JP6399611B2 - Nucleic acid molecules that bind to shrimp allergens and uses thereof - Google Patents
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Description
本発明は、エビアレルゲンに結合する核酸分子およびその用途に関する。 The present invention relates to nucleic acid molecules that bind to shrimp allergens and uses thereof.
エビは、日常的に頻繁に摂取される食品であるが、近年、エビアレルギーの患者が増加しており、問題視されている。エビを原料とした加工食品は、数多く存在し、また、エビは、魚介類のエサであるため、魚介類を原料とした加工食品にもエビの成分が含まれていることがある。このため、加工食品やその製造ライン等においては、原料としてエビが混入しているか否かを分析することは、極めて重要である。 Shrimp is a food that is frequently consumed on a daily basis, but in recent years, the number of shrimp allergic patients has increased and has been regarded as a problem. There are many processed foods that use shrimp as raw materials, and shrimp are foods for seafood, so processed foods made from seafood may contain shrimp components. For this reason, it is extremely important to analyze whether shrimp are mixed as a raw material in processed foods and production lines thereof.
アレルギーのアレルゲンは、一般的に、タンパク質やその分解物（ペプチド）であり、これらを抗原とする抗体を使用した分析方法が、主流である。エビに関しては、例えば、エビタンパク質であるトロポミオシンがアレルゲンとして知られている。トロポミオシンに対する分析方法として、ＥＬＩＳＡを用いた方法が報告されている（非特許文献１、非特許文献２）。 Allergic allergens are generally proteins and their degradation products (peptides), and analysis methods using antibodies using these as antigens are the mainstream. Regarding shrimp, for example, shrimp protein tropomyosin is known as an allergen. As an analysis method for tropomyosin, a method using ELISA has been reported (Non-Patent Document 1, Non-Patent Document 2).
しかし、抗体は、タンパク質であり、安定性に問題があるため、低コストで簡易な検査法に抗体を用いることが難しい。 However, since an antibody is a protein and has a problem in stability, it is difficult to use the antibody for a low-cost and simple test method.
そこで、本発明の目的は、エビアレルゲンの検出に利用可能な新たな核酸分子を提供することにある。 Then, the objective of this invention is providing the new nucleic acid molecule which can be utilized for the detection of a shrimp allergen.
本発明のエビアレルゲン結合核酸分子は、エビアレルゲンに対する解離定数が、５０ｎＭ以下の核酸分子であることを特徴とする。 The shrimp allergen-binding nucleic acid molecule of the present invention is a nucleic acid molecule having a dissociation constant for shrimp allergen of 50 nM or less.
本発明のエビアレルゲン分析用センサは、前記本発明のエビアレルゲン結合核酸分子を含むことを特徴とする。 The sensor for analyzing shrimp allergens of the present invention is characterized by comprising the shrimp allergen-binding nucleic acid molecule of the present invention.
本発明のエビアレルゲンの分析方法は、試料と前記本発明のエビアレルゲン結合核酸分子とを接触させ、前記試料中のエビアレルゲンと前記核酸分子とを結合させることにより、前記試料中のエビアレルゲンを検出する工程を含むことを特徴とする。 The method for analyzing shrimp allergens of the present invention comprises contacting a sample with the shrimp allergen-binding nucleic acid molecule of the present invention, and binding the shrimp allergen in the sample and the nucleic acid molecule to thereby remove the shrimp allergen in the sample. A step of detecting.
本発明のエビアレルゲン結合核酸分子は、エビアレルゲンに対して前述のような解離定数で結合することができる。このため、本発明のエビアレルゲン結合核酸分子によれば、例えば、試料中のエビアレルゲンとの結合の有無によって、優れた精度で、エビアレルゲンを検出できる。したがって、本発明のエビアレルゲン結合核酸分子は、例えば、食品製造、食品管理、食品の流通等の分野におけるエビアレルゲンの検出に、極めて有用なツールといえる。 The shrimp allergen-binding nucleic acid molecule of the present invention can bind to shrimp allergen with the dissociation constant as described above. Therefore, according to the shrimp allergen-binding nucleic acid molecule of the present invention, shrimp allergen can be detected with excellent accuracy, for example, by the presence or absence of binding with shrimp allergen in the sample. Therefore, the shrimp allergen-binding nucleic acid molecule of the present invention can be said to be an extremely useful tool for detecting shrimp allergens in the fields of food production, food management, food distribution, and the like.
本発明の核酸分子は、例えば、前記エビアレルゲンが、トロポミオシンまたはそのサブユニットである。 In the nucleic acid molecule of the present invention, for example, the shrimp allergen is tropomyosin or a subunit thereof.
本発明の核酸分子は、例えば、前記エビアレルゲンが、未変性アレルゲンまたは加熱変性アレルゲンである。 In the nucleic acid molecule of the present invention, for example, the shrimp allergen is a native allergen or a heat-denatured allergen.
本発明の核酸分子は、例えば、下記（ａ）〜（ｄ）からなる群から選択された少なくとも一つのポリヌクレオチドを含む。
（ａ）配列番号１、２および３の少なくともいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）前記（ａ）のいずれかの塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、前記エビアレルゲンに結合するポリヌクレオチド
（ｃ）前記（ａ）のいずれかの塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、前記エビアレルゲンに結合するポリヌクレオチド
（ｄ）前記（ａ）のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに、相補的な塩基配列からなり、エビアレルゲンに結合するポリヌクレオチドThe nucleic acid molecule of the present invention includes, for example, at least one polynucleotide selected from the group consisting of the following (a) to (d).
(A) a polynucleotide comprising at least one of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1, 2 and 3 (b) in the nucleotide sequence of any one of (a), one or several bases are deleted, substituted, inserted and (C) a polynucleotide that binds to the shrimp allergen, and (c) a base sequence that has an identity of 80% or more to any of the base sequences of (a). A polynucleotide that binds to an allergen (d) a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions to a polynucleotide comprising any one of the nucleotide sequences of (a) above, comprising a complementary nucleotide sequence, and Binding polynucleotide
本発明の核酸分子は、例えば、前記ポリヌクレオチドが、ＤＮＡである。 In the nucleic acid molecule of the present invention, for example, the polynucleotide is DNA.
本発明の分析用センサは、例えば、さらに、Ｇカルテット構造を形成する核酸分子を含む。 The analytical sensor of the present invention further includes, for example, a nucleic acid molecule that forms a G quartet structure.
本発明の分析用センサは、例えば、前記Ｇカルテット構造を形成する核酸分子が、ＤＮＡｚｙｍｅまたはＲＮＡｚｙｍｅである。 In the analytical sensor of the present invention, for example, the nucleic acid molecule forming the G quartet structure is DNAzyme or RNAzyme.
本発明の分析用センサは、例えば、さらに、ポルフェリンを含む。 The analytical sensor of the present invention further includes porferin, for example.
本発明の分析方法は、例えば、前記試料が、食品、食品原料および食品添加物からなる群から選択された少なくとも一つである。 In the analysis method of the present invention, for example, the sample is at least one selected from the group consisting of foods, food raw materials, and food additives.
（１）エビアレルゲン結合核酸分子
本発明のエビアレルゲン結合核酸分子は、前述のように、エビアレルゲンに対する解離定数が、５０ｎＭ以下の核酸分子であることを特徴とする。(1) Shrimp allergen-binding nucleic acid molecule The shrimp allergen-binding nucleic acid molecule of the present invention is a nucleic acid molecule having a dissociation constant for shrimp allergen of 50 nM or less as described above.
本発明の核酸分子は、例えば、エビの主要アレルゲンであるトロポミオシン、そのサブユニット、またはそのドメインに結合する。トロポミオシンの種類は、特に制限されず、種々のエビ由来のトロポミオシンがあげられる。前記エビは、例えば、クルマエビ科（Ｐｅｎａｅｉｄａｅ）があげられ、具体例として、ウシエビ属（Ｐｅｎａｅｕｓ）、ヨシエビ属（Ｍｅｔａｐｅｎａｅｕｓ）等があげられる。ウシエビ属の具体例として、ブラウンシュリンプ（Ｐｅｎａｅｕｓ ａｚｔｅｃｕｓ）、ショウナンエビ（Ｐｅｎａｅｕｓ ｉｎｄｉｃｕｓ）があげられ、ヨシエビ属の具体例として、ヨシエビ（Ｍｅｔａｐｅｎａｅｕｓ ｅｎｉｓ）があげられる。それぞれのエビのトロポミオシンの具体例として、Ｐｅｎ ａ １、Ｐｅｎ ｉ １、Ｍｅｔ ｅ １等があげられる。The nucleic acid molecule of the present invention binds to, for example, tropomyosin, a subunit, or a domain thereof, which is a major shrimp allergen. The type of tropomyosin is not particularly limited, and examples thereof include various shrimp-derived tropomyosin. The shrimp, for example, penaeidae (Penaeidae) can be mentioned, as specific examples, Penaeus monodon genus (Penaeus), Metapenaeus Ensis genus (Metapenaeus) and the like. Specific examples of the genus Shrimp include brown shrimp ( Penaeus aztecus ) and shrimp ( Penaeus indicus ), and specific examples of the genus Shrimp include Metapenaeus enis . Specific examples of each shrimp tropomyosin include Pen a 1, Pen i 1, Met e 1, and the like.
前記エビアレルゲンは、例えば、加熱による変性が生じていない未変性アレルゲンでもよいし、加熱による変性が生じた変性アレルゲンでもよい。本発明の核酸分子は、例えば、いずれのアレルゲンに対しても結合可能である。 The shrimp allergen may be, for example, a non-denatured allergen that is not denatured by heating or a denatured allergen that is denatured by heating. For example, the nucleic acid molecule of the present invention can bind to any allergen.
本発明の核酸分子は、前記エビアレルゲンに対する解離定数が、例えば、５０ｎＭ、４０ｎＭ以下である。本発明の核酸分子は、前記エビアレルゲンの検出限界濃度が、例えば、３００ｎＭ、１５０ｎＭ、７５ｎＭである。 In the nucleic acid molecule of the present invention, the dissociation constant for the shrimp allergen is, for example, 50 nM or 40 nM or less. In the nucleic acid molecule of the present invention, the detection limit concentration of the shrimp allergen is, for example, 300 nM, 150 nM, or 75 nM.
本発明の核酸分子は、前記トロポミオシンに対する解離定数が、例えば、５０ｎＭ、４０ｎＭ以下である。本発明の核酸分子は、前記トロポミオシンの検出限界濃度が、例えば、３００ｎＭ、１５０ｎＭ、７５ｎＭである。 In the nucleic acid molecule of the present invention, the dissociation constant for the tropomyosin is, for example, 50 nM or 40 nM or less. In the nucleic acid molecule of the present invention, the detection limit concentration of the tropomyosin is, for example, 300 nM, 150 nM, or 75 nM.
