JP7405400B2 - Nucleic acid molecules and their uses - Google Patents
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Description
本発明は、クロモグラニンＡに結合する核酸分子およびその用途に関する。 The present invention relates to nucleic acid molecules that bind to chromogranin A and their uses.
クロモグラニンＡ（ｃｈｒｏｍｏｇｒａｎｉｎ Ａ；ＣｇＡ）は、副腎髄質クロム親和性細胞や交感神経ニューロン等から分泌される糖タンパク質である。近年、クロモグラニンＡをストレスマーカーとして、ストレスの計測及び評価等に用いる研究が進められている（非特許文献１及び２）。また、クロモグラニンＡの分析方法として、クロモグラニンＡを抗原とする抗体を使用した分析方法が知られている。 Chromogranin A (CgA) is a glycoprotein secreted from adrenal medulla chromaffin cells, sympathetic neurons, and the like. In recent years, research has been underway to use chromogranin A as a stress marker for measuring and evaluating stress (Non-Patent Documents 1 and 2). Furthermore, as a method for analyzing chromogranin A, an analysis method using an antibody having chromogranin A as an antigen is known.
しかしながら、抗体は、タンパク質であり、安定性に問題があるため、低コストで簡易な検査法に抗体を用いることが難しい。また、電気泳動やニトロセルロース膜へのブロッティング等が必要であり、操作が煩雑である。このため、抗体に代えて、抗原と特異的に結合する核酸分子が求められている。 However, since antibodies are proteins and have stability problems, it is difficult to use antibodies in low-cost and simple testing methods. In addition, electrophoresis, blotting onto a nitrocellulose membrane, etc. are required, and the operations are complicated. Therefore, in place of antibodies, nucleic acid molecules that specifically bind to antigens are being sought.
そこで、本発明の目的は、クロモグラニンＡに結合する新たな核酸分子を提供することにある。 Therefore, an object of the present invention is to provide a new nucleic acid molecule that binds to chromogranin A.
本発明の核酸分子は、下記（ａ）または（ｂ）のいずれか一方のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、クロモグラニンＡに結合する核酸分子である。
（ａ）配列番号１～８のいずれかの塩基配列または配列番号１～８のいずれかの塩基配列の部分配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）前記（ａ）の塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、クロモグラニンＡに結合するポリヌクレオチド
The nucleic acid molecule of the present invention is a nucleic acid molecule that binds to chromogranin A and is characterized by containing either one of the following polynucleotides (a) or (b).
(a) A polynucleotide consisting of the base sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 8 or a partial sequence of any of the base sequences of SEQ ID NOs: 1 to 8 (b) 80% or more of the base sequence of (a) above A polynucleotide that binds to chromogranin A and consists of a base sequence having the same identity as
本発明のクロモグラニンＡの検出試薬は、前記本発明の核酸分子を含むことを特徴とする。 The chromogranin A detection reagent of the present invention is characterized by containing the nucleic acid molecule of the present invention.
本発明のクロモグラニンＡの検出方法は、前記本発明の核酸分子、または前記本発明の検出試薬と、試料とを接触させ、前記試料中のクロモグラニンＡと、前記核酸分子または前記検出試薬との複合体を形成させる工程、および、
前記複合体を検出する工程を含むことを特徴とする。
The method for detecting chromogranin A of the present invention includes contacting the nucleic acid molecule of the present invention or the detection reagent of the present invention with a sample to form a complex between chromogranin A in the sample and the nucleic acid molecule or the detection reagent. a step of forming a body, and
The method is characterized by including a step of detecting the complex.
本発明の核酸分子は、クロモグラニンＡに結合可能である。このため、本発明の核酸分子によれば、試料中のクロモグラニンＡとの結合の有無によって、クロモグラニンＡを検出できる。したがって、本発明の核酸分子は、例えば、医薬等の分野において、クロモグラニンＡの検出に、極めて有用なツールといえる。 Nucleic acid molecules of the invention are capable of binding chromogranin A. Therefore, according to the nucleic acid molecule of the present invention, chromogranin A can be detected depending on the presence or absence of binding to chromogranin A in a sample. Therefore, the nucleic acid molecule of the present invention can be said to be an extremely useful tool for detecting chromogranin A, for example, in the pharmaceutical field.
（１）核酸分子
本発明の核酸分子は、前述のように、下記（ａ）または（ｂ）のいずれか一方のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、クロモグラニンＡに結合する核酸分子である。
（ａ）配列番号１～８のいずれかの塩基配列もしくは配列番号１～８のいずれかの塩基配列の部分配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）前記（ａ）の塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、クロモグラニンＡに結合するポリヌクレオチド
(1) Nucleic acid molecule As described above, the nucleic acid molecule of the present invention is a nucleic acid molecule that binds to chromogranin A and is characterized by containing either one of the following polynucleotides (a) or (b).
(a) A polynucleotide consisting of the base sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 8 or a partial sequence of any of the base sequences of SEQ ID NOs: 1 to 8 (b) 80% or more of the base sequence of (a) above A polynucleotide that binds to chromogranin A and consists of a base sequence having the same identity as
本発明において、ターゲットは、クロモグラニンＡである。クロモグラニンＡ（ＵｎｉＰｒｏｔＩＤ：Ｐ１０６４５）は、５１ｋＤａの糖タンパク質である。本発明の核酸について、例えば、結合能を確認するためのクロモグラニンＡとして、市販のクロモグラニンＡが使用でき、具体例として、Recombinant full length Human Chromogranin A (Creative BioMart、#CHGA-26904TH)が例示できる。クロモグラニンＡは、例えば、ヒト由来クロモグラニンＡである。クロモグラニンＡは、例えば、変性が生じていない未変性タンパク質でもよいし、加熱等による変性が生じた変性タンパク質でもよい。 In the present invention, the target is chromogranin A. Chromogranin A (UniProtID: P10645) is a 51 kDa glycoprotein. For the nucleic acid of the present invention, for example, commercially available chromogranin A can be used as chromogranin A to confirm binding ability, and a specific example is Recombinant full length Human Chromogranin A (Creative BioMart, #CHGA-26904TH). Chromogranin A is, for example, human-derived chromogranin A. Chromogranin A may be, for example, an undenatured protein that has not been denatured, or a denatured protein that has been denatured by heating or the like.
本発明の核酸分子は、前述のように、クロモグラニンＡに結合可能である。本発明において、「クロモグラニンＡに結合する」とは、例えば、クロモグラニンＡに対する結合性を有している、または、クロモグラニンＡに対する結合活性を有しているともいう。本発明の核酸分子とクロモグラニンＡとの結合は、例えば、表面プラズモン共鳴分子相互作用（ＳＰＲ；Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｌａｓｍｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）解析等により決定できる。前記解析は、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ３０００（商品名、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＵＫ Ｌｔｄ．）が使用できる。本発明の核酸分子は、クロモグラニンＡに結合することから、例えば、クロモグラニンＡの検出に使用できる。 The nucleic acid molecules of the invention are capable of binding chromogranin A, as described above. In the present invention, "binding to chromogranin A" also means, for example, having a binding property to chromogranin A or having a binding activity to chromogranin A. The binding between the nucleic acid molecule of the present invention and chromogranin A can be determined, for example, by surface plasmon resonance (SPR) analysis. For the analysis, for example, BIACORE3000 (trade name, GE Healthcare UK Ltd.) can be used. Since the nucleic acid molecule of the present invention binds to chromogranin A, it can be used, for example, to detect chromogranin A.
本発明の核酸分子は、クロモグラニンＡに対する結合力を示す解離定数が、例えば、８０ｎＭ以下、６０ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、４０ｎＭ以下、１５ｎＭ以下である。 The nucleic acid molecule of the present invention has a dissociation constant indicating binding strength to chromogranin A of, for example, 80 nM or less, 60 nM or less, 50 nM or less, 40 nM or less, or 15 nM or less.
本発明の核酸分子は、ＤＮＡ分子、またはＤＮＡアプタマーともいう。本発明の核酸分子は、例えば、前記（ａ）または（ｂ）のいずれか一方のポリヌクレオチドからなる分子でもよいし、前記ポリヌクレオチドを含む分子でもよい。 The nucleic acid molecules of the present invention are also referred to as DNA molecules or DNA aptamers. The nucleic acid molecule of the present invention may be, for example, a molecule consisting of the polynucleotide of either (a) or (b), or a molecule containing the polynucleotide.
前記（ａ）のポリヌクレオチドは、前述のように、前記配列番号１～８のいずれかの塩基配列もしくは前記配列番号１～８のいずれかの塩基配列の部分配列からなるポリヌクレオチドである。前記配列番号１～８のポリヌクレオチドを以下に示す。 As described above, the polynucleotide (a) is a polynucleotide consisting of the base sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 8 or a partial sequence of any of the base sequences of SEQ ID NOs: 1 to 8. The polynucleotides of SEQ ID NOs: 1 to 8 are shown below.
アプタマー１：CgA_s1（配列番号１）
GGTTATCCGAGGAGCCGCAATATCTTACACCCTGCCTTCCCCCCTGTCCGCATCGAAACTACCCTGCCCGTGTATTG
アプタマー２：CgA_s2（配列番号２）
GGTTATCCGAGGAGCCGCAATATCAACACTGCCCACCCTTCTACCCATGGCCGCGAAACTACCCTGCCCGTGTATTG
アプタマー３：CgA_s3（配列番号３）
GGTTATCCGAGGAGCCGCAATATCTACCCTGTCCCCTCCTGCTTTCCAGCCTGTGAAACTACCCTGCCCGTGTATTG
アプタマー４：CgA_s4（配列番号４）
GGTTATCCGAGGAGCCGCAATATCACTACCCGCCTTCTTCTACCCTGTCCTCTTGAAACTACCCTGCCCGTGTATTG
アプタマー５：CgA_s5（配列番号５）
GGTTATCCGAGGAGCCGCAATATCTCTCCCCCTCCTTTCCTTCTCCTTGCCCGTGAAACTACCCTGCCCGTGTATTG
アプタマー６：CgA_s6（配列番号６）
GGTTATCCGAGGAGCCGCAATATCAAACTACCCGTCCTCTCCCGTCCCGCCGCCGAAACTACCCTGCCCGTGTATTG
アプタマー７：CgA_s9（配列番号７）
GGTTATCCGAGGAGCCGCAATATCACTACCCTTCGCCCTTTCCCTCTCCATGCTGAAACTACCCTGCCCGTGTATTG
アプタマー８：CgA_s10（配列番号８）
GGTTATCCGAGGAGCCGCAATATCACCCTACCTGACCATCTCGCCCGTCTCTCTGAAACTACCCTGCCCGTGTATTG
Aptamer 1: CgA_s1 (SEQ ID NO: 1)
GGTTATCCGAGGAGCCGCAATATCTTACACCCTGCCTTCCCCCCTGTCCGCATCGAAACTACCCTGCCCGTGTATTG
Aptamer 2: CgA_s2 (SEQ ID NO: 2)
GGTTATCCGAGGAGCCGCAATCAACACTGCCCACCCTTCTACCCATGGCCGCGAAACTACCCTGCCCGTGTATTG
Aptamer 3: CgA_s3 (SEQ ID NO: 3)
GGTTATCCGAGGAGCCGCAATATCTACCCTGTCCCCTCCTGCTTTCCAGCCTGTGAAACTACCCTGCCCGTGTATTG
Aptamer 4: CgA_s4 (SEQ ID NO: 4)
GGTTATCCGAGGAGCCGCAATATCACTACCCGCCTTCTTCTACCCTGTCCTCTTGAAACTACCCTGCCCGTGTATTG
Aptamer 5: CgA_s5 (SEQ ID NO: 5)
GGTTACCGAGGAGCCGCAATATCTCTCCCCCTCCTTTCCTTCTCCTTGCCCGTGAAACTACCCTGCCCGTGTATTG
Aptamer 6: CgA_s6 (SEQ ID NO: 6)
GGTTATCCGAGGAGCCGCAATCAAACTACCCGTCCTCTCCCGTCCCGCCGCCGAAACTACCCTGCCCGTGTATTG
Aptamer 7: CgA_s9 (SEQ ID NO: 7)
GGTTATCCGAGGAGCCGCAATATCACTACCCTTCGCCCTTTCCCTCTCCATGCTGAAACTACCCTGCCCGTGTATTG
Aptamer 8: CgA_s10 (SEQ ID NO: 8)
GGTTATCCGAGGAGCCGCAATATCACCCTACCTGACCATCTCGCCCGTCTCTCTGAAACTACCCTGCCCGTGTATTG
前記（ｂ）において、「同一性」は、特に制限されず、例えば、前記（ｂ）のポリヌクレオチドが、クロモグラニンＡに結合する範囲であればよい。前記同一性は、例えば、８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、９６％以上、９７％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上である。前記同一性は、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ等の解析ソフトウェアを用いて、デフォルトのパラメータにより算出できる（以下、同様）。 In (b) above, "identity" is not particularly limited, and may be within the range in which the polynucleotide in (b) binds to chromogranin A, for example. The identity is, for example, 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, still more preferably 95% or more, 96% or more, 97% or more, particularly preferably 98% or more, most preferably 99% or more. % or more. The identity can be calculated using default parameters using analysis software such as BLAST and FASTA (the same applies hereinafter).
