JP7408008B2 - 抗アルファ－４－ベータ－７抗体 - Google Patents
抗アルファ－４－ベータ－７抗体 Download PDFInfo
- Publication number
- JP7408008B2 JP7408008B2 JP2023502654A JP2023502654A JP7408008B2 JP 7408008 B2 JP7408008 B2 JP 7408008B2 JP 2023502654 A JP2023502654 A JP 2023502654A JP 2023502654 A JP2023502654 A JP 2023502654A JP 7408008 B2 JP7408008 B2 JP 7408008B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cells
- human
- antibody
- hiv
- binding
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 31
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 25
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 354
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 211
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 206
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 72
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 66
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 60
- 238000000034 method Methods 0.000 description 57
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 55
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 54
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 48
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 46
- 101710139349 Mucosal addressin cell adhesion molecule 1 Proteins 0.000 description 41
- 102100028793 Mucosal addressin cell adhesion molecule 1 Human genes 0.000 description 41
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 40
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 40
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 37
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 34
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 34
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 34
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 34
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 description 33
- 208000037357 HIV infectious disease Diseases 0.000 description 33
- 208000033519 human immunodeficiency virus infectious disease Diseases 0.000 description 33
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 32
- 102100029193 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-A Human genes 0.000 description 30
- 101710099301 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-A Proteins 0.000 description 30
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 30
- 102100024952 Protein CBFA2T1 Human genes 0.000 description 29
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 29
- 108010021468 Fc gamma receptor IIA Proteins 0.000 description 28
- 102100029204 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor II-a Human genes 0.000 description 28
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 28
- 230000010056 antibody-dependent cellular cytotoxicity Effects 0.000 description 26
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 25
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 25
- 241000282567 Macaca fascicularis Species 0.000 description 24
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 24
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 23
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 22
- 101000914514 Homo sapiens T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Proteins 0.000 description 21
- 102100027213 T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Human genes 0.000 description 21
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 21
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 21
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 20
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 20
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 19
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 19
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 19
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 19
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 18
- 108010000134 Vascular Cell Adhesion Molecule-1 Proteins 0.000 description 17
- 102100023543 Vascular cell adhesion protein 1 Human genes 0.000 description 17
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 17
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 17
- 239000000463 material Substances 0.000 description 17
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 17
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 17
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 17
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 17
- 210000001266 CD8-positive T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 16
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 16
- 230000005888 antibody-dependent cellular phagocytosis Effects 0.000 description 16
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 16
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 16
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 16
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 16
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 15
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 15
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 15
- 108010021472 Fc gamma receptor IIB Proteins 0.000 description 14
- 102100029205 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor II-b Human genes 0.000 description 14
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 14
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 14
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 14
- OZFAFGSSMRRTDW-UHFFFAOYSA-N (2,4-dichlorophenyl) benzenesulfonate Chemical compound ClC1=CC(Cl)=CC=C1OS(=O)(=O)C1=CC=CC=C1 OZFAFGSSMRRTDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 239000012591 Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Substances 0.000 description 13
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 13
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 13
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 13
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 13
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 13
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 12
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 12
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 12
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 12
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 12
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 12
- 229960004914 vedolizumab Drugs 0.000 description 12
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 11
- 101100005713 Homo sapiens CD4 gene Proteins 0.000 description 11
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 11
- 230000006870 function Effects 0.000 description 11
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 11
- 210000000662 T-lymphocyte subset Anatomy 0.000 description 10
- 239000012911 assay medium Substances 0.000 description 10
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 10
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 10
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 10
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 10
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 10
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 10
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 9
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 9
- 108010087904 neutravidin Proteins 0.000 description 9
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 9
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 9
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 9
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 9
- 102100036301 C-C chemokine receptor type 7 Human genes 0.000 description 8
- 101000716065 Homo sapiens C-C chemokine receptor type 7 Proteins 0.000 description 8
- 101710177940 IgG receptor FcRn large subunit p51 Proteins 0.000 description 8
- 102100026120 IgG receptor FcRn large subunit p51 Human genes 0.000 description 8
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 8
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 8
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 8
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 8
- 229950004912 etrolizumab Drugs 0.000 description 8
- 108010043603 integrin alpha4beta7 Proteins 0.000 description 8
- DDVBPZROPPMBLW-ZJBINBEQSA-N latrunculin a Chemical compound C([C@H]1[C@@]2(O)C[C@H]3C[C@H](O2)CC[C@@H](/C=C\C=C/CC\C(C)=C/C(=O)O3)C)SC(=O)N1 DDVBPZROPPMBLW-ZJBINBEQSA-N 0.000 description 8
- DDVBPZROPPMBLW-UHFFFAOYSA-N latrunculin-A Natural products O1C(=O)C=C(C)CCC=CC=CC(C)CCC(O2)CC1CC2(O)C1CSC(=O)N1 DDVBPZROPPMBLW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 8
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 8
- 230000000153 supplemental effect Effects 0.000 description 8
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 7
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 7
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 7
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 7
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 7
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 7
- 108010021315 integrin beta7 Proteins 0.000 description 7
- 229960003646 lysine Drugs 0.000 description 7
- 229960005027 natalizumab Drugs 0.000 description 7
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 7
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 7
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 7
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 7
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 7
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108010041012 Integrin alpha4 Proteins 0.000 description 6
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 6
- 102100029185 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Human genes 0.000 description 6
- 101100005714 Macaca fascicularis CD4 gene Proteins 0.000 description 6
- 101000913098 Macaca fascicularis IgG receptor FcRn large subunit p51 Proteins 0.000 description 6
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 6
- 230000020385 T cell costimulation Effects 0.000 description 6
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 6
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 6
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 6
- 230000000139 costimulatory effect Effects 0.000 description 6
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 6
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 6
- 229960002743 glutamine Drugs 0.000 description 6
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 6
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 6
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 6
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 6
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 6
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 6
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 6
- 241000894007 species Species 0.000 description 6
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 6
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 6
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 6
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 6
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 5
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 5
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 5
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 5
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 5
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 5
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 210000004837 gut-associated lymphoid tissue Anatomy 0.000 description 5
- 210000003071 memory t lymphocyte Anatomy 0.000 description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 5
- 108010068617 neonatal Fc receptor Proteins 0.000 description 5
- 239000013610 patient sample Substances 0.000 description 5
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- 229960000575 trastuzumab Drugs 0.000 description 5
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 4
- 101001057504 Homo sapiens Interferon-stimulated gene 20 kDa protein Proteins 0.000 description 4
- 101001055144 Homo sapiens Interleukin-2 receptor subunit alpha Proteins 0.000 description 4
- 101000917858 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-A Proteins 0.000 description 4
- 102100027268 Interferon-stimulated gene 20 kDa protein Human genes 0.000 description 4
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 4
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 4
- SHGAZHPCJJPHSC-YCNIQYBTSA-N all-trans-retinoic acid Chemical compound OC(=O)\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C SHGAZHPCJJPHSC-YCNIQYBTSA-N 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 4
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 4
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 4
- 238000003352 cell adhesion assay Methods 0.000 description 4
- 230000004940 costimulation Effects 0.000 description 4
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 4
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 4
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 4
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 4
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 4
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 4
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 4
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 235000013930 proline Nutrition 0.000 description 4
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 4
- 229930002330 retinoic acid Natural products 0.000 description 4
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- 229960001727 tretinoin Drugs 0.000 description 4
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 4
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 4-isocyanato-4'-methyldiphenylmethane Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1CC1=CC=C(N=C=O)C=C1 UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 3
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 3
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 description 3
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 description 3
- 108090000331 Firefly luciferases Proteins 0.000 description 3
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 3
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 3
- 101000917839 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Proteins 0.000 description 3
- 101001059662 Homo sapiens Mucosal addressin cell adhesion molecule 1 Proteins 0.000 description 3
- 108010073807 IgG Receptors Proteins 0.000 description 3
- 102000009786 Immunoglobulin Constant Regions Human genes 0.000 description 3
- 108010009817 Immunoglobulin Constant Regions Proteins 0.000 description 3
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 3
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 3
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 3
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 3
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 3
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 3
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 3
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 3
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 3
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 3
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 3
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010064548 Lymphocyte Function-Associated Antigen-1 Proteins 0.000 description 3
- 229910021380 Manganese Chloride Inorganic materials 0.000 description 3
- GLFNIEUTAYBVOC-UHFFFAOYSA-L Manganese chloride Chemical compound Cl[Mn]Cl GLFNIEUTAYBVOC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 108010047620 Phytohemagglutinins Proteins 0.000 description 3
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091027981 Response element Proteins 0.000 description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 3
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 3
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000010162 Tukey test Methods 0.000 description 3
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 3
- 229960003767 alanine Drugs 0.000 description 3
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 3
- 229960003121 arginine Drugs 0.000 description 3
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 3
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 3
- 229960005261 aspartic acid Drugs 0.000 description 3
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000020411 cell activation Effects 0.000 description 3
- 238000012054 celltiter-glo Methods 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 229960002433 cysteine Drugs 0.000 description 3
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 229960002989 glutamic acid Drugs 0.000 description 3
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 3
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960002449 glycine Drugs 0.000 description 3
- 230000036541 health Effects 0.000 description 3
- 229960002885 histidine Drugs 0.000 description 3
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000054424 human MADCAM1 Human genes 0.000 description 3
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 3
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 3
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960003136 leucine Drugs 0.000 description 3
- 239000011565 manganese chloride Substances 0.000 description 3
- 235000002867 manganese chloride Nutrition 0.000 description 3
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 3
- 229960004452 methionine Drugs 0.000 description 3
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 3
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000001543 one-way ANOVA Methods 0.000 description 3
- 229960005190 phenylalanine Drugs 0.000 description 3
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000008729 phenylalanine Nutrition 0.000 description 3
- 230000001885 phytohemagglutinin Effects 0.000 description 3
- 229960002429 proline Drugs 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 3
- 229960001153 serine Drugs 0.000 description 3
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 3
- 230000009469 supplementation Effects 0.000 description 3
- 229960002898 threonine Drugs 0.000 description 3
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 3
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 3
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960004295 valine Drugs 0.000 description 3
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 3
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010000807 Acute HIV infection Diseases 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 2
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 2
- 101710177291 Gag polyprotein Proteins 0.000 description 2
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- 101000917826 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor II-a Proteins 0.000 description 2
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108700029228 Immunoglobulin Heavy Chain Genes Proteins 0.000 description 2
- 102000013463 Immunoglobulin Light Chains Human genes 0.000 description 2
- 108010065825 Immunoglobulin Light Chains Proteins 0.000 description 2
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 2
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 2
- 102100032818 Integrin alpha-4 Human genes 0.000 description 2
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 2
- 108091007491 NSP3 Papain-like protease domains Proteins 0.000 description 2
- 206010034133 Pathogen resistance Diseases 0.000 description 2
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 2
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 2
- 239000012979 RPMI medium Substances 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 2
- 108010003533 Viral Envelope Proteins Proteins 0.000 description 2
- 108070000030 Viral receptors Proteins 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 2
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 2
- 230000000798 anti-retroviral effect Effects 0.000 description 2
- 238000011225 antiretroviral therapy Methods 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 238000002820 assay format Methods 0.000 description 2
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 229940112129 campath Drugs 0.000 description 2
- 230000034303 cell budding Effects 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 2