本発明の核酸分子と前記エビアレルゲンとの結合は、例えば、表面プラズモン共鳴分子相互作用（ＳＰＲ；Surface Plasmon resonance）解析等により決定できる。前記解析は、例えば、ＰｒｏｔｅＯＮ（商品名 BioRad社）が使用できる。 The binding between the nucleic acid molecule of the present invention and the shrimp allergen can be determined, for example, by surface plasmon resonance molecular interaction (SPR) analysis. For example, ProteON (trade name BioRad) can be used for the analysis.
本発明のエビアレルゲン結合核酸分子について、具体例を以下に示す。本発明の核酸分子は、例えば、下記（ａ）〜（ｄ）からなる群から選択された少なくとも一つのポリヌクレオチドを含む核酸分子である。
（ａ）配列番号１、２および３の少なくともいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）前記（ａ）のいずれかの塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、前記エビアレルゲンに結合するポリヌクレオチド
（ｃ）前記（ａ）のいずれかの塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、前記エビアレルゲンに結合するポリヌクレオチド
（ｄ）前記（ａ）のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに、相補的な塩基配列からなり、エビアレルゲンに結合するポリヌクレオチドSpecific examples of the shrimp allergen-binding nucleic acid molecule of the present invention are shown below. The nucleic acid molecule of the present invention is a nucleic acid molecule containing at least one polynucleotide selected from the group consisting of (a) to (d) below, for example.
(A) a polynucleotide comprising at least one of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1, 2 and 3 (b) in the nucleotide sequence of any one of (a), one or several bases are deleted, substituted, inserted and (C) a polynucleotide that binds to the shrimp allergen, and (c) a base sequence that has an identity of 80% or more to any of the base sequences of (a). A polynucleotide that binds to an allergen (d) a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions to a polynucleotide comprising any one of the nucleotide sequences of (a) above, comprising a complementary nucleotide sequence, and Binding polynucleotide
本発明の核酸分子において、前記ポリヌクレオチドの構成単位は、例えば、ヌクレオチド残基であり、デオキシリボヌクレオチド残基およびリボヌクレオチド残基があげられる。前記ポリヌクレオチドは、後述するように、例えば、デオキシリボヌクレオチド残基からなるＤＮＡ、デオキシリボヌクレオチド残基およびリボヌクレオチド残基を含むＤＮＡであり、さらに、非ヌクレオチド残基を含んでもよい。本発明のエビアレルゲン結合核酸分子は、例えば、以下、ＤＮＡアプタマーともいう。 In the nucleic acid molecule of the present invention, the structural unit of the polynucleotide is, for example, a nucleotide residue, and examples thereof include a deoxyribonucleotide residue and a ribonucleotide residue. As will be described later, the polynucleotide is, for example, DNA composed of deoxyribonucleotide residues, DNA containing deoxyribonucleotide residues and ribonucleotide residues, and may further contain non-nucleotide residues. The shrimp allergen-binding nucleic acid molecule of the present invention is hereinafter also referred to as a DNA aptamer, for example.
本発明の核酸分子は、例えば、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドからなる分子でもよいし、前記ポリヌクレオチドを含む分子でもよい。後者の場合、本発明の核酸分子は、例えば、後述するように、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドを２つ以上含んでもよい。前記２つ以上のポリヌクレオチドは、同じ配列でもよいし、異なる配列でもよい。また、後者の場合、本発明の核酸分子は、例えば、さらに、リンカーおよび／または付加配列等を有してもよい。 The nucleic acid molecule of the present invention may be, for example, a molecule composed of any of the polynucleotides (a) to (d) or a molecule containing the polynucleotide. In the latter case, the nucleic acid molecule of the present invention may contain, for example, two or more of any of the polynucleotides (a) to (d) as described later. The two or more polynucleotides may have the same sequence or different sequences. In the latter case, the nucleic acid molecule of the present invention may further have, for example, a linker and / or an additional sequence.
前記（ａ）のポリヌクレオチドは、前記配列番号１、２および３の少なくともいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチドである。 The polynucleotide (a) is a polynucleotide comprising the base sequence of at least one of SEQ ID NOs: 1, 2, and 3.
配列番号２および配列番号３は、それぞれ配列番号１の小型化配列である。前記表１において、配列番号１の下線部領域は、配列番号２の塩基配列に対応し、配列番号１の小文字領域は、配列番号３の塩基配列に対応する。図１に、前記配列番号１、２または３の塩基配列からなるポリヌクレオチドの推定二次構造を示すが、本発明は、これには制限されない。 SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3 are miniaturized sequences of SEQ ID NO: 1, respectively. In Table 1, the underlined region of SEQ ID NO: 1 corresponds to the base sequence of SEQ ID NO: 2, and the lower case region of SEQ ID NO: 1 corresponds to the base sequence of SEQ ID NO: 3. FIG. 1 shows a predicted secondary structure of a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, 2 or 3, but the present invention is not limited to this.
前記（ｂ）において、「１もしくは数個」は、例えば、前記（ｂ）のポリヌクレオチドが、エビアレルゲンに結合する範囲であればよい。前記「１もしくは数個」は、前記（ａ）のいずれかの塩基配列において、例えば、１〜１０個、１〜７個、１〜５個、１〜３個、１または２個である。本発明において、塩基数および配列数等の個数の数値範囲は、例えば、その範囲に属する正の整数を全て開示するものである。つまり、例えば、「１〜５塩基」との記載は、「１、２、３、４、５塩基」の全ての開示を意味する（以下、同様）。 In (b) above, “one or several” may be in a range that allows the polynucleotide of (b) to bind to shrimp allergen, for example. The “1 or several” is, for example, 1 to 10, 1 to 7, 1 to 5, 1 to 3, or 1 or 2 in the base sequence of (a). In the present invention, the numerical range of numbers such as the number of bases and the number of sequences, for example, discloses all positive integers belonging to the range. That is, for example, the description “1 to 5 bases” means all disclosures of “1, 2, 3, 4, 5 bases” (hereinafter the same).
前記（ｃ）において、「同一性」は、例えば、前記（ｃ）のポリヌクレオチドが、エビアレルゲンに結合する範囲であればよい。前記同一性は、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上である。前記同一性は、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ等の解析ソフトウェアを用いて、デフォルトのパラメータにより算出できる（以下、同様）。 In the above (c), the “identity” may be, for example, a range in which the polynucleotide (c) binds to a shrimp allergen. The identity is, for example, 80% or more, 85% or more, 90% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, 99% or more. The identity can be calculated with default parameters using analysis software such as BLAST and FASTA (hereinafter the same).
前記（ｄ）において、「ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド」は、例えば、前記（ａ）のポリヌクレオチドに対して、完全または部分的に相補的なポリヌクレオチドである。前記ハイブリダイズは、例えば、各種ハイブリダイゼーションアッセイにより検出できる。前記ハイブリダイゼーションアッセイは、特に制限されず、例えば、ザンブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編「モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリーマニュアル第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ Ｅｄ．）」〔（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ （１９８９）〕等に記載されている方法を採用することもできる。 In (d), the “hybridizable polynucleotide” is, for example, a polynucleotide that is completely or partially complementary to the polynucleotide in (a). The hybridization can be detected by, for example, various hybridization assays. The hybridization assay is not particularly limited. For example, “Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd Ed.” (Cold Spring Harbor Laboratory) edited by Sambrook et al. (1989)] and the like can also be employed.
前記（ｄ）において、「ストリンジェントな条件」は、例えば、低ストリンジェントな条件、中ストリンジェントな条件、高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。「低ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、３２℃の条件である。「中ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、４２℃の条件である。「高ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、５０℃の条件である。ストリンジェンシーの程度は、当業者であれば、例えば、温度、塩濃度、プローブの濃度および長さ、イオン強度、時間等の条件を適宜選択することで、設定可能である。「ストリンジェントな条件」は、例えば、前述したザンブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編「モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリーマニュアル第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ Ｅｄ．）」〔（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ （１９８９）〕等に記載の条件を採用することもできる。 In (d) above, the “stringent conditions” may be, for example, any of low stringent conditions, moderate stringent conditions, and highly stringent conditions. “Low stringent conditions” are, for example, conditions of 5 × SSC, 5 × Denhardt's solution, 0.5% SDS, 50% formamide, and 32 ° C. “Medium stringent conditions” are, for example, 5 × SSC, 5 × Denhardt's solution, 0.5% SDS, 50% formamide, 42 ° C. “High stringent conditions” are, for example, conditions of 5 × SSC, 5 × Denhardt's solution, 0.5% SDS, 50% formamide, 50 ° C. The degree of stringency can be set by those skilled in the art by appropriately selecting conditions such as temperature, salt concentration, probe concentration and length, ionic strength, time, and the like. The “stringent conditions” are described in, for example, the above-mentioned “Sequence of Molecular Blocking: A Laboratory Manual 2nd Ed.” (Cold Spring Harbor Laboratories, edited by Sambrook et al., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd Edition”. 1989)]] and the like.
本発明の核酸分子は、例えば、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドの配列を１つ含んでもよいし、前記ポリヌクレオチドの配列を複数含んでもよい。後者の場合、複数のポリヌクレオチドの配列が連結して、一本鎖のポリヌクレオチドを形成していることが好ましい。前記複数のポリヌクレオチドの配列は、例えば、それぞれが直接的に連結してもよいし、リンカーを介して、それぞれが間接的に連結してもよい。前記ポリヌクレオチドの配列は、それぞれの末端において、直接的または間接的に連結していることが好ましい。前記複数のポリヌクレオチドの配列は、例えば、同じでもよいし、異なってもよい。前記複数のポリヌクレオチドの配列は、例えば、同じであることが好ましい。前記ポリヌクレオチドの配列を複数含む場合、前記配列の数は、特に制限されず、例えば、２以上、２〜２０、２〜１０、２または３である。 The nucleic acid molecule of the present invention may include, for example, one of the polynucleotide sequences (a) to (d) or a plurality of the polynucleotide sequences. In the latter case, it is preferable that a plurality of polynucleotide sequences are linked to form a single-stranded polynucleotide. For example, the sequences of the plurality of polynucleotides may be directly linked to each other or indirectly linked via a linker. The polynucleotide sequences are preferably linked directly or indirectly at the respective ends. The sequences of the plurality of polynucleotides may be the same or different, for example. The sequences of the plurality of polynucleotides are preferably the same, for example. When a plurality of sequences of the polynucleotide are included, the number of the sequences is not particularly limited, and is 2 or more, 2 to 20, 2 to 10, 2 or 3, for example.
