JP7404230B2 - ネトーシスおよび好中球活性化を処置するための方法 - Google Patents

ネトーシスおよび好中球活性化を処置するための方法 Download PDF

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Description

関連出願の相互参照
本出願は、35 U.S.C.第119（e）条の下、2017年9月18日に出願された米国仮出願第62/559,874号および2018年6月15日に出願された同第62/685,377号の恩典を主張し、これらの全内容は、全体として参照により本明細書に組み入れられる。
政府の支援
本発明は、National Institutes of Healthにより授与された助成金番号T32EB006359の下、政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
技術分野
本明細書に記載される技術は、ネトーシス（NETosis）および好中球関連病状を処置する方法に関する。
背景
最も一般的な種類の血液細胞である多形核好中球（PMN）は、非常に短命であり、通常は血流中でほんの数時間だけ生き延びる。これらのPMNは、傷害および／または感染に対する反応の間、細菌細胞を死滅させるために活性化され、この活性化過程の一部としてPMNの寿命が延長される。並行して、損傷関連分子パターン（DAMP）が放出される、傷害に対する反応の間、PMNは、創傷治癒を開始するためにも活性化され、ほんの数時間から数日へとより長く生存する。しかし、調節不全になった活性化PMNは、単に細菌だけでなく宿主自体に致死的または傷害的であり、好中球パラドックスと呼ばれる好中球主導二次性（2°）組織傷害の悪循環につながる可能性がある。Weiss, S. J. 1989. Tissue destruction by neutrophils. N. Engl. J. Med.320:365-376。これは、活性化PMNが収束せずに存続する場合に特に問題であり、a）死につながる可能性がある組織傷害とPMN活性化との自己増幅サイクル、もしくはb）慢性状態を進行もしくは悪化させる相互作用をもたらす、または免疫回避をもたらす。
通常、活性化PMNは、その標的部位（傷害または病原体の部位）に到達すると自己のスイッチを切り（turn-off）、「能動収束（active resolution）」の過程を開始することができる。しかし、活性化PMNが自己のスイッチを切らない、または調節不全になった場合、これは、慢性疾患における好中球主導二次性（2°）組織傷害または増悪の自己持続性悪循環につながる。さらなる損傷を引き起こさずに、または新しい問題を誘発せずに、好中球主導2°組織傷害のスイッチを切るまたはそれを中和する方法は、大きな難題のままである。急性クリーゼまたは慢性疾患もしくは慢性疾患の増悪発作における好中球主導2°傷害の悪循環を止めることができる、FDAに承認された治療法はない。
新たに現れたデータは、活性化PMNに加えて好中球細胞外トラップ（NET）を好中球主導二次性（2°）組織傷害における主役として意味付けている。PMNによるNET排出過程であるネトーシスは、PMN細胞死の一形態の可能性があり、またはPMNが生存したままであるバイタルネトーシス（vital NETosis）として起こる可能性がある。NETの生物物理学的性質のために、NETは、組織の直接傷害（例えば、血液脳関門破損）を誘発する可能性があるのみならず、血管閉塞および血栓症などの傷害（例えば、脳外傷）または病状（例えば、血管炎、アテローム血栓症）を悪化させる可能性がある。
問題のある活性化PMNと対抗する方法は、免疫系が誤制御されるいくつかの病態（例えば、自己免疫疾患またはがん）を処置する上で、および生命にかかわる二次性組織傷害または慢性疾患（例えば、COPD、鎌状赤血球クリーゼ、嚢胞性線維症、糖尿病、全身性エリテマトーデス）の増悪を引き起こす、活性化PMNの損傷と特に関連する病態において、大きな関心対象である。ネトーシスを防止もしくは回避する、またはNETを中和する方法も、大きな関心対象である。
現在までに、活性化PMN主導の組織傷害もしくは全身性臓器機能不全もしくは慢性疾患の増悪、またはNET関連組織傷害を回避または停止することができる治療法はない。他の種類の白血球細胞を阻害もしくは活性化せずに、または好中球をさらに活性化せずに、または補体系を活性化せずに、または凝固系を撹乱せずに、好中球および／またはNETを止めることは、達成されていない。
概要
本明細書に記載のように、本発明者らは、DEspRと特異的に結合できる作用物質が、活性化PMNの寿命延長を遮断または後退させることができることを見出した。一態様では、本明細書において抗DEspR抗体と呼ばれるヒト化抗体は、actPMNの寿命延長を遮断または後退させることができる。したがって、本明細書に記載の方法は、調節不全の活性化PMNの迅速な機能シャットダウンおよび排除を可能にし、他の重要臓器または重要機能に有害な副作用を及ぼさずに、調節不全の（例えば過剰な）PMN活性化により引き起こされる有害な副作用（例えば、組織傷害および／または臓器機能不全）を低減または予防することができる。
いずれかの態様の一局面では、好中球をDEspR阻害剤と接触させる段階を含む、好中球の生存および／または活性を低下させる方法が、本明細書に記載される。態様のいずれかの一局面では、それを必要としている対象において、好中球細胞外トラップ（NET）放出またはactPMNネトーシスまたはバイタルネトーシスを防止または減少させる方法であって、治療有効量のDEspR阻害剤を対象に投与する段階を含む方法が、本明細書に記載される。
これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、好中球は、活性化好中球（actPMN）である。
いずれかの態様の一局面では、それを必要としている対象において、NET放出またはactPMNネトーシスまたはバイタルネトーシスを防止または減少させる方法であって、治療有効量の、抗好中球試薬または抗NET試薬とコンジュゲートした抗DEspR抗体試薬を投与する段階を含む方法が、本明細書に記載される。
これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、DEspR阻害剤は、抗DEspR抗体試薬またはその抗原結合性フラグメントである。これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、抗DEspR抗体試薬は、モノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメントである。これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、抗DEspR抗体試薬は、i）DEspRおよびii）PD1またはPD-L1と特異的に結合できる二重特異性試薬である。
これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、抗体試薬は、SEQ ID No：1～3、9～11、17～19、5～7、13～15、21～23、25～27、29～31、および33～35より選択される相補性決定領域を有する。
これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、対象は、好中球が疾患の発症または悪化の一因となる病態または疾患に対する処置を必要としている。これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、病態または疾患は、全身性炎症反応症候群（SIRS）；急性肺傷害（ALI）；急性呼吸窮迫症候群（ARDS）；例えば、ARDS、出血性ショック、手術、熱傷、または敗血症による多臓器不全または多臓器機能障害症候群（MODS）；敗血症；敗血症性凝固障害；外傷；多発性硬化症；急性腎障害（AKI）；AKI関連尿細管壊死および遠隔臓器損傷；外傷後手術；出血性ショック；感染症、または薬物もしくは任意の作用物質により誘発されるサイトカインストーム；虚血性または出血性脳卒中；脳卒中における二次性脳損傷；心筋虚血/梗塞；アテローム性動脈硬化性不安定プラーク；アテローム性動脈硬化性血栓症；冠動脈疾患；急性冠症候群；心不全；再灌流傷害；腎透析患者における共存症（例えば、血栓症および内皮機能障害）；脳の虚血性または薬物誘導出血性変化、出血性脳症、外傷性脳損傷；無酸素性脳損傷、慢性腎臓病；がん；actPMN依存性がん；糖尿病；1型糖尿病；2型糖尿病；血管障害；脈管障害；終末器官合併症（例えば、網膜症または糖尿病性腎臓病）；糖尿病性潰瘍の創傷治癒不良；深部静脈血栓症；がん；がん転移；全身性微小血栓症；化学療法誘導性微小血栓症；アテローム性動脈硬化性血栓症；全身性エリテマトーデス（SLE）；ループス腎炎；SLE促進アテローム性動脈硬化症；関節リウマチ；COPD；嚢胞性線維症；肺疾患；アルツハイマー病；鎌状赤血球症；炎症性腸疾患（IBD）；クローン病；潰瘍性大腸炎；ならびに分類不能大腸炎からなる群より選択される。
これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、対象は、がんの処置を必要とし、PD-L1+/DespR+腫瘍を有する。
これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、対象は、がんの処置を必要とし、かつ腫瘍切除により以前に処置されたことがある。これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、対象は、さらなる免疫療法をさらに施される。これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、対象は、さらなる免疫療法を以前に施されたことがある。これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、対象は、さらなる免疫療法を用いた処置に抵抗性である。これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、さらなる免疫療法を用いた処置により対象に毒性が発現したことがある。これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、免疫療法は、PD1および／もしくはPD-L1阻害剤療法または共刺激物質療法である。
これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、対象は哺乳動物である。これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、対象はヒトである。
図1A～1Dは、ヒト化抗DEspRmAb、6g8-IgG4 humabへの原型である抗DEspRマウスmAb、6g8により検出されたヒト活性化好中球上のDEspRの発現を示す。図1A）AF568で蛍光標識された6g8 mumabにより免疫染色されたヒト活性化好中球の代表的な画像である；DAPI核染色。図1B）アイソタイプ対照は陰性であり、DEspR発現に対する抗DEspR免疫染色の特異性を実証している。図1C）ネトーシスを起こしているヒト好中球の抗DEspR 6g8 mumab免疫染色。DAPIは、排出されたDNAを染色する。図1D）NETの高倍率像、およびSYTOXグリーンによりDNAを染色されたNETの公開された参照画像（挿入図）。 図2A～2Bは、ラット活性化好中球上のDEspR発現および活性化好中球の生存率の抗DEspR阻害を示す。図2A）DEspR+（太線楕円）、およびDEspR[-]（太線円）であるCD11b活性化好中球のFACS分析。静止状態の好中球は、Q4象限中のDEspR[-]およびCD11B[-]である。図2Bは、DEspR上の2つの異なるエピトープを標的とする2つの異なる抗DEspR mAbによる活性化好中球の長期生存の阻害を示す。 図3A～3Fは、過剰な活性化好中球により媒介される非感染性出血性脳症（HgeEnc）のモデルにおける抗DEspR mAb療法のインビボ有効性分析を示す。図3A）血管内の血液を除去するためのPBS緩衝液の灌流後の対照ラット脳。図3B）低用量リポ多糖（LPS）のiv注入の24時間後に出血性全脳炎を示している未処置ラット脳。図3C）出血性脳炎を最小限有する～有しない、抗DEspR処置されたラット脳（1mg/kg/用量をLPSの注入直後にiv投与）。図3D）抗DEspRマウスmAbで処置されたラット脳（レーン2および3：両方ともマウスIgGレベルを示す）とは対照的に、2つの対照群（レーンC：正常な（すなわちLPS誘発脳症を有しない）対照、およびレーン1：LPS誘発脳症を有する未処置対照）からの脳内にはマウスIgGがないことを示す、脳の膜タンパク質のELISA分析。とりわけ、抗DEspR 6g8は、抗DEspR 10a3よりも高い脳レベルを示す。図3E）正常（レーンC）、未処置Hge-Enc脳（レーン1）、および異なるDEspRエピトープを標的とする2つのマウスmAbの抗DEspR処置に対する応答（レーン2、3）を比較している脳内好中球ミエロペルオキシダーゼ（MPO）レベルのELISA分析は、脳内の減少したMPOレベルを示し、したがって、脳内の活性化好中球浸潤を阻害する抗DEspRの有効性を指し示している。図3F）ラット特異的アルブミンのELISA分析は、両方の抗DEspR（10a3、6g8）mAb処置ラットにおけるアルブミンレベルの減少を実証し、これは、アルブミンの流入減少により特徴付けられる脳浮腫の減少と一致する。 図3Aの説明を参照。 図3Aの説明を参照。 図3Aの説明を参照。 図3Aの説明を参照。 図3Aの説明を参照。 主に出血性脳症として現れているLPS誘発多臓器不全のラットモデルにおいて未処置ラットと比較した抗DEspR処置ラットの生存曲線分析を示す（表現型は図3A～3Fで確証）。 抗DEspR mAb（hu-6g8）（ベースラインの試料採取後に3mg/kg iv×1回を与える）が、中等度～重度慢性腎臓病－ステージ4（4）およびステージ5（5）を有する雌ラットにおいてアルブミン尿、尿中アルブミンクレアチニン比（UACR）を減少させたことを示す。凡例：hu-6g8、ヒト化抗DEspRモノクローナル抗体、HSD、2％ NaCl水を自由に飲ませることにより誘導した高食塩食；CKD、高食塩食（2％ NaCl）により誘発された中等度腎硬化症（Raijスコア約300）を有する慢性腎臓病を有するDahl食塩感受性高血圧ラット；対照、齢および性別をマッチングした未処置CKDラット。 抗DEspR完全ヒト化6g8 mAb、6g8-humab、および原型マウス抗DEspR 6g8 mAb、6g8-mumabの機能活性のグラフ比較を示す。抗DEspR mAb処置を行ったおよび行わなかった生存阻害のインビトロアッセイでは、6g8-humabは、6g8 mumab（用量反応生存アッセイで使用した最大用量であるIC50＞200nMまたは（＞30μg/ml）と比較して、改善したIC50＜8nM（7.7nM±2.0）を示した。トリパンブルー排除アッセイを使用して、生きた細胞を計数した。 過剰および調節不全の場合に不適応になる活性化好中球の抗細菌機能の略図を示す。異なる治療法により標的とされる部位にマークする。 図8は、腫瘍における免疫回避を促進しているT細胞阻害の好中球メカニズム（1～3番）の略図を示し、このことから、アポトーシスの抗DEspR誘導または活性化好中球の生存率の減少は、好中球媒介性の免疫回避を除去する。1）T細胞アポトーシスの誘導、2）好中球により放出されるアルギナーゼ-1によるT細胞増殖およびT細胞受容体ζ鎖発現の阻害、ならびに好中球により放出される活性酸素種（ROS）によるコフィリンの酸化によるT細胞の免疫シナプス成熟および生存の阻害；ならびに3）T細胞刺激サイトカイン（IL-2、IL-6）を分解し、受容体の脱落を誘導するプロテアーゼ（カテプシンG、エラスターゼ）の放出を介したT細胞活性化の阻害。略図は、腫瘍中の活性化好中球がどのように腫瘍の免疫回避の一因となり、したがって、抗DEspRにより誘導される活性化好中球のプログラム細胞死がどのように活性化好中球（X）を排除し、腫瘍における好中球により媒介される複数の免疫回避メカニズムの排除にもつながるかを示す。 図8-1の続きを示す。 複数の固形腫瘍実験モデルにおいて試験されたMoAのインビトロおよびインビボ裏付けデータの概要を示す。すべてのインビボ試験は、膵臓癌、膠芽腫、乳癌を表すCSC由来異種移植（CDX）モデルで行った。Col1/3、コラーゲン1/3；CSC、がん幹細胞；EC、内皮細胞；TNFα、腫瘍壊死アルファ；↓、…の減少；□の中に×、抗DEspR mAbによる阻害。 略図を示す。抗DEspR mAbは、一緒になってALI/ARDSおよびMOFの原因となる組織傷害につながる不適応の過剰活性化好中球活性およびNET損傷により媒介される悪循環を断つ。抗DEspRは、活性化好中球を標的とし、ALI/ARDSにおける傷害カスケードおよび悪循環の収束に向けた後続のエフェロサイトーシスのためにアポトーシスを誘導する。対照的に、他のアプローチは、下流の事象または終点を標的とするが、中心的なドライバーである活性化好中球を標的としない。 ヒト化抗DEspR mAb、hu-6g8は、静止状態の好中球がDEspR(-)であるため、それらの数の減少を引き起こさず、すなわち、好中球減少症の副作用がないことを実証するグラフを示す。抗DEspR hu-6g8はまた、未処置対照と比較して血小板数または赤血球数の減少を引き起こさない。14日目（Panc1-CSC異種移植（CDX）腫瘍の樹立の14日後）に処置を開始してから1週間後である21日目に開始して、全血球計算（CBC）を毎週測定した。 急性脳卒中の開始時に与えた単回用量の抗DEspR mumabは、脳卒中易発性トランスジェニック高脂血症/高血圧（spTg25）ラットにおける生存期間を増加させたことを実証するグラフを示す。抗DEspRを尾静脈i.v.経由で静脈内（i.v.）に与えた。アイソタイプ対照は、マウスIgG1（抗体依存性細胞性細胞傷害作用またはADCC、および補体依存性細胞傷害作用またはCDCが、わずかである、またはない）。一過性虚血を除外するために脳卒中の症状を少なくとも1時間記録した。脳卒中の開始は、臨床で行うように、脳卒中の神経学的徴候：発作、不全麻痺、麻痺、除皮質姿勢、アテトーゼ様運動の存在により特定した。ラットが生存しているか監視した（死亡または2回目の脳卒中後に安楽死）。Kaplan Meier生存曲線分析、ログランクMantel-CoxのP＜0.0001、生存期間中央値：未処置について0.5日、抗DEspR処置について22日；死亡についてのハザード比は、未処置脳卒中ラットについて17.8であり、95％ CIが4.2～75.5であった。 免疫適格な自然発生乳房腫瘍モデルで試験した場合に、抗DEspRが、潰瘍化腫瘍の創傷治癒を損なわずに腫瘍サイズを退縮させたことを実証する。処置の前に3日間非治癒性と記録された潰瘍化腫瘍は、7日目に処置した4日後に有意な改善を示した。中心の侵食された潰瘍周囲の赤い硬結した腫瘍領域は、好中球の炎症性浸潤のせいである。7日目までの急速な収束は、抗DEspRがマクロファージによる食作用のために活性化好中球におけるアポトーシスを誘導したこと、ならびに炎症性の発赤および腫脹が最終的に収束したことと一致する。 抗DEspR mAbが食塩感受性高血圧ラットにおいて高血圧を悪化させず、または高血圧クリーゼを誘発しないことを実証する。非ストレス的に24/7測定できるように、ラジオテレメトリーを使用して血圧（BP）測定を行った。3日のベースライン記録後に、尾静脈を介して抗DEspRを注入し、BPの測定値を得た。 抗DEspRが適用から2時間以内にPanc1腫瘍細胞においてアポトーシスを誘導することを実証する。Panc1 CSCを蒔き、培地中でAF568標識（*）抗DEspR 7c5*またはアイソタイプIgG*に曝露し、指定された時点、1時間および2時間（hr）で洗浄し、固定し、DAPIを行ってマウントした。CSC、がん幹様細胞。DAPI、DNA核染色およびAF568。参照画像は、Malorni et al.、Archana et al 2013から採用。 免疫適格ラットにおける自然発生乳房腫瘍モデルのより大きい腫瘍退縮を実証する。免疫適格ラットにおける自然発生乳房腫瘍モデルで、抗DEspRは、ベースラインの腫瘍体積からより大きい腫瘍退縮を誘導した（体積759～23,856mm3の範囲）。これは、異種移植免疫低下モデルよりも免疫適格モデルにおいて腫瘍退縮が大きいことが、免疫適格腫瘍モデルにおける無傷の免疫系の抗腫瘍的役割と合致するという報告と一致する。この考えと一致して、抗DEspRは、免疫低下ヌードラットにおける異種移植腫瘍モデルで腫瘍の成長速度を有意に減速したのに対して、免疫適格CSC由来ラットモデルでは腫瘍サイズをベースラインの腫瘍体積から顕著に退縮させた。これらの観察は、好中球の生存に対する抗DEspRの阻害効果が、好中球媒介性腫瘍免疫回避を消失させ、次いでこれが免疫適格腫瘍モデルにおいてのみ腫瘍の退縮を推進することを示唆している。抗DEspR mAbは、わずかな抗体依存性細胞性細胞傷害（ADCC）または補体依存性細胞傷害（CDC）を有するマウスIgG1/カッパFc領域を有したので、ADCCおよびCDCで腫瘍退縮を説明することができない。 図17A～17Cは、抗DEspR-mab（hu6g8 mab）を図示する。図17Aは、DEspR、マウス前駆mabならびにヒト化IgG mabおよびIgG4 mabの略図を示す。Hu6g8は、推定上の結合ドメインに及ぶエピトープ2に対して産生された6g8g7-hu-IgG4として表す。図17Bは、三つ組で行った無傷ヒト細胞上のDEspRに対するhu6g8の結合のグラフを図示し、hu-6g8についてのEC50は4.2nM；それに対してマウス前駆体mu-6g8についてのEC50は178nMである。図17Cは、好中球（PMN）生存率の阻害のグラフを示す：hu6g8のIC50は7.7nMであるのに対し、mu-6g8 mabについてのIC50は＞198nMである。 図18A～18Bは、（図18A）ヒト活性化好中球、および（図18B）NETの免疫蛍光分析を図示する。図18Cは、hu6g8-mabを用いて探索したヒト腎臓（K）およびヒト活性化好中球（act-N）のウエスタンブロット分析を示す。腎臓DEspRは、グリコシル化型の約17.5kDaであり；活性化好中球におけるDEspRは、グリコシル化されておらず、予想されたサイズ9.8kDa MWを示す。 図19A～19Jは、PDAC組織およびPDAC株におけるDEspRの発現を図示する。（図19A）ステージIIBのPDAC、（図19B）ステージIVのPDAC、（図19C）正常な膵臓、（図19D）PDAC：肝転移についてのヒトPDAC組織の蛍光標識を図示する。図19Eは、PDAC試料の腫瘍割合スコア（tumor proportion score）を図示し（n=133）、図19Fは、腫瘍試料の先端部におけるDEspR[+]細胞割合のグラフを図示する。（n=77）。PDAC細胞上でのDEspRの発現：（図19G）Panc1非CSC、（図19H）Panc1 CSC、（図19I）MIA PaCa2非CSC、（図19J）MIA PaCa2 CSC。 図19-1の説明を参照。 図19-1の説明を参照。 図20A～20Fは、抗DEspR療法を行った（図20A）塩基性pHおよび（図20B）低pH下のPanc1細胞の生存率を示す。DEspR-humabAF-568のエンドサイトーシスは、1時間までに核共局在（図20C）、1時間までにリソソーム共局在（図20D）、1時間までにネクロトーシス形態（矢印）（図20E）およびアポトーシス形態（矢印）（図20F）を示した。 DEspR-humabを用いた処置を受けて生存期間の増加を示しているPanc1異種移植片の生存グラフを示す。 Panc1異種移植マウスにおけるDEspR-humabのPK研究を示す；15mg/kg i.v.（n=3）；半減期=1.70日。 図23A～23Bは、ヒトストレス活性化好中球の免疫蛍光分析が、古典的な多分葉核を有する活性化好中球（図23A）およびネトーシスを起こしている好中球（図23B）においてDEspR+発現を示すことを表す。正常なヒト志願者からのヒトストレス活性化好中球の免疫染色のマージした画像を表す。図23Aは、活性化好中球（actN）のDEspR+免疫染色を図示する。1］NETを有しない高倍率のactN；2］非常に初期のネトーシスを示唆しているDNAの周縁化を有する高倍率のactN。図23Bは、無傷の細胞膜を有してバイタルネトーシスを起こしているActNを図示する。好中球細胞外トラップ（NET）を定義するDNAの排出の1）初期、2）中期；3）完了。 図23Aの説明を参照。 ヒトストレス活性化好中球の免疫細胞染色が、好中球、およびネトーシスを起こしている（NETosing）好中球におけるDEspR+発現を検出することを示す。すべての好中球がDEspR陽性とは限らないことに注意。 ABTM-468抗体を使用してヒト組織におけるDEspRを検出するウエスタンブロット分析を示す。HK、ヒト腎臓；N1、正常なヒト志願者からのストレス活性化好中球；N2、正常なヒト志願者からのLPS活性化好中球。分子量マーカーは、kDa（キロダルトン）単位。 DEspRにおけるセリンおよび／またはトレオニンリン酸化部位のインシリコ解析の表が、複数のリン酸化部位を検出することを図示し、最低カットオフ値よりも3.7～4.3倍大きいスコアをボックス内に示す。DEspRのS72、およびT76、77、84である。 DEspRタンパク質における推定上のO-グリコシル化部位を示す。［NetOGlyc 4.0サーバー］。DEspRのセリン残基、S16、S28、S31、およびトレオニン残基、T18、T24は、＞閾値0.5のスコアを有すると予測される予測上のO-グリコシル化部位である［Steentoft C, et al 2013；ワールドワイドウェブcbs.dtu.dkから入手可能］。アミノ酸残基：C、システイン I、イソロイシン G、グリシン L、ロイシン M、メチオニン Q、グルタミン S、セリンおよびT、トレオニン。 診断から96時間目のARDS A04全血のFACS分析を示す。A04は、生存し、4日目に人工呼吸器離脱、6日目に退院した。Hu6g8（DEspR-AF568）、CD11b-FITC。ARDS患者からの新鮮全血試料中の好中球、単球、およびリンパ球におけるDEspR発現のエクスビボ分析：患者の循環微小環境を刺激するため。WBCのサブタイプを識別するためにサイズ（FSC）および粒度によるゲート設定。抗DEspR hu-6g8 IgG4 S228PmAb（アイソタイプ対照hu-IgG4）。抗CD11b mAb（アイソタイプ対照mu-IgG2b）。 ARDS患者の生存者は、非生存者と対照的にDEspR+/CD11b+好中球レベルが低いことを実証する。対照は、それぞれ抗DEspR mAbおよび抗CD11b mAbに対するアイソタイプ対照としてのAF-568蛍光標識ヒトIgG4およびAF-488標識マウスIgG2b。DEspR hu-6g8は、AF-568で蛍光標識された抗DEspRヒト化IgG4 mAb。CD11bは、AF488で蛍光標識された抗CD11bマウスmAb。 表示の細胞型におけるDEspR発現レベルのグラフを図示する。 他のパラメーターと対照的に、DEspR+/CD11b+好中球数がARDS非生存者よりもARDS生存者ではるかに少ないことを実証するグラフを図示する。ARDS患者の生存者：A01、A04、A05、A06。ARDSの非生存者：A02。 DEsprR+/CD11b+好中球とARDS死亡率との関連が、ARDS患者において多臓器不全をもたらす全身組織傷害に果たす主要な役割を指し示すことを実証するグラフを図示する。ARDS患者の生存者：A01、A04、A05、A06。ARDSの非生存者：A02。 10ug/mLのABTM-468（hu-6g8）が、ARDS患者の血液中の生きた好中球数をエクスビボで減少させたことを実証するグラフを図示する。FSC（サイズ）およびSSC（粒度）のゲート設定により好中球を独特なサイズ/粒度特性についてゲート設定した。A02で有意な減少が検出された。低いDEspR+/CD11b+好中球を有する患者（A04、A05、A06）で効果は観察されなかった。FSC、前方側方散乱。SSC、側方散乱。N=4～5回の反復；平均±SD。A02およびA03について全血を37Cで24時間インキュベートした（regインキュベーター、回転、HEPES緩衝液中）。A04、A05、およびA06については37Cで6時間。10ug/mLのABTM-468（cho）。*、P=0.0286 Mann-Whitney順位和検定。ARDS患者の生存者：A01、A04、A05、A06。ARDSの非生存者：A02。 ヒト膵臓腹膜転移の異種移植ラットモデル（Panc1がん幹細胞CSC由来異種移植片またはPanc1-cdxモデル）における好中球-リンパ球比の分析のグラフを示す。ABTM-468、ヒト化抗DEspR mAb 6g8-IgG4S228P 図35A～35Bは、ヒト膵臓癌細胞（Panc1）におけるアポトーシスの抗DEspR mAb誘導およびゲムシタビン標準治療の濃度依存的相乗作用のインビトロ試験のグラフを図示する。 ゲムシタビン単独および模擬処置食塩水対照と比べて抗DEspR mAbとゲムシタビンとの併用で腫瘍を処置されたラットの代表的な画像を図示する。GEM tx：ゲムシタビン処置（100mg/kg/回 iv×2）。Hu-6g8またはABTM-468：ヒト化抗DEspR mAb処置 1mg/kg/回 iv×1/週×2。Combo-tx：併用療法。食塩水模擬Tx：模擬。 図37A～37Dは、原発性膵臓癌（PDAC）のDEspR+免疫組織蛍光の代表的な顕微鏡写真画像を図示する。2人の異なる患者からの腫瘍切片。図37Aは、第1の患者からの切片を図示する。図37Bは、説明ラベルのない同じ画像である。図37Cは、第2の患者からの切片を図示する。図37Dは、説明ラベルのない同じ画像である。invTCs、侵襲性腫瘍細胞；actNs、活性化好中球。腫瘍細胞は、浸潤炎症細胞よりも大きな核を有して特徴的に大きい。DEspRは、リンパ球または単球に発現されないので、DEspR+炎症細胞は、NET易発性活性化好中球およびNETを形成している（NETting）好中球である。 図38A～38Bは、膵臓腹膜転移腫瘍切片の腫瘍間質中のDEspR+好中球の代表的な免疫組織蛍光顕微鏡写真を図示する。腫瘍切片は、患者Cからのもの：図38Aは、説明ラベルの付いた欄であり；図38Bは、妨げなく目視検査するための、ラベルのない対応する同一の欄である。invTCは、侵襲性腫瘍細胞；actNsは、活性化好中球、黄色の括弧｛｝は、DEspR+侵襲性腫瘍細胞および浸潤性の好中球を有する腫瘍間質を枠で囲むものであり；白い矢印は、DEspR+腫瘍微小血管を指し示す。 対照の未処置腫瘍ラット（左欄）およびABTM-468処置ラット（右欄）の代表的な画像を図示する。苦痛が原因で対照ラットを安楽死させ、齢および腫瘍持続期間をマッチングした腫瘍を得るために処置ラットを安楽死させた。処置を開始する3週間前に腹腔内に注射したPanc1がん幹細胞から異種移植腫瘍モデルを作製した。T、腫瘍；GB、胆嚢。 すべてのステージの膵臓癌（PDAC）における腫瘍間質中にDEspR+炎症細胞、ネトーシス易発性活性化好中球が検出され、これは、ステージIV-PDACへの傾向が漸増している転移腫瘍と類似することを実証する画像を図示する。バー=20ミクロン。 図41A～41Cは、ABTM-468抗DEspR処置が、中等度～重度慢性腎臓病を有する高血圧Dahl Sラットにおいて腎機能を改善したことを実証するグラフを図示する。図41Aは、慢性腎臓病の事後実証が腎硬化症についてのRaijスコアの定量分析により行われたことを示す。図41Bは、抗高血圧療法なしで、抗DEspR mAb処置、ABTM-468が、1回処置の7日後にアルブミン尿および（図41C）尿中アルブミン対クレアチニン比（UACR）を低減したことを実証する。 免疫蛍光染色および共焦点顕微鏡法によるデジタル顕微鏡写真を図示する。Hoechst：核DNA染色；抗Adar1抗体；抗DEspR hu-IgGS228P mAb（ABTM-468またはhu-6g8）、位相差、および対応するマージ画像。
詳細な説明
本明細書に記載するように、抗DEspR試薬が、調節不全のDEspR+ actPMNを機能的にシャットダウンすることが見出された。この調節不全は、消散よりも組織傷害につながる可能性がある。したがって、本明細書記載の抗DEspR試薬は、好中球媒介性二次組織傷害を駆動するDEspR+の「ならず者」PMNまたは高度活性化PMN（actPMN）の過剰な傷害機能を、例えばこのようなactPMNの長寿命を阻害することにより、阻害することができる。この阻害は、actPMN活性の過剰の傷害レベルおよび／または所与のレベルのならず者DEspR+ actPMN活性が対象に存在する時間を低減する。したがって、このような抗DEspR試薬は、DEspR+ actPMNにより特徴付けられるおよび／または引き起こされるいくつかの病態を処置するために使用することができる。理論に縛られることを望むわけでなく、抗DEspR試薬は、actPMNの表面に存在するDEspRと結合することにより作用し得ると本明細書において考えられている。あるいは、抗DEspR試薬は、別のメカニズムを介して、例えば、DEspRと1つまたは複数のエピトープを共有する分子に結合することにより、作用し得る。
いずれかの態様の一局面では、活性化好中球の生存期間および／または活性を低下させる方法であって、好中球をDEspR阻害剤と接触させる段階を含む方法が、本明細書に記載される。態様のいずれかの一局面では、それを必要としている対象において、好中球細胞外トラップ（NET）の放出またはactPMNのネトーシスを防止または減少させる方法であって、治療有効量のDEspR阻害剤を対象に投与する段階を含む方法が、本明細書に記載される。
本明細書において使用される「actPMN」、「活性化PMN」、または「活性化好中球」は、例えば、走化性シグナル、サイトカイン、補体、および／またはLPSの存在により活性化された好中球（例えば多形核細胞）を指す。活性化好中球は、例えば、NET産生/放出、増加したレベルの細胞表面インテグリン（例えば、CD11b/CD18）、ROS産生および放出、ならびに脱顆粒を表すことができる。これらのマーカーおよび活性のレベルは、当技術分野において公知の、および本明細書の実施例に記載される、アッセイにより容易に測定される。ActPMNは、例えば、未活性化好中球の通常の寿命（例えば数時間、または一部の報告では1～2日）を超える、増加した生存期間によりさらに特徴付けられる。これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、actPMNは、DEspR+好中球であることができる。これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、actPMNは、CD11b+好中球であることができる。
本明細書において使用される用語「NET」または「好中球細胞外トラップ」は、ヌクレオソームとタンパク質、例えば抗微生物活性を有するタンパク質との細胞外複合体を指す。活性化すると、好中球および他の細胞は、「ネトーシス」と呼ばれる細胞死プログラムを起こし、抗微生物活性を有する様々なタンパク質とコンジュゲートしたヌクレオソームの形態で核DNAの部分（すなわちNET）を放出する。好中球からのNETの放出は、敗血症および非感染症の間の炎症および微小血栓症と関連し、本明細書記載の様々な疾患の病状の一因となることが実証されている。バイタルネトーシスは、好中球の細胞死を伴わないNETの放出を指す。