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 2
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 2
- 238000002784 cytotoxicity assay Methods 0.000 description 2
- 231100000263 cytotoxicity test Toxicity 0.000 description 2
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 2
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 2
- BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L disodium;(2',7'-dibromo-3',6'-dioxido-3-oxospiro[2-benzofuran-1,9'-xanthene]-4'-yl)mercury;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Na+].O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(Br)=C([O-])C([Hg])=C1OC1=C2C=C(Br)C([O-])=C1 BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 2
- 210000004188 enterochromaffin-like cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 2
- 239000012997 ficoll-paque Substances 0.000 description 2
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 2
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 2
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 2
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 2
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000000111 isothermal titration calorimetry Methods 0.000 description 2
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 2
- 210000004779 membrane envelope Anatomy 0.000 description 2
- 230000036438 mutation frequency Effects 0.000 description 2
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 2
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 2
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 2
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 2
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 206010036807 progressive multifocal leukoencephalopathy Diseases 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000008261 resistance mechanism Effects 0.000 description 2
- 239000012146 running buffer Substances 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 238000012409 standard PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- YMXHPSHLTSZXKH-RVBZMBCESA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 5-[(3as,4s,6ar)-2-oxo-1,3,3a,4,6,6a-hexahydrothieno[3,4-d]imidazol-4-yl]pentanoate Chemical compound C([C@H]1[C@H]2NC(=O)N[C@H]2CS1)CCCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O YMXHPSHLTSZXKH-RVBZMBCESA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KZMAWJRXKGLWGS-UHFFFAOYSA-N 2-chloro-n-[4-(4-methoxyphenyl)-1,3-thiazol-2-yl]-n-(3-methoxypropyl)acetamide Chemical compound S1C(N(C(=O)CCl)CCCOC)=NC(C=2C=CC(OC)=CC=2)=C1 KZMAWJRXKGLWGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine Chemical compound CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1 UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 1
- 239000012103 Alexa Fluor 488 Substances 0.000 description 1
- 238000012815 AlphaLISA Methods 0.000 description 1
- 102100022005 B-lymphocyte antigen CD20 Human genes 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102100024217 CAMPATH-1 antigen Human genes 0.000 description 1
- 108010065524 CD52 Antigen Proteins 0.000 description 1
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 102100024746 Dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283074 Equus asinus Species 0.000 description 1
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010021470 Fc gamma receptor IIC Proteins 0.000 description 1
- 102000006395 Globulins Human genes 0.000 description 1
- 108010044091 Globulins Proteins 0.000 description 1
- 206010019851 Hepatotoxicity Diseases 0.000 description 1
- 101000897405 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD20 Proteins 0.000 description 1
- 101000913074 Homo sapiens High affinity immunoglobulin gamma Fc receptor I Proteins 0.000 description 1
- 101000994375 Homo sapiens Integrin alpha-4 Proteins 0.000 description 1
- 101000935043 Homo sapiens Integrin beta-1 Proteins 0.000 description 1
- 101000622304 Homo sapiens Vascular cell adhesion protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 1
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 208000029462 Immunodeficiency disease Diseases 0.000 description 1
- 102100025304 Integrin beta-1 Human genes 0.000 description 1
- 102100033016 Integrin beta-7 Human genes 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 102100029206 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor II-c Human genes 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N Phenolsulfonephthalein Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1C1(C=2C=CC(O)=CC=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M Pyruvate Chemical compound CC(=O)C([O-])=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000010802 RNA extraction kit Methods 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- PLXBWHJQWKZRKG-UHFFFAOYSA-N Resazurin Chemical compound C1=CC(=O)C=C2OC3=CC(O)=CC=C3[N+]([O-])=C21 PLXBWHJQWKZRKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 1
- 230000006044 T cell activation Effects 0.000 description 1
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 230000010530 Virus Neutralization Effects 0.000 description 1
- 229950008347 abrilumab Drugs 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 1
- 230000008485 antagonism Effects 0.000 description 1
- 239000013584 assay control Substances 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000022534 cell killing Effects 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 238000001516 cell proliferation assay Methods 0.000 description 1
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 1
- 230000007248 cellular mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000013377 clone selection method Methods 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 150000001945 cysteines Chemical class 0.000 description 1
- 238000004163 cytometry Methods 0.000 description 1
- 230000006240 deamidation Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 108020001096 dihydrofolate reductase Proteins 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002875 fluorescence polarization Methods 0.000 description 1
- 238000001506 fluorescence spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 238000002825 functional assay Methods 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007686 hepatotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000304 hepatotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 230000004727 humoral immunity Effects 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 description 1
- 230000007813 immunodeficiency Effects 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 210000004347 intestinal mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000006317 isomerization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 238000011694 lewis rat Methods 0.000 description 1
- 238000012417 linear regression Methods 0.000 description 1
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002941 microtiter virus yield reduction assay Methods 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000036963 noncompetitive effect Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000014207 opsonization Effects 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000007427 paired t-test Methods 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 230000003285 pharmacodynamic effect Effects 0.000 description 1
- 229960003531 phenolsulfonphthalein Drugs 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 210000004990 primary immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 150000003148 prolines Chemical class 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 238000003118 sandwich ELISA Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 238000003998 size exclusion chromatography high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 125000000020 sulfo group Chemical group O=S(=O)([*])O[H] 0.000 description 1
- 210000000225 synapse Anatomy 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 231100000041 toxicology testing Toxicity 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- ZSDSQXJSNMTJDA-UHFFFAOYSA-N trifluralin Chemical compound CCCN(CCC)C1=C([N+]([O-])=O)C=C(C(F)(F)F)C=C1[N+]([O-])=O ZSDSQXJSNMTJDA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- 210000000264 venule Anatomy 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2839—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the integrin superfamily
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
- C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
- C07K2317/734—Complement-dependent cytotoxicity [CDC]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Virology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- AIDS & HIV (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Oncology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Description
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出された配列表を含有し、これにより参照によってその全体を組み込む。前記ＡＳＣＩＩコピーは、２０２１年７月１４日に作成され、４８３ＷＯ＿ＳＬ．ｔｘｔと命名され、サイズは１０６，７９７バイトである。
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出された配列表を含有し、これにより参照によってその全体を組み込む。前記ＡＳＣＩＩコピーは、２０２１年７月１４日に作成され、４８３ＷＯ＿ＳＬ．ｔｘｔと命名され、サイズは１０６，７９７バイトである。
本出願は、とりわけ、新規の抗α４β７抗体、この抗体をコードするポリヌクレオチド、この抗体を産生する方法及びこれらの抗体の使用方法に関する。
今日、世界的に見ると３７００万人以上がヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に感染しており、流行している人口は増え続けている。抗レトロウイルス併用療法（ｃＡＲＴ）の出現によりＨＩＶの管理は著しく進歩してきた。ｃＡＲＴは、ＨＩＶを抱えている人の生涯を通じて終始一貫して受ける必要がある。ｃＡＲＴはリスクベネフィット限界を有し、さらに、ＨＩＶ潜伏ウイルス保有宿主を減らさない。生涯処置を必要としなくてもウイルス負荷を検出レベルより低く保つことができる改良処置の重大な必要性が存在する。
急性ヒトＨＩＶ感染では、高レベルのウイルス複製と感染したＣＤ４＋Ｔ細胞の甚大な枯渇の両方が、ＨＩＶ感染に関連する免疫不全の発生に中心的な役割を果たすと考えられている。α４β７は、Ｔ細胞（ＣＤ４＋又はＣＤ８＋）、Ｂ細胞及び他の免疫細胞上で発現される腸管ホーミングインテグリンであり、ＨＩＶ感染の病態形成に重要な役割を果たす。α４β７は、ビリオンが感染宿主細胞から出芽するとＨＩＶのエンベロープに組み込まれることも報告されている（Ｇｕｚｚｏら、Ｓｃｉ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２０１７年）。
α４β７インテグリンは、Ｔ細胞サブセット、Ｂ細胞、ＮＫ細胞及び他の免疫細胞上で発現されるヘテロ二量体受容体である。このインテグリンは、腸管粘膜の内皮性小静脈上で発現されるそのリガンド粘膜アドレシン細胞接着分子１（ＭＡｄＣＡＭ－１）に結合することにより、腸管関連リンパ組織（ＧＡＬＴ）中へのリンパ球輸送を媒介する。高α４β７発現ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏではＨＩＶ感染の標的であり（Ｃｉｃａｌａら、ＰＮＡＳ ２００９年）、この細胞は感染し、したがって、急性ＨＩＶ感染の間枯渇する（Ｓｉｖｒｏら、Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ２０１８年）。ＨＩＶ感染ＣＤ４＋細胞に並びにＨＩＶビリオンに存在するα４β７は、ＧＡＬＴへのその輸送を媒介することができると考えられる（Ｇｕｚｚｏら、Ｓｃｉ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０１７年）。ＧＡＬＴに向かうＣＤ４＋Ｔ細胞は、抗レトロウイルス療法の間でも身体において最大のＨＩＶ保有宿主を構成する（Ｂｒｅｎｃｈｌｅｙ ａｎｄ Ｄｏｕｅｋ、Ｍｕｃｏｓａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００８年）。
Ｇｕｚｚｏら、Ｓｃｉ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２０１７年
Ｃｉｃａｌａら、ＰＮＡＳ ２００９年
Ｓｉｖｒｏら、Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ２０１８年
Ｂｒｅｎｃｈｌｅｙ ａｎｄ Ｄｏｕｅｋ、Ｍｕｃｏｓａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００８年
（発明の要旨）
本開示は、ヒトα４β７に特異的に結合する抗α４β７抗体及びその結合断片を提供する。例示的な抗α４β７抗体の重及び軽鎖の例示的なＣＤＲのアミノ酸配列、並びにＶＨ及びＶＬ領域のアミノ酸配列は、下の、発明を実施するための形態で提供される。
本開示は、ヒトα４β７に特異的に結合する抗α４β７抗体及びその結合断片を提供する。例示的な抗α４β７抗体の重及び軽鎖の例示的なＣＤＲのアミノ酸配列、並びにＶＨ及びＶＬ領域のアミノ酸配列は、下の、発明を実施するための形態で提供される。
本開示の抗α４β７抗体をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドが本明細書で提供され、ポリヌクレオチドを含むベクターも同様である。さらに、開示された抗α４β７抗体をコードするヌクレオチド配列を含むベクターで形質転換された原核細胞及びこのベクターをトランスフェクトされた真核細胞並びにヌクレオチド配列を発現するように操作された真核（哺乳動物などの）宿主細胞が本明細書で提供される。宿主細胞を培養し抗体を回収することにより、抗体を産生する方法も提供される。
本開示は、ＨＩＶ感染と診断された、ヒト対象などの対象を抗α４β７抗体を用いて処置する方法を提供する。方法は、一般に、対象に、治療効果を与えるのに有効な本明細書に記載される抗α４β７抗体の量を投与するステップを含む。対象は、ＨＩＶ感染のいかなる臨床カテゴリーで診断してもよい。
本明細書に記載される抗α４β７抗体は、ウイルスタンパク質の代わりにヒトα４β７を標的にするので、ＨＩＶ突然変異ベースの耐性機構を誘導しない有利な治療アプローチを提供するが、この耐性機構は、ＨＩＶの高突然変異頻度のせいでウイルスタンパク質を標的にする処置により発生することが多い。
本明細書に提示されるデータに基づいて、本明細書に記載される抗α４β７抗体は、ＨＩＶ感染と診断された対象に治療効果をもたらすと予想される。
理論に拘束されるものではないが、本発明の実施形態は、以下の２つの主要な作用機構を介してＨＩＶ感染に対するウイルス制御を発揮すると仮定される：１）Ｆａｂ依存性機構：α４β７と、ＭＡｄＣＡＭ－１及びＨＩＶ ｇｐ１２０などのそのリガンドとの相互作用を遮断し、それにより、これらのリガンドのシグナル伝達によって媒介されるＣＤ４＋ Ｔ細胞の共刺激を阻害し、これらの刺激された細胞におけるＨＩＶ複製（Ｎａｗａｚら、Ｍｕｃｏｓａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１８、Ｌｉｖｉａら、ＰＮＡＳ．２０２０）、消化器組織のＨＩＶ感染（Ｇｕｚｚｏら、Ｓｃｉ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１７）及び細胞間ウイルス伝播（Ａｒｔｈｏｓら、Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００８）をそれぞれ抑制すること、並びに２）Ｆｃ依存性機構：抗α４β７ ｍＡｂはα４β７＋ ＨＩＶビリオンに結合し、免疫複合体を形成し、この免疫複合体は、ｍＡｂ Ｆｃドメインと、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上のＦｃγＲとの相互作用を通じて内部移行し、プロセシングされ、結果として得られたウイルスペプチドが続いてＡＰＣの表面上に提示されて、新しく耐久性のあるＨＩＶ特異的免疫反応を誘発して、ウイルス複製を抑制する、「ワクチン接種効果」を誘導すること（Ｐａｒｓｏｎｓら、Ｒｅｔｒｏｖｉｒｏｌｏｇｙ ２０１８；Ｎａｒａｎｊｏ－Ｇｏｍｅｚら、Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． ＨＩＶ ＡＩＤＳ ２０１９）。
α４β７インテグリンは、通常、そのリガンドに対して低い親和性で休止（不活性）状態にある。活性化されると、これは、高い親和性でそのリガンド（例えば、ＭＡｄＣＡＭ－１及びｇｐ１２０）に結合することができる（Ｙｅら、Ｂｌｏｏｄ、２０１２；Ｌｅｒｔｊｕｔｈａｐｏｒｎら、ＰｌｏＳ Ｏｎｅ、２０１８）。ＨＩＶ感染中、ＨＩＶ ｇｐ１２０のＶ２領域におけるモチーフは、ＭＡｄＣＡＭ－１を模倣し、α４β７に結合することができる（Ｐｅａｃｈｍａｎら、ＰｌｏＳ Ｏｎｅ、２０１５）。α４β７とｇｐ１２０との相互作用は、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）の活性化を誘導し、ウイルス学的シナプスの形成を潜在的に誘導し、それによって、ＨＩＶの細胞間伝播を増強する（Ａｒｔｈｏｓら、Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００８）。細胞間伝播は、組織内でのウイルスの拡散を促進するために不可欠であり、ウイルスの伝播には無細胞ウイルスよりも重要である。α４β７に結合すると、本発明の実施形態は、α４β７とｇｐ１２０との相互作用を破壊することにより、ＨＩＶのα４β７媒介性細胞間伝播を低減させ、細胞へのα４β７抗体結合複合体の内部移行を誘導することができる又はα４β７を不活性化することができる。したがって、本発明の実施形態は、組織内のＨＩＶ複製及びウイルスの拡散を阻害する能力を示す。
ウイルスタンパク質の代わりにα４β７のヒトタンパク質を標的とすることにより、本発明の実施形態は、ＨＩＶの高い突然変異頻度のためにウイルスタンパク質を標的とする処置に通常関連するウイルス耐性突然変異の出現を誘導しない。
６．１．略語
本明細書に記載されている抗体は、多くの実施形態では、それらのそれぞれのポリペプチド配列によって記載されている。別段の指示がない限り、ポリペプチド配列は、Ｎ→Ｃ方向において提供されている。
本明細書に記載されている抗体は、多くの実施形態では、それらのそれぞれのポリペプチド配列によって記載されている。別段の指示がない限り、ポリペプチド配列は、Ｎ→Ｃ方向において提供されている。
本明細書に記載されているポリヌクレオチドは、多くの実施形態では、それらのそれぞれのポリヌクレオチド配列によって記載されている。別段の指示がない限り、５’→３’方向のポリヌクレオチド配列。
ポリペプチド配列に関して、以下の表１に示されているように、遺伝的にコードされたアミノ酸についての従来の３文字又は１文字の略語が使用され得る。
ある特定の配列は、ある特定のクラス（例えば、脂肪族、疎水性など）に属するアミノ酸残基を特定する構造式によって定義される。本明細書で使用される場合、遺伝的にコードされたアミノ酸が属する様々なクラスは、以下の表２に示されている。一部のアミノ酸は、１つより多いクラスに属する場合がある。スルフヒドリル基を含有するシステイン、及び立体構造的に制限されているプロリンには、クラスが割り当てられていない。
様々な例示的な実施形態を通して使用されている略語は、以下の表３に提供されているものを含む：
６．２．定義
本明細書で別段の定義がない限り、本開示に関連して使用されている科学用語及び技術用語は、当業者によって一般的に理解されている意味を有する。
本明細書で別段の定義がない限り、本開示に関連して使用されている科学用語及び技術用語は、当業者によって一般的に理解されている意味を有する。
本明細書で使用される場合、抗体アミノ酸残基の番号付けは、別段の指示がない限り、ＥＵ番号付けスキームに従って行われる。
６．３．抗α４β７抗体
一態様では、本開示は、α４β７ヘテロ二量体インテグリン受容体（ａ４ｂ７、ＬＰＡＭ－１、リンパ球パイエル板接着分子１、並びにインテグリンアルファ－４及びインテグリンベータ－７の二量体としても知られている）に特異的に結合する抗体に関する。
一態様では、本開示は、α４β７ヘテロ二量体インテグリン受容体（ａ４ｂ７、ＬＰＡＭ－１、リンパ球パイエル板接着分子１、並びにインテグリンアルファ－４及びインテグリンベータ－７の二量体としても知られている）に特異的に結合する抗体に関する。
本明細書で使用される場合、「抗体」（Ａｂ）という用語は、特定の抗原、例えば、α４β７に特異的に結合する免疫グロブリン分子を指す。一部の実施形態では、本開示の抗α４β７抗体は、ヒトα４β７に結合し、それによって免疫系をモジュレートする。本開示の抗α４β７抗体は、軽鎖及び重鎖可変ドメインの両方において、超可変領域としても知られている、相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。可変ドメインのより高度に保存された部分は、フレームワーク（ＦＲ）と呼ばれる。当該技術分野で知られているように、抗体の超可変領域を示すアミノ酸位置／境界は、文脈及び当該技術分野で知られている様々な定義に応じて変化し得る。可変ドメイン内のいくつかの位置は、それらの位置が、ある一連の基準の下では超可変領域内にあると判断され得るのに対して、異なる一連の基準の下では超可変領域外にあると判断され得るという点で、ハイブリッド超可変位置とみなされ得る。また、これらの位置の１つ以上は、拡張された超可変領域にも見出され得る。本開示は、これらのハイブリッド超可変位置における修飾を含む抗体を提供する。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインの各々は、主にβシート構造をとることによって３つのＣＤＲによって接続される４つのＦＲ領域を含み、この３つのＣＤＲは、βシート構造を接続し、場合によってはその一部を形成するループを形成する。各鎖のＣＤＲは、ＦＲ領域に近接して一緒に保持され、他の鎖からのＣＤＲとともに、抗体の標的結合部位の形成に寄与する。Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ． １９８７）を参照のこと。
本開示の抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、一本鎖抗体などを含むが、これらに限定されない、ポリクローナル、モノクローナル、遺伝子操作された、及び／又は別様で性質が修飾されたものであってもよい。様々な実施形態では、抗体は、抗体の定常領域の全て又は一部を含む。一部の実施形態では、定常領域は、ＩｇＡ（例えば、ＩｇＡ１又はＩｇＡ２）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４）及びＩｇＭから選択されるアイソタイプである。具体的な実施形態では、本明細書に記載されている抗α４β７抗体はＩｇＧ１を含む。他の実施形態では、抗α４β７抗体はＩｇＧ２を含む。さらに他の実施形態では、抗α４β７抗体はＩｇＧ４を含む。本明細書で使用される場合、抗体の「定常領域」には、ヒトＩｇＧ１におけるＴ２５０Ｑ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｄ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ、Ｍ４２８Ｌ及び／又はＡ４３１Ｇのいずれかなどの、天然の定常領域、アロタイプ又はバリアントが含まれる。
抗α４β７抗体の軽定常領域は、カッパ（κ）軽鎖領域又はラムダ（λ）領域であり得る。λ軽鎖領域は、既知のサブタイプ、例えば、λ１、λ２、λ３又はλ４のうちのいずれか１つであり得る。一部の実施形態では、抗α４β７抗体は、カッパ（κ）軽鎖領域を含む。
本明細書で使用される場合、「モノクローナル抗体」という用語は、ハイブリドーマ技術によって産生される抗体に限定されない。モノクローナル抗体は、当該技術分野で利用可能又は公知の任意の手段によって、任意の真核生物、原核生物又はファージのクローンを含む、単一クローンから誘導される。本開示で有用なモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、組換え及びファージディスプレイ技術又はそれらの組合せの使用を含む、当該技術分野で公知の多種多様な技術を使用して調製され得る。
本明細書で使用される場合、「キメラ」抗体という用語は、ラット又はマウス抗体などの非ヒト免疫グロブリンに由来する可変配列、及び典型的にはヒト免疫グロブリン鋳型から選択されるヒト免疫グロブリン定常領域を有する抗体を指す。
非ヒト（例えば、マウス）抗体の「ヒト化」形態は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、ＣＤＲ領域の全て又は実質的に全ては、非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲ領域の全て又は実質的に全ては、ヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体はまた、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものも含むことができる。
「ヒト抗体」は、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体を含み、ヒト免疫グロブリンライブラリーから、又は１つ以上のヒト免疫グロブリンについてのトランスジェニック動物から単離され、内因性の機能的免疫グロブリンを発現しない抗体を含む。ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体ライブラリーを使用するファージディスプレイ法を含む、当該技術分野で公知の様々な方法によって作製され得る。
本開示の抗α４β７抗体は、全長（インタクトな）抗体分子を含む。
抗α４β７抗体は、少なくとも１つの定常領域により媒介される生物学的エフェクター機能を変化させるために、その配列が修飾された抗体であり得る。例えば、一部の実施形態では、抗α４β７抗体は、未修飾抗体と比較して少なくとも１つの定常領域により媒介される生物学的エフェクター機能を低減させるために修飾され得、例えば、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａ及び／又はＦｃγＲＩＩＩｂなどのＦｃ受容体（ＦｃγＲ）の１つ以上への結合が低減され得る。ＦｃγＲ結合は、ＦｃγＲ相互作用に必要な特定の領域における抗体の免疫グロブリン定常領域セグメントを突然変異させることによって低減され得る（例えば、Ｃａｎｆｉｅｌｄ及びＭｏｒｒｉｓｏｎ、１９９１、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １７３：１４８３～１４９１；並びにＬｕｎｄら、１９９１、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４７：２６５７～２６６２を参照のこと）。抗体のＦｃγＲ結合能力の低減は、オプソニン作用、食作用及び抗原依存性細胞傷害性（「ＡＤＣＣ」）などのＦｃγＲ相互作用に依存する他のエフェクター機能も低減させることができる。
本明細書に記載されている抗α４β７抗体は、例えば、ＦｃγＲ相互作用を増強するために、未修飾抗体と比較して、少なくとも１つの定常領域により媒介される生物学的エフェクター機能を獲得又は改善するように修飾された抗体を含む（例えば、米国特許出願第２００６／０１３４７０９号を参照のこと）。例えば、本開示の抗α４β７抗体は、対応する未修飾定常領域よりも高い親和性で、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａ及び／又はＦｃγＲＩＩＩｂに結合する定常領域を有することができる。
抗α４β７抗体のＦｃγＲ結合及び／又はＡＤＣＣエフェクター機能を修飾することができるさらなる置換は、Ｆｃ領域におけるＫ３２２Ａ置換又はＬ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ二重置換を含む。例えば、Ｈｅｚａｒｅｈら、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．、７５（２４）：１２１６１～１２１６８（２００１）を参照のこと。
本開示の抗α４β７抗体は、対応する野生型ＣＨ２又はＦｃ領域の結合と比較して、ＦｃγＲＩＩｂへの結合を増加させる及び／又はＦｃγＲＩＩＩａへの結合を低減させるアミノ酸置換を含む修飾（又はバリアント）ＣＨ２ドメイン又はＦｃドメイン全体を含むことができる。バリアントＣＨ２又はバリアントＦｃドメインは、２６３位、２６６位、２７３位及び３０５位に１つ以上の置換を含むことができる。一部の実施形態では、抗α４β７抗体は、野生型ＣＨ２ドメインに対して、Ｖ２６３Ｌ、Ｖ２６６Ｌ、Ｖ２７３Ｃ、Ｖ２７３Ｅ、Ｖ２７３Ｆ、Ｖ２７３Ｌ、Ｖ２７３Ｍ、Ｖ２７３Ｓ、Ｖ２７３Ｙ、Ｖ３０５Ｋ及びＶ３０５Ｗから選択される１つ以上の置換を含む。
対応する野生型ＣＨ２又はＦｃ領域の結合と比較して、ＦｃγＲＩＩｂへの結合の増加及び／又はＦｃγＲＩＩＩａへの結合の低減をもたらすことができるバリアントＣＨ２又はバリアントＦｃドメインの他の例には、ヒトＩｇＧ１におけるＳ２６７Ｅ又はＳ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆなどの、Ｖｏｎｄｅｒｈｅｉｄｅら、Ｃｌｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、１９（５）、１０３５～１０４３（２０１３）に見出されるものが含まれる。
ヒトＩｇＧ４定常領域を含む抗α４β７抗体は、Ｆａｂアーム交換を阻止することが報告されている、Ｓ２２８Ｐ突然変異を含むことができる。例えば、Ｓｉｌｖａ，ＪＰら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２９０（９）、５４６２～５４６９（２０１５）を参照のこと。
一部の実施形態では、抗α４β７抗体は、例えば、ＦｃＲｎ相互作用に関与する特定の領域における免疫グロブリン定常領域セグメントを突然変異させることによって、胎児Ｆｃ受容体、ＦｃＲｎに対するそれらの結合親和性を増加又は減少させる修飾を含む。特定の実施形態では、ＩｇＧクラスの抗α４β７抗体は、重鎖定常領域のアミノ酸残基２５０、３１４及び４２８のうちの少なくとも１つが単独で又はそれらの任意の組合せで置換されるように突然変異される。２５０位については、置換アミノ酸残基は、限定されないが、アラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、バリン、トリプトファン又はチロシンを含む、スレオニン以外の任意のアミノ酸残基であり得る。３１４位については、置換アミノ酸残基は、限定されないが、アラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、スレオニン、バリン、トリプトファン又はチロシンを含む、ロイシン以外の任意のアミノ酸残基であり得る。４２８位については、置換アミノ酸残基は、限定されないが、アラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リシン、ロイシン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、スレオニン、バリン、トリプトファン又はチロシンを含む、メチオニン以外の任意のアミノ酸残基であり得る。Ｆｃエフェクター機能を修飾することが知られている例示的な置換は、Ｆｃ置換Ｔ２５０Ｑと組み合わせて生じ得る、Ｆｃ置換Ｍ４２８Ｌである。適切なアミノ酸置換の追加の具体的な組合せは、米国特許第７，２１７，７９７号の表１に特定されている。このような突然変異は、ＦｃＲｎへの結合を増加させ、抗体を分解から保護し、その半減期を延長させる。
ヒトα４β７に対して高い親和性を有する抗α４β７抗体は、治療及び診断用途に望ましい場合がある。したがって、本開示は、ヒトα４β７に対して高い結合親和性を有する抗体を企図する。具体的な実施形態では、抗α４β７抗体は、少なくとも約１００ｎＭの親和性でヒトα４β７に結合するが、より高い親和性、例えば、少なくとも約９０ｎＭ、８０ｎＭ、７０ｎＭ、６０ｎＭ、５０ｎＭ、４０ｎＭ、３０ｎＭ、２５ｎＭ、２０ｎＭ、１５ｎＭ、１０ｎＭ、７ｎＭ、６ｎＭ、５ｎＭ、４ｎＭ、３ｎＭ、２ｎＭ、１ｎＭ、０．１ｎＭ、０．０１ｎＭ又はさらにそれ以上を示し得る。一部の実施形態では、抗体は、約１ｐＭ～約１０ｎＭ、約１００ｐＭ～約１０ｎＭ、約１００ｐＭ～約１ｎＭの範囲の親和性又は前述の値のいずれかの間の範囲の親和性でヒトα４β７に結合する。
ヒトα４β７に対する抗α４β７抗体の親和性は、例えば、限定の目的ではないが、ＥＬＩＳＡ、等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）、表面プラズモン共鳴又は蛍光偏光アッセイなどの、当該技術分野で周知である又は本明細書に記載されている技術を使用して決定され得る。
抗α４β７抗体は、一般に、本明細書において（Ｎ→Ｃの順で）、ＶＨ ＣＤＲ＃１、ＶＨ ＣＤＲ＃２及びＶＨ ＣＤＲ＃３と称される３つの相補性決定領域（「ＣＤＲ」）を有する可変領域（ＶＨ）を含む重鎖、並びに本明細書において（Ｎ→Ｃの順で）、ＶＬ ＣＤＲ＃１、ＶＬ ＣＤＲ＃２及びＶＬ ＣＤＲ＃３と称される３つの相補性決定領域を有する可変領域（ＶＬ）を含む軽鎖を含む。例示的なＣＤＲのアミノ酸配列並びに例示的な抗α４β７の重鎖及び軽鎖のＶＨ及びＶＬ領域のアミノ酸配列が本明細書に提供されている。抗α４β７抗体の具体的な実施形態には、これらの例示的なＣＤＲ並びに／又はＶＨ及び／若しくはＶＬ配列、並びにこのような抗体とヒトα４β７の結合について競合する抗体が含まれる。
一部の実施形態では、抗α４β７抗体は、ヒトへの投与に適している。具体的な実施形態では、抗α４β７抗体は、ヒト化されている。
一部の実施形態では、抗α４β７抗体のＣＤＲのアミノ酸配列は、表４の配列から選択される。
上記のＣＤＲを有する抗α４β７抗体の具体的な例示的な実施形態は、本明細書に記載されている。一部の実施形態では、抗α４β７抗体は、配列番号１２、１３、１４、１５、１６及び１７のＣＤＲを有する。一部の実施形態では、抗α４β７抗体は、配列番号３２、３３、３４、３５、３６及び３７のＣＤＲを有する。一部の実施形態では、抗α４β７抗体は、配列番号４２、４３、４４、４５、４６及び４７のＣＤＲを有する。一部の実施形態では、抗α４β７抗体は、配列番号５２、５３、５４、５５、５６及び５７のＣＤＲを有する。一部の実施形態では、抗α４β７抗体は、配列番号６２、６３、６４、６５、６６及び６７のＣＤＲを有する。一部の実施形態では、抗α４β７抗体は、配列番号７２、７３、７４、７５、７６及び７７のＣＤＲを有する。一部の実施形態では、抗α４β７抗体は、配列番号８２、８３、８４、８５、８６及び８７のＣＤＲを有する。