本発明の核酸分子における前記ポリヌクレオチドは、例えば、下記（ｃ）または（ｄ）のポリヌクレオチドでもよい。この場合、本発明の核酸分子は、例えば、前記（ｃ）または（ｄ）のポリヌクレオチドからなる分子でもよいし、前記ポリヌクレオチドを含む分子でもよい。
（ｃ）前記（ａ）の塩基配列からなるポリヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに相補的な塩基配列からなり、クロモグラニンＡに結合するポリヌクレオチド
（ｄ）前記（ａ）の塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、クロモグラニンＡに結合するポリヌクレオチド
The polynucleotide in the nucleic acid molecule of the present invention may be, for example, the polynucleotide (c) or (d) below. In this case, the nucleic acid molecule of the present invention may be, for example, a molecule consisting of the above polynucleotide (c) or (d), or a molecule containing the above polynucleotide.
(c) A polynucleotide that binds to chromogranin A and is composed of a complementary base sequence to a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions to the polynucleotide composed of the base sequence of (a). (d) A polynucleotide that binds to chromogranin A. A polynucleotide that binds to chromogranin A and consists of a base sequence in which one or several bases have been deleted, substituted, inserted, and/or added to the base sequence of a)
前記（ｃ）において、「ハイブリダイズするポリヌクレオチド」は、特に制限されず、例えば、前記（ａ）の塩基配列に対して、完全または部分的に相補的なポリヌクレオチドである。前記ハイブリダイズは、例えば、各種ハイブリダイゼーションアッセイにより検出できる。前記ハイブリダイゼーションアッセイは、特に制限されず、例えば、ザンブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編「モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリーマニュアル第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ Ｅｄ．）」〔Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ （１９８９）〕等に記載されている方法を採用することもできる。 In (c) above, the "hybridizing polynucleotide" is not particularly limited, and is, for example, a polynucleotide that is completely or partially complementary to the base sequence in (a) above. The hybridization can be detected, for example, by various hybridization assays. The hybridization assay is not particularly limited, and is described, for example, in "Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd Ed." edited by Sambrook et al. [Cold Spring Harbor Lab oratory Press (1989)] and the like can also be adopted.
前記（ｃ）において、「ストリンジェントな条件」は、例えば、低ストリンジェントな条件、中ストリンジェントな条件、高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。「低ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、３２℃の条件である。「中ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、４２℃の条件である。「高ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、５０℃の条件である。ストリンジェンシーの程度は、当業者であれば、例えば、温度、塩濃度、プローブの濃度および長さ、イオン強度、時間等の条件を適宜選択することで、設定可能である。「ストリンジェントな条件」は、例えば、前述したザンブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編「モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリーマニュアル第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ Ｅｄ．）」〔Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ （１９８９）〕等に記載の条件を採用することもできる。 In (c) above, the "stringent conditions" may be, for example, low stringency conditions, medium stringency conditions, or high stringency conditions. "Low stringency conditions" are, for example, 5x SSC, 5x Denhardt's solution, 0.5% SDS, 50% formamide, and 32°C. "Intermediate stringency conditions" are, for example, 5x SSC, 5x Denhardt's solution, 0.5% SDS, 50% formamide, and 42°C. "Highly stringent conditions" are, for example, 5x SSC, 5x Denhardt's solution, 0.5% SDS, 50% formamide, and 50°C. The degree of stringency can be set by those skilled in the art by appropriately selecting conditions such as temperature, salt concentration, probe concentration and length, ionic strength, and time. "Stringent conditions" are described, for example, in "Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd Ed." edited by Sambrook et al. [Cold Spring Harbor Laboratory] tory Press ( 1989) and the like can also be adopted.
前記（ｄ）において、「１もしくは数個」は、例えば、前記（ｄ）のポリヌクレオチドが、クロモグラニンＡに結合する範囲であればよい。前記「１もしくは数個」は、前記（ａ）の塩基配列において、例えば、１～１０個、好ましくは１～７個、より好ましくは１～５個、さらに好ましくは１～３個、特に好ましくは１または２個である。 In the above (d), "one or several" may be within a range in which the polynucleotide of the above (d) binds to chromogranin A, for example. The "one or several" refers to, for example, 1 to 10, preferably 1 to 7, more preferably 1 to 5, still more preferably 1 to 3, particularly preferably 1 to 3 in the base sequence (a). is 1 or 2.
本発明の核酸分子は、例えば、前記（ａ）～（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドの配列を１つ含んでもよいし、前記ポリヌクレオチドの配列を複数含んでもよい。後者の場合、複数のポリヌクレオチドの配列が連結して、一本鎖のポリヌクレオチドを形成していることが好ましい。前記複数のポリヌクレオチドの配列は、例えば、それぞれが直接的に連結してもよいし、リンカーを介して、それぞれが間接的に連結してもよい。前記ポリヌクレオチドの配列は、それぞれの末端において、直接的または間接的に連結していることが好ましい。前記複数のポリヌクレオチドの配列は、例えば、同じでもよいし、異なってもよいが、好ましくは同じである。前記ポリヌクレオチドの配列を複数含む場合、前記配列の数は、特に制限されず、例えば、２以上であり、好ましくは２～１２であり、より好ましくは２～６であり、さらに好ましくは２である。 The nucleic acid molecule of the present invention may contain, for example, one sequence of any of the polynucleotides (a) to (d) above, or a plurality of sequences of the above polynucleotides. In the latter case, it is preferable that multiple polynucleotide sequences are linked to form a single-stranded polynucleotide. The plurality of polynucleotide sequences may be linked directly to each other, or may be linked to each other indirectly via a linker, for example. Preferably, the polynucleotide sequences are linked directly or indirectly at each end. The sequences of the plurality of polynucleotides may be, for example, the same or different, but are preferably the same. When a plurality of the polynucleotide sequences are included, the number of the sequences is not particularly limited, and is, for example, 2 or more, preferably 2 to 12, more preferably 2 to 6, and even more preferably 2 or more. be.
前記リンカーは、例えば、ポリヌクレオチドがあげられ、その構成単位は、例えば、ヌクレオチド残基があげられる。前記ヌクレオチド残基は、例えば、リボヌクレオチド残基、デオキシリボヌクレオチド残基があげられる。前記リンカーの長さは、特に制限されず、例えば、１～２４塩基長であり、好ましくは１２～２４塩基長であり、より好ましくは１６～２４塩基長であり、さらに好ましくは２０～２４塩基長である。 Examples of the linker include polynucleotides, and examples of its constituent units include nucleotide residues. Examples of the nucleotide residues include ribonucleotide residues and deoxyribonucleotide residues. The length of the linker is not particularly limited, and is, for example, 1 to 24 bases, preferably 12 to 24 bases, more preferably 16 to 24 bases, and even more preferably 20 to 24 bases. It is long.
本発明の核酸分子において、前記ポリヌクレオチドは、一本鎖ポリヌクレオチドであることが好ましい。前記一本鎖ポリヌクレオチドは、例えば、自己アニーリングによりステム構造およびループ構造を形成可能であることが好ましい。前記ポリヌクレオチドは、例えば、ステムループ構造、インターナルループ構造および／またはバルジ構造等を形成可能であることが好ましい。 In the nucleic acid molecule of the present invention, the polynucleotide is preferably a single-stranded polynucleotide. The single-stranded polynucleotide is preferably capable of forming a stem structure and a loop structure, for example, by self-annealing. The polynucleotide is preferably capable of forming, for example, a stem-loop structure, an internal loop structure, and/or a bulge structure.
本発明の核酸分子は、例えば、二本鎖でもよい。二本鎖の場合、例えば、一方の一本鎖ポリヌクレオチドは、前記（ａ）～（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドであり、他方の一本鎖ポリヌクレオチドは、制限されない。前記他方の一本鎖ポリヌクレオチドは、例えば、前記（ａ）～（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドに相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドがあげられる。本発明の核酸分子が二本鎖の場合、例えば、使用に先立って、変性等により、一本鎖ポリヌクレオチドに解離させることが好ましい。また、解離した前記（ａ）～（ｄ）のいずれかの一本鎖ポリヌクレオチドは、例えば、前述のように、ステム構造およびループ構造を形成していることが好ましい。 Nucleic acid molecules of the invention may, for example, be double-stranded. In the case of double-stranded polynucleotides, for example, one single-stranded polynucleotide is any of the polynucleotides (a) to (d) above, and the other single-stranded polynucleotide is not limited. The other single-stranded polynucleotide is, for example, a polynucleotide consisting of a base sequence complementary to any of the polynucleotides (a) to (d). When the nucleic acid molecule of the present invention is double-stranded, it is preferably dissociated into single-stranded polynucleotides, for example, by denaturation or the like prior to use. Further, it is preferable that the dissociated single-stranded polynucleotide of any one of (a) to (d) above forms a stem structure and a loop structure, for example, as described above.
本発明において、「ステム構造およびループ構造を形成可能」とは、例えば、実際にステム構造およびループ構造を形成すること、ならびに、ステム構造およびループ構造が形成されていなくても、条件によってステム構造およびループ構造を形成可能なことも含む。「ステム構造およびループ構造を形成可能」とは、例えば、実験的に確認した場合、および、コンピュータ等のシミュレーションで予測した場合の双方を含む。 In the present invention, "capable of forming a stem structure and a loop structure" means, for example, actually forming a stem structure and a loop structure, and even if a stem structure and a loop structure are not formed, a stem structure may be formed depending on conditions. It also includes the ability to form a loop structure. "A stem structure and a loop structure can be formed" includes, for example, both experimentally confirmed and predicted by computer simulation.