本明細書において使用される「DEspR」または「二重エンドセリン/VEGFシグナルペプチド受容体」は、腫瘍細胞、微小血管、および足場非依存性がん幹細胞（CSC）に発現される受容体であって、細胞膜および核膜、ならびに細胞質における発現に差がある受容体を指す。DEspRは、隣接する正常組織とは対照的にヒト膵臓癌および膠芽腫の両方において差次的に増加している。しかし、これらのデータにかかわらず、DEspRは、依然としてNCBIデータベース中でノンコーディングRNAまたはncRNA FBXW7アンチセンスRNA1として注釈を付けられている。DEspRポリペプチドおよび核酸についての配列は、当技術分野において公知であり、例えば、ヒトDEspR（NCBI Gene ID: 102191832）である。例えば、DEspRポリペプチドは、例えば、アクセッション番号EF212178.1、Gene ID 102191832、またはGlorioso et al. 2007によって記載されている
Figure 0007404230000001
およびその天然対立遺伝子バリアント、スプライスバリアント、およびプロセシングされた形態であることができる。典型的には、本明細書において使用されるDEspRは、SEQ ID NO：37のヒトDEspRを指す。
本明細書において使用される「阻害剤」という用語は、標的の発現および／または活性を例えば少なくとも10％以上、例えば10％以上、50％以上、70％以上、80％以上、90％以上、95％以上、または98％以上減少させることができる作用物質を指す。1つまたは複数の標的の阻害剤の有効性、例えばそれが標的のレベルおよび／または活性を低下させる能力は、例えば、標的の発現産物のレベルおよび／または標的の活性を測定することによって決定することができる。所与のmRNAおよび／またはポリペプチドのレベルを測定するための方法は、当業者に公知であり、例えばプライマーを用いるRT-PCRを使用して、RNAのレベルを決定することができ、抗体を用いるウエスタンブロットを使用して、ポリペプチドのレベルを決定することができる。例えばDEspRの活性は、当技術分野において公知の方法を使用して決定することができる。いくつかの態様では、阻害剤は、阻害性核酸；アプタマー；抗体試薬；抗体；または小分子であることができる。
これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、DEspR阻害剤は、抗DEspR抗体試薬、抗体、またはその抗原結合性フラグメントであることができる。本明細書において使用される「抗体試薬」という用語は、少なくとも1つの免疫グロブリン可変ドメインまたは免疫グロブリン可変ドメイン配列を含み、所与の抗原と特異的に結合するポリペプチドを指す。抗体試薬は、抗体または抗体の抗原結合ドメインを含むポリペプチドを含むことができる。いくつかの態様では、抗体試薬は、モノクローナル抗体またはモノクローナル抗体の抗原結合ドメインを含むポリペプチドを含むことができる。例えば、抗体は、重（H）鎖可変領域（本明細書においてVHと略語化する）、および軽（L）鎖可変領域（本明細書においてVLと略語化する）を含むことができる。別の例では、抗体は、2つの重（H）鎖可変領域および2つの軽（L）鎖可変領域を含む。「抗体試薬」という用語は、抗体の抗原結合性フラグメント（例えば、単鎖抗体、FabおよびsFabフラグメント、F(ab')2、Fdフラグメント、Fvフラグメント、scFv、およびドメイン抗体（dAb）フラグメント、ならびに完全抗体を包含する。
本明細書において使用される「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的活性部分、すなわち、抗原と免疫特異的に結合する抗原結合部位を含有する分子を指す。本用語はまた、2つの免疫グロブリン重鎖および2つの免疫グロブリン軽鎖から構成される抗体のみならず、例えば、免疫グロブリン分子、モノクローナル抗体、キメラ抗体、CDR移植抗体、ヒト化抗体、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、ジスルフィド結合Fv、scFv、単一ドメイン抗体（dAb）、ダイアボディー（diabody）、多重特異性抗体、デュアル特異性（dual specific）抗体、抗イディオタイプ抗体、二重特異性抗体、その機能的活性エピトープ結合部分、および／または二機能性ハイブリッド抗体などの、完全長抗体およびその抗原結合部分を含めた多様な形態を指す。
各重鎖は、重鎖の可変領域（本明細書においてHCVRまたはVHと略語化する）および重鎖の定常領域から構成される。重鎖定常領域は、3つのドメインCH1、CH2およびCH3からなる。各軽鎖は、軽鎖の可変領域（本明細書においてLCVRまたはVLと略語化する）および軽鎖の定常領域から構成される。軽鎖定常領域は、CLドメインからなる。VHおよびVL領域は、フレームワーク領域（FR）と呼ばれる保存された領域が散在する相補性決定領域（CDR）と呼ばれる超可変領域にさらに分割される場合がある。各VH領域およびVL領域は、したがって、N末端からC末端に次の順序で並んだ3つのCDRおよび4つのFRからなる：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。この構造は、当業者に周知である。
本明細書において使用される「CDR」という用語は、抗体可変配列内の相補性決定領域を指す。重鎖および軽鎖の可変領域のそれぞれには3つのCDRがあり、それらは、可変領域のそれぞれについて、CDR1、CDR2およびCDR3と称される。これらのCDRの正確な境界は、異なるシステムにより別々に定義されている。Kabatにより記載されたシステム（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987) and (1991)）は、抗体のいかなる可変領域にも適用可能な明確な残基番号付けシステムを提供するだけではなく、3つのCDRを規定する正確な残基境界も提供する。これらのCDRは、Kabat CDRと呼ばれる場合がある。KabatのCDRと重なり合うCDRを規定する他の境界は、Padlan（FASEB J. 9:133-139 (1995)）およびMacCallum（J Mol Biol 262(5):732-45 (1996)）およびChothia（J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)）およびNature 342:877-883 (1989)）によって記載されている。なお他のCDRの境界規定は、上記システムの1つに厳密には従わない場合があり、特定の残基または残基の群またはCDR全体でさえも抗原の結合に著しく影響するわけではないという予測または実験結果に照らして短縮または延長している場合があるものの、それでもKabat CDRと重なり合うであろう。本明細書において使用される方法は、これらのシステムのいずれかにより規定されたCDRを利用する場合がある。
抗体の「抗原結合部分」という用語は、本明細書記載の抗体の1つまたは複数の部分であって、本明細書の上記に定義された結合親和性を依然として有する部分を指す。完全抗体の部分は、抗体の抗原結合機能を果たすことができると示されている。抗体の「抗原結合部分」という用語により、結合部分の例には、（i）Fab部分、すなわち、VL、VH、CLおよびCH1ドメインから構成される一価部分；（ii）F(ab')2部分、すなわち、ジスルフィド架橋を介してヒンジ領域で相互に連結した2つのFab部分を含む二価部分；（iii）VHおよびCH1ドメインから構成されるFd部分；（iv）抗体の短腕のFLおよびVHドメインから構成されるFv部分；ならびに（v）VHドメインまたはVH、CH1、CH2、DH3、もしくはVH、CH2、CH3からなるdAb部分（dAb、もしくはVLドメインだけを含む単一ドメイン抗体も標的エピトープと特異的に結合することが示されている）が挙げられる。Fv部分、すなわちVLおよびVHの2つのドメインは、別々の遺伝子によってコードされるものの、それらは、合成リンカー、例えば、ポリ-G4Sアミノ酸配列（SEQ ID NO：38として開示される「G4S]）および組換え方法を使用して、さらに相互に連結される場合があり、一価分子を形成するためにVL領域およびVH領域が組み合わされたタンパク質単鎖（単鎖Fv（ScFv）として公知）としてそれらを調製することが可能になる。抗体の「抗原結合部分」という用語はまた、このような単鎖抗体を含むことを意図する。「ダイアボディー」などの他の形態の単鎖抗体も同様にこれに含まれる。ダイアボディーは、VHドメインおよびVLドメインがポリペプチド単鎖上に発現されているが、これら2つのドメインを同じ鎖上で合わせることができるには短かすぎるリンカーが使用されており、それにより、これらのドメインが別の鎖の相補ドメインと強制的に対形成されて2つの抗原結合部位を形成する、二価二重特異性抗体である。免疫グロブリン定常ドメインは、重鎖または軽鎖定常ドメインを指す。ヒトIgG重鎖および軽鎖定常ドメインのアミノ酸配列は、当技術分野において公知である。
抗体は、IgA、IgG、IgE、IgD、IgM（ならびにそのサブタイプおよび組み合わせ）の構造特徴を有することができる。抗体は、マウス、ウサギ、ブタ、ラット、および霊長類（ヒトおよび非ヒト霊長類）を含めた任意の起源ならびに霊長類化抗体であることができる。抗体には、ミディー抗体（midibody）、ヒト化抗体、キメラ抗体なども挙げられる。
さらに、本明細書記載の抗体または抗体試薬は、抗体または抗体部分と1つまたは複数のさらなるタンパク質またはペプチドとの共有結合的または非共有結合的関連により形成されるより大きい免疫接着分子の部分であり得る。このような免疫接着分子に関連するのは、テトラマー性scFv分子を調製するためのストレプトアビジンコア領域の使用ならびに二価およびビオチン化scFv分子を産生するためのシステイン残基、マーカーペプチドおよびC末端ポリヒスチジニルタグ、例えば、ヘキサヒスチジニルタグ（SEQ ID NO：39として開示される「ヘキサヒスチジニルタグ」）の使用である。
いくつかの態様では、本明細書記載の抗体または抗体試薬は、免疫グロブリン分子、モノクローナル抗体、キメラ抗体、CDR移植抗体、ヒト化抗体、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、ジスルフィド結合Fv、scFv、単一ドメイン抗体、ダイアボディー、多重特異性抗体、デュアル特異性抗体、抗イディオタイプ抗体、二重特異性抗体、およびその機能的活性エピトープ結合部分であることができる。
いくつかの態様では、抗体またはその抗原結合部分は、完全ヒト抗体である。いくつかの態様では、抗体、その抗原結合部分は、ヒト化抗体または抗体試薬である。いくつかの態様では、抗体、その抗原結合部分は、完全ヒト化抗体または抗体試薬である。いくつかの態様では、抗体またはその抗原結合部分は、キメラ抗体または抗体試薬である。いくつかの態様では、抗体、その抗原結合部分は、組換えポリペプチドである。
「ヒト抗体」という用語は、その可変領域および定常領域が、例えば、Kabatらによって記載されているように、ヒト生殖細胞系の免疫グロブリン配列に対応するまたはそれに由来する抗体を指す（Kabat, et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242参照）。しかし、ヒト抗体は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列によってコードされていないアミノ酸残基を、例えばCDR中に、特にCDR3中に含有することができる（例えば、インビトロのランダム変異誘発もしくは部位特異的変異誘発により、またはインビボで体細胞変異により導入された変異）。本明細書記載の組換えヒト抗体は、可変領域を有するが、ヒト生殖細胞系の免疫グロブリン配列由来の定常領域を含有する場合もある（Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242参照）。しかし、特定の態様により、このような組換えヒト抗体は、インビトロ変異誘発（またはヒトIg配列によるトランスジェニック動物が使用される場合、体細胞インビボ変異誘発）に供され、その結果、組換え抗体のVHおよびVL領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系のVHおよびVL配列と関係するまたはそれに由来するものの、ヒト抗体生殖細胞系レパートリー内に自然にインビボで存在しない配列である。特定の態様により、この種の組換え抗体は、選択的変異誘発もしくは復帰変異またはその両方の結果である。好ましくは、変異誘発は、親抗体よりも大きい標的に対する親和性および／または小さい非標的構造に対する親和性をもたらす。本明細書提供の配列および情報からヒト化抗体を生成することは、過度の実験なしに当業者により実施されることができる。1つのアプローチでは、モノクローナル抗体をヒト化するために採用される4つの一般段階がある。例えば、米国特許第5,585,089号；同第6,835,823号；同第6,824,989号を参照されたい。これらは、（1）出発抗体の軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインのヌクレオチドおよび予測されるアミノ酸配列を決定すること；（2）ヒト化抗体を設計すること、すなわち、ヒト化工程の間に使用するための抗体フレームワーク領域を決めること；（3）実際のヒト化方法論/技法；ならびに（4）ヒト化抗体のトランスフェクションおよび発現である。
通常、ヒト化抗体およびヒト抗体バリアント中のCDR領域は、実質的に同一であり、より通常には、それらが由来したマウス抗体またはヒト抗体中の対応するCDR領域と同一である。いくつかの態様では、結果として生じるヒト化免疫グロブリンまたはヒト抗体バリアントの結合親和性にはっきりとは影響せずにCDR残基の1つまたは複数の保存的アミノ酸置換を行うことが可能である。いくつかの態様では、CDR領域の置換は、結合親和性を高めることができる。
「キメラ抗体」という用語は、マウス重鎖可変領域および軽鎖可変領域がヒト定常領域と連結した抗体などの、1つの種からの重鎖可変領域および軽鎖可変領域についての配列ならびに別の種からの定常領域の配列を含有する抗体を指す。ヒト化抗体は、実質的にヒト抗体（アクセプター抗体と名付けられる）からの可変領域フレームワーク残基および実質的に非ヒト抗体、例えばマウス抗体（ドナー免疫グロブリンと称される）からの相補性決定領域を有する。定常領域はまた、存在する場合、実質的または完全にヒト免疫グロブリン由来である。ヒト可変ドメインは、通常、CDRが由来した（マウス）可変領域ドメインとフレームワーク配列が高度の配列同一性を示すヒト抗体から選択される。重鎖および軽鎖可変領域フレームワーク残基は、同じまたは異なるヒト抗体配列の領域と実質的に類似することができる。ヒト抗体配列は、天然のヒト抗体の配列であることができ、またはいくつかのヒト抗体のコンセンサス配列であることができる。
加えて、適切な抗原特異性のマウスまたは他種抗体分子からの遺伝子を、適切な生物学的活性のヒト抗体分子からの遺伝子と一緒にスプライスすることによる、「キメラ抗体」の産生のために開発された技法を使用することができる。キメラ抗体の可変セグメントは、典型的には、免疫グロブリン定常領域（Fc）の少なくとも一部分、典型的にはヒト免疫グロブリンの少なくとも一部分と連結される。ヒト定常領域DNA配列は、不死化B細胞などの多様なヒト細胞から周知の手順により単離することができる。抗体は、軽鎖定常領域および重鎖定常領域の両方を含有することができる。重鎖定常領域は、CH1、ヒンジ、CH2、CH3、および時にCH4領域を含むことができる。治療目的のために、CH2ドメインを欠失させるまたは省略することができる。
追加的に、および本明細書に記載されるように、組換えヒト化抗体をさらに最適化して、ヒトにおける治療のために機能的活性を維持しながら潜在的免疫原性を減少させることができる。これに関して、機能的活性は、ポリペプチドが本明細書記載の組換え抗体または抗体試薬に関連する1つまたは複数の公知の機能的活性を発揮することが可能なことを意味する。このような機能的活性は、がん細胞への結合性および／または抗がん活性を含む。追加的に、機能的活性を有するポリペプチドは、該ポリペプチドが、例えば、生物学的アッセイなどの特定のアッセイで測定されるとき、成熟型を含む本明細書記載の参照抗体または抗体試薬の活性と類似しているが、必ずしも同一ではない活性を用量依存的にまたは非依存的に示すことを意味する。用量依存性が存在する場合、参照抗体または抗体試薬の用量依存性と同一である必要はないが、むしろ、本明細書記載の参照抗体または抗体試薬と比較して所与の活性における用量依存性と実質的に類似している（すなわち、候補ポリペプチドは、本明細書記載の抗体または抗体試薬と比べて大きい活性、または約25倍以下小さい、約10倍以下小さい、または約3倍小さい活性を示すであろう）。
いくつかの態様では、本明細書記載の抗体試薬は、非天然生体分子である。例えば、ヒト起源の抗原に対して産生されるマウス抗体は、ヒトの介入および操作、例えばヒトによって実施される製造段階なしには自然界で存在しないであろう。キメラ抗体はまた、例えば、複数の種から得られ、組換え分子に組み立てられた配列を含む点で、天然の生体分子ではない。ある特定の態様では、本明細書記載のヒト抗体試薬は、天然の生体分子ではなく、例えば、ヒト抗原に対する完全ヒト抗体は、自然界で負の選択に供され、ヒトの体内で自然に見出されない。
いくつかの態様では、抗体または抗体試薬は、単離されたポリペプチドである。いくつかの態様では、抗体または抗体試薬は、精製ポリペプチドである。いくつかの態様では、抗体または抗体試薬は、操作ポリペプチドである。
いずれかの態様の一局面では、DEspRポリペプチドと特異的に結合する抗体、抗原試薬、その抗原結合性フラグメントが、本明細書に記載される。これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、抗体、抗体試薬、またはその抗原結合性フラグメントは、
（a）SEQ ID NO：9のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1；
（b）SEQ ID NO：10のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2；
（c）SEQ ID NO：11のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3；
（d）SEQ ID NO：1のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1；
（e）SEQ ID NO：2のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2；および
（f）SEQ ID NO：3のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3；または
（a）～（f）のうち1つもしくは複数の保存的置換バリアント
からなる群より選択される少なくとも1つの重鎖または軽鎖相補性決定領域（CDR）を含む。これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、抗体、抗体試薬、またはその抗原結合性フラグメントは、
（a）SEQ ID NO：9のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1；
（b）SEQ ID NO：10のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2；
（c）SEQ ID NO：11のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3；
（d）SEQ ID NO：1のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1；
（e）SEQ ID NO：2のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2；および
（f）SEQ ID NO：3のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3
からなる群より選択される少なくとも1つの重鎖または軽鎖相補性決定領域（CDR）を含む。
これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、抗体、抗体試薬、またはその抗原結合部分は、DEspRと特異的に結合し、かつ結合について
（a）SEQ ID NO：9のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1；
（b）SEQ ID NO：10のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2；
（c）SEQ ID NO：11のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3；
（d）SEQ ID NO：1のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1；
（e）SEQ ID NO：2のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2；および
（f）SEQ ID NO：3のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3
を含む抗体と競合する。
これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、抗体、抗体試薬、またはその抗原結合性フラグメントは、SEQ ID NO：1～3のアミノ酸配列を有する重鎖CDRを含む。これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、抗体、抗体試薬、またはその抗原結合性フラグメントは、SEQ ID NO：1～3のアミノ酸配列またはこのようなアミノ酸配列の保存的置換バリアントを有する重鎖CDRを含む。これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、抗体、抗体試薬、またはその抗原結合性フラグメントは、SEQ ID NO：9～11のアミノ酸配列を有する軽鎖CDRを含む。これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、抗体、抗体試薬、またはその抗原結合性フラグメントは、SEQ ID NO：9～11のアミノ酸配列またはこのようなアミノ酸配列の保存的置換バリアントを有する軽鎖CDRを含む。
これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、抗体、抗体試薬、またはその抗原結合性フラグメントは、以下の重鎖または軽鎖相補性決定領域（CDR）を含む：
（a）SEQ ID NO：9のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1；
（b）SEQ ID NO：10のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2；
（c）SEQ ID NO：11のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3；
（d）SEQ ID NO：1のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1；
（e）SEQ ID NO：2のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2；および
（f）SEQ ID NO：3のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3。
これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、抗体、抗体試薬、またはその抗原結合性フラグメントは、以下の重鎖または軽鎖相補性決定領域（CDR）を含む：
（a）SEQ ID NO：9のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1；
（b）SEQ ID NO：10のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2；
（c）SEQ ID NO：11のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3；
（d）SEQ ID NO：1のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1；
（e）SEQ ID NO：2のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2；および
（f）SEQ ID NO：3のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3；または
（a）～（f）のうちいずれかのアミノ酸配列の保存的置換バリアント。
いくつかの態様では、抗体、抗体試薬、またはその抗原結合部分は、SEQ ID NO：1～3および9～11より選択されるCDRの配列を有する、1つまたは複数のCDR（例えば、1つのCDR、2つのCDR、3つのCDR、4つのCDR、5つのCDR、または6つのCDR）を含むことができる。いくつかの態様では、抗体、抗体試薬、その抗原結合部分、またはCARは、SEQ ID NO：1～3および9～11のCDRの配列を有するCDRを含むことができる。
いずれかの態様の一局面では、DEspRポリペプチドと特異的に結合する抗体、抗原試薬、またはその抗原結合性フラグメントが、本明細書に記載される。これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、抗体、抗原試薬、またはその抗原結合性フラグメントは、
（a）SEQ ID NO：17のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1；
（b）SEQ ID NO：18のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2；
（c）SEQ ID NO：19のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3；
（d）SEQ ID NO：1のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1；
（e）SEQ ID NO：2のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2；および
（f）SEQ ID NO：3のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3；または
（a）～（f）のうち1つもしくは複数の保存的置換バリアントからなる群より選択される少なくとも1つの重鎖または軽鎖相補性決定領域（CDR）を含む。これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、抗体、抗体試薬、またはその抗原結合性フラグメントは、
（a）SEQ ID NO：17のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1；
（b）SEQ ID NO：18のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2；
（c）SEQ ID NO：19のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3；
（d）SEQ ID NO：1のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1；
（e）SEQ ID NO：2のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2；および
（f）SEQ ID NO：3のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3
からなる群より選択される少なくとも1つの重鎖または軽鎖相補性決定領域（CDR）を含む。
これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、抗体、抗体試薬、またはその抗原結合部分は、DEspRと特異的に結合し、かつ結合について
（a）SEQ ID NO：17のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1；
（b）SEQ ID NO：18のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2；
（c）SEQ ID NO：19のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3；
（d）SEQ ID NO：1のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1；
（e）SEQ ID NO：2のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2；および
（f）SEQ ID NO：3のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3
を含む抗体と競合する。
これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、抗体、抗体試薬、またはその抗原結合性フラグメントは、SEQ ID NO：1～3のアミノ酸配列を有する重鎖CDRを含む。これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、抗体、抗体試薬、またはその抗原結合性フラグメントは、SEQ ID NO：1～3のアミノ酸配列またはこのようなアミノ酸配列の保存的置換バリアントを有する重鎖CDRを含む。これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、抗体、抗体試薬、またはその抗原結合性フラグメントは、SEQ ID NO：17～19のアミノ酸配列を有する軽鎖CDRを含む。これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、抗体、抗体試薬、またはその抗原結合性フラグメントは、SEQ ID NO：17～19のアミノ酸配列またはこのようなアミノ酸配列の保存的置換バリアントを有する軽鎖CDRを含む。
これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、抗体、抗体試薬、またはその抗原結合性フラグメントは、以下の重鎖または軽鎖相補性決定領域（CDR）を含む：
（a）SEQ ID NO：17のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1；
（b）SEQ ID NO：18のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2；
（c）SEQ ID NO：19のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3；
（d）SEQ ID NO：1のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1；
（e）SEQ ID NO：2のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2；および
（f）SEQ ID NO：3のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3。
これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、抗体、抗体試薬、またはその抗原結合性フラグメントは、以下の重鎖または軽鎖相補性決定領域（CDR）を含む：
（a）SEQ ID NO：17のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1；
（b）SEQ ID NO：18のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2；
（c）SEQ ID NO：19のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3；
（d）SEQ ID NO：1のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1；
（e）SEQ ID NO：2のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2；および
（f）SEQ ID NO：3のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3；または
（a）～（f）のうちいずれかのアミノ酸配列の保存的置換バリアント。
いくつかの態様では、抗体、抗体試薬、またはその抗原結合部分は、SEQ ID NO：1～3および17～19より選択されるCDRの配列を有する1つまたは複数のCDR（例えば、1つのCDR、2つのCDR、3つのCDR、4つのCDR、5つのCDR、または6つのCDR）を含むことができる。いくつかの態様では、抗体、抗体試薬、その抗原結合部分、またはCARは、SEQ ID NO：1～3および17～19のCDRの配列を有するCDRを含むことができる。
いずれかの態様の一局面では、DEspRポリペプチドと特異的に結合する抗体、抗原試薬、またはその抗原結合性フラグメントが、本明細書に記載される。これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、抗体、抗原試薬、またはその抗原結合性フラグメントは、
（a）SEQ ID NO：13のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1；
（b）SEQ ID NO：14のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2；
（c）SEQ ID NO：15のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3；
（d）SEQ ID NO：5のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1；
（e）SEQ ID NO：6のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2；および
（f）SEQ ID NO：7のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3；または
（a）～（f）のうち1つもしくは複数の保存的置換バリアント
からなる群より選択される少なくとも1つの重鎖または軽鎖相補性決定領域（CDR）を含む。これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、抗体、抗体試薬、またはその抗原結合性フラグメントは、
（a）SEQ ID NO：13のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1；
（b）SEQ ID NO：14のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2；
（c）SEQ ID NO：15のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3；
（d）SEQ ID NO：5のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1；
（e）SEQ ID NO：6のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2；および