一部の実施形態では、抗α４β７抗体は、表５の配列から選択されるＶＨ鎖及びＶＬ鎖を含む：
一部の実施形態では、抗α４β７抗体は、配列が配列番号１０に対応するＶＨ鎖、及び配列が配列番号１１に対応するＶＬ鎖を含む。一部の実施形態では、抗α４β７抗体は、配列が配列番号２０又は２２～２３のいずれか１つに対応するＶＨ鎖、及び配列が配列番号２５又は２７～２８のいずれか１つに対応するＶＬ鎖を含む。一部の実施形態では、抗α４β７抗体は、配列が配列番号２１のバリアントに対応するＶＨ鎖、及び配列が配列番号２６のバリアントに対応するＶＬ鎖を含む。一部の実施形態では、抗α４β７抗体は、配列が配列番号４０に対応するＶＨ鎖、及び配列が配列番号４１に対応するＶＬ鎖を含む。一部の実施形態では、抗α４β７抗体は、配列が配列番号５０に対応するＶＨ鎖、及び配列が配列番号５１に対応するＶＬ鎖を含む。一部の実施形態では、抗α４β７抗体は、配列が配列番号６０に対応するＶＨ鎖、及び配列が配列番号６１に対応するＶＬ鎖を含む。一部の実施形態では、抗α４β７抗体は、配列が配列番号７０に対応するＶＨ鎖、及び配列が配列番号７１に対応するＶＬ鎖を含む。一部の実施形態では、抗α４β７抗体は、配列が配列番号８０に対応するＶＨ鎖、及び配列が配列番号８１に対応するＶＬ鎖を含む。
当業者であれば、本明細書に記載されている抗α４β７抗体におけるＶＨ又はＶＬ配列のある特定の突然変異は、本開示の範囲内の抗α４β７抗体をもたらすことを理解する。突然変異は、有意な抗α４β７活性を保持しながら、本明細書に開示されているＶＨ又はＶＬ配列からのアミノ酸置換、付加又は欠失を含むことができる。したがって、一部の実施形態では、抗α４β７抗体は、表５に示されている抗体のいずれか１つのＶＨ配列に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有するＶＨ配列を含む。抗α４β７抗体は、表５に示されている抗体のいずれか１つのＶＨ配列と比較して、最大で８個まで、最大で７個まで、最大で６個まで、最大で５個まで、最大で４個まで、最大で３個まで又は最大で２個までの突然変異を有するＶＨ配列を含むことができる。一部の実施形態では、抗α４β７抗体は、表５に示されている抗体のいずれか１つのＶＨ配列と比較して、５個以下、４個以下、３個以下又は２個以下の突然変異を有するＶＨ配列を含むことができる。一部の実施形態では、抗α４β７抗体は、単一のアミノ酸置換を有するＶＨ配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨ配列における突然変異は、ＶＨ ＣＤＲ＃１、ＶＨ ＣＤＲ＃２又はＶＨ ＣＤＲ＃３に位置する。一部の実施形態では、抗α４β７抗体は、表５に示されている抗体のいずれか１つのＶＬ配列に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有するＶＬ配列を含む。抗α４β７抗体は、表５に示されている抗体のいずれか１つのＶＬ配列と比較して、最大で８個まで、最大で７個まで、最大で６個まで、最大で５個まで、最大で４個まで、最大で３個まで又は最大で２個までの突然変異を有するＶＬ配列を含むことができる。一部の実施形態では、抗α４β７抗体は、表５に示されている抗体のいずれか１つのＶＬ配列と比較して、５個以下、４個以下、３個以下又は２個以下の突然変異を有するＶＬ配列を含むことができる。一部の実施形態では、抗α４β７抗体は、単一のアミノ酸置換を有するＶＬ配列を含む。一部の実施形態では、ＶＬ配列における突然変異は、ＶＬ ＣＤＲ＃１、ＶＬ ＣＤＲ＃２又はＶＬ ＣＤＲ＃３に位置する。
一部の実施形態では、抗α４β７抗体は、表６の配列から選択される重鎖アミノ酸配列及び／又は軽鎖アミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、抗α４β７抗体は、配列が配列番号９０に対応する重鎖、及び配列が配列番号１００に対応する軽鎖を含む。一部の実施形態では、抗α４β７抗体は、配列が配列番号９２に対応する重鎖、及び配列が配列番号１００に対応する軽鎖を含む。一部の実施形態では、抗α４β７抗体は、配列が配列番号９４に対応する重鎖、及び配列が配列番号１００に対応する軽鎖を含む。一部の実施形態では、抗α４β７抗体は、配列が配列番号９６に対応する重鎖、及び配列が配列番号１００に対応する軽鎖を含む。一部の実施形態では、抗α４β７抗体は、配列が配列番号９８に対応する重鎖、及び配列が配列番号１００に対応する軽鎖を含む。
抗体重鎖のＣ末端上の１つ以上（例えば、１、２、３又はそれ以上）のアミノ酸残基の切断などの、抗α４β７抗体の配列に対する翻訳後修飾を行って、切断型を生成することができる。
一部の実施形態では、抗α４β７抗体は、配列が配列番号９１に対応する重鎖、及び配列が配列番号１００に対応する軽鎖を含む。一部の実施形態では、抗α４β７抗体は、配列が配列番号９３に対応する重鎖、及び配列が配列番号１００に対応する軽鎖を含む。一部の実施形態では、抗α４β７抗体は、配列が配列番号９５に対応する重鎖、及び配列が配列番号１００に対応する軽鎖を含む。一部の実施形態では、抗α４β７抗体は、配列が配列番号９７に対応する重鎖、及び配列が配列番号１００に対応する軽鎖を含む。一部の実施形態では、抗α４β７抗体は、配列が配列番号９９に対応する重鎖、及び配列が配列番号１００に対応する軽鎖を含む。
一部の実施形態では、抗α４β７抗体は、インビトロアッセイにおいて、ヒトα４β７への結合について参照抗体と競合する。一部の実施形態では、抗α４β７抗体は、ヒトα４β７を発現する細胞上でヒトα４β７への結合について競合する。参照抗体は、本明細書に記載されている抗α４β７抗体のいずれかであり得る。一部の実施形態では、参照抗体は、表４～６に提供されている抗体である。一部の実施形態では、参照抗体は、表８に提供されている抗体である。具体的な実施形態では、参照抗体は、抗ヒトα４β７抗体由来のアミノ酸配列を使用して生成された研究グレードの抗体、又はそれと等価のアミノ酸配列を有する抗体、例えば、ベドリズマブから選択される。
一部の実施形態では、抗α４β７抗体は、１つのα４（配列番号１～２）及び１つのβ７（配列番号３～４）のヒトα４β７ヘテロ二量体に拮抗する、例えば、それを阻害する。α４β７受容体拮抗作用は、多くの機構によって、例えば、ヒトＭＡｄＣＡＭ－１（配列番号５）又はヒトＶＣＡＭ－１（配列番号６）などの、そのリガンドの少なくとも１つによるα４β７の結合を阻害することによって発生し得る。
本明細書に記載されている抗α４β７抗体は、ヒトα４β７に結合する。他の種、例えば、サル、例えば、カニクイザル由来のα４β７への結合に対する抗体の交差反応は、生物活性についてサル動物モデルにおいて試験を行うことができるなどの利点を提供することができる。このような動物モデル試験は、抗α４β７抗体をスクリーニングして、有効性に関連する特性、例えば、好ましい薬物動態又は安全性に関連する特性、例えば、肝毒性の減少を選択するために使用され得る。一部の実施形態では、抗α４β７抗体は、カニクイザルα４β７及びヒトα４β７に結合する。
競合のためのアッセイには、限定されないが、放射性物質標識イムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、サンドイッチＥＬＩＳＡ、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）アッセイ及び表面プラズモン共鳴アッセイが含まれる。
参照抗体と試験抗体との間の抗体競合アッセイを実施する際に（種又はアイソタイプに関係なく）、最初に、フルオロフォア、ビオチン又は酵素（又はさらに放射性）標識などの検出可能な標識により参照を標識して、その後の同定を可能にすることができる。この場合、ヒトα４β７を発現する細胞は、非標識試験抗体とインキュベートされ、標識された参照抗体が加えられ、結合した標識の強度が測定される。試験抗体が、重複するエピトープに結合することによって標識された参照抗体と競合する場合、強度は、試験抗体を用いずに行われた対照反応と比較して減少する。
このアッセイの具体的な実施形態では、アッセイ条件（例えば、特定の細胞密度）下で最大結合の８０％（「ｃｏｎｃ８０％」）をもたらす標識された参照抗体の濃度が最初に決定され、競合アッセイが、１０×ｃｏｎｃ８０％の標識されていない試験抗体及びｃｏｎｃ８０％の標識された参照抗体を用いて行われる。
阻害は、以下の式に従って計算される阻害定数又はＫｉとして表すことができる：
Ｋｉ＝ＩＣ５０／（１＋［参照Ａｂ濃度］／Ｋｄ）、
式中、ＩＣ５０は、参照抗体の結合が５０％減少する試験抗体の濃度であり、Ｋｄは、参照抗体の解離定数であり、ヒトα４β７に対するその親和性の尺度である。本明細書に開示されている抗α４β７抗体と競合する抗体は、本明細書に記載されているアッセイ条件下で１０ｐＭ～１０ｎＭのＫｉを有することができる。
Ｋｉ＝ＩＣ５０／（１＋［参照Ａｂ濃度］／Ｋｄ）、
式中、ＩＣ５０は、参照抗体の結合が５０％減少する試験抗体の濃度であり、Ｋｄは、参照抗体の解離定数であり、ヒトα４β７に対するその親和性の尺度である。本明細書に開示されている抗α４β７抗体と競合する抗体は、本明細書に記載されているアッセイ条件下で１０ｐＭ～１０ｎＭのＫｉを有することができる。
様々な実施形態では、試験抗体は、使用される特定のアッセイ条件下で最大結合の８０％である参照抗体濃度において、及び参照抗体濃度よりも１０倍高い試験抗体濃度において、参照抗体の結合を、少なくとも約２０％以上、例えば、少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％若しくはさらにそれ以上、又は前述の値のいずれかの間の範囲のパーセンテージ減少させる場合、参照抗体と競合するとみなされる。
本開示の別の態様は、ヒトα４β７に特異的に結合することができる抗α４β７抗体結合断片を含む。一部の実施形態では、これらの抗α４β７結合断片は、本明細書に開示されている抗α４β７抗体の少なくとも１つ及び最大で全てのＣＤＲを含む。抗体結合断片の例には、限定ではなく例として、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片、一本鎖Ｆｖ断片及び単一ドメイン断片が含まれる。
抗α４β７抗体又はその結合断片は、例えば、Ｊｕｎｇ及びＰｌｕｃｋｔｈｕｎ、１９９７、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １０：９、９５９～９６６；Ｙａｚａｋｉら、２００４、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ． Ｄｅｓ Ｓｅｌ． １７（５）：４８１～９． Ｅｐｕｂ ２００４年８月１７日；並びに米国特許出願公開第２００７／０２８０９３１号に記載されているように、そのＣＤＲの１つ以上に挿入された１つ以上のアミノ酸を有することができる。
６．４．抗α４β７抗体をコードするポリヌクレオチド、発現系及び抗体を作製する方法
本開示は、抗α４β７抗体についての免疫グロブリン軽鎖及び重鎖遺伝子をコードするポリヌクレオチド分子、そのようなポリヌクレオチドを含むベクター並びに本開示の抗α４β７抗体を産生することができる宿主細胞を包含する。
本開示は、抗α４β７抗体についての免疫グロブリン軽鎖及び重鎖遺伝子をコードするポリヌクレオチド分子、そのようなポリヌクレオチドを含むベクター並びに本開示の抗α４β７抗体を産生することができる宿主細胞を包含する。
本開示の抗α４β７抗体は、宿主細胞における免疫グロブリン軽鎖及び重鎖遺伝子の組換え発現によって調製され得る。抗体を組換え的に発現させるために、抗体の免疫グロブリン軽鎖及び重鎖をコードするＤＮＡ断片を担持する１つ以上の組換え発現ベクターを宿主細胞にトランスフェクトし、それにより、軽鎖及び重鎖が宿主細胞内で発現され、任意選択的に、宿主細胞が培養される培地内に分泌され、その培地から抗体が回収され得る。
そのような抗α４β７抗体をコードするポリヌクレオチドを生成するために、軽鎖及び重鎖の可変領域をコードするＤＮＡ断片が最初に得られる。これらのＤＮＡは、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して、生殖細胞系列ＤＮＡ又は軽鎖及び重鎖可変配列をコードするｃＤＮＡの増幅及び修飾によって得ることができる。
抗α４β７抗体に関連するＶＨ及びＶＬセグメントをコードするＤＮＡ断片が得られると、これらのＤＮＡ断片は、例えば、可変領域遺伝子を全長抗体鎖遺伝子、Ｆａｂ断片遺伝子又はｓｃＦｖ遺伝子に変換するために、標準的な組換えＤＮＡ技術によってさらに操作され得る。これらの操作において、ＶＬ又はＶＨをコードするＤＮＡ断片は、抗体定常領域又は柔軟なリンカーなどの別のタンパク質をコードする別のＤＮＡ断片に作動可能に連結される。この文脈で使用される場合、「作動可能に連結される」という用語は、２つのＤＮＡ断片によってコードされるアミノ酸配列がインフレームのままであるように、２つのＤＮＡ断片が結合されることを意味することを意図する。
ＶＨ領域をコードする単離されたＤＮＡは、ＶＨをコードするＤＮＡを、重鎖定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３及び任意選択的にＣＨ４）をコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結することによって全長重鎖遺伝子に変換され得る。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は、当該技術分野で公知であり（例えば、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、１９９１、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｕ．Ｓ． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１～３２４２を参照のこと）、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は、標準的なＰＣＲ増幅によって得ることができる。重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ又はＩｇＤ定常領域であり得るが、ある特定の実施形態では、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４である。Ｆａｂ断片重鎖遺伝子の場合、ＶＨをコードするＤＮＡは、重鎖ＣＨ１定常領域のみをコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結され得る。
ＶＬ領域をコードする単離されたＤＮＡは、ＶＬをコードするＤＮＡを、軽鎖定常領域ＣＬをコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結することによって全長軽鎖遺伝子（及びＦａｂ軽鎖遺伝子）に変換され得る。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は、当該技術分野で公知であり（例えば、Ｋａｂａｔら、１９９１、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｕ．Ｓ． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１～３２４２を参照のこと）、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は、標準的なＰＣＲ増幅によって得ることができる。軽鎖定常領域は、カッパ又はラムダ定常領域であり得るが、ある特定の実施形態では、カッパ定常領域である。
本開示の抗α４β７抗体を発現させるために、上記のように得られた部分的又は全長の軽鎖及び重鎖をコードするＤＮＡは、遺伝子が転写及び翻訳制御配列に作動可能に連結されるように発現ベクターに挿入される。この文脈において、「作動可能に連結される」という用語は、ベクター内の転写及び翻訳制御配列が、抗体遺伝子の転写及び翻訳を調節するという意図された機能を果たすように、抗体遺伝子がベクターにライゲーションされることを意味することを意図する。発現ベクター及び発現制御配列は、使用される発現宿主細胞と適合するように選択される。抗体軽鎖遺伝子及び抗体重鎖遺伝子は、別個のベクターに挿入され得る又はより典型的には、両方の遺伝子は同じ発現ベクターに挿入される。
抗体遺伝子は、標準的な方法（例えば、抗体遺伝子断片及びベクター上の相補的制限部位のライゲーション、又は制限部位が存在しない場合、平滑末端ライゲーション）によって発現ベクターに挿入される。抗α４β７抗体に関連する軽鎖又は重鎖配列の挿入前に、発現ベクターは既に抗体定常領域配列を担持することができる。例えば、抗α４β７モノクローナル抗体に関連するＶＨ及びＶＬ配列を全長抗体遺伝子に変換する１つのアプローチは、それらを、既に重鎖定常領域及び軽鎖定常領域をそれぞれコードしている発現ベクターに挿入することであり、それによって、ＶＨセグメントは、ベクター内のＣＨセグメントに作動可能に連結され、ＶＬセグメントは、ベクター内のＣＬセグメントに作動可能に連結される。加えて又は代替として、組換え発現ベクターは、宿主細胞から抗体鎖の分泌を促進するシグナルペプチドをコードすることができる。シグナルペプチドが抗体鎖遺伝子のアミノ末端にインフレームで連結されるように、抗体鎖遺伝子はベクターにクローニングされ得る。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチド又は異種シグナルペプチド（すなわち、非免疫グロブリンタンパク質由来のシグナルペプチド）であり得る。
抗体鎖遺伝子に加えて、本開示の組換え発現ベクターは、宿主細胞における抗体鎖遺伝子の発現を制御する調節配列を担持する。「調節配列」という用語は、抗体鎖遺伝子の転写又は翻訳を制御するプロモーター、エンハンサー及び他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むことを意図する。
抗体鎖遺伝子及び調節配列に加えて、本開示の組換え発現ベクターは、宿主細胞におけるベクターの複製を調節する配列（例えば、複製起点）及び選択可能マーカー遺伝子などの追加の配列を担持することができる。選択可能マーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞の選択を容易にする。軽鎖及び重鎖の発現のために、重鎖及び軽鎖をコードする発現ベクターは、標準的な技術によって宿主細胞にトランスフェクトされる。「トランスフェクション」という用語の様々な形態は、外因性ＤＮＡを原核又は真核宿主細胞に導入するために一般的に使用されている多種多様な技術、例えば、電気穿孔、リポフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ－デキストラントランスフェクションなどを包含することを意図する。
原核又は真核宿主細胞のいずれかにおいて本開示の抗体を発現させることが可能である。ある特定の実施形態では、抗体の発現は、適切に折り畳まれ、免疫学的に活性な抗体を最適に分泌する、真核細胞、例えば、哺乳動物宿主細胞において実施される。本開示の組換え抗体を発現させるための例示的な哺乳動物宿主細胞には、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）（例えば、Ｋａｕｆｍａｎ及びＳｈａｒｐ、１９８２、Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １５９：６０１～６２１に記載されているＤＨＦＲ選択可能マーカーとともに使用されている、Ｕｒｌａｕｂ及びＣｈａｓｉｎ、１９８０、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７７：４２１６～４２２０に記載されているＤＨＦＲ－ ＣＨＯ細胞を含む）、ＮＳＯ骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞及びＳＰ２細胞が含まれる。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターが、哺乳動物宿主細胞に導入される場合、抗体は、宿主細胞における抗体の発現又は宿主細胞が成長する培養培地への抗体の分泌を可能にするのに十分な時間、宿主細胞を培養することによって産生される。抗体は、標準的なタンパク質精製法を使用して培養培地から回収され得る。宿主細胞はまた、Ｆａｂ断片又はｓｃＦｖ分子などの、インタクトな抗体の部分を産生するために使用され得る。上記の手順に対する変更は、本開示の範囲内であることが理解される。例えば、本開示の抗α４β７抗体の軽鎖又は重鎖のいずれか（しかし両方ではない）をコードするＤＮＡを宿主細胞にトランスフェクトすることが望ましい可能性がある。
組換えＤＮＡ技術はまた、ヒトα４β７への結合に必要ではない軽鎖及び重鎖のいずれか又は両方をコードするＤＮＡの一部又は全てを除去するために使用され得る。このような切断されたＤＮＡ分子から発現される分子も、本開示の抗体に包含される。
本開示の抗α４β７抗体の組換え発現のために、本開示の２つの発現ベクター、重鎖由来ポリペプチドをコードする第１のベクター及び軽鎖由来ポリペプチドをコードする第２のベクターを宿主細胞に同時トランスフェクトすることができる。２つのベクターは、同一の選択可能マーカーを含有することができる又はそれらは、別個の選択可能マーカーを各々含有することができる。代替として、重鎖及び軽鎖ポリペプチドの両方をコードする単一のベクターが使用され得る。
抗α４β７抗体の１つ以上の部分をコードするポリヌクレオチドが得られると、さらなる改変又は突然変異が、例えば、異なるＣＤＲ配列を有する抗体、Ｆｃ受容体に対する親和性が低下した抗体、又は異なるサブクラスの抗体をコードするポリヌクレオチドを生成するために、コード配列に導入され得る。
本開示の抗α４β７抗体はまた、化学合成によって、又は無細胞プラットフォームを使用することによって産生され得る。
６．５．抗α４β７抗体の精製
本開示のポリペプチドが、組換え発現によって産生されると、これは、タンパク質の精製のための当該技術分野で公知の任意の方法によって精製され得る。
本開示のポリペプチドが、組換え発現によって産生されると、これは、タンパク質の精製のための当該技術分野で公知の任意の方法によって精製され得る。
ポリペプチドは、単量体又は二量体として、例えば、２つのポリペプチドを含む抗α４β７抗体として精製され得る。
単離されると、抗α４β７抗体はさらに精製され得る。
６．６．使用方法
６．６．１．治療利益
本明細書に提供されているデータは、開示されている抗ヒトα４β７抗体が、α４β７に対する好ましい結合親和性、特異性及び効力、並びに初代免疫細胞に対する好ましい結合プロファイル、ＦｃγＲ結合、並びにヒトα４β７＋細胞に対するＡＤＣＣ及びＡＤＣＰ活性の欠如を示すことを実証している。これらの抗ヒトα４β７抗体は、実験室で成長させた異なるＨＩＶ株のビリオンにおけるα４β７及び患者のＨＩＶ試料からのα４β７に結合し、続いて免疫複合体を形成することが示された。これらの免疫複合体は、異なるＦｃγＲに結合することができ、食作用によってヒト単球細胞系ＴＨＰ－１に取り込まれる。これらの抗体はまた、α４β７と、ＭａｄＣＡＭ－１及びＨＩＶ ｇｐ１２０タンパク質などのそのリガンドとの相互作用を遮断する。したがって、抗α４β７抗体、結合断片及び／又はそれらを含む医薬組成物は、ＨＩＶ感染のウイルス抑制を誘導するため、又はＦｃ依存性機構及びＦａｂ依存性機構によってＨＩＶ感染対象におけるウイルス量を減少させるために治療的に使用され得る。一部の実施形態では、ＨＩＶ感染のウイルス抑制は、ＨＩＶウイルスの機能を低下させること、及び／又はＨＩＶウイルスの複製を低下させることを含む。
６．６．１．治療利益
本明細書に提供されているデータは、開示されている抗ヒトα４β７抗体が、α４β７に対する好ましい結合親和性、特異性及び効力、並びに初代免疫細胞に対する好ましい結合プロファイル、ＦｃγＲ結合、並びにヒトα４β７＋細胞に対するＡＤＣＣ及びＡＤＣＰ活性の欠如を示すことを実証している。これらの抗ヒトα４β７抗体は、実験室で成長させた異なるＨＩＶ株のビリオンにおけるα４β７及び患者のＨＩＶ試料からのα４β７に結合し、続いて免疫複合体を形成することが示された。これらの免疫複合体は、異なるＦｃγＲに結合することができ、食作用によってヒト単球細胞系ＴＨＰ－１に取り込まれる。これらの抗体はまた、α４β７と、ＭａｄＣＡＭ－１及びＨＩＶ ｇｐ１２０タンパク質などのそのリガンドとの相互作用を遮断する。したがって、抗α４β７抗体、結合断片及び／又はそれらを含む医薬組成物は、ＨＩＶ感染のウイルス抑制を誘導するため、又はＦｃ依存性機構及びＦａｂ依存性機構によってＨＩＶ感染対象におけるウイルス量を減少させるために治療的に使用され得る。一部の実施形態では、ＨＩＶ感染のウイルス抑制は、ＨＩＶウイルスの機能を低下させること、及び／又はＨＩＶウイルスの複製を低下させることを含む。
開示された抗ヒトα４β７抗体は、それを必要とする対象においてＨＩＶ感染を治療する方法に使用され得る。一部の実施形態では、この方法は、対象におけるウイルス量を減少させることを含む。一部の実施形態では、対象におけるウイルス量は、検出不可能なレベルまで減少する。一部の実施形態では、対象は、ＨＩＶに感染したヒト対象である。
一部の実施形態では、この方法は、治療利益をもたらすために、ＨＩＶ感染を有するヒト対象に、α４β７に拮抗する抗α４β７抗体を投与することを含む。一部の実施形態では、この方法は、ＨＩＶ感染を有するヒト対象に、ＨＩＶビリオンに結合する抗α４β７抗体を投与することを含む。一部の実施形態では、この方法は、免疫複合体を形成するために、ＨＩＶ感染を有するヒト対象に、ＨＩＶビリオンにおけるα４β７に結合する抗α４β７抗体を投与することを含む。一部の実施形態では、この方法は、ＨＩＶ感染を有するヒト対象に、ＨＩＶビリオンと免疫複合体を形成する抗α４β７抗体を投与することを含む。一部の実施形態では、これらの免疫複合体は、食作用によってＡＰＣによって取り込まれる。一部の実施形態では、この方法は、ＨＩＶ感染を有するヒト対象に、α４β７と、ＭａｄＣＡＭ－１などのそのリガンド及びＨＩＶ ｇｐ１２０との相互作用を遮断する抗α４β７抗体を投与することを含む。一部の実施形態では、この方法は、ＨＩＶ感染を有するヒト対象に、α４β７とＨＩＶ ｇｐ１２０との相互作用を遮断し、細胞間ＨＩＶ伝播を阻害する抗α４β７抗体を投与することを含む。一部の実施形態では、この方法は、ＨＩＶ感染を有するヒト対象に、ＭａｄＣＡＭ－１又はＨＩＶ ｇｐ１２０によって媒介されるＣＤ４ Ｔ細胞刺激を遮断する抗α４β７抗体を投与することを含む。一部の実施形態では、この方法は、ＨＩＶ感染を有するヒト対象に、ＭａｄＣＡＭ－１又はＨＩＶ ｇｐ１２０によって共刺激されたＣＤ４ Ｔ細胞におけるＨＩＶ複製を抑制する抗α４β７抗体を投与することを含む。一部の実施形態では、この方法は、ＨＩＶ感染を有するヒト対象に、ＨＩＶ複製のウイルス抑制を誘導する抗α４β７抗体を投与することを含む。一部の実施形態では、この方法は、ＨＩＶ感染を有するヒト対象に、免疫媒介性のＨＩＶ抑制を誘導する抗α４β７抗体を投与することを含む。
６．７．配列表の説明
組み込まれた配列表に開示された配列及びそれらの簡単な説明の相関関係を表７に示す。
組み込まれた配列表に開示された配列及びそれらの簡単な説明の相関関係を表７に示す。
以下の実施例は、本明細書に記載される抗体及び結合断片の例示的実施形態のある特定の特色及び特性を強調しているが、限定ではなく説明目的で提供される。
抗体
Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴ、陽性対照及びアイソタイプコントロールを含む実施例を通して使用される抗体は表８に収載されている。
Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴ、陽性対照及びアイソタイプコントロールを含む実施例を通して使用される抗体は表８に収載されている。
統計
半数阻害濃度（ＩＣ５０）及び半数効果濃度（ＥＣ５０）値は、グラフパッドプリズムを使用して濃度応答曲線の非線形回帰解析により決定した。比較の有意性は、マン・ホイットニー両側検定により決定した。注記されたものを除いて、すべての値は、少なくとも３つの独立した実験結果の平均又は標準偏差であった。
半数阻害濃度（ＩＣ５０）及び半数効果濃度（ＥＣ５０）値は、グラフパッドプリズムを使用して濃度応答曲線の非線形回帰解析により決定した。比較の有意性は、マン・ホイットニー両側検定により決定した。注記されたものを除いて、すべての値は、少なくとも３つの独立した実験結果の平均又は標準偏差であった。
［実施例１］
７．１．抗ヒトα４β７抗体の産生
７．１．１．ハイブリドーマスクリーニング
ハイブリドーマベースの技法を利用して、マウス抗ヒトα４β７抗体の最初のパネルを産生した。マウスは、アジュバンドに加えてヒトα４β７を発現するＨＥＫ２９３、ＣＨＯ－Ｋ１又はＢａＦ３組換え細胞を用いて免疫した。候補ハイブリドーマ由来抗体の選択は、表９の基準に基づいた。
７．１．抗ヒトα４β７抗体の産生
７．１．１．ハイブリドーマスクリーニング
ハイブリドーマベースの技法を利用して、マウス抗ヒトα４β７抗体の最初のパネルを産生した。マウスは、アジュバンドに加えてヒトα４β７を発現するＨＥＫ２９３、ＣＨＯ－Ｋ１又はＢａＦ３組換え細胞を用いて免疫した。候補ハイブリドーマ由来抗体の選択は、表９の基準に基づいた。
機能的ハイブリドーマｍＡｂのパネルはこの選別から同定され、すべての候補が好ましいプロファイルを示した。しかし、齧歯動物交差反応性を有するものはなく、これは、１）ヒトα４／β７がカニクイザルα４／β７に対し９６％／９７％アミノ酸配列相同性を有するが、ラット及びマウスα４／β７に対しては８４％／８５％配列相同性しかないこと；及び２）すべての選択された機能的ハイブリドーマｍＡｂはα４β７に対し高度に選択的であり、α４β７ヘテロ二量体上の立体構造的エピトープに結合しうることにより説明しうる。
７．１．２．抗体特性評価
２００～３００ｍｌローラーボトル培養及びプロテインＡ親和性精製による小規模の抗体産生は、サブクローニングされた安定なハイブリドーマ細胞系で実施した。ｍＡｂの純度は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及び質量分析により確かめられた。精製された抗体は、アイソフォーム及び種交差反応性を決定するため、結合及び機能アッセイを通じて特性評価した。
２００～３００ｍｌローラーボトル培養及びプロテインＡ親和性精製による小規模の抗体産生は、サブクローニングされた安定なハイブリドーマ細胞系で実施した。ｍＡｂの純度は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及び質量分析により確かめられた。精製された抗体は、アイソフォーム及び種交差反応性を決定するため、結合及び機能アッセイを通じて特性評価した。
結合スクリーニング
精製された抗体は、ＢａＦ３－ｈα４β７、ＢａＦ３－ｈαＥβ７、ＢａＦ３－ｃαＥβ７、ＢａＦ３、ＣＨＯＫ１－ｃα４β７、ＣＨＯＫ１－ｍα４β７及びＣＨＯＫ１－ｈα４β１細胞系を１μｇ／ｍｌの濃度で用いてＦＡＣＳによりアイソフォーム及び種交差反応性について特性評価した。例示的ｍＡｂ Ａｂ－ｍ１のＦＡＣＳプロファイルを含む、ＦＡＣＳプロファイルは表１０にまとめられている。
精製された抗体は、ＢａＦ３－ｈα４β７、ＢａＦ３－ｈαＥβ７、ＢａＦ３－ｃαＥβ７、ＢａＦ３、ＣＨＯＫ１－ｃα４β７、ＣＨＯＫ１－ｍα４β７及びＣＨＯＫ１－ｈα４β１細胞系を１μｇ／ｍｌの濃度で用いてＦＡＣＳによりアイソフォーム及び種交差反応性について特性評価した。例示的ｍＡｂ Ａｂ－ｍ１のＦＡＣＳプロファイルを含む、ＦＡＣＳプロファイルは表１０にまとめられている。
機能的検証
精製された抗体は、ＨｕＴ７８細胞におけるＭａｄＣＡＭ－１への接着アッセイにより特性評価した。Ａｂ－ｍ１は、ＭａｄＣＡＭ－１アッセイにおいて潜在的な遮断効力を示し、したがって、機能的に検証した。Ａｂ－ｍ１についての３つの独立した実験のデータは表１１にまとめられている。代表的なデータは図１に示されている。
精製された抗体は、ＨｕＴ７８細胞におけるＭａｄＣＡＭ－１への接着アッセイにより特性評価した。Ａｂ－ｍ１は、ＭａｄＣＡＭ－１アッセイにおいて潜在的な遮断効力を示し、したがって、機能的に検証した。Ａｂ－ｍ１についての３つの独立した実験のデータは表１１にまとめられている。代表的なデータは図１に示されている。
機能的特性評価
Ａｂ－ｍ１のさらなる機能的特性評価は、カニクイザル交差反応性について調べるため、ＣＨＯＫ１－ｃα４β７においてＭａｄＣＡＭ－１への接着アッセイを使用して実施した。ＣＨＯＫ１－ｃα４β７での接着アッセイデータは上の表１１にまとめられている。代表的なデータは図２に示されている。
Ａｂ－ｍ１のさらなる機能的特性評価は、カニクイザル交差反応性について調べるため、ＣＨＯＫ１－ｃα４β７においてＭａｄＣＡＭ－１への接着アッセイを使用して実施した。ＣＨＯＫ１－ｃα４β７での接着アッセイデータは上の表１１にまとめられている。代表的なデータは図２に示されている。
ヒトα４β７へのＡｂ－ｍ１結合の親和性を決定するため、ＢａＦ３－ｈα４β７においてＦＡＣＳベースの滴定を実施した。ＥＣ５０が決定され、表１２にまとめられている。
エピトープビニングは、表１３に示される５０×過剰な非標識Ａｂの存在下でＡｌｅｘａ４８８フルオロフォアにコンジュゲートされたコンパレータ抗体を使用して競合的ＦＡＣＳにより実施した。Ａｂ－ｍ１は、非標識ＡｂによるＡｌｅｘａ４８８標識Ａｂの結合阻害のパーセンテージに基づいてベドリズマブ（Ａｂ－Ｖｅｄｏ）様グループに属すると特性評価した（表１３）。
候補プロファイリング
ヒトα４β７へのｍＡｂ結合の親和性は、一次ヒトＣＤ４＋メモリーＴ細胞において確かめた。Ａｂ－ｍｌは、一次ヒトＣＤ４＋メモリーＴ細胞へのヒトＭａｄＣＡＭ－１結合を高効力（ＩＣ５０＝６３．７ｐＭ、最大阻害１００％、図３）で遮断することもできた。
ヒトα４β７へのｍＡｂ結合の親和性は、一次ヒトＣＤ４＋メモリーＴ細胞において確かめた。Ａｂ－ｍｌは、一次ヒトＣＤ４＋メモリーＴ細胞へのヒトＭａｄＣＡＭ－１結合を高効力（ＩＣ５０＝６３．７ｐＭ、最大阻害１００％、図３）で遮断することもできた。
７．１．３．ＶＨ／ＶＬシーケンシング、キメラ抗体産生及び特性評価
ハイブリドーマクローンは回収され、完全ハイブリドーマ培養培地（１０％ＦＢＳを有するＤＭＥＭ）において増大した。細胞は、室温で５分間、１０００ｒｐｍでの遠心分離により収集し、ＰＢＳ、ｐＨ７．４を用いて２回洗浄した。ＲＮＡは、Ｔｒｉｚｏｌを用いて細胞ペレット（おおよそ１×１０７細胞）から抽出した。
ハイブリドーマクローンは回収され、完全ハイブリドーマ培養培地（１０％ＦＢＳを有するＤＭＥＭ）において増大した。細胞は、室温で５分間、１０００ｒｐｍでの遠心分離により収集し、ＰＢＳ、ｐＨ７．４を用いて２回洗浄した。ＲＮＡは、Ｔｒｉｚｏｌを用いて細胞ペレット（おおよそ１×１０７細胞）から抽出した。
抗体ＶＨ及びＶＬ断片は、マウスＩｇプライマーセット（Ｎｏｖａｇｅｎ、６９８３１－３）を使用してＲＴ－ＰＣＲにより、そのハイブリドーマ全ＲＮＡから別々に増幅した。適切なサイズの陽性ＰＣＲ産物は、ＶＨ及びＶＬ領域のシーケンシング及び同定のためにＴベクターに挿入した（表１４）。完全長抗体配列は、ＶＨ／ＶＬ配列と理論的定常領域配列との組合せを使用して構築した。
プライマー設計後、ＶＨ／ＶＬは個々に増幅させ、発現ベクター中にクローニングして、相同組換えを経てキメラ抗体構築物を作製した。ＶＨ及びＶＬにおけるＣＤＲのアミノ酸配列は表１４に示されている。
キメラ抗体は、ＨＥＫ２９３細胞において一過性トランスフェクションにより産生した。発現後、タンパク質は精製された。キメラ抗体についての高パーセンテージ単量体はＳＥＣ－ＨＰＬＣにより確かめた。
Ａｂ－ｃ１は、Ａｂ－ｍ１の可変領域及びヒトＩｇＧ１／κ定常領域を有するキメラ抗体である。ヒト一次ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞へのＡｂ－ｃ１結合の親和性はＦＡＣＳにより決定され、１つの代表的なヒト全血から、３．９ｐＭの結合ＥＣ５０値であった（図４及び表１５に示される）。ＭａｄＣＡＭ－１へのα４β７インテグリン結合を遮断するＡｂ－ｃ１の能力は、ＨｕＴ７８細胞及びＣＨＯＫ１－ｃα４β７細胞でも評価した（表１５）。
精製されたキメラ抗体Ａｂ－ｃ１は、その結合特異性及びカニクイザル交差反応性を確かめるため、ＢａＦ３－ｈα４β７、ＢａＦ３－ｈαＥβ７、ＢａＦ３－ｃαＥβ７、ＢａＦ３、ＣＨＯＫ１－ｃα４β７及びＣＨＯＫ１－ｈα４β１細胞系を１つの濃度（１μｇ／ｍｌ）で用いてＦＡＣＳによりさらに特性評価した。試験したキメラのＦＡＣＳプロファイルは図１６にまとめられている。
ＨｕＴ７８を使用して、キメラＡｂ－ｃ１が、ｈα４β７インテグリンへのＭａｄＣＡＭ－１媒介接着を遮断することができるかどうかを調べた。表１７に示されるように、Ａｂ－ｃ１は、ＭａｄＣＡＭ－１へのＨｕＴ７８細胞接着を阻害する能力を示している。
ＣＨＯＫ１－ｃα４β７を使用して、キメラ抗体が、ｃα４β７へのＭａｄＣＡＭ－１媒介接着を阻害できるかどうかを調べた。表１７に示されるように、Ａｂ－ｃ１は、ＭａｄＣＡＭ－１へのＣＨＯＫ１－ｃα４β７細胞接着を阻害する能力を示している。
７．１．４．ヒト化
抗体Ａｂ－ｍ１は、ＨｕＴ７８細胞とヒト一次ＣＤ４＋Ｔメモリー細胞の両方での結合及び効力、カニクイザル交差反応性、ＣＤＲ配列多様性、結合選択性、配列ライアビリティー（すなわち、グリコシル化）及びエピトープ群に基づいて選択された。指定の特徴については表１８を参照のこと。
抗体Ａｂ－ｍ１は、ＨｕＴ７８細胞とヒト一次ＣＤ４＋Ｔメモリー細胞の両方での結合及び効力、カニクイザル交差反応性、ＣＤＲ配列多様性、結合選択性、配列ライアビリティー（すなわち、グリコシル化）及びエピトープ群に基づいて選択された。指定の特徴については表１８を参照のこと。
ヒト化抗体は、表１９に従ってＶＨ及びＶＬ断片を組み立て、ヒトＩｇＧ１及びカッパ定常領域を組み込むことから設計された。
これらのヒト化抗α４β７ｍＡｂは産生され、十分な発現を有し、ＳＥＣにより＞９５％単量体を示した。同一性はＭＳにより確かめられ、ヒト化抗α４β７の安定性はＤＳＣにより測定された。ヒト化Ａｂ－ｈ１の４種は、ＭａｄＣＡＭ－１媒介ＨｕＴ７８細胞接着を遮断するその能力について評価され、そのすべてが、１桁の数字又は低い２桁のｐＭ範囲のＩＣ５０値を有する強い効力を示した（表２０）。
７．１．５．Ａｂ－ｈ１．９のライアビリティー操作
抗体Ａｂ－ｈ１．９は、脱アミド化、異性化、酸化、グリコシル化、加水分解及び切断に関して減少した化学的ライアビリティーを有するバリアントＶＨ及びＶＬ鎖を産生するために選択された。
抗体Ａｂ－ｈ１．９は、脱アミド化、異性化、酸化、グリコシル化、加水分解及び切断に関して減少した化学的ライアビリティーを有するバリアントＶＨ及びＶＬ鎖を産生するために選択された。
Ａｂ－ｈ１．９ＶＨの配列は：
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＦＮＩＫＮＴＹＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＲＩＤＰＡＮＧＨＴＥＹＡＰＫＦＱＧＲＶＴＩＴＡＤＥＳＴＮＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＹＹＶＤＳＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ（配列番号２３）であり、
Ａｂ－ｈ１．９ＶＬの配列は：
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＨＡＳＱＧＩＳＤＮＩＧＷＬＱＱＫＰＧＫＳＦＫＬＬＩＹＨＧＴＮＬＥＤＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＶＱＹＡＱＦＰＷＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲ（配列番号２８）であり、
選択されたライアビリティー突然変異部位は下線が引かれ、ＣＤＲは太字である。ライアビリティーはＶＨ－ＣＤＲ２、ＶＨ－ＣＤＲ３及びＶＬ－ＣＤＲ１に存在している。
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＦＮＩＫＮＴＹＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＲＩＤＰＡＮＧＨＴＥＹＡＰＫＦＱＧＲＶＴＩＴＡＤＥＳＴＮＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＹＹＶＤＳＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ（配列番号２３）であり、
Ａｂ－ｈ１．９ＶＬの配列は：
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＨＡＳＱＧＩＳＤＮＩＧＷＬＱＱＫＰＧＫＳＦＫＬＬＩＹＨＧＴＮＬＥＤＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＶＱＹＡＱＦＰＷＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲ（配列番号２８）であり、
選択されたライアビリティー突然変異部位は下線が引かれ、ＣＤＲは太字である。ライアビリティーはＶＨ－ＣＤＲ２、ＶＨ－ＣＤＲ３及びＶＬ－ＣＤＲ１に存在している。
ビオチン化ヒトα４β７細胞外ドメインタンパク質を使用する２ラウンドのライアビリティーフリー抗α４β７クローン選択が実施された。それぞれのライブラリーからのコロニーは配列決定され、いずれかのＣＤＲに追加のライアビリティーを有するコロニーは取り除かれた。それぞれのライブラリーからのクローンは、親Ａｂ－ｈ１．９と比べて、酵母上の表面α４β７抗原への結合についてＦＡＣＳによりスクリーニングした。
親と類似した形で結合すると同定されたライアビリティー操作クローン（図５）は表２１に提示されている。これらのライアビリティー操作クローンはその可変領域と一緒にＩｇＧフォーマットに変換された。
Ａｂ－ｈ１．９ｅを通したライアビリティー操作ｍＡｂ Ａｂ－ｈ１．９ａは、ＦＡＣＳによりα４β７発現ＨｕＴ７８細胞への結合について試験した。これらの抗体は結合活性を保持しており、２５３ｐＭ～７０２ｐＭに及ぶＥＣ５０値を有していた。ＶＨ－ＣＤＲ３の大部分（例えば、ＣＤＲ中のアミノ酸残基の３分の１）がライアビリティー操作ｍＡｂでは突然変異していたことを考慮すると、α４β７結合のこの保持は驚きであった。Ａｂ－ｈ１．９ｄは、最も強力な結合親和性（２５３ｐＭ）を示し、良好な薬物様特性を見せた。
ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ ＬＡＬＡフォーマットにおける抗体Ａｂ－ｈ１．９（ａ）～（ｅ）のタンパク質産生特性も試験し、Ａｂ－ｈ１．９ｄが優れた特性を示した。
７．１．６．抗体
例示的Ａｂ－ｈ１．９ｄ由来ＩｇＧ１抗体変換は表２２に示されている。Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＨｕＩｇＧ１は、カノニカルヒト重鎖定常領域を特徴とする配列番号９０のＨＣ、及びカノニカルヒトカッパ軽鎖定常領域を特徴とする配列番号１００のＬＣを有するヒトＩｇＧ１／カッパ型抗体である。Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＨｕＩｇＧ１は、配列番号９１のＣ末端リシン切断型ＨＣも有する場合がある。Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴは、バリアントＣＨ３置換Ｄ３５６Ｅ及びＬ３５８Ｍを特徴とする配列番号９２のＨＣ、及び配列番号１００のＬＣを有するＩｇＧ１／カッパ型抗体である。Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴは、配列番号９３のＣ末端リシン切断型ＨＣも有する場合がある。Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＬＡＬＡは、バリアントＣＨ２置換Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ及びバリアントＣＨ３置換Ｄ３５６Ｅ及びＬ３５８Ｍを特徴とする配列番号９４のＨＣ、並びに配列番号１００のＬＣを有するＩｇＧ１／カッパ型抗体である。Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＬＡＬＡは、配列番号９５のＣ末端リシン切断型ＨＣも有する場合がある。Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＱＬは、バリアントＣＨ２置換Ｔ２５０Ｑ、及びバリアントＣＨ３置換Ｄ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ及びＭ４２８Ｌを特徴とする配列番号９６のＨＣ、並びに配列番号１００のＬＣを有するＩｇＧ１／カッパ型抗体である。Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＱＬは、配列番号９７のＣ末端リシン切断型ＨＣも有する場合がある。Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＬＡＬＡ／ＱＬは、バリアントＣＨ２置換Ｔ２５０Ｑ、及びバリアントＣＨ３置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｄ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ及びＭ４２８Ｌを特徴とする配列番号９８のＨＣ、並びに配列番号１００のＬＣを有するＩｇＧ１／カッパ型抗体である。Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＬＡＬＡ／ＱＬは、配列番号９９のＣ末端リシン切断型ＨＣも有する場合がある。