本発明の核酸分子の構成単位は、例えば、ヌクレオチド残基である。前記核酸分子の長さは、特に制限されず、その下限は、例えば、１５塩基長であり、好ましくは７５塩基長または８０塩基長であり、その上限は、例えば、１０００塩基長であり、好ましくは２００塩基長、１００塩基長または９０塩基長である。 The structural unit of the nucleic acid molecule of the present invention is, for example, a nucleotide residue. The length of the nucleic acid molecule is not particularly limited, and the lower limit is, for example, 15 bases, preferably 75 or 80 bases, and the upper limit is, for example, 1000 bases, preferably is 200 bases long, 100 bases long or 90 bases long.
前記ヌクレオチド残基は、例えば、デオキシリボヌクレオチド残基およびリボヌクレオチド残基があげられる。本発明の核酸分子は、例えば、デオキシリボヌクレオチド残基のみから構成されるＤＮＡ、１もしくは数個のリボヌクレオチド残基を含むＤＮＡ等があげられる。後者の場合、「１もしくは数個」は、特に制限されず、例えば、前記ポリヌクレオチドにおいて、例えば、１～３個である。本発明において、塩基数および配列数等の個数の数値範囲は、例えば、その範囲に属する正の整数を全て開示するものである。つまり、例えば、「１～３塩基」との記載は、「１、２、３塩基」の全ての開示を意味する（以下、同様）。 Examples of the nucleotide residues include deoxyribonucleotide residues and ribonucleotide residues. Examples of the nucleic acid molecule of the present invention include DNA composed only of deoxyribonucleotide residues, DNA containing one or several ribonucleotide residues, and the like. In the latter case, "one or several" is not particularly limited, and is, for example, 1 to 3 in the polynucleotide. In the present invention, numerical ranges of numbers such as the number of bases and the number of sequences disclose, for example, all positive integers belonging to the ranges. That is, for example, the description "1 to 3 bases" means all disclosures of "1, 2, and 3 bases" (the same applies hereinafter).
前記ポリヌクレオチドは、例えば、少なくとも１個の修飾塩基を含む。前記修飾塩基は、特に制限されず、例えば、天然塩基（非人工塩基）が修飾された塩基があげられ、前記天然塩基と同様の機能を有することが好ましい。前記天然塩基は、特に制限されず、例えば、プリン骨格を有するプリン塩基、ピリミジン骨格を有するピリミジン塩基等があげられる。前記プリン塩基は、特に制限されず、例えば、アデニン（ａ）、グアニン（ｇ）があげられる。前記ピリミジン塩基は、特に制限されず、例えば、シトシン（ｃ）、チミン（ｔ）、ウラシル（ｕ）等があげられる。前記塩基の修飾部位は、特に制限されない。前記塩基がプリン塩基の場合、前記プリン塩基の修飾部位は、例えば、前記プリン骨格の７位および８位があげられる。前記塩基がピリミジン塩基の場合、前記ピリミジン塩基の修飾部位は、例えば、前記ピリミジン骨格の５位および６位があげられる。前記ピリミジン骨格において、４位の炭素に「＝Ｏ」が結合し、５位の炭素に「－ＣＨ３」または「－Ｈ」以外の基が結合している場合、修飾ウラシルまたは修飾チミンということができる。 The polynucleotide includes, for example, at least one modified base. The modified base is not particularly limited, and includes, for example, a base obtained by modifying a natural base (non-artificial base), and preferably has the same function as the natural base. The natural base is not particularly limited, and includes, for example, a purine base having a purine skeleton, a pyrimidine base having a pyrimidine skeleton, and the like. The purine base is not particularly limited, and examples thereof include adenine (a) and guanine (g). The pyrimidine base is not particularly limited, and examples thereof include cytosine (c), thymine (t), uracil (u), and the like. The modification site of the base is not particularly limited. When the base is a purine base, examples of modification sites of the purine base include positions 7 and 8 of the purine skeleton. When the base is a pyrimidine base, examples of modification sites of the pyrimidine base include the 5th and 6th positions of the pyrimidine skeleton. In the pyrimidine skeleton, when "=O" is bonded to the carbon at the 4th position and a group other than "-CH 3 " or "-H" is bonded to the carbon at the 5th position, it is called modified uracil or modified thymine. I can do it.
前記修飾塩基の修飾基は、特に制限されず、例えば、メチル基、フルオロ基、アミノ基、チオ基、下記式（１）のベンジルアミノカルボニル基（benzylaminocarbonyl）、下記式（２）のトリプタミノカルボニル基（tryptaminocarbonyl）およびイソブチルアミノカルボニル基（isobutylaminocarbonyl）等があげられる。
前記修飾塩基は、特に制限されず、例えば、アデニンが修飾された修飾アデニン、チミンが修飾された修飾チミン、グアニンが修飾された修飾グアニン、シトシンが修飾された修飾シトシンおよびウラシルが修飾された修飾ウラシル等があげられ、前記修飾チミン、前記修飾ウラシルおよび前記修飾シトシンが好ましい。 The modified bases are not particularly limited, and include, for example, modified adenine in which adenine is modified, modified thymine in which thymine is modified, modified guanine in which guanine is modified, modified cytosine in which cytosine is modified, and modification in which uracil is modified. Examples include uracil, and the modified thymine, the modified uracil, and the modified cytosine are preferred.
前記修飾アデニンの具体例としては、例えば、７’－デアザアデニン等があげられる。 Specific examples of the modified adenine include, for example, 7'-deazaadenine.
前記修飾グアニンの具体例としては、例えば、７’－デアザグアニン等があげられる。 Specific examples of the modified guanine include, for example, 7'-deazaguanine.
前記修飾シトシンの具体例としては、例えば、５’－メチルシトシン等があげられる。 Specific examples of the modified cytosine include, for example, 5'-methylcytosine.
前記修飾チミンの具体例としては、例えば、５’－ベンジルアミノカルボニルチミン、５’－トリプタミノカルボニルチミン、５’－イソブチルアミノカルボニルチミン等があげられる。 Specific examples of the modified thymine include 5'-benzylaminocarbonylthymine, 5'-tryptaminocarbonylthymine, 5'-isobutylaminocarbonylthymine, and the like.
前記修飾ウラシルの具体例としては、例えば、５’－ベンジルアミノカルボニルウラシル（ＢｎｄＵ）、５’－トリプタミノカルボニルウラシル（ＴｒｐｄＵ）および５’－イソブチルアミノカルボニルウラシル等があげられる。 Specific examples of the modified uracil include 5'-benzylaminocarbonyluracil (BndU), 5'-tryptaminocarbonyluracil (TrpdU), and 5'-isobutylaminocarbonyluracil.
前記ポリヌクレオチドは、特に制限されず、例えば、いずれか１種類の前記修飾塩基のみを含んでもよいし、２種類以上の前記修飾塩基を含んでもよい。 The polynucleotide is not particularly limited, and may include, for example, only one type of the modified base, or two or more types of the modified base.
前記修飾塩基の個数は、特に制限されない。前記ポリヌクレオチドにおいて、前記修飾塩基の個数は、例えば、１個以上である。前記修飾塩基は、前記ポリヌクレオチドにおいて、例えば、１～８０個、好ましくは１～７０個、より好ましくは１～５０個、さらに好ましくは１～４０個、特に好ましくは１～３０個、最も好ましくは１～２０個であり、また、全ての塩基が、前記修飾塩基でもよい。前記修飾塩基の個数は、例えば、いずれか１種類の前記修飾塩基の個数であってもよいし、２種類以上の前記修飾塩基の個数の合計であってもよい。また、前記ポリヌクレオチドを含む前記核酸分子の全長における前記修飾塩基も、特に制限されず、例えば、１～８０個、１～５０個、１～２０個であり、好ましくは、前述の範囲と同様である。 The number of modified bases is not particularly limited. In the polynucleotide, the number of modified bases is, for example, one or more. The number of modified bases in the polynucleotide is, for example, 1 to 80, preferably 1 to 70, more preferably 1 to 50, still more preferably 1 to 40, particularly preferably 1 to 30, and most preferably is 1 to 20, and all bases may be the modified bases described above. The number of modified bases may be, for example, the number of any one type of modified base, or the total number of two or more types of modified bases. Further, the number of modified bases in the entire length of the nucleic acid molecule containing the polynucleotide is not particularly limited, and is, for example, 1 to 80, 1 to 50, or 1 to 20, preferably in the same range as above. It is.
前記ポリヌクレオチドにおいて、前記修飾塩基の割合は、特に制限されない。前記修飾塩基の割合は、前記ポリヌクレオチドの全塩基数のうち、例えば、１／１００以上、好ましくは１／４０以上、より好ましくは１／２０以上、さらに好ましくは１／１０以上、特に好ましくは１／４以上、最も好ましくは１／３以上である。また、前記ポリヌクレオチドを含む前記核酸分子の全長における前記修飾塩基の割合も、特に制限されず、前述の範囲と同様である。ここで、前記全塩基数は、例えば、前記ポリヌクレオチドにおける天然塩基の個数と前記修飾塩基の個数の合計である。前記修飾塩基の割合を分数で示すが、これを満たす全塩基数と修飾塩基数とは、それぞれ正の整数である。 In the polynucleotide, the proportion of the modified bases is not particularly limited. The proportion of the modified bases is, for example, 1/100 or more, preferably 1/40 or more, more preferably 1/20 or more, still more preferably 1/10 or more, particularly preferably 1/10 or more of the total number of bases in the polynucleotide. It is 1/4 or more, most preferably 1/3 or more. Further, the proportion of the modified base in the total length of the nucleic acid molecule containing the polynucleotide is not particularly limited, and is the same as the above range. Here, the total number of bases is, for example, the sum of the number of natural bases and the number of modified bases in the polynucleotide. The proportion of modified bases is expressed as a fraction, and the total number of bases and the number of modified bases satisfying this fraction are each positive integers.
前記ポリヌクレオチドにおける前記修飾塩基が、前記修飾チミンの場合、前記修飾チミンの個数は、特に制限されない。前記ポリヌクレオチドにおいて、例えば、天然チミンは、前記修飾チミンに置換できる。前記ポリヌクレオチドにおいて、前記修飾チミンの個数は、例えば、１個以上である。前記修飾チミンは、前記ポリヌクレオチドにおいて、例えば、１～８０個、好ましくは１～７０個、より好ましくは１～５０個、さらに好ましくは１～４０個、特に好ましくは１～３０個、最も好ましくは１～２１個であり、また、全てのチミンが、前記修飾チミンでもよい。 When the modified base in the polynucleotide is the modified thymine, the number of modified thymines is not particularly limited. In the polynucleotide, for example, natural thymine can be replaced with the modified thymine. In the polynucleotide, the number of modified thymines is, for example, one or more. The modified thymine in the polynucleotide is, for example, 1 to 80, preferably 1 to 70, more preferably 1 to 50, still more preferably 1 to 40, particularly preferably 1 to 30, and most preferably is 1 to 21, and all thymines may be the modified thymines described above.
前記ポリヌクレオチドにおいて、前記修飾チミンの割合は、特に制限されない。前記修飾チミンの割合は、前記天然チミンの個数と前記修飾チミンの個数との合計のうち、例えば、１／１００以上、好ましくは１／４０以上、より好ましくは１／２０以上、さらに好ましくは１／１０以上、特に好ましくは１／４以上、最も好ましくは１／３以上である。 In the polynucleotide, the proportion of the modified thymine is not particularly limited. The proportion of the modified thymine is, for example, 1/100 or more, preferably 1/40 or more, more preferably 1/20 or more, and still more preferably 1/100 or more of the total number of natural thymine and the number of modified thymine. /10 or more, particularly preferably 1/4 or more, most preferably 1/3 or more.