前記リンカーは、特に制限されない。前記リンカーの長さは、特に制限されず、例えば、１〜２００塩基長、１〜２０塩基長、３〜１２塩基長、５〜９塩基長である。前記リンカーの構成単位は、例えば、ヌクレオチド残基であり、デオキシリボヌクレオチド残基およびリボヌクレオチド残基等があげられる。前記リンカーは、特に制限されず、例えば、デオキシリボヌクレオチド残基からなるＤＮＡ、リボヌクレオチド残基を含むＤＮＡ等のポリヌクレオチドがあげられる。前記リンカーの具体例として、例えば、ポリデオキシチミン（ポリｄＴ）、ポリデオキシアデニン（ポリｄＡ）、ＡとＴの繰り返し配列であるポリｄＡｄＴ等があげられ、好ましくはポリｄＴ、ポリｄＡｄＴである。 The linker is not particularly limited. The length in particular of the said linker is not restrict | limited, For example, it is 1-200 base length, 1-20 base length, 3-12 base length, 5-9 base length. The structural unit of the linker is, for example, a nucleotide residue, and examples thereof include a deoxyribonucleotide residue and a ribonucleotide residue. The linker is not particularly limited, and examples thereof include polynucleotides such as DNA consisting of deoxyribonucleotide residues and DNA containing ribonucleotide residues. Specific examples of the linker include polydeoxythymine (poly dT), polydeoxyadenine (poly dA), poly dAdT which is a repeating sequence of A and T, and preferably poly dT and poly dAdT.
本発明の核酸分子において、前記ポリヌクレオチドは、一本鎖ポリヌクレオチドであることが好ましい。前記一本鎖ポリヌクレオチドは、例えば、自己アニーリングによりステム構造およびループ構造を形成可能であることが好ましい。前記ポリヌクレオチドは、例えば、ステムループ構造、インターナルループ構造および／またはバルジ構造等を形成可能であることが好ましい。 In the nucleic acid molecule of the present invention, the polynucleotide is preferably a single-stranded polynucleotide. The single-stranded polynucleotide is preferably capable of forming a stem structure and a loop structure by, for example, self-annealing. The polynucleotide is preferably capable of forming a stem loop structure, an internal loop structure, and / or a bulge structure, for example.
本発明の核酸分子は、例えば、二本鎖でもよい。二本鎖の場合、例えば、一方の一本鎖ポリヌクレオチドは、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドを含み、他方の一本鎖ポリヌクレオチドは、制限されない。前記他方の一本鎖ポリヌクレオチドは、例えば、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドに相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドがあげられる。本発明の核酸分子が二本鎖の場合、例えば、使用に先立って、変性等により、一本鎖ポリヌクレオチドに解離させることが好ましい。また、解離した前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかの一本鎖ポリヌクレオチドは、例えば、前述のように、ステム構造およびループ構造を形成していることが好ましい。 The nucleic acid molecule of the present invention may be, for example, double stranded. In the case of a double strand, for example, one single-stranded polynucleotide includes any of the polynucleotides (a) to (d), and the other single-stranded polynucleotide is not limited. Examples of the other single-stranded polynucleotide include a polynucleotide containing a base sequence complementary to any one of the polynucleotides (a) to (d). When the nucleic acid molecule of the present invention is double-stranded, it is preferably dissociated into a single-stranded polynucleotide by denaturation or the like prior to use. The dissociated single-stranded polynucleotide of any one of (a) to (d) preferably has, for example, a stem structure and a loop structure as described above.
本発明において、「ステム構造およびループ構造を形成可能」とは、例えば、実際にステム構造およびループ構造を形成すること、ならびに、ステム構造およびループ構造が形成されていなくても、条件によってステム構造およびループ構造を形成可能なことも含む。「ステム構造およびループ構造を形成可能」とは、例えば、実験的に確認した場合、および、コンピュータ等のシミュレーションで予測した場合の双方を含む。 In the present invention, “the stem structure and the loop structure can be formed” means, for example, that the stem structure and the loop structure are actually formed, and even if the stem structure and the loop structure are not formed, the stem structure depending on the conditions. And the ability to form a loop structure. “A stem structure and a loop structure can be formed” includes, for example, both experimental confirmation and prediction by a computer simulation.
本発明の核酸分子の構成単位は、例えば、ヌクレオチド残基である。前記ヌクレオチド残基は、例えば、デオキシリボヌクレオチド残基およびリボヌクレオチド残基があげられる。本発明の核酸分子は、例えば、デオキシリボヌクレオチド残基のみから構成されるＤＮＡ、１もしくは数個のリボヌクレオチド残基を含むＤＮＡ等があげられる。後者の場合、「１もしくは数個」は、特に制限されず、例えば、前記ポリヌクレオチドにおいて、例えば、１〜９１個、１〜３０個、１〜１５個、１〜７個、１〜３個、１または２個である。 The structural unit of the nucleic acid molecule of the present invention is, for example, a nucleotide residue. Examples of the nucleotide residue include deoxyribonucleotide residue and ribonucleotide residue. Examples of the nucleic acid molecule of the present invention include DNA composed only of deoxyribonucleotide residues, DNA containing one or several ribonucleotide residues, and the like. In the latter case, “one or several” is not particularly limited. For example, in the polynucleotide, for example, 1 to 91, 1 to 30, 1 to 15, 1 to 7, 1 to 3 are used. One or two.
前記ポリヌクレオチドは、修飾塩基を含んでもよい。前記修飾塩基は、特に制限されず、例えば、天然塩基（非人工塩基）が修飾された塩基があげられ、前記天然塩基と同様の機能を有することが好ましい。前記天然塩基は、特に制限されず、例えば、プリン骨格を有するプリン塩基、ピリミジン骨格を有するピリミジン塩基等があげられる。前記プリン塩基は、特に制限されず、例えば、アデニン（ａ）、グアニン（ｇ）があげられる。前記ピリミジン塩基は、特に制限されず、例えば、シトシン（ｃ）、チミン（ｔ）、ウラシル（ｕ）等があげられる。前記塩基の修飾部位は、特に制限されない。前記塩基がプリン塩基の場合、前記プリン塩基の修飾部位は、例えば、前記プリン骨格の７位および８位があげられる。前記塩基がピリミジン塩基の場合、前記ピリミジン塩基の修飾部位は、例えば、前記ピリミジン骨格の５位および６位があげられる。前記ピリミジン骨格において、４位の炭素に「＝Ｏ」が結合し、５位の炭素に「−ＣＨ３」または「−Ｈ」以外の基が結合している場合、修飾ウラシルまたは修飾チミンということができる。 The polynucleotide may include a modified base. The modified base is not particularly limited, and examples thereof include a base modified with a natural base (non-artificial base), and preferably has the same function as the natural base. The natural base is not particularly limited, and examples thereof include a purine base having a purine skeleton and a pyrimidine base having a pyrimidine skeleton. The purine base is not particularly limited, and examples thereof include adenine (a) and guanine (g). The pyrimidine base is not particularly limited, and examples thereof include cytosine (c), thymine (t), uracil (u) and the like. The base modification site is not particularly limited. When the base is a purine base, examples of the purine base modification site include the 7th and 8th positions of the purine skeleton. When the base is a pyrimidine base, examples of the modification site of the pyrimidine base include the 5th and 6th positions of the pyrimidine skeleton. In the pyrimidine skeleton, when “═O” is bonded to the carbon at the 4th position and a group other than “—CH3” or “—H” is bonded to the carbon at the 5th position, it is called a modified uracil or a modified thymine. it can.
前記修飾塩基の修飾基は、特に制限されず、例えば、メチル基、フルオロ基、アミノ基、チオ基、下記式（１）のベンジルアミノカルボニル基（benzylaminocarbonyl）、下記式（２）のトリプタミノカルボニル基（tryptaminocarbonyl）およびイソブチルアミノカルボニル基（isobutylaminocarbonyl）等があげられる。 The modifying group of the modifying base is not particularly limited, and examples thereof include a methyl group, a fluoro group, an amino group, a thio group, a benzylaminocarbonyl group represented by the following formula (1), and a tryptaminocarbonyl represented by the following formula (2). Group (tryptaminocarbonyl), isobutylaminocarbonyl group (isobutylaminocarbonyl) and the like.
前記修飾塩基は、特に制限されず、例えば、アデニンが修飾された修飾アデニン、チミンが修飾された修飾チミン、グアニンが修飾された修飾グアニン、シトシンが修飾された修飾シトシンおよびウラシルが修飾された修飾ウラシル等があげられ、前記修飾チミン、前記修飾ウラシルおよび前記修飾シトシンが好ましい。 The modified base is not particularly limited. For example, modified adenine modified with adenine, modified thymine modified with thymine, modified guanine modified with guanine, modified cytosine modified with cytosine and modified modified with uracil Examples include uracil and the like, and the modified thymine, the modified uracil and the modified cytosine are preferable.
前記修飾アデニンの具体例としては、例えば、７’−デアザアデニン等があげられる。 Specific examples of the modified adenine include 7'-deazaadenine.
前記修飾グアニンの具体例としては、例えば、７’−デアザグアニン等があげられる。 Specific examples of the modified guanine include 7'-deazaguanine and the like.
前記修飾シトシンの具体例としては、例えば、５’−メチルシトシン（５−Ｍｅ−ｄＣ）等があげられる。 Specific examples of the modified cytosine include 5'-methylcytosine (5-Me-dC).
前記修飾チミンの具体例としては、例えば、５’−ベンジルアミノカルボニルチミン、５’−トリプタミノカルボニルチミン、５’−イソブチルアミノカルボニルチミン等があげられる。 Specific examples of the modified thymine include 5'-benzylaminocarbonylthymine, 5'-tryptaminocarbonylthymine, 5'-isobutylaminocarbonylthymine and the like.
前記修飾ウラシルの具体例としては、例えば、５’−ベンジルアミノカルボニルウラシル（ＢｎｄＵ）、５’−トリプタミノカルボニルウラシル（ＴｒｐｄＵ）および５’−イソブチルアミノカルボニルウラシル等があげられる。例示した前記修飾ウラシルは、チミンの修飾塩基ということもできる。 Specific examples of the modified uracil include 5'-benzylaminocarbonyluracil (BndU), 5'-tryptaminocarbonyluracil (TrpdU), 5'-isobutylaminocarbonyluracil and the like. The exemplified modified uracil can also be referred to as a modified base of thymine.
前記ポリヌクレオチドは、例えば、いずれか１種類の前記修飾塩基のみを含んでもよいし、２種類以上の前記修飾塩基を含んでもよい。 For example, the polynucleotide may include only one of the modified bases, or may include two or more types of the modified bases.
本発明の核酸分子は、例えば、修飾ヌクレオチドを含んでもよい、前記修飾ヌクレオチドは、前述の前記修飾塩基を有するヌクレオチドでもよいし、糖残基が修飾された修飾糖を有するヌクレオチドでもよいし、前記修飾塩基および前記修飾糖を有するヌクレオチドでもよい。 The nucleic acid molecule of the present invention may contain, for example, a modified nucleotide. The modified nucleotide may be a nucleotide having the modified base described above, a nucleotide having a modified sugar in which a sugar residue is modified, It may be a nucleotide having a modified base and the modified sugar.