例示的Ａｂ－ｈ１．９ｄ由来ＩｇＧ１抗体変換は表２２に示されている。Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＨｕＩｇＧ１は、カノニカルヒト重鎖定常領域を特徴とする配列番号９０のＨＣ、及びカノニカルヒトカッパ軽鎖定常領域を特徴とする配列番号１００のＬＣを有するヒトＩｇＧ１／カッパ型抗体である。Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＨｕＩｇＧ１は、配列番号９１のＣ末端リシン切断型ＨＣも有する場合がある。Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴは、バリアントＣＨ３置換Ｄ３５６Ｅ及びＬ３５８Ｍを特徴とする配列番号９２のＨＣ、及び配列番号１００のＬＣを有するＩｇＧ１／カッパ型抗体である。Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴは、配列番号９３のＣ末端リシン切断型ＨＣも有する場合がある。Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＬＡＬＡは、バリアントＣＨ２置換Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ及びバリアントＣＨ３置換Ｄ３５６Ｅ及びＬ３５８Ｍを特徴とする配列番号９４のＨＣ、並びに配列番号１００のＬＣを有するＩｇＧ１／カッパ型抗体である。Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＬＡＬＡは、配列番号９５のＣ末端リシン切断型ＨＣも有する場合がある。Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＱＬは、バリアントＣＨ２置換Ｔ２５０Ｑ、及びバリアントＣＨ３置換Ｄ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ及びＭ４２８Ｌを特徴とする配列番号９６のＨＣ、並びに配列番号１００のＬＣを有するＩｇＧ１／カッパ型抗体である。Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＱＬは、配列番号９７のＣ末端リシン切断型ＨＣも有する場合がある。Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＬＡＬＡ／ＱＬは、バリアントＣＨ２置換Ｔ２５０Ｑ、及びバリアントＣＨ３置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｄ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ及びＭ４２８Ｌを特徴とする配列番号９８のＨＣ、並びに配列番号１００のＬＣを有するＩｇＧ１／カッパ型抗体である。Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＬＡＬＡ／ＱＬは、配列番号９９のＣ末端リシン切断型ＨＣも有する場合がある。
産生後、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴは、抗ヒトα４β７抗体では優れた特性を示し、高特異性（α４β７への低結合）及び望ましいＰＫ／ＰＤ（低ＡＤＡ）力価及び高プラズマ曝露）を実証した。
［実施例２］
７．２．健康なドナー又はＨＩＶ＋個人由来のＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞サブセット上でのα４β７発現
７．２．１．材料及び方法
急性ＨＩＶ感染の間、α４β７発現ＣＤ４＋Ｔ細胞は優先的に感染し、したがって、枯渇する（Ｓｉｖｒｏら、Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ２０１８年）。末梢α４β７発現がｃＡＲＴを受けているＨＩＶ＋個人において時間とともに回復するかどうかを調べるため、１０人の健康な（ＨＩＶ－）ドナー及び４５人のｃＡＲＴを受けているＨＩＶ＋個人（年齢：２６～６６歳、中央値４２歳；ＨＩＶ感染期間：１～３６歳、中央値１２歳）のＰＢＭＣ由来のＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞サブセット上でのα４β７のパーセンテージ及び発現レベルを、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＣＲ７及びα４β７についての抗体のカクテルを使用してフローサイトメトリー分析により比較した。ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞集団におけるα４β７のパーセンテージ（％）と発現レベル（ＭＥＳＦ）の両方を分析した。ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットは、ＣＤ２８＋ＣＤ４５ＲＯ－ナイーブ細胞、ＣＤ２８－ＣＤ４５ＲＯ－ターミナルエフェクター細胞、ＣＤ２８－ＣＤ４５ＲＯ＋エフェクターメモリー細胞、ＣＤ２８＋ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＣＲ７＋セントラルメモリー細胞及びＣＤ２８＋ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＣＲ７－トランジエントメモリー細胞と定義された。
７．２．健康なドナー又はＨＩＶ＋個人由来のＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞サブセット上でのα４β７発現
７．２．１．材料及び方法
急性ＨＩＶ感染の間、α４β７発現ＣＤ４＋Ｔ細胞は優先的に感染し、したがって、枯渇する（Ｓｉｖｒｏら、Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ２０１８年）。末梢α４β７発現がｃＡＲＴを受けているＨＩＶ＋個人において時間とともに回復するかどうかを調べるため、１０人の健康な（ＨＩＶ－）ドナー及び４５人のｃＡＲＴを受けているＨＩＶ＋個人（年齢：２６～６６歳、中央値４２歳；ＨＩＶ感染期間：１～３６歳、中央値１２歳）のＰＢＭＣ由来のＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞サブセット上でのα４β７のパーセンテージ及び発現レベルを、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＣＲ７及びα４β７についての抗体のカクテルを使用してフローサイトメトリー分析により比較した。ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞集団におけるα４β７のパーセンテージ（％）と発現レベル（ＭＥＳＦ）の両方を分析した。ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットは、ＣＤ２８＋ＣＤ４５ＲＯ－ナイーブ細胞、ＣＤ２８－ＣＤ４５ＲＯ－ターミナルエフェクター細胞、ＣＤ２８－ＣＤ４５ＲＯ＋エフェクターメモリー細胞、ＣＤ２８＋ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＣＲ７＋セントラルメモリー細胞及びＣＤ２８＋ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＣＲ７－トランジエントメモリー細胞と定義された。
７．２．２．結果
ＨＩＶ－及びｃＡＲＴを受けているＨＩＶ＋個人の両方で、α４β７を発現している細胞のパーセンテージはメモリーＴ細胞サブセットと比べるとナイーブＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞ではより高く、α４β７発現レベル（ＭＥＳＦにより測定した場合）は、ナイーブ細胞よりもセントラルメモリー、トランジエントメモリー及びエフェクターメモリー細胞上のほうが高かった（図６Ａ～６Ｆ）。末梢ＣＤ４＋とＣＤ８＋Ｔ細胞の両方が、ＨＩＶ－及びＨＩＶ＋個人において類似するレベルのα４β７を発現した（ＭＥＳＦ測定）。この分析は、ｃＡＲＴを受けているＨＩＶ＋個人間の末梢ＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞上でのα４β７発現は、高度に変わりやすいが、非感染個人の末梢ＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞上でのα４β７発現と違ってはいないことを示した。これらの結果は、ＨＩＶ＋個人間の末梢ＣＤ４＋Ｔ細胞でのα４β７発現が、出芽ＨＩＶビリオン中へのα４β７の組込みを支援できることを示唆していた。
ＨＩＶ－及びｃＡＲＴを受けているＨＩＶ＋個人の両方で、α４β７を発現している細胞のパーセンテージはメモリーＴ細胞サブセットと比べるとナイーブＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞ではより高く、α４β７発現レベル（ＭＥＳＦにより測定した場合）は、ナイーブ細胞よりもセントラルメモリー、トランジエントメモリー及びエフェクターメモリー細胞上のほうが高かった（図６Ａ～６Ｆ）。末梢ＣＤ４＋とＣＤ８＋Ｔ細胞の両方が、ＨＩＶ－及びＨＩＶ＋個人において類似するレベルのα４β７を発現した（ＭＥＳＦ測定）。この分析は、ｃＡＲＴを受けているＨＩＶ＋個人間の末梢ＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞上でのα４β７発現は、高度に変わりやすいが、非感染個人の末梢ＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞上でのα４β７発現と違ってはいないことを示した。これらの結果は、ＨＩＶ＋個人間の末梢ＣＤ４＋Ｔ細胞でのα４β７発現が、出芽ＨＩＶビリオン中へのα４β７の組込みを支援できることを示唆していた。
［実施例３］
７．３．Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴでのＨＩＶビリオン補足
７．３．１．材料及び方法
α４β７がＨＩＶビリオンのエンベロープに存在することを確かめるため、及びＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴがＨＩＶビリオンのエンベロープ中に組み込まれたα４β７に結合して免疫複合体を形成することができるかどうかを試験するため、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴを、実験室生育ＨＩＶ－１株又は公表された方法（Ｇｕｚｚｏら、Ｓｃｉ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０１７年）に従ってウイルス血症ＨＩＶ＋個人由来の試料を使用してビリオン補足アッセイ（ビーズフォーマット）において先ず試験した。実験室生育ＨＩＶ－１株では、異なる群、遺伝子サブタイプ、及び共受容体使用を表す６種の株（ＢＣＦ０６、ＣＭＵ０８、ＮＬ４－３、ＲＵ５０７、ＹＢＦ３０及びＩＩＩＢ）（表２３）は、細胞においてα４βの発現を誘導するレチノイン酸（ＲＡ）の存在下、活性化された一次ヒトＰＢＭＣ［例えば、ＯＫＴ３抗体又はフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）により活性化される］で作製した。プロテインＧコンジュゲート免疫磁気ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）は、適切な抗体を装備され、次にそれぞれのＨＩＶ株のウイルスストック（約２ｎｇ ｐ２４ｇａｇ／反応）と一緒にインキュベートした。インキュベーション後、装備されたビーズは洗浄されて未結合ウイルス粒子を取り除き、それに続いてＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で処置して、ｐ２４ｇａｇ定量化のため補足されたビリオンを溶解した。ＨＩＶ患者の試料では、試料のウイルス力価（コピー／ｍＬ）は、ＣＯＢＡＳ Ｔａｑｍａｎ ２．０アッセイにより決定した。１０μｇの適切な抗体を装備されたプロテインＧコンジュゲート免疫磁気ビーズを、４００μＬの患者血清と一緒に２時間インキュベートした。次に、ビーズを洗浄して未結合ウイルス粒子を取り除き、結合したビリオンのＲＮＡは引き続いてＱｉａｇｅｎのウイルスＲＮＡ抽出キットを製造業者の説明書によって使用して抽出した。患者の試料から補足されたビリオンのコピー数は、引き続いて、ＨＩＶサブタイプＢではＬＴＲ－ｇａｇにおける保存された領域を標的にするプライマー及びプローブを使用してデジタルドロプレットＰＣＲにより定量化した。
７．３．Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴでのＨＩＶビリオン補足
７．３．１．材料及び方法
α４β７がＨＩＶビリオンのエンベロープに存在することを確かめるため、及びＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴがＨＩＶビリオンのエンベロープ中に組み込まれたα４β７に結合して免疫複合体を形成することができるかどうかを試験するため、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴを、実験室生育ＨＩＶ－１株又は公表された方法（Ｇｕｚｚｏら、Ｓｃｉ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０１７年）に従ってウイルス血症ＨＩＶ＋個人由来の試料を使用してビリオン補足アッセイ（ビーズフォーマット）において先ず試験した。実験室生育ＨＩＶ－１株では、異なる群、遺伝子サブタイプ、及び共受容体使用を表す６種の株（ＢＣＦ０６、ＣＭＵ０８、ＮＬ４－３、ＲＵ５０７、ＹＢＦ３０及びＩＩＩＢ）（表２３）は、細胞においてα４βの発現を誘導するレチノイン酸（ＲＡ）の存在下、活性化された一次ヒトＰＢＭＣ［例えば、ＯＫＴ３抗体又はフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）により活性化される］で作製した。プロテインＧコンジュゲート免疫磁気ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）は、適切な抗体を装備され、次にそれぞれのＨＩＶ株のウイルスストック（約２ｎｇ ｐ２４ｇａｇ／反応）と一緒にインキュベートした。インキュベーション後、装備されたビーズは洗浄されて未結合ウイルス粒子を取り除き、それに続いてＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で処置して、ｐ２４ｇａｇ定量化のため補足されたビリオンを溶解した。ＨＩＶ患者の試料では、試料のウイルス力価（コピー／ｍＬ）は、ＣＯＢＡＳ Ｔａｑｍａｎ ２．０アッセイにより決定した。１０μｇの適切な抗体を装備されたプロテインＧコンジュゲート免疫磁気ビーズを、４００μＬの患者血清と一緒に２時間インキュベートした。次に、ビーズを洗浄して未結合ウイルス粒子を取り除き、結合したビリオンのＲＮＡは引き続いてＱｉａｇｅｎのウイルスＲＮＡ抽出キットを製造業者の説明書によって使用して抽出した。患者の試料から補足されたビリオンのコピー数は、引き続いて、ＨＩＶサブタイプＢではＬＴＲ－ｇａｇにおける保存された領域を標的にするプライマー及びプローブを使用してデジタルドロプレットＰＣＲにより定量化した。
ＨＩＶビリオンを補足するための抗体のＥＣ５０値を決定するため、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴを、９６ウェルプレーフォーマットに改造されたビリオン補足アッセイにおいて試験した。段階希釈された抗体を予洗されたＰｉｅｒｃｅＴＭタンパク質Ｇ被覆プレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）に添加した。インキュベーション後、プレートを洗浄して未結合抗体を取り除いた。それぞれのＨＩＶ株のウイルスストック（おおよそ２ｎｇ ｐ２４ ｇａｇ）をそれぞれのウェルに添加してインキュベートした。プレートを洗浄して未結合ウイルス粒子を取り除き、次に、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で処置して、ｐ２４ ｇａｇ定量化のために補足されたビリオンを溶解した。ＨＩＶ ｐ２４ ｇａｇは、高感度ＡｌｐｈａＬＩＳＡ ｐ２４ ｇａｇ検出キット（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）により検出した。
７．３．２．結果
Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴは、臨床株であれ実験室適応株であれ、補足されたビリオン中のウイルスｐ２４ ｇａｇタンパク質により示されるように、試験された６種の実験室生育ＨＩＶ株すべてからビリオンを補足することができた（図７Ａ～７Ｆ）。補足されたビリオン由来のｐ２４ ｇａｇタンパク質の量は、アッセイにおいて使用された抗体濃度（５及び１５ｎＭ）への用量応答を実証した。陰性対照抗体と反応した試料と比べてＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴと反応した試料中のＨＩＶ ＲＮＡコピー数の数が多いことにより示されるように（図７Ｇ－２）、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴは、ＨＩＶ－１患者の試料からもビリオンを補足することができた（図７Ｇ－１に示されるウイルス入力）。
Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴは、臨床株であれ実験室適応株であれ、補足されたビリオン中のウイルスｐ２４ ｇａｇタンパク質により示されるように、試験された６種の実験室生育ＨＩＶ株すべてからビリオンを補足することができた（図７Ａ～７Ｆ）。補足されたビリオン由来のｐ２４ ｇａｇタンパク質の量は、アッセイにおいて使用された抗体濃度（５及び１５ｎＭ）への用量応答を実証した。陰性対照抗体と反応した試料と比べてＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴと反応した試料中のＨＩＶ ＲＮＡコピー数の数が多いことにより示されるように（図７Ｇ－２）、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴは、ＨＩＶ－１患者の試料からもビリオンを補足することができた（図７Ｇ－１に示されるウイルス入力）。
Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴは、ＨＩＶビリオンを補足するためのそのＥＣ５０値を決定するため、次に９６ウェルプレーフォーマットに適合されたビリオン補足アッセイにおいて試験した。ＥＣ５０値は試験されたすべてのウイルスについて類似しており、０．１２ｎＭ（０．０１９μｇ／ｍＬ）～０．２５ｎＭ（０．０３８μｇ／ｍＬ）に及んだ（表２３）。同じパネルのウイルスに対して試験された場合、Ａｂ－ＶｅｄｏはＨＩＶビリオンを補足するのにＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴほど強力ではなく、ＥＣ５０値はそれぞれ個々のウイルスについてＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴのＥＣ５０値の約２～３倍であった（表２３）。ＨＩＶ ＩＩＩＢ株は、ビーズフォーマットアッセイを使用してＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴ（図７Ｆ）及びＡｂ－Ｖｅｄｏ（データは示さず）により補足することができたが、そのＥＣ５０値はウイルスストックの低力価のせいでプレートフォーマットアッセイにより決めることはできなかった。
まとめると、これらのデータにより、試験されたすべての実験室生育ＨＩＶ株及びＨＩＶ－１患者の試料のビリオンにはα４β７が存在することが確かめられ、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴが、耐久性のあるＨＩＶウイルス制御のための提唱された「予防接種効果」の誘導に必要な一連のステップの第一歩である、免疫複合体を形成するＨＩＶビリオン上のα４β７への結合ではＡｂ－Ｖｅｄｏよりも強力であることが実証された。
Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴは、試験されたすべてのＨＩＶ株及びＨＩＶ－１患者の試料のビリオンのエンベロープ上のα４β７に結合できる強力な抗α４β７抗体である。
［実施例４］
７．４．Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴとＨＩＶビリオンの免疫複合体のＦｃγＲへの結合
７．４．１．材料及び方法
Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴとＨＩＶビリオンにより形成される免疫複合体がｉｎ ｖｉｔｒｏでＦｃγＲに結合できるかどうかを試験するため、適切な抗体を先ずＨＩＶ ＮＬ４－３ウイルス（α４β７の発現を誘導するようにＲＡの存在下で活性化されたヒトＰＢＭＣにおいて調製された）と混合して免疫複合体を形成させ、この複合体を、引き続いて、ニッケル被覆プレート上に固定化されたＨｉｓタグ付きＦｃγＲ［ＦｃγＲＩ及びＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ１５８）では、表３２に示されるように、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴに対して比較的高い親和性を有する］又は検出感度を高めるためニュートラアビジン被覆プレート上に固定化されたビオチン化ＦｃγＲ［ＦｃγＲＩＩａ（Ｈ１３１又はＲ１３１）及びＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ１５８）では、表３２に示されるように、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴに対して比較的低い親和性を有する］と一緒にインキュベートした。インキュベーション後、プレートを洗浄してＦｃγＲに結合しなかった免疫複合体を取り除き、次に、溶解バッファーで処置して、補足された免疫複合体を溶解して、ｐ２４ ｇａｇ定量化のためウイルスタンパク質を放出した。
７．４．Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴとＨＩＶビリオンの免疫複合体のＦｃγＲへの結合
７．４．１．材料及び方法
Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴとＨＩＶビリオンにより形成される免疫複合体がｉｎ ｖｉｔｒｏでＦｃγＲに結合できるかどうかを試験するため、適切な抗体を先ずＨＩＶ ＮＬ４－３ウイルス（α４β７の発現を誘導するようにＲＡの存在下で活性化されたヒトＰＢＭＣにおいて調製された）と混合して免疫複合体を形成させ、この複合体を、引き続いて、ニッケル被覆プレート上に固定化されたＨｉｓタグ付きＦｃγＲ［ＦｃγＲＩ及びＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ１５８）では、表３２に示されるように、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴに対して比較的高い親和性を有する］又は検出感度を高めるためニュートラアビジン被覆プレート上に固定化されたビオチン化ＦｃγＲ［ＦｃγＲＩＩａ（Ｈ１３１又はＲ１３１）及びＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ１５８）では、表３２に示されるように、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴに対して比較的低い親和性を有する］と一緒にインキュベートした。インキュベーション後、プレートを洗浄してＦｃγＲに結合しなかった免疫複合体を取り除き、次に、溶解バッファーで処置して、補足された免疫複合体を溶解して、ｐ２４ ｇａｇ定量化のためウイルスタンパク質を放出した。
７．４．２．結果
ＨＩＶビリオンとＷＴ Ｆｃドメインを有するＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴにより形成される免疫複合体は、ＦｃγＲに結合しているタンパク質複合体中のＨＩＶ ｐ２４カプシドタンパク質の存在により示される異なるＦｃγＲに結合することができた（図８Ａ～８Ｅ）。ＨＩＶビリオン単独ではＦｃγＲにも（データは示さず）、ＨＩＶビリオンとＦｃγＲへのその結合を有意に減少させるそのＦｃドメイン中に操作されたＬＡＬＡ突然変異を有すること以外Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴと同一の抗体であるＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＬＡＬＡにより形成される免疫複合体にも結合しなかった（図８Ａ～８Ｅ）。さらに、ＨＩＶビリオンとＡｂ－Ｖｅｄｏにより形成される免疫複合体は、ＦｃγＲへの最小結合を示した（図８Ａ～８Ｅ）。これは、Ａｂ－ＶｅｄｏのＦｃドメイン中の操作された突然変異のせいで、異なるＦｃγＲに対するＡｂ－Ｖｅｄｏの結合親和性がＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴよりも有意に低いことと一致している。ヒトＦｃγＲＩＩａ（Ｈ１３１又はＲ１３１）及びＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ１５８、Ｆ１７６としても知られる）に対するＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴの結合親和性がＦｃγＲＩ及びＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ１５８、Ｖ１７６としても知られる）よりも低いせいで（図１９Ａ）、ニッケルプレート上に固定化された対応するＨｉｓタグ付きＦｃγＲを使用する代わりに、これらのＦｃγＲによるＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴの免疫複合体の補足を増強するため、ビオチン化ＦｃγＲＩＩａ（Ｈ１３１又はＲ１３１）及びＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ１５８）は、ニュートラアビジン被覆プレート上に固定化された。
ＨＩＶビリオンとＷＴ Ｆｃドメインを有するＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴにより形成される免疫複合体は、ＦｃγＲに結合しているタンパク質複合体中のＨＩＶ ｐ２４カプシドタンパク質の存在により示される異なるＦｃγＲに結合することができた（図８Ａ～８Ｅ）。ＨＩＶビリオン単独ではＦｃγＲにも（データは示さず）、ＨＩＶビリオンとＦｃγＲへのその結合を有意に減少させるそのＦｃドメイン中に操作されたＬＡＬＡ突然変異を有すること以外Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴと同一の抗体であるＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＬＡＬＡにより形成される免疫複合体にも結合しなかった（図８Ａ～８Ｅ）。さらに、ＨＩＶビリオンとＡｂ－Ｖｅｄｏにより形成される免疫複合体は、ＦｃγＲへの最小結合を示した（図８Ａ～８Ｅ）。これは、Ａｂ－ＶｅｄｏのＦｃドメイン中の操作された突然変異のせいで、異なるＦｃγＲに対するＡｂ－Ｖｅｄｏの結合親和性がＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴよりも有意に低いことと一致している。ヒトＦｃγＲＩＩａ（Ｈ１３１又はＲ１３１）及びＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ１５８、Ｆ１７６としても知られる）に対するＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴの結合親和性がＦｃγＲＩ及びＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ１５８、Ｖ１７６としても知られる）よりも低いせいで（図１９Ａ）、ニッケルプレート上に固定化された対応するＨｉｓタグ付きＦｃγＲを使用する代わりに、これらのＦｃγＲによるＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴの免疫複合体の補足を増強するため、ビオチン化ＦｃγＲＩＩａ（Ｈ１３１又はＲ１３１）及びＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ１５８）は、ニュートラアビジン被覆プレート上に固定化された。
Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴとＨＩＶビリオンにより形成される免疫複合体は、ＦｃγＲＩＩａ（ＡＤＣＰを担当している）を含む異なるＦｃγＲに結合できた。これは、複合体がＡＰＣにより取り込まれてＨＩＶ制御のための提唱された「予防接種効果」を誘導することを可能にすると考えられるステップである。
［実施例５］
７．５．Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴはＴＨＰ－１細胞におけるα４β７被覆ビーズのＦｃ依存性取込みを媒介する
７．５．１．材料及び方法
細胞培養
ＴＨＰ－１細胞は、１０％ＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ）を補充されたＲＰＭＩ培地（Ｇｉｂｃｏ）において３７℃、５％ＣＯ２で培養した。細胞は２日又は３日ごとに継代され、５００，０００～１，０００，０００細胞／ｍｌの密度で維持した。
７．５．Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴはＴＨＰ－１細胞におけるα４β７被覆ビーズのＦｃ依存性取込みを媒介する
７．５．１．材料及び方法
細胞培養
ＴＨＰ－１細胞は、１０％ＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ）を補充されたＲＰＭＩ培地（Ｇｉｂｃｏ）において３７℃、５％ＣＯ２で培養した。細胞は２日又は３日ごとに継代され、５００，０００～１，０００，０００細胞／ｍｌの密度で維持した。
ビーズ調製
組換えヒトα４β７タンパク質（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）は、３．５ｋＤａ ＭＷＣＯ透析装置（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）を使用して１×ＰＢＳ中４℃で一晩透析した。こうして得られたα４β７は、次に、４℃で２時間、１００×モル過剰ＮＨＳ－ビオチン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）でビオチン化した。過剰なビオチンは、４℃で一晩透析により取り除いた。α４β７被覆ビーズでは、ニュートラアビジン標識蛍光ビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）は、４℃で１～２４時間、ビオチン化α４β７と一緒にインキュベートした。ビーズ－タンパク質コンジュゲーション反応は、別段述べられなければ、１ｍｌのストックビーズ当たり２ｍｇのα４β７タンパク質の比で起きた。タンパク質コンジュゲートビーズは、１％ＢＳＡを含有する１×ＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ）で２回洗浄し、次に、使用に先立って１００×希釈した。ビーズへのタンパク質のコンジュゲーションの成功は、抗α４β７をアイソタイプコントロール条件と比較する食作用アッセイにおいて確かめた。
組換えヒトα４β７タンパク質（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）は、３．５ｋＤａ ＭＷＣＯ透析装置（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）を使用して１×ＰＢＳ中４℃で一晩透析した。こうして得られたα４β７は、次に、４℃で２時間、１００×モル過剰ＮＨＳ－ビオチン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）でビオチン化した。過剰なビオチンは、４℃で一晩透析により取り除いた。α４β７被覆ビーズでは、ニュートラアビジン標識蛍光ビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）は、４℃で１～２４時間、ビオチン化α４β７と一緒にインキュベートした。ビーズ－タンパク質コンジュゲーション反応は、別段述べられなければ、１ｍｌのストックビーズ当たり２ｍｇのα４β７タンパク質の比で起きた。タンパク質コンジュゲートビーズは、１％ＢＳＡを含有する１×ＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ）で２回洗浄し、次に、使用に先立って１００×希釈した。ビーズへのタンパク質のコンジュゲーションの成功は、抗α４β７をアイソタイプコントロール条件と比較する食作用アッセイにおいて確かめた。
食作用アッセイ
タンパク質被覆ビーズ及びＴＨＰ－１細胞を使用する食作用アッセイは、以前記載された研究（Ａｃｋｅｒｍａｎら、２０１１年）から改作した。アッセイは９６ウェルプレートで実施した。免疫複合体は、１０μｌの調製したα４β７被覆ビーズを１０μｌの示された抗体（１０μｇ／ｍｌ）と組み合わせることにより形成した。これらは３７℃、５％ＣＯ２で１～２時間インキュベートした。ＴＨＰ－１細胞（１００，０００／ウェル）は、次に、最終体積２００μｌで、示された時間免疫複合体と一緒にインキュベートした。インキュベーションに続いて、細胞は、固定化可能なｌｉｖｅ／ｄｅａｄ染色（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で染色し、続いてＦＡＣＳバッファーで洗浄し、固定化した。得られた細胞に関するデータは、ＢＤ製のＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａ Ｘ２０を使用して収集した。蛍光ビーズ及びｌｉｖｅ／ｄｅａｄ染色蛍光は、それぞれＰＥ－ＣＦ５９４及びＢＶ５１０設定を用いて検出した。次に、データはＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して解析した。食作用スコアーは以下の通りに計算した：食作用スコアー＝（ＭＦＩ×パーセントビーズ陽性細胞）／１０００。正規化：３つの独立した実験のデータを正規化し、１つのグラフ上にプロットした。正規化するため、「ビーズのみ」条件での１つの複写物は、この値を同じ値で割ることにより１に設定した（それぞれの実験について行った）。他の値はすべてこの正規化値で割って正規化された食作用スコアーを表示し、このスコアーは「ビーズのみ」条件からの倍率変化を表す。
タンパク質被覆ビーズ及びＴＨＰ－１細胞を使用する食作用アッセイは、以前記載された研究（Ａｃｋｅｒｍａｎら、２０１１年）から改作した。アッセイは９６ウェルプレートで実施した。免疫複合体は、１０μｌの調製したα４β７被覆ビーズを１０μｌの示された抗体（１０μｇ／ｍｌ）と組み合わせることにより形成した。これらは３７℃、５％ＣＯ２で１～２時間インキュベートした。ＴＨＰ－１細胞（１００，０００／ウェル）は、次に、最終体積２００μｌで、示された時間免疫複合体と一緒にインキュベートした。インキュベーションに続いて、細胞は、固定化可能なｌｉｖｅ／ｄｅａｄ染色（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で染色し、続いてＦＡＣＳバッファーで洗浄し、固定化した。得られた細胞に関するデータは、ＢＤ製のＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａ Ｘ２０を使用して収集した。蛍光ビーズ及びｌｉｖｅ／ｄｅａｄ染色蛍光は、それぞれＰＥ－ＣＦ５９４及びＢＶ５１０設定を用いて検出した。次に、データはＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して解析した。食作用スコアーは以下の通りに計算した：食作用スコアー＝（ＭＦＩ×パーセントビーズ陽性細胞）／１０００。正規化：３つの独立した実験のデータを正規化し、１つのグラフ上にプロットした。正規化するため、「ビーズのみ」条件での１つの複写物は、この値を同じ値で割ることにより１に設定した（それぞれの実験について行った）。他の値はすべてこの正規化値で割って正規化された食作用スコアーを表示し、このスコアーは「ビーズのみ」条件からの倍率変化を表す。
イメージングフローサイトメトリー
ビーズの内部移行はイメージングフローサイトメトリーを使用して確かめた。固定化された細胞は、ＩｍａｇｅｓｔｒｅａｍＸ Ｍａｒｋ ＩＩイメージングフローサイトメトリー（Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｃｏｒｐ．）上で４０×の拡大率及び中度の感度及び中度の速度設定で分析した。蛍光ビーズは、４８８ｎｍ（５ｍＷ）／５６０～５９５ｎｍ（励起／放射）を使用して画像化した。ｌｉｖｅ／ｄｅａｄ染色は、４０５ｎｍ（５ｍＷ）／４３０～４８０ｎｍ（励起／放射）を使用して画像化された。明視野像はチャネル２に収集された（カメラ１）。データは、ＩＤＥＡＳ解析ソフトウェアｖ６．１（Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｃｏｒｐ．）を使用して解析した。標準ゲート開閉戦略を使用して適切な細胞集団を見つけた。簡単に言えば、フォーカス細胞は、明視野画像鮮明度のため高（＞４０）勾配ＲＭＳ（二乗平均平方根）を使用して同定した。単細胞は、明視野像の高アスペクト比及び低オブジェクトエリアにより同定された。細胞オブジェクトエリアは明視野像において同定され、「細胞内マスク」を限定するため細胞境界から４画素が損なわれた。細胞内マスクにおいて陽性蛍光シグナルを有する細胞は、真の内部移行イベントとして同定された。斑点数フィーチャーを使用して、真の内部移行イベントを有する細胞中の内部移行したビーズの数を数えた。真の内部移行イベントを有する少なくとも２０００細胞は試料ごとに分析した。
ビーズの内部移行はイメージングフローサイトメトリーを使用して確かめた。固定化された細胞は、ＩｍａｇｅｓｔｒｅａｍＸ Ｍａｒｋ ＩＩイメージングフローサイトメトリー（Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｃｏｒｐ．）上で４０×の拡大率及び中度の感度及び中度の速度設定で分析した。蛍光ビーズは、４８８ｎｍ（５ｍＷ）／５６０～５９５ｎｍ（励起／放射）を使用して画像化した。ｌｉｖｅ／ｄｅａｄ染色は、４０５ｎｍ（５ｍＷ）／４３０～４８０ｎｍ（励起／放射）を使用して画像化された。明視野像はチャネル２に収集された（カメラ１）。データは、ＩＤＥＡＳ解析ソフトウェアｖ６．１（Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｃｏｒｐ．）を使用して解析した。標準ゲート開閉戦略を使用して適切な細胞集団を見つけた。簡単に言えば、フォーカス細胞は、明視野画像鮮明度のため高（＞４０）勾配ＲＭＳ（二乗平均平方根）を使用して同定した。単細胞は、明視野像の高アスペクト比及び低オブジェクトエリアにより同定された。細胞オブジェクトエリアは明視野像において同定され、「細胞内マスク」を限定するため細胞境界から４画素が損なわれた。細胞内マスクにおいて陽性蛍光シグナルを有する細胞は、真の内部移行イベントとして同定された。斑点数フィーチャーを使用して、真の内部移行イベントを有する細胞中の内部移行したビーズの数を数えた。真の内部移行イベントを有する少なくとも２０００細胞は試料ごとに分析した。
統計分析
データはグラフパッドプリズムを使用してプロットした。有意性は、テューキー多重比較検定と連結させた一元配置分散分析を使用して決定した。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、＊＊＊ｐ＝０．０００１～０．００１、＊＊ｐ＝０．００１～０．０１、＊ｐ＝０．０１～０．０５。
データはグラフパッドプリズムを使用してプロットした。有意性は、テューキー多重比較検定と連結させた一元配置分散分析を使用して決定した。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、＊＊＊ｐ＝０．０００１～０．００１、＊＊ｐ＝０．００１～０．０１、＊ｐ＝０．０１～０．０５。
７．５．２．結果
抗原提示細胞による免疫複合体の取込みは、下流細胞性及び液性免疫を開始するのに重大な意味を持つ。ＴＨＰ－１細胞は、抗体－蛍光ビーズ免疫複合体をＦｃ／ＦｃγＲ依存的に貪食することが報告されている（Ａｃｋｅｒｍａｎら、２０１１年）。したがって、ＴＨＰ－１細胞を使用して、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴがα４β７被覆蛍光ビーズの食作用を媒介するかどうかを調べた。α４β７－ビーズ／Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴ抗体免疫複合体で３時間処置した細胞は、フローサイトメトリーにより、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＬＡＬＡ及びＡｂ－Ｖｅｄｏ（フィーチャリングＬＡＬＡ）と比べて蛍光ビーズの有意な取込みを示した（図９Ａ～９Ｂ）。ＬＡＬＡ突然変異は、ＦｃγＲへのＩｇＧ Ｆｃの結合を大幅に低減することが分かっている。これらのデータから、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴが、α４β７被覆蛍光ビーズを含有する免疫複合体の頑強なＦｃ／ＦｃγＲ依存性食作用を媒介することが示唆される。
抗原提示細胞による免疫複合体の取込みは、下流細胞性及び液性免疫を開始するのに重大な意味を持つ。ＴＨＰ－１細胞は、抗体－蛍光ビーズ免疫複合体をＦｃ／ＦｃγＲ依存的に貪食することが報告されている（Ａｃｋｅｒｍａｎら、２０１１年）。したがって、ＴＨＰ－１細胞を使用して、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴがα４β７被覆蛍光ビーズの食作用を媒介するかどうかを調べた。α４β７－ビーズ／Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴ抗体免疫複合体で３時間処置した細胞は、フローサイトメトリーにより、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＬＡＬＡ及びＡｂ－Ｖｅｄｏ（フィーチャリングＬＡＬＡ）と比べて蛍光ビーズの有意な取込みを示した（図９Ａ～９Ｂ）。ＬＡＬＡ突然変異は、ＦｃγＲへのＩｇＧ Ｆｃの結合を大幅に低減することが分かっている。これらのデータから、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴが、α４β７被覆蛍光ビーズを含有する免疫複合体の頑強なＦｃ／ＦｃγＲ依存性食作用を媒介することが示唆される。
Ａｍｎｉｓ Ｉｍａｇｅｓｔｒｅａｍを用いたイメージングフローサイトメトリーを実施して、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴ／α４β７ビーズ免疫複合体がＴＨＰ－１細胞に内部移行したことを確かめた。予測通り、蛍光ビーズは、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴ免疫複合体処置後にＴＨＰ－１細胞内に局在した（図９Ｃ）。
［実施例６］
７．６．ＴＨＰ－１細胞におけるα４β７＋ＧＦＰ＋ＶＬＰ／Ａｂ免疫複合体のＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴ誘導取込みはα４β７－及びＦｃ依存性である
７．６．１．材料および方法
ＥＬＩＳＡによるα４β７発現ＧＦＰ＋ウイルス様粒子（ＶＬＰ）への抗体結合
