とする。

また、本発明にかかる核酸回収用カラムは、上記の発明において、前記担体は、粒径が１０μｍ以上６０μｍ以下であることを特徴とする。

本発明の核酸回収用カラムによれば、核酸を高効率で回収することができ、特に少量の試料から高濃度な核酸を回収することが可能となる効果を奏する。

図１は、本発明の一実施の形態にかかる核酸回収用カラムを模式的に示す平面図である。図２は、図１に示す核酸回収用カラムの断面図である。図３は、核酸を回収する方法を説明する図である。図４は、本発明の一実施の形態にかかる核酸回収用カラムを用いた核酸回収について説明する図である。

以下、本発明を実施するための形態を図面とともに詳細に説明する。なお、以下の実施の形態により本発明が限定されるものではない。また、以下の説明において参照する各図は、本発明の内容を理解でき得る程度に形状、大きさ、および位置関係を概略的に示してあるに過ぎない。すなわち、本発明は各図で例示された形状、大きさ、および位置関係のみに限定されるものではない。さらに、図面の記載において、同一の部分には同一の符号を付している。

本発明にかかる核酸回収用カラムは、核酸を含む試料から、核酸を回収するために用いられる。核酸には、例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡ／ＤＮＡ（キメラ）及び人工核酸などが挙げられる。ＤＮＡには、ｃＤＮＡ、マイクロＤＮＡ（ｍｉＤＮＡ）、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、セルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）、血中循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）、ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）などが挙げられる。また、ＲＮＡには、ｔｏｔａｌＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ若しくはｎｏｎ－ｃｏｄｉｎｇＲＮＡ、又は、それらの前駆体、および合成ＲＮＡ等が挙げられる。

核酸を含む試料には、生物学的試料も挙げられる。生物学的試料には、培養細胞、培養細胞の培養液、組織試料や標本等の細胞由来試料、細菌やウイルス等の微生物由来試料、体液や便等のヒトを含む動物由来試料、核酸のほかに、タンパク質、糖や脂質等の生物学的機能を有する化合物を含む溶液等を利用することができ、これらに限定されない。上記生物学的試料は、好ましくは、培養細胞や体液であり、さらに好ましくは、血液又は尿である。血液には、全血、血漿、血清、血球等が含まれる。

核酸を含む試料は、必要に応じて以下の処理を施してもよい。これは、核酸が生物学的試料において細胞膜、細胞壁、小胞、リポソーム、ミセル、リボソーム、ヒストン、核膜、ミトコンドリア、ウイルスのキャプシド、エンベロープ、エンドソーム又はエキソソームのような化合物に内包されていたり、これらが相互作用していたりすることが多いためである。高収率に核酸を回収するために、これらから遊離させることを目的とする処理を施してもよい。
具体的には、大腸菌が含まれている試料から核酸の回収効率を高めるために、以下の処理を施す。例えば、大腸菌が含まれる試料に対して、０．２Ｍの水酸化ナトリウムと、１％のドデシル硫酸ナトリウム（Sodium Dodecyl Sulfate：ＳＤＳ）との混合液を加えたり（アルカリ変性法）、１０％のサルコシル溶液を加えたり（サルコシルによる非変性法）することができる。また、これらの溶液にリゾチームを添加しておいてもよい。また、プロテイナーゼＫにより３７℃で１時間、処理を施すこともできる。このほか、超音波処理を施してもよい。

試料に酵母が含まれている場合、核酸の回収効率を向上させるため、以下の処理を施してもよい。例えば、生化学工業株式会社やナカライテスク株式会社から市販されている酵母細胞壁溶解酵素で処理した後に１０％のＳＤＳを加えることもできる。

また、核酸を含む試料に細胞が含まれている場合、核酸の回収効率を向上させるため、以下の処理を施してもよい。具体的には、細胞が含まれる試料に１％のＳＤＳを加える。このほか、塩化グアニジニウム、グアニジンチオシアン酸塩、及び尿素等を各終濃度が４Ｍ以上になるように加えてもよい。この溶液に対して、サルコシルを０．５％以上になるように加えてもよい。また、メルカプトエタノールを５０ｍＭ以上の濃度になるように加えてもよい。

上記の処理において、核酸の分解を抑制するために、核酸の分解酵素の阻害剤を添加してもよい。この阻害剤としては、ＥＤＴＡ（ethylenediaminetetraacetic acid）が挙げられ、例えば、１ｍＭ以下の濃度で添加する。また、ＲＮＡ分解酵素の阻害剤としては、ＲＮａｓｉｎＰｌｕｓＲｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒ（プロメガ株式会社製）、ＲｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒ（タカラバイオ株式会社製）、ＲＮａｓｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒ（東洋紡株式会社製）を用いることができる。

核酸を含む試料にＤＮＡとＲＮＡとが混在している場合には、フェノール・クロロホルム抽出によって分離することができる。例えば、フェノール・クロロホルム抽出を酸性条件下で行えば、ＲＮＡが水層、ＤＮＡがクロロホルム層に分離される。また、フェノール・クロロホルム抽出を中性条件下で行えば、ＲＮＡ及びＤＮＡは水層に分配される。このように条件を変えることによって、取得する核酸の種類を選択することができる。なお、上記のクロロホルムは、ｐ－ブロモアニソールに置換することができる。