前記ポリヌクレオチドにおける前記修飾塩基が、前記修飾ウラシルの場合、前記修飾ウラシルの個数は、特に制限されない。前記ポリヌクレオチドにおいて、例えば、天然チミンは、前記修飾ウラシルに置換できる。前記ポリヌクレオチドにおいて、前記修飾ウラシルの個数は、例えば、１個以上である。前記修飾ウラシルは、前記ポリヌクレオチドにおいて、例えば、１～８０個、好ましくは１～７０個、より好ましくは１～５０個、さらに好ましくは１～４０個、特に好ましくは１～３０個、最も好ましくは１～２１個であり、また、全てのウラシルが、前記修飾ウラシルでもよい。 When the modified base in the polynucleotide is the modified uracil, the number of modified uracils is not particularly limited. In the polynucleotide, for example, natural thymine can be replaced with the modified uracil. In the polynucleotide, the number of modified uracils is, for example, one or more. The modified uracil in the polynucleotide is, for example, 1 to 80, preferably 1 to 70, more preferably 1 to 50, still more preferably 1 to 40, particularly preferably 1 to 30, and most preferably is 1 to 21, and all uracils may be the modified uracils described above.
前記ポリヌクレオチドにおいて、前記修飾ウラシルの割合は、特に制限されない。前記修飾ウラシルの割合は、前記天然チミンの個数と前記修飾ウラシルの個数との合計のうち、例えば、１／１００以上、好ましくは１／４０以上、より好ましくは１／２０以上、さらに好ましくは１／１０以上、特に好ましくは１／４以上、最も好ましくは１／３以上である。 In the polynucleotide, the proportion of the modified uracil is not particularly limited. The proportion of the modified uracil is, for example, 1/100 or more, preferably 1/40 or more, more preferably 1/20 or more, and still more preferably 1/100 or more, preferably 1/40 or more, more preferably 1/20 or more, of the total number of natural thymine and modified uracil. /10 or more, particularly preferably 1/4 or more, most preferably 1/3 or more.
前記修飾チミンと前記修飾ウラシルの個数の例示は、例えば、両者をあわせた個数であってもよい。 An example of the number of the modified thymine and the modified uracil may be, for example, the total number of the modified thymine and the modified uracil.
前記ポリヌクレオチドにおける前記修飾塩基が、前記修飾シトシンの場合、前記修飾シトシンの個数は、特に制限されない。前記ポリヌクレオチドにおいて、例えば、天然シトシンは、前記修飾シトシンに置換できる。前記ポリヌクレオチドにおいて、前記修飾シトシンの個数は、例えば、１個以上である。前記修飾シトシンは、前記ポリヌクレオチドにおいて、例えば、１～８０個、好ましくは１～７０個、より好ましくは１～５０個、さらに好ましくは１～４０個、特に好ましくは１～３０個、最も好ましくは１～２１個であり、であり、また、全てのシトシンが、前記修飾シトシンでもよい。 When the modified base in the polynucleotide is the modified cytosine, the number of modified cytosines is not particularly limited. In the polynucleotide, for example, natural cytosine can be replaced with the modified cytosine. In the polynucleotide, the number of modified cytosines is, for example, one or more. The modified cytosine in the polynucleotide is, for example, 1 to 80, preferably 1 to 70, more preferably 1 to 50, still more preferably 1 to 40, particularly preferably 1 to 30, and most preferably is 1 to 21, and all the cytosines may be the modified cytosines.
前記ポリヌクレオチドにおいて、前記修飾シトシンの割合は、特に制限されない。前記修飾シトシンの割合は、前記天然シトシンの個数と前記修飾シトシンの個数との合計のうち、例えば、１／１００以上、好ましくは１／４０以上、より好ましくは１／２０以上、さらに好ましくは１／１０以上、特に好ましくは１／４以上、最も好ましくは１／３以上である。 In the polynucleotide, the proportion of the modified cytosine is not particularly limited. The proportion of the modified cytosine is, for example, 1/100 or more, preferably 1/40 or more, more preferably 1/20 or more, and still more preferably 1/100 or more, preferably 1/40 or more, more preferably 1/20 or more, of the total number of natural cytosine and modified cytosine. /10 or more, particularly preferably 1/4 or more, most preferably 1/3 or more.
前記修飾塩基が、前記修飾アデニンまたは前記修飾グアニンの場合、前記修飾シトシンの個数および割合の説明において、「シトシン」および「修飾シトシン」を、それぞれ「アデニン」および「修飾アデニン」または「グアニン」および「修飾グアニン」に読み替えて援用できる。前記ポリヌクレオチドにおいて、例えば、天然アデニンは、前記修飾アデニンに置換でき、例えば、天然グアニンは、前記修飾グアニンに置換できる。 When the modified base is the modified adenine or the modified guanine, in the description of the number and proportion of modified cytosines, "cytosine" and "modified cytosine" are replaced with "adenine" and "modified adenine" or "guanine" and "modified cytosine", respectively. It can be used by replacing it with "modified guanine". In the polynucleotide, for example, natural adenine can be replaced with the modified adenine, and, for example, natural guanine can be replaced with the modified guanine.
本発明の核酸分子は、修飾ヌクレオチドを含んでもよい。前記修飾ヌクレオチドは、前述の前記修飾塩基を有するヌクレオチドでもよいし、糖残基が修飾された修飾糖を有するヌクレオチドでもよいし、前記修飾塩基および前記修飾糖を有するヌクレオチドでもよい。 Nucleic acid molecules of the invention may include modified nucleotides. The modified nucleotide may be a nucleotide having the modified base described above, a nucleotide having a modified sugar whose sugar residue is modified, or a nucleotide having the modified base and the modified sugar.
前記糖残基は、特に制限されず、例えば、デオキシリボース残基またはリボース残基があげられる。前記糖残基における修飾部位は、特に制限されず、例えば、前記糖残基の２’位または４’位があげられ、いずれか一方でも両方が修飾されてもよい。前記修飾糖の修飾基は、例えば、メチル基、フルオロ基、アミノ基、チオ基等があげられる。 The sugar residue is not particularly limited, and examples thereof include deoxyribose residues and ribose residues. The modification site in the sugar residue is not particularly limited, and examples include the 2'-position or the 4'-position of the sugar residue, and either or both may be modified. Examples of the modifying group of the modified sugar include a methyl group, a fluoro group, an amino group, a thio group, and the like.
前記修飾ヌクレオチド残基において、塩基がピリミジン塩基の場合、例えば、前記糖残基の２’位および／または４’位が修飾されていることが好ましい。前記修飾ヌクレオチド残基の具体例は、例えば、デオキシリボース残基またはリボース残基の２’位が修飾された、２’－メチル化－ウラシルヌクレオチド残基、２’－メチル化－シトシンヌクレオチド残基、２’－フルオロ化－ウラシルヌクレオチド残基、２’－フルオロ化－シトシンヌクレオチド残基、２’－アミノ化－ウラシルヌクレオチド残基、２’－アミノ化－シトシンヌクレオチド残基、２’－チオ化－ウラシルヌクレオチド残基、２’－チオ化－シトシンヌクレオチド残基等があげられる。 When the base in the modified nucleotide residue is a pyrimidine base, for example, it is preferable that the 2'-position and/or 4'-position of the sugar residue is modified. Specific examples of the modified nucleotide residues include, for example, 2'-methylated-uracil nucleotide residues, 2'-methylated-cytosine nucleotide residues in which the 2'-position of a deoxyribose residue or a ribose residue is modified. , 2'-fluorinated-uracil nucleotide residue, 2'-fluorinated-cytosine nucleotide residue, 2'-aminated-uracil nucleotide residue, 2'-aminated-cytosine nucleotide residue, 2'-thiolated -uracil nucleotide residue, 2'-thiolated-cytosine nucleotide residue, etc.
前記修飾ヌクレオチドの個数は、特に制限されず、例えば、前記ポリヌクレオチドにおいて、例えば、１～８０個、好ましくは１～７０個、より好ましくは１～５０個、さらに好ましくは１～４０個、特に好ましくは１～３０個、最も好ましくは１～２１個である。また、前記ポリヌクレオチドを含む前記核酸分子の全長における前記修飾ヌクレオチドも、特に制限されず、例えば、１～８０個、１～５０個、１～２０個であり、好ましくは、前述の範囲と同様である。 The number of modified nucleotides is not particularly limited, and for example, in the polynucleotide, for example, 1 to 80, preferably 1 to 70, more preferably 1 to 50, still more preferably 1 to 40, especially The number is preferably 1 to 30, most preferably 1 to 21. Furthermore, the number of modified nucleotides in the entire length of the nucleic acid molecule containing the polynucleotide is not particularly limited, and is, for example, 1 to 80, 1 to 50, or 1 to 20, preferably in the same range as above. It is.
本発明の核酸分子は、例えば、１もしくは数個の人工核酸モノマー残基を含んでもよい。前記「１もしくは数個」は、特に制限されず、例えば、前記ポリヌクレオチドにおいて、例えば、１～８０個、好ましくは１～７０個、より好ましくは１～５０個、さらに好ましくは１～４０個、特に好ましくは１～３０個、最も好ましくは１～２１個である。前記人工核酸モノマー残基は、例えば、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）、ＥＮＡ（２’－Ｏ，４’－Ｃ－Ｅｔｈｙｌｅｎｅｂｒｉｄｇｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ）等があげられる。前記モノマー残基における核酸は、例えば、前述と同様である。また、前記ポリヌクレオチドを含む前記核酸分子の全長における前記人工核酸モノマー残基も、特に制限されず、例えば、１～８０個、１～５０個、１～２０個であり、好ましくは、前述の範囲と同様である。 Nucleic acid molecules of the invention may, for example, contain one or several artificial nucleic acid monomer residues. The above "one or several" is not particularly limited, and for example, in the polynucleotide, for example, 1 to 80, preferably 1 to 70, more preferably 1 to 50, still more preferably 1 to 40. , particularly preferably from 1 to 30 pieces, most preferably from 1 to 21 pieces. Examples of the artificial nucleic acid monomer residues include PNA (peptide nucleic acid), LNA (Locked Nucleic Acid), and ENA (2'-O,4'-C-Ethylene bridged Nucleic Acids). The nucleic acid in the monomer residue is, for example, the same as described above. Furthermore, the number of artificial nucleic acid monomer residues in the entire length of the nucleic acid molecule containing the polynucleotide is not particularly limited, and is, for example, 1 to 80, 1 to 50, or 1 to 20, preferably the aforementioned Same as range.
本発明の核酸分子は、例えば、ヌクレアーゼ耐性であることが好ましい。本発明の核酸分子は、ヌクレアーゼ耐性のため、例えば、前記修飾ヌクレオチド残基および／または前記人工核酸モノマー残基を有することが好ましい。本発明の核酸分子は、ヌクレアーゼ耐性のため、例えば、５’末端または３’末端に、数１０ｋＤａのＰＥＧ（ポリエチレングリコール）またはデオキシチミジン等が結合してもよい。 Nucleic acid molecules of the invention, for example, are preferably nuclease resistant. The nucleic acid molecule of the present invention preferably has, for example, the modified nucleotide residue and/or the artificial nucleic acid monomer residue for nuclease resistance. The nucleic acid molecule of the present invention may have several tens of kDa of PEG (polyethylene glycol) or deoxythymidine attached to the 5' end or 3' end, for example, for nuclease resistance.