α４β７＋ＧＦＰ＋ＶＬＰは、α４β７ ｃＤＮＡ構築物及びＨＩＶｇａｇ－ＧＦＰ ＤＮＡ構築物を順次トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞から生成され、続いて細胞培養上澄みからＶＬＰを精製した。ＥＬＩＳＡを実施して、ＧＦＰ＋ＶＬＰ表面上でのα４β７の発現及び種々の試験Ａｂによる結合特異性を確かめた。簡単に言えば、高結合平底９６ウェルプレートのそれぞれのウェルを、ＰＢＳ中７．５×１０７粒子／ｍＬの濃度で５０μＬのα４β７＋ＧＦＰ＋ＶＬＰを用いて被覆し、４℃で一晩インキュベートした。ウェルはＰＢＳ＋１％ＦＢＳで洗浄し、室温（ＲＴ）で３０分間１００μＬのスーパーブロック液で遮断した。３回洗浄後、それぞれのウェルは、ＲＴで１時間、ＰＢＳ＋１％ＦＢＳ中５０μＬの４倍段階希釈一次抗体と一緒にインキュベートし、続いて洗浄し、ＲＴで１時間、ＰＢＳ＋１％ＦＢＳ中５０μｌのＨＲＰコンジュゲートロバ抗ヒトＩｇＧ－Ｆｃγ特異的二次抗体と一緒にインキュベートした。最終洗浄後、ＴＭＢ基質を発色現像のためにそれぞれのウェルに添加し、反応は２ＮのＨ２ＳＯ４を添加することにより停止させた。それぞれのウェルについての光学密度（ＯＤ）はプレートリーダーにより４５０ｎｍで測定した。
７．６．ＴＨＰ－１細胞におけるα４β７＋ＧＦＰ＋ＶＬＰ／Ａｂ免疫複合体のＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴ誘導取込みはα４β７－及びＦｃ依存性である
７．６．１．材料および方法
ＥＬＩＳＡによるα４β７発現ＧＦＰ＋ウイルス様粒子（ＶＬＰ）への抗体結合
α４β７＋ＧＦＰ＋ＶＬＰは、α４β７ ｃＤＮＡ構築物及びＨＩＶｇａｇ－ＧＦＰ ＤＮＡ構築物を順次トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞から生成され、続いて細胞培養上澄みからＶＬＰを精製した。ＥＬＩＳＡを実施して、ＧＦＰ＋ＶＬＰ表面上でのα４β７の発現及び種々の試験Ａｂによる結合特異性を確かめた。簡単に言えば、高結合平底９６ウェルプレートのそれぞれのウェルを、ＰＢＳ中７．５×１０７粒子／ｍＬの濃度で５０μＬのα４β７＋ＧＦＰ＋ＶＬＰを用いて被覆し、４℃で一晩インキュベートした。ウェルはＰＢＳ＋１％ＦＢＳで洗浄し、室温（ＲＴ）で３０分間１００μＬのスーパーブロック液で遮断した。３回洗浄後、それぞれのウェルは、ＲＴで１時間、ＰＢＳ＋１％ＦＢＳ中５０μＬの４倍段階希釈一次抗体と一緒にインキュベートし、続いて洗浄し、ＲＴで１時間、ＰＢＳ＋１％ＦＢＳ中５０μｌのＨＲＰコンジュゲートロバ抗ヒトＩｇＧ－Ｆｃγ特異的二次抗体と一緒にインキュベートした。最終洗浄後、ＴＭＢ基質を発色現像のためにそれぞれのウェルに添加し、反応は２ＮのＨ２ＳＯ４を添加することにより停止させた。それぞれのウェルについての光学密度（ＯＤ）はプレートリーダーにより４５０ｎｍで測定した。
ＴＨＰ－１細胞におけるα４β７＋ＧＦＰ＋ＶＬＰ／抗α４β７免疫複合体の内部移行
α４β７＋ＧＦＰ＋ＶＬＰ取込み実験では、５×１０４ＴＨＰ－１細胞を平底９６ウェルプレートにおいて、最終濃度１μｇ／ｍｌの抗体及び１００μＬ体積のＲＰＭＩ、１０％ＦＢＳ中１対１００の細胞対粒子比のα４β７＋ＧＦＰ＋ＶＬＰなしで又はこれと混合した。プレートは、ＣＯ２インキュベータにおいて３７℃で１６時間インキュベートした。次に、細胞を再懸濁して、Ｖ字型底９６ウェルプレートに移し、遠心分離を通して２００μＬのＰＢＳ、２％ＦＢＳで１回洗浄した。細胞ペレットは２００μＬのＰＢＳ、０．５％パラホルムアルデヒドに再懸濁し、フローサイトメトリーによるパーセントＧＦＰ＋細胞の決定に供した。
α４β７＋ＧＦＰ＋ＶＬＰ取込み実験では、５×１０４ＴＨＰ－１細胞を平底９６ウェルプレートにおいて、最終濃度１μｇ／ｍｌの抗体及び１００μＬ体積のＲＰＭＩ、１０％ＦＢＳ中１対１００の細胞対粒子比のα４β７＋ＧＦＰ＋ＶＬＰなしで又はこれと混合した。プレートは、ＣＯ２インキュベータにおいて３７℃で１６時間インキュベートした。次に、細胞を再懸濁して、Ｖ字型底９６ウェルプレートに移し、遠心分離を通して２００μＬのＰＢＳ、２％ＦＢＳで１回洗浄した。細胞ペレットは２００μＬのＰＢＳ、０．５％パラホルムアルデヒドに再懸濁し、フローサイトメトリーによるパーセントＧＦＰ＋細胞の決定に供した。
ＶＬＰ取込みの阻害では、ＴＨＰ－１細胞（５×１０６／ｍＬ）を、ＣＯ２インキュベータにおいて３７℃で２時間、最終濃度２４０ｎＭのラトランクリンＡ（ＬａｔＡ）を用いて若しくはこれなしで又は０．１％ＤＭＳＯ（対照）を用いて前処置し、続いて上に示された通りに抗体及びα４β７＋ＧＦＰ＋ＶＬＰと一緒に若しくはこれなしでインキュベートした。
７．６．２．結果
ＴＨＰ－１細胞におけるα４β７＋ＧＦＰ＋ＶＬＰ／Ａｂ免疫複合体のＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴ誘導取込みはα４β７－及びＦｃ依存性である
哺乳動物細胞から生成される組換えウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、０．１～０．２ミクロンに及ぶ動的サイズを有する。したがって、ＶＬＰは以前に実験で使用された蛍光標識ビーズよりもサイズがビリオンに類似しており、ＴＨＰ－１細胞によるα４β７＋ビリオン／Ａｂ免疫複合体の内部移行／取込みをモデル化するためのツールとして利用された。精製されたα４β７発現ＧＦＰ＋ＶＬＰは、ＥＬＩＳＡによって、抗α４β７ Ａｂに結合するその能力について評価した。図１０に示されるように、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴ、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＬＡＬＡ及びＡｂ－Ｖｅｄｏはα４β７＋ＧＦＰ＋ＶＬＰに比較できるほどに類似する結合ＥＣ５０値（それぞれ、０．０５０ｎＭ、０．０４８ｎＭ及び０．０５８ｎＭ）で結合し、アイソタイプコントロールＡｂ（抗ＣＭＶ ＩｇＧ）はα４β７＋ＧＦＰ＋ＶＬＰに全く結合しなかった。このデータにより、種々の抗α４β７ Ａｂが、良好な結合親和性及び特異性でα４β７＋ＧＦＰ＋ＶＬＰに結合できることが示唆される。
ＴＨＰ－１細胞におけるα４β７＋ＧＦＰ＋ＶＬＰ／Ａｂ免疫複合体のＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴ誘導取込みはα４β７－及びＦｃ依存性である
哺乳動物細胞から生成される組換えウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、０．１～０．２ミクロンに及ぶ動的サイズを有する。したがって、ＶＬＰは以前に実験で使用された蛍光標識ビーズよりもサイズがビリオンに類似しており、ＴＨＰ－１細胞によるα４β７＋ビリオン／Ａｂ免疫複合体の内部移行／取込みをモデル化するためのツールとして利用された。精製されたα４β７発現ＧＦＰ＋ＶＬＰは、ＥＬＩＳＡによって、抗α４β７ Ａｂに結合するその能力について評価した。図１０に示されるように、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴ、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＬＡＬＡ及びＡｂ－Ｖｅｄｏはα４β７＋ＧＦＰ＋ＶＬＰに比較できるほどに類似する結合ＥＣ５０値（それぞれ、０．０５０ｎＭ、０．０４８ｎＭ及び０．０５８ｎＭ）で結合し、アイソタイプコントロールＡｂ（抗ＣＭＶ ＩｇＧ）はα４β７＋ＧＦＰ＋ＶＬＰに全く結合しなかった。このデータにより、種々の抗α４β７ Ａｂが、良好な結合親和性及び特異性でα４β７＋ＧＦＰ＋ＶＬＰに結合できることが示唆される。
次に、ＴＨＰ－１細胞によるα４β７＋ＧＦＰ＋ＶＬＰの取込みは、機能的Ｆｃを用いて又はなしで種々の抗α４β７ Ａｂの存在下で評価した。図１１Ａに示されるように、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴ処置は、ＧＦＰ＋細胞の５０倍誘導を表すアイソタイプＡｂ対照処置による１．２％ＧＦＰ＋細胞と比べて６０％を超えるＧＦＰ＋ＴＨＰ－１細胞の検出を誘導した。これにより、ＴＨＰ－１細胞によるα４β７＋ＧＦＰ＋ＶＬＰ取込みがＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴ特異的であり、α４β７発現に依存していることが示唆される。しかし、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＬＡＬＡ又はＡｂ－Ｖｅｄｏ（ＬＡＬＡ）はＴＨＰ－１細胞において最小レベルのＶＬＰ取込みしか示さず、これらの細胞による抗α４β７ Ａｂ誘導α４β７＋ＧＦＰ＋ＶＬＰ取込みが、そのα４β７結合Ｆａｂドメインに加えて、免疫複合体のＦｃ／ＦｃγＲ媒介内部移行を可能にする抗体の機能的Ｆｃドメインを必要とすることが示唆される。
α４β７＋ＧＦＰ＋ＶＬＰのＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴ媒介取込みが、細胞表面ＦｃγＲに結合しているだけではなく、本当に内部移行のせいであることを確かめるため、Ａｂ／ＶＬＰ免疫複合体と一緒のそのインキュベーションに先立って、既知の内部移行阻害剤であるラトランクリンＡ（ＬａｔＡ）を使用してＴＨＰ－１細胞を前処置した。図１１Ｂに示されるが、非処置の細胞と比べて、ＬａｔＡ処置細胞ではＧＦＰ＋細胞が４０％減少した。これにより、非処置（モック）又はＤＭＳＯ処置対照において観察される全ＧＦＰシグナルの少なくとも４０％がＴＨＰ－１細胞でのＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴ依存性ＶＬＰ内部移行から生じたことが示唆される。
［実施例７］
７．７．Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴはＨＩＶに対する中和活性を示さなかった
７．７．１．材料及び方法
ＨＩＶビリオンに結合できる一部のＡｂ、例えば、ＨＩＶ広域中和抗体は、ウイルス感染を遮断することができる。ＨＩＶビリオン上のα４β７へのＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴの結合が宿主細胞のＨＩＶ感染を遮断することができるかどうかを試験するため、ＴＺＭ－ｂｌインジケータ細胞系を使用してウイルス中和アッセイにおいてそのことを評価した（Ａｒｒｉｌｄｔら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ ２０１５年）。
７．７．Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴはＨＩＶに対する中和活性を示さなかった
７．７．１．材料及び方法
ＨＩＶビリオンに結合できる一部のＡｂ、例えば、ＨＩＶ広域中和抗体は、ウイルス感染を遮断することができる。ＨＩＶビリオン上のα４β７へのＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴの結合が宿主細胞のＨＩＶ感染を遮断することができるかどうかを試験するため、ＴＺＭ－ｂｌインジケータ細胞系を使用してウイルス中和アッセイにおいてそのことを評価した（Ａｒｒｉｌｄｔら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ ２０１５年）。
ＨＩＶ中和アッセイ
おおよそ１５０，０００ＲＬＵ（ＴＺＭ－ｂｌ細胞上でのウイルス滴定により以前決定された）に対応するＨＩＶウイルス（ＰＨＡ及びＲＡで調製された）は、段階希釈抗体と一緒にプレインキュベートした。ＤＥＡＥ－デキストランを含有するＴＺＭ－ｂｌ細胞は、プレインキュベートされたＨＩＶと抗体を含有する混合物に添加され、次に、３７℃で４８時間インキュベートした。細胞はＢｒｉｇｈｔ－Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で処置され、ルシフェラーゼシグナルを測定した。
おおよそ１５０，０００ＲＬＵ（ＴＺＭ－ｂｌ細胞上でのウイルス滴定により以前決定された）に対応するＨＩＶウイルス（ＰＨＡ及びＲＡで調製された）は、段階希釈抗体と一緒にプレインキュベートした。ＤＥＡＥ－デキストランを含有するＴＺＭ－ｂｌ細胞は、プレインキュベートされたＨＩＶと抗体を含有する混合物に添加され、次に、３７℃で４８時間インキュベートした。細胞はＢｒｉｇｈｔ－Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で処置され、ルシフェラーゼシグナルを測定した。
７．７．２．結果
表２３に示されるＨＩＶ株のパネルに対して試験された場合、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴは５０μｇ／ｍＬまでの濃度でいかなる中和活性も示さず、ＣＤ４＋結合部位を標的にするＨＩＶ広域中和抗体は、試験された群Ｍ ＨＩＶ株のすべて（すなわち、ＣＭＵ０８、ＮＬ４－３及びＲＵ５７０）に対しておおよそ０．１μｇ／ｍＬの中和ＩＣ５０値を有していた（データは示されず）。
表２３に示されるＨＩＶ株のパネルに対して試験された場合、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴは５０μｇ／ｍＬまでの濃度でいかなる中和活性も示さず、ＣＤ４＋結合部位を標的にするＨＩＶ広域中和抗体は、試験された群Ｍ ＨＩＶ株のすべて（すなわち、ＣＭＵ０８、ＮＬ４－３及びＲＵ５７０）に対しておおよそ０．１μｇ／ｍＬの中和ＩＣ５０値を有していた（データは示されず）。
Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴはＨＩＶビリオンに結合するが、ＨＩＶ感染を中和せず、このことは、α４β７は宿主細胞上ではウイルス受容体ではないという見解と一致している。この知見は、ウイルスにコードされた糖タンパク質ではなくα４β７を標的にするとウイルス耐性機構を回避しうるという仮説を支持する。
［実施例８］
７．８．異なる抗体によるα４β７とＨＩＶ ｇｐ１２０の相互作用の阻害
７．８．１．材料及び方法
α４β７とＨＩＶ ｇｐ１２０の間の相互作用は、ＬＦＡ－１を活性化し、ＨＩＶの細胞間伝播を潜在的に促進することが報告されている（Ａｒｔｈｏｓら、Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００８年）。Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴがこの相互作用を破壊することができるかどうかを試験するため、公表された方法（Ｐｅａｃｈｍａｎら、ＰｌｏＳ Ｏｎｅ）に従ってプレート上に固定化されたＨＩＶ ｇｐ１２０－Ｖ２ペプチドに結合するα４β７発現ＲＰＭＩ８８６６細胞を使用して、α４β７／ｇｐ１２０結合アッセイを設定した。ニュートラアビジン被覆高容量９６ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を、ビオチン化ＨＩＶ ｇｐ１２０－Ｖ２ ＷＴ又はｇｐ１２０－Ｖ２対照ペプチドで被覆した（表２４）。２つのビオチン化ペプチドの配列は、α４β７とｇｐ１２０の間の結合を媒介することが報告されている４つのアミノ酸が対照ペプチドでは突然変異していることを除いて同一であった。
７．８．異なる抗体によるα４β７とＨＩＶ ｇｐ１２０の相互作用の阻害
７．８．１．材料及び方法
α４β７とＨＩＶ ｇｐ１２０の間の相互作用は、ＬＦＡ－１を活性化し、ＨＩＶの細胞間伝播を潜在的に促進することが報告されている（Ａｒｔｈｏｓら、Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００８年）。Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴがこの相互作用を破壊することができるかどうかを試験するため、公表された方法（Ｐｅａｃｈｍａｎら、ＰｌｏＳ Ｏｎｅ）に従ってプレート上に固定化されたＨＩＶ ｇｐ１２０－Ｖ２ペプチドに結合するα４β７発現ＲＰＭＩ８８６６細胞を使用して、α４β７／ｇｐ１２０結合アッセイを設定した。ニュートラアビジン被覆高容量９６ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を、ビオチン化ＨＩＶ ｇｐ１２０－Ｖ２ ＷＴ又はｇｐ１２０－Ｖ２対照ペプチドで被覆した（表２４）。２つのビオチン化ペプチドの配列は、α４β７とｇｐ１２０の間の結合を媒介することが報告されている４つのアミノ酸が対照ペプチドでは突然変異していることを除いて同一であった。
抗体－細胞混合物を添加する前に、ペプチド被覆プレートを洗浄して未結合ペプチドを取り除いた。抗体－細胞混合物ストックを作製するため、ＲＰＭＩ８８６６細胞（８×１０６細胞／ｍＬ）を、最終濃度２ｍＭでＭｎＣｌ２を補充した冷ブロッキングバッファーに再懸濁して、α４β７の立体構造を活性化した。段階希釈Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴ、Ａｂ－Ｖｅｄｏ又はアイソタイプネガティブコントロール抗体をＭｎＣｌ２処置細胞と混合し、混合物をインキュベートした。抗体－細胞混合物（ウェル当たり５０μＬ中２×１０５細胞）を、ｇｐ１２０ペプチドで被覆されたプレートのそれぞれのウェルに添加し、インキュベートした。プレートを洗浄し、ペプチド被覆プレートに付着した生細胞はＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ ２．０試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）により決定した。
７．８．２．結果
このアッセイの特異性は、α４β７へのｇｐ１２０の結合を媒介することが報告されている４アミノ酸に突然変異を宿す固定化されたｇｐ１２０－Ｖ２対照ペプチド（図１２Ａ）への結合ではなく、プレート上に固定化されたＨＩＶ ｇｐ１２０－Ｖ２ ＷＴペプチドへのα４β７発現ＲＰＭＩ８８６６細胞の結合により示される（表２４）。このアッセイフォーマットにおいて試験された場合、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴは、ＨＩＶ ｇｐ１２０－Ｖ２ ＷＴペプチドへのＲＰＭＩ８８６６細胞の結合を０．０２２±０．０１６μｇ／ｍＬのＩＣ５０値で遮断した（図１２Ｂ）。Ａｂ－Ｖｅｄｏは、同じアッセイで試験した場合、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴのＩＣ５０値よりも高いＩＣ５０値（０．０４２±０．０２３μｇ／ｍＬ）を有しており、この相互作用を遮断するのにＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴほど強力ではないことを示した（図１２Ｂ）。まとめると、これらの結果は、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴがα４β７とｇｐ１２０の相互作用を効果的に破壊し、細胞間ウイルス伝播を潜在的に阻害できることを示している。
このアッセイの特異性は、α４β７へのｇｐ１２０の結合を媒介することが報告されている４アミノ酸に突然変異を宿す固定化されたｇｐ１２０－Ｖ２対照ペプチド（図１２Ａ）への結合ではなく、プレート上に固定化されたＨＩＶ ｇｐ１２０－Ｖ２ ＷＴペプチドへのα４β７発現ＲＰＭＩ８８６６細胞の結合により示される（表２４）。このアッセイフォーマットにおいて試験された場合、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴは、ＨＩＶ ｇｐ１２０－Ｖ２ ＷＴペプチドへのＲＰＭＩ８８６６細胞の結合を０．０２２±０．０１６μｇ／ｍＬのＩＣ５０値で遮断した（図１２Ｂ）。Ａｂ－Ｖｅｄｏは、同じアッセイで試験した場合、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴのＩＣ５０値よりも高いＩＣ５０値（０．０４２±０．０２３μｇ／ｍＬ）を有しており、この相互作用を遮断するのにＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴほど強力ではないことを示した（図１２Ｂ）。まとめると、これらの結果は、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴがα４β７とｇｐ１２０の相互作用を効果的に破壊し、細胞間ウイルス伝播を潜在的に阻害できることを示している。
このアッセイフォーマットにおいて試験された場合、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴは、ＨＩＶ ｇｐ１２０－Ｖ２ ＷＴペプチドへのＲＰＭＩ８８６６細胞の結合を０．０２２±０．０１６μｇ／ｍＬのＩＣ５０値で遮断した（図１２Ｂ）。これらの結果は、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴがα４β７とｇｐ１２０の相互作用を効果的に破壊し、細胞間ウイルス伝播を潜在的に阻害できることを示している。
［実施例９］
７．９．α４β７インテグリンを発現するヒト及びカニクイザル細胞へのＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴの結合
７．９．１．材料及び方法
Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴの結合は、ＥＣＬ結合アッセイを使用してＨｕＴ７８細胞（内在性α４β７を発現するヒトＴリンパ腫細胞）上で並びにフローサイトメトリーを使用してヒト及びカニクイザル末梢リンパ球上で評価した。
７．９．α４β７インテグリンを発現するヒト及びカニクイザル細胞へのＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴの結合
７．９．１．材料及び方法
Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴの結合は、ＥＣＬ結合アッセイを使用してＨｕＴ７８細胞（内在性α４β７を発現するヒトＴリンパ腫細胞）上で並びにフローサイトメトリーを使用してヒト及びカニクイザル末梢リンパ球上で評価した。
さらに、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴの結合ＥＣ５０値が決定され、ヒトとカニクイザル血液由来全、ナイーブ並びにメモリーＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の両方について比較した。
ＥＣＬ細胞結合アッセイ
内在性α４β７を発現するＨｕＴ７８細胞は、２０％のＦＢＳ、ペニシリン（５０ユニット／ｍＬ）／ストレプトマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を含有するＩＭＤＭ培地で培養した。ＨｕＴ７８細胞は収集され、１回洗浄し、１．５×１０６細胞／ｍＬでＤＰＢＳに再懸濁した。細胞（５０μＬ中７．５×１０４）は、ＭＳＤ高結合プレートのそれぞれのウェルに添加した。６．７％のウシ胎仔血清（ＤＰＢＳに希釈された）を添加し、プレートは３７℃で１時間インキュベートした。上澄みは取り除き、１．５μｇ／ｍＬ～０．００００９１μｇ／ｍＬ（５％ＦＢＳ及び１ｍＭのＭｎＣｌ２を含有するＤＰＢＳバッファー中）に及ぶ１対４倍８ポイント希釈を通じて調製された滴定Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴ抗体又はアイソタイプコントロールの２５μＬをそれぞれのウェルに添加し、次に、プレートは３７℃で１時間インキュベートした。プレートはＤＰＢＳで２回洗浄し、５％のＦＢＳ／ＤＰＢＳ／１ｍＭ ＭｎＣｌ２中１対５００希釈でのヤギ抗ヒトＡｂ ｓｕｌｆｏタグの２５μＬをそれぞれのウェルに添加し、続いて３７℃で３０分間インキュベートした。細胞はＤＰＢＳで２回洗浄し、次に２×ＭＳＤリードバッファーＴを１５０μＬそれぞれのウェルに添加した。プレートはＳｅｃｔｏｒ Ｉｍａｇｅｒ ６０００リーダー上で読み取り、結合曲線及び結合ＥＣ５０値は、グラフパッドプリズム７．０ソフトウェアを使用して生成した。
内在性α４β７を発現するＨｕＴ７８細胞は、２０％のＦＢＳ、ペニシリン（５０ユニット／ｍＬ）／ストレプトマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を含有するＩＭＤＭ培地で培養した。ＨｕＴ７８細胞は収集され、１回洗浄し、１．５×１０６細胞／ｍＬでＤＰＢＳに再懸濁した。細胞（５０μＬ中７．５×１０４）は、ＭＳＤ高結合プレートのそれぞれのウェルに添加した。６．７％のウシ胎仔血清（ＤＰＢＳに希釈された）を添加し、プレートは３７℃で１時間インキュベートした。上澄みは取り除き、１．５μｇ／ｍＬ～０．００００９１μｇ／ｍＬ（５％ＦＢＳ及び１ｍＭのＭｎＣｌ２を含有するＤＰＢＳバッファー中）に及ぶ１対４倍８ポイント希釈を通じて調製された滴定Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴ抗体又はアイソタイプコントロールの２５μＬをそれぞれのウェルに添加し、次に、プレートは３７℃で１時間インキュベートした。プレートはＤＰＢＳで２回洗浄し、５％のＦＢＳ／ＤＰＢＳ／１ｍＭ ＭｎＣｌ２中１対５００希釈でのヤギ抗ヒトＡｂ ｓｕｌｆｏタグの２５μＬをそれぞれのウェルに添加し、続いて３７℃で３０分間インキュベートした。細胞はＤＰＢＳで２回洗浄し、次に２×ＭＳＤリードバッファーＴを１５０μＬそれぞれのウェルに添加した。プレートはＳｅｃｔｏｒ Ｉｍａｇｅｒ ６０００リーダー上で読み取り、結合曲線及び結合ＥＣ５０値は、グラフパッドプリズム７．０ソフトウェアを使用して生成した。
ヒト及びカニクイザル末梢Ｔ細胞結合アッセイ
凍結したヒト又はカニクイザルＰＢＭＣ（標準Ｆｉｃｏｌｌ Ｐａｑｕｅ分離法を使用して血液ドナーから単離される）はＲＰＭＩ１６４０／１０％ ＦＢＳ培地に解凍し、ＦＡＣＳバッファー（ＤＰＢＳ、ｗ／ｏ Ｃａ＋２／Ｍｇ＋２、１％ＢＳＡ）で１回洗浄し、５％ヤギ血清を含有するＦＡＣＳバッファーに再懸濁した。約１～２×１０５（１００μＬ中）を９６ウェルＵ字型底プレートに添加し、氷上で３０分間インキュベートした。プレートは遠心分離し、上澄みは取り除いた。５％ヤギ血清及び蛍光色素標識抗体カクテルを含有するＦＡＣＳバッファーに希釈した５～０．００００１６μｇ／ｍＬに及ぶ最終濃度で１対５倍希釈を通じて調製された滴定されたＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴ又はアイソタイプコントロール（２５μＬ）をそれぞれのウェルに添加し、次に、プレートを氷上で１時間インキュベートした。同時に、補償及びＦＭＯ対照も調製した。インキュベーションに続いて、細胞は遠心分離し、ＦＡＣＳバッファーで２回洗浄した。二次抗体（ＰＥコンジュゲート）は、５％ヤギ血清を含有するＦＡＣＳバッファーに１対２，０００希釈し、５０μＬをそれぞれのウェルに添加した。プレートは氷上で１時間インキュベートした。インキュベーションに続いて、細胞はＦＡＣＳバッファーで２回洗浄し、ＰＢＳ中０．５％ＰＦＡの２００μＬに再懸濁した。プレートはＦＡＣＳ（Ｃａｎｔｏ ＩＩ、ＢＤ）上で読み取り、生細胞は、前方及び側方散乱に基づいてゲート開閉した。フローデータ（ＦＣＳ ３．０ファイル）はＦｌｏｗＪｏ Ｖｅｒｓｉｏｎ １０ソフトウェアを使用して解析し、結合曲線及び結合ＥＣ５０値は、グラフパッドプリズム７．０ソフトウェアを使用して生成した。
凍結したヒト又はカニクイザルＰＢＭＣ（標準Ｆｉｃｏｌｌ Ｐａｑｕｅ分離法を使用して血液ドナーから単離される）はＲＰＭＩ１６４０／１０％ ＦＢＳ培地に解凍し、ＦＡＣＳバッファー（ＤＰＢＳ、ｗ／ｏ Ｃａ＋２／Ｍｇ＋２、１％ＢＳＡ）で１回洗浄し、５％ヤギ血清を含有するＦＡＣＳバッファーに再懸濁した。約１～２×１０５（１００μＬ中）を９６ウェルＵ字型底プレートに添加し、氷上で３０分間インキュベートした。プレートは遠心分離し、上澄みは取り除いた。５％ヤギ血清及び蛍光色素標識抗体カクテルを含有するＦＡＣＳバッファーに希釈した５～０．００００１６μｇ／ｍＬに及ぶ最終濃度で１対５倍希釈を通じて調製された滴定されたＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴ又はアイソタイプコントロール（２５μＬ）をそれぞれのウェルに添加し、次に、プレートを氷上で１時間インキュベートした。同時に、補償及びＦＭＯ対照も調製した。インキュベーションに続いて、細胞は遠心分離し、ＦＡＣＳバッファーで２回洗浄した。二次抗体（ＰＥコンジュゲート）は、５％ヤギ血清を含有するＦＡＣＳバッファーに１対２，０００希釈し、５０μＬをそれぞれのウェルに添加した。プレートは氷上で１時間インキュベートした。インキュベーションに続いて、細胞はＦＡＣＳバッファーで２回洗浄し、ＰＢＳ中０．５％ＰＦＡの２００μＬに再懸濁した。プレートはＦＡＣＳ（Ｃａｎｔｏ ＩＩ、ＢＤ）上で読み取り、生細胞は、前方及び側方散乱に基づいてゲート開閉した。フローデータ（ＦＣＳ ３．０ファイル）はＦｌｏｗＪｏ Ｖｅｒｓｉｏｎ １０ソフトウェアを使用して解析し、結合曲線及び結合ＥＣ５０値は、グラフパッドプリズム７．０ソフトウェアを使用して生成した。
７．９．２．結果
ＥＣＬ細胞結合
表２５にまとめられているように、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴは、ＨｕＴ７８細胞、ヒト及びカニクイザル血液由来リンパ球についてそれぞれ２６ｐＭ、１３０ｐＭ、６２ｐＭの結合ＥＣ５０値を示した。
ＥＣＬ細胞結合
表２５にまとめられているように、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴは、ＨｕＴ７８細胞、ヒト及びカニクイザル血液由来リンパ球についてそれぞれ２６ｐＭ、１３０ｐＭ、６２ｐＭの結合ＥＣ５０値を示した。
ヒト及びカニクイザル末梢Ｔ細胞結合アッセイ
ヒトとカニクイザル血液由来全、ナイーブ並びにメモリーＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞両方に対するＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴの結合ＥＣ５０値は表２６に示されている。
ヒトとカニクイザル血液由来全、ナイーブ並びにメモリーＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞両方に対するＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴの結合ＥＣ５０値は表２６に示されている。
平均結合ＥＣ５０値は、評価されたすべてのＴ細胞サブセット上で１０～１６５ｐＭに及ぶ。Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴは、ヒト及びカニクイザルＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞又はそのサブセットに非常に類似した形で結合する。なぜならば、それぞれの対応する細胞型についての平均ＥＣ５０値は、これらの２つの種間で２～３倍しか変動しないからである。
ヒト及びカニクイザルＣＤ４＋及びＣＤ８＋ＴサブセットへのＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴの結合は、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴ結合Ｔ細胞サブセットのパーセンテージを比較するためにも分析し、図１３に示されている。全体では、それぞれのＴ細胞サブセット中のＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴ結合細胞のパーセンテージは、ヒトとカニクイザルの間で匹敵する。これらの発見は、ヒト及びカニクイザル由来のα４とβ７の両方は高度に相同的である（９７％アミノ酸同一性、表２７参照）という事実があるので驚くことではなかった。
さらに、カニクイザルに対するＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴの機能的交差反応性は、ｉｎ ｖｉｖｏ研究で確かめた。カニクイザルでＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴを繰り返し投与すると、α４β７受容体が完全に占められた時には、末梢血ＣＤ４＋Ｔ細胞数は増加した。これらのデータは、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴのオンターゲット機能的薬力学的効果を示しており、カニクイザルをＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴの毒性学的評価のための薬理学的に妥当な種として支持した。
要約すれば、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴは、ヒトとカニクイザルＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔサブセットの両方に強く結合し、優れたカニクイザル結合交差反応性を実証している。
［実施例１０］
７．１０．Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴのインテグリン結合特異性
７．１０．１．材料及び方法
個別のヒト及びカニクイザルヘテロ二量体インテグリンα４β７、α４β１及びαＥβ７を発現する組換え細胞により、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴの結合特異性の評価が可能になった。
７．１０．Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴのインテグリン結合特異性
７．１０．１．材料及び方法
個別のヒト及びカニクイザルヘテロ二量体インテグリンα４β７、α４β１及びαＥβ７を発現する組換え細胞により、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴの結合特異性の評価が可能になった。
Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴは、ヒト上皮ＨＥＫ２９３細胞への非特異的結合についても評価した。
インテグリン結合特異性アッセイ
種々のヒト及びカニクイザルインテグリン（α４β７、α４β１又はαＥβ７）発現ＣＨＯ－Ｋ１又はＢＡＦ３細胞は、カニクイザルα４β１を除いて、収集し、数を数え、ミリリットル当たり１．５×１０６細胞の密度でＦＡＣＳバッファー（ＤＰＢＳ、ｗ／ｏ Ｃａ＋２／Ｍｇ＋２、１％ＢＳＡ）中で調製した。１．５×１０５細胞を含有する１００μＬを、９６ウェルＵ字型底プレートのそれぞれのウェルに添加し、遠心分離して上澄みを取り除いた。ＦＡＣＳバッファー中の滴定されたＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴ、アッセイ対照又はアイソタイプコントロール（それぞれ１００μＬ）を添加して、細胞ペレットを元に戻した。ウェル内容物は混合し、続いて氷上で１時間インキュベートした。細胞はＦＡＣＳバッファーで２回洗浄し、次に、ＦＡＣＳバッファー中１対６００希釈二次抗体（ヤギ抗ｈｕ ＩｇＧ Ｆｃγ特異的Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８）の１００μＬをそれぞれのウェルに添加して混合させた。プレートは氷上で４５分間インキュベートした。続いて、細胞はＦＡＣＳバッファーで２回洗浄し、ＰＢＳ中０．５％ＰＦＡの２００μＬに再懸濁した。プレートはＦＡＣＳ（Ｃａｎｔｏ ＩＩ、ＢＤ）上で読み取り、生細胞は、前方及び側方散乱に基づいて測定した。細胞結合抗体についての蛍光強度中央値は、グラフパッドプリズム７．０ソフトウェアを使用して生成した。
種々のヒト及びカニクイザルインテグリン（α４β７、α４β１又はαＥβ７）発現ＣＨＯ－Ｋ１又はＢＡＦ３細胞は、カニクイザルα４β１を除いて、収集し、数を数え、ミリリットル当たり１．５×１０６細胞の密度でＦＡＣＳバッファー（ＤＰＢＳ、ｗ／ｏ Ｃａ＋２／Ｍｇ＋２、１％ＢＳＡ）中で調製した。１．５×１０５細胞を含有する１００μＬを、９６ウェルＵ字型底プレートのそれぞれのウェルに添加し、遠心分離して上澄みを取り除いた。ＦＡＣＳバッファー中の滴定されたＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴ、アッセイ対照又はアイソタイプコントロール（それぞれ１００μＬ）を添加して、細胞ペレットを元に戻した。ウェル内容物は混合し、続いて氷上で１時間インキュベートした。細胞はＦＡＣＳバッファーで２回洗浄し、次に、ＦＡＣＳバッファー中１対６００希釈二次抗体（ヤギ抗ｈｕ ＩｇＧ Ｆｃγ特異的Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８）の１００μＬをそれぞれのウェルに添加して混合させた。プレートは氷上で４５分間インキュベートした。続いて、細胞はＦＡＣＳバッファーで２回洗浄し、ＰＢＳ中０．５％ＰＦＡの２００μＬに再懸濁した。プレートはＦＡＣＳ（Ｃａｎｔｏ ＩＩ、ＢＤ）上で読み取り、生細胞は、前方及び側方散乱に基づいて測定した。細胞結合抗体についての蛍光強度中央値は、グラフパッドプリズム７．０ソフトウェアを使用して生成した。
カニクイザルα４β１を発現するＣＨＯ－Ｋ１では、それぞれ１対２５希釈でのＣＤ２９－ＡＰＣ及びＣＤ４９ｄ－ＢＶ４２１混合物の２５μＬ並びにＦＡＣＳバッファー中１対５倍段階希釈により調製されたＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴ、アッセイ対照又はアイソタイプコントロールの２５μＬを含有する抗体染色カクテルを、９６ウェルＵ字型底のそれぞれのウェルに添加し、カニクイザルα４β１細胞ペレットを元に戻した。ウェル内容物は混合し、続いて氷上で４５分間インキュベートした。併せて、染色対照も調製した。細胞はＦＡＣＳバッファーで２回洗浄し、次に、ＦＡＣＳバッファー中１対６００希釈二次抗体（ヤギ抗ｈｕ ＩｇＧ Ｆｃγ特異的ＰＥ）５０μＬをそれぞれのウェルに添加して、混合した。プレートは氷上でさらに４５分間インキュベートした。続いて、細胞はＦＡＣＳバッファーで２回洗浄し、ＰＢＳ中０．５％ＰＦＡの２００μＬに再懸濁した。プレートはＦＡＣＳ（Ｃａｎｔｏ ＩＩ、ＢＤ）上で読み取り、生細胞は、前方及び側方散乱に基づいてゲート開閉した。次に、ＣＤ２９＋ＣＤ４９ｄ＋細胞をゲート開閉して、ＦｌｏｗＪｏバージョン１０ソフトウェアを使用して細胞結合試験抗体について蛍光強度中央値を決定した。データはグラフパッドプリズム７．０ソフトウェアを使用してプロットした。
非特異的ＨＥＫ２９３細胞結合アッセイ
ＨＥＫ２９３細胞は完全ＤＭＥＭ（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋１％ピルビン酸Ｎａ）で培養した。細胞は、非酵素的解離バッファー（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｔ１３１５１－０１４）を使用して収集し、数を数えて、ＦＡＣＳバッファー（２％ ＢＳＡ／ＰＢＳ）に１．５×１０６細胞／ｍＬで再懸濁した。９６ウェルＵ字型底プレートのそれぞれのウェルに、７．５×１０４細胞を分散させた。Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴ、陽性対照抗体又はアイソタイプコントロール抗体をそれぞれのウェルに１００μｇ／ｍＬで添加し、氷上で１時間インキュベートした。インキュベーションに続いて、細胞はＦＡＣＳバッファーで２回洗浄し、ＦＡＣＳバッファー中１対１００希釈ヤギ抗ｈｕＩｇＧ Ｆｃ－ＰＥ（Ｊａｃｋｓｏｎ、Ｃａｔ１０９－１１６－０９８）の１００μＬと一緒に氷上で３０分間さらにインキュベートした。続いて、細胞はＦＡＣＳバッファーで２回洗浄し、２００μＬのＦＡＣＳバッファーに再懸濁した。プレートはＦＡＣＳ（Ｃａｎｔｏ ＩＩ、ＢＤ）により読み取った。結合データはグラフパッドプリズム７．０ソフトウェアを使用して解析した。
ＨＥＫ２９３細胞は完全ＤＭＥＭ（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋１％ピルビン酸Ｎａ）で培養した。細胞は、非酵素的解離バッファー（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｔ１３１５１－０１４）を使用して収集し、数を数えて、ＦＡＣＳバッファー（２％ ＢＳＡ／ＰＢＳ）に１．５×１０６細胞／ｍＬで再懸濁した。９６ウェルＵ字型底プレートのそれぞれのウェルに、７．５×１０４細胞を分散させた。Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴ、陽性対照抗体又はアイソタイプコントロール抗体をそれぞれのウェルに１００μｇ／ｍＬで添加し、氷上で１時間インキュベートした。インキュベーションに続いて、細胞はＦＡＣＳバッファーで２回洗浄し、ＦＡＣＳバッファー中１対１００希釈ヤギ抗ｈｕＩｇＧ Ｆｃ－ＰＥ（Ｊａｃｋｓｏｎ、Ｃａｔ１０９－１１６－０９８）の１００μＬと一緒に氷上で３０分間さらにインキュベートした。続いて、細胞はＦＡＣＳバッファーで２回洗浄し、２００μＬのＦＡＣＳバッファーに再懸濁した。プレートはＦＡＣＳ（Ｃａｎｔｏ ＩＩ、ＢＤ）により読み取った。結合データはグラフパッドプリズム７．０ソフトウェアを使用して解析した。
７．１０．２．結果
インテグリン結合特異性
図１４Ａ～１４Ｃに示されるように、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴはヒトα４β７発現細胞に特異的に結合し、ヒトα４β１発現細胞には結合せず、抗α４ｍＡｂ、Ａｂ－ｎａｔａは両インテグリンに確かに結合した。Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴは、抗β７ｍＡｂ、研究グレードのエトロリズマブについて観察されたはるかに強力な結合と比べてヒトαＥβ７発現細胞には最小限に結合した。Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴは、カニクイザルインテグリンには類似する結合特異性プロファイルを示した。これらのデータにより、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴは、ヒトとカニクイザルα４β７の両方に対し結合特異性を有することが示された。
インテグリン結合特異性
図１４Ａ～１４Ｃに示されるように、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴはヒトα４β７発現細胞に特異的に結合し、ヒトα４β１発現細胞には結合せず、抗α４ｍＡｂ、Ａｂ－ｎａｔａは両インテグリンに確かに結合した。Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴは、抗β７ｍＡｂ、研究グレードのエトロリズマブについて観察されたはるかに強力な結合と比べてヒトαＥβ７発現細胞には最小限に結合した。Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴは、カニクイザルインテグリンには類似する結合特異性プロファイルを示した。これらのデータにより、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴは、ヒトとカニクイザルα４β７の両方に対し結合特異性を有することが示された。
非特異的ＨＥＫ２９３細胞結合
Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴは、ヒト上皮ＨＥＫ２９３細胞への非特異的結合についても評価した。図１５に示されるように、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴは、対照抗体に匹敵して、高濃度（１００μｇ／ｍＬ）ではＨＥＫ２９３細胞への非特異的結合は全く見せず、陽性対照ｍＡｂはこれらの細胞に強い非特異的結合を示した。
Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴは、ヒト上皮ＨＥＫ２９３細胞への非特異的結合についても評価した。図１５に示されるように、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴは、対照抗体に匹敵して、高濃度（１００μｇ／ｍＬ）ではＨＥＫ２９３細胞への非特異的結合は全く見せず、陽性対照ｍＡｂはこれらの細胞に強い非特異的結合を示した。
［実施例１１］
７．１１．Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴのウサギ及び齧歯動物結合交差反応性
７．１１．１．材料及び方法
ウサギ、ラット及びマウスから単離されたＰＢＭＣへのＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴの結合は、フローサイトメトリーによって評価した。
７．１１．Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴのウサギ及び齧歯動物結合交差反応性
７．１１．１．材料及び方法
ウサギ、ラット及びマウスから単離されたＰＢＭＣへのＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴの結合は、フローサイトメトリーによって評価した。
ウサギ及び齧歯動物交差反応性結合アッセイ