前記糖残基は、特に制限されず、例えば、デオキシリボース残基またはリボース残基があげられる。前記糖残基における修飾部位は、特に制限されず、例えば、前記糖残基の２’位または４’位があげられ、いずれか一方でも両方が修飾されてもよい。前記修飾糖の修飾基は、例えば、メチル基、フルオロ基、アミノ基、チオ基等があげられる。 The sugar residue is not particularly limited, and examples thereof include deoxyribose residue or ribose residue. The modification site in the sugar residue is not particularly limited, and examples thereof include the 2'-position and the 4'-position of the sugar residue, and both of them may be modified. Examples of the modifying group of the modified sugar include a methyl group, a fluoro group, an amino group, and a thio group.
前記修飾ヌクレオチド残基において、塩基がピリミジン塩基の場合、例えば、前記糖残基の２’位および／または４’位が修飾されていることが好ましい。前記修飾ヌクレオチド残基の具体例は、例えば、デオキシリボース残基またはリボース残基の２’位が修飾された、２’−メチル化−ウラシルヌクレオチド残基、２’−メチル化−シトシンヌクレオチド残基、２’−フルオロ化−ウラシルヌクレオチド残基、２’−フルオロ化−シトシンヌクレオチド残基、２’−アミノ化−ウラシルヌクレオチド残基、２’−アミノ化−シトシンヌクレオチド残基、２’−チオ化−ウラシルヌクレオチド残基、２’−チオ化−シトシンヌクレオチド残基等があげられる。 In the modified nucleotide residue, when the base is a pyrimidine base, for example, the 2'-position and / or the 4'-position of the sugar residue is preferably modified. Specific examples of the modified nucleotide residue include, for example, a 2′-methylated-uracil nucleotide residue and a 2′-methylated-cytosine nucleotide residue in which the deoxyribose residue or the 2 ′ position of the ribose residue is modified. 2'-fluorinated-uracil nucleotide residues, 2'-fluorinated-cytosine nucleotide residues, 2'-aminated-uracil nucleotide residues, 2'-aminated-cytosine nucleotide residues, 2'-thiolated -Uracyl nucleotide residue, 2'-thiolated-cytosine nucleotide residue and the like.
前記修飾ヌクレオチドの個数は、特に制限されず、例えば、前記ポリヌクレオチドにおいて、例えば、１〜１００個、１〜９０個、１〜８０個、１〜７０個である。また、前記ポリヌクレオチドを含む前記核酸分子の全長における前記修飾ヌクレオチドも、特に制限されず、例えば、１〜９１個または１〜７８個であり、好ましくは、前述の範囲と同様である。 The number of the modified nucleotides is not particularly limited, and is, for example, 1 to 100, 1 to 90, 1 to 80, or 1 to 70 in the polynucleotide. In addition, the modified nucleotides in the entire length of the nucleic acid molecule including the polynucleotide are not particularly limited, and are, for example, 1 to 91 or 1 to 78, and preferably the same as the above range.
本発明の核酸分子は、例えば、１もしくは数個の人工核酸モノマー残基を含んでもよい。前記「１もしくは数個」は、特に制限されず、例えば、前記ポリヌクレオチドにおいて、例えば、１〜１００個、１〜５０個、１〜３０個、１〜１０個である。前記人工核酸モノマー残基は、例えば、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）、ＥＮＡ（２’−Ｏ，４’−Ｃ−Ｅｔｈｙｌｅｎｅｂｒｉｄｇｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ）等があげられる。前記モノマー残基における核酸は、例えば、前述と同様である。 The nucleic acid molecule of the present invention may contain, for example, one or several artificial nucleic acid monomer residues. The “one or several” is not particularly limited, and is, for example, 1 to 100, 1 to 50, 1 to 30, or 1 to 10 in the polynucleotide. Examples of the artificial nucleic acid monomer residue include PNA (peptide nucleic acid), LNA (Locked Nucleic Acid), and ENA (2'-O, 4'-C-Ethylenebridged Nucleic Acids). The nucleic acid in the monomer residue is the same as described above, for example.
本発明の核酸分子は、例えば、ヌクレアーゼ耐性であることが好ましい。本発明の核酸分子は、ヌクレアーゼ耐性のため、例えば、前記修飾化ヌクレオチド残基および／または前記人工核酸モノマー残基を有することが好ましい。本発明の核酸分子は、ヌクレアーゼ耐性のため、例えば、５’末端または３’末端に、数１０ｋＤａのＰＥＧ（ポリエチレングリコール）またはデオキシチミジン等が結合してもよい。 The nucleic acid molecule of the present invention is preferably resistant to nucleases, for example. The nucleic acid molecule of the present invention preferably has, for example, the modified nucleotide residue and / or the artificial nucleic acid monomer residue for nuclease resistance. Since the nucleic acid molecule of the present invention is nuclease resistant, for example, tens of kDa PEG (polyethylene glycol) or deoxythymidine may be bound to the 5 'end or 3' end.
本発明の核酸分子は、例えば、さらに付加配列を有してもよい。前記付加配列は、例えば、前記核酸分子の５’末端および３’末端の少なくとも一方に結合していることが好ましく、より好ましくは３’末端である。前記付加配列は、特に制限されない。前記付加配列の長さは、特に制限されず、例えば、１〜２００塩基長、１〜５０塩基長、１〜２５塩基長、１８〜２４塩基長である。前記付加配列の構成単位は、例えば、ヌクレオチド残基であり、デオキシリボヌクレオチド残基およびリボヌクレオチド残基等があげられる。前記付加配列は、特に制限されず、例えば、デオキシリボヌクレオチド残基からなるＤＮＡ、リボヌクレオチド残基を含むＤＮＡ等のポリヌクレオチドがあげられる。前記付加配列の具体例として、例えば、ポリｄＴ、ポリｄＡ等があげられる。 The nucleic acid molecule of the present invention may further have an additional sequence, for example. The additional sequence is preferably bound to, for example, at least one of the 5 'end and the 3' end of the nucleic acid molecule, and more preferably the 3 'end. The additional sequence is not particularly limited. The length of the additional sequence is not particularly limited, and is, for example, 1 to 200 bases, 1 to 50 bases, 1 to 25 bases, or 18 to 24 bases. The structural unit of the additional sequence is, for example, a nucleotide residue, and examples thereof include a deoxyribonucleotide residue and a ribonucleotide residue. The additional sequence is not particularly limited, and examples thereof include polynucleotides such as DNA consisting of deoxyribonucleotide residues and DNA containing ribonucleotide residues. Specific examples of the additional sequence include poly dT and poly dA.
本発明の核酸分子は、例えば、担体に固定化して使用できる。前記本発明の核酸分子は、例えば、５’末端および３’末端のいずれかを固定化することが好ましく、より好ましくは３’末端である。本発明の核酸分子を固定化する場合、例えば、前記核酸分子は、前記担体に、直接的に固定化してもよいし、間接的に固定化してもよい。後者の場合、例えば、前記付加配列を介して固定化することが好ましい。 The nucleic acid molecule of the present invention can be used, for example, immobilized on a carrier. In the nucleic acid molecule of the present invention, for example, either the 5 'end or the 3' end is preferably immobilized, and more preferably the 3 'end. When immobilizing the nucleic acid molecule of the present invention, for example, the nucleic acid molecule may be immobilized directly or indirectly on the carrier. In the latter case, for example, it is preferable to immobilize via the additional sequence.
本発明の核酸分子の製造方法は、特に制限されず、例えば、化学合成を利用した核酸合成方法等、遺伝子工学的手法、公知の方法により合成できる。本発明の核酸分子は、例えば、いわゆるＳＥＬＥＸ法によっても得ることができる。この場合、ターゲットは、エビアレルゲンであるトロポミオシンが好ましい。 The method for producing the nucleic acid molecule of the present invention is not particularly limited, and can be synthesized by, for example, a genetic engineering technique such as a nucleic acid synthesis method using chemical synthesis or a known method. The nucleic acid molecule of the present invention can also be obtained, for example, by the so-called SELEX method. In this case, the target is preferably tropomyosin, which is a shrimp allergen.
本発明の核酸分子は、前述のように、前記エビアレルゲンに結合性を示す。このため、本発明の核酸分子の用途は、前記エビアレルゲンへの結合性を利用する用途であれば、特に制限されない。本発明の核酸分子は、例えば、前記エビアレルゲンに対する抗体に代えて、種々の方法に使用できる。 As described above, the nucleic acid molecule of the present invention exhibits binding property to the shrimp allergen. For this reason, the use of the nucleic acid molecule of the present invention is not particularly limited as long as it uses the binding property to the shrimp allergen. The nucleic acid molecule of the present invention can be used in various methods, for example, instead of the antibody against the shrimp allergen.
（２）エビアレルゲン分析用センサ
本発明のエビアレルゲン分析用センサは、前述のように、本発明のエビアレルゲン結合核酸分子を含むことを特徴とする。本発明のセンサは、前記本発明のエビアレルゲン結合核酸分子を含んでいればよく、その他の構成は、何ら制限されない。(2) Sensor for analyzing shrimp allergen The sensor for analyzing shrimp allergen of the present invention includes the shrimp allergen-binding nucleic acid molecule of the present invention as described above. The sensor of the present invention only needs to contain the above-described shrimp allergen-binding nucleic acid molecule of the present invention, and other configurations are not limited at all.
本発明のセンサは、例えば、前記エビアレルゲン結合核酸分子に前記エビアレルゲンが結合した状態で、活性型となり、前記エビアレルゲン結合核酸分子に前記エビアレルゲンが未結合の状態で、不活性型となる、前記結合を検出する結合検出用核酸分子を、さらに含んでもよい。本発明のセンサは、前記結合検出用核酸分子を含む場合、前記結合検出用核酸分子が活性型であるか不活性型であるかによって、前記エビアレルゲン結合核酸分子への前記エビアレルゲンの結合の有無を確認でき、それによって、前記エビアレルゲンの有無を分析することができる。 The sensor of the present invention becomes active, for example, when the shrimp allergen binds to the shrimp allergen-binding nucleic acid molecule, and becomes inactive when the shrimp allergen binds to the shrimp allergen-binding nucleic acid molecule. Further, a nucleic acid molecule for detecting binding that detects the binding may be further included. When the sensor of the present invention includes the nucleic acid molecule for binding detection, the binding of the shrimp allergen to the shrimp allergen-binding nucleic acid molecule depends on whether the nucleic acid molecule for binding detection is an active type or an inactive type. The presence or absence can be confirmed, thereby analyzing the presence or absence of the shrimp allergen.