（f）SEQ ID NO：7のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3
からなる群より選択される少なくとも1つの重鎖または軽鎖相補性決定領域（CDR）を含む。
これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、抗体、抗体試薬、またはその抗原結合部分は、DEspRと特異的に結合し、かつ結合について
（a）SEQ ID NO：13のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1；
（b）SEQ ID NO：14のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2；
（c）SEQ ID NO：15のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3；
（d）SEQ ID NO：5のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1；
（e）SEQ ID NO：6のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2；および
（f）SEQ ID NO：7のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3
を含む抗体と競合する。
これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、抗体、抗体試薬、またはその抗原結合性フラグメントは、SEQ ID NO：5～7のアミノ酸配列を有する重鎖CDRを含む。これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、抗体、抗体試薬、またはその抗原結合性フラグメントは、SEQ ID NO：5～7のアミノ酸配列またはこのようなアミノ酸配列の保存的置換バリアントを有する重鎖CDRを含む。これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、抗体、抗体試薬、またはその抗原結合性フラグメントは、SEQ ID NO：13～15のアミノ酸配列を有する軽鎖CDRを含む。これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、抗体、抗体試薬、またはその抗原結合性フラグメントは、SEQ ID NO：13～15のアミノ酸配列またはこのようなアミノ酸配列の保存的置換バリアントを有する軽鎖CDRを含む。
これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、抗体、抗体試薬、またはその抗原結合性フラグメントは、以下の重鎖または軽鎖相補性決定領域（CDR）を含む：
（a）SEQ ID NO：13のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1；
（b）SEQ ID NO：14のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2；
（c）SEQ ID NO：15のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3；
（d）SEQ ID NO：5のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1；
（e）SEQ ID NO：6のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2；および
（f）SEQ ID NO：7のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3。
これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、抗体、抗体試薬、またはその抗原結合性フラグメントは、以下の重鎖または軽鎖相補性決定領域（CDR）を含む：
（a）SEQ ID NO：13のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1；
（b）SEQ ID NO：14のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2；
（c）SEQ ID NO：15のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3；
（d）SEQ ID NO：5のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1；
（e）SEQ ID NO：6のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2；および
（f）SEQ ID NO：7のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3；または
（a）～（f）のうちいずれかのアミノ酸配列の保存的置換バリアント。
いくつかの態様では、抗体、抗体試薬、またはその抗原結合部分は、SEQ ID NO：5～7および13～15より選択されるCDRの配列を有する1つまたは複数のCDR（例えば、1つのCDR、2つのCDR、3つのCDR、4つのCDR、5つのCDR、または6つのCDR）を含むことができる。いくつかの態様では、抗体、抗体試薬、その抗原結合部分、またはCARは、SEQ ID NO：5～7および13～15のCDRの配列を有するCDRを含むことができる。
いずれかの態様の一局面では、DEspRポリペプチドと特異的に結合する抗体、抗原試薬、またはその抗原結合性フラグメントが、本明細書に記載される。これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、抗体、抗原試薬、またはその抗原結合性フラグメントは、
（a）SEQ ID NO：25のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1；
（b）SEQ ID NO：26のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2；
（c）SEQ ID NO：27のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3；
（d）SEQ ID NO：21のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1；
（e）SEQ ID NO：22のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2；および
（f）SEQ ID NO：23のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3；または
（a）～（f）のうち1つもしくは複数の保存的置換バリアント
からなる群より選択される少なくとも1つの重鎖または軽鎖相補性決定領域（CDR）を含む。これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、抗体、抗体試薬、またはその抗原結合性フラグメントは、
（a）SEQ ID NO：25のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1；
（b）SEQ ID NO：26のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2；
（c）SEQ ID NO：27のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3；
（d）SEQ ID NO：21のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1；
（e）SEQ ID NO：22のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2；および
（f）SEQ ID NO：23のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3
からなる群より選択される少なくとも1つの重鎖または軽鎖相補性決定領域（CDR）を含む。
これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、抗体、抗体試薬、またはその抗原結合部分は、DEspRと特異的に結合し、かつ結合について
（a）SEQ ID NO：25のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1；
（b）SEQ ID NO：26のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2；
（c）SEQ ID NO：27のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3；
（d）SEQ ID NO：21のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1；
（e）SEQ ID NO：22のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2；および
（f）SEQ ID NO：23のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3
を含む抗体と競合する。
これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、抗体、抗体試薬、またはその抗原結合性フラグメントは、SEQ ID NO：21～23のアミノ酸配列を有する重鎖CDRを含む。これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、抗体、抗体試薬、またはその抗原結合性フラグメントは、SEQ ID NO：21～23のアミノ酸配列またはこのようなアミノ酸配列の保存的置換バリアントを有する重鎖CDRを含む。これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、抗体、抗体試薬、またはその抗原結合性フラグメントは、SEQ ID NO：25～27のアミノ酸配列を有する軽鎖CDRを含む。これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、抗体、抗体試薬、またはその抗原結合性フラグメントは、SEQ ID NO：25～27のアミノ酸配列またはこのようなアミノ酸配列の保存的置換バリアントを有する軽鎖CDRを含む。
これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、抗体、抗体試薬、またはその抗原結合性フラグメントは、以下の重鎖または軽鎖相補性決定領域（CDR）を含む：
（a）SEQ ID NO：25のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1；
（b）SEQ ID NO：26のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2；
（c）SEQ ID NO：27のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3；
（d）SEQ ID NO：21のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1；
（e）SEQ ID NO：22のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2；および
（f）SEQ ID NO：23のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3。
これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、抗体、抗体試薬、またはその抗原結合性フラグメントは、以下の重鎖または軽鎖相補性決定領域（CDR）を含む：
（a）SEQ ID NO：25のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1；
（b）SEQ ID NO：26のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2；
（c）SEQ ID NO：27のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3；
（d）SEQ ID NO：21のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1；
（e）SEQ ID NO：22のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2；および
（f）SEQ ID NO：23のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3；または
（a）～（f）のうちいずれかのアミノ酸配列の保存的置換バリアント。
いくつかの態様では、抗体、抗体試薬、またはその抗原結合部分は、SEQ ID NO：21～23および25～27より選択されるCDRの配列を有する1つまたは複数のCDR（例えば、1つのCDR、2つのCDR、3つのCDR、4つのCDR、5つのCDR、または6つのCDR）を含むことができる。いくつかの態様では、抗体、抗体試薬、その抗原結合部分、またはCARは、SEQ ID NO：21～23および25～27のCDRの配列を有するCDRを含むことができる。
いずれかの態様の一局面では、DEspRポリペプチドと特異的に結合する抗体、抗原試薬、またはその抗原結合性フラグメントが、本明細書に記載される。これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、抗体、抗原試薬、またはその抗原結合性フラグメントは、
（a）SEQ ID NO：33のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1；
（b）SEQ ID NO：34のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2；
（c）SEQ ID NO：35のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3；
（d）SEQ ID NO：29のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1；
（e）SEQ ID NO：30のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2；および
（f）SEQ ID NO：31のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3；または
（a）～（f）のうち1つもしくは複数の保存的置換バリアント
からなる群より選択される少なくとも1つの重鎖または軽鎖相補性決定領域（CDR）を含む。これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、抗体、抗体試薬、またはその抗原結合性フラグメントは、
（a）SEQ ID NO：33のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1；
（b）SEQ ID NO：34のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2；
（c）SEQ ID NO：35のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3；
（d）SEQ ID NO：29のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1；
（e）SEQ ID NO：30のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2；および
（f）SEQ ID NO：31のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3
からなる群より選択される少なくとも1つの重鎖または軽鎖相補性決定領域（CDR）を含む。
これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、抗体、抗体試薬、またはその抗原結合部分は、DEspRと特異的に結合し、かつ結合について
（a）SEQ ID NO：33のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1；
（b）SEQ ID NO：34のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2；
（c）SEQ ID NO：35のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3；
（d）SEQ ID NO：29のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1；
（e）SEQ ID NO：30のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2；および
（f）SEQ ID NO：31のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3
を含む抗体と競合する。
これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、抗体、抗体試薬、またはその抗原結合性フラグメントは、SEQ ID NO：29～31のアミノ酸配列を有する重鎖CDRを含む。これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、抗体、抗体試薬、またはその抗原結合性フラグメントは、SEQ ID NO：29～31のアミノ酸配列またはこのようなアミノ酸配列の保存的置換バリアントを有する重鎖CDRを含む。これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、抗体、抗体試薬、またはその抗原結合性フラグメントは、SEQ ID NO：33～35のアミノ酸配列を有する軽鎖CDRを含む。これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、抗体、抗体試薬、またはその抗原結合性フラグメントは、SEQ ID NO：33～35のアミノ酸配列またはこのようなアミノ酸配列の保存的置換バリアントを有する軽鎖CDRを含む。
これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、抗体、抗体試薬、またはその抗原結合性フラグメントは、以下の重鎖または軽鎖相補性決定領域（CDR）を含む：
（a）SEQ ID NO：33のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1；
（b）SEQ ID NO：34のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2；
（c）SEQ ID NO：35のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3；
（d）SEQ ID NO：29のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1；
（e）SEQ ID NO：30のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2；および
（f）SEQ ID NO：31のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3。
これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、抗体、抗体試薬、またはその抗原結合性フラグメントは、以下の重鎖または軽鎖相補性決定領域（CDR）を含む：
（a）SEQ ID NO：33のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1；
（b）SEQ ID NO：34のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2；
（c）SEQ ID NO：35のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3；
（d）SEQ ID NO：29のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1；
（e）SEQ ID NO：30のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2；および
（f）SEQ ID NO：31のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3；または
（a）～（f）のうちいずれかのアミノ酸配列の保存的置換バリアント。
いくつかの態様では、抗体、抗体試薬、またはその抗原結合部分は、SEQ ID NO：29～31および33～35より選択されるCDRの配列を有する1つまたは複数のCDR（例えば、1つのCDR、2つのCDR、3つのCDR、4つのCDR、5つのCDR、または6つのCDR）を含むことができる。いくつかの態様では、抗体、抗体試薬、その抗原結合部分、またはCARは、SEQ ID NO：29～31および33～35のCDRの配列を有するCDRを含むことができる。
いくつかの態様では、抗体、抗体試薬、またはその抗原結合部分は、表3の抗体のCDRと少なくとも90％の相同性、少なくとも95％の相同性、少なくとも97％の相同性、少なくとも98％の相同性、またはこれ超を有するCDRを含むことができる。当業者により理解されるように、異なる配列においてどの残基が相互に「対応する」かを考慮する場合、別の配列と比べて一方の配列中に指定の長さのギャップを容認することによるなどの、配列の相同性の程度を決定するために配列の比較が可能な、多様なアルゴリズムが利用可能である。CDR変異体などの抗体変異体を得るための一手順は、「アラニンスキャニング変異誘発」である（Cunningham & Wells, Science 244:1081-1085 (1989)；およびCunningham & Wells, Proc Nat Acad Sci USA 84:6434-6437 (1991)）。超可変領域残基のうち1つまたは複数が、アラニンまたはポリアラニン残基により置き換えられる。次いで、置換に対して機能感受性を示す超可変領域残基が、置換部位に、または置換部位の代わりにさらなる変異または他の変異を導入することによって精密化される。したがって、アミノ酸配列の変化を導入するための部位が予め決まっているのに対し、変異自体の性質が予め決まっている必要はない。スキャニングされる残基の所望の性質に応じて、類似の置換を他のアミノ酸で試みることができる。改変すべきアミノ酸残基を同定するためのより系統的な方法は、DEspRとの結合に関与する超可変領域残基およびDEspRとの結合にほとんどまたはまったく関与しない超可変領域残基を同定することを含む。非結合性超可変領域残基のアラニンスキャンは、各ala変異体をDEspRとの結合強化について試験して行われる。別の態様では、DEspRとの結合に顕著に関与する残基が、改変のため選択される。改変は、残基の欠失または関心対象の残基に隣接する1つもしくは複数の残基の挿入を伴うことができる。しかし、通常、改変は、別のアミノ酸による残基の置換を伴う。保存的置換は、最初の置換であることができる。このような置換が、結果として生物学的活性（例えば、結合親和性）における変化を生じる場合、別の保存的置換を行って、より実質的な変化が得られるかどうか判定することができる。抗体の範囲および生物学的性質の提示におけるいっそうより実質的な改変は、部位に通常固有のアミノ酸と性質がより実質的に異なるアミノ酸を選択することにより達成することができる。したがって、このような置換は、（a）置換領域内のポリペプチド主鎖の、例えばシートまたはらせん形コンフォメーションとしての構造；（b）標的部位での分子の電荷もしくは疎水性、または（c）側鎖の嵩を維持しながら行うことができる。
DEspRと結合する例示的な抗体および抗体試薬は、それぞれがその全体で参照により本明細書に組み入れられる、米国特許出願公開第2017/0058036号および同第2016/0108124号に記載されている。
（表３）Kabatシステムによる例示的な抗DEspR抗体試薬の配列
Figure 0007404230000002
Figure 0007404230000003
いくつかの態様では、本明細書記載の抗体または抗体試薬は、本明細書記載の配列のバリアント、例えば、抗体ポリペプチドの保存的置換バリアントであることができる。いくつかの態様では、バリアントは、保存的改変バリアントである。保存的置換バリアントは、例えば、ネイティブなヌクレオチド配列の変異によって得ることができる。本明細書において指す「バリアント」は、ネイティブなポリペプチドまたは参照ポリペプチドと実質的に相同であるが、1つまたは複数の欠失、挿入または置換のせいでネイティブなポリペプチドまたは参照ポリペプチドと異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。バリアントポリペプチドをコードするDNA配列は、ネイティブなDNA配列または参照DNA配列と比較した場合にヌクレオチドの1つまたは複数の付加、欠失、または置換を含む配列であって、活性、例えば、関連する標的ポリペプチド、例えばDEspRに対して抗原特異的結合活性を保持するバリアントタンパク質またはその部分をコードする配列を包含する。多種多様なPCRベースの部位特異的変異誘発アプローチはまた、当技術分野において公知であり、当業者により適用されることができる。
当業者であれば、コードされる配列中の単一のアミノ酸または低パーセンテージのアミノ酸を改変する、核酸、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質配列への個別の置換、欠失または付加は、改変が化学的に類似のアミノ酸によるアミノ酸の置換を結果として生じ、標的抗原（例えば、DEspR）と特異的に結合する能力を保持する、「保存的改変バリアント」であることを認識しているであろう。このような保存的改変バリアントは、本開示において一致する多形バリアント、種間相同体、および対立遺伝子に追加されるものであり、それらを排除しない。
置換バリアントの例には、CDRの配列を改変しない、例えばVHまたはVLドメイン中の、アミノ酸の保存的置換が挙げられる。CDRにより含まれない配列中の保存的置換は、野生型配列または天然配列、例えば、抗体配列のヒトまたはマウスのフレームワークおよび／または定常領域と比べた置換であることができる。いくつかの態様では、抗体試薬の保存的改変バリアントは、CDR以外に改変を含むことができ、例えば、抗体、抗体試薬、またはその抗原結合部分の保存的改変バリアントは、SEQ ID NO：1～3、9～11、17～19、5～7、13～15、21～23、25～27、29～31、および33～35のうち1つまたは複数の配列を有するCDRを含むことができる。いくつかの態様では、抗体、抗体試薬、またはその抗原結合部分の保存的改変バリアントは、SEQ ID NO：1～3、9～11、17～19、5～7、13～15、21～23、25～27、29～31、および33～35の配列を有するCDRを含むことができる。
例えば、別の残基の代わりに1つの脂肪族残基に置換して（相互にIle、Val、Leu、もしくはAlaなど）、または別の残基の代わりに1つの極性残基に置換して（LysおよびArg；GluおよびAsp；またはGlnおよびAsnの間など）、所与のアミノ酸を、類似の物理化学的性質を有する残基によって置き換えることができる。他のこのような保存的置換、例えば、類似の疎水性質を有する領域全体の置換は、周知である。保存的アミノ酸置換を含むポリペプチドは、本明細書記載のアッセイのうち任意の1つで試験して、所望の活性、例えば、抗原結合活性、およびネイティブなポリペプチドまたは参照ポリペプチドの特異性が保持されていることを確認することができる。
アミノ酸は、その側鎖の性質における類似性に従って群分けすることができる（A. L. Lehninger, in Biochemistry、second ed., pp. 73-75, Worth Publishers, New York (1975)）：（1）非極性：Ala（A）、Val（V）、Leu（L）、Ile（I）、Pro（P）、Phe（F）、Trp（W）、Met（M）；（2）非荷電極性：Gly（G）、Ser（S）、Thr（T）、Cys（C）、Tyr（Y）、Asn（N）、Gln（Q）；（3）酸性：Asp（D）、Glu（E）；（4）塩基性：Lys（K）、Arg（R）、His（H）。あるいは、共通の側鎖性質に基づき天然残基を群に分けることができる：（1）疎水性：ノルロイシン、Met、Ala、Val、Leu、Ile；（2）中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；（3）酸性：Asp、Glu；（4）塩基性：His、Lys、Arg；（5）鎖の配向に影響する残基：Gly、Pro；（6）芳香族：Trp、Tyr、Phe。非保存的置換は、別のクラスの代わりにこれらのクラスのうち1つのメンバーに交換することを必然的に伴うであろう。特定の保存的置換には、例えば；AlaからGlyもしくはSerへ；ArgからLysへ；AsnからGlnもしくはHisへ；AspからGlu；CysからSerへ；GlnからAsnへ；GluからAspへ；GlyからAlaもしくはProへ；HisからAsnもしくはGlnへ；IleからLeuもしくはValへ；LeuからIleもしくはValへ；LysからArg、GlnもしくはGluへ；MetからLeu、TyrもしくはIleへ；PheからMet、LeuもしくはTyrへ；SerからThrへ；ThrからSerへ；TrpからTyrへ；TyrからTrpへ；および／またはPheからVal、IleもしくはLeuへが挙げられる。
バリアントアミノ酸またはDNA配列は、好ましくは、ネイティブな配列または参照配列と少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、またはこれ超、同一である。ネイティブな配列と変異体配列との間の相同性の程度（同一パーセント）は、例えば、ワールドワイドウェブ上でこの目的のために通常採用される、自由に入手可能なコンピュータープログラム（例えば、デフォルトの設定のBLASTpまたはBLASTn）を使用して2つの配列を比較することによって決定することができる。
ネイティブなアミノ酸配列の改変は、当業者に公知のいくつかの技法のうちいずれかによって達成することができる。変異は、例えば、制限部位に隣接する変異体配列を含有するオリゴヌクレオチドを合成して、ネイティブな配列のフラグメントへの連結を可能にすることによって、特定の遺伝子座に導入することができる。連結に続き、結果として生じた、再構成された配列は、所望のアミノ酸の挿入、置換、または欠失を有する類似体をコードする。あるいは、オリゴヌクレオチド定方向部位特異的変異誘発手順を採用して、必要とされる置換、欠失、または挿入に従って改変された特定のコドンを有する改変ヌクレオチド配列を提供することができる。
ポリペプチドの適当なコンフォメーションを維持することに関与しない任意のシステイン残基はまた、一般的にセリンにより置換されて、分子の酸化的安定性を改善し、異所性の架橋を防止することができる。逆に、システイン結合をポリペプチドに付加して、その安定性を改善する、またはオリゴマー化を促進することができる。
本明細書記載の抗体または抗体試薬が、SEQ ID No：1～3、9～11、17～19、5～7、13～15、21～23、25～27、29～31、および33～35の配列と同一ではない少なくとも1つのCDRを含む特定の態様では、その少なくとも1つのCDRのアミノ酸配列は、当業者に周知の方法により選択することができる。例えば、Fujii, 2004, "Antibody affinity maturation by random mutagenesis" in Methods in Molecular Biology: Antibody Engineering 248: 345-349（その全体で参照により本明細書に組み入れられる）の特に図2および3.3節が、関心対象の任意のCDRについてのライブラリーを作製する方法を記載している。これにより、当業者は、本明細書記載の特異的CDR配列の保存的置換バリアントを含めた代替的なCDRであって、本明細書記載の抗体またはその抗原結合部分の中に存在する場合、がん細胞の表面抗原と結合する抗原またはその抗原結合部分を結果として生じるであろうCDRを同定することが可能になる。Fujiiらに記載される方法はまた、当業者が、公知の重鎖フラグメントと組み合わせた場合に所望の結合挙動を与えるであろう軽鎖配列についてスクリーニングすること、およびその逆を可能にする。
これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、本明細書記載のDEspR阻害剤は、二重特異性試薬、例えば、二重特異性抗体または二重特異性抗体試薬であることができる。二重特異性作用物質は、2つの異なる分子と同時に物理的に接触してそれらを阻害することができる分子を含む。これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、二重特異性作用物質は、二重特異性モノクローナル抗体試薬、例えば、bsAbである。これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、二重特異性作用物質は、i）DEspRおよびii）PD1またはPD-L1と同時に物理的に接触してそれらを阻害することができる分子を含む。本明細書において使用される「二重特異性」抗体または抗体試薬という用語は、第1の標的に対して結合特異性を有する結合部位を有する第1のドメイン、および第2の標的に対して結合特異性を有する結合部位を有する第2のドメインを含む抗体または抗体試薬を指し、すなわち、作用物質は、2つの標的、例えば、i）DEspRおよびii）PD1またはPD-L1に対して特異性を有する。第1の標的および第2の標的は、同じでない（すなわち、異なる標的（例えば、タンパク質）である）。いくつかの態様では、異なる標的は、同じ細胞上に同時発現されることができる。いくつかの態様では、二重特異性試薬は、単一の細胞上に存在する標的と結合することができ（ヘテロフィリックなシス結合）、かつ／または1つの細胞上の一方の標的および別の細胞上の他方の標的と結合することができる（ヘテロフィリックなトランス結合）。したがって、本明細書記載の二重特異性試薬は、第1の標的および第2の標的を発現する細胞と選択的および特異的に結合することができる。二重特異性試薬の非限定的な例は、二重特異性抗体構築物である。2つの異なる抗原に特異的な抗体の抗原結合部分を含む二重特異性抗体構築物は、当業者によって容易に構築されることができる。一般的に、一方の抗原上の所望のエピトープと結合すると特徴付けられ、知られている第1の抗体の抗原結合ドメインをコードする配列を、直接的に、または当業者に公知の多様なリンカーのうちいずれかを経由して、第2の抗原上の所望のエピトープと結合すると特徴付けられ、知られている第2の抗体の抗原結合ドメインをコードする配列と繋ぐことができる。当業者に公知の方法によりこのような配列を適切なベクター中に挿入し、細胞に導入して、二重特異性抗体ポリペプチドを産生することができる。PD-1および／またはPD-L1阻害剤（例えば、抗PD1および／または抗PD-L1抗体）は、当技術分野において公知である。
これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、二重特異性抗体試薬は、i）DEspRならびにii）免疫細胞の活性および／または生存をモジュレートする（例えば、阻害する）標的と特異的に結合し、それらを阻害することができる。免疫細胞の活性をモジュレートする標的と結合させる目的は、免疫細胞の活性をシミュレートもしくは阻害すること、例えば、腫瘍サーベイランスのためにT細胞活性を高めること、または免疫細胞と結合して、2つの細胞、例えば、DEspR+好中球およびCD14+マクロファージを近付ける（一緒にまとめる）ことを含むことができる。標的は、例えば、細胞表面受容体、リガンドもしくは細胞外タンパク質、または細胞内タンパク質であることができる。抗DEspR抗体は、DEspRと結合した後にインターナリゼーションされ（例えば、その全体で参照により本明細書に組み入れられるHerrera et al. PLoS One 2014 9:e112335を参照されたい）、DEspRと細胞内標的との両方に結合する二重特異性抗体の使用を可能にすることが以前に実証されている。適切な細胞表面受容体の非限定的な例は、PD1；CTLA-4（例えば、NCBI Gene ID:1493）；TLR-2（例えば、NCBI Gene ID:7097）；TLR-4 （例えば、NCBI Gene ID:7099）；CD14（例えば、NCBI Gene ID:929）；またはCD168（例えば、NCBI Gene ID:3161）である。適切なリガンドまたは細胞外タンパク質の非限定的な例は、PD-L1；CD80（例えば、NCBI Gene ID: 941）:CD86（例えば、NCBI Gene ID: 942）；ミエロペルオキシダーゼ（MPO）（例えば、NCBI Gene ID 4353）；カテプシン-G（例えば、NCBI Gene ID: 1511）；好中球エラスターゼ（NE）（例えば、NCBI Gene ID:1991）、アルギナーゼ-1（例えば、NCBI Gene ID:383）、G-CSF（例えば、CSF3またはNCBI Gene ID:1441）、およびGM-CSF（例えば、CSF2またはNCBI Gene ID:1439）である。適切な細胞内タンパク質の非限定的な例には、Mcl-1（例えば、NCBI Gene ID:4170）；cIAP2（例えば、NCBI Gene ID:330）；STAT3（例えば、NCBI Gene ID:6774）；ERK1/2（例えば NCBI Gene ID:5595および5594）ペプチジルアルギニンデアミナーゼ（PAD4）（例えば、NCBI Gene ID:23569）；ガレクチン1（例えば、NCBI Gene ID:3956）、ガレクチン3（例えば、NCBI Gene ID:3958）、またはRNAアデノシンデアミナーゼ-1（ADAR-1）（例えば、NCBI Gene ID:103）が挙げられる。このような標的に特異的な抗体は、当技術分野において公知であり、例えば、表6に示される通りである。
（表６）
Figure 0007404230000004
Figure 0007404230000005
Figure 0007404230000006
PD1（またはCD279）は、1つの免疫グロブリン（Ig）スーパーファミリードメイン、アミノ酸20個のストーク、膜貫通ドメイン、および免疫受容抑制性チロシンモチーフ（ITIM）のみならず免疫受容スイッチ性チロシンモチーフ（ITSM）を含有する約95残基の細胞内ドメインから構成される、アミノ酸288個のI型膜貫通タンパク質である。PD1は、マウスにおける1番染色体上およびヒトにおける2番染色体上でそれぞれPdcd1およびPDCD1によりコードされる。両方の種において、Pdcd1は、5つのエクソンによってコードされる。エクソン1は、短いシグナル配列をコードする一方で、エクソン2は、Igドメインをコードする。ストークおよび膜貫通ドメインが、エクソン3を構成し、エクソン4は、細胞質ドメインの開始部をマークする短いアミノ酸12個の配列をコードする。エクソン5は、C末端細胞内残基および長い3'UTRを含有する（Keir ME et al., 2008. Annu Rev Immunol. 26:677-704）。PD1は、B7ファミリー受容体のメンバーである。PD-1についての配列は、いくつかの種で公知であり、例えばヒトPD-1（NCBI Gene ID:5133）である。「PD-1」という用語は、任意の天然対立遺伝子、スプライスバリアント、および／またはそのプロセシングされた形態を指す。
PD1は、B7ファミリーのメンバーでもある2つの公知のリガンド、PD-L1およびPD-L2を有する。PD1のPD-L1への結合界面は、そのIgV様ドメイン（すなわち、PD1(42-136)）を介する。PD1のそのリガンドへの結合に重要な残基は、残基64、66、68、73、74、75、76、78、90、122、124、126、128、130、131、132、134、および136を含む。PD-L1/CD274は、マウスT細胞およびB細胞、DC、マクロファージ、間葉系幹細胞、および骨髄由来マスト細胞上に構成性発現されることが示されている。CD274/PD-L1の発現はまた、広範囲の非造血細胞上に見出され、活性化後にいくつかの細胞型でアップレギュレーションされる。PD-L1は、IFN-γを用いた処置を受けて、PA1骨髄腫、P815マスト細胞腫、およびB16黒色腫を含むほぼすべてのマウス腫瘍細胞株上に発現される。PD1への結合に重要なPD-L1の残基は、PD-L1(67)、PD-L1(121)、PD-L1(122)、PD-L1(123)、PD-L1(123)、PD-L1(124)、およびPD-L1(126)を含む。PD-L1についての配列は、いくつかの種で公知であり、例えば、ヒトPD-1（NCBI Gene ID:29126）である。「PD-L1」という用語は、任意の天然対立遺伝子、スプライスバリアント、および／またはそのプロセシングされた形態を指す。
PD-1の阻害は、PD-1またはそのリガンド、PD-L1と結合する抗体を含めた多様なメカニズムによって達成することができる。PD-1およびPD-L1遮断薬の例は、その全体で参照により本明細書に組み入れられる米国特許第7,488,802号；同第7,943,743号；同第8,008,449号；同第8,168,757号；同第8,217,149号、ならびにPCT公開特許出願番号：WO03042402、WO2008156712、WO2010089411、WO2010036959、WO2011066342、WO2011159877、WO2011082400、およびWO2011161699に記載されている。ある特定の態様では、PD-1阻害剤は、抗PD-Ll阻害剤、例えば、抗体を含む。ある特定の他の態様では、PD-1阻害剤は、ニボルマブ（MDX 1106、BMS 936558、ONO 4538）、PD-1と結合してそのリガンドPD-LlおよびPD-L2によるPD-1の活性化を遮断する完全ヒトIgG4抗体；ランブロリズマブ（MK-3475またはSCH 900475）、PD-1に対するヒト化モノクローナルIgG4抗体；CT-011、PD-1と結合するヒト化抗体；AMP-224、B7-DCの融合タンパク質；抗体Fc部分；PD-L1（B7-H1）遮断のためのBMS-936559（MDX-1105-01）などの抗PD-1抗体および類似の結合タンパク質を含む。高親和性PD-L1アンタゴニストなどの、PD-1とPD-L1との間の相互作用を破壊または遮断する作用物質も、本明細書において具体的に考えられている。PD-1阻害剤の非限定的な例として、ペムブロリズマブ（Merck）；ニボルマブ（Bristol Meyers Squibb）；ピディリズマブ（Medivation）；およびAUNP12（Aurigene）を挙げることができる。
PD-L1阻害剤の非限定的な例として、アテゾリズマブ（Genentech）；MPDL3280A（Roche）；MEDI4736（AstraZeneca）；MSB0010718C（EMD Serono）；アベルマブ（Merck）；およびデュルバルマブ（Medimmune）を挙げることができる。
CTLA-4阻害剤の非限定的な例として、アバタセプト,イピリムマブおよびトレメリムマブを挙げることができる。
DEspRに対する二重特異性抗体試薬および本明細書記載の任意の標的は、本明細書記載または当技術分野において公知の任意の標的特異的抗体のCDRを使用して容易に調製される。
本明細書記載の抗体試薬をさらに改変して、例えば、免疫原性または半減期を改善することができる。例えば、本明細書記載の抗体試薬は、IgG4抗体試薬および／またはヒンジ安定化IgG4抗体試薬であることができる。これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、ヒンジの安定化は、例えば、本明細書の実施例に記載されるように、野生型IgG4配列と比べてS228P変異を含むことができる。
本明細書記載の抗体試薬は、抗体試薬を含みかつ／または発現する細胞を投与することによって対象に投与することができる。例えば、細胞は、T細胞、CAR-T細胞、または養子移入T細胞であることができる。これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、抗体試薬は、キメラ抗原受容体（CAR）である。これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、本明細書記載の抗体試薬は、CARではなく、細胞は、CARに加えて本明細書記載の抗体試薬を含む。CAR-T細胞および関連する治療法は、対象を処置するための、標的細胞型（例えば、がん細胞）と特異的に結合するCARを発現する免疫細胞（例えば、T細胞）の養子細胞移入に関する。これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、治療法の一部として投与される細胞は、対象に対して自己由来であることができる。これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、治療法の一部として投与される細胞は、対象に対して自己由来ではない。これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、細胞は、CARおよび／または本明細書記載の抗体試薬を発現するように操作および／または遺伝的に改変される。CAR、CAR-T、および他の養子細胞移入技法は、当技術分野において周知である。CAR-T療法のさらなる論述は、例えば、それぞれがその全体で参照により本明細書に組み入れられる、Maus et al. Blood 2014 123:2624-35；Reardon et al. Neuro-Oncology 2014 16:1441-1458；Hoyos et al. Haematologica 2012 97:1622；Byrd et al. J Clin Oncol 2014 32:3039-47；Maher et al. Cancer Res 2009 69:4559-4562；およびTamada et al. Clin Cancer Res 2012 18:6436-6445に見出すことができる。
これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、本明細書記載のDEspR阻害剤、または抗DEspR抗体試薬、または二重特異性抗体試薬は、抗体-薬物コンジュゲートである。抗体-薬物コンジュゲートは、少なくとも1種の抗DEspR抗体試薬および当該抗体試薬とコンジュゲートした少なくとも1種の薬物を含むことができる。
特定の態様では、抗体-薬物コンジュゲートは、本明細書記載の抗体、抗体試薬、またはその抗原結合部分を含む。薬物は、例えば、本明細書の他の箇所に記載の化学療法分子であることができる。これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、抗体-薬物コンジュゲートは、抗体またはその抗原結合部分と直接的にコンジュゲートおよび／または結合した化学療法剤を含む。これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、結合は、非共有結合、例えば、水素結合、静電、またはファンデルワールス相互作用であることができるが、結合はまた、共有結合である場合がある。「コンジュゲートする」ことにより、少なくとも2つの分子の共有結合的連結が意味される。これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、組成物は、抗体-薬物コンジュゲートであることができる。
これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、抗体、抗体試薬、またはその抗原結合部分は、複数の化学療法薬分子と結合および／またはコンジュゲートすることができる。これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、抗体-薬物コンジュゲートは、複数の化学療法薬分子と結合および／またはコンジュゲートすることができる。これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、所与の化学療法分子と抗体またはその抗原結合部分との比は、約1：1～約1,000：1であることができ、例えば、単一の抗体試薬分子が、約1～約1,000個の個別の化学療法分子と連結、コンジュゲートなどをすることができる。
これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、抗体またはその抗原結合部分、および化学療法剤は、足場材料中に存在することができる。治療用組成物における使用に適した足場材料は、当技術分野において公知であるが、非限定的に、ナノ粒子；マトリックス；ヒドロゲル；ならびに生体材料、生体適合性、および／または生分解性足場材料を含むことができる。本明細書において使用される「ナノ粒子」という用語は、約10-9メートルまたは10億分の1～数10億分の1メートル程度の粒子を指す。「ナノ粒子」という用語は、ナノスフェア；ナノロッド；ナノシェル；およびナノプリズム（nanoprism）を含み；これらのナノ粒子は、ナノネットワークの部分である場合がある。
「ナノ粒子」という用語はまた、ナノ粒子のサイズを有するリポソームおよび脂質粒子を包含する。本明細書において使用される「マトリックス」という用語は、本明細書記載の組成物の成分（例えば、抗体またはその抗原結合部分）を含む三次元構造を指す。マトリックス構造の非限定的な例には、泡状物質；ヒドロゲル；エレクトロスパン繊維；ゲル；繊維マット；スポンジ；三次元足場；不織マット；織物；ニット材料；ファイバーバンドル；ならびに繊維および他の材料形式が挙げられる（例えば、それぞれがその全体で参照により本明細書に組み入れられるRockwood et al. Nature Protocols 2011 6:1612-1631および米国特許出願公開第2011/0167602号；同第2011/0009960号；同第2012/0296352号；および米国特許第8,172,901号を参照されたい）。マトリックスの構造は、組成物の意図される適用に応じて当業者により選択されることができ、例えば、エレクトロスパンマトリックスは、泡状物質よりも大きな表面積を有することができる。
これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、足場は、ヒドロゲルである。本明細書において使用される「ヒドロゲル」という用語は、水に不溶であるが、大量の水を吸収および保持して、安定な、しばしば柔らかく曲げやすい構造を形成することが可能な、三次元ポリマー構造を指す。これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、水は、ポリマーネットワークのポリマー鎖の間に浸透して、その後、ヒドロゲルの膨潤および形成を引き起こすことができる。一般に、ヒドロゲルは超吸収性である。ヒドロゲルは、生物医学適用に多くの望ましい性質を有する。例えばヒドロゲルは、無毒で組織と適合するように作ることができ、それらは、高度に水、イオン、および小分子透過性である。ヒドロゲルは、超吸収性であり（99％を超える水を含有することができる）、天然ポリマー（例えば、絹）または合成ポリマー、例えば、PEGから構成されることができる。
本明細書において使用される「生体材料」は、生体適合性および生分解性である材料を指す。本明細書において使用される「生体適合性」という用語は、細胞に無毒である物質を指す。これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、細胞への物質のインビトロ添加が、結果として約20％以下の細胞死を生じる場合に、当該物質は、「生体適合性」であると見なされる。これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、細胞への物質のインビボ添加が、インビボで炎症および／または他の有害作用を誘導しない場合に、当該物質は、「生体適合性」であると見なされる。本明細書において使用される「生分解性」という用語は、生理条件下で分解される物質を指す。これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、生分解性物質は、細胞機構により分解される物質である。これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、生分解性物質は、化学工程により分解される物質である。
抗体-薬物コンジュゲートに使用するための例示的な薬物は、血栓溶解薬、化学療法薬、ナノ粒子、ポリペプチド、イメージング剤、フルオロフォア、小分子、酵素、核酸分子、または化学物質を含むことができる。化学療法薬の非限定的な例には、メルタンシン、エムタンシン、ゲムシタビン、テモゾロミド、パクリタキセル、またはシスプラチン/オキサリプラチンが挙げられる。ナノ粒子の非限定的な例には、酸化鉄ナノ粒子（IONP）、ポリマーナノ粒子、または金ナノ粒子、またはキメラナノ粒子が挙げられる。酵素の非限定的な例には、DNaseI、例えば、ヒトDNaseI、DNaseI、マトリックスメタロプロテアーゼ1（MMP1）、マトリックスメタロプロテアーゼ2（MMP2）、マトリックスメタロプロテアーゼ3（MMP3）、組織メタロプロテアーゼ阻害物質（TIMP）、プロテアーゼ、リコンビナーゼ、またはプラスミノーゲン活性化因子が挙げられる。ポリペプチドの非限定的な例には、キモスタチン、アンジオポエチン1/2、およびSDF-1が挙げられる。化学物質の非限定的な例には、4-アミノ安息香酸ヒドラジドまたはNX-059ニトロンが挙げられる。本明細書記載の方法のいくつかの態様では、対象は、PD1および／またはPD-L1阻害剤療法を、例えば、順次または同時に、例えば、同じ組成物または別々の組成物として、さらに投与される対象であることができる。核酸分子の非限定的な例として、RNA阻害剤（siRNA、miRNA）またはRNAモジュレーター（miRNA）または転写因子デコイ（DNAデコイ）を挙げることができる。
PD-1および／またはPD-L1阻害剤療法は、PD-1および／もしくはPD-L1と結合し、それにより、それらの活性を阻害し、かつ／またはPD-1および／もしくはPD-L1発現細胞のアポトーシスもしくは食作用を増加させる、抗体、抗体試薬、CAR-T、または他の分子を含むことができる。
本明細書記載の方法のいくつかの態様では、対象は、PD1および／またはPD-L1阻害剤療法を以前に投与された対象であることができる。本明細書記載の方法のいくつかの態様では、対象は、PD1および／またはPD-L1阻害剤療法を用いた処置に抵抗性の可能性がある。抵抗性は、先天的な可能性があり、例えば、腫瘍がPD1および／もしくはPD-L1阻害剤療法に決して応答しなかったか、または抵抗性は、PD1および／もしくはPD-L1阻害剤療法を用いた処置の過程で発生する可能性がある。本明細書記載の方法のいくつかの態様では、対象は、PD1および／またはPD-L1阻害剤療法を用いた処置から毒性を有する、例えば、PD1および／またはPD-L1阻害剤療法の投与が、望ましくない副作用、例えば、PD1および／またはPD-L1阻害剤療法の休止を必要とした副作用を引き起こした、対象であることができる。
本明細書記載の方法のいくつかの態様では、対象は、さらなる免疫療法を以前に施された対象であることができる。本明細書記載の方法のいくつかの態様では、対象は、さらなる免疫療法を用いた処置に抵抗性の可能性がある。抵抗性は、例えば、腫瘍がさらなる免疫療法に決して応答しなかったという生得的な可能性がある、または抵抗性は、免疫療法を用いた処置の過程で発生する可能性がある。本明細書記載の方法のいくつかの態様では、対象は、さらなる免疫療法を用いた処置から毒性を有する、例えば、免疫療法の投与が、望ましくない副作用、例えば、免疫療法の休止を必要とした副作用を引き起こした、対象であることができる。これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、さらなる免疫療法は、PD1および／またはPD-L1阻害剤療法であることができる。
本明細書において使用される「免疫療法」は、患者自身の免疫系が疾患、例えば、がんまたは腫瘍と戦うことを誘導するように設計された治療戦略の多種多様なセットを指す。免疫療法の非限定的な例として、表在性膀胱癌に対する膀胱内BCG免疫療法、悪性黒色腫および腎細胞癌などに対する特異免疫応答を生成するためのワクチン、前立腺由来細胞に対する特異免疫応答を誘導するために患者からの樹状細胞に前立腺酸性ホスファターゼペプチドを負荷する、前立腺癌に対するシプロイセル-Tの使用、1つもしくは複数の免疫細胞型を刺激するサイトカイン、成長因子および／もしくはシグナル伝達分子（例えば、インターロイキン）の投与、患者に再導入する前の腫瘍抗原特異的リンパ球および／もしくは樹状細胞のエクスビボ増大および／もしくは刺激、イミキモド、養子細胞移入、ならびに/または例えば、国際公開公報第2003/063792号および米国特許第8,329,660号に記載された方法を挙げることができる。いくつかの態様では、免疫療法は、NK応答を刺激する。いくつかの態様では、免疫療法は、養子細胞移入アプローチ、すなわち、養子免疫療法である。いくつかの態様では、本明細書記載の方法は、対象に追加的な抗体、抗体試薬、その抗原結合部分、またはCARを含むT細胞を投与することをさらに含むことができる。いくつかの態様では、本明細書記載の方法は、対象に1種または複数種のサイトカインを投与することをさらに含むことができる。抗体に基づくおよびサイトカインに基づく治療法は、当技術分野において公知であり、非限定的な例として、アレムツズマブ；ベバシズマブ；ブレンツキシマブベドチン；セツキシマブ；ゲムツズマブ；イブリツモマブチウキセタン；イピリムマブ；オファツムマブ；パンチブムマブ（pantibumumab）；リツキシマブ；トシツモマブ；トラスツズマブ；インターロイキン-2、およびインターフェロン-アルファを挙げることができる。
これらの態様のいずれかの一局面では、本明細書における局面または態様のいずれかに記載される、DEspR阻害剤、抗DEspR抗体試薬、抗体-薬物コンジュゲート、および／または二重特異性試薬が、本明細書に記載される。
これらの態様のいずれかの一局面では、好中球が、それを必要としている対象において、疾患の発症または悪化の一因となる病態または疾患を処置する方法であって、治療有効量のDEspR阻害剤を対象に投与する段階を含む方法が、本明細書に記載される。
いずれかの態様の一局面では、好中球、NET、またはネトーシスを起こしている好中球もしくはNETを形成している好中球が、それを必要としている対象において、疾患の発症、慢性化、または悪化の一因となる病態または疾患を処置する方法であって、治療有効量のDEspR阻害剤を対象に投与する段階を含む方法が、本明細書に記載される。
いずれかの態様の一局面では、それを必要としている対象において、NET放出またはactPMNネトーシスを防止または減少させる方法であって、別の抗好中球または抗NET試薬（例えば、第2の抗好中球または抗NET試薬）とコンジュゲートした抗DEspR抗体試薬の治療有効量を投与する段階を含む方法が、本明細書に記載される。
好中球が、疾患の発症または悪化の一因となる病態または疾患は、好中球、例えば、活性化好中球の活性および／またはレベルが、疾患自体の症状または疾患に対する反応であるのとは対照的に、病態の病理の一因となる、例えば、疾患の発生または原因の一因となる任意の疾患である。このような病態は、当技術分野において公知であり、非限定的な例として、全身性炎症反応症候群（SIRS）；急性肺傷害（ALI）；急性呼吸窮迫症候群（ARDS）；例えば、ARDS、出血性ショック、手術、熱傷、または敗血症による多臓器不全または多臓器機能障害症候群（MOS）；敗血症,；敗血症性凝固障害；外傷；多発性硬化症；急性腎障害（AKI）；AKI関連尿細管壊死および遠隔臓器損傷；外傷後手術；出血性ショック；感染症、または薬物もしくは任意の作用物質により誘発されるサイトカインストーム；虚血性または出血性脳卒中；脳卒中における二次性脳損傷；心筋虚血/梗塞；アテローム性動脈硬化性不安定プラーク；アテローム性動脈硬化性血栓症；冠動脈疾患；急性冠症候群；心不全；再灌流傷害；腎透析患者における共存症（例えば、血栓症および内皮機能障害）；脳の虚血性または薬物誘導出血性変化、出血性脳症、外傷性脳損傷；無酸素性脳損傷、慢性腎臓病；がん；actPMN依存性がん；糖尿病；1型糖尿病；2型糖尿病；血管障害；脈管障害；終末器官合併症（例えば、網膜症または糖尿病性腎臓病）；糖尿病性潰瘍の創傷治癒不良；深部静脈血栓症；がん；がん転移；全身性微小血栓症；化学療法誘導性微小血栓症；アテローム性動脈硬化性血栓症；全身性エリテマトーデス（SLE）；ループス腎炎；SLE促進アテローム性動脈硬化症；関節リウマチ；COPD；嚢胞性線維症；肺疾患；アルツハイマー病；鎌状赤血球症；炎症性腸疾患（IBD）；クローン病；潰瘍性大腸炎；ならびに分類不能大腸炎を挙げることができる。
これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、本明細書記載の方法により処置される対象は、全身性炎症反応症候群（SIRS）；急性肺傷害（ALI）；急性呼吸窮迫症候群（ARDS）；例えば、ARDS、出血性ショック、手術、熱傷、または敗血症による多臓器不全または多臓器機能障害症候群（MOS）；敗血症；敗血症性凝固障害；外傷；多発性硬化症；急性腎障害（AKI）；AKI関連尿細管壊死および遠隔臓器損傷；外傷後手術；出血性ショック；感染症、または薬物もしくは任意の作用物質により誘発されるサイトカインストーム；虚血性または出血性脳卒中；脳卒中における二次性脳損傷；心筋虚血/梗塞；アテローム性動脈硬化性不安定プラーク；アテローム性動脈硬化性血栓症；冠動脈疾患；急性冠症候群；心不全；再灌流傷害；腎透析患者における共存症（例えば、血栓症および内皮機能障害）；脳の虚血性または薬物誘導出血性変化、出血性脳症、外傷性脳損傷；無酸素性脳損傷、慢性腎臓病；がん；actPMN依存性がん；糖尿病；1型糖尿病；2型糖尿病；血管障害；脈管障害；終末器官合併症（例えば、網膜症または糖尿病性腎臓病）；糖尿病性潰瘍の創傷治癒不良；深部静脈血栓症；がん；がん転移；全身性微小血栓症；化学療法誘導性微小血栓症；アテローム性動脈硬化性血栓症；全身性エリテマトーデス（SLE）；ループス腎炎；SLE促進アテローム性動脈硬化症；関節リウマチ；COPD；嚢胞性線維症；肺疾患；アルツハイマー病；鎌状赤血球症；炎症性腸疾患（IBD）；クローン病；潰瘍性大腸炎；ならびに分類不能大腸炎を有するまたは有すると診断された対象であることができる。
好中球は、多発性硬化症における増悪発作に関係付けられている。したがって、本明細書記載の方法は、多発性硬化症の処置に関係することができる。好中球は、現時点で処置法がない急性腎障害に関係付けられている。したがって、本明細書記載の方法は、急性腎障害の処置に関係することができる。免疫回避は、前がん病変の悪性病変へ、または微小転移性病変のマクロ転移への進行に関係付けられている。好中球は、免疫サーベイランスにおけるその役割でT細胞を阻害する物質を放出することにより免疫回避の一因となるので、DEspR+好中球におけるDEspR媒介生存の増加は、前がんから悪性腫瘍へのスイッチの一因となる。したがって、本明細書記載の方法は、前がん病変の処置に関係することができる。とりわけ、いくつかのがんが、以前の感染症および／または好中球増加症と関連し、膵炎は、膵臓癌についての危険因子であり、好中球増加症は、肺癌と結びついている喫煙により誘発される。
これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、本明細書記載の方法により処置される対象は、がんを有するまたは有すると診断されている可能性があり、PD-L1+/DEspR+腫瘍および／またはがん細胞を有する。特定のマーカーまたはポリペプチドについて「陽性」である細胞または腫瘍は、例えば、同じ種類の健康な細胞、または同じ種類の健康な細胞中に見出されるマーカーもしくはポリペプチドの平均レベルと比較して増加したレベルのマーカーまたはポリペプチドを発現する細胞または腫瘍である。いくつかの態様では、マーカーまたはポリペプチドの増加したレベルは、参照において見出されるレベルの少なくとも1.5倍、例えば、参照レベルよりも1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍のレベル、またはこれを上回るレベルであることができる。
これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、本明細書記載の方法により処置される対象は、がんを有するまたは有すると診断されている可能性があり、かつ腫瘍切除により以前に処置されたことがある。これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、がんは、膵管腺癌、膠芽腫、肺癌、乳癌、トリプルネガティブ乳癌、黒色腫、または結腸直腸癌である。
いくつかの態様では、本明細書記載の方法により処置される対象は、PD-L1+/DespR+腫瘍；増加したレベルの循環DEspR+好中球；増加したレベルのDEspR+活性化好中球；増加したレベルのNET；増加した血漿中レベルの好中球エラスターゼ（NE）；増加した血漿中レベルの好中球ミエロペルオキシダーゼ（MPO）；または、DEspR+好中球、ネトーシスを起こしているDEspR+好中球、NET、増加したレベルの好中球放出免疫抑制物質、増加したレベルのシトルリン化ヒストン-3、および増加したレベルの好中球刺激物質のうちの1種または複数種を含む腫瘍を有するかまたは有すると判定された対象であることができる。非限定的な好中球放出免疫抑制物質には、アルギナーゼ-1；PD-L1；ミエロペルオキシダーゼ（MPO）；好中球-エラスターゼ（NE）；またはカテプシンGが挙げられる。非限定的な好中球刺激物質には、例えば、G-CSF、ET1、Hif1a、またはDAMPが挙げられる。これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、レベルは、参照レベルに対して、例えばより早期の時点の当該対象と比べて、がんを有しない対象、またはNET、ネトーシス、もしくは活性化好中球を伴わないがんを有する対象と比べて、増加している可能性がある。
本明細書において使用される、「抗NET」化合物または試薬は、排除のためにNETの任意の成分を分解させるもしくは分解のためにターゲティングする、および／またはNETの形成を防止する任意の化合物または試薬を指す。NETの成分の活性を別な方法で阻害する化合物も含まれる。抗NET化合物は、核酸（DNAもしくはRNA）、小分子、脂質、糖質、タンパク質、ペプチド、抗体、または抗体フラグメントであることができる。いくつかの態様では、抗NET化合物は、酵素、例えば核酸、タンパク質、ポリペプチド、または糖質を例えば切断および／または分解する酵素であることができる。抗NET化合物の例は、その全体で参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願公開第2014-0199329号に記載されている。抗NET試薬の非限定的な例として、DNase；RNAse；ヒストン分解酵素；クロマチン脱凝縮阻害剤；NETの成分に対する抗体；エラスターゼ阻害剤；PAD阻害剤；およびPAD4阻害剤を挙げることができる。
本明細書において使用される「抗好中球」化合物または試薬は、好中球に有毒である、アポトーシスを促進する、および/あるいは好中球の接着もしくは遊出の阻害（例えば、抗ICAM1）、好中球活性化の阻害（例えば、抗CD11b）、または骨髄中の好中球前駆細胞の枯渇（例えば、化学療法）などの、actPMNの1つまたは複数の活性を阻害する、任意の化合物または試薬を指す。
本明細書記載の組成物および方法は、本明細書記載の疾患または病態を有するまたは有すると診断された対象に投与することができる。いくつかの態様では、本明細書記載の方法は、疾患または病態の症状を緩和するために、本明細書記載の組成物、例えば作用物質、例えば、有効量のDEspR阻害剤を対象に投与する段階を含む。本明細書において使用される、「症状を緩和すること」は、疾患または病態に関連する任意の病態または症状を改善することである。同等の未処置対照と比較して、このような低減は、任意の標準的技法により測定されるとき、少なくとも5％、10％、20％、40％、50％、60％、80％、90％、95％、99％、またはこれより大幅である。一態様では、本明細書記載の方法は、有効量の、本明細書において抗DEspR抗体と称されるヒト抗体またはヒト化抗体を投与する段階を含む。対象に本明細書記載の組成物を投与するための多様な手段は、当業者に公知である。このような方法として、非限定的に、経口、非経口、静脈内、筋肉内、皮下、経皮、気道（エアロゾル）、肺、皮膚、外用、注射、または腫瘍内投与を挙げることができる。投与は、局所または全身であることができる。
本明細書において使用される「有効量」という用語は、疾患または障害の少なくとも1つまたは複数の症状を緩和するために必要な作用物質、例えばDEspR阻害剤の量を指し、所望の効果を提供するために十分な薬理学的組成物の量に関係する。したがって、「治療有効量」という用語は、典型的な対象に投与された場合に特定の効果を提供するために十分な作用物質（例えば、DEspR阻害剤）の量を指す。本明細書において様々な文脈で使用される有効量はまた、疾患の症状の発生を遅延させる、疾患の症状の経過を改変する（例えば非限定的に疾患の症状の進行を減速させる）、または疾患の症状を後退させるために十分な量を含む。したがって、正確な「有効量」を特定することは、一般的に実行不可能である。しかし、任意の所与の場合について、適切な「有効量」は、当業者により日常的な実験のみを使用して決定されることができる。
有効量、毒性、および治療有効性は、例えば、LD50（集団の50％に致死的な用量）およびED50（集団の50％に治療有効な用量）を決定するために、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手順により決定することができる。投薬量は、採用される剤形および利用される投与経路に応じて変動することができる。毒性作用と治療効果との間の用量比は、治療指数であり、比LD50/ED50として表現することができる。大きな治療指数を示す組成物および方法が好ましい。治療有効用量は、最初に細胞培養アッセイから推定することができる。また、用量は、細胞培養または適切な動物モデルにおいて決定されたIC50（すなわち、症状の最大半値阻害を達成する活性成分の濃度）を含む循環血漿中濃度の範囲を達成するように、動物モデルにおいて設定することができる。血漿中のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって測定することができる。任意の特定の投薬量の効果は、適切なバイオアッセイ、例えば、とりわけactPMNおよび／またはNETについてのアッセイにより監視することができる。投薬量は、医師により決定され、必要に応じて処置の観察された効果に適合するように調整されることができる。