ウサギＰＢＭＣを解凍し、ＲＰＭＩ１６４０／１０％ ＦＢＳ培地に置き、ＦＡＣＳバッファー（ＤＰＢＳ、ｗ／ｏ Ｃａ＋２／Ｍｇ＋２、１％ＢＳＡ）で１回洗浄し、５％ヤギ血清を含有するＦＡＣＳバッファーに再懸濁した。細胞（１００μＬ中１×１０５）を９６ウェルＵ字型底プレート中に分散させ、氷上で３０分間インキュベートした。プレートは遠心分離して上澄みを取り除き、滴定されたＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴ又はアイソタイプコントロールの２５μＬプラス１対１０希釈ＣＤ４－ＦＩＴＣ抗体の２５μＬ（ＡｂはすべてＦＡＣＳバッファーに希釈される）をそれぞれのウェルに添加し、細胞ペレットを元に戻した。ウェル内容物は混合し、続いて氷上で４５分間インキュベートした。併せて、適切な染色対照も調製した。続いて、細胞はＦＡＣＳバッファーで２回洗浄し、二次抗体－ＰＥの５０μＬを、５％ヤギ血清を含有するＦＡＣＳバッファーに１対２０００希釈で細胞ペレットに添加した。プレートは氷上４５分間さらにインキュベートした。細胞はＦＡＣＳバッファーで２回洗浄し、ＰＢＳ中０．５％ＰＦＡの２００μＬに再懸濁した。プレートはＦＡＣＳ（Ｃａｎｔｏ ＩＩ、ＢＤ）上で読み取り、生細胞は、前方及び側方散乱に基づいてゲート開閉した。パーセンテージ抗体結合細胞は、ＦｌｏｗＪｏバージョン１０ソフトウェアを使用して決定し、結合曲線及び結合ＥＣ５０値はグラフパッドプリズム７．０ソフトウェアを使用して生成した。
ウサギＰＢＭＣを解凍し、ＲＰＭＩ１６４０／１０％ ＦＢＳ培地に置き、ＦＡＣＳバッファー（ＤＰＢＳ、ｗ／ｏ Ｃａ＋２／Ｍｇ＋２、１％ＢＳＡ）で１回洗浄し、５％ヤギ血清を含有するＦＡＣＳバッファーに再懸濁した。細胞（１００μＬ中１×１０５）を９６ウェルＵ字型底プレート中に分散させ、氷上で３０分間インキュベートした。プレートは遠心分離して上澄みを取り除き、滴定されたＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴ又はアイソタイプコントロールの２５μＬプラス１対１０希釈ＣＤ４－ＦＩＴＣ抗体の２５μＬ（ＡｂはすべてＦＡＣＳバッファーに希釈される）をそれぞれのウェルに添加し、細胞ペレットを元に戻した。ウェル内容物は混合し、続いて氷上で４５分間インキュベートした。併せて、適切な染色対照も調製した。続いて、細胞はＦＡＣＳバッファーで２回洗浄し、二次抗体－ＰＥの５０μＬを、５％ヤギ血清を含有するＦＡＣＳバッファーに１対２０００希釈で細胞ペレットに添加した。プレートは氷上４５分間さらにインキュベートした。細胞はＦＡＣＳバッファーで２回洗浄し、ＰＢＳ中０．５％ＰＦＡの２００μＬに再懸濁した。プレートはＦＡＣＳ（Ｃａｎｔｏ ＩＩ、ＢＤ）上で読み取り、生細胞は、前方及び側方散乱に基づいてゲート開閉した。パーセンテージ抗体結合細胞は、ＦｌｏｗＪｏバージョン１０ソフトウェアを使用して決定し、結合曲線及び結合ＥＣ５０値はグラフパッドプリズム７．０ソフトウェアを使用して生成した。
メスＣ５７Ｂ／６Ｎマウス及びメスルイスラットは、それぞれＴａｃｏｎｉｃ研究所及びＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ研究所から受け取った。ＰＢＭＣはプールされたマウスから単離され、ラット血液はラット動物から単離された。赤血球はＲＢＣ溶解バッファー（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して溶解した。細胞はＰＢＳで１回洗浄し、５％ヤギ血清を含有するＦＡＣＳバッファー（ＤＰＢＳ、ｗ／ｏ Ｃａ＋２／Ｍｇ＋２、１％ＢＳＡ）に再懸濁した。おおよそ２．５×１０５細胞（１００μＬ）は、９６ウェルＵ字型底プレートに添加し、次に氷上で３０分間インキュベートした。適切な蛍光色素コンジュゲート抗体は、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴ又はアイソタイプコントロールに加えて、１対５０希釈でマウス細胞（ＣＤ３－ＡＰＣ、α４β７－ＰＥ又はＩｇＧ２ａ－ＦＩＴＣ対照）又はラット細胞（ＣＤ３－ＡＰＣ、α４－ＦＩＴＣ又はＩｇＧ２ａ－ＰＥ対照）に添加した。ウェル内容物は徹底的に混合し、プレートは氷上で１時間インキュベートした。最終濃度は、アイソタイプコントロール及びＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴでは１０及び１μｇ／ｍＬであった。続いて、細胞はＦＡＣＳバッファーで２回洗浄し、二次抗体－ＰＥ又は二次抗体－ＡＦ４８８の１００μＬは１対８００希釈でウェルに添加し、ウェルは氷上で４５分間インキュベートした。インキュベーションに続いて、細胞はＦＡＣＳバッファーで２回洗浄し、ＰＢＳ中０．５％ＰＦＡの２００μＬに再懸濁した。プレートはＦＡＣＳ（Ｃａｎｔｏ ＩＩ、ＢＤ）上で読み取り、生細胞は、前方及び側方散乱に基づいてゲート開閉した。試験抗体又はアイソタイプコントロールに結合したパーセンテージＣＤ３＋細胞は、ＦｌｏｗＪｏバージョン１０ソフトウェアを使用して決定し、グラフパッドプリズム７．０ソフトウェアを使用してグラフで表した。
７．１１．２．結果
表２８にまとめたように、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴは、ヒト及びカニクイザル対応物と比べて、ウサギリンパ球及びＣＤ４＋Ｔ細胞について類似する結合ＥＣ５０値を示し、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴは、ラット又はマウスＰＢＭＣ（リンパ球及びＣＤ４＋Ｔ細胞）への測定できるほどの結合は全く示さなかった。
表２８にまとめたように、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴは、ヒト及びカニクイザル対応物と比べて、ウサギリンパ球及びＣＤ４＋Ｔ細胞について類似する結合ＥＣ５０値を示し、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴは、ラット又はマウスＰＢＭＣ（リンパ球及びＣＤ４＋Ｔ細胞）への測定できるほどの結合は全く示さなかった。
［実施例１２］
７．１２．Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴ誘導α４β７内部移行
７．１２．１．材料及び方法
Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴは、２人のＰＢＭＣドナー由来のヒト一次ＣＤ４＋及びＣＤ８＋ナイーブＴ細胞上で細胞表面α４β７の内部移行を誘導するその能力について調べた。
７．１２．Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴ誘導α４β７内部移行
７．１２．１．材料及び方法
Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴは、２人のＰＢＭＣドナー由来のヒト一次ＣＤ４＋及びＣＤ８＋ナイーブＴ細胞上で細胞表面α４β７の内部移行を誘導するその能力について調べた。
内部移行アッセイ
Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴ内部移行は、エトロリズマブの細胞機構を決定するのに使用されたのと類似のＦＡＣＳプロトコルを使用して調べ定量化した（Ｌｉｃｈｎｏｇら、Ｆｒｏｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ）。末梢血単核球（ＰＢＭＣ）は、Ｆｉｃｏｌｌ Ｐａｑｕｅ（ＧＥ １７－１４４０－０３）及びＳｅｐＭａｔｅチューブ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ ８５４５０）を使用して２人の健康な血液ドナー（ＲＢＣ、Ｄｏｎｏｒ ＫＰ５８２１９及びＫＰ５８２３９）から単離し、５％ＤＭＳＯを含有するＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ １０４３８－０２６）に再懸濁し、液体窒素に凍結保存した。凍結ＰＢＭＣを解凍し、数を数え、ＲＰＭＩ培地＋１０％ ＦＢＳ中１×１０６細胞／ｍＬで元に戻し、１００μＬの細胞をウェル当たり１×１０５細胞で蒔いた。次に、蒔いた細胞を４℃でインキュベートする又は３７℃、５％ＣＯ２インキュベータに３０分間置いてプレート温度を順応させた。ヒトＰＢＭＣは、１．２５μｇ／ｍＬ（最終０．６２５μｇ／ｍＬ）での２×濃縮、非標識Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴ抗体の１００μＬと一緒に４℃で１時間、前インキュベートさせた。細胞は遠心分離し、洗浄して、２００μＬのＲＰＭＩ＋１０％ ＦＢＳに再懸濁し、４℃又は３７℃、５％ＣＯ２で１８時間インキュベートした。インキュベーションに続いて、細胞はＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ＋１％ＦＢＳ）で２回洗浄し、次に、ＡＦ６４７標識非競合抗β７抗体と一緒に又はこれなしで、ＣＤ４＋（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ３１７４１０）、ＣＤ８＋（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ３４４７１０）及びＣＤ４５ＲＡ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ３０４１３０）を用いて３０分間染色した。細胞蛍光はフローサイトメトリー（ＬＳＲ－Ｆｏｒｔｅｓｓａ）により獲得した。データは、ＦｌｏｗＪｏ １０ソフトウェアを使用して解析し、パーセンテージ内部移行は、１００×［内部移行前の全細胞表面α４β７発現（４℃でＭＦＩ）－内部移行後の残りの細胞表面α４β７発現（３７℃でＭＦＩ）／内部移行前の全細胞表面α４β７発現（４℃でＭＦＩ）］により計算した。
Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴ内部移行は、エトロリズマブの細胞機構を決定するのに使用されたのと類似のＦＡＣＳプロトコルを使用して調べ定量化した（Ｌｉｃｈｎｏｇら、Ｆｒｏｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ）。末梢血単核球（ＰＢＭＣ）は、Ｆｉｃｏｌｌ Ｐａｑｕｅ（ＧＥ １７－１４４０－０３）及びＳｅｐＭａｔｅチューブ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ ８５４５０）を使用して２人の健康な血液ドナー（ＲＢＣ、Ｄｏｎｏｒ ＫＰ５８２１９及びＫＰ５８２３９）から単離し、５％ＤＭＳＯを含有するＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ １０４３８－０２６）に再懸濁し、液体窒素に凍結保存した。凍結ＰＢＭＣを解凍し、数を数え、ＲＰＭＩ培地＋１０％ ＦＢＳ中１×１０６細胞／ｍＬで元に戻し、１００μＬの細胞をウェル当たり１×１０５細胞で蒔いた。次に、蒔いた細胞を４℃でインキュベートする又は３７℃、５％ＣＯ２インキュベータに３０分間置いてプレート温度を順応させた。ヒトＰＢＭＣは、１．２５μｇ／ｍＬ（最終０．６２５μｇ／ｍＬ）での２×濃縮、非標識Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴ抗体の１００μＬと一緒に４℃で１時間、前インキュベートさせた。細胞は遠心分離し、洗浄して、２００μＬのＲＰＭＩ＋１０％ ＦＢＳに再懸濁し、４℃又は３７℃、５％ＣＯ２で１８時間インキュベートした。インキュベーションに続いて、細胞はＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ＋１％ＦＢＳ）で２回洗浄し、次に、ＡＦ６４７標識非競合抗β７抗体と一緒に又はこれなしで、ＣＤ４＋（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ３１７４１０）、ＣＤ８＋（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ３４４７１０）及びＣＤ４５ＲＡ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ３０４１３０）を用いて３０分間染色した。細胞蛍光はフローサイトメトリー（ＬＳＲ－Ｆｏｒｔｅｓｓａ）により獲得した。データは、ＦｌｏｗＪｏ １０ソフトウェアを使用して解析し、パーセンテージ内部移行は、１００×［内部移行前の全細胞表面α４β７発現（４℃でＭＦＩ）－内部移行後の残りの細胞表面α４β７発現（３７℃でＭＦＩ）／内部移行前の全細胞表面α４β７発現（４℃でＭＦＩ）］により計算した。
７．１２．２．結果
図１６Ａに示されるように、内部移行を最小にするために、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴが４℃でヒトＰＢＭＣに結合した１８時間後に評価した場合、ドナー１由来のＣＤ４＋ナイーブＴ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ＋）の７３％及びＣＤ８＋のナイーブＴ細胞（ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＡ＋）の４９％がβ７陽性のままであった。しかし、内部移行を促進するために同じプロトコル下でしかし３７℃でのＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴインキュベーション後では、ＣＤ４＋ナイーブＴ細胞の１７％及びＣＤ８＋ナイーブＴ細胞の７％だけがβ７陽性であることが見出された。これらのデータは、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴに結合した表面α４β７の有意な内部移行は３７℃で起こったことを示している。類似する結果がドナー２由来のＰＢＭＣを用いて観察された。図１６Ｂで３７℃でのα４β７内部移行の定量化に基づけば（４℃での処置後に観察された発現と比べて減少した表面α４β７発現）、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴは、α４β７＋ナイーブＣＤ４＋とＣＤ８＋Ｔ細胞の両方でα４β７内部移行を約８０％誘導することができた。
図１６Ａに示されるように、内部移行を最小にするために、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴが４℃でヒトＰＢＭＣに結合した１８時間後に評価した場合、ドナー１由来のＣＤ４＋ナイーブＴ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ＋）の７３％及びＣＤ８＋のナイーブＴ細胞（ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＡ＋）の４９％がβ７陽性のままであった。しかし、内部移行を促進するために同じプロトコル下でしかし３７℃でのＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴインキュベーション後では、ＣＤ４＋ナイーブＴ細胞の１７％及びＣＤ８＋ナイーブＴ細胞の７％だけがβ７陽性であることが見出された。これらのデータは、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴに結合した表面α４β７の有意な内部移行は３７℃で起こったことを示している。類似する結果がドナー２由来のＰＢＭＣを用いて観察された。図１６Ｂで３７℃でのα４β７内部移行の定量化に基づけば（４℃での処置後に観察された発現と比べて減少した表面α４β７発現）、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴは、α４β７＋ナイーブＣＤ４＋とＣＤ８＋Ｔ細胞の両方でα４β７内部移行を約８０％誘導することができた。
Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴは、Ａｂ－Ｖｅｄｏと比べてα４β７内部移行を誘導するのがより強力である。
［実施例１３］
７．１３．Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴによるＭＡｄＣＡＭ－１リガンド遮断
７．１３．１．材料及び方法
ＭＡｄＣＡＭ－１リガンド遮断アッセイ
ＦＡＣＳベースのアッセイでは、ＨｕＴ７８細胞又はヒトＰＢＭＣを収集し、ＤＰＢＳで１回洗浄し、１．５×１０６細胞／ｍＬの密度に調整して、ＦＡＣＳバッファー（ＤＰＢＳ、ｗ／ｏ Ｃａ＋２／Ｍｇ＋２、１％ＢＳＡ／１ｍＭ ＭｎＣｌ２）に再懸濁した。１×１０５（１００μＬ）／ウェルで細胞を９６ウェルＵ字型底プレート中に分散させ、遠心分離して上澄みを取り除いた。滴定したＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴ又はアイソタイプコントロール（５０μＬ）プラスＦＡＣＳバッファー中に０．３μｇ／ｍＬのＭＡｄＣＡＭ－１－ｍＦｃ、２ｍＭのＭｎＣｌ２及び１対５０希釈（３０μｇ／ｍＬ）Ａｌｅｘａ４８８コンジュゲート検出Ａｂを含有する５０μＬの混合物をそれぞれのウェルに添加した。プレートは氷上で１時間インキュベートし、次に遠心分離した。プレートは２００μＬのＦＡＣＳバッファーで１回穏やかに洗浄し、細胞は同じバッファーで元に戻した。プレートはＦＡＣＳ（Ｃａｎｔｏ ＩＩ）により読み取り、生細胞は、前方及び側方散乱ゲート開閉により決定した。フローデータ（ＦＣＳ ３．０ファイル）は、ＦｌｏｗＪｏバージョン１０ソフトウェアを使用して解析し、結合曲線及び阻害ＩＣ５０値はグラフパッドプリズム７．０ソフトウェアを使用して生成した。
７．１３．Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴによるＭＡｄＣＡＭ－１リガンド遮断
７．１３．１．材料及び方法
ＭＡｄＣＡＭ－１リガンド遮断アッセイ
ＦＡＣＳベースのアッセイでは、ＨｕＴ７８細胞又はヒトＰＢＭＣを収集し、ＤＰＢＳで１回洗浄し、１．５×１０６細胞／ｍＬの密度に調整して、ＦＡＣＳバッファー（ＤＰＢＳ、ｗ／ｏ Ｃａ＋２／Ｍｇ＋２、１％ＢＳＡ／１ｍＭ ＭｎＣｌ２）に再懸濁した。１×１０５（１００μＬ）／ウェルで細胞を９６ウェルＵ字型底プレート中に分散させ、遠心分離して上澄みを取り除いた。滴定したＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴ又はアイソタイプコントロール（５０μＬ）プラスＦＡＣＳバッファー中に０．３μｇ／ｍＬのＭＡｄＣＡＭ－１－ｍＦｃ、２ｍＭのＭｎＣｌ２及び１対５０希釈（３０μｇ／ｍＬ）Ａｌｅｘａ４８８コンジュゲート検出Ａｂを含有する５０μＬの混合物をそれぞれのウェルに添加した。プレートは氷上で１時間インキュベートし、次に遠心分離した。プレートは２００μＬのＦＡＣＳバッファーで１回穏やかに洗浄し、細胞は同じバッファーで元に戻した。プレートはＦＡＣＳ（Ｃａｎｔｏ ＩＩ）により読み取り、生細胞は、前方及び側方散乱ゲート開閉により決定した。フローデータ（ＦＣＳ ３．０ファイル）は、ＦｌｏｗＪｏバージョン１０ソフトウェアを使用して解析し、結合曲線及び阻害ＩＣ５０値はグラフパッドプリズム７．０ソフトウェアを使用して生成した。
プレートベースのアッセイでは、９６ウェル平底プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ、Ｃａｔ ６５５０７７）を、コーティングバッファー（ＰＢＳ ｗ／ｏ Ｃａ＋２／Ｍｇ＋２、０．１％ＢＳＡ）を使用して４℃で一晩、１００μＬの２０μｇ／ｍＬ ＭＡｄＣＡＭ－１ ｈＦｃ又はアイソタイプコントロール（最終濃度２μｇ／ウェル）で被覆した。次の日、プレートを２００μＬの洗浄バッファー（ＰＢＳ ｗ／Ｃａ＋２／Ｍｇ＋２、０．１％ＢＳＡ）で２回洗浄し、次に、ブロッキングバッファー（ＰＢＳ ｗ／Ｃａ＋２／Ｍｇ＋２、１％ＢＳＡ）を使用して３７℃で１時間遮断した。ブロッキングインキュベーション中、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴ及びアイソタイプコントロールの希釈液を調製し、ＨｕＴ７８細胞を収集した。２×開始濃度は５μｇ／ｍＬで調製し、次に段階１対４．５ ７ポイント希釈（最終濃度は２．５～０．０００３μｇ／ｍＬに及ぶ）は２通り又は３通り実施した。細胞は数え、洗浄し、アッセイ培地（ＩＭＤＭ、１％ ＢＳＡ）に２×１０６細胞／ｍＬで再懸濁し、これに最終濃度２ｍＭのＭｎＣｌ２を添加し、１００，０００細胞を９６ウェルプレートのそれぞれのウェルに分散させた。次に、希釈した抗体を細胞に添加し、混合物は３７℃、５％ＣＯ２で３０分間インキュベートした。ＭＡｄＣＡＭ－１ ｈＦｃ被覆プレートからのブロッキング液はデカントし、１００μＬ／ウェルの前インキュベートしたＨｕＴ７８細胞及びｍＡｂ混合物はＭＡｄＣＡＭ－１ ｈＦｃ被覆プレートのそれぞれのウェル中に分配した。プレートは１，０００ｒｐｍで１分間回転させ、３７℃、５％ＣＯ２で３０分間インキュベートした。接着プレートはデカントし、１５０μＬの洗浄バッファーで４回穏やかに洗浄した。洗浄後、１００μＬ／ウェルの混合物（５０μＬのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ試薬及び５０μＬのアッセイ培地を含有する）をそれぞれのウェルに添加した。プレートはオービタルシェーカー上に２分間置き、次にＲＴで１０分間インキュベートした。プレート発光は発光プレートリーダー（Ｔｏｐｃｏｕｎｔ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）上で読み取った。発光シグナルをプロットし、ＩＣ５０値はグラフパッドプリズム７．０において４パラメータカーブフィット解析を使用して決定した。
７．１３．２．結果
Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴは、プレートベースとＦＡＣＳベースのアッセイの両方を使用して、α４β７発現ＨｕＴ７８細胞及びヒトリンパ球（ＰＢＭＣ）へのＭＡｄＣＡＭ－１タンパク質の組換え細胞外ドメインの結合を遮断するその能力について試験した。
Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴは、プレートベースとＦＡＣＳベースのアッセイの両方を使用して、α４β７発現ＨｕＴ７８細胞及びヒトリンパ球（ＰＢＭＣ）へのＭＡｄＣＡＭ－１タンパク質の組換え細胞外ドメインの結合を遮断するその能力について試験した。
ＦＡＣＳ－及びプレートベースのアッセイを使用することにより、それぞれ５０ｐＭ及び２５ｐＭのＩＣ５０値が得られた。
さらに、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴによるヒト血液由来リンパ球へのＭＡｄＣＡＭ－１結合の遮断が２２３ｐＭのＩＣ５０値で観察された（表２９）。
これらのデータにより、ＭＡｄＣＡＭ－１／α４β７相互作用に対するＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴの強い阻害効果が実証された。
［実施例１４］
７．１４．Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴはヒト一次ＣＤ４＋Ｔ細胞上でのＭＡｄＣＡＭ－１同時刺激を遮断する
７．１４．１．材料及び方法
ヒトＰＢＭＣ及びＣＤ４＋Ｔ細胞単離
ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）は健康なドナーから収集した新鮮な血液から単離された。次に、ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＣＤ４ネガティブセレクションキット（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してＰＢＭＣから単離した。
７．１４．Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴはヒト一次ＣＤ４＋Ｔ細胞上でのＭＡｄＣＡＭ－１同時刺激を遮断する
７．１４．１．材料及び方法
ヒトＰＢＭＣ及びＣＤ４＋Ｔ細胞単離
ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）は健康なドナーから収集した新鮮な血液から単離された。次に、ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＣＤ４ネガティブセレクションキット（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してＰＢＭＣから単離した。
ＣＤ４＋Ｔ細胞活性化及び増殖アッセイ
９６ウェル平底組織培養プレートを、ＨＢＳＳ中２００ｎｇ／ウェル抗ＣＤ３抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を用いて４℃で一晩被覆した。翌日、抗ＣＤ３被覆プレートをＨＢＳＳで１回洗浄し、２００ｎｇ／ウェルのＭＡｄＣＡＭ－１（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）と一緒に３７℃で１時間インキュベートした。インキュベーションに続いて、プレートは２００μｌのＨＢＳＳで１回洗浄し、５０，０００ＣＤ４＋Ｔ細胞を、１μｇ／ｍｌ試験抗体の存在下又は非存在下でそれぞれのウェルに添加した。細胞を３７℃、５％ＣＯ２で９６時間培養後、細胞は洗浄し、Ｌｉｖｅ－Ｄｅａｄ Ａｑｕａバイアビリティー色素（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）で染色し、続いて細胞活性化マーカー抗ＣＤ２５ ＦＩＴＣ（クローンＭＡ０２５１ ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）及び抗Ｋｉ６７ ＡＰＣ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で染色した。細胞はフローサイトメーター上で分析し、データはＦｌｏｗＪｏソフトウェアで解析した。複数のドナー由来のデータをプロットし、統計解析はグラフパッドプリズムを使用して実施した。有意性は、テューキー多重比較検定と連結させた一元配置分散分析を使用して決定された。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、＊＊ｐ＝０．００１～０．０１。
９６ウェル平底組織培養プレートを、ＨＢＳＳ中２００ｎｇ／ウェル抗ＣＤ３抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を用いて４℃で一晩被覆した。翌日、抗ＣＤ３被覆プレートをＨＢＳＳで１回洗浄し、２００ｎｇ／ウェルのＭＡｄＣＡＭ－１（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）と一緒に３７℃で１時間インキュベートした。インキュベーションに続いて、プレートは２００μｌのＨＢＳＳで１回洗浄し、５０，０００ＣＤ４＋Ｔ細胞を、１μｇ／ｍｌ試験抗体の存在下又は非存在下でそれぞれのウェルに添加した。細胞を３７℃、５％ＣＯ２で９６時間培養後、細胞は洗浄し、Ｌｉｖｅ－Ｄｅａｄ Ａｑｕａバイアビリティー色素（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）で染色し、続いて細胞活性化マーカー抗ＣＤ２５ ＦＩＴＣ（クローンＭＡ０２５１ ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）及び抗Ｋｉ６７ ＡＰＣ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で染色した。細胞はフローサイトメーター上で分析し、データはＦｌｏｗＪｏソフトウェアで解析した。複数のドナー由来のデータをプロットし、統計解析はグラフパッドプリズムを使用して実施した。有意性は、テューキー多重比較検定と連結させた一元配置分散分析を使用して決定された。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、＊＊ｐ＝０．００１～０．０１。
７．１４．２．結果
Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴはヒト一次ＣＤ４＋Ｔ細胞上でのＭＡｄＣＡＭ－１同時刺激を遮断する
α４β７＋ＣＤ４＋Ｔ細胞のＭＡｄＣＡＭ－１媒介腸管ホーミングは、ＧＡＬＴ（腸管関連リンパ組織）のＨＩＶ感染で中心的な役割を果たす。この役割に加えて、ＭＡｄＣＡＭ－１は同時刺激シグナルをヒト一次ＣＤ４＋Ｔ細胞に伝達し、ＨＩＶ複製を促進するとも報告されている（Ｎａｗａｚら、Ｍｕｃｏｓａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２０１８年）。ＨＩＶ感染及び複製はこれらの細胞の代謝的活性化を必要とし、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴはヒトリンパ球へのＭＡｄＣＡＭ－１結合を２２３ｐＭのＩＣ５０値で遮断できる（表３５）ので、本発明者らはＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴがヒト一次ＣＤ４＋Ｔ細胞上でＭＡｄＣＡＭ－１同時刺激シグナルを遮断でき、それにより今度はこれらの細胞においてＭＡｄＣＡＭ－１媒介ウイルス複製が阻害されるかどうかを評価した。
Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴはヒト一次ＣＤ４＋Ｔ細胞上でのＭＡｄＣＡＭ－１同時刺激を遮断する
α４β７＋ＣＤ４＋Ｔ細胞のＭＡｄＣＡＭ－１媒介腸管ホーミングは、ＧＡＬＴ（腸管関連リンパ組織）のＨＩＶ感染で中心的な役割を果たす。この役割に加えて、ＭＡｄＣＡＭ－１は同時刺激シグナルをヒト一次ＣＤ４＋Ｔ細胞に伝達し、ＨＩＶ複製を促進するとも報告されている（Ｎａｗａｚら、Ｍｕｃｏｓａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２０１８年）。ＨＩＶ感染及び複製はこれらの細胞の代謝的活性化を必要とし、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴはヒトリンパ球へのＭＡｄＣＡＭ－１結合を２２３ｐＭのＩＣ５０値で遮断できる（表３５）ので、本発明者らはＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴがヒト一次ＣＤ４＋Ｔ細胞上でＭＡｄＣＡＭ－１同時刺激シグナルを遮断でき、それにより今度はこれらの細胞においてＭＡｄＣＡＭ－１媒介ウイルス複製が阻害されるかどうかを評価した。
１人の代表的な健康なドナー由来のヒト一次ＣＤ４＋Ｔ細胞をプレート結合抗ＣＤ３単独と一緒に９６時間インキュベートすると、細胞の２２．６％が活性化されＫｉ６７＋ＣＤ２５＋表現型を示した（図１７Ａ）。細胞がプレート結合抗ＣＤ３及びＭＡｄＣＡＭ－１と併せて一緒にインキュベートされると、５６．６％のＣＤ４＋Ｔ細胞が活性化された。これは、ＭＡｄＣＡＭ－１が同時刺激シグナルを細胞表面α４β７と相互作用することにより媒介されるＣＤ４＋Ｔ細胞に伝達したことを示している。９６時間のインキュベーション中に細胞にＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴを添加すると、細胞活性化は２０．８％まで減少し、これは抗ＣＤ３単独に匹敵するレベルであり、アイソタイプコントロールＡｂは細胞活性化に対しては全く阻害効果がなかった。データによれば、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴが、ＭＡｄＣＡＭ－１が発揮する同時刺激シグナルを効果的に完全に遮断したことが示唆される。アッセイは、５人の追加の個々のドナー由来の一次ＣＤ４ Ｔ細胞を用いて繰り返し、データは図１７Ｂにまとめられている。図１７Ａにおいて１人の代表的なドナーから得られたデータと一致して、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴはＣＤ４＋Ｔ細胞のＭＡｄＣＡＭ－１／α４β７媒介同時刺激をほぼ完全に遮断し、アイソタイプコントロールＡｂには阻害効果は全くなかった。
［実施例１５］
７．１５．Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴのＶＣＡＭ－１リガンド遮断特異性
７．１５．１．材料及び方法
ＶＣＡＭ－１媒介細胞接着アッセイにおけるα４β７／ＶＣＡＭ－１相互作用に対するＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴの効果が評価された。
７．１５．Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴのＶＣＡＭ－１リガンド遮断特異性
７．１５．１．材料及び方法
ＶＣＡＭ－１媒介細胞接着アッセイにおけるα４β７／ＶＣＡＭ－１相互作用に対するＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴの効果が評価された。
ＶＣＡＭ－１リガンド遮断アッセイ
プレート（９６ウェル平底型、Ｇｒｅｉｎｅｒ、Ｃａｔ ６５５０７７）を、コーティングバッファー（ＰＢＳ ｗ／ｏ Ｃａ＋２／Ｍｇ＋２、０．１％ＢＳＡ）を使用して４℃で一晩、２０μｇ／ｍＬのＶＣＡＭ－１ ｈＦｃ又はアイソタイプコントロール（最終濃度２μｇ／ウェル）を１００μＬ用いて１日目に被覆した。２日目、プレートは２００μＬの洗浄バッファー（ＰＢＳ ｗ／Ｃａ＋２／Ｍｇ＋２、０．１％ＢＳＡ）で３回洗浄し、次に、ブロッキングバッファー（ＰＢＳ ｗ／Ｃａ＋２／Ｍｇ＋２、１％ＢＳＡ）を使用して３７℃で１時間又はそれよりも長く遮断した。ブロッキングインキュベーション中、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴ、Ａｂ－ｎａｔａ及びアイソタイプコントロールの希釈液を調製し、ＨｕＴ７８細胞を収集した。抗体の２×開始濃度は４μｇ／ｍＬで調製し、次にアッセイ培地（ＩＭＤＭ、１％ＢＳＡ）中１対４倍段階希釈液を作った。ＨｕＴ７８細胞の数を数え、洗浄しアッセイ培地中２×１０６細胞／ｍＬで再懸濁し、これに最終濃度２ｍＭのＭｎＣｌ２を添加し、１００，０００細胞を９６ウェルプレートのそれぞれのウェルに分散させた。次に、希釈した抗体を細胞に添加し、混合物は３７℃、５％ＣＯ２で３０分間インキュベートした。ＶＣＡＭ－１ ｈＦｃ被覆プレートからのブロッキング液はデカントし、１００μＬの前インキュベートしたＨｕＴ７８細胞及びｍＡｂ混合物はＶＣＡＭ－１ ｈＦｃ被覆プレートのそれぞれのウェル中に分配した。プレートは３７℃、５％ＣＯ２で３０分間インキュベートし、次に、洗浄バッファーを使用して３回穏やかに洗浄した。洗浄後、１００μＬ／ウェルの混合物（５０μＬのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ試薬及び５０μＬのアッセイ培地を含有する）をそれぞれのウェルに添加した。プレートはオービタルシェーカー上に２分間置き、次にＲＴで１０分間インキュベートした。プレート発光は発光プレートリーダー（Ｔｏｐｃｏｕｎｔ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）上で読み取った。発光シグナルをプロットし、グラフパッドプリズム７．０において４パラメータカーブフィット解析を使用してＩＣ５０値を決定した。
プレート（９６ウェル平底型、Ｇｒｅｉｎｅｒ、Ｃａｔ ６５５０７７）を、コーティングバッファー（ＰＢＳ ｗ／ｏ Ｃａ＋２／Ｍｇ＋２、０．１％ＢＳＡ）を使用して４℃で一晩、２０μｇ／ｍＬのＶＣＡＭ－１ ｈＦｃ又はアイソタイプコントロール（最終濃度２μｇ／ウェル）を１００μＬ用いて１日目に被覆した。２日目、プレートは２００μＬの洗浄バッファー（ＰＢＳ ｗ／Ｃａ＋２／Ｍｇ＋２、０．１％ＢＳＡ）で３回洗浄し、次に、ブロッキングバッファー（ＰＢＳ ｗ／Ｃａ＋２／Ｍｇ＋２、１％ＢＳＡ）を使用して３７℃で１時間又はそれよりも長く遮断した。ブロッキングインキュベーション中、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴ、Ａｂ－ｎａｔａ及びアイソタイプコントロールの希釈液を調製し、ＨｕＴ７８細胞を収集した。抗体の２×開始濃度は４μｇ／ｍＬで調製し、次にアッセイ培地（ＩＭＤＭ、１％ＢＳＡ）中１対４倍段階希釈液を作った。ＨｕＴ７８細胞の数を数え、洗浄しアッセイ培地中２×１０６細胞／ｍＬで再懸濁し、これに最終濃度２ｍＭのＭｎＣｌ２を添加し、１００，０００細胞を９６ウェルプレートのそれぞれのウェルに分散させた。次に、希釈した抗体を細胞に添加し、混合物は３７℃、５％ＣＯ２で３０分間インキュベートした。ＶＣＡＭ－１ ｈＦｃ被覆プレートからのブロッキング液はデカントし、１００μＬの前インキュベートしたＨｕＴ７８細胞及びｍＡｂ混合物はＶＣＡＭ－１ ｈＦｃ被覆プレートのそれぞれのウェル中に分配した。プレートは３７℃、５％ＣＯ２で３０分間インキュベートし、次に、洗浄バッファーを使用して３回穏やかに洗浄した。洗浄後、１００μＬ／ウェルの混合物（５０μＬのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ試薬及び５０μＬのアッセイ培地を含有する）をそれぞれのウェルに添加した。プレートはオービタルシェーカー上に２分間置き、次にＲＴで１０分間インキュベートした。プレート発光は発光プレートリーダー（Ｔｏｐｃｏｕｎｔ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）上で読み取った。発光シグナルをプロットし、グラフパッドプリズム７．０において４パラメータカーブフィット解析を使用してＩＣ５０値を決定した。
７．１５．２．結果
血液リンパ球の腸管ホーミングを可能にするＭＡｄＣＡＭ－１へのα４β７結合に加えて、α４β７は内皮細胞上で発現されるＶＣＡＭ－１にも結合できる（表３０）。
血液リンパ球の腸管ホーミングを可能にするＭＡｄＣＡＭ－１へのα４β７結合に加えて、α４β７は内皮細胞上で発現されるＶＣＡＭ－１にも結合できる（表３０）。
ナタリズマブ、Ａｂ－ｎａｔａ抗α４ ｍＡｂは、ＶＣＡＭ－１へのα４β７及びα４β１結合を遮断することができるが、脳への循環リンパ球の輸送を遮断するせいで進行性多巣性白質脳症（ＰＭＬ）を引き起こした。したがって、ＶＣＡＭ－１媒介細胞接着アッセイでのα４β７／ＶＣＡＭ－１相互作用に対するＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴの効果の評価は、Ａｂ－ｎａｔａを陽性対照として使用して調べるための非常に重要な安全パラメータであった。予想通り、Ａｂ－ｎａｔａは、ＶＣＡＭ－１媒介ＨｕＴ７８細胞接着を５６ｐＭの平均ＩＣ５０値で遮断した。これとは対照的に、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴは、ＶＣＡＭ－１により媒介されるＨｕＴ７８細胞接着の検出できるほどの遮断を全く示さなかった（図１８）。
Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴはα４β７／ＭＡｄＣＡＭ－１相互作用を高い効力で選択的に遮断するが、α４β７／ＶＣＡＭ－１相互作用の阻害は全く示さない。
［実施例１６］
７．１６．ヒト及びカニクイザルＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａ及びＦｃＲｎに対するＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴ結合親和性
７．１６．１．材料及び方法
Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴは、抗体ＩｇＧ１対照であるトラスツズマブと比べて、組換えヒト及びカニクイザルＦｃγＲ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）タンパク質のパネルへのその結合親和性についてＢＩＡｃｏｒｅにより評価した。
７．１６．ヒト及びカニクイザルＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａ及びＦｃＲｎに対するＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴ結合親和性
７．１６．１．材料及び方法
Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴは、抗体ＩｇＧ１対照であるトラスツズマブと比べて、組換えヒト及びカニクイザルＦｃγＲ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）タンパク質のパネルへのその結合親和性についてＢＩＡｃｏｒｅにより評価した。
ヒトＦｃγＲへのＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴ結合も、種々の細胞表面ヒトＦｃγＲを発現するように操作されたＣＨＯ－Ｋ１細胞を使用することによりフローサイトメトリーを介して評価した。
ヒト及びカニクイザルＦｃＲｎへのＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴの結合は、組換えヒト及びカニクイザルＦｃＲｎ ＥＣＤタンパク質を使用してＢＩＡｃｏｒｅによりｐＨ６．０及びｐＨ７．４で評価した（表３１）。
ヒト及びカニクイザルＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ及びＦｃγＲＩＩＩａ表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）結合アッセイ
Ｈｉｓタグ付きヒトＦｃγＲに対するＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴの結合速度論は、抗Ｈｉｓ補足を使用して２５℃でＢｉａｃｏｒｅＴ２００計器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で行うＳＰＲ測定により決定した。１０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）中２５μｇ／ｍＬまで希釈されたおおよそ１００００ＲＵのマウス抗Ｈｉｓ抗体（Ｒ＆Ｄ）を、標準アミンカップリングキットを製造業者の説明書に従って使用してＣＭ５バイオセンサーチップ中に固定化した。バイオセンサー表面の未反応部分は１Ｍのエタノールアミンで遮断した。フローセル１上の活性化及び非活性化表面は参照として使用された。チップ調製及び結合動力学測定はアッセイランニングバッファー、ＨＢＳ－ＥＰ＋（１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０）中で行われた。次に、ヒト及びカニクイザルＦｃγＲは、補足レベル２５０～５００ＲＵに達するまでフローセル２上で補足された。Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴ試料は、５０μＬ／分の流速で１～５分間（ヒト及びカニクイザルＦｃγＲＩＩｂ及びＦｃγＲＩＩａでは１分間、ヒトＦｃγＲＩＩＩａでは２分間並びにヒト及びカニクイザルＦｃγＲＩ＆カニクイザルＦｃγＲでは５分間）すべてのフローセル上に注入された。分析物濃度は、ヒト及びカニクイザルＦｃγＲＩ、カニクイザルＦｃγＲＩＩＩでは０．７８～２００ｎＭ、ヒト及びカニクイザルＦｃγＲＩＩでは４６．９～１２０００ｎＭ並びにＦｃγＲＩＩでは７．８～４０００ｎＭ（２倍段階希釈）の範囲に及んだ。バッファーのみ注入はダブル参照のために含まれた。結合ＦｃγＲ解離は、１～５分間（ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩａでは１分間、ＦｃγＲＩＩＩａでは３分間及びＦｃγＲＩでは５分間）モニターされた。チップ表面は、８チャネルすべてにわたり流速１００μＬ／分で２秒間、注入された１００ｍＭのＨＣｌを用いて再生させた。同じＣＭ５チップを使用する３つの実験はそれぞれの試料について実行した。これら３実験の結果は平均された。
Ｈｉｓタグ付きヒトＦｃγＲに対するＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴの結合速度論は、抗Ｈｉｓ補足を使用して２５℃でＢｉａｃｏｒｅＴ２００計器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で行うＳＰＲ測定により決定した。１０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）中２５μｇ／ｍＬまで希釈されたおおよそ１００００ＲＵのマウス抗Ｈｉｓ抗体（Ｒ＆Ｄ）を、標準アミンカップリングキットを製造業者の説明書に従って使用してＣＭ５バイオセンサーチップ中に固定化した。バイオセンサー表面の未反応部分は１Ｍのエタノールアミンで遮断した。フローセル１上の活性化及び非活性化表面は参照として使用された。チップ調製及び結合動力学測定はアッセイランニングバッファー、ＨＢＳ－ＥＰ＋（１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０）中で行われた。次に、ヒト及びカニクイザルＦｃγＲは、補足レベル２５０～５００ＲＵに達するまでフローセル２上で補足された。Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴ試料は、５０μＬ／分の流速で１～５分間（ヒト及びカニクイザルＦｃγＲＩＩｂ及びＦｃγＲＩＩａでは１分間、ヒトＦｃγＲＩＩＩａでは２分間並びにヒト及びカニクイザルＦｃγＲＩ＆カニクイザルＦｃγＲでは５分間）すべてのフローセル上に注入された。分析物濃度は、ヒト及びカニクイザルＦｃγＲＩ、カニクイザルＦｃγＲＩＩＩでは０．７８～２００ｎＭ、ヒト及びカニクイザルＦｃγＲＩＩでは４６．９～１２０００ｎＭ並びにＦｃγＲＩＩでは７．８～４０００ｎＭ（２倍段階希釈）の範囲に及んだ。バッファーのみ注入はダブル参照のために含まれた。結合ＦｃγＲ解離は、１～５分間（ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩａでは１分間、ＦｃγＲＩＩＩａでは３分間及びＦｃγＲＩでは５分間）モニターされた。チップ表面は、８チャネルすべてにわたり流速１００μＬ／分で２秒間、注入された１００ｍＭのＨＣｌを用いて再生させた。同じＣＭ５チップを使用する３つの実験はそれぞれの試料について実行した。これら３実験の結果は平均された。