前記結合検出用核酸分子としては、例えば、Ｇカルテット構造を形成する核酸分子があげられる。前記Ｇカルテッド構造を形成する核酸分子は、例えば、Ｇカルテッド構造を形成した状態が、活性型であり、Ｇカルテッド構造を非形成の状態が、不活性型である。 Examples of the binding detection nucleic acid molecule include a nucleic acid molecule that forms a G quartet structure. The nucleic acid molecule that forms the G-culted structure is, for example, an active type when a G-culted structure is formed, and an inactive state when a G-culted structure is not formed.
前記Ｇカルテット構造を形成する核酸分子は、例えば、ＤＮＡｚｙｍｅまたはＲＮＡｚｙｍｅ等があげられ、好ましくはＤＮＡｚｙｍｅである。 Examples of the nucleic acid molecule forming the G quartet structure include DNAzyme and RNAzyme, and DNAzyme is preferable.
Ｇカルテッド構造を形成した活性型ＤＮＡｚｙｍｅは、例えば、酸化還元反応を触媒するペルオキシダーゼ様の活性を示す。このため、本発明のセンサがＤＮＡｚｙｍｅを有する場合、前記ＤＮＡｚｙｍｅの触媒活性を検出することによって、前記エビアレルゲン結合核酸分子への前記エビアレルゲンの結合の有無または結合量を分析することができる。 An active DNAzyme having a G-culted structure exhibits, for example, a peroxidase-like activity that catalyzes a redox reaction. Therefore, when the sensor of the present invention has DNAzyme, the presence or amount of the shrimp allergen bound to the shrimp allergen-binding nucleic acid molecule can be analyzed by detecting the catalytic activity of the DNAzyme.
この場合、本発明のセンサは、例えば、ポルフィリンを共存させることが好ましい。前記ポルフィリンは、特に制限されず、例えば、無置換体のポルフィリン、その誘導体があげられる。前記誘導体は、例えば、置換体のポルフィリンおよび金属元素と錯体を形成した金属ポルフィリン等があげられる。前記置換体のポルフィリンは、例えば、Ｎ−メチルメソポルフィリン等があげられる。前記金属ポルフィリンは、例えば、三価鉄錯体であるヘミン等があげられる。前記ポルフィリンは、例えば、前記金属ポルフィリンが好ましく、より好ましくはヘミンである。 In this case, for example, it is preferable that the sensor of the present invention coexists with porphyrin. The porphyrin is not particularly limited, and examples thereof include unsubstituted porphyrin and derivatives thereof. Examples of the derivatives include substituted porphyrins and metal porphyrins complexed with metal elements. Examples of the substituted porphyrin include N-methylmesoporphyrin. Examples of the metal porphyrin include hemin, which is a trivalent iron complex. The porphyrin is, for example, preferably the metal porphyrin, more preferably hemin.
また、Ｇカルテッド構造を形成した活性型のＤＮＡｚｙｍｅは、例えば、ポルフィリンと複合体を形成することで、蛍光を生じる。このため、本発明のセンサがＤＮＡｚｙｍｅを有する場合、前記ポルフィリンを共存させ、前記ＤＮＡｚｙｍｅと前記ポルフィリンとの複合体形成による蛍光を検出することによって、前記エビアレルゲン結合核酸分子への前記エビアレルゲンの結合の有無または結合量を分析することができる。 In addition, active DNAzyme having a G-culted structure generates fluorescence by forming a complex with porphyrin, for example. Therefore, when the sensor of the present invention has DNAzyme, the porphyrin is allowed to coexist, and the fluorescence due to the complex formation of the DNAzyme and the porphyrin is detected, thereby binding the shrimp allergen to the shrimp allergen-binding nucleic acid molecule. The presence or absence or the amount of binding can be analyzed.
前記ポルフィリンは、特に制限されず、例えば、Ｎ−メチルメソポルフィリン（ＮＭＭ）、Ｚｎ−ＤＩＧＰ、ＺｎＰＰ９およびＴＭＰｙＰ等が好ましい。 The porphyrin is not particularly limited, and for example, N-methylmesoporphyrin (NMM), Zn-DIGP, ZnPP9, and TMPyP are preferable.
本発明のセンサは、例えば、さらに標識物質を有してもよい。前記標識物質は、例えば、前記核酸分子の５’末端および３’末端の少なくとも一方に結合していることが好ましく、より好ましくは５’末端である。前記標識物質は、特に制限されず、例えば、蛍光物質、色素、同位体、酵素等があげられる。前記蛍光物質は、例えば、ピレン、ＴＡＭＲＡ、フルオレセイン、Ｃｙ３色素、Ｃｙ５色素、ＦＡＭ色素、ローダミン色素、テキサスレッド色素、ＪＯＥ、ＭＡＸ、ＨＥＸ、ＴＹＥ等の蛍光団があげられ、前記色素は、例えば、Ａｌｅｘａ４８８、Ａｌｅｘａ６４７等のＡｌｅｘａ色素等があげられる。 For example, the sensor of the present invention may further include a labeling substance. The labeling substance is preferably bound to, for example, at least one of the 5 'end and the 3' end of the nucleic acid molecule, and more preferably the 5 'end. The labeling substance is not particularly limited, and examples thereof include fluorescent substances, dyes, isotopes and enzymes. Examples of the fluorescent substance include pyrene, TAMRA, fluorescein, Cy3 dye, Cy5 dye, FAM dye, rhodamine dye, Texas red dye, JOE, MAX, HEX, TYE and the like, and the dye includes, for example, And Alexa dyes such as Alexa 488 and Alexa 647.
前記標識物質は、例えば、前記核酸分子に直接的に連結してもよいし、リンカーを介して、間接的に連結してもよい。前記リンカーは、特に制限されず、例えば、前述の例示を援用できる。 The labeling substance may be linked directly to the nucleic acid molecule or indirectly via a linker, for example. The linker is not particularly limited, and for example, the above examples can be used.
（３）分析方法
本発明の分析方法は、前述のように、エビアレルゲンの分析方法であって、試料と前記本発明のエビアレルゲン結合核酸分子とを接触させ、前記試料中のエビアレルゲンと前記核酸分子とを結合させることにより、前記試料中のエビアレルゲンを検出する工程を含むことを特徴とする。本発明の分析方法は、前記本発明の核酸分子を使用することが特徴であって、その他の工程および条件等は、特に制限されない。また、本発明の分析方法は、前記本発明の核酸分子として、前記本発明のエビアレルゲン分析用センサを使用してもよい。(3) Analysis method As described above, the analysis method of the present invention is a method for analyzing shrimp allergen, wherein the sample is brought into contact with the shrimp allergen-binding nucleic acid molecule of the present invention, and the shrimp allergen in the sample and the aforementioned It comprises a step of detecting shrimp allergen in the sample by binding with a nucleic acid molecule. The analysis method of the present invention is characterized by using the nucleic acid molecule of the present invention, and other steps and conditions are not particularly limited. In the analysis method of the present invention, the sensor for analyzing shrimp allergen of the present invention may be used as the nucleic acid molecule of the present invention.
本発明によれば、前記本発明の核酸分子が、エビアレルゲンに特異的に結合することから、例えば、エビアレルゲンと前記核酸分子との結合を検出することによって、試料中のエビアレルゲンを特異的に検出可能である。具体的には、例えば、試料中のエビアレルゲンの有無またはエビアレルゲンの量を分析可能であることから、定性または定量も可能といえる。 According to the present invention, since the nucleic acid molecule of the present invention specifically binds to a shrimp allergen, for example, by detecting the binding between the shrimp allergen and the nucleic acid molecule, the shrimp allergen in the sample is specifically detected. Can be detected. Specifically, for example, since the presence or absence of shrimp allergen in the sample or the amount of shrimp allergen can be analyzed, it can be said that qualitative or quantitative determination is also possible.
本発明において、前記試料は、特に制限されない。前記試料は、例えば、食品、食品原料、食品添加物等があげられる。また、前記試料は、例えば、食品加工場または調理場等における付着物、洗浄後の洗浄液等があげられる。 In the present invention, the sample is not particularly limited. Examples of the sample include foods, food materials, food additives, and the like. Examples of the sample include a deposit in a food processing shop or a cooking place, a cleaning liquid after cleaning, and the like.
前記試料は、例えば、液体試料でもよいし、固体試料でもよい。前記試料は、例えば、前記核酸分子と接触させ易く、取扱いが簡便であることから、液体試料が好ましい。前記固体試料の場合、例えば、溶媒を用いて、混合液、抽出液、溶解液等を調製し、これを使用してもよい。前記溶媒は、特に制限されず、例えば、水、生理食塩水、緩衝液等があげられる。 The sample may be, for example, a liquid sample or a solid sample. For example, the sample is preferably a liquid sample because it is easy to contact with the nucleic acid molecule and is easy to handle. In the case of the solid sample, for example, a mixed solution, an extract, a dissolved solution, and the like may be prepared using a solvent and used. The solvent is not particularly limited, and examples thereof include water, physiological saline, and buffer solution.
前記検出工程は、例えば、前記試料と前記核酸分子とを接触させて、前記試料中のエビアレルゲンと前記核酸分子とを結合させる接触工程と、前記エビアレルゲンと前記核酸分子との結合を検出する結合検出工程とを含む。また、前記検出工程は、例えば、さらに、前記結合検出工程の結果に基づいて、前記試料中のエビアレルゲンの有無または量を分析する工程を含む。 In the detection step, for example, a contact step in which the sample and the nucleic acid molecule are brought into contact with each other and a shrimp allergen in the sample is bound to the nucleic acid molecule, and a binding between the shrimp allergen and the nucleic acid molecule is detected. A binding detection step. The detection step further includes, for example, a step of analyzing the presence or amount of shrimp allergen in the sample based on the result of the binding detection step.
前記接触工程において、前記試料と前記核酸分子との接触方法は、特に制限されない。前記試料と前記核酸分子との接触は、例えば、液体中で行われることが好ましい。前記液体は、特に制限されず、例えば、水、生理食塩水、緩衝液等があげられる。 In the contacting step, the method for contacting the sample and the nucleic acid molecule is not particularly limited. The contact between the sample and the nucleic acid molecule is preferably performed in a liquid, for example. The liquid is not particularly limited, and examples thereof include water, physiological saline, and buffer solution.
前記接触工程において、前記試料と前記核酸分子との接触条件は、特に制限されない。接触温度は、例えば、４〜３７℃、１８〜２５℃であり、接触時間は、例えば、１０〜１２０分、３０〜６０分である。 In the contacting step, the contact condition between the sample and the nucleic acid molecule is not particularly limited. The contact temperature is, for example, 4 to 37 ° C. and 18 to 25 ° C., and the contact time is, for example, 10 to 120 minutes and 30 to 60 minutes.