いくつかの態様では、本明細書記載の技法は、本明細書記載の作用物質（例えば、DEspR阻害剤）および任意で薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物に関する。いくつかの態様では、薬学的組成物の活性成分は、本明細書記載の作用物質（例えば、DEspR阻害剤）を含む。いくつかの態様では、薬学的組成物の活性成分は、本質的に本明細書記載の作用物質（例えば、DEspR阻害剤）からなる。いくつかの態様では、薬学的組成物の活性成分は、本明細書記載の作用物質（例えば、DEspR阻害剤）からなる。薬学的に許容される担体および希釈剤には、食塩水、緩衝水溶液、溶媒および／または分散媒が挙げられる。このような担体および希釈剤の使用は、当技術分野において周知である。薬学的に許容される担体として役立つことができる物質のいくつかの例には、（1）ラクトース、グルコースおよびスクロースなどの糖；（2）トウモロコシデンプンおよびバレイショデンプンなどのデンプン；（3）セルロース、およびカルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、エチルセルロース、結晶セルロースおよび酢酸セルロースなどのその誘導体；（4）粉末トラガカント；（5）麦芽；（6）ゼラチン；（7）ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウムおよびタルクなどの滑沢剤；（8）カカオ脂および坐剤用ろうなどの賦形剤；（9）ラッカセイ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油およびダイズ油などの油；（10）プロピレングリコールなどのグリコール；（11）グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコール（PEG）などのポリオール；（12）オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなどのエステル；（13）寒天；（14）水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなどの緩衝剤；（15）アルギン酸；（16）発熱性物質不含水；（17）等張性食塩水；（18）リンゲル液；（19）エチルアルコール；（20）pH緩衝溶液；（21）ポリエステル、ポリカーボネートおよび／またはポリ無水物；（22）ポリペプチドおよびアミノ酸などの増量剤；（23）血清アルブミン、HDLおよびLDLなどの血清成分；（22）エタノールなどのC2～C12アルコール；ならびに（23）薬学的製剤に採用される他の無毒の適合性物質が挙げられる。湿潤剤、着色剤、放出剤、コーティング剤、甘味剤、香味剤、芳香剤、保存料および抗酸化物質も製剤中に存在することができる。「賦形剤」、「担体」、「薬学的に許容される担体」またはその他のような用語は、本明細書において互換的に使用される。いくつかの態様では、担体は、活性作用物質、例えば、本明細書記載の作用物質（例えば、DEspR阻害剤）の分解を阻害する。
いくつかの態様では、本明細書記載の作用物質（例えば、DEspR阻害剤）を含む薬学的組成物は、非経口剤形であることができる。非経口剤形の投与は、典型的には混入物に対する患者の自然防御を回避するので、非経口剤形は、好ましくは無菌である、または患者への投与前に滅菌することが可能である。非経口剤形の例には、非限定的に、注射の準備ができた溶液、薬学的に許容される注射用ビヒクル中に溶解または懸濁する準備ができた粉末製品、注射の準備ができた懸濁液、および乳剤が挙げられる。加えて、DUROS（登録商標）型剤形および用量ダンピング（dose-dumping）を非限定的に含めた放出制御非経口剤形を、患者の投与のために調製することができる。
本明細書開示の作用物質（例えば、DEspR阻害剤）の非経口剤形を提供するために使用することができる適切なビヒクルは、当業者に周知である。例には、非限定的に、滅菌水；USP注射用水；食塩水；グルコース溶液；非限定的に塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、デキストロース注射液、デキストロースおよび塩化ナトリウム注射液、および乳酸加リンゲル注射液などの水性ビヒクル；エチルアルコール、ポリエチレングリコール、およびプロピレングリコールなどの水混和性ビヒクル；ならびに非限定的にトウモロコシ油、綿実油、ラッカセイ油、ゴマ油、オレイン酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル、および安息香酸ベンジルなどの非水性ビヒクルが挙げられる。本明細書開示の薬学的に許容される塩の溶解度を改変または修飾する化合物もまた、従来の剤形および放出制御非経口剤形を含めた本開示の非経口剤形に組み入れることができる。
本明細書記載の作用物質（例えば、DEspR阻害剤）を含む薬学的組成物はまた、経口投与に適するように、例えば、非限定的に、錠剤（非限定的に分割錠またはコーティング錠を含む）、丸剤、カプレット剤、カプセル剤、咀嚼錠、分包散剤、カシェ剤、トローチ剤、ウエファー、エアロゾルスプレー、または液剤、例えば非限定的に、シロップ剤、エリキシル剤、水性液体、非水性液体中の溶液もしくは懸濁液、水中油型乳液、もしくは油中水型乳剤中などの別個の剤形として製剤化することができる。このような組成物は、開示された化合物の薬学的に許容される塩の所定の量を含有し、当業者に周知の薬学的方法により調製される場合がある。一般的に、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Ed., Lippincott, Williams, and Wilkins, Philadelphia PA. (2005)を参照されたい。
従来の剤形は、一般的に製剤からの急速または即時の薬物放出を提供する。薬物の薬理および薬物動態に応じて、従来の剤形の使用は、患者の血液および他の組織中の薬物濃度に広い増減をもたらす可能性がある。これらの増減は、投薬頻度、作用の開始、有効性持続期間、治療血中レベルの維持、毒性、副作用、その他などのいくつかのパラメーターに影響する可能性がある。有利には、放出制御製剤を使用して、薬物の作用開始、作用の持続期間、治療可能時間域内の血漿中レベル、およびピーク血中レベルを制御することができる。特に、放出制御または持続放出剤形または製剤を使用して、薬物の最大有効性が達成される一方で、薬物を過少投与すること（すなわち、最小治療レベルを下回ること）および薬物についての毒性レベルを超えることの両方から起こる可能性がある潜在的有害作用および安全上の懸念を最小限にすることを保証することができる。いくつかの態様では、組成物は、徐放製剤として投与することができる。
放出制御型の薬学的製品は、非放出制御型の対応物によって達成されるものよりも、薬物療法を改善するという共通の目標を有する。理想的には、最適に設計された放出制御調製物を医学的処置に使用することは、最小の時間で病態を治癒または制御するために、最小の原薬が採用されることによって特徴付けられる。放出制御製剤の利点には、：1）薬物の活性持続；2）投薬頻度の低減；3）患者のコンプライアンス増加；4）より少ない総薬物量の使用；5）局所または全身副作用の低減；6）薬物蓄積の極小化；7）血中レベルの増減の縮小；8）処置の有効性の改善；9）薬物活性の強化または消失の低減；および10）疾患または病態の制御速度の改善が挙げられる。Kim, Cherng-ju, Controlled Release Dosage Form Design, 2 (Technomic Publishing, Lancaster, Pa.: 2000)。
大部分の放出制御製剤は、所望の治療効果を迅速に生成する薬物（活性成分）の量を最初に放出し、このレベルの治療効果または予防効果を維持するために他の量の薬物を徐々にかつ連続的に長期間放出するように設計される。この一定レベルの薬物を体内に維持するために、薬物は、代謝され、体から排泄されている薬物の量に取って代わる速度で剤形から放出されなければならない。活性成分の放出制御は、非限定的に、pH、イオン強度、浸透圧、温度、酵素、水、および他の生理条件または化合物を含めた様々な条件により刺激されることができる。
多様な公知の放出制御または持続放出剤形、製剤、およびデバイスは、本開示の塩および組成物と共の使用のために適応させることができる。例には、非限定的に、米国特許第3,845,770号；同第3,916,899号；同第3,536,809号；同第3,598,123号；同第4,008,719号；同第5674,533号；同第5,059,595号；同第5,591,767号；同第5,120,548号；同第5,073,543号；同第5,639,476号；同第5,354,556号；同第5,733,566号；および同第6,365,185B1号に記載されたものが挙げられ、これらのそれぞれは、参照により本明細書に組み入れられる。これらの剤形は、例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、他のポリマーマトリックス、ゲル、透過膜、浸透圧システム（OROS（登録商標）（Alza Corporation, Mountain View, Calif. USA）など）、またはそれらの組み合わせを使用して、1種または複数種の活性成分の低速放出または放出制御を提供して、所望の放出プロファイルを様々な比率で提供するために使用することができる。
任意の局面のいくつかの態様では、本明細書記載の作用物質（例えば、DEspR阻害剤）は、単剤療法として投与され、例えば、疾患または病態に対する別の処置は、対象に投与されない。
これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、本明細書記載の方法は、第2の作用物質および／または処置を、例えば併用療法の一部として対象に投与する段階をさらに含むことができる。第2の作用物質（例示的な化学療法を含む）および／または処置の非限定的な例として、放射線療法、手術、ゲムシタビン、シスプラチン、パクリタキセル、カルボプラチン、ボルテゾミブ、AMG479、ボリノスタット、リツキシマブ、テモゾロミド、ラパマイシン、ABT-737、PI-103；チオテパおよびCYTOXAN（登録商標）シクロホスファミドなどのアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファンおよびピポスルファンなどのスルホン酸アルキル；ベンゾドーパ、カルボコン、メツレドーパ、およびウレドーパなどのアジリジン；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド（trietylenephosphoramide）、トリエチレンチオホスホルアミド（triethiylenethiophosphoramide）およびトリメチロロメラミン（trimethylolomelamine）を含むエチレンイミンおよびメチラメラミン；アセトゲニン（特にブラタシンおよびブラタシノン）；カンプトテシン（合成類似体トポテカンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン；CC-1065（そのアドゼレシン、カルゼルシンおよびビゼレシン合成類似体を含む）；クリプトフィシン（特にクリプトフィシン1およびクリプトフィシン8）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成類似体KW-2189およびCB1-TM1を含む）；エリュテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチイン；スポンジスタチン；クロラムブシル、クロルナファジン、コロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノベンビチン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、およびラニムスチン（ranimnustine）などのニトロソ尿素（nitrosureas）；抗生物質、例えばエンジイン抗生物質（例えば、カリケアミシン、特にカリケアミシンガンマ1IおよびカリケアミシンオメガI1（例えば、Agnew, Chem. Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994）参照）；ジネミシンAを含むジネミシン；クロドロネートのようなビスホスホネート；エスペラマイシン；ならびにネオカルジノスタチンクロモフォアおよび関連した色素タンパク質エンジイン抗生物質クロモフォア）、アクラシノマイシン（aclacinomysins）、アクチノマイシン、オースラマイシン（authramycin）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン（chromomycinis）、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、6-ジアゾ-5-オキソ-L-ノルロイシン、ADRIAMYCIN（登録商標）ドキソルビシン（モルホリノ-ドキソルビシン、シアノモルホリノ-ドキソルビシン、2-ピロリノ-ドキソルビシンおよびデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシンCなどのマイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフフィロマイシン、ピューロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；メトトレキサートおよび5-フルオロウラシル（5-FU）などの代謝拮抗物質；デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサートなどの葉酸類似体；フルダラビン、6-メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンなどのプリン類似体；アンシタビン、アザシチジン、6-アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジンなどのピリミジン類似体；カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンなどのアンドロゲン；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンなどの抗副腎剤；フロリン酸（frolinic acid）のような葉酸補給剤；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキサート（edatraxate）；デフォファミン；デメコルシン；ジアジクオン；エルホルミチン；酢酸エリプチニウム；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダイニン；メイタンシンおよびアンサミトシンなどのメイタンシノイド；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダンモール（mopidanmol）；ニトラエリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ロソキサントロン；ポドフィリン酸；2-エチルヒドラジド；プロカルバジン；PSK（登録商標）多糖複合物（JHS Natural Products, Eugene, Oreg.）；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；2,2',2"-トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（特にT-2毒素、ベラクリンA、ロリジンAおよびアングイジン）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ara-C」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えば、TAXOL （登録商標）パクリタキセル（Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.）、ABRAXANE（登録商標）パクリタキセルのクレモフォール（Cremophor）無添加アルブミン操作ナノ粒子製剤（American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, I11.）、およびTAXOTERE（登録商標）ドキセタキセル（Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France）；クロランブシル；GEMZAR（登録商標）ゲムシタビン；6-チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；シスプラチン、オキサリプラチンおよびカルボプラチンなどの白金類似体；ビンブラスチン；白金；エトポシド（VP-16）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ナベルビン（NAVELBINE）、ビノレルビン；ノバントロン；テニポシド；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロナート；イリノテカン（Camptosar、CPT-11）（イリノテカンと5-FUおよびロイコボリンとの処置レジメンを含む）；トポイソメラーゼ阻害剤RFS2000；ジフルオロメチルオルニチン（DMFO）；レチノイン酸などのレチノイド；カペシタビン；コンブレタスタチン；ロイコボリン（LV）；オキサリプラチン処置レジメン（FOLFOX）を含む、オキサリプラチン；ラパチニブ（タイケルブ（TYKERB））；細胞増殖を低減するPKC-アルファ、Raf、H-Ras、EGFR（例えば、エルロチニブ（TARCEVA（登録商標）））およびVEGF-Aの阻害剤ならびに上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸または誘導体を挙げることができる。
加えて、処置の方法は、放射線または放射線療法の使用をさらに含むことができる。さらに、処置の方法は、外科的処置の使用をさらに含むことができる。
これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、対象は、さらなる免疫療法および／または化学療法をさらに投与される。これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、対象は、さらなる免疫療法および／または化学療法を以前に投与されたことがある。これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、対象は、さらなる免疫療法および／または化学療法を用いた処置に抵抗性である。これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、化学療法（例えば、DEspR阻害剤と共にまたは抗体-薬物コンジュゲートの一部として投与される）は、ゲムシタビン、パクリタキセル、テモゾロミド、イリノテカン、アブラキサン、白金ベースの化学療法、シスプラチン、オキシロプラチン、またはフォルフィリノックス（FOLFIRINOX）などのそれらの組み合わせであることができる。
本明細書において使用される「免疫療法」は、患者自身の免疫系が腫瘍と戦うことを誘導するように設計された治療戦略の多種多様なセットを指し、免疫療法には、非限定的に、表在性膀胱癌に対する膀胱内BCG免疫療法、悪性黒色腫および腎細胞癌などに対する特異免疫応答を生成するためのワクチン、前立腺由来細胞に対する特異免疫応答を誘導するために患者からの樹状細胞に前立腺酸性ホスファターゼペプチドを負荷する、前立腺癌に対するシプロイセル-Tの使用、1つもしくは複数の免疫細胞型を刺激するサイトカイン、成長因子および／もしくはシグナル伝達分子（例えば、インターロイキン）の投与、患者に再導入する前の腫瘍抗原特異的リンパ球および／もしくは樹状細胞のエクスビボ増大および／もしくは刺激、イミキモド、養子細胞移入、ならびに/または例えば、国際公開公報第2003/063792号および米国特許第8,329,660号に記載された方法が挙げられる。これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、免疫療法は、NK応答を刺激する。これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、免疫療法は、養子細胞移入アプローチ、すなわち、養子免疫療法である。例示的な免疫療法は、免疫チェックポイントタンパク質免疫療法（例えば、PD1および／またはPD-L1阻害剤療法、T細胞共刺激物質；またはCAR-T療法を含むことができる。
ある特定の態様では、有効用量の本明細書記載の作用物質（例えばDEspR阻害剤）を含む組成物を患者に1回投与することができる。ある特定の態様では、有効用量の本明細書記載の作用物質（例えば、DEspR阻害剤）を含む組成物を、患者に繰り返し投与することができる。例えば0.1mg/kg、0.5mg/kg、1.0mg/kg、2.0mg/kg、2.5mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、40mg/kg、50mg/kg、またはこれより多い治療量の、本明細書記載の作用物質（例えば、DEspR阻害剤）を含む組成物を対象に投与することができる。
いくつかの態様では、最初の処置レジメンの後、処置をさらに低頻度で投与することができる。例えば、2週間に1回の処置を3ヶ月間行った後、1ヶ月に1回の処置を6ヶ月もしくは1年またはそれよりも長く繰り返すことができる。本明細書記載の方法による処置は、病態のマーカーまたは症状のレベルを、例えば少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、もしくは少なくとも90％、またはこれより大幅に、低減することができる。
本明細書記載の投薬量は、医師により決定され、必要に応じて処置の観察された効果に適合するように調整されることができる。処置の持続期間および頻度に関して、処置がいつ治療上の利益を提供しているかを判定する、投薬量を増加もしくは減少させる、投与頻度を増加もしくは減少させる、処置を中止する、処置を再開する、または処置レジメンに他の改変を加えるかどうかを判定するために、熟練の臨床家が対象を監視することが典型的である。投薬スケジュールは、活性成分に対する対象の感受性などのいくつかの臨床要因に応じて、週1回から毎日まで変動することができる。所望の用量または活性化の量を一度に投与するか、または分割用量、例えば、2～4つの分割用量に分けて、ある期間にわたり、例えば1日を通して適切な間隔で、もしくは他の適切なスケジュールで投与することができる。いくつかの態様では、投与は、慢性、例えば、1つもしくは複数回の、および／または毎日、数週間もしくは数ヶ月にわたる処置であることができる。投薬スケジュールおよび／または処置スケジュールの例は、1週間、2週間、3週間、4週間、1ヶ月、2ヶ月、3ヶ月、4ヶ月、5ヶ月、もしくは6ヶ月、またはこれより長い期間にわたる、1日1回、1日2回、1日3回、もしくは1日4回、またはそれより多い投与である。本明細書記載の作用物質（例えば、DEspR阻害剤）を含む組成物は、5分、10分、15分、20分、または25分間などの期間にわたり投与することができる。
本明細書記載の方法による本明細書記載の作用物質（例えば、DEspR阻害剤）の投与のための投薬量範囲は、例えば、本明細書記載の作用物質（例えば、DEspR阻害剤）の形態、その効力、および本明細書記載の病態の症状、マーカー、または指標の所望の低減の程度、例えば、actPMNおよび／またはNETについて望ましい低減のパーセンテージに依存する。投薬量は、有害な副作用を引き起こすほど大きいべきではない。一般的に、投薬量は、患者の年齢、状態、および性別により変動し、当業者により決定されることができる。任意の合併症が起きた場合、投薬量はまた、個別の医師が調整することができる。
例えば、本明細書記載の病態の処置における、または本明細書記載の応答（例えば、PMN細胞死の増加）を誘導するための、本明細書記載の作用物質（例えば、DEspR阻害剤）の有効性は、熟練の臨床家が決定することができる。しかし、例えば本明細書記載の方法による処置の後に少なくとも10％だけ、本明細書記載の病態の徴候もしくは症状の1つもしくは複数が有益な方式で改変されるか、他の臨床的に許容される症状が好転もしくは改善さえするか、または所望の応答が誘発される場合、処置は、本明細書においてその用語が使用されるところの「有効な処置」と見なされる。有効性は、例えば、本明細書記載の方法により処置される病態のマーカー、指標、症状、および／もしくは発生率または適切な任意の他の測定可能なパラメーター、例えばactPMNおよび／またはNETのレベルを測定することによって評価することができる。有効性はまた、入院または医学的介入の必要性により評価される個体の悪化がないこと（すなわち、疾患の進行が停止している）によって測定することができる。これらの指標を測定する方法は、当業者に公知であり、かつ／または本明細書に記載されている。処置は、個体または動物（いくつかの非限定的な例は、ヒトまたは動物を含む）における疾患の任意の処置を含み、（1）疾患を阻害すること、例えば、症状（例えば疼痛もしくは炎症）の悪化を予防すること；または（2）疾患の重症度を軽減すること、例えば、症状の退行を引き起こすことを含む。疾患の処置のための有効量は、それを必要としている対象に投与した場合に、その疾患に対して、本明細書においてその用語が定義されるところの有効な処置をもたらすために十分な量を意味する。作用物質の有効性は、状態または所望の応答の身体的指標を評価することによって決定することができる。このようなパラメーターの任意の1つ、またはパラメーターの任意の組み合わせを測定することにより投与および／または処置の有効性を監視することは、十分に当業者の能力の範囲内である。有効性は、本明細書記載の病態、例えばがんまたはネトーシスの処置の動物モデルにおいて評価することができる。実験動物モデルを使用する場合、マーカー、例えば、actPMNおよび／またはNETのレベルに統計的に有意な変化が観察される場合に処置の有効性が証明される。
本明細書記載の作用物質（例えば、DEspR阻害剤）の所与の用量の評価を可能にするインビトロアッセイおよび動物モデルアッセイが本明細書において提供される。非限定的な例として、本明細書記載の作用物質（例えば、DEspR阻害剤）の用量の効果は、actPMNレベル、actPMNの生存、actPMNの活性（例えば、ミエロペルオキシダーゼレベル、好中球エラスターゼレベル）、好中球-リンパ球比、および／またはNETのレベルを測定することによって評価することができる。
これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、本明細書記載の処置を投与される対象は、DEspR+好中球および／または増加もしくは上昇したレベルのDEspR+好中球を有すると決定された対象であることができる。
これらの態様のいずれかの一局面では、対象から得られた試料中のDEspR+好中球のレベルを検出することを含む、好中球細胞外トラップ（NET）放出、バイタルネトーシス、またはactPMNネトーシスの危険性がある対象を同定する方法が、本明細書に記載され、その際、参照と比べて増加したレベルのDEspR+好中球は、対象の好中球細胞外トラップ（NET）放出、バイタルネトーシス、またはactPMNネトーシスの危険性が増加していることを示す。これらの態様のいずれかの一局面では、対象から得られた好中球におけるDEspRのレベルを検出することを含む、好中球細胞外トラップ（NET）放出、バイタルネトーシス、またはactPMNネトーシスの危険性がある対象を同定する方法が、本明細書に記載され、その際、好中球における参照と比べて増加したレベルのDEspR+は、対象の好中球細胞外トラップ（NET）放出、バイタルネトーシス、またはactPMNネトーシスの危険性が増加していることを示す。
これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、例えば、DEspRの発現レベルは、DEspR遺伝子の発現産物、例えば、DEspR RNA転写物またはDEspRポリペプチドのレベルを決定することにより測定することができる。このような分子は、生体液などの生物学的試料から単離、由来、または増幅することができる。これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、DEspR分子が存在する場合、抗体またはその抗原結合部分により検出可能なシグナルが生成される。これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、抗体またはその抗原結合部分は、検出可能に標識される、または検出可能なシグナルを生成することが可能である。これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、例えば、DEspR分子のレベルは、ウエスタンブロット；免疫沈降；酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）；放射免疫学的アッセイ（RIA）；サンドイッチアッセイ；蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（FISH）；免疫組織染色；ラジオイムノメトリックアッセイ；免疫蛍光アッセイ；質量分析；FACS；および免疫電気泳動アッセイからなる群より選択される方法を使用して決定される。これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、抗体またはその抗原結合部分は、検出可能に標識される、または検出可能なシグナルを生成する。これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、例えば、DEspRの発現レベルは、1つまたは複数の参照遺伝子または参照タンパク質の発現レベルに対して規準化される。これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、DEspRの参照レベルは、対象から得られた以前の試料中のDEspRの発現レベルである。
これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、例えば、DEspRのレベルは、DEspRポリペプチドのレベルであることができる。ポリペプチドの検出は、当技術分野において公知の任意の方法によることができる。本技法により特定のポリペプチドを検出するための免疫学的方法には、非限定的に、本明細書記載の抗体試薬を利用する免疫組織化学、免疫細胞化学、フローサイトメトリー、蛍光標識細胞分取（FACS）、イムノブロット、ラジオイムノアッセイ、ウエスタンブロット、免疫沈降、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）、および派生技法などの抗体技法が挙げられる。
免疫化学的方法は、標的分子（例えば、抗原または本明細書記載の態様におけるもの、例えば、DEspRポリペプチドに特異的な抗体試薬の使用を必要とする。これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、本明細書記載のアッセイ、方法、および／またはシステムは、抗DEspR抗体試薬を含むことができる。これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、抗体試薬は、検出可能に標識することができる。これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、抗体試薬は、固体支持体に結び付ける（例えば、固体支持体と結合させる）ことができる。これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、固体支持体は、粒子（非限定的に、アガロースもしくはラテックスビーズもしくは粒子または磁気粒子を含む）、ビーズ、ナノ粒子、ポリマー、基材、スライド、カバースリップ、プレート、皿、ウェル、メンブラン、および／またはグレーティングを含むことができる。固体支持体は、非限定的に、ポリマー、プラスチック、樹脂、多糖、ケイ素または無水ケイ酸ベースの材料、炭素、金属、無機ガラス、およびメンブランを含めた多数の異なる材料を含むことができる。
一態様では、本明細書記載のアッセイ、方法、および／またはシステムは、ELISAを含むことができる。例示的な態様では、第1の抗体試薬は、固体支持体（通常はポリスチレン製マイクロタイタープレート）上に固定化することができる。固体支持体は、対象から得られた試料と接触させることができ、抗体試薬は、それが特異的である相手の（「捕捉」）抗原（例えばDEspR）と結合する。次いで固体支持体は、第2の標識抗体試薬（例えば、検出抗体試薬）と接触されることができる。検出抗体試薬は、例えば、検出可能なシグナルを含むことができる、酵素と共有結合的に連結されることができる、またはバイオコンジュゲーションを経由して酵素と連結された二次抗体によりそれ自体が検出されることができる。シグナルの存在は、支持体上に固定化された第1の抗体試薬および第2の「検出」抗体試薬の両方が抗原と結合したことを示し、すなわち、シグナルの存在は、標的分子の存在を示した。各段階の間で、特異的に結合していない任意のタンパク質または抗体を除去するために、プレートは、典型的には穏やかな洗剤溶液で洗浄される。最終洗浄段階の後、酵素基質を添加することによりプレートは顕色されて可視シグナルを発生し、このシグナルは、試料中の標的ポリペプチドの量を示す。昔のELISAは、発色基質を利用するが、最近のアッセイは、ずっと感度の高い蛍光発生基質を採用する。他の異なる形態のELISAがあり、それらは、当業者に周知である。
一態様では、本明細書記載のアッセイ、システム、および方法は、試料中の例えばDEspRポリペプチドのレベルを測定または決定するための、イムノクロマトグラフィーアッセイとしても公知のラテラルフローイムノアッセイ検査（LFIA）またはストリップ検査を含むことができる。LFIAは、試料中の標的の存在（または不在）を検出することが意図される簡単なデバイスである。現在、在宅検査、ポイントオブケア検査、または実験室使用のいずれかのための医用診断のために使用される多くのLFIA検査がある。LFIA検査は、検査試料が毛細管の作用を介して固体支持体に沿って流動するイムノアッセイの一形態である。試料は、検査ストリップに適用された後、着色された抗体試薬と遭遇し、抗体試薬は試料と混ざり、試料の一部分と結合した場合は、第2の抗体試薬で前処理された基質遭遇線または基質遭遇帯を通過する。試料中に存在する標的のレベルに応じて、着色抗体試薬は、検査線または検査帯と結合するようになることができる。LFIAは、本質的に、単一の軸に沿って作動して、検査ストリップ形式またはディップスティック形式に適するように適応されたイムノアッセイである。ストリップ検査は、極めて用途が広く、尿、血液、水試料などの液体試料から莫大な範囲の抗原を検出するために当業者によって容易に改変されることができる。ストリップ検査はまた、検査ストリップを被験液体試料中に「浸す」という文字通りの行為から付いた名称であるディップスティック検査としても公知である。LFIAストリップ検査は、使用が容易であり、最小限の訓練を必要とし、当技術分野において現場で使用するためのポイントオフケア検査（POCT）診断の構成要素として容易に含まれることができる。LFIA検査は、競合アッセイまたはサンドイッチアッセイのいずれかとして作動することができる。サンドイッチLFIAは、サンドイッチELISAに類似している。試料は、最初に、標的に特異的な抗体試薬（例えば、DEspR特異的抗体試薬）で標識された着色粒子と遭遇する。検査線もまた、抗体試薬（例えば、DEspR特異的抗体試薬）を含有する。陽性試料では、検査線は色つきの帯として見える。これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、ラテラルフローイムノアッセイは、ダブル抗体サンドイッチアッセイ、競合アッセイ、定量アッセイまたはその変形であることができる。ラテラルフロー技法に対するいくつかの変形がある。複数の捕捉帯を適用してマルチプレックス検査を創出することも可能である。