本発明の核酸分子は、例えば、さらに付加配列を有してもよい。前記付加配列は、例えば、前記核酸分子の５’末端および３’末端の少なくとも一方に結合していることが好ましく、より好ましくは３’末端である。前記付加配列は、特に制限されない。前記付加配列の長さは、特に制限されず、例えば、１～２００塩基長であり、好ましくは１～５０塩基長であり、より好ましくは１～２５塩基長、さらに好ましくは１８～２４塩基長である。前記付加配列の構成単位は、例えば、ヌクレオチド残基であり、デオキシリボヌクレオチド残基およびリボヌクレオチド残基等があげられる。前記付加配列は、特に制限されず、例えば、デオキシリボヌクレオチド残基からなるＤＮＡ、リボヌクレオチド残基を含むＤＮＡ等のポリヌクレオチドがあげられる。前記付加配列の具体例として、例えば、ポリｄＴ、ポリｄＡ等があげられる。 The nucleic acid molecule of the invention may, for example, further have additional sequences. The additional sequence is preferably bound to at least one of the 5' end and 3' end of the nucleic acid molecule, more preferably the 3' end. The additional sequence is not particularly limited. The length of the additional sequence is not particularly limited, and is, for example, 1 to 200 bases long, preferably 1 to 50 bases long, more preferably 1 to 25 bases long, and even more preferably 18 to 24 bases long. It is. The structural unit of the additional sequence is, for example, a nucleotide residue, such as a deoxyribonucleotide residue and a ribonucleotide residue. The additional sequence is not particularly limited, and includes, for example, polynucleotides such as DNA consisting of deoxyribonucleotide residues and DNA containing ribonucleotide residues. Specific examples of the additional sequences include poly-dT, poly-dA, and the like.
本発明の核酸分子は、例えば、担体に固定化して使用できる。前記本発明の核酸分子は、例えば、５’末端および３’末端のいずれかを固定化することができる。本発明の核酸分子を固定化する場合、例えば、前記核酸分子は、前記担体に、直接的に固定化してもよいし、間接的に固定化してもよい。後者の場合、本発明の核酸分子は、例えば、前記付加配列を介して、前記担体に固定化する。前記担体は、例えば、ビーズ、プレート、フィルター、カラム、基板、容器等があげられる。 The nucleic acid molecule of the present invention can be used, for example, by being immobilized on a carrier. The nucleic acid molecule of the present invention can be immobilized, for example, at either the 5' end or the 3' end. When immobilizing the nucleic acid molecule of the present invention, for example, the nucleic acid molecule may be immobilized directly or indirectly on the carrier. In the latter case, the nucleic acid molecule of the invention is immobilized on the carrier, for example, via the additional sequence. Examples of the carrier include beads, plates, filters, columns, substrates, containers, and the like.
本発明の核酸分子は、例えば、さらに標識物質を有してもよく、具体的には、前記核酸分子に前記標識物質が結合してもよい。前記標識物質が結合した前記核酸分子は、例えば、本発明の核酸センサということもできる。前記標識物質は、例えば、前記核酸分子の５’末端および３’末端の少なくとも一方に結合させてもよい。前記標識物質による標識化は、例えば、結合でもよいし、化学修飾でもよい。前記標識物質は、特に制限されず、例えば、酵素、蛍光物質、色素、同位体、薬物、毒素および抗生物質等があげられる。前記酵素は、例えば、ルシフェラーゼ、ＳＡ－Ｌｕｃｉａルシフェラーゼ等があげられる。前記蛍光物質は、例えば、ピレン、ＴＡＭＲＡ、フルオレセイン、Ｃｙ３色素、Ｃｙ５色素、ＦＡＭ色素、ローダミン色素、テキサスレッド色素、ＪＯＥ、ＭＡＸ、ＨＥＸ、ＴＹＥ等の蛍光団があげられ、前記色素は、例えば、Ａｌｅｘａ４８８、Ａｌｅｘａ６４７等のＡｌｅｘａ色素等があげられる。前記標識物質は、例えば、前記核酸分子に直接的に連結してもよいし、リンカーを介して、間接的に連結してもよい。前記リンカーは、特に制限されず、例えば、ポリヌクレオチドのリンカー等である。 The nucleic acid molecule of the present invention may further include a labeling substance, for example, and specifically, the labeling substance may bind to the nucleic acid molecule. The nucleic acid molecule bound to the labeling substance can also be referred to as, for example, the nucleic acid sensor of the present invention. The labeling substance may be bound to at least one of the 5' end and 3' end of the nucleic acid molecule, for example. Labeling with the labeling substance may be, for example, binding or chemical modification. The labeling substance is not particularly limited, and examples thereof include enzymes, fluorescent substances, dyes, isotopes, drugs, toxins, and antibiotics. Examples of the enzyme include luciferase, SA-Lucia luciferase, and the like. Examples of the fluorescent substance include fluorophores such as pyrene, TAMRA, fluorescein, Cy3 dye, Cy5 dye, FAM dye, rhodamine dye, Texas red dye, JOE, MAX, HEX, and TYE; Examples include Alexa dyes such as Alexa488 and Alexa647. For example, the labeling substance may be directly linked to the nucleic acid molecule, or may be linked indirectly to the nucleic acid molecule via a linker. The linker is not particularly limited, and may be, for example, a polynucleotide linker.
本発明の核酸分子の製造方法は、特に制限されず、例えば、化学合成を利用した核酸合成方法、遺伝子工学的手法等の公知の方法等により合成できる。 The method for producing the nucleic acid molecule of the present invention is not particularly limited, and the nucleic acid molecule can be synthesized by, for example, a known method such as a nucleic acid synthesis method using chemical synthesis or a genetic engineering method.
本発明の核酸分子は、前述のように、クロモグラニンＡに結合性を示す。このため、本発明の核酸分子の用途は、クロモグラニンＡへの結合性を利用する用途であれば、特に制限されない。本発明の核酸分子は、例えば、クロモグラニンＡに対する抗体に代えて、種々の方法に使用できる。 The nucleic acid molecule of the present invention exhibits binding property to chromogranin A, as described above. Therefore, the use of the nucleic acid molecule of the present invention is not particularly limited as long as it utilizes its ability to bind to chromogranin A. The nucleic acid molecules of the present invention can be used in various methods in place of, for example, antibodies against chromogranin A.
本発明の核酸分子によれば、クロモグラニンＡを検出できる。クロモグラニンＡの検出方法は、特に制限されず、クロモグラニンＡと前記核酸分子との結合を検出することによって行える。 According to the nucleic acid molecule of the present invention, chromogranin A can be detected. The method for detecting chromogranin A is not particularly limited, and can be carried out by detecting the binding between chromogranin A and the nucleic acid molecule.
（２）検出試薬およびキット
本発明の検出試薬は、前述のように、クロモグラニンＡの検出試薬であって、前記本発明の核酸分子を含むことを特徴とする。本発明の検出試薬は、前記本発明の核酸分子を含んでいればよく、その他の構成は何ら制限されない。本発明の検出試薬を使用すれば、前述のように、例えば、クロモグラニンＡの検出等を行うことができる。本発明の検出試薬は、例えば、クロモグラニンＡへの結合剤ともいえる。
(2) Detection Reagent and Kit As described above, the detection reagent of the present invention is a detection reagent for chromogranin A, and is characterized by containing the nucleic acid molecule of the present invention. The detection reagent of the present invention only needs to contain the nucleic acid molecule of the present invention, and other configurations are not limited at all. By using the detection reagent of the present invention, it is possible to detect, for example, chromogranin A, as described above. The detection reagent of the present invention can also be said to be a binding agent for chromogranin A, for example.
本発明の検出試薬は、例えば、さらに、標識物質を有し、前記標識物質が、前記核酸分子に結合されてもよい。前記標識物質は、例えば、前記本発明の核酸分子における説明を援用できる。また、本発明の検出試薬は、例えば、担体を有し、前記担体に前記核酸分子が固定化されてもよい。前記担体は、例えば、前記本発明の核酸分子における説明を援用できる。 The detection reagent of the present invention may further include, for example, a labeling substance, and the labeling substance may be bound to the nucleic acid molecule. For the labeling substance, for example, the explanation regarding the nucleic acid molecule of the present invention can be referred to. Furthermore, the detection reagent of the present invention may include, for example, a carrier, and the nucleic acid molecule may be immobilized on the carrier. For the carrier, for example, the explanation regarding the nucleic acid molecule of the present invention can be referred to.
本発明の検出キットは、前記本発明の核酸分子または前記本発明の検出試薬を含む。本発明の検出キットは、例えば、さらに、その他の構成要素を含んでもよい。前記構成要素は、例えば、前記試料を調製するための緩衝液、使用説明書等があげられる。また、後述する本発明の検出方法に示す、前記核酸分子に標識物質であるルシフェラーゼを結合させた核酸センサと、標識化担体とを用いる方法の場合、本発明の検出キットは、例えば、前記核酸センサと、クロモグラニンＡ標識化担体とを含むキットとすることができる。 The detection kit of the present invention includes the nucleic acid molecule of the present invention or the detection reagent of the present invention. The detection kit of the present invention may further include other components, for example. Examples of the components include a buffer for preparing the sample, instructions for use, and the like. In addition, in the case of a method using a labeled carrier and a nucleic acid sensor in which a labeling substance, luciferase, is bound to the nucleic acid molecule, as shown in the detection method of the present invention described later, the detection kit of the present invention, for example, It can be a kit containing a sensor and a chromogranin A-labeled carrier.
本発明の検出試薬および検出キットは、例えば、前記本発明の核酸分子の説明を援用でき、また、その使用方法についても、前記本発明の核酸分子および後述する前記本発明の検出方法を援用できる。 For the detection reagent and detection kit of the present invention, for example, the description of the nucleic acid molecule of the present invention described above can be referred to, and for the method of use thereof, the aforementioned nucleic acid molecule of the present invention and the detection method of the present invention described below can be cited. .
（３）検出方法
本発明のクロモグラニンＡの検出方法は、前述のように、前記本発明の核酸分子、または前記本発明の検出試薬と、試料とを接触させ、前記試料中のクロモグラニンＡと、前記核酸分子または前記検出試薬との複合体を形成させる工程、および、前記複合体を検出する工程を含むことを特徴とする。本発明の検出方法は、前記本発明の核酸分子または前記検出試薬を使用することが特徴であって、その他の工程および条件等は、特に制限されない。以下、本発明の核酸分子の使用を例にあげて説明するが、本発明の核酸分子は、本発明の検出試薬と読み替え可能である。
(3) Detection method As described above, the method for detecting chromogranin A of the present invention includes contacting the nucleic acid molecule of the present invention or the detection reagent of the present invention with a sample, and detecting chromogranin A in the sample. The method is characterized by comprising a step of forming a complex with the nucleic acid molecule or the detection reagent, and a step of detecting the complex. The detection method of the present invention is characterized by using the nucleic acid molecule of the present invention or the detection reagent, and other steps and conditions are not particularly limited. The use of the nucleic acid molecule of the present invention will be described below as an example, but the nucleic acid molecule of the present invention can be read as the detection reagent of the present invention.
本発明によれば、前記本発明の核酸分子が、クロモグラニンＡに特異的に結合することから、例えば、クロモグラニンＡと、前記核酸分子または前記検出試薬との結合を検出することによって、試料中のクロモグラニンＡを特異的に検出可能である。具体的には、例えば、試料中のクロモグラニンＡの量を分析可能であることから、定性分析または定量分析も可能といえる。 According to the present invention, since the nucleic acid molecule of the present invention specifically binds to chromogranin A, for example, by detecting the binding between chromogranin A and the nucleic acid molecule or the detection reagent, Chromogranin A can be specifically detected. Specifically, for example, since the amount of chromogranin A in a sample can be analyzed, it can be said that qualitative analysis or quantitative analysis is also possible.