前記接触工程において、前記核酸分子は、例えば、担体に固定化された固定化核酸分子でもよいし、未固定の遊離した核酸分子でもよい。後者の場合、例えば、容器内で、前記試料と接触させる。前記核酸分子は、例えば、取扱性に優れることから、前記固定化核酸分子が好ましい。前記担体は、特に制限されず、例えば、基板、ビーズ、容器等があげられ、前記容器は、例えば、マイクロプレート、チューブ等があげられる。前記核酸分子の固定化は、例えば、前述の通りである。 In the contacting step, the nucleic acid molecule may be, for example, an immobilized nucleic acid molecule immobilized on a carrier or an unimmobilized free nucleic acid molecule. In the latter case, for example, the sample is contacted in a container. The nucleic acid molecule is preferably, for example, the immobilized nucleic acid molecule because of its excellent handleability. The carrier is not particularly limited, and examples thereof include a substrate, a bead, and a container. Examples of the container include a microplate and a tube. The nucleic acid molecule is immobilized as described above, for example.
前記結合検出工程は、前述のように、前記試料中のエビアレルゲンと前記核酸分子との結合を検出する工程である。前記両者の結合の有無を検出することによって、例えば、前記試料中のエビアレルゲンの有無を分析（定性）でき、また、前記両者の結合の程度（結合量）を検出することによって、例えば、前記試料中のエビアレルゲンの量を分析（定量）できる。 As described above, the binding detection step is a step of detecting the binding between the shrimp allergen in the sample and the nucleic acid molecule. By detecting the presence or absence of binding between the two, for example, the presence or absence of shrimp allergen in the sample can be analyzed (qualitative), and by detecting the degree of binding (binding amount) between the two, for example, The amount of shrimp allergen in the sample can be analyzed (quantified).
そして、前記エビアレルゲンと前記核酸分子との結合が検出できなかった場合は、前記試料中にエビアレルゲンは存在しないと判断でき、前記結合が検出された場合は、前記試料中にエビアレルゲンが存在すると判断できる。 If the binding between the shrimp allergen and the nucleic acid molecule cannot be detected, it can be determined that there is no shrimp allergen in the sample. If the binding is detected, the shrimp allergen is present in the sample. It can be judged.
前記エビアレルゲンと前記核酸分子との結合の分析方法は、特に制限されない。前記方法は、例えば、物質間の結合を検出する従来公知の方法が採用でき、具体例として、前述のＳＰＲ、蛍光偏光法等があげられる。また、前記結合は、例えば、前記エビアレルゲンと前記核酸分子との複合体の検出でもよい。 A method for analyzing the binding between the shrimp allergen and the nucleic acid molecule is not particularly limited. As the method, for example, a conventionally known method for detecting the binding between substances can be adopted, and specific examples include the above-mentioned SPR, fluorescence polarization method and the like. The binding may be, for example, detection of a complex of the shrimp allergen and the nucleic acid molecule.
前記蛍光偏光法による前記エビアレルゲンと前記核酸分子との結合の検出は、例えば、以下のようにして行うことができる。 Detection of the binding between the shrimp allergen and the nucleic acid molecule by the fluorescence polarization method can be performed, for example, as follows.
前記蛍光偏光法は、一般に、偏光励起光を前記標識物質に照射した際、前記標識物質から発せられる蛍光が、前記標識物質で標識された分子の分子量に応じて異なった偏光度を示すという特性に基づく測定方法である。本発明においては、例えば、前記標識物質で標識化した前記核酸分子（標識化核酸分子）を使用することで、前記蛍光偏光法により前記エビアレルゲンと前記核酸分子との結合を検出することができる。具体的には、前記標識化核酸分子は、エビアレルゲンと未結合の状態と、エビアレルゲンと結合した状態とを比較した場合、前者は、相対的に分子量が小さいため、相対的に偏光度が低く、一方、後者は、相対的に分子量が大きいため、相対的に偏光度が高い。このため、例えば、試料と接触させる前の前記標識化核酸分子の偏光度と、前記試料と接触させた後の前記標識化核酸分子の前記偏光度とを比較することで、エビアレルゲンと前記標識化核酸分子との結合を検出できる。また、エビアレルゲンと未結合の前記標識化核酸分子およびエビアレルゲンと結合した前記標識化核酸分子の少なくとも一方の偏光度を評価基準として、前記試料と接触させた後の前記標識化核酸分子の偏光度を評価することでも、エビアレルゲンと前記標識化核酸分子との結合を検出できる。 The fluorescence polarization method is generally characterized in that when the labeling substance is irradiated with polarized excitation light, the fluorescence emitted from the labeling substance exhibits different degrees of polarization depending on the molecular weight of the molecule labeled with the labeling substance. Is a measurement method based on In the present invention, for example, by using the nucleic acid molecule labeled with the labeling substance (labeled nucleic acid molecule), the binding between the shrimp allergen and the nucleic acid molecule can be detected by the fluorescence polarization method. . Specifically, when the labeled nucleic acid molecule is compared with a state in which it is not bound to shrimp allergen and a state in which it is bound to shrimp allergen, the former has a relatively low molecular weight, and therefore has a relatively low degree of polarization. On the other hand, the latter has a relatively high degree of polarization due to its relatively high molecular weight. Therefore, for example, by comparing the degree of polarization of the labeled nucleic acid molecule before contact with the sample and the degree of polarization of the labeled nucleic acid molecule after contact with the sample, the shrimp allergen and the label Binding to the activated nucleic acid molecule can be detected. Further, the polarization of the labeled nucleic acid molecule after contact with the sample is evaluated using the polarization degree of at least one of the labeled nucleic acid molecule unbound to shrimp allergen and the labeled nucleic acid molecule bound to shrimp allergen as an evaluation standard. By evaluating the degree, the binding between the shrimp allergen and the labeled nucleic acid molecule can be detected.
前記蛍光偏光法によれば、例えば、前記本発明の核酸分子を、前記標識物質で標識化するのみで、センサとして容易に使用できる。また、前記標識物質は、その種類によって検出波長が異なるため、例えば、試料の種類に応じて前記標識物質を選択することで、前記試料由来の蛍光の影響を低減することもできる。 According to the fluorescence polarization method, for example, the nucleic acid molecule of the present invention can be easily used as a sensor only by labeling with the labeling substance. In addition, since the detection wavelength of the labeling substance varies depending on the type thereof, for example, the influence of the fluorescence derived from the sample can be reduced by selecting the labeling substance according to the type of the sample.
前記標識化核酸分子は、例えば、前記本発明の核酸分子が前記標識物質で標識化されていればよく、その標識方法は、特に制限されない。 The labeled nucleic acid molecule is not particularly limited as long as the nucleic acid molecule of the present invention is labeled with the labeling substance, for example.
前記標識化核酸分子としては、例えば、前記本発明の核酸分子に前記標識物質が連結した形態があげられる。この形態は、例えば、前述の記載が援用でき、前記本発明の核酸分子に、前記標識物質が直接的に連結してもよいし、前述のようにリンカー等を介して前記標識物質が間接的に連結してもよい。前記リンカーの長さは、特に制限されず、例えば、０〜１０塩基長、０〜７塩基長、０〜５塩基長である。前記標識物質は、例えば、前記本発明の核酸分子のいずれの部位に連結されてもよく、具体例としては、５’末端および３’末端があげられ、両末端に連結してもよいし、いずれか一方の末端に連結してもよく、好ましくは、５’末端である。 Examples of the labeled nucleic acid molecule include a form in which the labeling substance is linked to the nucleic acid molecule of the present invention. For example, the above description can be used for this form, and the labeling substance may be directly linked to the nucleic acid molecule of the present invention, or the labeling substance is indirectly linked via a linker or the like as described above. You may connect to. The length in particular of the said linker is not restrict | limited, For example, it is 0-10 base length, 0-7 base length, 0-5 base length. The labeling substance may be linked to, for example, any part of the nucleic acid molecule of the present invention, and specific examples include 5 ′ end and 3 ′ end, and may be linked to both ends. It may be linked to any one of the ends, preferably the 5 ′ end.
前記標識化核酸分子としては、この他に、例えば、前記本発明の核酸分子と、これに相補的であって且つ標識物質が連結した相補鎖（以下、「標識化相補鎖」ともいう）とを含み、前記核酸分子と前記標識化相補鎖とがハイブリダイズしたハイブリッド分子があげられる。 Other examples of the labeled nucleic acid molecule include, for example, the nucleic acid molecule of the present invention and a complementary strand that is complementary to the nucleic acid molecule (hereinafter also referred to as “labeled complementary strand”). And a hybrid molecule in which the nucleic acid molecule and the labeled complementary strand are hybridized.
前記相補鎖は、例えば、前記本発明の核酸分子の一部に相補的な配列を有していればよく、前記相補的な配列のみから構成されてもよいし、前記相補的な配列を含んでもよい。前記相補鎖は、前記本発明の核酸分子のどの領域に対して相補的でもよく、好ましくは、５’末端領域または３’末端領域に相補的である。また、例えば、前記本発明の核酸分子が、その５’末端または３’末端にリンカーを有し、前記相補的な配列は、前記リンカーに相補的であることが好ましい。前記リンカーの長さは、特に制限されず、例えば、１０〜３０塩基長、１５〜２５塩基長、１８〜２４塩基長である。前記相補鎖の長さは、特に制限されず、例えば、１０〜３０塩基長、１５〜２５塩基長、１８〜２４塩基長である。 The complementary strand only needs to have a sequence complementary to a part of the nucleic acid molecule of the present invention, for example, may be composed of only the complementary sequence, or includes the complementary sequence. But you can. The complementary strand may be complementary to any region of the nucleic acid molecule of the present invention, and is preferably complementary to the 5 'end region or 3' end region. In addition, for example, the nucleic acid molecule of the present invention preferably has a linker at the 5 'end or 3' end, and the complementary sequence is preferably complementary to the linker. The length in particular of the said linker is not restrict | limited, For example, it is 10-30 base length, 15-25 base length, and 18-24 base length. The length of the complementary strand is not particularly limited, and is, for example, 10 to 30 bases long, 15 to 25 bases long, or 18 to 24 bases long.
前記標識化相補鎖において、前記標識物質は、例えば、前記相補鎖のいずれの部位に連結されてもよく、具体例としては、５’末端および３’末端があげられ、両末端に連結してもよいし、いずれか一方の末端に連結してもよい。前記標識化相補鎖が、前記本発明の核酸分子の３’末端領域に相補的な場合、前記標識物質は、前記相補鎖の５’末端に連結することが好ましく、前記標識化相補鎖が、前記本発明の核酸分子の５’末端領域に相補的な場合、前記標識物質は、前記相補鎖の３’末端に連結することが好ましい。 In the labeled complementary strand, the labeling substance may be linked to, for example, any part of the complementary strand, and specific examples include the 5 ′ end and the 3 ′ end. Alternatively, it may be linked to either one of the ends. When the labeled complementary strand is complementary to the 3 ′ end region of the nucleic acid molecule of the present invention, the labeling substance is preferably linked to the 5 ′ end of the complementary strand, and the labeled complementary strand is When complementary to the 5 ′ end region of the nucleic acid molecule of the present invention, the labeling substance is preferably linked to the 3 ′ end of the complementary strand.