典型的な検査ストリップは、以下の構成要素からなる：（1）検査試料が上に適用される吸収剤パッド（すなわちマトリックスまたは材料）を含む試料適用領域；（2）複合体または試薬パッド－これは、着色粒子（通常、コロイド状金粒子、またはラテックスミクロスフェア）とコンジュゲートしていることができる標的に特異的な抗体試薬を含有する；（3）反応メンブランを含む検査結果領域－典型的には、抗体試薬が捕捉帯または検査線としてメンブランを横切るように線状に固定化されている疎水性ニトロセルロースまたは酢酸セルロースメンブラン（粒子またはミクロスフェアとコンジュゲートした抗体試薬に特異的な抗体を含有する対照帯が存在する場合もある）；および（4）随意の芯または廃棄物リザーバー－毛細管作用により反応メンブランを通して試料を吸い上げ、それを集めるように設計されたさらなる吸収剤パッド。ストリップの構成要素は、通常、不活性な下地材料に固定されており、簡単なディップスティック形式で、または試料ポートならびに捕捉帯および対照帯を見せる反応ウインドウを備えるプラスチックケース内に存在する場合がある。厳密に必要なわけではないが、大部分の検査は、検査が正しく作動したことを確認するために遊離のラテックス/金を回収する抗体を含有する第2の線を組み入れている。
「ディップスティック」またはLFIA検査ストリップおよび他の固体支持体の使用は、いくつかの抗原バイオマーカーについてのイムノアッセイに関連して当技術分野において記載されている。その全体で参照により本明細書に組み入れられる米国特許第4,943,522号；同第6,485,982号；同第6,187,598号；同第5,770,460号；同第5,622,871号；同第6,565,808、米国特許出願第10/278,676号；同第09/579,673号および同第10/717,082号は、このようなラテラルフロー検査デバイスの非限定的な例である。3つの米国特許（H. Tomに発行された米国特許第4,444,880号；R. N. Piasioに発行された米国特許第4,305,924号；およびJ. T. Shenに発行された米国特許第4,135,884号）は、免疫化学アッセイにより可溶性抗原を検出するための「ディップスティック」技法の使用を記載している。これらの3つの特許の装置および方法は、「ディップスティック」上の固体表面に固定された第1の成分を広く記載しており、ディップスティックは、「ディップスティック」上に固定された成分と結合する可溶性抗原を含有する溶液に曝露された後、スティック上の成分-抗原複合物が検出される。例えば、DEspRポリペプチドの検出に必要であるとしてこれらの「ディップスティック」技法の教示を改変することは、当業者の技能の範囲内である。これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、ディップスティック（またはLFIA）は、尿試料と共の使用に適することができる。これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、ディップスティックは、血液試料と共の使用に適することができる。
免疫化学は、特異抗体の使用に基づく技法のファミリーであり、その際、抗体が、細胞内部または細胞表面の標的分子を特異的に標的とするために使用される。これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、免疫組織化学（「IHC」）および免疫細胞化学（「ICC」）技法を使用して、例えば、DEspRポリペプチドを検出するまたはそのレベルを測定することができる。IHCは、組織切片への免疫化学の適用であり、一方で、ICCは、例えば液体ベースの調製などの特定の細胞学的調製を受けた後の細胞または組織インプリントに対する免疫化学の適用である。場合によっては、シグナル増幅が、特定のプロトコールに組み入れられる場合があり、その際、標識を含む二次抗体が、血小板または白血球に特異的な抗体試薬の適用の後に続く。典型的には、免疫組織化学のために、対象から得られ、アルコール、アセトン、およびパラホルムアルデヒドなどの適切な固定剤により固定された組織が切片にされ、抗体と反応される。免疫組織化学のための従来方法は、その全体で参照により本明細書に組み入れられるBuchwalow and Bocker (Eds) "Immunohistochemistry: Basics and Methods" Springer (2010): Lin and Prichard "Handbook of Practical Immunohistochemistry" Springer (2011)に記載されている。これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、免疫細胞化学は、一般に、対象から得られた組織または細胞が、アルコール、アセトン、およびパラホルムアルデヒドなどの適切な固定剤により固定され、抗体がそれと反応される場合に利用される場合がある。ヒト試料の免疫細胞学的染色の方法は、当業者に公知であり、例えば、その全体で参照により本明細書に組み入れられるBurry "Immunocytochemistry: A Practical Guide for Biomedical Research" Springer (2009)に記載されている。
これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、本明細書記載の抗体試薬のうち1種または複数種は、検出可能な標識を含むことができ、かつ／または検出可能なシグナルを生成する能力（例えば、化合物を検出可能な産物に変換する反応を触媒することによる）を含むことができる。検出可能な標識は、例えば、光吸収色素、蛍光色素、または放射性標識を含むことができる。検出可能な標識、それらを検出する方法、およびそれらを抗体試薬に組み入れる方法は、当技術分野において周知である。
これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、検出可能な標識は、蛍光、化学蛍光、もしくは化学発光などの分光学的、光化学的、生物化学的、免疫化学的、電磁気的、放射線化学的、または化学的手段、または任意の他の適切な手段によって検出することができる標識を含むことができる。本明細書記載の方法で使用される検出可能な標識は、一次標識（標識が、直接検出可能である部分、または直接検出可能な部分を産生する部分を含む）または二次標識（例えば、二次抗体および三次抗体を使用する免疫学的標識に通常のように、検出可能な標識が、別の部分と結合して検出可能なシグナルを産生する）であることができる。検出可能な標識は、抗体試薬と共有結合的または非共有結合的手段により連結することができる。あるいは、検出可能な標識は、リガンド-受容体結合ペアの配置を介して抗体試薬または他のこのような特異的認識分子への結合を達成する分子を直接標識することなどによって連結することができる。検出可能な標識として、非限定的に、放射性同位体、生物発光化合物、発色団、抗体、化学発光化合物、蛍光化合物、金属キレート、および酵素を挙げることができる。
他の態様では、検出抗体は、蛍光化合物で標識される。蛍光標識された抗体が適当な波長の光に曝露された場合、その存在は、蛍光により検出することができる。これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、検出可能な標識は、非限定的にフルオレセイン、フィコエリトリン、フィコシアニン、o-フタルアルデヒド、フルオレスカミン、Cy3（商標）、Cy5（商標）、アロフィコシアニン、テキサスレッド、ペリジニン（peridenin）クロロフィル、シアニン、フィコエリトリン-Cy5（商標）などのタンデム複合体、緑色蛍光タンパク質、ローダミン、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）およびOregon Green（商標）、ローダミンおよび誘導体（例えば、テキサスレッドおよびテトラローダミン（tetrarhodimine）イソチオシアネート（TRITC））、ビオチン、フィコエリトリン、AMCA、CyDyes（商標）、6-カルボキシフルオセイン（carboxyfhiorescein）（略語FAMおよびFにより一般に公知）、6-カルボキシ-2',4',7',4,7-ヘキサクロロフルオレセイン（fiuorescein）（HEX）、6-カルボキシ-4',5'-ジクロロ-2',7'-ジメトキシフルオレセイン（JOEまたはJ）、N,N,N',N'-テトラメチル-6カルボキシローダミン（TAMRAまたはT）、6-カルボキシ-X-ローダミン（ROXまたはR）、5-カルボキシローダミン-6G（R6G5またはG5）、6-カルボキシローダミン-6G（R6G6またはG6）、およびローダミン110；シアニン色素、例えば、Cy3、Cy5およびCy7色素；クマリン、例えばウンベリフェロン；ベンズイミド色素、例えば、Hoechst 33258；フェナントリジン色素、例えば、Texas Red；エチジウム色素；アクリジン色素；カルバゾール色素；フェノキサジン色素；ポルフィリン色素；ポリメチン色素、例えば、Cy3、Cy5などのシアニン色素；BODIPY色素ならびにキノリン色素を含めた蛍光色素分子、またはフルオロフォアであることができる。
これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、検出可能な標識は、非限定的に3H、125I、35S、14C、32P、および33Pを含めた放射性標識であることができる。
これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、検出可能な標識は、非限定的にホースラディッシュペルオキシダーゼおよびアルカリホスファターゼを含めた酵素であることができる。酵素標識は、例えば、化学発光シグナル、発色シグナル、または蛍光シグナルを産生することができる。抗体試薬を検出可能に標識するための使用のために考えられている酵素には、非限定的に、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、デルタ-V-ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、アルファ-グリセロリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、ベータ-ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース-VI-リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼおよびアセチルコリンエステラーゼが挙げられる。
これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、検出可能な標識は、非限定的に、ルシゲニン、ルミノール、ルシフェリン、イソルミノール、テロマティック（theromatic）アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩、およびシュウ酸エステルを含めた化学発光標識である。
これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、検出可能な標識は、非限定的に、コロイド状金または着色ガラスまたはプラスチック（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、およびラテックス）ビーズを含めた分光比色標識であることができる。
これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、抗体はまた、c-Myc、HA、VSV-G、HSV、FLAG、V5、HIS、またはビオチンなどの検出可能なタグで標識されることができる。他の検出システム、例えば、ビオチン-ストレプトアビジンシステムもまた、使用されることができる。このシステムでは、関心対象のバイオマーカーと免疫反応性の（すなわち特異的な）抗体は、ビオチン化される。バイオマーカーと結合したビオチン化抗体の量は、ストレプトアビジン-ペルオキシダーゼ複合体および発色基質を使用して決定される。このようなストレプトアビジンペルオキシダーゼ検出キットは、例えばDAKO；Carpinteria, CAから市販されている。
抗体試薬はまた、152Eu、またはランタン系列のその他などの蛍光発光金属を使用して検出可能に標識することができる。これらの金属は、ジエチレントリアミン五酢酸（DTPA）またはエチレンジアミン四酢酸（EDTA）のような金属キレート基を使用して抗体試薬と結び付けることができる。
本明細書記載の方法は、対象が、参照レベルに対して増加したレベルの、例えば、DEspRを有するかどうかを判定することに関係することができる。これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、マーカー（例えば、DEspR）の参照レベルは、例えば、がんを有しない、または有すると診断されていない健康な対象におけるマーカーのレベルであることができる。これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、参照レベルは、類似の細胞種類、試料種類、試料処理の試料、ならびに/または標的のレベルを決定すべき試料/対象と類似の年齢、性別および他の人口統計学的パラメーターの対象から得られた試料中のレベルであることができる。これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、検査試料および対照参照試料は同じ種類であり、すなわち、同じ生物学的起源から得られ、同じ組成、例えば同じ数ならびに同じ種類の細胞および／または同じ種類の試料材料を含む。したがって、これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、増加される標的のレベルは、年齢、性別、遺伝子型、環境因子、および個別の医療歴などの人口統計学的要因が変動すると共に変動することができる。これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、参照レベルは、例えば、がんのいかなる徴候または症状も示していない対象から採取された同じ種類の試料中の標的（例えば、DEspRまたはDEspR+好中球）のレベルを含むことができる。これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、マーカーの参照発現レベルは、対象から得られた以前の試料中のマーカーの発現レベルであることができる。これは、その個体における任意のレベル変化の直接分析を可能にする。
これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、マーカーのレベルが、参照レベルの少なくとも1.25×、例えば、参照レベルの少なくとも1.25×、少なくとも1.5×、少なくとも2×、少なくとも3×、少なくとも4×、少なくとも5×、少なくとも6×、またはこれより大きい場合に、マーカーのレベルは参照レベルに対して増加していることができる。これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、マーカーの発現レベルは、1つまたは複数の参照遺伝子または参照タンパク質の発現レベルに対して規準化することができる。これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、マーカーの発現レベルは、参照値に対して規準化することができる。
これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、20個以下の他の遺伝子の発現レベルが決定される。これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、10個以下の他の遺伝子の発現レベルが決定される。
本明細書において使用される「試料」または「検査試料」という用語は、生物から採取または単離された試料、例えば、対象からの尿試料を意味する。例示的な生物学的試料には、非限定的に、生体液試料；血清；血漿；尿；唾液；および／または腫瘍試料などが挙げられる。本用語はまた、上述の試料の混合物も含む。「検査試料」という用語はまた、未処理または前処理された（または前加工された）生物学的試料も含む。これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、検査試料は、対象からの細胞を含むことができる。本明細書において使用される「生体液」という用語は、生物起源から得られた任意の液体を指し、非限定的に、血液、尿、および体分泌液を含む。
検査試料は、対象から試料を取り出すことにより得ることができるが、また、予め単離された試料（例えば、事前の時点で単離されたおよび同じまたは別の人物により単離された）を使用することにより達成することもできる。加えて、検査試料は、新たに収集された試料または予め収集された試料であることができる。
これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、検査試料は、未処理の検査試料であることができる。本明細書において使用される「未処理の検査試料」という語句は、溶液中の希釈および／または懸濁を除くいかなる事前の試料前処理も受けなかった検査試料を指す。検査試料を処理するための例示的な方法には、非限定的に、遠心分離、濾過、超音波処理、均質化、加熱、凍結および解凍、ならびにそれらの組み合わせが挙げられる。これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、検査試料は、凍結検査試料、例えば、凍結組織であることができる。凍結試料は、本明細書記載の方法、アッセイおよびシステムを採用する前に解凍することができる。解凍後、本明細書記載の方法、アッセイおよびシステムに供する前に凍結試料を遠心分離することができる。これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、検査試料は、清澄化された検査試料、例えば、遠心分離および清澄化された検査試料を含む上清の収集により調製された検査試料である。これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、検査試料は、加工前の検査試料、例えば、遠心分離、濾過、解凍、精製、およびその任意の組み合わせからなる群より選択される処理から生じた上清または濾液であることができる。これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、検査試料は、化学試薬および／または生物学的試薬で処理されることができる。化学試薬および／または生物学的試薬を採用して、加工の間にその中の生体分子（例えば、核酸およびタンパク質）を含めた試料の安定性を保護および／または維持することができる。例示的な一試薬は、加工の間にタンパク質の安定性を保護または維持するために一般的に使用されるプロテアーゼ阻害剤である。熟練の技術者は、本明細書記載のマーカーのレベルの決定のために必要とされる生物学的試料の前加工に適した方法および工程を十分に分かっている。
これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、本明細書記載の方法、アッセイ、およびシステムは、対象から検査試料を得る段階をさらに含むことができる。これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、対象は、ヒト対象であることができる。
これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、本明細書記載の方法、アッセイ、およびシステムは、マーカーのレベルに基づき報告を作成することを含むことができる。これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、報告は、検査試料中のマーカーについての生データ値（および任意で、参照試料中のマーカーのレベル）を意味する、あるいはそれは、参照レベルと比較した、マーカーにおける増加パーセンテージもしくは増加倍率を示し、かつ／または対象ががんを有する危険性がある、もしくは有しないというシグナルを提供する。
本明細書において使用される「有する危険性がある」は、上昇および／または増加したレベルのマーカーを有しなかった対象と比較して、特定の状態を有する可能性が少なくとも2倍大きいこと、例えば、2倍、または2.5倍、または3倍、または4倍、またはこれより大幅に危険性があることを指す。
便宜上、本明細書、実施例、および添付の特許請求の範囲に使用されるいくつかの用語および語句の意味が、下に提供される。特に述べないかぎり、または文脈から暗に意味されないかぎり、以下の用語および語句は、下に提供される意味を含む。定義は、特定の態様の説明を助けるために提供されるのであって、本発明の範囲は、特許請求の範囲によってのみ限定されるので、定義は、請求された発明を限定することを意図しない。特に定義されないかぎり、本明細書において使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の技術者によって通常理解されるものと同じ意味を有する。当技術分野における用語の利用と、本明細書に提供されるその定義との間に明らかな矛盾がある場合、本明細書内に提供される定義が優先されるものとする。
便宜上、本出願の明細書、実施例および添付の特許請求の範囲に採用されるある特定の用語をここに集める。
「減少する」、「低減した」、「低減」、または「阻害する」という用語はすべて、本明細書において、統計的に有意な量だけの減少を意味するために使用される。いくつかの態様では、「低減する」、「低減」または「減少する」または「阻害する」は、典型的には、参照レベル（例えば、所与の処置または作用物質の不在）と比較して少なくとも10％の減少を意味し、例えば、少なくとも約10％、少なくとも約20％、少なくとも約25％、少なくとも約30％、少なくとも約35％、少なくとも約40％、少なくとも約45％、少なくとも約50％、少なくとも約55％、少なくとも約60％、少なくとも約65％、少なくとも約70％、少なくとも約75％、少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約98％、少なくとも約99％、またはこれ大幅の減少を含むことができる。本明細書において使用される「低減」または「阻害」は、参照レベルと比較した完全な阻害または低減を包含しない。「完全阻害」は、参照レベルと比較した100％阻害である。減少は、好ましくは、所与の障害を有しない個体について正常範囲内として受け入れられるレベルへの低下であることができる。
「増加した」、「増加する」、「高める」、または「活性化する」という用語は、すべて、本明細書において、統計的に有意な量だけの増加を意味するために使用される。いくつかの態様では、「増加した」、「増加する」、「高める」、または「活性化する」という用語は、参照レベルと比較して少なくとも10％の増加、例えば参照レベルと比較して少なくとも約20％、もしくは少なくとも約30％、もしくは少なくとも約40％、もしくは少なくとも約50％、もしくは少なくとも約60％、もしくは少なくとも約70％、もしくは少なくとも約80％、もしくは少なくとも約90％の増加もしくは100％を含む最大100％の増加もしくは10～100％の間の任意の増加、または参照レベルと比較して少なくとも約2倍、もしくは少なくとも約3倍、もしくは少なくとも約4倍、もしくは少なくとも約5倍もしくは少なくとも約10倍の増加、もしくは2倍から10倍の間もしくはこれ超の任意の増加を意味することができる。マーカーまたは症状に関連して、「増加する」は、そのようなレベルにおける統計的に有意な増加である。
本明細書において使用される「対象」は、ヒトまたは動物を意味する。通常、動物は、霊長類、げっ歯類、家畜または狩猟動物などの脊椎動物である。霊長類には、チンパンジー、カニクイザル、クモザル、およびマカク、例えばアカゲザル（Rhesus）が挙げられる。げっ歯類には、マウス、ラット、ウッドチャック、フェレット、ウサギおよびハムスターが挙げられる。家畜および狩猟動物には、ウシ、ウマ、ブタ、シカ、バイソン、バッファロー、ネコ類、例えば、イエネコ、イヌ類、例えば、イヌ、キツネ、オオカミ、鳥類、例えば、ニワトリ、エミュー、ダチョウ、および魚類、例えば、マス、ナマズおよびサケが挙げられる。いくつかの態様では、対象は、哺乳動物、例えば、霊長類、例えば、ヒトである。用語「個体」、「患者」および「対象」は、本明細書において互換的に使用される。
好ましくは、対象は、哺乳動物である。哺乳動物は、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、またはウシであることができるが、これらの例に限定されない。ヒト以外の哺乳動物は、本明細書記載の疾患または病態、例えばがんの動物モデルを表す対象として有利に使用することができる。対象は、雄性または雌性であることができる。
これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、対象または患者は、ヒトであることができる。これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、対象または患者は、哺乳動物であることができる。したがって、一態様では、哺乳動物は、ネコ、イヌ、ブタ、ウマ、ウシ、ヒツジ、およびヤギ、ならびにヒトを含むことができる。本明細書記載の方法は、獣医学的方法および処置に適用可能である。例えば、ウマにおける蹄葉炎がactPMNにより起こる場合、いくつかの態様では、対象は、非ヒト哺乳動物である。
対象は、処置の必要のある病態またはこのような病態に関係する1つもしくは複数の合併症を有すると以前に診断された、またはそれを患うもしくは有すると特定された対象であって、任意で、疾患もしくは病態または疾患もしくは病態と関係する1つもしくは複数の合併症に対する処置をすでに受けた対象であることができる。あるいは、対象は、疾患もしくは病態または疾患もしくは病態と関係する1つもしくは複数の合併症を有すると以前に診断されていない対象であることもできる。例えば、対象は、疾患もしくは病態または疾患もしくは病態と関係する1つもしくは複数の合併症についての1つまたは複数の危険因子を示す対象、あるいは危険因子を示さない対象であることができる。
特定の病態に対する処置を「必要とする対象」は、その病態を有する、その病態を有すると診断された、またはその病態を発生する危険性がある、対象であることができる。
本明細書において使用される、「タンパク質」および「ポリペプチド」という用語は、隣接残基のアルファ-アミノ基とカルボキシ基との間のペプチド結合によって相互につながった一連のアミノ酸残基を呼ぶために本明細書において互換的に使用される。「タンパク質」、および「ポリペプチド」という用語は、そのサイズまたは機能にかかわらず、修飾アミノ酸（例えば、リン酸化、糖化、グリコシル化など）およびアミノ酸類似体を含めたアミノ酸のポリマーを指す。「タンパク質」および「ポリペプチド」は、多くの場合に比較的大型のポリペプチドを参照して使用され、一方で「ペプチド」という用語は、小型のポリペプチドを参照して使用されることが多いが、これらの用語の用法は、当技術分野において重複している。遺伝子産物およびそのフラグメントを指す場合、「タンパク質」および「ポリペプチド」という用語は、本明細書において互換的に使用される。したがって、例示的なポリペプチドまたはタンパク質には、遺伝子産物、天然タンパク質、相同体、オルソログ、パラログ、フラグメントならびに前記の他の等価物、バリアント、フラグメント、および類似体が挙げられる。
本明細書記載の様々な態様では、記載された特定のポリペプチドのいずれかのバリアント（天然またはその他）、対立遺伝子、相同体、保存的改変バリアント、および／または保存的に置換されたバリアントが包含されることが、さらに考えられている。アミノ酸配列に関して、コード配列中の単一のアミノ酸またはわずかなパーセンテージのアミノ酸を改変する、核酸、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質配列への個別の置換、欠失または付加は、改変が結果として化学的に類似のアミノ酸によるアミノ酸の置換を生じ、ポリペプチドの所望の活性を保持する、「保存的改変バリアント」であると、技術者は、認識しているであろう。このような保存的改変バリアントは、本開示と矛盾しない多形バリアント、種間相同体、および対立遺伝子に追加的であり、それらを排除しない。
いくつかの態様では、本明細書記載のポリペプチド（またはこのようなポリペプチドをコードする核酸）は、本明細書記載のアミノ酸配列のうち1つの機能的フラグメントであることができる。本明細書において使用される、「機能的フラグメント」は、本明細書に下記のアッセイにより野生型参照ポリペプチドの活性の少なくとも50％を保持する、ペプチドのフラグメントまたはセグメントである。機能的フラグメントは、本明細書開示の配列の保存的置換を含むことができる。
いくつかの態様では、本明細書記載のポリペプチドは、本明細書記載の配列のバリアントであることができる。いくつかの態様では、バリアントは、保存的改変バリアントである。保存的置換バリアントは、例えば、ネイティブなヌクレオチド配列の変異により得ることができる。本明細書において呼ばれる「バリアント」は、ネイティブなポリペプチドまたは参照ポリペプチドと実質的に相同なポリペプチドであるが、1つまたは複数の欠失、挿入または置換のせいでネイティブなポリペプチドまたは参照ポリペプチドと異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。バリアントポリペプチドをコードするDNA配列は、ネイティブなDNA配列または参照DNA配列と比較した場合にヌクレオチドの1つまたは複数の付加、欠失、または置換を含む配列であるが、活性を保持するバリアントタンパク質またはそのフラグメントをコードする配列を包含する。多種多様なPCRベースの部位特異的変異誘発アプローチが、当技術分野において公知であり、当業者によって適用されることができる。
バリアントアミノ酸配列またはバリアントDNA配列は、ネイティブな配列または参照配列と少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、またはこれを超えて同一であることができる。ネイティブな配列と変異体配列との間の相同性の程度（同一パーセント）は、例えば、この目的のために通常採用される、ワールドワイドウェブ上で自由に入手可能なコンピュータープログラム（例えば、デフォルト設定のBLASTpまたはBLASTn）を使用して2つの配列を比較することにより、決定することができる。
ネイティブなアミノ酸配列の改変は、当業者に公知のいくつかの技法のいずれかにより達成することができる。変異は、例えば、ネイティブな配列のフラグメントとの連結を可能にする制限部位により隣接される変異体配列を含有するオリゴヌクレオチドを合成することによって、特定の遺伝子座に導入することができる。連結に続いて、結果として生じた再構築後の配列は、所望のアミノ酸挿入、置換、または欠失を有する類似体をコードする。あるいは、オリゴヌクレオチド定方向部位特異的変異誘発手順を採用して、必要とされる置換、欠失、または挿入により改変された特定のコドンを有する、改変されたヌクレオチド配位列を提供することができる。このような改変を行うための技法は、非常に十分に確立されており、それらには、例えばその全体で参照により本明細書に組み入れられる、Walderら（Gene 42:133, 1986)；Bauerら（Gene 37:73, 1985)；Craik（BioTechniques, January 1985, 12-19)；Smithら（Genetic Engineering: Principles and Methods, Plenum Press, 1981)；ならびに米国特許第4,518,584号および同第4,737,462号に開示されたものが挙げられる。ポリペプチドの適当なコンフォメーションを維持することに関与していない任意のシステイン残基をまた、一般的にセリンと置換して、分子の酸化安定性を改善し、異常な架橋を防止することができる。逆に、システイン結合をポリペプチドに付加して、ポリペプチドの安定性を改善する、またはオリゴマー化を推進することができる。
本明細書において使用される「核酸」または「核酸配列」という用語は、リボ核酸、デオキシリボ核酸またはその類似体のユニットを組み入れている任意の分子、好ましくはポリマー分子を指す。核酸は、1本鎖または2本鎖のいずれかであることができる。1本鎖核酸は、変性した2本鎖DNAの一方の核酸鎖であることができる。あるいは、1本鎖核酸は、いかなる2本鎖DNA由来でもない1本鎖核酸であることができる。一局面では、核酸は、DNAであることができる。別の局面では、核酸は、RNAであることができる。適切なDNAは、例えば、ゲノムDNAまたはcDNAを含むことができる。適切なRNAは、例えば、mRNAを含むことができる。
これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、本明細書記載のポリペプチド、核酸、または細胞は、操作されることができる。本明細書において使用される「操作された」は、ヒトにより用手操作されたという局面を指す。例えば、ポリペプチドは、ポリペプチドの少なくとも1つの局面、例えば、その配列が、ヒトにより用手操作されていて、それが自然界で存在する局面と異なる場合に「操作された」と見なされる。よく行われ、当業者により理解されるように、操作された細胞の子孫は、典型的には、実際の操作が以前の実体に行われたとしても、依然として「操作された」と呼ばれる。
いくつかの態様では、本明細書記載のポリペプチド（例えば、抗体または抗体試薬）をコードする核酸は、ベクターによって含まれる。本明細書記載の局面のうちいくつかでは、本明細書記載の所与のポリペプチドをコードする核酸配列、またはその任意のモジュールは、ベクターと機能的に連結されている。本明細書において使用される「ベクター」という用語は、宿主細胞への送達または異なる宿主細胞の間の移行のために設計された核酸構築物を指す。本明細書において使用されるベクターは、ウイルス性または非ウイルス性であることができる。「ベクター」という用語は、適当な制御要素と関連した場合に複製が可能となる任意の遺伝要素であって、細胞に遺伝子配列を移行させることができる遺伝要素を包含する。ベクターとして、非限定的に、クローニングベクター、発現ベクター、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、染色体、ウイルス、ビリオンなどを挙げることができる。