フェノール・クロロホルム抽出は、ＩＳＯＧＥＮ（登録商標：株式会社ニッポンジーン製）、ＴＲＩｚｏｌ（登録商標：ライフテクノロジーズジャパン株式会社製）、３Ｄ－Ｇｅｎｅ（登録商標）ＲＮＡｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｒｅａｇｅｎｔｆｒｏｍｌｉｑｕｉｄｓａｍｐｌｅｋｉｔ（東レ株式会社製）を利用することができる。以上の処理は、その一工程をのみを実施してもよいし、他の操作における工程と組み合わせてもよい。また、処理に用いる溶液の濃度は、必要に応じて変えることができる。

本発明において核酸を含む試料としては、核酸、人工核酸、色素やリン酸基等の修飾が施された核酸を溶解させた溶液や、生体試料を用いる場合には、体液等の液体試料やその希釈液、細胞ペレットや組織片等の固体試料の希釈液を用いることができる。また、液体試料や固体試料を含む試料に対し、上述したいずれかの処理を施した後に得られる溶液をそのまま用いてもよいし、必要に応じて希釈してもよい。希釈する溶液は特に限定されないが、水やＴｒｉｓ－塩酸緩衝液等の核酸を含む溶液に汎用される溶液を使用することが好ましい。核酸を含む溶液に対し、例えば、それぞれの終濃度が４Ｍ以上になるよう塩化グアニジニウム、グアニジンチオシアン酸塩や尿素を加えてもよい。

本発明において、回収対象の核酸の長さは特に限定されないが、１０００塩基対以下であることが好ましい。また、本発明は、従来技術では難しいとされていた３００塩基対以下のｐｒｅ－ｍｉＲＮＡやｍｉＲＮＡも高収率で回収することができる。

（実施の形態）
本発明の実施の形態にかかる核酸回収用カラムについて、図１及び図２を参照して説明する。図１は、本発明の一実施の形態にかかる核酸回収用カラムを模式的に示す平面図である。図２は、図１に示す核酸回収用カラムの断面図である。図１及び図２示す核酸回収用カラム１は、筒状をなす本体部１０を有する。本体部１０には、生物学的試料を導入し、排出可能な孔が形成されている。この孔は、生物学的試料を導入する側から、試料注入部１１、担体吸着部１２、排出部１３の順で構成されている。

試料注入部１１は、本体部１０において、核酸を含む液状の試料を導入する開口と、担体吸着部１２に連なる孔部を形成する。この孔部は、担体吸着部１２側の端部が、連続的に縮径している。担体吸着部１２の体積に対する試料注入部１１の体積の比が、１００以上１００００以下であることが好ましい。

担体吸着部１２は、試料に含まれる核酸が吸着する複数の担体１２１を収容する。担体吸着部１２において、担体１２１が収容されている空間（以下、「吸着部」ということもある）の形状は、孔の中心軸Ｎと平行な軸を有する円柱状をなしている。この空間の体積は、例えば、０．１３μｌ以上１３．５μｌ以下（担体１２１の重量として、０．１ｍｇ以上１０ｍｇ以下）であることが好ましい。
また、円柱状の空間の、軸方向の長さ（第１の長さ）をｄ₁、軸方向と直交する方向の直径（第２の長さ）をｄ₂としたとき（図２参照）、この空間のアスペクト比（ｄ₁／ｄ₂）は、下式（１）の関係を満たすことが好ましい。なお、長さｄ₁（第１の長さ）と、直径ｄ₂（第２の長さ）とは互いに垂直な方向に延びる。
１．０≦ｄ₁／ｄ₂＜１５．０・・・（１）
ここで、ｄ₁／ｄ₂の下限値である０．１は、核酸の回収率が、計算上で５０％となる値に基づいて決定される値である。また、ｄ₁／ｄ₂の上限値である１５．０は、核酸回収用カラム１において、生物学的試料や洗浄液、溶出液が担体吸着部１２（担体１２１間）を通過して排出可能な値に基づいて決定される値である。より好ましいアスペクト比は、１．０≦ｄ₁／ｄ₂≦１４．０である。
また、長さｄ₁は、１ｍｍ以上１０ｍｍ以下の範囲で設定される。直径ｄ₂は、０．４ｍｍ以上２ｍｍ以下の範囲で設定される。
なお、空間の形状は、円柱状に限らず、例えば角柱状をなしていてもよい。空間が角柱状をなす場合、上述した直径ｄ₂に相当する長さは、この空間に外接する円の直径とする。

担体１２１は、水溶性の中性ポリマーが表面に吸着した酸化アルミニウムからなる。担体１２１は、粒子の直径（粒径又は粒子径）が１０μｍ以上６０μｍ以下である。

中性ポリマーは、水に対して溶解可能な性質を有し、その溶解度が、少なくとも０．０００１質量％以上であり、好ましくは０．００１質量％以上、より好ましくは０．０１質量％以上、さらに好ましくは０．１質量％以上のポリマーである。
ここで、本発明におけるポリマーとは、基本単位である単量体やモノマーと呼ばれる繰り返し単位が多数繋がった化合物の総称である。担体１２１に用いられるポリマーは、１種類の単量体からなるホモポリマーと、２種類以上の単量体からなるコポリマーのいずれも含まれる。さらに、このポリマーには、天然ポリマー及び合成ポリマーのいずれも含まれる。