前記標識物質は、特に制限されず、前述した例示を援用でき、中でも前記蛍光物質および前記色素が好ましい。 The labeling substance is not particularly limited, and the examples described above can be used, and among these, the fluorescent substance and the dye are preferable.
前記蛍光偏光法を採用する場合、本発明の分析方法は、例えば、前記試料と前記標識化核酸分子とを接触させ、前記試料中のエビアレルゲンと前記標識化核酸分子とを結合させる接触工程と、前記標識化核酸分子に偏光励起光を照射して、前記標識化核酸分子の偏光度を測定する測定工程と、前記測定工程における測定結果と評価基準とを比較し、エビアレルゲンと前記標識化核酸分子との結合を検出する工程を検出する検出工程を含むことが好ましい。 When employing the fluorescence polarization method, the analysis method of the present invention includes, for example, a contact step in which the sample and the labeled nucleic acid molecule are brought into contact with each other, and a shrimp allergen in the sample and the labeled nucleic acid molecule are bound together. The labeling nucleic acid molecule is irradiated with polarized excitation light to measure the degree of polarization of the labeled nucleic acid molecule, and the measurement result in the measurement step and the evaluation standard are compared, and the shrimp allergen and the labeling are compared. It is preferable to include a detection step of detecting a step of detecting binding with the nucleic acid molecule.
前記測定工程において、前記偏光励起光の波長および前記偏光度の検出波長は、特に制限されず、例えば、前記標識物質の種類に応じて適宜設定できる。具体例として、前記標識物質がＡｌｅｘａ６４７の場合、前記偏光励起光の波長は、例えば、６２０〜６８０ｎｍであり、偏光度の検出波長は、例えば、６６０〜８００ｎｍである。前記偏光励起光の照射時間は、特に制限されず、例えば、１ナノ〜５ナノ秒があげられる。 In the measurement step, the wavelength of the polarized excitation light and the detection wavelength of the polarization degree are not particularly limited, and can be appropriately set according to, for example, the type of the labeling substance. As a specific example, when the labeling substance is Alexa647, the wavelength of the polarized excitation light is, for example, 620 to 680 nm, and the detection wavelength of the polarization degree is, for example, 660 to 800 nm. The irradiation time of the polarized excitation light is not particularly limited, and examples thereof include 1 nanosecond to 5 nanoseconds.
前記検出工程において、前記評価基準は、例えば、予め決定してもよいし、測定ごとに決定してもよい。前記評価基準としては、例えば、エビアレルゲン未結合の基準、エビアレルゲン結合の基準が設定できる。前者の基準は、例えば、エビアレルゲンが結合していない前記標識化核酸分子のみの偏光度であり、後者の基準は、例えば、エビアレルゲンが結合した前記標識化核酸分子の偏光度である。 In the detection step, the evaluation criterion may be determined in advance or may be determined for each measurement, for example. As the evaluation criterion, for example, a criterion for unshrimp allergen binding or a criterion for shrimp allergen binding can be set. The former criterion is, for example, the degree of polarization of only the labeled nucleic acid molecule to which no shrimp allergen is bound, and the latter criterion is, for example, the degree of polarization of the labeled nucleic acid molecule to which shrimp allergen is bound.
前者の基準を用いる場合は、例えば、前記測定工程における測定値が、前記基準よりも高ければ、エビアレルゲンが存在すると判断でき、また、前記基準よりも相対的に高ければ、相対的に多くのエビアレルゲンが存在すると判断できる。他方、前記測定工程における測定値が、前記基準と同程度または低ければ、エビアレルゲンが存在しないと判断できる。前者の基準は、例えば、前記接触工程前の前記標識化核酸分子の偏光度でもよい。 When using the former standard, for example, if the measured value in the measurement step is higher than the standard, it can be determined that shrimp allergen is present, and if the measured value is relatively higher than the standard, relatively many It can be determined that shrimp allergen is present. On the other hand, if the measurement value in the measurement step is about the same as or lower than the reference, it can be determined that there is no shrimp allergen. The former criterion may be, for example, the degree of polarization of the labeled nucleic acid molecule before the contacting step.
また、後者の基準を用いる場合は、例えば、前記測定工程における測定値が、前記基準よりも低ければ、エビアレルゲンが存在しないと判断できる。他方、前記測定工程における測定値が、前記基準と同程度または高ければ、エビアレルゲンが存在すると判断でき、また、前記基準よりも相対的に高ければ、相対的に多くのエビアレルゲンが存在すると判断できる。 Moreover, when using the latter reference | standard, if the measured value in the said measurement process is lower than the said reference | standard, it can be judged that a shrimp allergen does not exist. On the other hand, if the measurement value in the measurement step is the same or higher than the reference, it can be determined that there is a shrimp allergen, and if it is relatively higher than the reference, it is determined that a relatively large amount of shrimp allergen is present. it can.
また、前記基準は、エビアレルゲンの量と偏光度との相関関係であってもよい。例えば、複数の既知濃度のエビアレルゲンと所定量の前記標識化核酸分子とを接触させ、各濃度のエビアレルゲンに結合した前記標識化核酸分子の偏光度を測定することにより、前記相関関係を示す相関式が得られる。そして、この相関式と、前記測定工程における測定値とから、前記試料におけるエビアレルゲンの量を判断することができる。 The reference may be a correlation between the amount of shrimp allergen and the degree of polarization. For example, the correlation is shown by contacting a plurality of known concentrations of shrimp allergen with a predetermined amount of the labeled nucleic acid molecule and measuring the degree of polarization of the labeled nucleic acid molecule bound to each concentration of shrimp allergen. A correlation equation is obtained. The amount of shrimp allergen in the sample can be determined from the correlation formula and the measured value in the measuring step.
また、本発明の核酸分子として、前記本発明のエビアレルゲン分析用センサを使用する場合、例えば、酸化還元反応の検出または蛍光発生の検出によって、前記エビアレルゲンの検出を行うことができる。 When the sensor for analyzing shrimp allergen of the present invention is used as the nucleic acid molecule of the present invention, the shrimp allergen can be detected by, for example, detecting a redox reaction or detecting fluorescence.
前述のように、前記本発明のセンサが、前記結合検出用核酸分子としてＧカルテッド構造を形成するＤＮＡｚｙｍｅを有する場合、前記エビアレルゲン結合核酸分子への前記エビアレルゲンの結合によって、前記ＤＮＡｚｙｍｅは、Ｇカルテッド構造を形成し、ペルオキシダーゼ様の酸化還元反応の触媒活性を示す活性型となる。このため、前記酸化還元反応を検出することによって、前記エビアレルゲン結合核酸分子への前記エビアレルゲンの結合を検出できる。この場合、例えば、前記酸化還元反応の基質を併用することが好ましい。 As described above, when the sensor of the present invention has a DNAzyme that forms a G-culted structure as the nucleic acid molecule for detection of binding, the DNAzyme is G by the binding of the shrimp allergen to the shrimp allergen binding nucleic acid molecule. It forms a culted structure and becomes an active form showing the catalytic activity of a peroxidase-like redox reaction. Therefore, by detecting the oxidation-reduction reaction, the binding of the shrimp allergen to the shrimp allergen-binding nucleic acid molecule can be detected. In this case, for example, it is preferable to use a substrate for the oxidation-reduction reaction in combination.
前記基質は、特に制限されず、例えば、３，３’，５，５’−Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ（ＴＭＢ）、１，２−Ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ（ＯＰＤ）、２，２’−Ａｚｉｎｏｂｉｓ（３−ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｉｎｅ−６−ｓｕｌｆｏｎｉｃ Ａｃｉｄ Ａｍｍｏｎｉｕｍ Ｓａｌｔ（ＡＢＴＳ）、３，３’−Ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ（ＤＡＢ）、３，３’−Ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ Ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ Ｈｙｄｒａｔｅ（ＤＡＢ４ＨＣｌ）、３−Ａｍｉｎｏ−９−ｅｔｈｙｌｃａｒｂａｚｏｌｅ（ＡＥＣ）、４−Ｃｈｌｏｒｏ−１−ｎａｐｈｔｈｏｌ（４Ｃ１Ｎ）、２，４，６−Ｔｒｉｂｒｏｍｏ−３−ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｉｃ Ａｃｉｄ、２，４−Ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｌ、４−Ａｍｉｎｏａｎｔｉｐｙｒｉｎｅ、４−Ａｍｉｎｏａｎｔｉｐｙｒｉｎｅ Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ、ルミノール等があげられる。 The substrate is not particularly limited, and examples thereof include 3,3 ′, 5,5′-tetramethylbenzidine (TMB), 1,2-phenylenediamine (OPD), and 2,2′-Azinobis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic Acid. Ammonium Salt (ABTS), 3,3′-Diaminobenzodinine (DAB), 3,3′-Diaminobenzoidine Tetrahhydrochloride Hydrate (DAB4HCl), 3-Amino-9-ethylcarbazole (AEC), CEC4 2,4,6-Tribromo-3-hydroxybenzoic Acid, 2,4- ichlorophenol, 4-Aminoantipyrine, 4-Aminoantipyrine Hydrochloride, luminol and the like.
また、前記本発明のセンサが、前記結合検出用核酸分子としてＧカルテッド構造を形成するＤＮＡｚｙｍｅを有する場合、前記エビアレルゲン結合核酸分子への前記エビアレルゲンの結合によって、前記ＤＮＡｚｙｍｅは、Ｇカルテット構造を形成し、ポルフィリンとの複合体を形成することで、蛍光を発生する。このため、前記蛍光を検出することによって、前記エビアレルゲン結合核酸分子へのエビアレルゲンを検出できる。 Further, when the sensor of the present invention has a DNAzyme that forms a G-culted structure as the binding detection nucleic acid molecule, the DNAzyme has a G quartet structure due to the binding of the shrimp allergen to the shrimp allergen-binding nucleic acid molecule. Fluorescence is generated by forming a complex with porphyrin. For this reason, the shrimp allergen to the shrimp allergen-binding nucleic acid molecule can be detected by detecting the fluorescence.
（４）検出キット
本発明の検出キットは、前記本発明のエビアレルゲン結合核酸分子を含むことを特徴とする。本発明の検出キットは、前記本発明の核酸分子を含んでいればよく、その他の構成は何ら制限されない。本発明の検出キットを使用すれば、前述のように、例えば、前記エビアレルゲンの検出等を行うことができる。(4) Detection kit The detection kit of the present invention comprises the above-described shrimp allergen-binding nucleic acid molecule of the present invention. The detection kit of the present invention is not limited as long as it contains the nucleic acid molecule of the present invention. If the detection kit of the present invention is used, for example, the detection of the shrimp allergen can be performed as described above.