本明細書において使用される「発現ベクター」という用語は、ベクター上の転写調節配列と連結される配列からのRNAまたはポリペプチドの発現を指示するベクターを指す。発現される配列は、多くの場合に細胞に対して異種であるが、必ずしも異種であるわけではない。発現ベクターは、追加的な要素を含む場合があり、例えば、発現ベクターは、2つの複製システムを有することで、それが2つの生物に、例えば発現についてヒト細胞に、ならびにクローニングおよび増幅について原核生物宿主に維持されることを可能にし得る。「発現」という用語は、RNAおよびタンパク質を産生することならびに適宜、タンパク質を分泌することに関与する細胞過程を指し、この細胞過程は、該当する場合、非限定的に例えば、転写、転写物プロセシング、翻訳ならびにタンパク質のフォールディング、修飾およびプロセシングを含む。「発現産物」は、遺伝子から転写されたRNA、および遺伝子から転写されたmRNAの翻訳によって得られるポリペプチドを含む。「遺伝子」という用語は、適切な調節配列と機能的に連結される場合にインビトロまたはインビボでRNAに転写される核酸配列（DNA）を意味する。遺伝子は、コード領域、例えば5'非翻訳（5'UTR）配列または「リーダー」配列および3'UTR配列または「トレーラー（trailer）」配列、ならびに個々のコードセグメント（エクソン）の間の介在配列（イントロン）に先行および後続する領域を含む場合または含まない場合がある。
本明細書において使用される「ウイルスベクター」という用語は、ウイルス起源の少なくとも1つの要素を含む核酸ベクター構築物であって、ウイルスベクター粒子にパッケージングされる能力を有する核酸ベクター構築物を指す。ウイルスベクターは、可欠ウイルス遺伝子の代わりに本明細書記載のポリペプチドをコードする核酸を含有することができる。ベクターおよび／または粒子は、任意の核酸をインビトロまたはインビボのいずれかで細胞内に移行させる目的で利用され得る。多数の形態のウイルスベクターが、当技術分野において公知である。
「組換えベクター」は、インビボで発現することが可能な異種核酸配列または「導入遺伝子」を含むベクターを意味する。本明細書記載のベクターを、いくつかの態様では、他の適切な組成物および治療法と組み合わせることができることを理解すべきである。いくつかの態様では、ベクターは、エピソーム性である。適切なエピソームベクターの使用は、対象において関心対象のヌクレオチドを高コピー数の染色体外DNA中に維持する手段を与え、それにより、染色体組込みの潜在的影響を排除する。
本明細書において使用される「処置する」、「処置」、「処置すること」、または「改善」という用語は、目標が、疾患または障害に関連する病態の進行または重症度を後退させる、緩和する、改善する、阻害する、減速させるまたは停止させることである、治療的処置を指す。「処置すること」という用語は、本明細書記載の病態、疾患または障害の少なくとも1つの有害作用または症状を低減または軽減させることを含む。1つまたは複数の症状または臨床マーカーが低減する場合、処置は一般的に「有効である」。あるいは、疾患の進行が軽減または停止する場合、処置は「有効である」。すなわち、「処置」は、症状またはマーカーの好転だけでなく、処置の不在下で予想される症状と比較した、症状の進行または悪化の休止または少なくとも減速も含む。有益なまたは所望の臨床結果には、非限定的に、検出可能または検出不可能のいずれにせよ、1つもしくは複数の症状の軽減、疾患の程度の縮小、疾患の安定した（すなわち悪化していない）状態、疾患進行の遅延もしくは減速、病状の改善もしくは一時的緩和、寛解（部分もしくは完全のいずれにせよ）、および／または死亡率低下が含まれる。疾患の「処置」という用語はまた、疾患の症状または副作用からの緩和を提供することも含む（姑息処置を含む）。
本明細書において使用される「小分子」という用語は、「天然物様」である化合物を指すことができるが、しかし、「小分子」という用語は、「天然物様」化合物に限定されない。むしろ小分子は、典型的には、それが数個の炭素-炭素結合を含有し、約50ダルトンよりも大きいが約5000ダルトン（5kD）未満の分子量を有することで特徴付けられる。好ましくは、小分子は、3kD未満、なおより好ましくは2kD未満、もっとも好ましくは1kD未満の分子量を有する。場合によっては、小分子が700ダルトン以下の分子量を有することが好ましい。
本明細書において使用される、「血栓溶解薬」という用語は、血餅を溶解させる、取り除く、または他の方法で解体することによって、例えば、フィブリン-血小板血餅を溶解させること、もしくはこのような血餅の形成を阻害することのいずれかによって再灌流を誘導することが可能な任意の薬剤を指す。再灌流は、血餅が溶解し、血流が回復した場合に起こる。例示的な血栓溶解剤には、非限定的に、組織型プラスミノーゲン活性化因子（t-PA）、ストレプトキナーゼ（SK）、プロウロキナーゼ、ウロキナーゼ（uPA）、アルテプラーゼ（Activase（登録商標）, Genentech, Inc.としても公知）、レテプラーゼ（r-PAまたはretavase（登録商標）, Centocor, Inc.としても公知）、テネクテプラーゼ（TNK（商標）, Genentech, Inc.としても公知）、Streptase（登録商標）（AstraZeneca, LP）、ラノテプラーゼ（Bristol-Myers Squibb Company）、モンテプラーゼ（Eisai Company, Ltd.）、サルプラーゼ（r-scu-PAおよびrescupase（商標）, Grunenthal GmbH, Corp.としても公知）、スタフィロキナーゼ、およびアニソイル化プラスミノーゲン-ストレプトキナーゼ活性化因子複合物（APSAC、アニストレプラーゼおよびEminase（登録商標）, SmithKline Beecham Corp.としても公知）が挙げられる。血栓溶解剤はまた、他の遺伝子操作プラスミノーゲン活性化因子を含む。本発明は、追加的に、上記血栓溶解剤のハイブリッド、生理活性フラグメントまたは変異型を採用することができる。本明細書において使用される「組織型プラスミノーゲン活性化因子」という用語は、このようなハイブリッド、フラグメントおよび変異体、ならびに天然由来および組換え由来の両方の組織型プラスミノーゲン活性化因子を含むことを意図する。
本明細書において使用される「薬学的組成物」という用語は、薬学的に許容される担体、例えば医薬品工業で通常使用される担体と組み合わせた活性薬剤を指す。「薬学的に許容される」という語句は、健全な医学的判断の範囲内で、ヒトおよび動物の組織と接触した使用に適切な、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症を有しない、合理的な便益／リスク比に見合う、化合物、材料、組成物、および／または投薬剤形を指すために本明細書において採用される。これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、薬学的に許容される担体は、水以外の担体であることができる。これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、薬学的に許容される担体は、クリーム、乳剤、ゲル、リポソーム、ナノ粒子、および／または軟膏であることができる。これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、薬学的に許容される担体は、人工担体または操作された担体、例えば、自然界で活性成分が存在することが見出されない担体であることができる。
本明細書において使用される「投与すること」という用語は、所望の部位での薬剤の少なくとも部分送達を招く方法または経路により、本明細書開示の化合物を対象内に配置することを指す。本明細書開示の化合物を含む薬学的組成物は、対象において有効な処置を招く任意の適切な経路によって投与されることができる。
「統計的に有意」または「有意に」という用語は、統計的有意性を指し、一般的に2標準偏差（2SD）以上の差を意味する。
実施例以外に、または特に指摘しないかぎり、本明細書使用の成分量または反応条件を表現するすべての数は、すべての場合に「約」という用語で修飾されていると理解すべきである。パーセンテージと共に使用されている場合の「約」という用語は、±1％を意味することができる。
本明細書において使用される「含む（comprising）」という用語は、提示された所定の要素に加えて、他の要素も存在することができることを意味する。「含む」は、限定よりもむしろ包含を示す。
「からなる（consisting of）」という用語は、態様の説明に列挙されないいかなる要素も排除した、本明細書記載の組成物、方法、およびそれらの各成分を指す。
本明細書において使用される「から本質的になる」という用語は、所与の態様に必要な要素を指す。本用語は、本発明の態様の基本的で新規または機能的な特徴に著しく影響しない追加的な要素の存在を容認する。
本明細書において使用される「エピトープ」は、タンパク質の三次フォールディングによって並んだ連続アミノ酸または非連続アミノ酸の両方からのポリペプチド上に形成されることができる。連続アミノ酸から形成されたエピトープは、変性溶媒に曝露されたときに典型的には保持され、一方で三次フォールディングによって形成されたエピトープは、変性溶媒を用いた処理を受けると典型的には消失する。エピトープは、典型的には、独特な空間コンフォメーション中に少なくともアミノ酸3個、より通常には少なくとも5、約9、または約8～10個を含む。「エピトープ」は、慣例的には免疫グロブリンVH/VL対によって結合された構造ユニットを含む。エピトープは、抗体に対する最小結合部位を定義しており、したがって、抗体の特異性の標的に相当する。単一ドメイン抗体の場合、エピトープは、別個の可変ドメインによって結合された構造ユニットに相当する。「抗原決定基」および「エピトープ」という用語はまた、本明細書において互換的に使用することができる。ある特定の態様では、エピトープ決定基には、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル、またはスルホニルなどの、化学的に活性な分子表面基（surface grouping）が含まれ、ある特定の態様では、特異的三次元構造特性、および／または特異的電荷特性を有する場合がある。
「結合活性」は、抗原結合分子（本明細書記載の抗体またはその抗原結合部分など）と、関係のある抗原との間の結合の強さの尺度である。結合活性は、抗原決定基と抗原結合分子上のその抗原結合部位との間の親和性、および抗原結合分子上に存在する関係する結合部位の数の両方に関係する。典型的には、抗原結合タンパク質（本明細書記載の抗体または抗体の部分など）は、10-5～10-12モル／リットル以下、例えば10-7～10-12モル／リットル以下、または10-8～10-12モル／リットルの解離定数（KD）で（すなわち、105～1012リットル／モル以上、例えば107～1012リットル／モルまたは108～1012リットル／モルの会合定数（KA）で）、それらの同族抗原または特異抗原と結合する。10-4mol／リットルよりも大きい任意のKD値（または104M-1未満の任意のKA値）は、一般的に、非特異的結合を示すと見なされる。意味がある（例えば、特異的）と見なされる生物学的相互作用についてのKDは、典型的には、10-10M（0.1nM）～10-5M（10,000nM）の範囲である。相互作用が強いほど、そのKDは低い。例えば、本明細書記載の抗体またはその部分の結合部位は、所望の抗原と500nM未満、例えば200nM未満、または10nM未満、例えば500pM未満の親和性で結合するであろう。抗原または抗原決定基への抗原結合タンパク質の特異的結合は、例えばスキャッチャード分析および／または競合結合アッセイ、例えばラジオイムノアッセイ（RIA）、酵素イムノアッセイ（EIA）およびサンドイッチ競合アッセイおよび当技術分野においてそれ自体公知のそれらの様々な変形、ならびに本明細書において言及された他の技法を含めた、本質的に公知の任意の適切な方法で決定することができる。
したがって、本明細書において使用される「選択的に結合する」または「特異的に結合する」は、本明細書記載のペプチド（例えば、抗体またはその部分）が、DEspRなどの標的と、10-5M（10000nM）以下、例えば、10-6M、10-7M、10-8M、10-9M、10-10M、10-11M、10-12M、またはそれ未満のKDで結合する能力を指す。特異的結合は、例えば、ポリペプチド作用物質の親和性および結合活性ならびにポリペプチド作用物質の濃度によって影響されることができる。当業者は、適切な細胞結合アッセイにおけるポリペプチド作用物質の力価測定などの任意の適切な方法を使用して、本明細書記載のポリペプチド作用物質が標的と選択的に結合する適切な条件を決定することができる。標的と特異的に結合したポリペプチドは、類似でない競合物質と置き換わらない。ある特定の態様では、タンパク質および／または高分子の複合混合物中で抗体試薬がその標的抗原を優先的に認識する場合、当該抗体試薬は、抗原と特異的に結合すると言われる。
いくつかの態様では、本明細書記載の抗体試薬は、DEspRと10-5M（10000nM）以下、例えば、10-6M、10-7M、10-8M、10-9M、10-10M、10-11M、10-12M、またはそれ未満の解離定数（KD）で結合する。いくつかの態様では、本明細書記載の抗体試薬は、DEspRと約10-5M～10-6Mの解離定数（KD）で結合する。いくつかの態様では、本明細書記載の抗体試薬は、DEspRと約10-6M～10-7Mの解離定数（KD）で結合する。いくつかの態様では、本明細書記載の抗体試薬は、DEspRと約10-7M～10-8Mの解離定数（KD）で結合する。いくつかの態様では、本明細書記載の抗体試薬は、DEspRと約10-8M～10-9Mの解離定数（KD）で結合する。いくつかの態様では、本明細書記載の抗体試薬は、DEspRと約10-9M～10-10Mの解離定数（KD）で結合する。いくつかの態様では、本明細書記載の抗体試薬は、DEspRと約10-10M～10-11Mの解離定数（KD）で結合する。いくつかの態様では、本明細書記載の抗体試薬は、DEspRと約10-11M～10-12Mの解離定数（KD）で結合する。いくつかの態様では、本明細書記載の抗体試薬は、DEspRと10-12M未満の解離定数（KD）で結合する。
本明細書において使用される「特異的結合」という用語は、2つの分子、化合物、細胞および／または粒子の間の化学的相互作用であって、第1の実体が、非標的である第3の実体に結合するよりも大きな特異性および親和性で第2の標的実体に結合する化学的相互作用を指す。いくつかの態様では、特異的結合は、第3の非標的実体に対する親和性の少なくとも10倍、少なくとも50倍、少なくとも100倍、少なくとも500倍、少なくとも1000倍またはこれ超の、第2の標的実体に対する第1の実体の親和性を指すことができる。所与の標的に対して特異的な試薬は、利用されているアッセイの条件下で標的に対して特異的結合を示す試薬である。
これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、DEspRを阻害する作用物質は、阻害性核酸である。これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、所与の遺伝子の発現の阻害剤は、阻害性核酸であることができる。本明細書において使用される「阻害性核酸」は、標的の発現を阻害することができる核酸分子、例えば、二本鎖RNA（dsRNA）、阻害性RNA（iRNA）などを指す。
二本鎖RNA分子（dsRNA）は、RNA干渉（RNAi）として公知の高度に保存された調節メカニズムで遺伝子発現を遮断することが示されている。本明細書記載の阻害性核酸は、30ヌクレオチド長以下、すなわち、15～30ヌクレオチド長、一般的に19～24ヌクレオチド長である領域を有するRNA鎖（アンチセンス鎖）を含むことができ、その領域は、実質的に、標的mRNA転写物と少なくとも部分的に相補性である。これらのiRNAの使用は、mRNA転写物のターゲティング分解を可能にし、結果として標的の発現および／または活性の減少をもたらす。
本明細書において使用される「iRNA」という用語は、RNA（または本明細書の下記の修飾核酸）を含有する作用物質であって、RNA誘導サイレンシング複合体（RISC）経路を介するRNA転写物のターゲティング切断を媒介する作用物質を指す。これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、本明細書記載のiRNAは、標的、例えばDEspRの発現および／または翻訳および／または活性の阻害を引き起こす。これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、細胞を阻害剤（例えばiRNA）と接触させることは、結果として細胞中の標的mRNAレベルに、iRNA非存在下の細胞に見られる標的mRNAレベルの少なくとも約5％、約10％、約20％、約30％、約40％、約50％、約60％、約70％、約80％、約90％、約95％、約99％、および最大100％以下の減少を招く。これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、対象に阻害剤（例えばiRNA）を投与することは、結果として対象における標的mRNAレベルに、iRNA非存在下の対象に見られる標的mRNAレベルの少なくとも約5％、約10％、約20％、約30％、約40％、約50％、約60％、約70％、約80％、約90％、約95％、約99％、および最大100％以下の減少を招く。
これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、iRNAはdsRNAであることができる。dsRNAは、dsRNAが使用される条件下でハイブリダイゼーションして二重鎖構造を形成するに足る十分に相補的な2つのRNA鎖を含む。dsRNAの1つの鎖（アンチセンス鎖）は、標的配列に実質的に相補的であり、一般的に完全に相補的な相補性領域を含む。標的配列は、標的の発現の間に形成されるmRNA配列に由来することができ、例えばそれは、1つまたは複数のイントロン境界にまたがることができる。他方の鎖（センス鎖）は、アンチセンス鎖に相補的な領域を含むことにより、2本の鎖は適切な条件下で混ぜ合わされると、ハイブリダイゼーションして二重鎖構造を形成する。一般的に、二重鎖構造は、15から30塩基対長の間（両端の値を含む）であり、より一般的には18から25塩基対長の間（両端の値を含むであり、なおより一般的には19から24塩基対長の間（両端の値を含む）であり、最も一般的には19から21塩基対長の間（両端の値を含む）である。同様に、標的配列に相補的な領域は、15から30塩基対長の間（両端の値を含む）であり、より一般的には18から25塩基対長の間（両端の値を含む）であり、なおより一般的には19から24塩基対長の間（両端の値を含む）であり、最も一般的には19から21塩基対長のヌクレオチド長の間（両端の値を含む）である。これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、dsRNAは、15から20ヌクレオチド長の間（両端の値を含む）であり、他の態様では、dsRNAは、25から30ヌクレオチド長の間（両端の値を含む）である。当業者が認識するように、切断の標的とされるRNAの標的領域は、最も多くの場合に、より大きなRNA分子、多くの場合にmRNA分子の部分である。該当する場合、mRNA標的の「部分」は、RNAiによって指示される切断（すなわちRISC経路による切断）ついての基質であるに足る十分な長さの、mRNA標的の連続配列である。9塩基対と短い二重鎖を有するdsRNAは、いくつかの状況下で、RNAiによって指示されるRNA切断を媒介することができる。最も多くの場合に、標的は、少なくとも15ヌクレオチド長、好ましくは15～30ヌクレオチド長であろう。
阻害性核酸の種類の例示的な態様として、例えば、当技術分野において周知のsiRNA、shRNA、miRNA、および／またはamiRNAを挙げることができる。
これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、iRNAのRNA、例えばdsRNAは、安定性または他の有益な特徴を高めるために化学的に修飾される。本明細書記載の核酸は、これによって参照により本明細書に組み入れられる"Current protocols in nucleic acid chemistry," Beaucage, S.L. et al. (Edrs.), John Wiley & Sons, Inc., New York, NY, USAに記載されている方法などの、当技術分野において十分に確立された方法により合成および／または修飾される場合がある。修飾には、例えば（a）末端修飾、例えば5'末端修飾（リン酸化、コンジュゲーション、逆結合など）、3'末端修飾（コンジュゲーション、DNAヌクレオチド、逆結合など）、（b）塩基修飾、例えば安定化塩基、不安定化塩基、もしくはパートナーの拡張レパートリーと塩基対形成する塩基による置換、塩基の除去（脱塩基ヌクレオチド）、または共役塩基、（c）糖修飾（例えば、2’位もしくは4’位で）または糖の置換、および（d）ホスホジエステル結合の修飾または置換を含めた骨格の修飾が含まれる。本明細書記載の態様に有用なRNA化合物の具体例には、非限定的に、修飾骨格を含有するRNAまたは天然のヌクレオシド間結合を含有しないRNAが含まれる。修飾骨格を有するRNAには、とりわけ、骨格にリン原子を有しないRNAが含まれる。本明細書のために、また時に当技術分野において参照されるように、ヌクレオシド間骨格にリン原子を有しない修飾RNAもまた、オリゴヌクレオシドであると見なすことができる。これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、修飾RNAは、そのヌクレオシド間骨格にリン原子を有するであろう。
修飾RNA骨格として、例えば、通常の3'-5'結合を有するホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルホスホネートならびに3'-アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートを含めた他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、3'-アミノホスホルアミデートおよびアミノアルキルホスホルアミデートを含めたホスホルアミデート、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、ならびに通常の3'-5'結合を有するボラノホスフェート、これらの2'-5'結合類似体、およびヌクレオシドユニットの隣接対が3'-5'から5'-3'に、または2'-5'から5'-2'に連結した逆極性を有するものを挙げることができる。様々な塩、混合塩および遊離酸の形態も含まれる。その中にリン原子を含まない修飾RNA骨格は、短鎖アルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合ヘテロ原子およびアルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、または1つもしくは複数の短鎖ヘテロ原子もしくは複素環ヌクレオシド間結合により形成される骨格を有する。これらには、モルホリノ結合を有する骨格（ヌクレオシドの糖部分から部分的に形成される）；シロキサン骨格；スルフィド、スルホキシドおよびスルホン骨格；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファメート骨格；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格；スルホネートおよびスルホンアミド骨格；アミド骨格；および混合N、O、SおよびCH2成分部分を有するその他、ならびにヘテロ原子骨格を有するオリゴヌクレオシド、特に-CH2-NH-CH2-、-CH2-N(CH3)-O-CH2-［メチレン（メチルイミノ)またはMMI骨格として公知］、-CH2-O-N(CH3)-CH2-、-CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2-および-N(CH3)-CH2-CH2-［式中、ネイティブなホスホジエステル骨格を-O-P-O-CH2-として表す］が挙げられる。
iRNAにおける使用に適するまたはそのために考えられている他のRNA模倣体では、ヌクレオチドユニットの糖およびヌクレオシド間結合の両方、すなわち骨格が、新規な基により置き換えられる。塩基ユニットは、適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために維持される。優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示された、そのような一オリゴマー化合物であるRNA模倣体は、ペプチド核酸（PNA）と呼ばれる。PNA化合物において、RNAの糖骨格は、アミド含有骨格、特にアミノエチルグリシン骨格により置き換えられる。核酸塩基は、保持され、骨格のアミド部分のアザ窒素原子と直接または間接的に結合している。
iRNAのRNAはまた、1つまたは複数のロックド核酸（LNA）を含むように修飾することができる。ロックド核酸は、リボース部分が2'炭素と4'炭素とをつないでいる余分な架橋を含む修飾リボース部分を有するヌクレオチドである。この構造は、リボースを3'-エンド構造コンフォメーションに効果的に「ロック」する。siRNAへのロックド核酸の付加は、血清中でのsiRNAの安定性を増加させ、オフターゲット効果を低減することが示されている（Elmen, J. et al., (2005) Nucleid Acids Research 33(1):439-447; Mook, OR. et al., (2007) Mol Canc Ther 6(3):833-843; Grunweller, A. et al., (2003) Nucleic Acids Research 31(12):3185-3193）。
修飾RNAはまた、1つまたは複数の置換糖部分を含有することができる。本明細書記載のiRNA、例えばdsRNAは、2'位に以下：OH；F；O-、S-、もしくはN-アルキル；O-、S-、もしくはN-アルケニル；O-、S-もしくはN-アルキニル；またはO-アルキル-O-アルキルのうち1つを含むことができ、その際、アルキル、アルケニルおよびアルキニルは、置換または非置換のC1～C10アルキルまたはC2～C10アルケニルおよびC2～C10アルキニルであり得る。例示的な適切な修飾には、O[(CH2)nO]mCH3、O(CH2)nOCH3、O(CH2)nNH2、O(CH2)nCH3、O(CH2)nONH2、およびO(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2［式中、nおよびmは、1～約10である］が挙げられる。これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、dsRNAは、2'位に以下：C1～C10低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリール、アラルキル、O-アルカリールもしくはO-アラルキル、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、RNA切断基、レポーター基、インターカレーター、iRNAの薬物動態特性を改善するための基、またはiRNAの薬力学特性を改善するための基、および類似の特性を有する他の置換基のうち1つを含む。これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、修飾は、2'-メトキシエトキシ(2'-O-(2-メトキシエチル)または2'-MOEとしても公知の2'-O-CH2CH2OCH3)（Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78:486-504）、すなわちアルコキシ-アルコキシ基を含む。別の例示的な修飾は、2'-ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち本明細書後述の実施例に記載される2'-DMAOEとしても公知のO(CH2)2ON(CH3)2基、および2'-ジメチルアミノエトキシエトキシ（当技術分野において2'-O-ジメチルアミノエトキシエチルまたは2'-DMAEOEとしても公知）、すなわち本明細書後述の実施例にも記載される2'-O-CH2-O-CH2-N(CH2)2である。
他の修飾には、2'-メトキシ(2'-OCH3)、2'-アミノプロポキシ(2'-OCH2CH2CH2NH2)および2'-フルオロ（2'-F）が挙げられる。類似の修飾はまた、iRNAのRNA上の他の位置、特に3'末端ヌクレオチド上または2'-5'連結dsRNA中の糖の3'位および5'末端ヌクレオチドの5'位で行うことができる。iRNAはまた、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分などの糖模倣体を有する場合がある。
阻害性核酸はまた、核酸塩基（当技術分野においてしばしば単に「塩基」と呼ばれる）の修飾または置換を含むことができる。本明細書において使用される「未修飾」または「天然」核酸塩基には、プリン塩基であるアデニン（A）およびグアニン（G）、ならびにピリミジン塩基であるチミン（T）、シトシン（C）およびウラシル（U）が含まれる。修飾核酸塩基には、他の合成および天然核酸塩基、例えば5-メチルシトシン（5-me-C）、5-ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、2-アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの6-メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの2-プロピルおよび他のアルキル誘導体、2-チオウラシル、2-チオチミンおよび2-チオシトシン、5-ハロウラシルおよびシトシン、5-プロピニルウラシルおよびシトシン、6-アゾウラシル、シトシンおよびチミン、5-ウラシル（プソイドウラシル）、4-チオウラシル、8-ハロ、8-アミノ、8-チオール、8-チオアルキル、8-ヒドロキシルおよび他の8-置換アデニンおよびグアニン、5-ハロ、特に5-ブロモ、5-トリフルオロメチルおよび他の5-置換ウラシルおよびシトシン、7-メチルグアニンおよび7-メチルアデニン、8-アザグアニンおよび8-アザアデニン、7-デアザグアニンおよび7-デアザ（daaza）アデニンならびに3-デアザグアニンおよび3-デアザアデニンが含まれる。これらの核酸塩基のうち特定のものは、本発明において特筆される阻害性核酸の結合親和性を増加させるために特に有用である。これらには、2-アミノプロピルアデニン、5-プロピニルウラシルおよび5-プロピニルシトシンを含めた、5-置換ピリミジン、6-アザピリミジンならびにN-2、N-6および0-6置換プリンが含まれる。5-メチルシトシン置換は、核酸二重鎖の安定性を0.6～1.2℃だけ上げることが示されており（Sanghvi, Y. S., Crooke, S. T. and Lebleu, B., Eds., dsRNA Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278）、さらにいっそう詳細には2'-O-メトキシエチル糖修飾と組み合わせた場合に、例示的な塩基置換である。
上記の修飾核酸、骨格、および核酸塩基の調製は、当技術分野において周知である。
本発明に特筆される阻害性核酸の別の修飾は、阻害性核酸を、iRNAの活性、細胞分布、薬物動態特性、または細胞取込みを高める1つまたは複数のリガンド、部分または複合体と化学的に連結することを含む。このような部分には、非限定的に、コレステロール部分（Letsinger et al., Proc. Natl. Acid. Sci. USA, 1989, 86: 6553-6556）、コール酸（Manoharan et al., Biorg. Med. Chem. Let., 1994, 4:1053-1060）などの脂質部分、チオエーテル、例えば、ベリル-S-トリチルチオール（Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660:306-309; Manoharan et al., Biorg. Med. Chem. Let., 1993, 3:2765-2770）、チオコレステロール（Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20:533-538）、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオールもしくはウンデシル残基（Saison-Behmoaras et al., EMBO J, 1991, 10:1111-1118; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259:327-330; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75:49-54）、リン脂質、例えば、ジ-ヘキサデシル-rac-グリセロールもしくはトリエチル-アンモニウム1,2-ジ-O-ヘキサデシル-rac-グリセロ-3-ホスホネート（Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651-3654； Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18:3777-3783）、ポリアミンもしくはポリエチレングリコール鎖（Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14:969-973）、またはアダマンタン酢酸（Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651-3654）、パルミチル部分（Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264:229-237）、またはオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ-カルボニルオキシコレステロール部分（Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277:923-937）が挙げられる。
「a」、「an」、および「the」という単数の用語は、文脈が明らかに他のことを示さないかぎり、複数の指示対象を含む。同様に、「または」という語句は、文脈が明らかに他のことを示さないかぎり、「および」を含むことが意図される。本開示の実施または試験に本明細書記載の方法および材料と類似または等価の方法および材料を使用することができるとはいえ、適切な方法および材料が、下に記載されている。「e.g.」という略語は、ラテン語のexempli gratiaに由来し、本明細書において非限定的な例を示すために使用される。したがって、「e.g.」という略語は、「例えば」という用語と同義である。
本明細書に開示される本発明の代替的な要素または態様のグループ分けは、限定として解釈すべきでない。各グループのメンバーは、個別に、またはグループの他のメンバーもしくは本明細書に見出される他の要素との任意の組み合わせで、参照および請求されることができる。グループの1つまたは複数のメンバーは、便宜および／または特許性の理由からグループに含まれるまたはグループから削除されることができる。任意のこのような包含または削除が生じる場合、本明細書は修正されたグループを含み、したがって、添付の特許請求の範囲に使用されるすべてのマーカッシュグループの記載要件（written description）を満たすものとみなされる。