中性ポリマーは、ｐＨ７の溶液中においてゼータ電位が－１０ｍＶ以上＋１０ｍＶ以下のポリマーであることが好ましく、－８ｍＶ以上＋８ｍＶ以下のポリマーであることがより好ましく、－６ｍＶ以上＋６ｍＶ以下のポリマーであることがさらに好ましく、－４．０ｍＶ以上＋１．１Ｖ以下のポリマーであることが特に好ましい。

中性ポリマーとしては、具体的には、以下のものが挙げられる。例えば、ポリビニルアルコール若しくはポリビニルピロリドン等のポリビニル系ポリマー、ポリアクリルアミド、ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）若しくはポリ（Ｎ－（ヒドロキシメチル）アクリルアミド）等のポリアクリルアミド系ポリマー、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール若しくはポリテトラメチレンエーテルグリコール等のポリアルキレングリコール系のポリマー、ポリ（２－エチル－２－オキサゾリン）、（ヒドロキシプロピル）メチルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、又は、２－ヒドロキシエチルセルロース若しくはヒドロキシプロピルセルロース等のセルロース等を用いることができる。また、上記のポリマーが含まれる共重合体も用いることができる。

また、フィコール、アガロース、キチン、及び、デキストラン等のポリサッカライド又はポリサッカライド類縁体、並びに、アルブミン等のタンパク質やペプチドも、本発明の中性ポリマーに含まれる。

また、中性ポリマーの官能基の一部をイオン化させたり、陽性や陰性を示す官能基に置換したり、側鎖にアセチル基等の水溶性を発現する官能基を導入してもよい。

中性ポリマーの分子量は、例えば、０．４ｋＤ以上であることが好ましく、６ｋＤ以上であることがより好ましい。また、分子量の上限は、５００ｋＤ以下であることが好ましく、１５０ｋＤ以下であることがより好ましい。中性ポリマーの分子量の好ましい範囲は、０．４ｋＤ以上５００ｋＤ以下、より好ましくは６ｋＤ以上１５０ｋＤ以下である。

酸化アルミニウムは、Ａｌ₂Ｏ₃の組成式で表される両性酸化物であり、アルミナとも呼ばれる。酸化アルミニウムは、天然に産出するものを用いてもよいし、工業的に作製されたものを用いてもよい。酸化アルミニウムを作製する方法としては、例えば、ギブサイトを出発原料とするバイヤー法や、ベーマイト形態の水酸化物を経由するアルコキシド法（ゾルーゲル法とも呼ばれる）、中和法、オイルドロップレット法、アルミニウム塩熱分解法や、陽極酸化法等が挙げられる。酸化アルミニウムは、それらが持つ結晶構造によってアルファ酸化アルミニウム、ロー酸化アルミニウム、カイ酸化アルミニウム、カッパ酸化アルミニウム、イータ酸化アルミニウム、ガンマ酸化アルミニウム、デルタ酸化アルミニウム、シータ酸化アルミニウム等に分類される。本発明では、高比表面積を有するガンマ酸化アルミニウムが好ましい。酸化アルミニウムは、作製時の焼成温度に応じて、酸点（Ａｌ⁺、Ａｌ－ＯＨ₂ ⁺）と、塩基点（Ａｌ－Ｏ^-）とが変化する。酸化アルミニウムは、この酸点と塩基点との数に応じて、酸点が多ければ酸性アルミナ、塩基点が多ければ塩基性アルミナ、酸点と塩基点とが同程度であれば中性アルミナに分類される。本発明では、いずれのアルミナでも使用することができる。

酸化アルミニウムは、粒状であることが好ましい。粒径は揃っていてもよいし、異なる粒径のものが混在していてもよい。粒径は、例えば、２１２μｍ未満の酸化アルミニウムを用いることが好ましく、１００μｍ未満の酸化アルミニウムを用いることがより好ましい。粒径は、日本工業規格（ＪＩＳＺ－８８０１－１：２００６）に準拠して、ふるい目開きの寸法で定義する。例えば、上記ＪＩＳ標準による目開きにして４０μｍのふるいを通過し、３２μｍのふるいを通過できない粒子は、粒径が３２μｍ以上４０μｍ未満となる。

担体１２１は、国際公開第２０１６／１５２７６３号に開示される担体を好ましく用いることができる。
担体１２１において、酸化アルミニウム表面への中性ポリマーの被覆率は、７％以上が好ましく、１０％以上がより好ましく、２０％以上がさらに好ましく、３０％以上が特に好ましく、４０％以上が最も好ましい。

排出部１３は、担体吸着部１２を通過した生物学的試料を外部に排出する。排出部１３の担体吸着部１２側の開口の直径は、担体吸着部１２の排出部１３側の開口の直径よりも大きい。