ヒトＦｃγＲ１、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａ細胞結合アッセイ
ＣＨＯ－Ｋ１発現ｈＦｃγＲ細胞は１５０ｃｍ２培養フラスコで生育し、特定量のフルオロフォア、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ ＣＦＳＥ商標及びＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ商標（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を製造業者の説明書に従って負荷させ、それぞれの系について独特の蛍光フットプリント（バーコード法）を確立した。系を混合し、ＲＰＭＩ１６４０／２ｍＭのＬ－グルタミン／１０％の超低ＩｇＧ熱不活化ＦＢＳ（結合培地）中異なる濃度（０、０．０１、０．１、１、１０、５０、１００、及び２５０μｇ／ｍＬ）で単量体Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴと一緒に４℃で１時間インキュベートした。インキュベーションに続いて、細胞はＰＢＳ、ｐＨ７．４（ｗ／ｏ Ｃａ＋２／Ｍｇ＋２）で２回洗浄し、細胞結合Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴを検出するために、結合培地中のＡＦ６４７に連結した二次抗体（Ｆ（ａｂ’）２ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）と一緒に４℃で１５分間インキュベートした。インキュベーションに続いて、細胞はＰＢＳ、ｐＨ７．４（ｗ／ｏ Ｃａ＋２／Ｍｇ＋２）でさらに２回洗浄した。細胞表面蛍光はフローサイトメトリーアナライザー（ＬＳＲ－Ｆｏｒｔｅｓｓａ）を使用して検出し記録した。記録された蛍光データはＦｌｏｗＪｏソフトウェアバージョン１０（Ｔｒｉｓｔａｒ）を使用して解析され、ＣＨＯ－Ｋ１ ｈＦｃγＲ細胞へのＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴ結合はＡＦ６４７の蛍光の幾何平均として報告された（Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴ濃度の関数としてのｇＭＦＩの結合曲線が作成された）。
ＣＨＯ－Ｋ１発現ｈＦｃγＲ細胞は１５０ｃｍ２培養フラスコで生育し、特定量のフルオロフォア、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ ＣＦＳＥ商標及びＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ商標（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を製造業者の説明書に従って負荷させ、それぞれの系について独特の蛍光フットプリント（バーコード法）を確立した。系を混合し、ＲＰＭＩ１６４０／２ｍＭのＬ－グルタミン／１０％の超低ＩｇＧ熱不活化ＦＢＳ（結合培地）中異なる濃度（０、０．０１、０．１、１、１０、５０、１００、及び２５０μｇ／ｍＬ）で単量体Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴと一緒に４℃で１時間インキュベートした。インキュベーションに続いて、細胞はＰＢＳ、ｐＨ７．４（ｗ／ｏ Ｃａ＋２／Ｍｇ＋２）で２回洗浄し、細胞結合Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴを検出するために、結合培地中のＡＦ６４７に連結した二次抗体（Ｆ（ａｂ’）２ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）と一緒に４℃で１５分間インキュベートした。インキュベーションに続いて、細胞はＰＢＳ、ｐＨ７．４（ｗ／ｏ Ｃａ＋２／Ｍｇ＋２）でさらに２回洗浄した。細胞表面蛍光はフローサイトメトリーアナライザー（ＬＳＲ－Ｆｏｒｔｅｓｓａ）を使用して検出し記録した。記録された蛍光データはＦｌｏｗＪｏソフトウェアバージョン１０（Ｔｒｉｓｔａｒ）を使用して解析され、ＣＨＯ－Ｋ１ ｈＦｃγＲ細胞へのＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴ結合はＡＦ６４７の蛍光の幾何平均として報告された（Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴ濃度の関数としてのｇＭＦＩの結合曲線が作成された）。
ヒト及びカニクイザルＦｃＲｎ表面プラズモン結合アッセイ
ＦｃＲｎ結合アッセイでは、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴは、ＣＭ５チップアミンカップリング上に製造業者のプロトコルに従って７５０ＲＵの密度まで直接固定化した。ヒト及びカニクイザルＦｃＲｎ組換えタンパク質は、５．５～１２０００ｎＭ（３倍段階希釈）に及ぶ濃度で、５０μＬ／分の流速で１分間すべてのフローセル上に注入され、続いて１分間解離された。表面はＨＢＳ－ＥＰ＋ｐＨ７．４の１５秒間の注入で再生させた。試料は調製され、２種類のランニングバッファーＭＥＳ ＥＰ＋ｐＨ６．０及びＨＢＳ－ＥＰ＋ｐＨ７．４で流された。異なるＣＭ５チップを使用する３つの実験をそれぞれの試料について実行した（それぞれが２通り）。これら３実験の結果は平均させた。すべての試料に結合するヒトＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ１５８）、ＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ１５８）及びカニクイザルＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＩからのデータは、一定のＲｍａｘを有する１対１グローバル動力学モデルにフィットさせた。すべての試料に結合するヒトＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩａ（Ｈ１３１）、ＦｃγＲＩＩａ（Ｒ１３１）、カニクイザルＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ及びＦｃＲｎからのデータは、定常状態親和性モデルにフィットさせた。Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００評価ソフトウェアバージョン２．０を使用してＦｃγＲ及びＦｃＲｎデータをフィットさせた。
ＦｃＲｎ結合アッセイでは、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴは、ＣＭ５チップアミンカップリング上に製造業者のプロトコルに従って７５０ＲＵの密度まで直接固定化した。ヒト及びカニクイザルＦｃＲｎ組換えタンパク質は、５．５～１２０００ｎＭ（３倍段階希釈）に及ぶ濃度で、５０μＬ／分の流速で１分間すべてのフローセル上に注入され、続いて１分間解離された。表面はＨＢＳ－ＥＰ＋ｐＨ７．４の１５秒間の注入で再生させた。試料は調製され、２種類のランニングバッファーＭＥＳ ＥＰ＋ｐＨ６．０及びＨＢＳ－ＥＰ＋ｐＨ７．４で流された。異なるＣＭ５チップを使用する３つの実験をそれぞれの試料について実行した（それぞれが２通り）。これら３実験の結果は平均させた。すべての試料に結合するヒトＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ１５８）、ＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ１５８）及びカニクイザルＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＩからのデータは、一定のＲｍａｘを有する１対１グローバル動力学モデルにフィットさせた。すべての試料に結合するヒトＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩａ（Ｈ１３１）、ＦｃγＲＩＩａ（Ｒ１３１）、カニクイザルＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ及びＦｃＲｎからのデータは、定常状態親和性モデルにフィットさせた。Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００評価ソフトウェアバージョン２．０を使用してＦｃγＲ及びＦｃＲｎデータをフィットさせた。
７．１６．２．結果
ヒト及びカニクイザルＦｃγＲ１、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ及びＦｃγＲＩＩＩａ結合
結合動力学パラメータは表３２（ヒトについて）及び表３３（カニクイザルについて）にまとめられている。
ヒト及びカニクイザルＦｃγＲ１、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ及びＦｃγＲＩＩＩａ結合
結合動力学パラメータは表３２（ヒトについて）及び表３３（カニクイザルについて）にまとめられている。
Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴ及びトラスツズマブは、ｈＦｃγＲＩとｈＦｃγＲＩＩ（Ｈ１３１）の両方に類似する測定できるほどの結合親和性を、ｈＦｃγＲＩＩ（Ｒ１３１）及びｈＦｃγＲＩＩｂ受容体へのもっと弱い結合を有していた。Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴ及びトラスツズマブは、ｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ１５８／Ｖ１５８）に測定できるほどの結合親和性を有し、予想された通り、Ｖ１５８多形性バリアントにはより高い親和性を有していた。
Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴとトラスツズマブの両方が、カニクイザルＦｃγＲＩとカニクイザルＦｃγＲＩＩＩの両方への結合を見せたが、カニクイザルＦｃγＲＩＩａとカニクイザルＦｃγＲＩＩ受容体では、おそらくこれらの受容体へのその弱い結合のせいで測定できるほどの結合パラメータを決めることはできなかった。
ヒトＦｃγＲ１、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａ細胞結合アッセイ
Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴは、ヒトＦｃγＲ１及びＦｃγＲＩＩａ（Ｖ１７６）多形性バリアントへの最も高い結合を示したが、他のヒトＦｃγＲ［ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩｃ、ＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ１７６）及びＦｃγＲＩＩＩｂ］への結合は比較的低かった（図１９Ａ～１９Ｂ）。
ヒトＦｃγＲ１、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａ細胞結合アッセイ
Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴは、ヒトＦｃγＲ１及びＦｃγＲＩＩａ（Ｖ１７６）多形性バリアントへの最も高い結合を示したが、他のヒトＦｃγＲ［ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩｃ、ＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ１７６）及びＦｃγＲＩＩＩｂ］への結合は比較的低かった（図１９Ａ～１９Ｂ）。
ヒト及びカニクイザルＦｃＲｎ表面プラズモン結合アッセイ
Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴは、酸性条件（ｐＨ６．０）下ではヒト及びカニクイザルＦｃＲｎへの測定できるほどの結合を見せたが、中性ｐＨ（ｐＨ７．４）では測定できるほどの結合はなかった（表３４）。ＦｃＲｎ結合特性は対照（トラスツズマブ）に匹敵していた。
Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴは、酸性条件（ｐＨ６．０）下ではヒト及びカニクイザルＦｃＲｎへの測定できるほどの結合を見せたが、中性ｐＨ（ｐＨ７．４）では測定できるほどの結合はなかった（表３４）。ＦｃＲｎ結合特性は対照（トラスツズマブ）に匹敵していた。
［実施例１７］
７．１７．Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ及びＣＤＣ活性
７．１７．１．材料及び方法
Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴは、天然のα４β７／ＣＤ２０発現ＲＰＭＩ８８６６細胞を標的細胞として、ｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ１５８）又はｈＦｃγＲＩＩａ（Ｈ１３１）を発現するレポータージャーカット細胞をエフェクター細胞として使用してｖｉｔｒｏ ＡＤＣＣ及びＡＤＣＰ活性について評価した。このジャーカット細胞系は、レポーターとしてホタルルシフェラーゼの発現を駆動するＮＦＡＴ応答エレメントを有していた。抗ＣＤ２０ｍＡｂであるＡｂ－Ｒｉｔｕは、これらのアッセイでは陽性対照として使用した。
７．１７．Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ及びＣＤＣ活性
７．１７．１．材料及び方法
Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴは、天然のα４β７／ＣＤ２０発現ＲＰＭＩ８８６６細胞を標的細胞として、ｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ１５８）又はｈＦｃγＲＩＩａ（Ｈ１３１）を発現するレポータージャーカット細胞をエフェクター細胞として使用してｖｉｔｒｏ ＡＤＣＣ及びＡＤＣＰ活性について評価した。このジャーカット細胞系は、レポーターとしてホタルルシフェラーゼの発現を駆動するＮＦＡＴ応答エレメントを有していた。抗ＣＤ２０ｍＡｂであるＡｂ－Ｒｉｔｕは、これらのアッセイでは陽性対照として使用した。
さらに、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴは、α４β７／ＣＤ５２発現ＨｕＴ７８細胞を標的細胞として、ヒト一次ＮＫ細胞をエフェクター細胞として、Ｃａｍｐａｔｈ（抗ＣＤ５２）を陽性対照抗体として使用する細胞傷害性ベースのＡＤＣＣアッセイにおいて評価した。
ＡＤＣＣレポーターアッセイ
標的α４β７発現ＲＰＭＩ８８６６細胞を生育し培養培地（ＲＰＭＩ１６４０、２ｍＭのＬ－グルタミン及び１０％のＦＢＳ）に維持した。対数期細胞を収集し、数を数え、洗浄して、６×１０５細胞／ｍＬストックでアッセイ培地（低ＩｇＧ血清を含有するＲＰＭＩ１６４０）に再懸濁し、使用準備ができるまで３７℃、５％ＣＯ２に置いた。Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴ及び対照ｍＡｂは３０μｇ／ｍＬの３×開始濃度で調製し、次に、Ｃｏｓｔａｒ３９５６希釈プレートに１対１００で段階（２ｐｔ．）希釈した。抗体（２５μＬ）は、プレートレイアウトに従って等容積の標的ＲＰＭＩ８８６６細胞（２５μＬ）と２通り混合した。エフェクタージャーカット細胞（ヒトＦｃγＲＩＩＩａ Ｖ１５８バリアント及びＰｒｏｍｅｇａ商標社製のホタルルシフェラーゼの発現を駆動するＮＦＡＴ応答エレメントを安定的に発現する）を急速解凍し、アッセイ培地中３×１０６細胞／ｍＬに調整した。次に、ジャーカットエフェクター（２５μＬ）をＲＰＭＩ８８６６標的及び抗体を含有する９６ウェルアッセイプレートに添加した。対照ウェルは、培地単独、エフェクター（Ｅ）及び標的（Ｔ）単独、Ｅ＋Ｔ、Ｅ＋ｍＡｂ（３０μｇ／ｍＬ）又はＴ＋ｍＡｂ（３０μｇ／ｍＬ）を含んだ。すべてのウェルはプレートレイアウトに従ってウェル当たり７５μＬに調整した。最終細胞数は、５対１のＥ対Ｔ比に応じて、７５，０００ジャーカットエフェクター細胞／ウェル及び１５，０００ＲＰＭＩ８８６６標的細胞／ウェルであった。ウェル当たりの最終抗体濃度は、６７ｎＭ（１０μｇ／ｍＬ）、０．６７ｎＭ（０．１μｇ／ｍＬ）及び０．００６７ｎＭ（０．００１μｇ／ｍＬ）であった。プレートは３７℃、５％ＣＯ２で６時間インキュベートし、その間Ｂｉｏ－Ｇｌｏ商標バッファー及び基質（Ｃａｔ７１１０）は使用に先立ってＲＴに平衡させた。インキュベーション終了時、Ｂｉｏ－Ｇｌｏ基質はバッファーで元に戻して酵素／基質溶液（Ｂｉｏ－Ｇｌｏ試薬）を形成させた。等容積の７５μＬ／ウェルＢｉｏ－Ｇｌｏをすべてのウェルに添加した。次に、プレートをＲＴで１０分間インキュベートした。プレート発光は発光プレートリーダー（Ｔｏｐｃｏｕｎｔ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）上で読み取った。発光シグナルは、グラフパッドプリズム７．０ソフトウェアを使用してＲＬＵとしてプロットした。
標的α４β７発現ＲＰＭＩ８８６６細胞を生育し培養培地（ＲＰＭＩ１６４０、２ｍＭのＬ－グルタミン及び１０％のＦＢＳ）に維持した。対数期細胞を収集し、数を数え、洗浄して、６×１０５細胞／ｍＬストックでアッセイ培地（低ＩｇＧ血清を含有するＲＰＭＩ１６４０）に再懸濁し、使用準備ができるまで３７℃、５％ＣＯ２に置いた。Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴ及び対照ｍＡｂは３０μｇ／ｍＬの３×開始濃度で調製し、次に、Ｃｏｓｔａｒ３９５６希釈プレートに１対１００で段階（２ｐｔ．）希釈した。抗体（２５μＬ）は、プレートレイアウトに従って等容積の標的ＲＰＭＩ８８６６細胞（２５μＬ）と２通り混合した。エフェクタージャーカット細胞（ヒトＦｃγＲＩＩＩａ Ｖ１５８バリアント及びＰｒｏｍｅｇａ商標社製のホタルルシフェラーゼの発現を駆動するＮＦＡＴ応答エレメントを安定的に発現する）を急速解凍し、アッセイ培地中３×１０６細胞／ｍＬに調整した。次に、ジャーカットエフェクター（２５μＬ）をＲＰＭＩ８８６６標的及び抗体を含有する９６ウェルアッセイプレートに添加した。対照ウェルは、培地単独、エフェクター（Ｅ）及び標的（Ｔ）単独、Ｅ＋Ｔ、Ｅ＋ｍＡｂ（３０μｇ／ｍＬ）又はＴ＋ｍＡｂ（３０μｇ／ｍＬ）を含んだ。すべてのウェルはプレートレイアウトに従ってウェル当たり７５μＬに調整した。最終細胞数は、５対１のＥ対Ｔ比に応じて、７５，０００ジャーカットエフェクター細胞／ウェル及び１５，０００ＲＰＭＩ８８６６標的細胞／ウェルであった。ウェル当たりの最終抗体濃度は、６７ｎＭ（１０μｇ／ｍＬ）、０．６７ｎＭ（０．１μｇ／ｍＬ）及び０．００６７ｎＭ（０．００１μｇ／ｍＬ）であった。プレートは３７℃、５％ＣＯ２で６時間インキュベートし、その間Ｂｉｏ－Ｇｌｏ商標バッファー及び基質（Ｃａｔ７１１０）は使用に先立ってＲＴに平衡させた。インキュベーション終了時、Ｂｉｏ－Ｇｌｏ基質はバッファーで元に戻して酵素／基質溶液（Ｂｉｏ－Ｇｌｏ試薬）を形成させた。等容積の７５μＬ／ウェルＢｉｏ－Ｇｌｏをすべてのウェルに添加した。次に、プレートをＲＴで１０分間インキュベートした。プレート発光は発光プレートリーダー（Ｔｏｐｃｏｕｎｔ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）上で読み取った。発光シグナルは、グラフパッドプリズム７．０ソフトウェアを使用してＲＬＵとしてプロットした。
ＡＤＣＰレポーターアッセイ
標的α４β７発現ＲＰＭＩ８８６６細胞を生育し培養培地（ＲＰＭＩ１６４０、２ｍＭのＬ－グルタミン及び１０％のＦＢＳ）に維持した。対数期細胞を収集し、数を数え、洗浄して、２×１０５細胞／ｍＬストックでアッセイ培地（低ＩｇＧ血清を含有するＲＰＭＩ１６４０）に再懸濁し、使用準備ができるまで３７℃、５％ＣＯ２に置いた。Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴ及び対照ｍＡｂは３０μｇ／ｍＬの３×開始濃度で調製し、次に、Ｃｏｓｔａｒ３９５６希釈プレートに１対１００で段階（２ｐｔ．）希釈した。抗体（２５μＬ）は、プレートレイアウトに従って等容積の標的細胞（２５μＬ）と２通り混合した。エフェクタージャーカット細胞（ヒトＦｃγＲＩＩＩａ Ｈ１３１バリアント及びＰｒｏｍｅｇａ商標社製のホタルルシフェラーゼの発現を駆動するＮＦＡＴ応答エレメントを安定的に発現する）を急速解凍し、アッセイ培地中１×１０６細胞／ｍＬに調整した。次に、ジャーカットエフェクター（２５μＬ）をＲＰＭＩ８８６６標的及び抗体を含有する９６ウェルアッセイプレートに添加した。対照ウェルは、培地単独、エフェクター（Ｅ）及び標的（Ｔ）単独、Ｅ＋Ｔ、Ｅ＋ｍＡｂ（３０μｇ／ｍＬ）又はＴ＋ｍＡｂ（３０μｇ／ｍＬ）を含んだ。すべてのウェルはプレートレイアウトに従ってウェル当たり７５μＬに調整した。最終細胞数は、５対１のＥ対Ｔ比に応じて、２５，０００ジャーカットエフェクター細胞／ウェル及び５，０００標的細胞／ウェルであった。ウェル当たりの最終抗体濃度は、６７ｎＭ（１０μｇ／ｍＬ）、０．６７ｎＭ（０．１μｇ／ｍＬ）及び０．００６７ｎＭ（０．００１μｇ／ｍＬ）であった。プレートは３７℃、５％ＣＯ２で６時間インキュベートし、その間Ｂｉｏ－Ｇｌｏ商標バッファー及び基質（Ｃａｔ７１１０）は使用に先立ってＲＴに平衡させた。インキュベーション終了時、Ｂｉｏ－Ｇｌｏ基質はバッファーで元に戻して酵素／基質溶液（Ｂｉｏ－Ｇｌｏ試薬）を形成させた。等容積の７５μＬ／ウェルＢｉｏ－Ｇｌｏをすべてのウェルに添加した。次に、プレートをＲＴで１０分間インキュベートした。プレート発光は発光プレートリーダー（Ｔｏｐｃｏｕｎｔ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）上で読み取った。発光シグナルは、グラフパッドプリズム７．０ソフトウェアを使用してＲＬＵとしてプロットした。
標的α４β７発現ＲＰＭＩ８８６６細胞を生育し培養培地（ＲＰＭＩ１６４０、２ｍＭのＬ－グルタミン及び１０％のＦＢＳ）に維持した。対数期細胞を収集し、数を数え、洗浄して、２×１０５細胞／ｍＬストックでアッセイ培地（低ＩｇＧ血清を含有するＲＰＭＩ１６４０）に再懸濁し、使用準備ができるまで３７℃、５％ＣＯ２に置いた。Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴ及び対照ｍＡｂは３０μｇ／ｍＬの３×開始濃度で調製し、次に、Ｃｏｓｔａｒ３９５６希釈プレートに１対１００で段階（２ｐｔ．）希釈した。抗体（２５μＬ）は、プレートレイアウトに従って等容積の標的細胞（２５μＬ）と２通り混合した。エフェクタージャーカット細胞（ヒトＦｃγＲＩＩＩａ Ｈ１３１バリアント及びＰｒｏｍｅｇａ商標社製のホタルルシフェラーゼの発現を駆動するＮＦＡＴ応答エレメントを安定的に発現する）を急速解凍し、アッセイ培地中１×１０６細胞／ｍＬに調整した。次に、ジャーカットエフェクター（２５μＬ）をＲＰＭＩ８８６６標的及び抗体を含有する９６ウェルアッセイプレートに添加した。対照ウェルは、培地単独、エフェクター（Ｅ）及び標的（Ｔ）単独、Ｅ＋Ｔ、Ｅ＋ｍＡｂ（３０μｇ／ｍＬ）又はＴ＋ｍＡｂ（３０μｇ／ｍＬ）を含んだ。すべてのウェルはプレートレイアウトに従ってウェル当たり７５μＬに調整した。最終細胞数は、５対１のＥ対Ｔ比に応じて、２５，０００ジャーカットエフェクター細胞／ウェル及び５，０００標的細胞／ウェルであった。ウェル当たりの最終抗体濃度は、６７ｎＭ（１０μｇ／ｍＬ）、０．６７ｎＭ（０．１μｇ／ｍＬ）及び０．００６７ｎＭ（０．００１μｇ／ｍＬ）であった。プレートは３７℃、５％ＣＯ２で６時間インキュベートし、その間Ｂｉｏ－Ｇｌｏ商標バッファー及び基質（Ｃａｔ７１１０）は使用に先立ってＲＴに平衡させた。インキュベーション終了時、Ｂｉｏ－Ｇｌｏ基質はバッファーで元に戻して酵素／基質溶液（Ｂｉｏ－Ｇｌｏ試薬）を形成させた。等容積の７５μＬ／ウェルＢｉｏ－Ｇｌｏをすべてのウェルに添加した。次に、プレートをＲＴで１０分間インキュベートした。プレート発光は発光プレートリーダー（Ｔｏｐｃｏｕｎｔ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）上で読み取った。発光シグナルは、グラフパッドプリズム７．０ソフトウェアを使用してＲＬＵとしてプロットした。
ＣＤＣアッセイ
ＲＰＭＩ８８６６細胞を生育し培養培地（ＲＰＭＩ１６４０、２ｍＭのＬ－グルタミン及び１０％のＦＢＳ）に維持した。対数期細胞を収集し、数を数え、洗浄して、４×１０６細胞／ｍＬストックでアッセイ培地（ＲＰＭＩ１６４０マイナスフェノールレッド、Ｃａｔ１１８３５－０３０）に再懸濁し、使用準備ができるまで３７℃、５％ＣＯ２に置いた。Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴ及び対照ｍＡｂは、Ｃｏｓｔａｒ３９５６希釈プレートにおいて４５μｇ／ｍＬ及び０．４５μｇ／ｍＬの３×開始濃度で調製した。ヒトドナー血清（ＨＭＮ１９１６９及びＨＭＮ１９１７０）を冷ランニング水を使用して解凍し直ちに氷上に置いた。抗体、対照（２５μＬ）及び培地をアッセイプレート（Ｃｏｓｔａｒ ３５９９）に添加した。ドナー血清（それぞれ２５μＬ）、標的細胞（２５μＬ）及び希釈ｍＡｂ（２５μＬ）を、３３％血清補体、１×１０５細胞及び１５μｇ／ｍＬ ｍＡｂを含有するウェル当たり７５μＬの最終容積で混合した。次に、プレートは３７℃、５％ＣＯ２で２時間インキュベートした。インキュベーション後、１．５ｍｇ／ｍＬの５×ストック溶液での細胞透過性色素（Ｓｉｇｍａ；Ｒｅｓａｚｕｒｉｎナトリウム塩）を、ＤＰＢＳに１対５で希釈し、２５μＬの色素をそれぞれのウェルに添加した。プレートはさらに１６時間インキュベートし、次に、吸光度（５４５／６００）をＣｌａｒｉｏｓｔａｒプレートリーダーを使用して読み取った。パーセンテージ標的特異的細胞溶解は、式：１００－１００×［（ｍＡｂインキュベーションでの吸光度）／（対照吸光度）］を使用してＥｘｃｅｌで計算し、結果はグラフパッドプリズム７．０ソフトウェアを使用してプロットした。
ＲＰＭＩ８８６６細胞を生育し培養培地（ＲＰＭＩ１６４０、２ｍＭのＬ－グルタミン及び１０％のＦＢＳ）に維持した。対数期細胞を収集し、数を数え、洗浄して、４×１０６細胞／ｍＬストックでアッセイ培地（ＲＰＭＩ１６４０マイナスフェノールレッド、Ｃａｔ１１８３５－０３０）に再懸濁し、使用準備ができるまで３７℃、５％ＣＯ２に置いた。Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴ及び対照ｍＡｂは、Ｃｏｓｔａｒ３９５６希釈プレートにおいて４５μｇ／ｍＬ及び０．４５μｇ／ｍＬの３×開始濃度で調製した。ヒトドナー血清（ＨＭＮ１９１６９及びＨＭＮ１９１７０）を冷ランニング水を使用して解凍し直ちに氷上に置いた。抗体、対照（２５μＬ）及び培地をアッセイプレート（Ｃｏｓｔａｒ ３５９９）に添加した。ドナー血清（それぞれ２５μＬ）、標的細胞（２５μＬ）及び希釈ｍＡｂ（２５μＬ）を、３３％血清補体、１×１０５細胞及び１５μｇ／ｍＬ ｍＡｂを含有するウェル当たり７５μＬの最終容積で混合した。次に、プレートは３７℃、５％ＣＯ２で２時間インキュベートした。インキュベーション後、１．５ｍｇ／ｍＬの５×ストック溶液での細胞透過性色素（Ｓｉｇｍａ；Ｒｅｓａｚｕｒｉｎナトリウム塩）を、ＤＰＢＳに１対５で希釈し、２５μＬの色素をそれぞれのウェルに添加した。プレートはさらに１６時間インキュベートし、次に、吸光度（５４５／６００）をＣｌａｒｉｏｓｔａｒプレートリーダーを使用して読み取った。パーセンテージ標的特異的細胞溶解は、式：１００－１００×［（ｍＡｂインキュベーションでの吸光度）／（対照吸光度）］を使用してＥｘｃｅｌで計算し、結果はグラフパッドプリズム７．０ソフトウェアを使用してプロットした。
ＡＤＣＣ細胞傷害性アッセイ
標的α４β７発現ＨｕＴ７８細胞を収集し、ＰＢＳ（ｗ／ｏ Ｃａ＋２／Ｍｇ＋２、１％ＢＳＡ）で２回洗浄し、１×１０７細胞／ｍＬでＰＢＳに再懸濁し、次に、ＲＴで８分間、最終濃度２μＭでＣＦＳＥを用いて標識した。インキュベーション後、ＦＢＳを１０％最終濃度で添加して、標識化をクエンチした。細胞は、ＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ培地で２回洗浄し、次にＣＦＳＥ標識化ＨｕＴ７８細胞は、１０μｇ／ｍＬで２×濃度のＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴ又は対照抗体の１００μＬと一緒に、９６ウェルＶ字型底プレートにおいて３７℃、５％ＣＯ２で３０分間インキュベートした。続いて、１００μＬの２．５×１０５ＮＫ（ＦｃγＲＩＩＩａ Ｖ１５８＋）エフェクター細胞（２００Ｕ／ｍＬでＩＬ－２と一緒に前インキュベートした）を５対１比で標的細胞に添加した。ウェル内容物は徹底的に混合し、続いてＣＯ２インキュベーターにおいて３７℃で５時間インキュベートした。ＮＫ及びＨｕＴ７８細胞混合物はＰＢＳで２回洗浄し、１μＬのＦＶＤ色素／ｍＬを含有する無アジド及び無タンパク質ＰＢＳを用いて１×１０６細胞／ｍＬで再懸濁し、ＲＴで２０分間インキュベートした。細胞はＦＡＣＳバッファーで２回洗浄し、ＰＢＳ中０．５％のＰＦＡの２００μＬに再懸濁し、プレートはＦＡＣＳ（ＣａｎｔｏＩＩ、ＢＤ）上で読み取った。フローデータ（ＦＣＳ ３．０ファイル）は、ＦｌｏｗＪｏバージョン１０ソフトウェアを使用することにより解析した。すべてのＨｕＴ７８標的細胞（ｌｉｖｅ及びｄｅａｄ）はゲート開閉させて全標的細胞集団内の％ｄｅａｄ標的を決定した。％ＡＤＣＣ計算に使用される式は、％ＡＤＣＣ＝１００×［（Ｅ＋Ｔ＋Ａｂ）混合物中の％ｄｅａｄ標的－（Ｅ＋Ｔ）ミックス中の％ｄｅａｄ標的］／［１００－（Ｅ＋Ｔ）ミックス中の％ｄｅａｄ標的］であった。パーセンテージＡＤＣＣは、グラフパッドプリズム７．０ソフトウェアを使用してグラフで示した。
標的α４β７発現ＨｕＴ７８細胞を収集し、ＰＢＳ（ｗ／ｏ Ｃａ＋２／Ｍｇ＋２、１％ＢＳＡ）で２回洗浄し、１×１０７細胞／ｍＬでＰＢＳに再懸濁し、次に、ＲＴで８分間、最終濃度２μＭでＣＦＳＥを用いて標識した。インキュベーション後、ＦＢＳを１０％最終濃度で添加して、標識化をクエンチした。細胞は、ＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ培地で２回洗浄し、次にＣＦＳＥ標識化ＨｕＴ７８細胞は、１０μｇ／ｍＬで２×濃度のＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴ又は対照抗体の１００μＬと一緒に、９６ウェルＶ字型底プレートにおいて３７℃、５％ＣＯ２で３０分間インキュベートした。続いて、１００μＬの２．５×１０５ＮＫ（ＦｃγＲＩＩＩａ Ｖ１５８＋）エフェクター細胞（２００Ｕ／ｍＬでＩＬ－２と一緒に前インキュベートした）を５対１比で標的細胞に添加した。ウェル内容物は徹底的に混合し、続いてＣＯ２インキュベーターにおいて３７℃で５時間インキュベートした。ＮＫ及びＨｕＴ７８細胞混合物はＰＢＳで２回洗浄し、１μＬのＦＶＤ色素／ｍＬを含有する無アジド及び無タンパク質ＰＢＳを用いて１×１０６細胞／ｍＬで再懸濁し、ＲＴで２０分間インキュベートした。細胞はＦＡＣＳバッファーで２回洗浄し、ＰＢＳ中０．５％のＰＦＡの２００μＬに再懸濁し、プレートはＦＡＣＳ（ＣａｎｔｏＩＩ、ＢＤ）上で読み取った。フローデータ（ＦＣＳ ３．０ファイル）は、ＦｌｏｗＪｏバージョン１０ソフトウェアを使用することにより解析した。すべてのＨｕＴ７８標的細胞（ｌｉｖｅ及びｄｅａｄ）はゲート開閉させて全標的細胞集団内の％ｄｅａｄ標的を決定した。％ＡＤＣＣ計算に使用される式は、％ＡＤＣＣ＝１００×［（Ｅ＋Ｔ＋Ａｂ）混合物中の％ｄｅａｄ標的－（Ｅ＋Ｔ）ミックス中の％ｄｅａｄ標的］／［１００－（Ｅ＋Ｔ）ミックス中の％ｄｅａｄ標的］であった。パーセンテージＡＤＣＣは、グラフパッドプリズム７．０ソフトウェアを使用してグラフで示した。
７．１７．２．結果
ＡＤＣＣレポーター活性、ＡＤＣＰレポーター活性及びＣＤＣ
予想通りに、Ａｂ－Ｒｉｔｕは強い濃度依存性ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＡＤＣＣ及びＡＤＣＰ活性を示したが、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴ及びアイソタイプコントロールは、試験された３種の濃度（１０、０．１、０．００１μｇ／ｍＬ）ではこれらの活性のどれも示さなかった（図２０Ａ及び２０Ｂ）。３種の陰性対照アッセイ条件、すなわち、標的及びエフェクター単独、標的プラス抗体、並びにエフェクタープラス抗体では最小シグナルのみが検出された（データは示さず）。Ａｂ－Ｒｉｔｕは、ＲＰＭＩ８８６６細胞上、０．１５及び１５μｇ／ｍＬ（１００ｎＭ）で強いｉｎ ｖｉｔｒｏ ＣＤＣ活性も示し、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴ及びアイソタイプコントロールは、２つのヒト血清ドナーを使用して対応する濃度でＣＤＣシグナルを示さなかった（図２１）。
ＡＤＣＣレポーター活性、ＡＤＣＰレポーター活性及びＣＤＣ
予想通りに、Ａｂ－Ｒｉｔｕは強い濃度依存性ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＡＤＣＣ及びＡＤＣＰ活性を示したが、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴ及びアイソタイプコントロールは、試験された３種の濃度（１０、０．１、０．００１μｇ／ｍＬ）ではこれらの活性のどれも示さなかった（図２０Ａ及び２０Ｂ）。３種の陰性対照アッセイ条件、すなわち、標的及びエフェクター単独、標的プラス抗体、並びにエフェクタープラス抗体では最小シグナルのみが検出された（データは示さず）。Ａｂ－Ｒｉｔｕは、ＲＰＭＩ８８６６細胞上、０．１５及び１５μｇ／ｍＬ（１００ｎＭ）で強いｉｎ ｖｉｔｒｏ ＣＤＣ活性も示し、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴ及びアイソタイプコントロールは、２つのヒト血清ドナーを使用して対応する濃度でＣＤＣシグナルを示さなかった（図２１）。
ＡＤＣＣ細胞傷害性
このｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイでは、Ｃａｍｐａｔｈ（Ａｂ－Ａｌｅｍ）は標的細胞に対して強い細胞傷害性を示した。これとは対照的に、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴは、アッセイを、ＦｃγＲＩＩＩａ Ｖ１５８遺伝子型を用いて２人の異なるドナーから単離されたＮＫエフェクター細胞を使用して実施した場合、１０μｇ／ｍＬ（６７ｎＭ）濃度ではいかなるｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害性も誘導しなかった（図２２）。したがって、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴは上に示されるように（実施例１２）ヒトＦｃγＲに結合するが、ｉｎ ｖｉｔｒｏでは非感染α４β７＋細胞に対して望ましくないＦｃ媒介ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ及びＣＤＣ活性を誘導しない。
このｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイでは、Ｃａｍｐａｔｈ（Ａｂ－Ａｌｅｍ）は標的細胞に対して強い細胞傷害性を示した。これとは対照的に、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴは、アッセイを、ＦｃγＲＩＩＩａ Ｖ１５８遺伝子型を用いて２人の異なるドナーから単離されたＮＫエフェクター細胞を使用して実施した場合、１０μｇ／ｍＬ（６７ｎＭ）濃度ではいかなるｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害性も誘導しなかった（図２２）。したがって、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴは上に示されるように（実施例１２）ヒトＦｃγＲに結合するが、ｉｎ ｖｉｔｒｏでは非感染α４β７＋細胞に対して望ましくないＦｃ媒介ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ及びＣＤＣ活性を誘導しない。
［実施例１８］
７．１８．標的上のＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴ結合部位のホモロジーモデリング
７．１８．１．材料及び方法
α４β７へのＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴの結合様式はホモロジーモデリングにより調べた。別の抗α４β７抗体ベドリズマブとの複合体中の組換えヒトα４β７細胞外ドメインタンパク質の結晶構造は、公表されている（Ｙｕら、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２０１２年）。そのデータ及びＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴのＦａｂ領域の独特の配列に基づいて、ベンチマーク抗体ベドリズマブ及びＡＭＧ１８１と比べた候補抗体の結合様式のモデリングに取りかかった。
７．１８．標的上のＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴ結合部位のホモロジーモデリング
７．１８．１．材料及び方法
α４β７へのＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴの結合様式はホモロジーモデリングにより調べた。別の抗α４β７抗体ベドリズマブとの複合体中の組換えヒトα４β７細胞外ドメインタンパク質の結晶構造は、公表されている（Ｙｕら、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２０１２年）。そのデータ及びＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴのＦａｂ領域の独特の配列に基づいて、ベンチマーク抗体ベドリズマブ及びＡＭＧ１８１と比べた候補抗体の結合様式のモデリングに取りかかった。
７．１８．２．結果
ｉｎ ｖｉｔｒｏ特性評価データと一致して、ハイブリドーマＡｂ－ｍ１のヒト化バリアントでありＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴの親であるＡｂ－ｈ１．９及び２種のベンチマークｍＡｂは、主にβ７サブユニットとの相互作用を通じて、しかし、僅かではあるが、α４サブユニットとも相互作用をしてα４β７に結合する。このモデルにより、α４β１への結合の欠如及びαＥβ７への非常に低い結合が説明される。興味深いことに、このモデルにより、Ａｂ－ｈ１．９がα４サブユニット上でわずかに多くの残基に結合する点で、Ａｂ－ｈ１．９と２つのベンチマークｍＡｂの間の微妙な違いが示唆される。モデルで明白である重複するエピトープにより、Ａｂ－ｈ１．９とベドリズマブは、その標的への結合を巡って競合するはずであると予想される。実際、ＦＡＣＳベースの結合競合研究では、Ａｂ－ｍ１は、α４β７＋細胞へのＡｂ－Ｖｅｄｏ結合と競合することができ、Ａｂ－ｍ１とＡｂ－Ｖｅｄｏは類似する結合エピトープに結合することを示していた（表１３）。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ特性評価データと一致して、ハイブリドーマＡｂ－ｍ１のヒト化バリアントでありＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴの親であるＡｂ－ｈ１．９及び２種のベンチマークｍＡｂは、主にβ７サブユニットとの相互作用を通じて、しかし、僅かではあるが、α４サブユニットとも相互作用をしてα４β７に結合する。このモデルにより、α４β１への結合の欠如及びαＥβ７への非常に低い結合が説明される。興味深いことに、このモデルにより、Ａｂ－ｈ１．９がα４サブユニット上でわずかに多くの残基に結合する点で、Ａｂ－ｈ１．９と２つのベンチマークｍＡｂの間の微妙な違いが示唆される。モデルで明白である重複するエピトープにより、Ａｂ－ｈ１．９とベドリズマブは、その標的への結合を巡って競合するはずであると予想される。実際、ＦＡＣＳベースの結合競合研究では、Ａｂ－ｍ１は、α４β７＋細胞へのＡｂ－Ｖｅｄｏ結合と競合することができ、Ａｂ－ｍ１とＡｂ－Ｖｅｄｏは類似する結合エピトープに結合することを示していた（表１３）。
７．１９．考察
ＨＩＶ＋及びＨＩＶ－個人由来の末梢ヒトＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞サブセット上でのα４β７の発現レベルは同等であり、ＨＩＶ＋個人由来のＣＤ４＋Ｔ細胞でのα４β７発現が、出芽ＨＩＶビリオン中へのα４β７の組込みを支持できることを示唆している。
ＨＩＶ＋及びＨＩＶ－個人由来の末梢ヒトＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞サブセット上でのα４β７の発現レベルは同等であり、ＨＩＶ＋個人由来のＣＤ４＋Ｔ細胞でのα４β７発現が、出芽ＨＩＶビリオン中へのα４β７の組込みを支持できることを示唆している。
Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴは、試験されたすべての実験室生育ＨＩＶ株及びＨＩＶ患者の試料のビリオンのエンベロープ上のα４β７に結合できる強力な抗α４β７抗体である。Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴとＨＩＶビリオンにより形成される免疫複合体は、そのＦｃドメインを通じて異なるＦｃγＲに結合でき、これは、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴが食作用によりＡＰＣに取り込まれて、ＨＩＶ制御のための提唱されている「予防接種効果」を誘導することができるステップであった。
Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴはＨＩＶビリオンに結合するが、ＨＩＶ感染を中和せず、このことは、α４β７が宿主細胞上のウイルス受容体ではないという考えと一致している。ＨＩＶウイルスエンベロープ上の宿主タンパク質であるα４β７インテグリンを標的にすることにより、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴは、ＨＩＶ広域中和抗体などのウイルスエンベロープ中のＨＩＶウイルス性にコードされたｇｐ１２０／４１糖タンパク質を標的にする他の抗体と比べて耐性に対するより高い障壁を示す可能性がある。
Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴは、Ｆａｂ依存性機構を通じてα４β７とＭａｄＣＡＭ－１又はＨＩＶ ｇｐ１２０などのそのリガンドの間の相互作用を破壊でき、ＭａｄＣＡＭ－１又はｇｐ１２０により媒介されるＣＤ４ Ｔ細胞同時刺激を阻害し、これらの刺激された細胞でのＨＩＶ複製を潜在的に阻害する。
Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴは、α４β７とＨＩＶ ｇｐ１２０の間の相互作用を破壊するその能力を通じて、Ｆａｂ媒介機構による細胞間ＨＩＶウイルス伝播を潜在的に阻害することができる。
Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴと比べた場合、Ａｂ－Ｖｅｄｏのほうが、ＨＩＶビリオンを補足しα４β７とＨＩＶ ｇｐ１２０の間の相互作用を破壊する活性が低いことを示した。さらに、Ａｂ－ＶｅｄｏはＨＩＶビリオンと結合して免疫複合体を形成することができたが、これらの免疫複合体は、Ｆｃ機能を低減するＡｂ－Ｖｅｄｏ Ｆｃドメインでの操作された突然変異のせいで、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴにより形成される複合体よりもはるかに低い親和性でＦｃγＲに結合した。