本発明の検出キットは、例えば、前記本発明の核酸分子として、前記本発明のセンサを含んでもよい。また、前記本発明の検出キットは、例えば、前記本発明の核酸分子の他に、その他の構成要素を含んでもよい。前記構成要素は、例えば、前記担体、前記ポルフィリン、緩衝液、使用説明書等があげられる。 The detection kit of the present invention may include, for example, the sensor of the present invention as the nucleic acid molecule of the present invention. In addition, the detection kit of the present invention may include other components in addition to the nucleic acid molecule of the present invention, for example. Examples of the component include the carrier, the porphyrin, a buffer solution, and instructions for use.
つぎに、本発明の実施例について説明する。ただし、本発明は、下記実施例により制限されない。市販の試薬は、特に示さない限り、それらのプロトコールに基づいて使用した。 Next, examples of the present invention will be described. However, the present invention is not limited by the following examples. Commercially available reagents were used based on their protocol unless otherwise indicated.
［実施例１］
各アプタマーについて、エビアレルゲンに対する結合能および動態パラメータを確認した。[Example 1]
For each aptamer, the binding ability and kinetic parameters to shrimp allergen were confirmed.
（１）アプタマー
下記ポリヌクレオチドを合成し、実施例のアプタマーとした。
(1) Aptamer The following polynucleotides were synthesized and used as aptamers in the examples.
前記アプタマーは、その末端に、２４塩基長のポリデオキシアデニン（ポリｄＡ）を付加し、ポリｄＡ付加アプタマーとして、後述するＳＰＲに使用した。前記ポリｄＡは、５’末端に付加した。 The aptamer was added with polydeoxyadenine (poly dA) having a length of 24 bases at its end, and used as a poly dA addition aptamer in SPR described later. The poly dA was added to the 5 'end.
（２）試料
トロポミオシン（Ｍｅｔ ｅ １）にヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）付加した状態で、発現させ、これを試料として、以下の試験に使用した。前記トロポミオシンをコードする遺伝子の全長塩基配列および前記タンパク質の全長アミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｑ２５４５６に登録された通りとし、前記Ｈｉｓタグは、１０個のＨｉｓが連続したペプチドとして、前記トロポミオシンのＮ末端に付加した。(2) Sample It was expressed in a state where histidine tag (His tag) was added to tropomyosin (Met e 1), and this was used as a sample for the following tests. The full-length base sequence of the gene encoding tropomyosin and the full-length amino acid sequence of the protein are as registered in UniProt accession number Q25456, and the His tag is a peptide in which 10 Hiss are continuous, and N of the tropomyosin. Added to the end.
（３）ＳＰＲによる結合能の解析
結合能の解析には、ProteON XPR36（BioRad社）を、その使用説明書にしたがって使用した。(3) Analysis of binding ability by SPR For analysis of binding ability, ProteON XPR36 (BioRad) was used according to the instruction manual.
まず、前記ProteON専用のセンサーチップとして、ストレプトアビジンが固定化されたチップ（商品名 ProteOn NLC Sensor Chip、BioRad社）を、前記ProteON XPR36にセットした。前記センサーチップのフローセルに、超純水（ＤＤＷ）を用いて、５μｍｏｌ／Ｌのビオチン化ポリｄＴをインジェクションし、シグナル強度（ＲＵ：Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｕｎｉｔ）が約９００ＲＵになるまで結合させた。前記ビオチン化ポリｄＴは、２４塩基長のデオキシチミジンの５’末端または３’末端をビオチン化して調製した。そして、前記チップの前記フローセルに、ＳＰＲバッファーを用いて、１μｍｏｌ／Ｌの前記ポリｄＡ付加アプタマーを、流速２５μＬ／ｍｉｎで８０秒間インジェクションし、シグナル強度が約８００ＲＵになるまで結合させた。この結果を、アプタマーのセンサーチップへの固層化量を示すシグナルとして、アプタマー固層化測定値（Ａ）という。続いて、前記試料を、ＳＰＲバッファーを用いて、流速５０μＬ／ｍｉｎで１２０秒間インジェクションし、引き続き、同じ条件で、ＳＰＲバッファーを流して洗浄を行った。前記試料のインジェクションおよび前記ＳＰＲバッファーによる洗浄に並行して、シグナル強度の測定を行った。この結果を、前記アプタマーとタンパクの結合量を示すシグナルとして、タンパク質結合測定値（Ｂ）という。前記試料の濃度は、３００ｎｍｏｌ／Ｌ、１５０ｎｍｏｌ／Ｌ、７５ｎｍｏｌ／Ｌ、３７．５ｎｍｏｌ／Ｌ、１８．７５ｎｍｏｌ／Ｌとした。 First, as a ProteON dedicated sensor chip, a chip (trade name: ProteOn NLC Sensor Chip, BioRad) on which streptavidin was immobilized was set in the ProteON XPR36. 5 μmol / L of biotinylated poly dT was injected into the flow cell of the sensor chip using ultrapure water (DDW) and allowed to bind until the signal intensity (RU: Resonance Unit) was about 900 RU. The biotinylated poly dT was prepared by biotinylating the 5 'end or 3' end of deoxythymidine having a length of 24 bases. Then, 1 μmol / L of the poly dA-added aptamer was injected into the flow cell of the chip at a flow rate of 25 μL / min for 80 seconds using an SPR buffer, and was bound until the signal intensity reached about 800 RU. This result is referred to as an aptamer solidification measurement value (A) as a signal indicating the amount of solidification of the aptamer to the sensor chip. Subsequently, the sample was injected with an SPR buffer at a flow rate of 50 μL / min for 120 seconds, and then washed by flowing the SPR buffer under the same conditions. In parallel with the injection of the sample and the washing with the SPR buffer, the signal intensity was measured. This result is referred to as a protein binding measurement value (B) as a signal indicating the amount of binding between the aptamer and the protein. The concentration of the sample was 300 nmol / L, 150 nmol / L, 75 nmol / L, 37.5 nmol / L, 18.75 nmol / L.
前記ＳＰＲバッファーの組成は、４０ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ、１２５ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、５ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＣｌ、１ｍｍｏｌ/Ｌ ＭｇＣｌ２および０．０１％ Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０とし、ｐＨは、７．５とした。 The composition of the SPR buffer was 40 mmol / L HEPES, 125 mmol / L NaCl, 5 mmol / L KCl, 1 mmol / L MgCl 2 and 0.01% Tween (registered trademark) 20, and the pH was 7.5.
これらの結果を図２に示す。図２は、前記トロポミオシンに対するアプタマーの結合能を示すグラフであり、横軸は、測定時間（秒）を示し、縦軸は、シグナル強度（ＲＵ）を示す。横軸において、０〜１２０秒が、前記試料のインジェクション時間であり、１２０秒以降が、前記ＳＰＲバッファーによる洗浄の時間である（以下、同様）。図２の各グラフにおいて、プロットは、上から、トロポミオシンタンパク質の濃度が３００ｎｍｏｌ／Ｌ、１５０ｎｍｏｌ／Ｌ、７５ｎｍｏｌ／Ｌ、３７．５ｎｍｏｌ／Ｌ、１８．７５ｎｍｏｌ／Ｌである。 These results are shown in FIG. FIG. 2 is a graph showing the binding ability of aptamers to the tropomyosin. The horizontal axis represents measurement time (seconds), and the vertical axis represents signal intensity (RU). On the horizontal axis, 0 to 120 seconds are the injection time of the sample, and 120 seconds and after are the cleaning times with the SPR buffer (the same applies hereinafter). In each graph of FIG. 2, the plots indicate that the concentrations of tropomyosin protein are 300 nmol / L, 150 nmol / L, 75 nmol / L, 37.5 nmol / L, and 18.75 nmol / L from the top.
図２に示すように、いずれのアプタマーを使用した場合も、前記トロポミオシンに対して、結合性を示した。 As shown in FIG. 2, even when any aptamer was used, it showed binding to the tropomyosin.
また、前記図２のＳＰＲ解析の結果から、動態パラメータを算出した。これらの結果を下記表３に示す。下記表３に示すように、いずれのアプタマーを使用した場合も、トロポミオシンに対する解離定数（ＫＤ）は、５０ｎＭ以下であり、非常に優れた結合性であることがわかった。 In addition, kinetic parameters were calculated from the results of the SPR analysis in FIG. These results are shown in Table 3 below. As shown in Table 3 below, when any aptamer was used, the dissociation constant (KD) for tropomyosin was 50 nM or less, which was found to be very excellent binding properties.
以上、実施形態および実施例を参照して本願発明を説明したが、本願発明は、上記実施形態および実施例に限定されるものではない。本願発明の構成や詳細には、本願発明のスコープ内で当業者が理解しうる様々な変更をできる。 Although the present invention has been described with reference to the exemplary embodiments and examples, the present invention is not limited to the above exemplary embodiments and examples. Various changes that can be understood by those skilled in the art can be made to the configuration and details of the present invention within the scope of the present invention.
この出願は、２０１４年４月３０日に出願された日本出願特願２０１４−９４０５６を基礎とする優先権を主張し、その開示のすべてをここに取り込む。 This application claims the priority on the basis of Japanese application Japanese Patent Application No. 2014-94056 for which it applied on April 30, 2014, and takes in those the indications of all here.
本発明のエビアレルゲン結合核酸分子は、エビアレルゲンに対して前述のような解離定数で結合することができる。このため、本発明のエビアレルゲン結合核酸分子によれば、例えば、試料中のエビアレルゲンとの結合の有無によって、優れた精度で、エビアレルゲンを検出できる。したがって、本発明のエビアレルゲン結合核酸分子は、例えば、食品製造、食品管理、食品の流通等の分野におけるエビアレルゲンの検出に、極めて有用なツールといえる。 The shrimp allergen-binding nucleic acid molecule of the present invention can bind to shrimp allergen with the dissociation constant as described above. Therefore, according to the shrimp allergen-binding nucleic acid molecule of the present invention, shrimp allergen can be detected with excellent accuracy, for example, by the presence or absence of binding with shrimp allergen in the sample. Therefore, the shrimp allergen-binding nucleic acid molecule of the present invention can be said to be an extremely useful tool for detecting shrimp allergens in the fields of food production, food management, food distribution, and the like.
Claims (8)
（ａ）配列番号１または３の少なくともいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｆ）配列番号１の塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、配列番号２または３の塩基配列を含む、エビアレルゲンに結合するポリヌクレオチド Following (a) and (f) or characterized in that it consists of at least one polynucleotide selected from the group Ranaru, shrimp allergen binding nucleic acid molecule.
(A) polynucleotide comprising at least any one of the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 1 or 3
(F) with respect to the base sequence of SEQ ID NO: 1, the base sequence having 80% or more identity, comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 or 3, polynucleotide that binds to the shrimp allergen
The method for analyzing shrimp allergens according to claim 7, wherein the sample is at least one selected from the group consisting of foods, food ingredients, and food additives.
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