本発明において、前記試料は、特に制限されない。前記試料は、例えば、だ液、血しょう、血清、尿等があげられる。 In the present invention, the sample is not particularly limited. Examples of the sample include saliva, plasma, serum, urine, and the like.
前記試料は、例えば、液体試料でもよいし、固体試料でもよい。前記試料は、例えば、前記核酸分子と接触させ易く、取扱いが簡便であることから、液体試料が好ましい。前記固体試料の場合、例えば、溶媒を用いて、混合液、抽出液、溶解液等を調製し、これを使用してもよい。前記溶媒は、特に制限されず、例えば、水、生理食塩水、緩衝液等があげられる。 The sample may be a liquid sample or a solid sample, for example. For example, the sample is preferably a liquid sample because it can be easily brought into contact with the nucleic acid molecule and is easy to handle. In the case of the solid sample, for example, a mixed solution, an extract solution, a solution solution, etc. may be prepared using a solvent and used. The solvent is not particularly limited, and examples include water, physiological saline, and buffer solutions.
本発明の検出方法について、本発明の核酸分子として、標識物質で標識化された本発明の核酸センサを使用し、クロモグラニンＡを検出する方法を例にあげて説明する。なお、本発明は、これらの例示には制限されない。 The detection method of the present invention will be explained by taking as an example a method of detecting chromogranin A using the nucleic acid sensor of the present invention labeled with a labeling substance as the nucleic acid molecule of the present invention. Note that the present invention is not limited to these examples.
前記検出工程は、例えば、さらに、前記複合体の検出結果に基づいて、前記試料中のクロモグラニンＡの有無または量を分析する工程を含む。 The detection step further includes, for example, a step of analyzing the presence or absence or amount of chromogranin A in the sample based on the detection result of the complex.
前記複合体形成工程において、前記試料と前記核酸分子との接触方法は、特に制限されない。前記試料と前記核酸分子との接触は、例えば、液体中で行われることが好ましい。前記液体は、特に制限されず、例えば、水、生理食塩水、緩衝液等があげられる。 In the complex forming step, the method of contacting the sample and the nucleic acid molecule is not particularly limited. The contact between the sample and the nucleic acid molecule is preferably performed in a liquid, for example. The liquid is not particularly limited, and examples thereof include water, physiological saline, and a buffer solution.
前記複合体形成工程において、前記試料と前記核酸分子との接触条件は、特に制限されない。接触温度は、例えば、４～３７℃であり、好ましくは１８～２５℃であり、接触時間は、例えば、１０～１２０分であり、好ましくは３０～６０分である。 In the complex forming step, the contact conditions between the sample and the nucleic acid molecule are not particularly limited. The contact temperature is, for example, 4 to 37°C, preferably 18 to 25°C, and the contact time is, for example, 10 to 120 minutes, preferably 30 to 60 minutes.
前記複合体形成工程において、前記核酸分子は、例えば、担体に固定化された固定化核酸分子（固相担体）でもよいし、未固定の遊離した核酸分子でもよい。後者の場合、例えば、容器内で、前記試料と接触させる。前者の場合、前記担体は、特に制限されず、例えば、プレート、フィルター、カラム、基板、ビーズ、容器等があげられ、前記容器は、例えば、マイクロプレート、チューブ等があげられる。前記核酸分子の固定化は、例えば、前述の通りである。 In the complex formation step, the nucleic acid molecule may be, for example, an immobilized nucleic acid molecule immobilized on a carrier (solid phase carrier) or an unimmobilized free nucleic acid molecule. In the latter case, contact is made with the sample, for example in a container. In the former case, the carrier is not particularly limited, and examples thereof include plates, filters, columns, substrates, beads, containers, etc., and examples of the containers include microplates, tubes, and the like. The immobilization of the nucleic acid molecule is, for example, as described above.
前記検出工程は、前述のように、前記試料中のクロモグラニンＡと前記核酸分子との結合を検出する工程である。前記両者の結合の有無を検出することによって、例えば、前記試料中のクロモグラニンＡの有無を分析（定性）でき、また、前記両者の結合の程度（結合量）を検出することによって、例えば、前記試料中のクロモグラニンＡの量を分析（定量）できる。 As described above, the detection step is a step of detecting the binding between chromogranin A in the sample and the nucleic acid molecule. By detecting the presence or absence of binding between the two, for example, the presence or absence of chromogranin A in the sample can be analyzed (qualitatively), and by detecting the degree of binding (amount of binding) between the two, for example, the presence or absence of chromogranin A in the sample can be analyzed (qualitatively). The amount of chromogranin A in a sample can be analyzed (quantified).
クロモグラニンＡと前記核酸分子との結合の検出方法は、特に制限されない。前記方法は、例えば、物質間の結合を検出する従来公知の方法が採用でき、具体例として、前述のＳＰＲ等があげられる。 The method for detecting the binding between chromogranin A and the nucleic acid molecule is not particularly limited. As the method, for example, a conventionally known method for detecting a bond between substances can be employed, and a specific example thereof includes the above-mentioned SPR.
そして、クロモグラニンＡと前記核酸分子との結合が検出できなかった場合は、前記試料中にクロモグラニンＡは存在しないと判断でき、前記結合が検出された場合は、前記試料中にクロモグラニンＡが存在すると判断できる。また、予め、クロモグラニンＡの濃度と結合量との相関関係を求めておき、前記相関関係に基づいて、前記結合量から、前記試料中のクロモグラニンＡの濃度を分析することもできる。 If the binding between chromogranin A and the nucleic acid molecule cannot be detected, it can be determined that chromogranin A does not exist in the sample, and if the binding is detected, it can be determined that chromogranin A is present in the sample. I can judge. It is also possible to determine the correlation between the concentration of chromogranin A and the amount of binding in advance, and then analyze the concentration of chromogranin A in the sample from the amount of binding based on the correlation.
クロモグラニンＡと前記核酸分子との結合の検出について、一例として、前記核酸分子に標識物質であるルシフェラーゼを結合させた核酸センサと、クロモグラニンＡ標識化担体とを用いる方法を、以下に示す。 As an example of detecting the binding between chromogranin A and the nucleic acid molecule, a method using a nucleic acid sensor in which a labeling substance, luciferase, is bound to the nucleic acid molecule and a chromogranin A-labeled carrier is shown below.
まず、前記核酸センサと前記試料とを混合する。これにより、前記試料中にクロモグラニンＡが存在する場合、前記核酸センサにおける前記核酸分子は、ターゲットであるクロモグラニンＡと結合する。他方、前記試料中にクロモグラニンＡが存在しない場合、前記核酸センサにおける核酸分子は、ターゲットと未結合の状態となる。 First, the nucleic acid sensor and the sample are mixed. Thereby, if chromogranin A is present in the sample, the nucleic acid molecule in the nucleic acid sensor binds to chromogranin A, which is the target. On the other hand, if chromogranin A is not present in the sample, the nucleic acid molecules in the nucleic acid sensor are in a state where they are not bound to the target.
つぎに、前記混合物を、前記クロモグラニンＡ標識化担体に接触させた後、前記クロモグラニンＡ標識化担体を除去する。前記担体は、例えば、ビーズがあげられる。前記混合物において、前記核酸センサがクロモグラニンＡと結合している場合、前記核酸センサにおける前記核酸分子は、前記クロモグラニンＡ標識化担体におけるクロモグラニンＡとは結合できない。このため、前記クロモグラニンＡ標識化担体を除去した画分に対して、ルシフェラーゼの基質を添加して発光反応を行った場合、前記核酸センサにおけるルシフェラーゼの触媒反応によって、発光が生じる。他方、前記混合物において、前記核酸センサがクロモグラニンＡと結合していない場合、前記核酸センサにおける前記核酸分子は、前記クロモグラニンＡ標識化担体におけるクロモグラニンＡと結合する。このため、前記クロモグラニンＡ標識化担体の除去により、前記核酸センサも、前記クロモグラニンＡ標識化担体に結合した状態で除去されることになる。このため、前記クロモグラニンＡ標識化担体を除去した画分に対して、ルシフェラーゼの基質を添加して発光反応を行った場合、前記核酸センサが存在していないことから、ルシフェラーゼの触媒反応による発光は生じない。このため、発光の有無によって、試料中のクロモグラニンＡの有無を分析（定性分析）することができる。また、試料中のクロモグラニンＡの量と、前記クロモグラニンＡ標識化担体を除去した後の前記画分に残存する前記核酸センサの量とは、相関関係を有するため、発光の強弱によって、試料中のクロモグラニンＡの量も分析（定量分析）することができる。 Next, the mixture is brought into contact with the chromogranin A-labeled carrier, and then the chromogranin A-labeled carrier is removed. Examples of the carrier include beads. In the mixture, when the nucleic acid sensor is bound to chromogranin A, the nucleic acid molecules in the nucleic acid sensor cannot bind to chromogranin A in the chromogranin A-labeled carrier. Therefore, when a luciferase substrate is added to the fraction from which the chromogranin A-labeled carrier has been removed and a luminescence reaction is performed, luminescence is generated by the catalytic reaction of luciferase in the nucleic acid sensor. On the other hand, when the nucleic acid sensor does not bind to chromogranin A in the mixture, the nucleic acid molecule in the nucleic acid sensor binds to chromogranin A in the chromogranin A-labeled carrier. Therefore, when the chromogranin A-labeled carrier is removed, the nucleic acid sensor is also removed in a state bound to the chromogranin A-labeled carrier. Therefore, when a luciferase substrate is added to the fraction from which the chromogranin A-labeled carrier has been removed and a luminescence reaction is performed, the luminescence due to the luciferase catalytic reaction will not occur because the nucleic acid sensor is not present. Does not occur. Therefore, the presence or absence of chromogranin A in the sample can be analyzed (qualitative analysis) based on the presence or absence of luminescence. Furthermore, since there is a correlation between the amount of chromogranin A in the sample and the amount of the nucleic acid sensor remaining in the fraction after removing the chromogranin A-labeled carrier, the amount of chromogranin A in the sample is The amount of chromogranin A can also be analyzed (quantitative analysis).
本発明によれば、前述のように、クロモグラニンＡを検出できる。また、本発明によれば、クロモグラニンＡの検出により、例えば、間接的に、ストレス応答を計測することも可能である。 According to the present invention, chromogranin A can be detected as described above. Further, according to the present invention, by detecting chromogranin A, it is also possible to measure stress response indirectly, for example.
つぎに、本発明の実施例について説明する。ただし、本発明は、下記実施例により制限されない。市販の試薬は、特に示さない限り、それらのプロトコルに基づいて使用した。 Next, examples of the present invention will be described. However, the present invention is not limited to the following examples. Commercially available reagents were used according to their protocols unless otherwise indicated.
［実施例１］
本発明のアプタマーについて、クロモグラニンＡに対する結合性を、ＳＰＲ解析により確認した。
[Example 1]
The binding property of the aptamer of the present invention to chromogranin A was confirmed by SPR analysis.
（１）アプタマー
下記ポリヌクレオチドのアプタマー１～８を、実施例１のアプタマーとして合成した。
(1) Aptamers Aptamers 1 to 8 of the following polynucleotides were synthesized as aptamers of Example 1.
アプタマー１：CgA_s1（配列番号１）
GGTTATCCGAGGAGCCGCAATATCTTACACCCTGCCTTCCCCCCTGTCCGCATCGAAACTACCCTGCCCGTGTATTG
アプタマー２：CgA_s2（配列番号２）
GGTTATCCGAGGAGCCGCAATATCAACACTGCCCACCCTTCTACCCATGGCCGCGAAACTACCCTGCCCGTGTATTG
アプタマー３：CgA_s3（配列番号３）
GGTTATCCGAGGAGCCGCAATATCTACCCTGTCCCCTCCTGCTTTCCAGCCTGTGAAACTACCCTGCCCGTGTATTG
アプタマー４：CgA_s4（配列番号４）
GGTTATCCGAGGAGCCGCAATATCACTACCCGCCTTCTTCTACCCTGTCCTCTTGAAACTACCCTGCCCGTGTATTG
アプタマー５：CgA_s5（配列番号５）
GGTTATCCGAGGAGCCGCAATATCTCTCCCCCTCCTTTCCTTCTCCTTGCCCGTGAAACTACCCTGCCCGTGTATTG
アプタマー６：CgA_s6（配列番号６）
GGTTATCCGAGGAGCCGCAATATCAAACTACCCGTCCTCTCCCGTCCCGCCGCCGAAACTACCCTGCCCGTGTATTG
アプタマー７：CgA_s9（配列番号７）
GGTTATCCGAGGAGCCGCAATATCACTACCCTTCGCCCTTTCCCTCTCCATGCTGAAACTACCCTGCCCGTGTATTG
アプタマー８：CgA_s10（配列番号８）
GGTTATCCGAGGAGCCGCAATATCACCCTACCTGACCATCTCGCCCGTCTCTCTGAAACTACCCTGCCCGTGTATTG
Aptamer 1: CgA_s1 (SEQ ID NO: 1)
GGTTATCCGAGGAGCCGCAATATCTTACACCCTGCCTTCCCCCCTGTCCGCATCGAAACTACCCTGCCCGTGTATTG
Aptamer 2: CgA_s2 (SEQ ID NO: 2)
GGTTATCCGAGGAGCCGCAATCAACACTGCCCACCCTTCTACCCATGGCCGCGAAACTACCCTGCCCGTGTATTG
Aptamer 3: CgA_s3 (SEQ ID NO: 3)
GGTTATCCGAGGAGCCGCAATATCTACCCTGTCCCCTCCTGCTTTCCAGCCTGTGAAACTACCCTGCCCGTGTATTG
Aptamer 4: CgA_s4 (SEQ ID NO: 4)
GGTTATCCGAGGAGCCGCAATATCACTACCCGCCTTCTTCTACCCTGTCCTCTTGAAACTACCCTGCCCGTGTATTG
Aptamer 5: CgA_s5 (SEQ ID NO: 5)
GGTTACCGAGGAGCCGCAATATCTCTCCCCCTCCTTTCCTTCTCCTTGCCCGTGAAACTACCCTGCCCGTGTATTG
Aptamer 6: CgA_s6 (SEQ ID NO: 6)
GGTTATCCGAGGAGCCGCAATCAAACTACCCGTCCTCTCCCGTCCCGCCGCCGAAACTACCCTGCCCGTGTATTG
Aptamer 7: CgA_s9 (SEQ ID NO: 7)
GGTTATCCGAGGAGCCGCAATATCACTACCCTTCGCCCTTTCCCTCTCCATGCTGAAACTACCCTGCCCGTGTATTG
Aptamer 8: CgA_s10 (SEQ ID NO: 8)
GGTTATCCGAGGAGCCGCAATATCACCCTACCTGACCATCTCGCCCGTCTCTCTGAAACTACCCTGCCCGTGTATTG
アプタマー１～８の推定二次構造を、それぞれ、図１～８に示す。ただし、これには限定されない。 The predicted secondary structures of aptamers 1-8 are shown in Figures 1-8, respectively. However, it is not limited to this.
前記アプタマーは、その３’末端に、２０塩基長のポリデオキシアデニン（ポリｄＡ）を付加し、ポリｄＡ付加アプタマーとして、後述するＳＰＲに使用した。前記ポリｄＡ付加アプタマーは、９５℃、５分の条件で熱変性させたものを使用した。 The aptamer had a 20-base long polydeoxyadenine (poly-dA) added to its 3' end, and was used as a poly-dA-added aptamer in SPR described below. The poly-dA-added aptamer was heat-denatured at 95° C. for 5 minutes.
（２）試料
クロモグラニンＡ（Recombinant full length Human Chromogranin A、Creative BioMart、#CHGA-26904TH)を、ＳＢ１Ｔバッファーに懸濁し、一晩溶解させた後、遠心（１２，０００ｒｐｍ、１５分、室温）し分離した。前記分離した上清を、クロモグラニンＡを含む抽出液として得た。これをクロモグラニンＡ試料とした。前記ＳＢ１Ｔバッファーの組成は、４０ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ、１２５ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、５ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＣｌ、１ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ２および０．０１％ Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０とし、ｐＨは、７．５とした。
(2) Sample Chromogranin A (Recombinant full length Human Chromogranin A, Creative BioMart, #CHGA-26904TH) was suspended in SB1T buffer, dissolved overnight, and separated by centrifugation (12,000 rpm, 15 minutes, room temperature). did. The separated supernatant was obtained as an extract containing chromogranin A. This was designated as a chromogranin A sample. The composition of the SB1T buffer was 40 mmol/L HEPES, 125 mmol/L NaCl, 5 mmol/L KCl, 1 mmol/L MgCl 2 and 0.01% Tween (registered trademark) 20, and the pH was 7.5.
また、前記アプタマーの交差反応の確認のため、前記クロモグラニンＡ試料と同様にして、以下に示す材料から、α－アミラーゼ試料、およびＢＳＡ試料を調製した。
α－アミラーゼ（Lee Biosolutions社製、#120-10）
ＢＳＡ（Bovine Serum Albumin、SIGMA社製、#A7906）
Furthermore, in order to confirm the cross-reactivity of the aptamer, an α-amylase sample and a BSA sample were prepared from the materials shown below in the same manner as the chromogranin A sample.
α-amylase (Lee Biosolutions, #120-10)
BSA (Bovine Serum Albumin, manufactured by SIGMA, #A7906)
（３）ＳＰＲによる結合性の解析
結合性の解析には、ProteON XPR36（BioRad社）を、その使用説明書にしたがって使用した。
(3) Binding analysis by SPR For binding analysis, ProteON XPR36 (BioRad) was used according to its instruction manual.
まず、前記ProteON専用のセンサーチップとして、ストレプトアビジンが固定化されたチップ（商品名 ProteOn NLC Sensor Chip、BioRad社）を、前記ProteON XPR36にセットした。前記センサーチップのフローセルに、超純水（ＤＤＷ）を用いて、５μｍｏｌ／Ｌのビオチン化ポリｄＴをインジェクションし、シグナル強度（ＲＵ：Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｕｎｉｔ）が飽和するまで結合させた。前記ビオチン化ポリｄＴは、２０塩基長のデオキシチミジンの５’末端をビオチン化して調製した。そして、前記チップの前記フローセルに、ＳＢ１Ｔバッファーを用いて、２００ｎｍｏｌ／Ｌの前記ポリｄＡ付加アプタマーを、流速２５μＬ／ｍｉｎで８０秒間インジェクションし、シグナル強度が飽和するまで結合させた。続いて、所定のタンパク質濃度（４００ｎｍｏｌ／Ｌ）の前記試料を、それぞれ、ＳＢ１Ｔバッファーを用いて、流速５０μＬ／ｍｉｎで１２０秒間インジェクションし、引き続き、同じ条件で、ＳＢ１Ｔバッファーを３００秒間流して、洗浄を行った。前記試料のインジェクション後、シグナル強度を測定した。 First, as a sensor chip exclusively for ProteON, a chip on which streptavidin was immobilized (trade name: ProteOn NLC Sensor Chip, BioRad) was set in the ProteON XPR36. 5 μmol/L of biotinylated poly-dT was injected into the flow cell of the sensor chip using ultrapure water (DDW), and allowed to bind until the signal intensity (RU: Resonance Unit) was saturated. The biotinylated poly-dT was prepared by biotinylating the 5' end of deoxythymidine having a length of 20 bases. Then, 200 nmol/L of the poly-dA-added aptamer was injected into the flow cell of the chip at a flow rate of 25 μL/min for 80 seconds using SB1T buffer, and allowed to bind until the signal intensity was saturated. Subsequently, each sample with a predetermined protein concentration (400 nmol/L) was injected using SB1T buffer at a flow rate of 50 μL/min for 120 seconds, and then washed by flowing SB1T buffer for 300 seconds under the same conditions. I did it. After injection of the sample, the signal intensity was measured.
これらの結果を図９および図１０に示す。図９は、４００ｎｍｏｌ／ＬのクロモグラニンＡに対するアプタマー１～８の結合性を示すグラフであり、横軸は、アプタマー１～８における、各試料を示し、縦軸は、シグナル強度（ＲＵ）を示す。横軸において、左から順に、クロモグラニンＡ試料、α－アミラーゼ試料、およびＢＳＡ試料を示す。図９に示す値は、前記試料のインジェクション開始を０秒として、１１５～１２５秒におけるシグナル強度（ＲＵ）の平均値である。図９に示すように、アプタマー１～８は、クロモグラニンＡに対して、結合性を示した。一方、アプタマー１～８は、α－アミラーゼ試料、およびＢＳＡ試料に対しては、いずれも、シグナル強度が０以下であり、結合性を示さなかった。この結果から、アプタマー１～８は、クロモグラニンＡに対して優れた特異性で結合することがわかった。 These results are shown in FIGS. 9 and 10. FIG. 9 is a graph showing the binding properties of aptamers 1 to 8 to 400 nmol/L chromogranin A, the horizontal axis shows each sample in aptamers 1 to 8, and the vertical axis shows signal intensity (RU). . On the horizontal axis, from left to right, a chromogranin A sample, an α-amylase sample, and a BSA sample are shown. The values shown in FIG. 9 are the average values of signal intensity (RU) from 115 to 125 seconds, with the injection start of the sample being 0 seconds. As shown in FIG. 9, aptamers 1 to 8 showed binding property to chromogranin A. On the other hand, aptamers 1 to 8 had signal intensities of 0 or less and showed no binding to the α-amylase sample and the BSA sample. These results revealed that aptamers 1 to 8 bind to chromogranin A with excellent specificity.
図１０は、４００ｎｍｏｌ／ＬのクロモグラニンＡに対するアプタマー１～８の結合性を示すグラフである。横軸は、前記試料のインジェクション開始後の経過時間（ｓｅｃ）を示し、縦軸は、シグナル強度（ＲＵ）を示す。図１０に示すように、アプタマー１～８は、クロモグラニンＡに対して、結合性を示した。一方、α－アミラーゼ試料、およびＢＳＡ試料に対しては、いずれも、シグナル強度が０以下であり、結合性を示さなかった。この結果から、アプタマー１～８は、クロモグラニンＡに対して優れた特異性で結合することがわかった。 FIG. 10 is a graph showing the binding properties of aptamers 1 to 8 to chromogranin A at 400 nmol/L. The horizontal axis shows the elapsed time (sec) after the start of injection of the sample, and the vertical axis shows the signal intensity (RU). As shown in FIG. 10, aptamers 1 to 8 showed binding property to chromogranin A. On the other hand, the signal intensity for both the α-amylase sample and the BSA sample was 0 or less, indicating no binding. These results revealed that aptamers 1 to 8 bind to chromogranin A with excellent specificity.
以上の結果から、本発明のアプタマーは、クロモグラニンＡに結合し、それを測定により検出できることがわかった。 From the above results, it was found that the aptamer of the present invention binds to chromogranin A and can be detected by measurement.
［実施例２］
本発明のアプタマーについて、クロモグラニンＡに対する解離定数を求めた。
[Example 2]
The dissociation constant for chromogranin A was determined for the aptamer of the present invention.
アプタマーとして、前記アプタマー１～８を使用し、前記試料におけるクロモグラニンＡの濃度を、１００、２００、および４００ｎｍｏｌ／Ｌとした以外は実施例１と同様にして、結合性の解析を行った。 Binding was analyzed in the same manner as in Example 1, except that Aptamers 1 to 8 were used as the aptamers, and the concentrations of chromogranin A in the samples were 100, 200, and 400 nmol/L.
この結果を図１１に示す。図１１は、クロモグラニンＡに対するアプタマー１～８の結合性を示すグラフである。横軸は、前記試料のインジェクション開始後の経過時間（ｓｅｃ）を示し、縦軸は、シグナル強度（ＲＵ）を示す。図１１に示すように、アプタマー１～８は、クロモグラニンＡの濃度が増加するにつれて、シグナル強度が増加した。 The results are shown in FIG. FIG. 11 is a graph showing the binding properties of aptamers 1 to 8 to chromogranin A. The horizontal axis shows the elapsed time (sec) after the start of injection of the sample, and the vertical axis shows the signal intensity (RU). As shown in FIG. 11, the signal intensity of aptamers 1 to 8 increased as the concentration of chromogranin A increased.
さらに、前記図１１のＳＰＲ解析の結果から、動態パラメータを算出した。この結果、アプタマー１は、クロモグラニンＡに対する解離定数（ＫＤ）が、１２．６×１０－９ｍｏｌ／Ｌであり、アプタマー２は、クロモグラニンＡに対する解離定数（ＫＤ）が、３５．４×１０－９ｍｏｌ／Ｌであり、アプタマー３は、クロモグラニンＡに対する解離定数（ＫＤ）が、７５．６×１０－９ｍｏｌ／Ｌであり、アプタマー４は、クロモグラニンＡに対する解離定数（ＫＤ）が、７５．９×１０－９ｍｏｌ／Ｌであり、アプタマー５は、クロモグラニンＡに対する解離定数（ＫＤ）が、４０．６×１０－９ｍｏｌ／Ｌであり、アプタマー６は、クロモグラニンＡに対する解離定数（ＫＤ）が、４７．２×１０－９ｍｏｌ／Ｌであり、アプタマー７は、クロモグラニンＡに対する解離定数（ＫＤ）が、３７．０×１０－９ｍｏｌ／Ｌであり、アプタマー８は、クロモグラニンＡに対する解離定数（ＫＤ）が、５０．８×１０－９ｍｏｌ／Ｌであり、優れた結合性であることがわかった。 Furthermore, kinetic parameters were calculated from the results of the SPR analysis shown in FIG. 11. As a result, aptamer 1 has a dissociation constant (KD) for chromogranin A of 12.6×10 −9 mol/L, and aptamer 2 has a dissociation constant (KD) for chromogranin A of 35.4×10 −9 mol/L . 9 mol/L, aptamer 3 has a dissociation constant (KD) for chromogranin A of 75.6×10 −9 mol/L, and aptamer 4 has a dissociation constant (KD) for chromogranin A of 75.6×10 −9 mol/L. Aptamer 5 has a dissociation constant (KD) for chromogranin A of 40.6× 10 -9 mol /L, and aptamer 6 has a dissociation constant (KD) for chromogranin A. is 47.2×10 −9 mol/L, aptamer 7 has a dissociation constant (KD) for chromogranin A of 37.0×10 −9 mol/L, and aptamer 8 has a dissociation constant (KD) for chromogranin A of 37.0×10 −9 mol/L. The constant (KD) was 50.8×10 −9 mol/L, indicating excellent binding properties.
以上の結果から、本発明のアプタマーは、クロモグラニンＡに特異的に結合、それを測定により検出できることがわかった。 From the above results, it was found that the aptamer of the present invention specifically binds to chromogranin A and can be detected by measurement.
以上、実施形態および実施例を参照して本発明を説明したが、本発明は、上記実施形態および実施例に限定されるものではない。本発明の構成や詳細には、本発明のスコープ内で当業者が理解しうる様々な変更をできる。 Although the present invention has been described above with reference to the embodiments and examples, the present invention is not limited to the above embodiments and examples. The configuration and details of the present invention can be modified in various ways within the scope of the present invention by those skilled in the art.
＜付記＞
上記の実施形態の一部または全部は、以下の付記のようにも記載しうるが、以下には限定されない。
（付記１）
下記（ａ）または（ｂ）のいずれか一方のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、クロモグラニンＡに結合する核酸分子。
（ａ）配列番号１～８のいずれかの塩基配列もしくは配列番号１～８のいずれかの塩基配列の部分配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）前記（ａ）の塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、クロモグラニンＡに結合するポリヌクレオチド
（付記２）
前記ポリヌクレオチドにおいて、少なくとも１個のチミンが、修飾塩基であり、前記チミンの修飾塩基が、修飾チミンおよび修飾ウラシルの少なくとも一方である、付記１記載の核酸分子。
（付記３）
前記ポリヌクレオチドにおいて、チミンの全塩基数のうち、２０分の１以上が、修飾塩基であり、前記チミンの修飾塩基が、修飾チミンおよび修飾ウラシルの少なくとも一方である、付記１または２記載の核酸分子。
（付記４）
前記ポリヌクレオチドにおいて、全チミンが、修飾塩基であり、前記チミンの修飾塩基が、修飾チミンおよび修飾ウラシルの少なくとも一方である、付記１から３のいずれかに記載の核酸分子。
（付記５）
前記ポリヌクレオチドにおいて、少なくとも１個のシトシンが、修飾塩基である、付記１から４のいずれかに記載の核酸分子。
（付記６）
前記ポリヌクレオチドにおいて、シトシンの全塩基数のうち、２０分の１以上が、修飾塩基である、付記１から５のいずれかに記載の核酸分子。
（付記７）
前記ポリヌクレオチドにおいて、全シトシンが、修飾塩基である、付記１から７のいずれかに記載の核酸分子。
（付記８）
前記ポリヌクレオチドが、ＤＮＡである、付記１から７のいずれかに記載の核酸分子。
（付記９）
付記１から８のいずれかに記載の核酸分子を含むことを特徴とする、クロモグラニンＡの検出試薬。
（付記１０）
さらに、標識物質を有し、
前記標識物質が、前記核酸分子に結合されている、付記９記載の検出試薬。
（付記１１）
前記標識物質が、酵素である、付記１０記載の検出試薬。
（付記１２）
前記酵素が、ルシフェラーゼである、付記１１記載の検出試薬。
（付記１３）
付記１から８のいずれかに記載の核酸分子、または付記９から１２のいずれかに記載の検出試薬と、試料とを接触させ、前記試料中のクロモグラニンＡと、前記核酸分子または前記検出試薬との複合体を形成させる工程、および、
前記複合体を検出する工程を含むことを特徴とする、クロモグラニンＡの検出方法。
（付記１４）
前記検出が、定性分析または定量分析である、付記１３記載の検出方法。
<Additional notes>
Some or all of the above embodiments may be described as in the following additional notes, but are not limited to the following.
(Additional note 1)
A nucleic acid molecule that binds to chromogranin A, characterized in that it contains the polynucleotide of either (a) or (b) below.
(a) A polynucleotide consisting of the base sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 8 or a partial sequence of any of the base sequences of SEQ ID NOs: 1 to 8 (b) 80% or more of the base sequence of (a) above A polynucleotide that binds to chromogranin A and consists of a base sequence having the same identity as (Appendix 2)
The nucleic acid molecule according to supplementary note 1, wherein in the polynucleotide, at least one thymine is a modified base, and the modified base of the thymine is at least one of a modified thymine and a modified uracil.
(Additional note 3)
In the polynucleotide, one-twentieth or more of the total number of thymine bases is a modified base, and the modified thymine base is at least one of modified thymine and modified uracil, the nucleic acid according to supplementary note 1 or 2. molecule.
(Additional note 4)
4. The nucleic acid molecule according to any one of appendices 1 to 3, wherein in the polynucleotide, all thymines are modified bases, and the modified base of the thymine is at least one of a modified thymine and a modified uracil.
(Appendix 5)
5. The nucleic acid molecule according to any one of Supplementary Notes 1 to 4, wherein in the polynucleotide, at least one cytosine is a modified base.
(Appendix 6)
6. The nucleic acid molecule according to any one of Supplementary Notes 1 to 5, wherein one-twentieth or more of the total number of cytosine bases in the polynucleotide is a modified base.
(Appendix 7)
8. The nucleic acid molecule according to any one of Supplementary Notes 1 to 7, wherein all cytosines in the polynucleotide are modified bases.
(Appendix 8)
8. The nucleic acid molecule according to any one of Supplementary Notes 1 to 7, wherein the polynucleotide is DNA.
(Appendix 9)
A detection reagent for chromogranin A, comprising the nucleic acid molecule according to any one of Supplementary Notes 1 to 8.
(Appendix 10)
Furthermore, it has a labeling substance,
The detection reagent according to appendix 9, wherein the labeling substance is bound to the nucleic acid molecule.
(Appendix 11)
The detection reagent according to
(Appendix 12)
The detection reagent according to supplementary note 11, wherein the enzyme is luciferase.
(Appendix 13)
The nucleic acid molecule according to any one of appendices 1 to 8 or the detection reagent according to any one of appendices 9 to 12 is brought into contact with a sample, and chromogranin A in the sample and the nucleic acid molecule or the detection reagent according to any one of appendices 9 to 12 are brought into contact with each other. forming a complex of; and
A method for detecting chromogranin A, comprising the step of detecting the complex.
(Appendix 14)
14. The detection method according to appendix 13, wherein the detection is qualitative analysis or quantitative analysis.
本発明の核酸分子は、クロモグラニンＡに結合可能である。このため、本発明の核酸分子によれば、試料中のクロモグラニンＡとの結合の有無によって、クロモグラニンＡを検出できる。このため、本発明の核酸分子は、例えば、医薬等の分野において、例えば、クロモグラニンＡの検出に、極めて有用なツールといえる。 Nucleic acid molecules of the invention are capable of binding chromogranin A. Therefore, according to the nucleic acid molecule of the present invention, chromogranin A can be detected depending on the presence or absence of binding to chromogranin A in a sample. Therefore, the nucleic acid molecule of the present invention can be said to be an extremely useful tool, for example, for detecting chromogranin A, in the field of medicine and the like.
Claims (10)
（ａ）配列番号１～８のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）前記（ａ）の塩基配列に対して、９０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、クロモグラニンＡに結合するポリヌクレオチド A nucleic acid molecule that binds to chromogranin A, characterized in that it contains the polynucleotide of either (a) or (b) below.
(a) A polynucleotide consisting of a base sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 8. (b) A polynucleotide consisting of a base sequence having 90 % or more identity to the base sequence of (a) above, and having a chromogranin A base sequence. polynucleotide to bind
前記標識物質が、前記核酸分子に結合されている、請求項６記載の検出試薬。 Furthermore, it has a labeling substance,
7. The detection reagent according to claim 6, wherein the labeling substance is bound to the nucleic acid molecule.
前記複合体を検出する工程を含むことを特徴とする、クロモグラニンＡの検出方法。 The nucleic acid molecule according to any one of claims 1 to 5 or the detection reagent according to any one of claims 6 to 8 is brought into contact with a sample, and chromogranin A in the sample and the nucleic acid molecule are brought into contact with each other. forming a complex with the molecule or the detection reagent; and
A method for detecting chromogranin A, comprising the step of detecting the complex.
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