排出部１３には、担体保持シート１３１と、リング１３２とが設けられている。担体保持シート１３１は、排出部１３と担体吸着部１２との境界に設けられ、担体吸着部１２の排出部１３側の開口を覆っている。担体保持シート１３１は、担体１２１の径よりも小さい開口を有する孔が複数形成された網目状をなしている。リング１３２は、例えば排出部１３の内周面に圧入又は固定され、担体保持シート１３１が排出部１３から離脱することを防止している。担体保持シート１３１を設けることによって、担体１２１が、排出部１３から外部に漏れ出ることが防止される。
また、担体保持シート１３１に対して撥水加工を施してもよい。この加工により、核酸を含む試料や洗浄液、溶出液がカラムから漏れることが防止され、カラムの流速を安定させることができる。
ここで、リング１３２は、内周の直径（内径）が、担体吸着部１２の排出部１３側の開口の直径よりも大きいことが好ましい。具体的に、担体吸着部１２の排出部１３側の開口の直径に対するリング１３２の内径の比率が、１以上５以下であることが好ましい。

本実施の形態において、生物学的試料から核酸を回収する方法について、図３及び図４を参照して説明する。図３は、核酸を回収する方法を説明する図である。図４は、本発明の一実施の形態にかかる核酸回収用カラムを用いた核酸回収について説明する図である。

まず、核酸２０１を含む試料２００と、担体１２１とを混合し（図３の（ａ）参照）、核酸２０１を担体１２１に吸着させる（図３の（ｂ）参照）。この際、核酸２０１を含む試料２００の量は、上式（１）等の条件を満たす核酸回収用カラム１において、１００μｌ以上２０ｍｌ以下であることが好ましい。ここで、核酸を含む試料が体液等の液体試料である場合には、採取後そのまま本発明にかかる核酸回収用カラムに導入してもよいし、採取後に溶液を加えて希釈してもよい。核酸を含む試料が微生物、細胞ペレット、組織片等を含む固体試料である場合には、水や緩衝液で希釈して用いることができる。

核酸２０１を担体１２１に吸着させた後、次の操作に移行する前に、担体１２１に吸着されなかった核酸を含む試料２００を取り除いてもよい。具体的には、核酸回収用カラム１に容器２を取り付けた状態で、遠心分離することによって、担体１２１に吸着されなかった核酸を含む試料２００が核酸回収用カラム１から容器２に移送され、核酸回収用カラム１には、核酸２０１が吸着した担体１２１が残される。

その後、核酸２０１が吸着した担体１２１を洗浄液３００で洗浄する（図３の（ｃ）参照）。洗浄液３００としては、水、ＨＥＰＥＳ（４－（２－ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）－１－ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃａｃｉｄ：ｐＨ７）緩衝液やＴｒｉｓ塩酸塩緩衝液が挙げられる。洗浄液３００で洗浄することによって、担体１２１に非特異的に吸着した化合物を除去することができる。また、担体１２１に非特異的に吸着したタンパク質、イオン、低分子化合物を除去するために、界面活性剤を添加してもよい。また、担体１２１に非特異的に吸着したタンパク質を除去するために、タンパク質分解酵素を添加してもよい。また、ＤＮＡのみを単離するために、ＲＮＡ分解酵素を添加してもよい。洗浄処理では、核酸回収用カラム１の排出部１３側に、図４に示すような容器２が取り付けられる。核酸回収用カラム１に容器２を取り付けた状態で、遠心分離することによって、洗浄液３００を核酸回収用カラム１から容器２に移送する。容器２に移送された洗浄液には、担体１２１から分離した化合物やタンパク質、ＲＮＡ等が含まれる。

その後、溶出液を加えて、担体１２１から核酸２０１を溶出させる。溶出液の導入量は、上述した担体吸着部１２において担体１２１が収容されている空間の体積の１．６倍以上８．５倍以下の量が好ましい。具体的に、上式（１）等の条件において好ましい量は、２μｌ以上３０μｌ以下となる。溶出処理においても、図４に示すような容器２を新たに取り付けて、核酸回収用カラム１に容器２を取り付けた状態で、遠心分離することによって、溶出液を核酸回収用カラム１から容器２に移送する。このとき、溶出液を加えた後、核酸回収用カラム１を静置したり、溶出液を加温したりすることにより溶出性を高めることもできる。静置する場合、２時間以内であることが好ましく、加温する場合、７０℃以下であることが好ましく、５０℃以下であることがより好ましい。容器２に移送された溶出液には、担体１２１から溶出した核酸２０１が含まれる。回収された核酸２０１は、遺伝子検査等に使用される。遠心分離の条件として、例えば、１００～８０００Ｇで１分程度、処理することが好ましい。

ここで、溶出液は、担体１２１に吸着した核酸２０１を溶出できれば特に限定されないが、緩衝液であることが好ましく、その緩衝液には、キレート剤が含まれていてもよい。具体的に、クエン酸とクエン酸ナトリウムとを含むクエン酸緩衝液や、リン酸とリン酸ナトリウムを含むリン酸緩衝液、トリスヒドロキシアミノメタンと塩酸とを含むＴｒｉｓ－ＥＤＴＡ緩衝液等が挙げられる。
緩衝液のｐＨは、ｐＨ４以上ｐＨ９以下が好ましく、ｐＨ５以上ｐＨ８以下がより好ましい。

担体１２１に吸着した核酸の吸着率は、以下のようにして求めることができる。まず、核酸を含む試料中の核酸量を算出する。
核酸量を定量する方法としては、吸光度測定、蛍光測定、発光測定、電気泳動法、ＰＣＲ、ＲＴ－ＰＣＲ、マイクロアレイを使用した解析、シーケンサーを使用した解析等が挙げられる。非修飾の核酸であれば、２６０ｎｍの波長の光による吸光度を測定することによって核酸量を定量できる。また、蛍光色素が修飾された核酸であれば、その蛍光色素に由来する蛍光強度を、濃度が既知の溶液における蛍光強度と比較することによって核酸量を定量できる。そのほか、電気泳動法では、同じゲルにおいて、濃度が既知のサンプルと核酸回収後のサンプルとを同時に泳動させ、ゲルを染色し、画像処理によってバンドの濃度を比較することによって核酸量を定量できる。

核酸回収用カラム１によって核酸を吸着させた後、吸着後の溶液中の核酸量を定量する。この核酸量は、吸着された核酸を除いた溶液中の核酸量になる。その後、吸着前の核酸量と吸着後の核酸量との差を求める。この差を、吸着前の核酸量で割ることによって、核酸の吸着率が求められる。

また、核酸の溶出率は、以下のようにして求めることができる。まず、核酸が吸着した担体１２１に対して溶出液を加え、溶出後の溶液中の核酸量を定量する。この核酸量は、核酸の溶出量に相当する。この核酸の溶出量を、担体１２１に吸着した核酸量（吸着後の核酸量）で割ることによって、核酸の溶出率が求められる。

本発明における核酸の回収率は、上述した核酸の吸着率と溶出率との積とする。なお、上述の方法で算出される回収率は、前記核酸の溶出量を、前記吸着前の核酸量で割った値と同じ値である。
本発明の方法を用いれば、上述のように、１００μｌ以上２０ｍｌ以下の少量の試料に対して、２μｌ以上３０μｌ以下の少量の溶出液を用いても、高い吸着率と溶出率を得ることが可能であり、吸着率と溶出率の積で算出される回収率も高くなる。本発明の具体的な使用方法としては、被験者から３００μｌの血液を採取し、当該血液を、核酸を含む試料として核酸を回収し、癌等の疾患を特定するゲノム解析を行うことなどが想定できる。

上述した実施の形態によれば、核酸を吸着する核酸回収用カラム１において、担体１２１を収容する空間のアスペクト比（ｄ₁／ｄ₂）が上式（１）（１．０≦ｄ₁／ｄ₂＜１５．０）の関係を満たす構成としたため、従来の構成と比して体積が抑制され、溶出液の回収性が向上するとともに、溶出液をボリュームダウンすることができる。本実施の形態にかかる核酸回収用カラム１を用いて核酸回収を行うことによって、核酸を回収するカラムとしての感度が向上して、核酸を高効率で回収することができる。

以下、実施例によって、さらに本発明の詳細を説明する。なお、本実施例により本発明が限定して解釈されるわけではない。

＜材料＞
酸化アルミニウムに吸着させるポリマー：ポリエチレングリコール（メルク株式会社製）
酸化アルミニウム：ガンマ酸化アルミニウム（Ｎ６１３Ｎ：日揮触媒化成株式会社製）
ポリリン酸ナトリウム（ＣＡＳＮｏ．６８９１５－３１―１：富士フイルム和光純薬株式会社製）
核酸：ｍｉＲＮＡとして知られる「ｌｅｔ７ａ」（２２塩基）の５’末端をＣｙ３標識して合成したＣｙ３－ＤＮＡを用いた。
ミキサー：ＣＵＴＥＭＩＸＥＲＣＭ－１０００（東京理化器械株式会社製）
遠心分離機：ＣＴ１５ＲＥ（株式会社日立製作所製）
ヒト血清：健常者からベノジェクトＩＩ真空採血管ＶＰ－ＡＳ１０９Ｋ６０（テルモ株式会社製）を用いて採取した。
＜担体の作製＞
１．５ｍｌチューブに、１０ｍｇの酸化アルミニウムを量り取った。これに、ポリマー水溶液として、水溶性の中性ポリマーであるポリエチレングリコール（ＰＥＧ、分子量：１０ｋＤ）を１０ｗｔ％の濃度で１００μｌ加えて、ミキサーで１０分間攪拌した。攪拌後、この溶液を、担体を含む溶液として、各カラムに充填して、本発明の担体が充填されたスピンカラムを作製した。この際、担体は、各実施例、各比較例でそれぞれ使用している核酸回収用カラムの担体収容空間に応じた体積になるように充填した。
＜核酸回収処理＞
核酸を含む溶液として、２５ｐｍｏｌのＣｙ３－ＤＮＡを添加したヒト血清２００μｌを用いた。６００μｌの７Ｍのグアニジンチオシアン酸塩（ＧＴＮ）、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ（4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid：ｐＨ７）溶液と、２００μｌのヒト血清とをピペッティングにより混合し、担体が充填された核酸回収用カラムに加えて遠心（２００Ｇ、１５ｍｉｎ）した。その後、コレクションチューブ（上述した容器２に相当）を交換した。
次に、洗浄液として７００μｌの０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７）を核酸回収用カラムへ加えて遠心（１０００Ｇ、２ｍｉｎ）した。その後、コレクションチューブを交換した。この操作をさらにもう１回行った。
５μｌの１２５ｍＭリン酸－１２５ｍＭポリリン酸混合液（ｐＨ７）を核酸回収用カラムへ加えて１５分間静置した。その後、遠心（１０００Ｇ、２ｍｉｎ）して、フロースルーを核酸回収溶液として回収した。
＜吸着率算出処理＞
吸着率は、Ｃｙ３の蛍光測定により以下のように算出した。
はじめに、担体が充填された核酸回収用カラムへ加える前の、２５ｐｍｏｌのＣｙ３－ＤＮＡが添加された７ＭＧＴＮ、２５ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７）溶液６００μｌと、２００μｌのヒト血清との混合液の蛍光強度を測定した。
次に、核酸回収用カラムのフロースルー溶液（核酸回収溶液）の蛍光強度を測定した。
核酸回収用カラムを通過した後の蛍光強度を、核酸回収用カラムを通過する前の蛍光強度で割り、核酸回収用カラムへ導入する前の核酸量（２５ｐｍｏｌ）の積をとってフロースルー溶液の核酸量を算出した。
核酸回収用カラム通過前の核酸量（２５ｐｍｏｌ）から、この値の差をとり、吸着した核酸量を算出した。吸着した核酸量を、担体に吸着させる前の核酸量（２５ｐｍｏｌ）で割り、吸着率を算出した。
＜溶出率算出処理＞
溶出率は、Ｃｙ３の蛍光測定により以下のように算出した。
まず、核酸が吸着した担体に対して５μｌの１２５ｍＭリン酸－１２５ｍＭポリリン酸混合液（ｐＨ７）を加え、溶出した後の溶出液に９５μｌの水を加えて蛍光測定を行った。
次に、２５ｐｍｏｌのＣｙ３－ＤＮＡが溶解した５μｌの１２５ｍＭリン酸―１２５ｍＭポリリン酸混合液（ｐＨ７）を調製して、９５μｌの水を加えて基準溶液を作製し、この基準溶液の蛍光測定を行った。
溶出液の蛍光強度を、基準溶液の蛍光強度で割り、溶出した核酸量を算出した。溶出した核酸量を、吸着した核酸量で割り、溶出率を算出した。
＜回収率算出処理＞
回収率は、算出された吸着率と溶出率の積をとって算出した。