ベドリズマブは、ＨＩＶ研究のための２つの臨床試験で中程度の効力を示した。この効力は、Ｆａｂ依存性に帰すことができる（例えば、ＭａｄＣＡＭ－１及びＨＩＶ ｇｐ１２０などのそのリガンドとの相互作用を破壊するα４β７への抗体結合、したがって、ＣＤ４ Ｔ細胞同時刺激及びこれらの刺激された細胞でのＨＩＶ複製、並びに細胞間ウイルス伝播を阻害する）が、Ｆｃ依存性作用機序に帰すことはできない。ＦｃγＲに対するベドリズマブの結合親和性が減少するため、ベドリズマブはＦｃ依存性機構を媒介することが不十分になる。これとは対照的に、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴは、無傷のＦｃ機能性を有しており、そのＦｃ依存性作用機序を通じて維持されたＨＩＶウイルス抑制を誘導するその能力ではベドリズマブとは明確に区別されうる。新たな耐久性のあるＨＩＶ特異的免疫応答（予防接種効果）を誘導するためには、ＡＰＣ上のＦｃγＲへのＨＩＶビリオンと抗α４β７抗体（無傷のＦｃドメインを有する）により形成される免疫複合体の結合が必要になる。実際、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴは、ＴＨＰ－１細胞においてα４β７被覆ビーズ又はα４β７発現ＧＦＰ＋ＶＬＰ（ウイルス様粒子）の取込みをα４β７－及びＦｃ依存的に媒介することができる。まとめると、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴは、Ｆｃ依存性又はＦａｂ依存性である機構を含む、ＨＩＶ制御のためのいくつかの提唱されている作用機序での活性を示している。したがって、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴは、α４β７に対するそのより高い親和性及び「予防接種効果」を誘導するその無傷のＦｃ機能性のために、ＨＩＶウイルス負荷の維持された低減のためにはベドリズマブよりも強力な作用物質であると予想される。
網羅的なｉｎ ｖｉｔｒｏ特性評価からのＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴの主要な特質は表３５にまとめられている。
Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴは、α４β７に結合するがα４β１には結合せずαＥβ７には最小限に結合するアンタゴニスト抗α４β７ヒトＩｇＧ１／κモノクローナル抗体である。Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴは、ヒトとカニクイザルＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔサブセットの両方に強く結合し、優れたカニクイザル結合交差反応性を示す。しかし、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴは齧歯動物ＰＢＭＣには結合しない。Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴは、α４β７／ＶＣＡＭ－１相互作用を阻害せずにα４β７／ＭＡｄＣＡＭ－１相互作用を高い効力で選択的に遮断する。Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴは、ヒト一次ＣＤ４＋Ｔ細胞のＭＡｄＣＡＭ－１媒介同時刺激を遮断することができる。ヒトＩｇＧ１について予測されるように、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで未感染α４β７＋細胞に対してＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ及びＣＤＣ活性の引き金を引かずにヒトＦｃγＲに結合する（ｉｎ ｖｉｖｏでのＦｃ媒介「予防接種効果」）に不可欠な必要条件）。Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴによるｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｆｃエフェクター活性の欠如は、抗体誘導標的内部移行に起因する減少した細胞表面α４β７発現により部分的に説明しうる。さらに、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴは、ＴＨＰ－１細胞においてα４β７被覆ビーズ又はα４β７発現ＧＦＰ＋ＶＬＰ（ウイルス様粒子）の取込みをα４β７依存的に及びＦｃ依存的に媒介することができる。Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴは、臨床候補に必要な意図されたｉｎ ｖｉｔｒｏ薬理学的特性を見せる。
本開示で提供されるように、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴは、ベドリズマブとは区別され、それから改良されている強力なα４β７選択的アンタゴニストである。Ａｂ－Ｖｅｄｏと比べたＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴの鍵となる特性は表３６～４０に示され表４１にまとめられている。
表３９－ＢＩＡｃｏｒｅによるＡｂ－Ｖｅｄｏと比べたヒトＦｃγＲに対するＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴの結合親和性
表４０－ＢＩＡｃｏｒｅによるＡｂ－Ｖｅｄｏと比べたカニクイザルＦｃγＲに対するＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴの結合親和性
表４１－Ａｂ－Ｖｅｄｏと比べたＡｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴの鍵となる特性
α４β７に対するそのより良好な結合親和性及びＦｃ媒介エフェクター機能の引き金を引かずにヒトＦｃγＲに結合するその能力などの、Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴの主要なパラメータは、ベドリズマブとの重要な区別要因であり、これらの特性はベドリズマブよりも改良された効力を駆動すると期待される。Ａｂ－ｈ１．９ｄ－ＷＴは、抗α４β７臨床候補に必要なｉｎ ｖｉｔｒｏ薬理学的特性も有する。
８．例示的実施形態
種々の特定の実施形態が説明され記載されており、一部は下に表されているが、本発明の精神と範囲から逸脱することなく種々の変更を加えることが可能であることは認識されている。
１．（ｉ）３つのＣＤＲを含むＶＨ鎖領域；及び（ｉｉ）３つのＣＤＲを含むＶＬ鎖領域を含む抗ヒトα４β７抗体であって、
ＶＨ ＣＤＲ＃１がＧＦＮＩＫＮＴＹＭＨ（配列番号７２）であり；
ＶＨ ＣＤＲ＃２がＲＩＤＰＡＫＧＨＴＥＹＡＰＫＦＬＧ（配列番号７３）であり；
ＶＨ ＣＤＲ＃３がＶＤＶ（配列番号７４）であり；
ＶＬ ＣＤＲ＃１がＨＡＳＱＤＩＳＤＮＩＧ（配列番号７５）であり；
ＶＬ ＣＤＲ＃２がＨＧＴＮＬＥＤ（配列番号７６）であり；及び
ＶＬ ＣＤＲ＃３がＶＱＹＡＱＦＰＷＴ（配列番号７７）である、
抗ヒトα４β７抗体。
２．ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＦＮＩＫＮＴＹＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＲＩＤＰＡＫＧＨＴＥＹＡＰＫＦＬＧＲＶＴＩＴＡＤＥＳＴＮＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＹＹＶＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ（配列番号７０）
のＶＨ鎖領域；及び
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＨＡＳＱＤＩＳＤＮＩＧＷＬＱＱＫＰＧＫＳＦＫＬＬＩＹＨＧＴＮＬＥＤＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＶＱＹＡＱＦＰＷＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号７１）
のＶＬ鎖領域
を含む、実施形態１に記載の抗ヒトα４β７抗体。
３．ヒト化されている、実施形態１又は２に記載の抗ヒトα４β７抗体。
４．ＩｇＧである、実施形態１～３のいずれかに記載の抗ヒトα４β７抗体。
５．カッパ軽定常領域を含む、実施形態１～４のいずれかに記載の抗ヒトα４β７抗体。
６．ＩｇＧ１である、実施形態１～５のいずれか一つに記載の抗ヒトα４β７抗体。
７．アミノ酸置換Ｄ３５６Ｅ及びＬ３５８Ｍを有するバリアントＣＨ３ドメインを含む、実施形態１～６のいずれか一つに記載の抗ヒトα４β７抗体。
８．配列番号９２又は配列番号９３のアミノ酸配列を有する重鎖、及び配列番号１００のアミノ酸配列を有する軽鎖を含む、実施形態１～７のいずれか一つに記載の抗ヒトα４β７抗体。
９．アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ及び／又はＬ２３５Ａを有するバリアントＣＨ２ドメインを含む、実施形態１～８のいずれか一つに記載の抗ヒトα４β７抗体。
１０．アミノ酸置換Ｔ２５０Ｑを有するバリアントＣＨ２ドメイン、及び／又はアミノ酸置換Ｍ４２８Ｌを有するバリアントＣＨ３ドメインを含む、実施形態１～９のいずれか一つに記載の抗ヒトα４β７抗体。
１１．抗ヒトα４β７抗体をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、抗体が、（ｉ）３つのＣＤＲを含むＶＨ鎖領域；及び（ｉｉ）３つのＣＤＲを含むＶＬ鎖領域を含み、
ＶＨ ＣＤＲ＃１がＧＦＮＩＫＮＴＹＭＨ（配列番号７２）であり；
ＶＨ ＣＤＲ＃２がＲＩＤＰＡＫＧＨＴＥＹＡＰＫＦＬＧ（配列番号７３）であり；
ＶＨ ＣＤＲ＃３がＶＤＶ（配列番号７４）であり；
ＶＬ ＣＤＲ＃１がＨＡＳＱＤＩＳＤＮＩＧ（配列番号７５）であり；
ＶＬ ＣＤＲ＃２がＨＧＴＮＬＥＤ（配列番号７６）であり；及び
ＶＬ ＣＤＲ＃３がＶＱＹＡＱＦＰＷＴ（配列番号７７）である、
ポリヌクレオチド。
１２．実施形態１１に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
１３．実施形態１２に記載のベクターをトランスフェクトされた真核宿主細胞。
１４．実施形態１１に記載のポリヌクレオチドを発現するように操作された真核宿主細胞。
１５．哺乳動物宿主細胞である、実施形態１３又は１４に記載の真核宿主細胞。
１６．抗ヒトα４β７抗体を産生する方法であって、（ａ）実施形態１５に記載の真核宿主細胞を培養するステップと（ｂ）抗ヒトα４β７抗体を回収するステップを含む方法。
１７．実施形態１２に記載のベクターで形質転換された原核宿主細胞。
１８．実施形態１７に記載のポリヌクレオチドを発現するように操作された原核宿主細胞。
１９．細菌宿主細胞である、実施形態１８に記載の原核宿主細胞。
２０．抗ヒトα４β７抗体を産生する方法であって、（ａ）実施形態１９に記載の原核宿主細胞を培養するステップと（ｂ）抗ヒトα４β７抗体を回収するステップを含む方法。
２１．ＨＩＶ感染対象においてＨＩＶ感染のウイルス抑制を誘導する方法であって、ある量の、実施形態１～１０のいずれか一つに記載の抗ヒトα４β７抗体を対象に投与するステップを含む方法。
２２．ウイルス抑制が免疫媒介される、実施形態２１に記載の方法。
２３．ＨＩＶ感染対象においてＨＩＶ感染を処置する方法であって、ある量の、実施形態１～１０のいずれか一つに記載の抗ヒトα４β７抗体を対象に投与するステップを含む方法。
２４．ＨＩＶを抑制する、抗ヒトα４β７抗体。
２５．ＨＩＶ複製及び／又はＨＩＶ感染を阻害する、実施形態２４に記載の抗ヒトα４β７抗体。
２６．ヒトα４β７を発現する細胞上でヒトα４β７を不活化する及び／又はヒトα４β７の活性化を減少させる、実施形態２４に記載の抗ヒトα４β７抗体。
２７．ヒトα４β７を発現する細胞上でヒトα４β７の内部移行を誘導する、実施形態２４に記載の抗ヒトα４β７抗体。
２８．ＣＤ４ Ｔ細胞同時刺激を阻害する、実施形態２４に記載の抗ヒトα４β７抗体。
２９．ＣＤ４ Ｔ細胞同時刺激が、ＭＡｄＣＡＭ－１又はＨＩＶ ｇｐ１２０により媒介される、実施形態２８に記載の抗ヒトα４β７抗体。
３０．ＣＤ４ Ｔ細胞でのＨＩＶ複製を阻害する、実施形態２５に記載の抗ヒトα４β７抗体。
３１．ＣＤ４ Ｔ細胞が、ＭＡｄＣＡＭ－１刺激ＣＤ４ Ｔ細胞又はＨＩＶ ｇｐ１２０刺激ＣＤ４ Ｔ細胞である、実施形態３０に記載の抗ヒトα４β７抗体。
３２．α４β７とそのリガンドの少なくとも１つの相互作用を破壊する、実施形態２４に記載の抗ヒトα４β７抗体。
３３．α４β７リガンドがＭＡｄＣＡＭ－１である、実施形態３２に記載の抗ヒトα４β７抗体。
３４．α４β７リガンドがＨＩＶ ｇｐ１２０である、実施形態３２に記載の抗ヒトα４β７抗体。
３５．ＨＩＶのｇｐ１２０媒介細胞間伝播を阻害する、実施形態３４に記載の抗ヒトα４β７抗体。
３６．ＨＩＶビリオンに結合する、実施形態２４に記載の抗ヒトα４β７抗体。
３７．ＨＩＶビリオンへの抗体結合が免疫複合体を形成する、実施形態３６に記載の抗ヒトα４β７抗体。
３８．免疫複合体が細胞上のＦｃγＲに結合する、実施形態３７に記載の抗ヒトα４β７抗体。
３９．免疫複合体が抗原提示細胞（ＡＰＣ）上のＦｃγＲに結合する、実施形態３７に記載の抗ヒトα４β７抗体。
４０．免疫複合体が食作用によりＡＰＣに取り込まれる、実施形態３９に記載の抗ヒトα４β７抗体。
４１．ＨＩＶ特異的免疫応答を誘導する、実施形態４０に記載の抗ヒトα４β７抗体。
４２．ＨＩＶに対する予防接種効果を誘導する、実施形態４０又は４１に記載の抗ヒトα４β７抗体。
４３．ＨＩＶ特異的免疫応答が、ＨＩＶ感染個人においてＨＩＶのウイルス制御をもたらす、実施形態４１に記載の抗ヒトα４β７抗体。
４４．ウイルス制御がウイルス負荷の減少をもたらす、実施形態４３に記載の抗ヒトα４β７抗体。
４５．ウイルス制御が、より低いウイルスセットポイントをもたらす、実施形態４３に記載の抗ヒトα４β７抗体。
４６．ウイルス制御が、抗レトロウイルス処置中断（ＡＴＩ）後のウイルスリバウンドの遅延をもたらす、実施形態４３に記載の抗ヒトα４β７抗体。
４７．Ａｂ－ｍ１、Ａｂ－ｃ１、Ａｂ－ｈ１．１、Ａｂ－ｈ１．２、Ａｂ－ｈ１．３、Ａｂ－ｈ１．４、Ａｂ－ｈ１．５、Ａｂ－ｈ１．６、Ａｂ－ｈ１．７、Ａｂ－ｈ１．８、Ａｂ－ｈ１．９、Ａｂ－ｈ１．９ａ、Ａｂ－ｈ１．９ｂ、Ａｂ－ｈ１．９ｃ、Ａｂ－ｈ１．９ｄ若しくはＡｂ－ｈ１．９ｅから選択される抗体由来の６つの相補性決定領域（ＣＤＲ）のセット又は可変重鎖領域及び可変軽鎖領域を有する、実施形態２４～４６のいずれか一つに記載の抗ヒトα４β７抗体。
４８．ＨＩＶを抑制する、実施形態１～１０のいずれか一つに記載の抗ヒトα４β７抗体。
４９．ＨＩＶ複製及び／又はＨＩＶ感染を阻害する、実施形態４８に記載の抗ヒトα４β７抗体。
５０．ヒトα４β７を発現する細胞上でヒトα４β７を不活化する及び／又はヒトα４β７の活性化を減少させる、実施形態４８に記載の抗ヒトα４β７抗体。
５１．ヒトα４β７を発現する細胞上でヒトα４β７の内部移行を誘導する、実施形態４８に記載の抗ヒトα４β７抗体。
５２．ＣＤ４ Ｔ細胞同時刺激を阻害する、実施形態４８に記載の抗ヒトα４β７抗体。
５３．ＣＤ４ Ｔ細胞同時刺激が、ＭＡｄＣＡＭ－１又はＨＩＶ ｇｐ１２０により媒介される、実施形態５２に記載の抗ヒトα４β７抗体。
５４．ＣＤ４ Ｔ細胞でのＨＩＶ複製を阻害する、実施形態４９に記載の抗ヒトα４β７抗体。
５５．ＣＤ４ Ｔ細胞が、ＭＡｄＣＡＭ－１刺激ＣＤ４ Ｔ細胞又はＨＩＶ ｇｐ１２０刺激ＣＤ４ Ｔ細胞である、実施形態５４に記載の抗ヒトα４β７抗体。
５６．α４β７とそのリガンドの少なくとも１つの相互作用を破壊する、実施形態４８に記載の抗ヒトα４β７抗体。
５７．α４β７リガンドがＭＡｄＣＡＭ－１である、実施形態５６に記載の抗ヒトα４β７抗体。
５８．α４β７リガンドがＨＩＶ ｇｐ１２０である、実施形態５６に記載の抗ヒトα４β７抗体。
５９．ＨＩＶのｇｐ１２０媒介細胞間伝播を阻害する、実施形態５８に記載の抗ヒトα４β７抗体。
６０．ＨＩＶビリオンに結合する、実施形態４８に記載の抗ヒトα４β７抗体。
６１．ＨＩＶビリオンへの抗体結合が免疫複合体を形成する、実施形態６０に記載の抗ヒトα４β７抗体。
６２．免疫複合体が細胞上のＦｃγＲに結合する、実施形態６１に記載の抗ヒトα４β７抗体。
６３．免疫複合体が抗原提示細胞（ＡＰＣ）上のＦｃγＲに結合する、実施形態６１に記載の抗ヒトα４β７抗体。
６４．免疫複合体が食作用によりＡＰＣに取り込まれる、実施形態６３に記載の抗ヒトα４β７抗体。
６５．ＨＩＶ特異的免疫応答を誘導する、実施形態６４に記載の抗ヒトα４β７抗体。
６６．ＨＩＶに対する予防接種効果を誘導する、実施形態６４又は６５に記載の抗ヒトα４β７抗体。
６７．ＨＩＶ特異的免疫応答が、ＨＩＶ感染個人においてＨＩＶのウイルス制御をもたらす、実施形態６４又は６５に記載の抗ヒトα４β７抗体。
６８．ウイルス制御がウイルス負荷の減少をもたらす、実施形態６７に記載の抗ヒトα４β７抗体。
６９．ウイルス制御が、より低いウイルスセットポイントをもたらす、実施形態６７に記載の抗ヒトα４β７抗体。
７０．ウイルス制御が、抗レトロウイルス処置中断（ＡＴＩ）後のウイルスリバウンドの遅延をもたらす、実施形態６７に記載の抗ヒトα４β７抗体。
７１．先行する実施形態のいずれか一つに記載の抗体を含む医薬組成物。
種々の特定の実施形態が説明され記載されており、一部は下に表されているが、本発明の精神と範囲から逸脱することなく種々の変更を加えることが可能であることは認識されている。
１．（ｉ）３つのＣＤＲを含むＶＨ鎖領域；及び（ｉｉ）３つのＣＤＲを含むＶＬ鎖領域を含む抗ヒトα４β７抗体であって、
ＶＨ ＣＤＲ＃１がＧＦＮＩＫＮＴＹＭＨ（配列番号７２）であり；
ＶＨ ＣＤＲ＃２がＲＩＤＰＡＫＧＨＴＥＹＡＰＫＦＬＧ（配列番号７３）であり；
ＶＨ ＣＤＲ＃３がＶＤＶ（配列番号７４）であり；
ＶＬ ＣＤＲ＃１がＨＡＳＱＤＩＳＤＮＩＧ（配列番号７５）であり；
ＶＬ ＣＤＲ＃２がＨＧＴＮＬＥＤ（配列番号７６）であり；及び
ＶＬ ＣＤＲ＃３がＶＱＹＡＱＦＰＷＴ（配列番号７７）である、
抗ヒトα４β７抗体。
２．ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＦＮＩＫＮＴＹＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＲＩＤＰＡＫＧＨＴＥＹＡＰＫＦＬＧＲＶＴＩＴＡＤＥＳＴＮＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＹＹＶＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ（配列番号７０）
のＶＨ鎖領域；及び
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＨＡＳＱＤＩＳＤＮＩＧＷＬＱＱＫＰＧＫＳＦＫＬＬＩＹＨＧＴＮＬＥＤＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＶＱＹＡＱＦＰＷＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号７１）
のＶＬ鎖領域
を含む、実施形態１に記載の抗ヒトα４β７抗体。
３．ヒト化されている、実施形態１又は２に記載の抗ヒトα４β７抗体。
４．ＩｇＧである、実施形態１～３のいずれかに記載の抗ヒトα４β７抗体。
５．カッパ軽定常領域を含む、実施形態１～４のいずれかに記載の抗ヒトα４β７抗体。
６．ＩｇＧ１である、実施形態１～５のいずれか一つに記載の抗ヒトα４β７抗体。
７．アミノ酸置換Ｄ３５６Ｅ及びＬ３５８Ｍを有するバリアントＣＨ３ドメインを含む、実施形態１～６のいずれか一つに記載の抗ヒトα４β７抗体。
８．配列番号９２又は配列番号９３のアミノ酸配列を有する重鎖、及び配列番号１００のアミノ酸配列を有する軽鎖を含む、実施形態１～７のいずれか一つに記載の抗ヒトα４β７抗体。
９．アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ及び／又はＬ２３５Ａを有するバリアントＣＨ２ドメインを含む、実施形態１～８のいずれか一つに記載の抗ヒトα４β７抗体。
１０．アミノ酸置換Ｔ２５０Ｑを有するバリアントＣＨ２ドメイン、及び／又はアミノ酸置換Ｍ４２８Ｌを有するバリアントＣＨ３ドメインを含む、実施形態１～９のいずれか一つに記載の抗ヒトα４β７抗体。
１１．抗ヒトα４β７抗体をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、抗体が、（ｉ）３つのＣＤＲを含むＶＨ鎖領域；及び（ｉｉ）３つのＣＤＲを含むＶＬ鎖領域を含み、
ＶＨ ＣＤＲ＃１がＧＦＮＩＫＮＴＹＭＨ（配列番号７２）であり；
ＶＨ ＣＤＲ＃２がＲＩＤＰＡＫＧＨＴＥＹＡＰＫＦＬＧ（配列番号７３）であり；
ＶＨ ＣＤＲ＃３がＶＤＶ（配列番号７４）であり；
ＶＬ ＣＤＲ＃１がＨＡＳＱＤＩＳＤＮＩＧ（配列番号７５）であり；
ＶＬ ＣＤＲ＃２がＨＧＴＮＬＥＤ（配列番号７６）であり；及び
ＶＬ ＣＤＲ＃３がＶＱＹＡＱＦＰＷＴ（配列番号７７）である、
ポリヌクレオチド。
１２．実施形態１１に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
１３．実施形態１２に記載のベクターをトランスフェクトされた真核宿主細胞。
１４．実施形態１１に記載のポリヌクレオチドを発現するように操作された真核宿主細胞。
１５．哺乳動物宿主細胞である、実施形態１３又は１４に記載の真核宿主細胞。
１６．抗ヒトα４β７抗体を産生する方法であって、（ａ）実施形態１５に記載の真核宿主細胞を培養するステップと（ｂ）抗ヒトα４β７抗体を回収するステップを含む方法。
１７．実施形態１２に記載のベクターで形質転換された原核宿主細胞。
１８．実施形態１７に記載のポリヌクレオチドを発現するように操作された原核宿主細胞。
１９．細菌宿主細胞である、実施形態１８に記載の原核宿主細胞。
２０．抗ヒトα４β７抗体を産生する方法であって、（ａ）実施形態１９に記載の原核宿主細胞を培養するステップと（ｂ）抗ヒトα４β７抗体を回収するステップを含む方法。
２１．ＨＩＶ感染対象においてＨＩＶ感染のウイルス抑制を誘導する方法であって、ある量の、実施形態１～１０のいずれか一つに記載の抗ヒトα４β７抗体を対象に投与するステップを含む方法。
２２．ウイルス抑制が免疫媒介される、実施形態２１に記載の方法。
２３．ＨＩＶ感染対象においてＨＩＶ感染を処置する方法であって、ある量の、実施形態１～１０のいずれか一つに記載の抗ヒトα４β７抗体を対象に投与するステップを含む方法。
２４．ＨＩＶを抑制する、抗ヒトα４β７抗体。
２５．ＨＩＶ複製及び／又はＨＩＶ感染を阻害する、実施形態２４に記載の抗ヒトα４β７抗体。
２６．ヒトα４β７を発現する細胞上でヒトα４β７を不活化する及び／又はヒトα４β７の活性化を減少させる、実施形態２４に記載の抗ヒトα４β７抗体。
２７．ヒトα４β７を発現する細胞上でヒトα４β７の内部移行を誘導する、実施形態２４に記載の抗ヒトα４β７抗体。
２８．ＣＤ４ Ｔ細胞同時刺激を阻害する、実施形態２４に記載の抗ヒトα４β７抗体。
２９．ＣＤ４ Ｔ細胞同時刺激が、ＭＡｄＣＡＭ－１又はＨＩＶ ｇｐ１２０により媒介される、実施形態２８に記載の抗ヒトα４β７抗体。
３０．ＣＤ４ Ｔ細胞でのＨＩＶ複製を阻害する、実施形態２５に記載の抗ヒトα４β７抗体。
３１．ＣＤ４ Ｔ細胞が、ＭＡｄＣＡＭ－１刺激ＣＤ４ Ｔ細胞又はＨＩＶ ｇｐ１２０刺激ＣＤ４ Ｔ細胞である、実施形態３０に記載の抗ヒトα４β７抗体。
３２．α４β７とそのリガンドの少なくとも１つの相互作用を破壊する、実施形態２４に記載の抗ヒトα４β７抗体。
３３．α４β７リガンドがＭＡｄＣＡＭ－１である、実施形態３２に記載の抗ヒトα４β７抗体。
３４．α４β７リガンドがＨＩＶ ｇｐ１２０である、実施形態３２に記載の抗ヒトα４β７抗体。
３５．ＨＩＶのｇｐ１２０媒介細胞間伝播を阻害する、実施形態３４に記載の抗ヒトα４β７抗体。
３６．ＨＩＶビリオンに結合する、実施形態２４に記載の抗ヒトα４β７抗体。
３７．ＨＩＶビリオンへの抗体結合が免疫複合体を形成する、実施形態３６に記載の抗ヒトα４β７抗体。
３８．免疫複合体が細胞上のＦｃγＲに結合する、実施形態３７に記載の抗ヒトα４β７抗体。
３９．免疫複合体が抗原提示細胞（ＡＰＣ）上のＦｃγＲに結合する、実施形態３７に記載の抗ヒトα４β７抗体。
４０．免疫複合体が食作用によりＡＰＣに取り込まれる、実施形態３９に記載の抗ヒトα４β７抗体。
４１．ＨＩＶ特異的免疫応答を誘導する、実施形態４０に記載の抗ヒトα４β７抗体。
４２．ＨＩＶに対する予防接種効果を誘導する、実施形態４０又は４１に記載の抗ヒトα４β７抗体。
４３．ＨＩＶ特異的免疫応答が、ＨＩＶ感染個人においてＨＩＶのウイルス制御をもたらす、実施形態４１に記載の抗ヒトα４β７抗体。
４４．ウイルス制御がウイルス負荷の減少をもたらす、実施形態４３に記載の抗ヒトα４β７抗体。
４５．ウイルス制御が、より低いウイルスセットポイントをもたらす、実施形態４３に記載の抗ヒトα４β７抗体。
４６．ウイルス制御が、抗レトロウイルス処置中断（ＡＴＩ）後のウイルスリバウンドの遅延をもたらす、実施形態４３に記載の抗ヒトα４β７抗体。
４７．Ａｂ－ｍ１、Ａｂ－ｃ１、Ａｂ－ｈ１．１、Ａｂ－ｈ１．２、Ａｂ－ｈ１．３、Ａｂ－ｈ１．４、Ａｂ－ｈ１．５、Ａｂ－ｈ１．６、Ａｂ－ｈ１．７、Ａｂ－ｈ１．８、Ａｂ－ｈ１．９、Ａｂ－ｈ１．９ａ、Ａｂ－ｈ１．９ｂ、Ａｂ－ｈ１．９ｃ、Ａｂ－ｈ１．９ｄ若しくはＡｂ－ｈ１．９ｅから選択される抗体由来の６つの相補性決定領域（ＣＤＲ）のセット又は可変重鎖領域及び可変軽鎖領域を有する、実施形態２４～４６のいずれか一つに記載の抗ヒトα４β７抗体。
４８．ＨＩＶを抑制する、実施形態１～１０のいずれか一つに記載の抗ヒトα４β７抗体。
４９．ＨＩＶ複製及び／又はＨＩＶ感染を阻害する、実施形態４８に記載の抗ヒトα４β７抗体。
５０．ヒトα４β７を発現する細胞上でヒトα４β７を不活化する及び／又はヒトα４β７の活性化を減少させる、実施形態４８に記載の抗ヒトα４β７抗体。
５１．ヒトα４β７を発現する細胞上でヒトα４β７の内部移行を誘導する、実施形態４８に記載の抗ヒトα４β７抗体。
５２．ＣＤ４ Ｔ細胞同時刺激を阻害する、実施形態４８に記載の抗ヒトα４β７抗体。
５３．ＣＤ４ Ｔ細胞同時刺激が、ＭＡｄＣＡＭ－１又はＨＩＶ ｇｐ１２０により媒介される、実施形態５２に記載の抗ヒトα４β７抗体。
５４．ＣＤ４ Ｔ細胞でのＨＩＶ複製を阻害する、実施形態４９に記載の抗ヒトα４β７抗体。
５５．ＣＤ４ Ｔ細胞が、ＭＡｄＣＡＭ－１刺激ＣＤ４ Ｔ細胞又はＨＩＶ ｇｐ１２０刺激ＣＤ４ Ｔ細胞である、実施形態５４に記載の抗ヒトα４β７抗体。
５６．α４β７とそのリガンドの少なくとも１つの相互作用を破壊する、実施形態４８に記載の抗ヒトα４β７抗体。
５７．α４β７リガンドがＭＡｄＣＡＭ－１である、実施形態５６に記載の抗ヒトα４β７抗体。
５８．α４β７リガンドがＨＩＶ ｇｐ１２０である、実施形態５６に記載の抗ヒトα４β７抗体。
５９．ＨＩＶのｇｐ１２０媒介細胞間伝播を阻害する、実施形態５８に記載の抗ヒトα４β７抗体。
６０．ＨＩＶビリオンに結合する、実施形態４８に記載の抗ヒトα４β７抗体。
６１．ＨＩＶビリオンへの抗体結合が免疫複合体を形成する、実施形態６０に記載の抗ヒトα４β７抗体。
６２．免疫複合体が細胞上のＦｃγＲに結合する、実施形態６１に記載の抗ヒトα４β７抗体。
６３．免疫複合体が抗原提示細胞（ＡＰＣ）上のＦｃγＲに結合する、実施形態６１に記載の抗ヒトα４β７抗体。
６４．免疫複合体が食作用によりＡＰＣに取り込まれる、実施形態６３に記載の抗ヒトα４β７抗体。
６５．ＨＩＶ特異的免疫応答を誘導する、実施形態６４に記載の抗ヒトα４β７抗体。
６６．ＨＩＶに対する予防接種効果を誘導する、実施形態６４又は６５に記載の抗ヒトα４β７抗体。
６７．ＨＩＶ特異的免疫応答が、ＨＩＶ感染個人においてＨＩＶのウイルス制御をもたらす、実施形態６４又は６５に記載の抗ヒトα４β７抗体。
６８．ウイルス制御がウイルス負荷の減少をもたらす、実施形態６７に記載の抗ヒトα４β７抗体。
６９．ウイルス制御が、より低いウイルスセットポイントをもたらす、実施形態６７に記載の抗ヒトα４β７抗体。
７０．ウイルス制御が、抗レトロウイルス処置中断（ＡＴＩ）後のウイルスリバウンドの遅延をもたらす、実施形態６７に記載の抗ヒトα４β７抗体。
７１．先行する実施形態のいずれか一つに記載の抗体を含む医薬組成物。
Claims (9)
- （ｉ）３つのＣＤＲを含むＶＨ鎖領域；及び（ｉｉ）３つのＣＤＲを含むＶＬ鎖領域を含む抗ヒトα４β７モノクローナル抗体であって、
ＶＨ ＣＤＲ＃１がＧＦＮＩＫＮＴＹＭＨ（配列番号７２）であり；
ＶＨ ＣＤＲ＃２がＲＩＤＰＡＫＧＨＴＥＹＡＰＫＦＬＧ（配列番号７３）であり；
ＶＨ ＣＤＲ＃３がＶＤＶ（配列番号７４）であり；
ＶＬ ＣＤＲ＃１がＨＡＳＱＤＩＳＤＮＩＧ（配列番号７５）であり；
ＶＬ ＣＤＲ＃２がＨＧＴＮＬＥＤ（配列番号７６）であり；及び
ＶＬ ＣＤＲ＃３がＶＱＹＡＱＦＰＷＴ（配列番号７７）である、
抗ヒトα４β７抗体。 - ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＦＮＩＫＮＴＹＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＲＩＤＰＡＫＧＨＴＥＹＡＰＫＦＬＧＲＶＴＩＴＡＤＥＳＴＮＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＹＹＶＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ（配列番号７０）
のＶＨ鎖領域；及び
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＨＡＳＱＤＩＳＤＮＩＧＷＬＱＱＫＰＧＫＳＦＫＬＬＩＹＨＧＴＮＬＥＤＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＶＱＹＡＱＦＰＷＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号７１）
のＶＬ鎖領域
を含む、請求項１に記載の抗ヒトα４β７モノクローナル抗体。 - ＩｇＧである、請求項２に記載の抗ヒトα４β７モノクローナル抗体。
- カッパ軽定常領域を含む、請求項３に記載の抗ヒトα４β７モノクローナル抗体。
- ＩｇＧ１である、請求項４に記載の抗ヒトα４β７モノクローナル抗体。
- アミノ酸置換Ｄ３５６Ｅ及びＬ３５８Ｍを有するバリアントＣＨ３ドメインを含む、請求項５に記載の抗ヒトα４β７モノクローナル抗体。
- 配列番号９２又は配列番号９３のアミノ酸配列を有する重鎖、及び配列番号１００のアミノ酸配列を有する軽鎖を含む、請求項１に記載の抗ヒトα４β７モノクローナル抗体。
- 配列番号９２のアミノ酸配列から、それぞれなる重鎖、及び配列番号１００のアミノ酸配列から、それぞれなる軽鎖を含む抗体である、請求項１に記載の抗ヒトα４β７モノクローナル抗体。
- 配列番号９３のアミノ酸配列から、それぞれなる重鎖、及び配列番号１００のアミノ酸配列から、それぞれなる軽鎖を含む抗体である、請求項１に記載の抗ヒトα４β７モノクローナル抗体。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2023212722A JP2024037932A (ja) | 2020-07-16 | 2023-12-18 | 抗アルファ－４－ベータ－７抗体 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US202063052933P | 2020-07-16 | 2020-07-16 | |
| US63/052,933 | 2020-07-16 | ||
| PCT/US2021/070898 WO2022016198A1 (en) | 2020-07-16 | 2021-07-16 | Anti-αlpha-4-βeta-7 antibodies |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2023212722A Division JP2024037932A (ja) | 2020-07-16 | 2023-12-18 | 抗アルファ－４－ベータ－７抗体 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2023535556A JP2023535556A (ja) | 2023-08-18 |
| JPWO2022016198A5 JPWO2022016198A5 (ja) | 2023-11-09 |
| JP7408008B2 true JP7408008B2 (ja) | 2024-01-04 |
Family
ID=77338969
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2023502654A Active JP7408008B2 (ja) | 2020-07-16 | 2021-07-16 | 抗アルファ－４－ベータ－７抗体 |
| JP2023212722A Pending JP2024037932A (ja) | 2020-07-16 | 2023-12-18 | 抗アルファ－４－ベータ－７抗体 |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2023212722A Pending JP2024037932A (ja) | 2020-07-16 | 2023-12-18 | 抗アルファ－４－ベータ－７抗体 |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US11639390B2 (ja) |
| EP (1) | EP4182349A1 (ja) |
| JP (2) | JP7408008B2 (ja) |
| KR (1) | KR20230038728A (ja) |
| CN (1) | CN115867352A (ja) |
| AR (1) | AR122983A1 (ja) |
| AU (1) | AU2021307468A1 (ja) |
| BR (1) | BR112023000718A2 (ja) |
| CA (1) | CA3188739A1 (ja) |
| CO (1) | CO2023001066A2 (ja) |
| IL (1) | IL299767A (ja) |
| MX (1) | MX2023000732A (ja) |
| TW (1) | TW202216781A (ja) |
| UY (1) | UY39327A (ja) |
| WO (1) | WO2022016198A1 (ja) |
| ZA (1) | ZA202300222B (ja) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2018104893A1 (en) | 2016-12-06 | 2018-06-14 | Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited | Alpha4-beta7 antibodies with incrased fcrn binding and/or half-life |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000029584A1 (en) | 1998-11-18 | 2000-05-25 | Genentech, Inc. | Antibody variants with higher binding affinity compared to parent antibodies |
| US7217797B2 (en) | 2002-10-15 | 2007-05-15 | Pdl Biopharma, Inc. | Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis |
| WO2007024249A2 (en) | 2004-11-10 | 2007-03-01 | Macrogenics, Inc. | Engineering fc antibody regions to confer effector function |
| UA116189C2 (uk) | 2011-05-02 | 2018-02-26 | Мілленніум Фармасьютікалз, Інк. | КОМПОЗИЦІЯ АНТИ-α4β7 АНТИТІЛА |
| EP2900228A1 (en) | 2012-09-26 | 2015-08-05 | KFLP Biotech, LLC | Compounds for the treatment and prevention of retroviral infections |
-
2021
- 2021-07-15 UY UY0001039327A patent/UY39327A/es unknown
- 2021-07-15 AR ARP210101993A patent/AR122983A1/es unknown
- 2021-07-16 AU AU2021307468A patent/AU2021307468A1/en active Pending
- 2021-07-16 WO PCT/US2021/070898 patent/WO2022016198A1/en active Application Filing
- 2021-07-16 MX MX2023000732A patent/MX2023000732A/es unknown
- 2021-07-16 US US17/378,565 patent/US11639390B2/en active Active
- 2021-07-16 IL IL299767A patent/IL299767A/en unknown
- 2021-07-16 JP JP2023502654A patent/JP7408008B2/ja active Active
- 2021-07-16 TW TW110126301A patent/TW202216781A/zh unknown
- 2021-07-16 KR KR1020237004136A patent/KR20230038728A/ko active Search and Examination
- 2021-07-16 CN CN202180049613.2A patent/CN115867352A/zh active Pending
- 2021-07-16 EP EP21755330.4A patent/EP4182349A1/en active Pending
- 2021-07-16 CA CA3188739A patent/CA3188739A1/en active Pending
- 2021-07-16 BR BR112023000718A patent/BR112023000718A2/pt unknown
-
2023
- 2023-01-04 ZA ZA2023/00222A patent/ZA202300222B/en unknown
- 2023-01-31 CO CONC2023/0001066A patent/CO2023001066A2/es unknown
- 2023-12-18 JP JP2023212722A patent/JP2024037932A/ja active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2018104893A1 (en) | 2016-12-06 | 2018-06-14 | Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited | Alpha4-beta7 antibodies with incrased fcrn binding and/or half-life |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Chang Li et al.，VIROLOGICA SINICA，2014年，Vol. 29, Issue 6，pp. 381-392 |
| Mathieu Uzzan et al.，Sci. Transl. Med.，2018年，Vol. 10, article eaau4711，pp. 1-15 |
| Michael C. Sneller et al.，Sci. Transl. Med.，2019年，Vol. 11, article eaax3447，pp. 1-8 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AR122983A1 (es) | 2022-10-19 |
| CO2023001066A2 (es) | 2023-02-06 |
| US20220017624A1 (en) | 2022-01-20 |
| KR20230038728A (ko) | 2023-03-21 |
| EP4182349A1 (en) | 2023-05-24 |
| CN115867352A (zh) | 2023-03-28 |
| JP2024037932A (ja) | 2024-03-19 |
| BR112023000718A2 (pt) | 2023-02-07 |
| CA3188739A1 (en) | 2022-01-20 |
| MX2023000732A (es) | 2023-02-13 |
| JP2023535556A (ja) | 2023-08-18 |
| US11639390B2 (en) | 2023-05-02 |
| TW202216781A (zh) | 2022-05-01 |
| UY39327A (es) | 2022-02-25 |
| ZA202300222B (en) | 2023-09-27 |
| WO2022016198A1 (en) | 2022-01-20 |
| IL299767A (en) | 2023-03-01 |
| AU2021307468A1 (en) | 2023-02-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU2019370339B2 (en) | Bispecific antibody and use thereof | |
| US20210171648A1 (en) | Antibodies and methods of use thereof | |
| JP6867955B2 (ja) | 抗ｏｘ４０抗体及びその使用方法 | |
| JP5933646B2 (ja) | ヒトｎｋｇ２ｄに対する抗体とその使用 | |
| CN111788225A (zh) | 抗cd38抗体及与抗cd3和抗cd28抗体的组合 | |
| JP2020504101A (ja) | 抗ｏｘ４０抗体及びそれらの使用 | |
| JP2020508637A (ja) | 新規抗ｃｔｌａ４抗体 | |
| KR102417687B1 (ko) | Tl1a 항체 및 그의 용도 | |
| KR20210089143A (ko) | 항-tnfr2 항체 및 그의 용도 | |
| US20230035798A1 (en) | Antigen Binding Molecules That Bind LIGHT | |
| JP7408008B2 (ja) | 抗アルファ－４－ベータ－７抗体 | |
| CA3196493A1 (en) | B and t lymphocyte attenuator (btla) modulators and method of using same | |
| GB2566389B (en) | Antigen binding molecules that bind light | |
| BR122024013054A2 (pt) | Anticorpo monoclonal humano anti-alfa-4--beta-7 | |
| CN116685603A (zh) | B和t淋巴细胞衰减因子（btla）调节剂及其使用方法 | |
| TW202315888A (zh) | 抗vegfr1抗體及其用途 | |
| EA042725B1 (ru) | Новые моноклональные антитела к белку 4, ассоциированному с цитотоксическими т-лимфоцитами, (ctla-4) |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20230807 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20231031 |
|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20231031 |
|
| A871 | Explanation of circumstances concerning accelerated examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A871 Effective date: 20231031 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20231128 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20231219 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 7408008 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |