JP7411583B2 - 複雑なサンプル中のそのグラム信号に従って細菌を検出するための方法 - Google Patents
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Description
a)前記サンプルと、
-蛍光色素に結合された小麦レクチン(小麦胚芽凝集素(WGA))、
-WGAに結合されたものとは異なる波長で蛍光を発する蛍光色素に結合されたバンコマイシン、
-任意には、蛍光色素(非標識)に結合されていないバンコマイシン、
-任意には、塩化カリウム、
とを同時に、又は順次にインキュベートする工程、
b)前記サンプルを遠心分離する工程、
c)任意には、前記サンプルを洗浄する工程、及び
d)前記サンプルの蛍光を、フローサイトメトリーを用いて測定する工程、
を含む。
a)前記サンプルと、
-蛍光色素に結合された小麦レクチン(小麦胚芽凝集素(WGA))、
-WGAに結合されたものとは異なる波長で蛍光を発する蛍光色素に結合されたバンコマイシン、
-任意には、バンコマイシン、
-任意には、塩化カリウム、
とを同時に、又は順次にインキュベートする工程、
b)前記サンプルを遠心分離する工程、
c)任意には、前記サンプルを洗浄する工程、
d)前記サンプルの蛍光を、フローサイトメトリーを用いて測定する工程、
e)2つの蛍光色素の相対蛍光を分析する工程、及び
f)任意には、グラム陽性菌及びグラム陰性菌の科、属及び/又は区別し、そして同定する工程、を含む。
i.蛍光色素に結合された小麦レクチン(小麦胚芽凝集素(WGA))、
ii.WGAに結合された蛍光色素とは異なる波長で蛍光を発する蛍光色素に結合されたバンコマイシン、
iii.任意には、バンコマイシン、及び
iv.任意には、塩化カリウム、を含む。
結合された蛍光色素:
例えば、以下のウェブサイトを参照のこと:
https://biotium.com/product/wheat-germ-agglutinin-wga-cf-dye-conjugates/
i.蛍光色素に結合された小麦レクチン((小麦胚芽凝集素WGA))、
ii.WGAに結合された蛍光色素とは異なる波長で蛍光を発する蛍光色素に結合されたバンコマイシン、
iii.任意には、非標識バンコマイシン、及び
iv.任意には、塩化カリウム(KCl)。
i.蛍光色素に結合された小麦レクチン((小麦胚芽凝集素WGA))の凍結乾燥物又は溶液、
ii.WGAに結合された蛍光色素とは異なる波長で蛍光を発する蛍光色素に結合されたバンコマイシンの粉末又は溶液、
iii.任意には、粉末又は溶液の形での非標識バンコマイシン、及び
iv.任意には、粉末又は溶液の形での塩化カリウム。
i.Alexa Fluor(登録商標) 647 (CAS番号 400051-23-2)に結合された小麦レクチン(小麦胚芽凝集素(WGA))の凍結乾燥物又は溶液、
ii.その商品名BODIPY(登録商標)FLにより当業者により知られている3-BODIPY-プロパン酸(CAS番号165500-63-3)に結合されたバンコマイシンの粉末又は溶液、
iii.任意には、バンコマイシン(非標識)、
iv.任意には、塩化カリウム(KCl)。
a)細菌を含むサンプルと、
-蛍光色素に結合された小麦レクチン(小麦胚芽凝集素(WGA))、
-WGAに結合されたものとは異なる波長で蛍光を発する蛍光色素に結合されたバンコマイシン、
-任意には、バンコマイシン、
-任意には、塩化カリウム、
とを同時に、又は順次にインキュベートする工程、
b)前記サンプルを遠心分離する工程、
c)任意には、前記サンプルを洗浄する工程、及び
d)前記サンプルの蛍光を測定する工程。
a)前記サンプルと、
-蛍光色素に結合された小麦レクチン(小麦胚芽凝集素(WGA))、
-WGAに結合されたものとは異なる波長で蛍光を発する蛍光色素に結合されたバンコマイシン、
-任意には、バンコマイシン、
-任意には、塩化カリウム、
とを同時に、又は順次にインキュベートする工程、
b)前記サンプルを遠心分離する工程、
c)任意には、前記サンプルを洗浄する工程、
d)前記サンプルの蛍光を、フローサイトメトリーを用いて測定する工程、
e)2つの蛍光色素の相対蛍光を分析する工程、及び
f)任意には、グラム陽性菌及びグラム陰性菌の科、属及び/又は区別し、そして同定する工程。
-Akkermansia muciniphila
-Faecalibacterium prausnitzii
-Clostridium scindens
-Bacteroides thetaiotaomicron
-及びClostridialesに属するそれら。
試験された異なる種を、Luria Bertani (LB) 又はBrain Heart Infusion (BHI)培地において、それらの種々の菌株の要件に従って、180rpmでの攪拌を伴って、又は攪拌しないで、37±1℃又は30±1℃で一晩、培養した。異なる細菌懸濁液を、約106CFU/mlに調整した。標識剤を、BODIPY(登録商標)FLに結合されたバンコマイシン、バンコマイシン、及びAlexa Fluor(登録商標)647に結合されたWGAを、それぞれ0.5μg/ml、0.5μg/ml及び100μg/mlの濃度で組合すことにより、上流で調製した。標識剤を、試験される異なる種と接触せしめた。暗室で周囲温度で15分間のインキュベーションの後、洗浄をPBS溶液により行い、続いて3,200gで15分間、遠心分離工程を行った。次に、サンプルを、流入サイトメーター(BD)により分析した。
図1は、2つのグラム陰性菌 (Klebsiella pneumoniae ATCC 700603 及び Salmonella enterica ATCC 13311) 及び 2つのグラム陽性菌 (Enterococcus faecalis JH2.2 及び Lactococcus lactis MG1363)のサンプルが、本発明の実施形態に行って分析される、実施例1に記載される実験の結果を示す。
試験された異なる種を、Luria Bertani (LB) 又はBrain Heart Infusion (BHI)培地において、それらの種々の菌株の要件に従って、180rpmでの攪拌を伴って、又は攪拌しないで、37±1℃又は30±1℃で一晩、培養した。異なる細菌懸濁液を、PBS(PBS条件の場合)又は1M のKCl(KCl条件の場合)のいずれかにより約106CFU/mlに調整した。特定の細菌懸濁液を、1%パラホルムアルデヒド(PFA)により、周囲温度で1時間、処理し、続いて3,220gで15分間、2回、遠心分離し、PFA残留物を除去した。細菌種を、試験される条件に従ってPBS又はIMのKClのいずれかに懸濁し、そしてBODIPY(登録商標)FLに結合されたバンコマイシン、バンコマイシン、及びAlexa Fluor(登録商標)647に結合されたWGAを、それぞれ2μg/ml、2μg/ml及び20μg/mlの濃度で組合すことにより、前もって調製された標識剤を、細菌懸濁液と接触せしめた。暗室で、周囲温度での標識剤の15分間のインキュベーション、PBS溶液による洗浄、及び3,220での15分間の遠心分離の後、サンプルを、流入サイトメーター(BD)により分析した。
図2は、3つのグラム陰性菌 (Klebsiella pneumoniae ATCC 700603 、 Salmonella enterica ATCC 13311及びE. coli ATCC 35218) 及び 3つのグラム陽性菌 (Enterococcus faecalis JH2.2、 Lactococcus lactis MG1363及びBacillus subtilis ATCC 23857)のサンプルが、本発明の実施形態に行って分析される、実施例2に記載される実験の結果を示す。細菌を、1MのKClの存在下で、Alexa Fluor(登録商標)647に結合されたWGA及びBODIPY(登録商標)FLに結合されたバンコマイシンにより標識した。グラム陰性菌は標識されておらず、そしてグラム陽性菌は十分に標識されていることに注意すること。
試験された異なる種を、Luria Bertani (LB) 又はBrain Heart Infusion (BHI)培地において、それらの種々の菌株の要件に従って、180rpmでの攪拌を伴って、又は攪拌しないで、37±1℃又は30±1℃で一晩、培養した。異なる細菌懸濁液を、約106CFU/mlに調整した。標識剤を、BODIPY(登録商標)FLに結合されたバンコマイシン、バンコマイシン、及びAlexa Fluor(登録商標)647に結合されたWGAを、1MのKClを含む溶液において、それぞれ2μg/ml、2μg/ml及び20μg/mlの濃度で組合すことにより、上流で調製した。標識剤を、試験される異なる種と接触せしめた。暗室で、周囲温度での15分間のインキュベーションの後、洗浄をPBS溶液により行い、続いて15,000gで15分間、遠心分離を行った。次にサンプルを、流入サイトメーター(BD)により分析した。
Claims (21)
- 細菌を含むサンプル中のグラム陽性菌の割合及びグラム陰性菌の割合を検出するための方法であって、下記工程:
a)前記サンプルと、
-蛍光色素に結合された小麦レクチン(WGA)、
-WGAに結合されたものとは異なる波長で蛍光を発する蛍光色素に結合されたバンコマイシン、
とを同時に、又は順次にインキュベートする工程、
b)前記サンプルを遠心分離する工程、
c)前記サンプルの蛍光を、フローサイトメトリーを用いて測定する工程、
を含む方法。 - 工程a)において、前記サンプルが、
-蛍光色素に結合された小麦レクチン(WGA)、
-WGAに結合されたものとは異なる波長で蛍光を発する蛍光色素に結合されたバンコマイシン、
-蛍光色素(非標識)に結合されていないバンコマイシン及び/又は塩化カリウム、
と同時に、又は順次にインキュベートされることを特徴とする、請求項1に記載の方法。 - 前記サンプルを遠心分離する工程と、前記サンプルの蛍光をフローサイトメトリーを用いて測定する工程との間に、更に、前記サンプルを洗浄する工程を含むことを特徴とする、請求項1又は2のいずれかに記載の方法。