（実施例１）
粒子径が２０μｍ以上３２μｍ以下の担体（粒子）が収容されている空間（吸着部）の直径（上述したｄ₂に相当）を１．６０ｍｍ、長さ（上述したｄ₁に相当）を６．０ｍｍとしたアスペクト比（ｄ₁／ｄ₂）が３．７５、吸着部の容積（担体を収容する空間の体積）が１２．５６μｌの核酸用回収カラムを用いて、体積が２０μｌの溶出液によって核酸を回収した。実施例１の核酸回収用カラム等の構成、並びに核酸の吸着率、溶出率及び回収率を、表１に示す。

（実施例２）
粒子径が２０μｍ以上３２μｍ以下の担体が収容されている吸着部の直径を０．８０ｍｍ、長さを１０．０ｍｍとしたアスペクト比が１２．５０、吸着部の容積が５．０２μｌの核酸用回収カラムを用いて、体積が１０μｌの溶出液によって核酸を回収した。実施例２の核酸回収用カラム等の構成、並びに核酸の吸着率、溶出率及び回収率を、表１に示す。
なお、実施例２～７の担体（粒子）は、実施例１と同様に、２０μｍ以上３２μｍ以下の粒子径を用いている。

（実施例３）
粒子径が２０μｍ以上３２μｍ以下の担体が収容されている吸着部の直径を０．８０ｍｍ、長さを３．０ｍｍとしたアスペクト比が３．７５、吸着部の容積が１．５１μｌの核酸用回収カラムを用いて、体積が５μｌの溶出液によって核酸を回収した。実施例３の核酸回収用カラム等の構成、並びに核酸の吸着率、溶出率及び回収率を、表１に示す。

（実施例４）
核酸用回収カラムの吸着部の直径を０．４０ｍｍ、長さを１．０ｍｍ（アスペクト比２．５０）、吸着部の容積を０．１３μｌとした以外は実施例３と同様にして核酸の回収を行った。実施例４の核酸回収用カラム等の構成、並びに核酸の吸着率、溶出率及び回収率を、表１に示す。

（実施例５）
核酸用回収カラムの吸着部の直径を０．６０ｍｍ、長さを１．０ｍｍ（アスペクト比１．６７）、吸着部の容積を０．２８μｌとした以外は実施例３と同様にして核酸の回収を行った。実施例５の核酸回収用カラム等の構成、並びに核酸の吸着率、溶出率、及び回収率を、表１に示す。

（実施例６）
核酸用回収カラムの吸着部の直径を０．８０ｍｍ、長さを１．０ｍｍ（アスペクト比１．２５）、吸着部の容積を０．５０μｌとした以外は実施例３と同様にして核酸の回収を行った。実施例６の核酸回収用カラム等の構成、並びに核酸の吸着率、溶出率及び回収率を、表１に示す。

（実施例７）
核酸用回収カラムの吸着部の直径を１．００ｍｍ、長さを１．０ｍｍ（アスペクト比１．００）、吸着部の容積を０．７９μｌとした以外は実施例３と同様にして核酸の回収を行った。実施例７の核酸回収用カラム等の構成、並びに核酸の吸着率、溶出率及び回収率を、表１に示す。