- WGAに結合された蛍光色素が、Alexa Fluor(登録商標)647であり、そしてバンコマイシンに結合された蛍光色素が3-BODIPY-プロパン酸であることを特徴とする、請求項1~3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記測定する工程c)が、工程b)の終了後、40分未満、好ましくは30分未満で実施されることを特徴とする、請求項1~4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記測定する工程c)が、フローサイトメトリーにより実施されることを特徴とする、請求項1~5のいずれか1項に記載の方法。
- 工程a)において、分析されるべきサンプル中の蛍光色素に結合された小麦レクチン(WGA)の濃度が、5~100μg/ml、好ましくは20μg/mlであり、そして/又は分析されるべきサンプル中の蛍光色素に結合されたバンコマイシンの濃度が、0.15~4μg/ml、好ましくは2μg/mlであることを特徴とする、請求項1~6のいずれか1項に記載の方法。
- 工程a)におけるインキュベーション時間が、10~30分、好ましくは15分であることを特徴とする、請求項1~7のいずれか1項に記載の方法。
- 前記サンプルが、ヒト又は動物微生物叢のサンプルであることを特徴とする、請求項1~8のいずれか1項に記載の方法。
- 細菌サンプル中のグラム陽性菌及びグラム陰性菌の属及び/又は種を検出するための方法であって、
a)前記サンプルと、
-蛍光色素に結合された小麦レクチン(WGA)、
-WGAに結合されたものとは異なる波長で蛍光を発する蛍光色素に結合されたバンコマイシン、
とを同時に、又は順次にインキュベートする工程、
b)前記サンプルを遠心分離する工程、
c)前記サンプルの蛍光を、フローサイトメトリーを用いて測定する工程、及び
d)2つの蛍光色素の相対蛍光を分析する工程、
を含む方法。 - 細菌サンプル中のグラム陽性菌及びグラム陰性菌の科、属及び/又は種を、検出し、区別し、そして同定するための方法であって、
a)前記サンプルと、
-蛍光色素に結合された小麦レクチン(WGA)、
-WGAに結合されたものとは異なる波長で蛍光を発する蛍光色素に結合されたバンコマイシン、
とを同時に、又は順次にインキュベートする工程、
b)前記サンプルを遠心分離する工程、
c)前記サンプルの蛍光を、フローサイトメトリーを用いて測定する工程、及び
d)2つの蛍光色素の相対蛍光を分析する工程、
を含む方法。 - 工程a)において、前記サンプルが、
-蛍光色素に結合された小麦レクチン(WGA)、
-WGAに結合されたものとは異なる波長で蛍光を発する蛍光色素に結合されたバンコマイシン、
-バンコマイシン及び/又は塩化カリウム、
と同時に、又は順次にインキュベートされることを特徴とする、請求項10又は11のいずれかに記載の方法。 - 前記サンプルを遠心分離する工程と、前記サンプルの蛍光をフローサイトメトリーを用いて測定する工程との間に、更に、前記サンプルを洗浄する工程を含むことを特徴とする、請求項10~12のいずれか1項に記載の方法。
- 2つの蛍光色素の相対蛍光を分析する工程の後に、グラム陽性菌及びグラム陰性菌の科、属及び/又は種を区別し、そして同定する工程を更に含む、請求項11~13のいずれか1項に記載の方法。
- WGAに結合された蛍光色素が、Alexa Fluor(登録商標)647であり、そしてバンコマイシンに結合された蛍光色素が3-BODIPY-プロパン酸であることを特徴とする、請求項10~14のいずれか1項に記載の方法。
- i.蛍光色素に結合された小麦レクチン(WGA)、及び
ii.WGAに結合された蛍光色素とは異なる波長で蛍光を発する蛍光色素に結合されたバンコマイシン、
を含む、フローサイトメトリーでグラム陽性菌を標識するためのキットの使用。 - 更に、バンコマイシン及び/又は塩化カリウムを含む、請求項16に記載の使用。
- 前記蛍光色素が、標識剤AlexaFluor(登録商標)、3-BODIPY-プロパン酸又はその誘導体の1つ、フルオレセイン又はその誘導体、塩又はエステルの1つ、Cy標識剤、CF標識剤、共役蛍光色素の群から選択されることを特徴とする、請求項16又は17のいずれかに記載の使用。
- WGAに結合された蛍光色素が、AlexaFluor(登録商標)標識剤、フルオレセイン又はその誘導体、塩、エステルの1つから選択されることを特徴とする、請求項18に記載の使用。
- バンコマイシンに結合された蛍光色素が、3-BODIPY-プロパン酸又はその誘導体の1つ、フルオレセイン又はその誘導体、塩又はエステルの1つ、特にFITCから選択されることを特徴とする、請求項18に記載の使用。
- WGAに結合された蛍光色素が、Alexa Fluor(登録商標)647であり、そしてバンコマイシンに結合された蛍光色素が3-BODIPY-プロパン酸であることを特徴とする、請求項18~20のいずれか1項に記載の使用。
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