（実施例８）
粒子径が３２μｍ以上４５μｍ以下の担体が収容されている吸着部の直径を０．４０ｍｍ、長さを１．０ｍｍとしたアスペクト比が２．５０、吸着部の容積が０．１３μｌの核酸用回収カラムを用いて、体積が５μｌの溶出液によって核酸を回収した。実施例８の核酸回収用カラム等の構成、並びに核酸の吸着率、溶出率及び回収率を、表２に示す。

（実施例９）
粒子径が３２μｍ以上４５μｍ以下の担体が収容されている吸着部の直径を０．８０ｍｍ、長さを１０．０ｍｍとしたアスペクト比が１２．５０、吸着部の容積が５．０２μｌの核酸用回収カラムを用いて、体積が１０μｌの溶出液によって核酸を回収した。実施例９の核酸回収用カラム等の構成、並びに核酸の吸着率、溶出率及び回収率を、表２に示す。

（比較例１）
粒子径が２０μｍ以上３２μｍ以下の担体が収容されている吸着部の直径を５．８ｍｍ、長さを０．５ｍｍとしたアスペクト比が０．０９、吸着部の容積が１３．２０μｌの核酸用回収カラムを用いて、体積が２０μｌの溶出液によって核酸を回収した。比較例１の核酸回収用カラム等の構成、並びに核酸の吸着率、溶出率及び回収率を、表３に示す。

（比較例２）
粒子径が２０μｍ以上３２μｍ以下の担体が収容されている吸着部の直径を０．８ｍｍ、長さを０．５ｍｍとしたアスペクト比が０．６３、吸着部の容積が０．２５μｌの核酸用回収カラムを用いて、体積が５μｌの溶出液によって核酸を回収した。比較例２の核酸回収用カラム等の構成、並びに核酸の吸着率、溶出率及び回収率を、表３に示す。
なお、比較例２～５の担体（粒子）は、比較例１と同様に、２０μｍ以上３２μｍ以下の粒子径を用いている。

（比較例３）
粒子径が２０μｍ以上３２μｍ以下の担体が収容されている吸着部の直径を０．６ｍｍ、長さを０．５ｍｍとしたアスペクト比が０．８３、吸着部の容積が０．０６μｌの核酸用回収カラムを用いて、体積が５μｌの溶出液によって核酸を回収した。比較例３の核酸回収用カラム等の構成、並びに核酸の吸着率、溶出率及び回収率を、表３に示す。

（比較例４）
粒子径が２０μｍ以上３２μｍ以下の担体が収容されている吸着部の直径を２．０ｍｍ、長さを８．０ｍｍとしたアスペクト比が４．００、吸着部の容積が２５．１μｌの核酸用回収カラムを用いて、体積が２０μｌの溶出液によって核酸を回収した。比較例４の核酸回収用カラム等の構成、並びに核酸の吸着率、溶出率及び回収率を、表３に示す。

（比較例５）
粒子径が２０μｍ以上３２μｍ以下の担体が収容されている吸着部の直径を７．５ｍｍ、長さを１．５ｍｍとしたアスペクト比が０．２０、吸着部の容積が６８．０μｌの核酸用回収カラムを用いて、体積が２０μｌの溶出液によって核酸を回収した。比較例５の核酸回収用カラム等の構成、並びに核酸の吸着率、溶出率及び回収率を、表３に示す。

実施例１～９の核酸回収用カラムを用いた場合、回収率はすべてにおいて５０％以上となっている。これに対し、比較例１～５は、いずれも回収率が４５％を下回っており、実施例１～９に対して回収率が低いことが分かる。この結果から、アスペクト比（ｄ₁／ｄ₂）が０．１≦ｄ₁／ｄ₂＜１５．０から外れたり、容積が０．１３μｌ以上１３．５μｌ以下から外れたりすると、核酸の吸着率又は溶出率が低くなり、回収率も低くなると考えられる。

次に、排出部１３の開口の大きさを変えた核酸回収用カラムを用いて核酸を回収した。排出部１３の開口の大きさは、上述したリング１３２の内径を変えることによって調整した。

（実施例１０）
出口開口部直径を０．５ｍｍとした以外は実施例３と同様にして核酸を回収した。実施例１０の核酸回収用カラム等の構成、並びに核酸の吸着率、溶出率及び回収率を、表４に示す。なお、実施例３の出口開口部直径は１．００ｍｍである。

（実施例１１）
粒子径が３２μｍ以上４５μｍ以下の担体が収容されている吸着部の直径を０．８０ｍｍ、長さを３．００ｍｍとしたアスペクト比が３．７５、吸着部の容積が１．５μｌ、排出部１３におけるリング１３２の内径（出口開口部直径）が１．００ｍｍの核酸用回収カラムを用いて、体積が５μｌの溶出液によって核酸を回収した。実施例１１の核酸回収用カラム等の構成、並びに核酸の吸着率、溶出率及び回収率を、表４に示す。

（実施例１２）
出口開口部直径を０．５ｍｍとした以外は実施例１２と同様にして核酸を回収した。実施例１２の核酸回収用カラム等の構成、並びに核酸の吸着率、溶出率及び回収率を、表４に示す。

実施例１０～１２では、いずれも回収率が６５％を上回っている。一方、実施例３と実施例１０とを比較すると、出口開口部直径が広い方が、回収率が高くなっている。同様に、実施例１１と実施例１２とを比較すると、出口開口部直径が広い方が、回収率が高くなっている。この結果から、出口開口部直径が大きい方が、高い回収率で核酸を回収することができるといえる。

＜送液性試験＞
排出部側に容器を取り付けた核酸回収用カラムに水又は血清を１ｍｌ添加して、２００Ｇで遠心した。同じサンプルについて遠心時間ごとの送液量を測定し、核酸回収用カラムを通過して容器に移送された、各遠心時間における水又は血清の量を測定した。なお、本送液性試験では、粒子径が２０μｍ以上３２μｍ以下の担体が収容された核酸回収用カラムを用いている。このため、以下で説明するアスペクト比は、担体を収容するための空間（担体吸着部１２に相当）の直径及び長さに基づく比率を示している。

（実施例１３）
空間（担体吸着部）の直径を０．８ｍｍ、長さを８ｍｍとしたアスペクト比が１０の核酸用回収カラムに１ｍｌの水を添加して、遠心時間（送液時間）を変えて送液量を測定した。実施例１３の核酸回収用カラムの構成、及び送液量（ｍｌ）を、表５に示す。

（実施例１４）
空間（担体吸着部）の直径を０．８ｍｍ、長さを１０ｍｍとしたアスペクト比が１２．５の核酸用回収カラムに１ｍｌの水を添加して、遠心時間（送液時間）を変えて送液量を測定した。実施例１４の核酸回収用カラムの構成、及び送液量（ｍｌ）を、表５に示す。

（実施例１５）
空間（担体吸着部）の直径を０．８ｍｍ、長さを１２ｍｍとしたアスペクト比が１５の核酸用回収カラムに１ｍｌの水を添加して、遠心時間（送液時間）を変えて送液量を測定した。実施例１５の核酸回収用カラムの構成、及び送液量（ｍｌ）を、表５に示す。

（実施例１６）
空間（担体吸着部）の直径を０．８ｍｍ、長さを８ｍｍとしたアスペクト比が１０の核酸用回収カラムに１ｍｌの血清を添加して、遠心時間（送液時間）を変えて送液量を測定した。実施例１６の核酸回収用カラムの構成、及び送液量（ｍｌ）を、表６に示す。

（実施例１７）
空間（担体吸着部）の直径を０．８ｍｍ、長さを１０ｍｍとしたアスペクト比が１２．５の核酸用回収カラムに１ｍｌの血清を添加して、遠心時間（送液時間）を変えて送液量を測定した。実施例１７の核酸回収用カラムの構成、及び送液量（ｍｌ）を、表６に示す。

（比較例６）
空間（担体吸着部）の直径を０．８ｍｍ、長さを１２ｍｍとしたアスペクト比が１５の核酸用回収カラムに１ｍｌの血清を添加して、遠心時間（送液時間）を変えて送液量を測定した。比較例６の核酸回収用カラムの構成、及び送液量（ｍｌ）を、表６に示す。

実施例１３～１７では、いずれも２００Ｇ、１０分の遠心によって核酸回収用カラムに導入した水又は血清のほぼすべてが、送液されたことがわかる。一方、比較例６では、８分の遠心で送液が停止された。この結果から、血清では、少なくともアスペクト比が１５を超えると、途中で送液が停止して、全量の移送ができない可能性があるといえる。

本発明の核酸回収用カラムは、担体を収容する空間のアスペクト比を調整することによって、核酸を高効率で回収することが可能である。従って、本発明は、核酸を高効率で回収できることから、産業上非常に有用である。

１核酸回収用カラム
１０本体部
１１試料注入部
１２担体吸着部
１３排出部
１２１担体
１３１担体保持シート
１３２リング

Claims

核酸を含む液状の試料から前記核酸を回収する核酸回収用カラムであって、
前記核酸を含む液状の試料が注入される開口を形成する試料注入部と、
前記核酸に吸着する担体を収容して、前記核酸が前記担体に吸着する担体吸着部と、
前記担体吸着部を通過した液体を排出する排出部と、
を備え、
前記担体は、水溶性の中性ポリマーが表面に吸着した酸化アルミニウムからなり、当該担体の粒径が２０μｍ以上４５μｍ以下であり、
前記担体吸着部において前記担体を収容する空間は、
円柱状の空間を形成し、該空間の体積が、０．１３μｌ以上１２．５６μｌ以下であり、
前記空間の軸方向の長さをｄ₁、軸方向と直交する方向の直径をｄ₂としたとき、該空間のアスペクト比（ｄ₁／ｄ₂）は、１．０≦ｄ₁／ｄ₂ ≦１２．５を満たす
ことを特徴とする核酸回収用カラム。
前記排出部は、
前記担体吸着部に収容される前記担体を保持する担体保持シートと、
前記担体保持シートを固定するリングと、
を備え、
前記リングは、内径が、前記担体吸着部の前記排出部側の開口の直径よりも大きい
ことを特徴とする請求項１に記載の核酸回収用カラム。