本明細書において別段の定義がなされていないかぎり、本出願と関連して使用される科学用語および技術用語は、本開示が属する技術分野の技術者に通常理解される意味を有するものとする。本発明は、本明細書記載の特定の方法論、プロトコール、および試薬などに限定されず、それ自体で変動できることを理解すべきである。本明細書において使用される用語は、特定の態様のみを説明するためのものであり、特許請求の範囲によってのみ定義される本発明の範囲を限定することが意図されない。免疫学および分子生物学における一般用語の定義は、The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 19th Edition, published by Merck Sharp & Dohme Corp., 2011 (ISBN 978-0-911910-19-3); Robert S. Porter et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Cell Biology and Molecular Medicine, published by Blackwell Science Ltd., 1999-2012 (ISBN 9783527600908); およびRobert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, published by VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8); Immunology by Werner Luttmann, published by Elsevier, 2006; Janeway's Immunobiology, Kenneth Murphy, Allan Mowat, Casey Weaver (eds.), Taylor & Francis Limited, 2014 (ISBN 0815345305, 9780815345305); Lewin's Genes XI, published by Jones & Bartlett Publishers, 2014 (ISBN-1449659055); Michael Richard Green and Joseph Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., USA (2012) (ISBN 1936113414); Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing, Inc., New York, USA (2012) (ISBN 044460149X); Laboratory Methods in Enzymology: DNA, Jon Lorsch (ed.) Elsevier, 2013 (ISBN 0124199542); Current Protocols in Molecular Biology (CPMB), Frederick M. Ausubel (ed.), John Wiley and Sons, 2014 (ISBN 047150338X, 9780471503385), Current Protocols in Protein Science (CPPS), John E. Coligan (ed.), John Wiley and Sons, Inc., 2005;およびCurrent Protocols in Immunology (CPI) (John E. Coligan, ADA M Kruisbeek, David H Margulies, Ethan M Shevach, Warren Strobe, (eds.) John Wiley and Sons, Inc., 2003 (ISBN 0471142735, 9780471142737)に見出すことができ、これらの内容は、その全体で参照により本明細書にすべて組み入れられる。
当業者は、有用な化学療法剤を容易に特定することができる（例えば、Physicians' Cancer Chemotherapy Drug Manual 2014, Edward Chu, Vincent T. DeVita Jr., Jones & Bartlett Learning； Principles of Cancer Therapy, Chapter 85 in Harrison's Principles of Internal Medicine, 18th edition； Therapeutic Targeting of Cancer Cells: Era of Molecularly Targeted Agents and Cancer Pharmacology, Chs. 28-29 in Abeloff's Clinical Oncology, 2013 Elsevier；およびFischer D S (ed): The Cancer Chemotherapy Handbook, 4th ed. St. Louis, Mosby-Year Book, 2003を参照されたい）。
これらの局面のいずれかのいくつかの態様では、本明細書記載の開示は、ヒトのクローニングのための工程、ヒトの生殖細胞系遺伝的同一性を改変するための工程、ヒトの胚の産業もしくは商業目的での使用、または動物を苦しませる可能性があり、ヒトもしくは動物にいかなる実質的な医学的利益ももたらさない、動物の遺伝的同一性を改変するための工程およびまたこのような工程の結果として生じる動物に関するものではない。
他の用語は、本明細書において本発明の様々な局面の説明の中で定義される。
本出願全体にわたり引用される参考文献、発行された特許、公開された特許出願、および同時係属特許出願を含むすべての特許および他の刊行物は、例えば、本明細書記載の技法に関して使用され得る、このような刊行物に記載された方法論を説明および開示するために参照により本明細書に明確に組み入れられる。これらの刊行物は、本出願の出願日前に、それらの開示のためにのみ提供される。この点について何物も、本発明者が先行発明によりまたは任意の他の理由のためにこのような開示に先行する権利を与えられないとの承認として解釈されるべきではない。これらの文書の日付のすべての記述または内容に関する表現は、出願者に入手可能な情報に基づいており、これらの文書の日付または内容の正確さに関するいかなる承認も構成しない。
本開示の態様の説明は、網羅的であることまたは開示された正確な形態に本開示を限定することが、意図されない。本開示の特定の態様およびその例が、例証的な目的で本明細書に記載されるとはいえ、関連する技術分野の技術者が認識するように、本開示の範囲内で様々な等価の改変が可能である。例えば、方法の段階または機能が所与の順序で提示されるとはいえ、代替的な態様が、異なる順序で機能を果たす場合があり、または機能が実質的に同時に果たされる場合がある。本明細書に提供される本開示の教示は、適宜、他の手順または方法に適用されることができる。さらなる態様を提供するために本明細書に記載の様々な態様を組み合わせることができる。本開示の局面は、上記の参考文献および出願の組成、機能、および概念を採用して、本開示のいっそうさらなる態様を提供するために、必要に応じて改変することができる。そのうえ、生物学的機能等価性の考察により、種類または量における生物学的または化学的作用に影響を与えずにタンパク質の構造にいくつかの変更を加えることができる。詳細な説明に照らして、本開示にこれらおよび他の変更を加えることができる。このような改変はすべて、添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図される。
前記態様のいずれかの特定の要素を他の態様における要素と組み合わせるまたは取り替えることができる。さらに、本開示のある態様と関連する利点が、これらの態様と関連して記載されているものの、他の態様がまたこのような利点を示す場合もあり、本開示の範囲内に入るために必ずしもすべての態様がこのような利点を示す必要はない。
本明細書記載の技術は、さらに限定するものと決して解釈すべきでない以下の実施例によりさらに例証される。
本明細書記載の技法のいくつかの態様は、以下の番号付きの項のいずれかにより定義されることができる：
1. 好中球の生存および／または活性を低下させる方法であって、好中球をDEspR阻害剤と接触させる段階を含む、方法。
2. それを必要としている対象において、好中球細胞外トラップ（NET）放出またはactPMNネトーシスを防止または減少させる方法であって、治療有効量のDEspR阻害剤を対象に投与する段階を含む、方法。
3. 好中球が、活性化好中球（actPMN）である、項1～2のいずれか1つに記載の方法。
4. DEspR阻害剤が、抗DEspR抗体試薬またはその抗原結合性フラグメントである、項1～3のいずれか1つに記載の方法。
5. 抗DEspR抗体試薬が、i）DEspRおよびii）PD1またはPD-L1と特異的に結合できる二重特異性試薬である、項4に記載の方法。
6. それを必要としている対象において、NET放出またはactPMNのネトーシスを防止または減少させる方法であって、治療有効量の、抗好中球または抗NET試薬とコンジュゲートした抗DEspR抗体試薬を対象に投与する段階を含む、方法。
7. 抗DEspR抗体試薬が、モノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメントである、項1～6のいずれか1つに記載の方法。
8. 抗DEspR抗体試薬が、i）DEspRおよびii）PD1またはPD-L1と特異的に結合できる二重特異性試薬である、項7に記載の方法。
9. 抗体試薬が、SEQ ID No：1～3、9～11、17～19、5～7、13～15、21～23、25～27、29～31、および33～35より選択される相補性決定領域を有する、項1～8のいずれか1つに記載の方法。
10. 対象が、好中球が疾患の発症または悪化の一因となる病態または疾患に対する処置を必要としている、項1～9のいずれか1つに記載の方法。
11. 病態または疾患が、全身性炎症反応症候群；急性肺傷害（ALI）；急性呼吸窮迫症候群（ARDS）；ARDS、敗血症、感染症、または薬物もしくは任意の作用物質により誘発されるサイトカインストームによる多臓器不全または多臓器機能障害症候群；虚血性または出血性脳卒中；脳の虚血性または薬物誘導出血性変化、出血性脳症、外傷性脳損傷；無酸素性脳損傷、慢性腎臓病；がん；actPMN依存性がん；糖尿病；深部静脈血栓症；がん、がん転移、全身性微小血栓症；アテローム性動脈硬化性血栓症；全身性エリテマトーデス（SLE）；関節リウマチ；COPD；嚢胞性線維症；肺疾患；およびアルツハイマー病からなる群より選択される、項10に記載の方法。
12. 対象が、がんの処置を必要とし、PD-L1+/DespR+腫瘍を有する、項1～11のいずれか1つに記載の方法。
13. 対象が、がんの処置を必要とし、かつ腫瘍切除により以前に処置されたことがある、項1～12のいずれか1つに記載の方法。
14. 対象が、さらなる免疫療法をさらに施される、項1～13のいずれか1つに記載の方法。
15. 対象が、さらなる免疫療法を以前に施されたことがある、項1～13のいずれか1つに記載の方法。
16. 対象が、さらなる免疫療法を用いた処置に抵抗性である、項1～13のいずれか1つに記載の方法。
17. さらなる免疫療法を用いた処置により対象に毒性が発現したことがある、項1～13のいずれか1つに記載の方法。
18. 免疫療法が、PD1および／またはPD-L1阻害剤療法である、項14～17のいずれか1つに記載の方法。
19. 対象が哺乳動物である、項1～18のいずれか1つに記載の方法。
20. 対象がヒトである、項1～19のいずれか1つに記載の方法。
21. 好中球をDEspR阻害剤と接触させることを含む、好中球の生存および／または活性を低下させるためのDEspR阻害剤の使用。
22. それを必要としている対象において好中球細胞外トラップ（NET）放出またはactPMNネトーシスを防止または減少させるためのDEspR阻害剤の使用であって、治療有効量のDEspR阻害剤を対象に投与することを含む、使用。
23. 好中球が活性化好中球（actPMN）である、項21～22のいずれか1つに記載の使用。
24. DEspR阻害剤が、抗DEspR抗体試薬またはその抗原結合性フラグメントである、項21～23のいずれか1つに記載の使用。
25. 抗DEspR抗体試薬が、i）DEspRおよびii）PD1またはPD-L1と特異的に結合できる二重特異性試薬である、項44に記載の使用。
26. それを必要としている対象においてNET放出またはactPMNネトーシスを防止または減少させるための抗好中球試薬または抗NET試薬とコンジュゲートした抗DEspR抗体試薬の使用であって、治療有効量の、抗好中球または抗NET試薬とコンジュゲートした抗DEspR抗体試薬を対象に投与することを含む、使用。
27. 抗DEspR抗体試薬が、モノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメントである、項21～26のいずれか1つに記載の使用。
28. 抗DEspR抗体試薬が、i）DEspRおよびii）PD1またはPD-L1と特異的に結合できる二重特異性である、項27に記載の使用。
29. 抗体試薬が、SEQ ID No：1～3、9～11、17～19、5～7、13～15、21～23、25～27、29～31、および33～35より選択される相補性決定領域を有する、項21～28のいずれか1つに記載の使用。
30. 対象が、病態または疾患の処置を必要とし、好中球が、疾患の発症または悪化の一因となる、項21～29のいずれか1つに記載の使用。
31. 病態または疾患が、全身性炎症反応症候群；急性肺傷害（ALI）；急性呼吸窮迫症候群（ARDS）；ARDS、敗血症、感染症、または薬物もしくは任意の作用物質により誘発されるサイトカインストームによる多臓器不全または多臓器機能障害症候群；虚血性または出血性脳卒中；脳の虚血性または薬物誘導出血性変化、出血性脳症、外傷性脳損傷；無酸素性脳損傷、慢性腎臓病；がん；actPMN依存性がん；糖尿病；深部静脈血栓症；がん、がん転移、全身性微小血栓症；アテローム性動脈硬化性血栓症；全身性エリテマトーデス（SLE）；関節リウマチ；COPD；嚢胞性線維症；肺疾患；およびアルツハイマー病からなる群より選択される、項30に記載の使用。
32. 対象が、がんの処置を必要とし、PD-L1+/DespR+腫瘍を有する、項21～31のいずれか1つに記載の使用。
33. 対象が、がんの処置を必要とし、かつ腫瘍切除により以前に処置されたことがある、項21～32のいずれか1つに記載の使用。
34. 対象が、さらなる免疫療法をさらに施される、項21～33のいずれか1つに記載の使用。
35. 対象が、さらなる免疫療法を以前に施されたことがある、項21～33のいずれか1つに記載の使用。
36. 対象が、さらなる免疫療法を用いた処置に抵抗性である、項21～33のいずれか1つに記載の使用。
37. さらなる免疫療法を用いた処置により対象に毒性が発現したことがある、項21～33のいずれか1つに記載の使用。
38. 免疫療法が、PD1および／またはPD-L1阻害剤療法である、項34～37のいずれか1つに記載の使用。
39. 対象が哺乳動物である、項21～38のいずれか1つに記載の使用。
40. 対象がヒトである、項21～39のいずれか1つに記載の使用。
本明細書記載の技法のうちいくつかの態様は、以下の番号付きの項のいずれかにより定義されることができる：
1. 好中球の生存および／または活性を低下させる方法であって、好中球をDEspR阻害剤と接触させる段階を含む、方法。
2. それを必要としている対象において、好中球細胞外トラップ（NET）放出またはactPMNネトーシス（actPMN NETosis）またはバイタルネトーシス（vital NETosis）を防止または減少させる方法であって、治療有効量のDEspR阻害剤を該対象に投与する段階を含む、方法。
3. 好中球が、活性化好中球（actPMN）またはCD11b+好中球である、項1または2記載の方法。
4. 好中球またはNETが、DEspR+である、項1～3のいずれか一項記載の方法。
5. DEspR阻害剤が、抗DEspR抗体試薬またはその抗原結合性フラグメントである、項1～3のいずれか一項記載の方法。
6. 抗DEspR抗体試薬が、i）DEspRおよびii）PD1またはPD-L1と特異的に結合できる二重特異性試薬である、項4記載の方法。
7. それを必要としている対象において、NET放出またはバイタルネトーシスまたはactPMNネトーシスを防止または減少させる方法であって、治療有効量の、抗好中球試薬または抗NET試薬とコンジュゲートした抗DEspR抗体試薬を該対象に投与する段階を含む、方法。
8. 抗DEspR抗体試薬が、抗DEspR抗体試薬、モノクローナル抗体、またはその抗原結合性フラグメントである、項1～7のいずれか一項記載の方法。
9. 抗DEspR抗体試薬が、
i）DespR；ならびに
ii）a. 細胞表面受容体、
b. リガンドまたは細胞外タンパク質、
c. 細胞内タンパク質
より選択される、免疫細胞の活性および／または生存をモジュレートする標的
と特異的に結合してそれらを阻害することができる二重特異性抗体試薬である、項8記載の方法。
10. 細胞表面受容体が、PD1；CTLA-4；TLR-2；TLR-4；CD14；またはCD168である、項9記載の方法。
11. リガンドまたは細胞外タンパク質が、PD-L1；CD80：CD86；G-CSF；GM-CSF；ミエロペルオキシダーゼ；カテプシン-G；好中球エラスターゼ；またはアルギナーゼ-1である、項9記載の方法。
12. 細胞内タンパク質が、Mcl-1；cIAP2；STAT3；ERK1/2；ペプチジルアルギニンデアミナーゼ（PAD4）；ガレクチン-1/3；またはRNAアデノシンデアミナーゼ-1（ADAR-1）である、項9記載の方法。
13. 抗DEspR抗体試薬または二重特異性抗体試薬が、SEQ ID No：1～3、9～11、17～19、5～7、13～15、21～23、25～27、29～31、および33～35より選択される相補性決定領域を含む、項1～12のいずれか一項記載の方法。
14. 抗DEspR抗体試薬または二重特異性抗体試薬が、ヒンジ安定化IgG4抗体試薬である、項1～13のいずれか一項記載の方法。
15. ヒンジ安定化IgG4抗体試薬が、野生型IgG4配列と比べてS228P変異を含む、項14記載の方法。
16. 抗DEspR抗体試薬または二重特異性抗体試薬を発現する細胞が、前記接触させる段階で投与または提供される抗体試薬を含む、項1～15のいずれか一項記載の方法。
17. 細胞が、T細胞、CAR-T細胞、または養子移入T細胞である、項16記載の方法。
18. 抗DEspR抗体試薬または二重特異性抗体試薬が、CARである、項17記載の方法。
19. DEspR阻害剤、抗DEspR抗体試薬、または二重特異性抗体試薬が、少なくとも1種の抗DEspR抗体試薬および該抗体試薬とコンジュゲートした少なくとも1種の薬物を含む抗体-薬物コンジュゲートである、項1～18のいずれか一項記載の方法。
20. 薬物が、血栓溶解薬、化学療法薬、ナノ粒子、ポリペプチド、イメージング剤、フルオロフォア、小分子、酵素、核酸分子、または化学物質からなる群より選択される、項19記載の方法。
21. 化学療法薬が、メルタンシン、エムタンシン、ゲムシタビン、テモゾロミド、パクリタキセル、またはシスプラチン／オキサリプラチンである、項20記載の方法。
22. ナノ粒子が、酸化鉄ナノ粒子（IONP）、ポリマーナノ粒子、もしくは金ナノ粒子、またはキメラナノ粒子である、項20記載の方法。
23. 酵素が、DNaseI、マトリックスメタロプロテアーゼ1（MMP1）、マトリックスメタロプロテアーゼ2（MMP2）、マトリックスメタロプロテアーゼ3（MMP3）、組織メタロプロテアーゼ阻害物質（TIMP）、プロテアーゼ、リコンビナーゼ、またはプラスミノーゲン活性化因子である、項20記載の方法。
24. 化学物質が、4-アミノ安息香酸ヒドラジドまたはNX-059ニトロンである、項20記載の方法。
25. ポリペプチドが、キモスタチン、アンジオポエチン1/2、SDF-1である、項20記載の方法。
26. 対象が、好中球；NET；またはネトーシスを起こしている（NETosing）好中球もしくはNETを形成している（NETting）好中球が疾患の発症、慢性化、または悪化の一因となる病態または疾患に対する処置を必要としている、項1～25のいずれか一項記載の方法。
27. 病態または疾患が、
全身性炎症反応症候群（SIRS）；急性肺傷害（ALI）；急性呼吸窮迫症候群（ARDS）；例えば、ARDS、出血性ショック、手術、熱傷、または敗血症による多臓器不全または多臓器機能障害症候群（MODS）；敗血症；敗血症性凝固障害；外傷；多発性硬化症；急性腎障害（AKI）；AKI関連尿細管壊死および遠隔臓器損傷；外傷後手術；出血性ショック；感染症、または薬物もしくは任意の作用物質により誘発されるサイトカインストーム；虚血性または出血性脳卒中；脳卒中における二次性脳損傷；心筋虚血/梗塞；アテローム性動脈硬化性不安定プラーク；アテローム性動脈硬化性血栓症；冠動脈疾患；急性冠症候群；心不全；再灌流傷害；腎透析患者における共存症（例えば、血栓症および内皮機能障害）；脳の虚血性または薬物誘導出血性変化、出血性脳症、外傷性脳損傷；無酸素性脳損傷、慢性腎臓病；がん；actPMN依存性がん；糖尿病；1型糖尿病；2型糖尿病；血管障害；脈管障害；終末器官合併症（例えば、網膜症または糖尿病性腎臓病）；糖尿病性潰瘍の創傷治癒不良；深部静脈血栓症；がん転移；全身性微小血栓症；化学療法誘導性微小血栓症；アテローム性動脈硬化性血栓症；全身性エリテマトーデス（SLE）；ループス腎炎；SLE促進アテローム性動脈硬化症；関節リウマチ；COPD；嚢胞性線維症；肺疾患；アルツハイマー病；鎌状赤血球症；炎症性腸疾患（IBD）；クローン病；潰瘍性大腸炎；ならびに分類不能大腸炎
からなる群より選択される、項26記載の方法。
28. 対象が、がんの処置を必要としている、項1～27のいずれか一項記載の方法。
29. 対象が、
PD-L1+/DespR+腫瘍；増加したレベルの循環もしくは腫瘍DEspR+好中球；増加したレベルのDEspR+活性化好中球；増加したレベルのNET；増加した血漿中レベルの好中球エラスターゼ（NE）；増加した血漿中レベルの好中球ミエロペルオキシダーゼ（MPO）；または
DEspR+好中球、ネトーシスを起こしているDEspR+好中球、NET、増加したレベルの好中球放出免疫抑制物質、増加したレベルのシトルリン化ヒストン-3、および増加したレベルの好中球刺激物質のうちの1種もしくは複数種を含む腫瘍
を有する、項28記載の方法。
30. 好中球放出免疫抑制物質が、アルギナーゼ-1；PD-L1；ミエロペルオキシダーゼ（MPO）；または好中球エラスターゼ（NE）；またはカテプシンG（CG）である、項29記載の方法。
31. 好中球刺激物質が、G-CSF、ET1、Hif1a、またはDAMPである、項30記載の方法。
32. がんが、膵管腺癌；膠芽腫；肺癌；トリプルネガティブ乳癌；黒色腫；結腸直腸癌、胃癌、または卵巣癌である、項1～31のいずれか一項記載の方法。
33. 対象が、がんの処置を必要とし、かつ腫瘍切除により以前に処置されたことがある、項1～32のいずれか一項記載の方法。
34. 対象が、さらなる免疫療法または化学療法をさらに施される、項1～33のいずれか一項記載の方法。
35. 対象が、さらなる免疫療法または化学療法を以前に施されたことがある、項1～34のいずれか一項記載の方法。
36. 対象が、さらなる免疫療法または化学療法を用いた処置に抵抗性である、項1～35のいずれか一項記載の方法。
37. さらなる免疫療法または化学療法を用いた処置により対象に毒性が発現したことがある、項1～36のいずれか一項記載の方法。
38. 免疫療法が、免疫チェックポイントタンパク質免疫療法、T細胞共刺激物質；またはCAR-T療法である、項1～37のいずれか一項記載の方法。
39. 免疫療法が、PD1および／またはPD-L1阻害剤療法である、項1～38のいずれか一項記載の方法。
40. 化学療法が、ゲムシタビン、パクリタキセル、テモゾロミド、イリノテカン、アブラキサン、白金ベースの化学療法、シスプラチン、オキシロプラチン、またはそれらの組み合わせである、項1～39のいずれか一項記載の方法。
41. 対象が哺乳動物である、項1～40のいずれか一項記載の方法。
42. 対象がヒトである、項1～41のいずれか一項記載の方法。
43. 対象が、DEspR+好中球を有するか、または有すると判定されたことがある、項1～42のいずれか一項記載の方法。
44. 好中球細胞外トラップ（NET）放出、バイタルネトーシス、またはactPMNネトーシスの危険性がある対象を同定する方法であって、該対象から得られた試料中のDEspR+好中球のレベルを検出する段階を含み、参照と比べて増加したレベルのDEspR+好中球が、該対象の好中球細胞外トラップ（NET）放出、バイタルネトーシス、またはactPMNネトーシスの危険性が増加していることを示す、方法。
45. 好中球細胞外トラップ（NET）放出、バイタルネトーシス、またはactPMNネトーシスの危険性がある対象を同定する方法であって、該対象から得られた好中球におけるDEspRのレベルを検出する段階を含み、好中球における参照と比べて増加したレベルのDEspR+が、該対象の好中球細胞外トラップ（NET）放出、バイタルネトーシス、またはactPMNネトーシスの危険性が増加していることを示す、方法。
46. NET放出、バイタルネトーシス、またはactPMNネトーシスの危険性が増加している対象が、臓器機能不全もしくは多臓器機能不全をもたらす生命にかかわる好中球主導二次性組織傷害の危険性が増加している、または慢性疾患、血管疾患、感染症、血栓症の好中球主導増悪の危険性が増加している、項44または45記載の方法。
47. 好中球の生存および／または活性を低下させる方法に使用するためのDEspR阻害剤。
48. それを必要としている対象において、好中球細胞外トラップ（NET）放出またはactPMNネトーシスまたはバイタルネトーシスを防止または減少させる方法に使用するためのDEspR阻害剤であって、該方法が、治療有効量の該DEspR阻害剤を該対象に投与する段階を含む、DEspR阻害剤。
49. 好中球が、活性化好中球（actPMN）またはCD11b+好中球である、項47～48のいずれか一項記載の阻害剤。
50. 好中球またはNETが、DEspR+である、項47～49のいずれか一項記載の阻害剤。
51. 抗DEspR抗体試薬またはその抗原結合性フラグメントである、項47～50のいずれか一項記載の阻害剤。
52. 抗DEspR抗体試薬が、i）DEspRおよびii）PD1またはPD-L1と特異的に結合することができる二重特異性試薬である、項51記載の阻害剤。
53. それを必要としている対象において、NET放出またはバイタルネトーシスまたはactPMNネトーシスを防止または減少させる方法に使用するための、抗好中球または抗NET試薬とコンジュゲートした抗DEspR抗体試薬。
54. 抗DEspR抗体試薬が、抗DEspR抗体試薬、モノクローナル抗体、またはその抗原結合性フラグメントである、項47～53のいずれか一項記載の阻害剤または試薬。
55. 抗DEspR抗体試薬が、
i）DespR；ならびに
ii）a. 細胞表面受容体、
b. リガンドまたは細胞外タンパク質、
c. 細胞内タンパク質
より選択される、免疫細胞の活性および／または生存をモジュレートする標的
と特異的に結合してそれらを阻害することができる二重特異性抗体試薬である、項54記載の阻害剤または試薬。
56. 細胞表面受容体が、PD1；CTLA-4；TLR-2；TLR-4；CD14；またはCD168である、項55記載の阻害剤または試薬。
57. リガンドまたは細胞外タンパク質が、PD-L1；CD80: CD86；G-CSF；GM-CSF；ミエロペルオキシダーゼ；カテプシン-G；好中球エラスターゼ；またはアルギナーゼ-1である、項55記載の阻害剤または試薬。
58. 細胞内タンパク質が、Mcl-1；cIAP2；STAT3；ERK1/2；ペプチジルアルギニンデアミナーゼ（PAD4）；ガレクチン-1/3；またはRNAアデノシンデアミナーゼ-1（ADAR-1）である、項55記載の阻害剤または試薬。
59. 抗DEspR抗体試薬または二重特異性抗体試薬が、SEQ ID No：1～3、9～11、17～19、5～7、13～15、21～23、25～27、29～31、および33～35より選択される相補性決定領域を含む、項47～58のいずれか一項記載の阻害剤または試薬。
60. 抗DEspR抗体試薬または二重特異性抗体試薬が、ヒンジ安定化IgG4抗体試薬である、項47～59のいずれか一項記載の阻害剤または試薬。
61. ヒンジ安定化IgG4抗体試薬が、野生型IgG4配列と比べてS228P変異を含む、項47～60のいずれか一項記載の阻害剤または試薬。
62. 抗DEspR抗体試薬または二重特異性抗体試薬を発現する細胞が、接触させる段階で投与または提供される抗体試薬を含む、項47～61のいずれか一項記載の阻害剤または試薬。
63. 細胞が、T細胞、CAR-T細胞、または養子移入T細胞である、項62記載の阻害剤または試薬。
64. 抗DEspR抗体試薬または二重特異性抗体試薬が、CARである、項63記載の阻害剤または試薬。
65. DEspR阻害剤、抗DEspR抗体試薬、または二重特異性抗体試薬が、少なくとも1種の抗DEspR抗体試薬および該抗体試薬とコンジュゲートした少なくとも1種の薬物を含む抗体-薬物コンジュゲートである、項47～64のいずれか一項記載の阻害剤または試薬。
66. 薬物が、血栓溶解薬、化学療法薬、ナノ粒子、ポリペプチド、イメージング剤、フルオロフォア、小分子、酵素、核酸分子、または化学物質からなる群より選択される、項65記載の阻害剤または試薬。
67. 化学療法薬が、メルタンシン、エムタンシン、ゲムシタビン、テモゾロミド、パクリタキセル、またはシスプラチン/オキサリプラチンである、項66記載の阻害剤または試薬。
68. ナノ粒子が、酸化鉄ナノ粒子（IONP）、ポリマーナノ粒子、もしくは金ナノ粒子、またはキメラナノ粒子である、項66記載の阻害剤または試薬。
69. 酵素が、DNaseI、マトリックスメタロプロテアーゼ1（MMP1）、マトリックスメタロプロテアーゼ2（MMP2）、マトリックスメタロプロテアーゼ3（MMP3）、組織メタロプロテアーゼ阻害物質（TIMP）、プロテアーゼ、リコンビナーゼ、またはプラスミノーゲン活性化因子である、項66記載の阻害剤または試薬。
70. 化学物質が、4-アミノ安息香酸ヒドラジドまたはNX-059ニトロンである、項66記載の阻害剤または試薬。
71. ポリペプチドが、キモスタチン、アンジオポエチン1/2、SDF-1である、項66記載の阻害剤または試薬。
72. 対象が、好中球；NET；またはネトーシスを起こしている好中球もしくはNETを形成している好中球が疾患の発症、慢性化、または悪化の一因となる病態または疾患に対する処置を必要としている、項47～71のいずれか一項記載の阻害剤または試薬。
73. 病態または疾患が、
全身性炎症反応症候群（SIRS）；急性肺傷害（ALI）；急性呼吸窮迫症候群（ARDS）；例えば、ARDS、出血性ショック、手術、熱傷、または敗血症による多臓器不全または多臓器機能障害症候群（MODS）；敗血症；敗血症性凝固障害；外傷；多発性硬化症；急性腎障害（AKI）；AKI関連尿細管壊死および遠隔臓器損傷；外傷後手術；出血性ショック；感染症、または薬物もしくは任意の作用物質により誘発されるサイトカインストーム；虚血性または出血性脳卒中；脳卒中における二次性脳損傷；心筋虚血/梗塞；アテローム性動脈硬化性不安定プラーク；アテローム性動脈硬化性血栓症；冠動脈疾患；急性冠症候群；心不全；再灌流傷害；腎透析患者における共存症（例えば、血栓症および内皮機能障害）；脳の虚血性または薬物誘導出血性変化、出血性脳症、外傷性脳損傷；無酸素性脳損傷、慢性腎臓病；がん；actPMN依存性がん；糖尿病；1型糖尿病；2型糖尿病；血管障害；脈管障害；終末器官合併症（例えば、網膜症または糖尿病性腎臓病）；糖尿病性潰瘍の創傷治癒不良；深部静脈血栓症；がん転移；全身性微小血栓症；化学療法誘導性微小血栓症；アテローム性動脈硬化性血栓症；全身性エリテマトーデス（SLE）；ループス腎炎；SLE促進アテローム性動脈硬化症；関節リウマチ；COPD；嚢胞性線維症；肺疾患；アルツハイマー病；鎌状赤血球症；炎症性腸疾患（IBD）；クローン病；潰瘍性大腸炎；ならびに分類不能大腸炎
からなる群より選択される、項72記載の阻害剤または試薬。
74. 対象が、がんの処置を必要としている、項47～73のいずれか一項記載の阻害剤または試薬。
75. 対象が、
PD-L1+/DespR+腫瘍；増加したレベルの循環もしくは腫瘍DEspR+好中球；増加したレベルのDEspR+活性化好中球；増加したレベルのNET；増加した血漿中レベルの好中球エラスターゼ（NE）；増加した血漿中レベルの好中球ミエロペルオキシダーゼ（MPO）；または
DEspR+好中球、ネトーシスを起こしているDEspR+好中球、NET、増加したレベルの好中球放出免疫抑制物質、増加したレベルのシトルリン化ヒストン-3、および増加したレベルの好中球刺激物質のうちの1種もしくは複数種を含む腫瘍
を有する、項74記載の阻害剤または試薬。
76. 好中球放出免疫抑制物質が、アルギナーゼ-1；PD-L1；ミエロペルオキシダーゼ（MPO）；または好中球エラスターゼ（NE）；またはカテプシンG（CG）である、項75記載の阻害剤または試薬。
77. 好中球刺激物質が、G-CSF、ET1、Hif1a、またはDAMPである、項76記載の阻害剤または試薬。
78. がんが、膵管腺癌；膠芽腫；肺癌；トリプルネガティブ乳癌；黒色腫；結腸直腸癌、胃癌、または卵巣癌である、項47～77のいずれか一項記載の阻害剤または試薬。
79. 対象が、がんの処置を必要とし、かつ腫瘍切除により以前に処置されたことがある、項47～78のいずれか一項記載の阻害剤または試薬。
80. 対象が、さらなる免疫療法または化学療法をさらに施される、項47～79のいずれか一項記載の阻害剤または試薬。
81. 対象が、さらなる免疫療法または化学療法を以前に施されたことがある、項47～80のいずれか一項記載の阻害剤または試薬。
82. 対象が、さらなる免疫療法または化学療法を用いた処置に抵抗性である、項47～81のいずれか一項記載の阻害剤または試薬。
83. さらなる免疫療法または化学療法を用いた処置により対象に毒性が発現したことがある、項47～82のいずれか一項記載の阻害剤または試薬。
84. 免疫療法が、免疫チェックポイントタンパク質免疫療法、T細胞共刺激物質；またはCAR-T療法である、項47～83のいずれか一項記載の阻害剤または試薬。
85. 免疫療法が、PD1および／またはPD-L1阻害剤療法である、項47～84のいずれか一項記載の阻害剤または試薬。
86. 化学療法が、ゲムシタビン、パクリタキセル、テモゾロミド、イリノテカン、アブラキサン、白金ベースの化学療法、シスプラチン、オキシロプラチン、またはそれらの組み合わせである、項47～85のいずれか一項記載の阻害剤または試薬。
87. 対象が哺乳動物である、項47～86のいずれか一項記載の阻害剤または試薬。
88. 対象がヒトである、項47～87のいずれか一項記載の阻害剤または試薬。
89. 対象が、DEspR+好中球を有するか、または有すると判定されたことがある、項47～88のいずれか一項記載の阻害剤または試薬。
実施例1：不適応好中球の過剰が媒介する病状における抗DEspR療法
本発明は、活性化好中球における生存期間延長メカニズムを阻害または抑止し（IC50＜8nM）、したがって不適応病原性カスケードに向けて他の細胞プレーヤーを駆動し、それと相互作用する、すべての活性化好中球の活性を阻害する抗DEspR技法に関する。actPMN主導の病原性カスケードは、疾患進行、および後続の消耗性の後遺症または死亡に向けた急速なフィードフォワード相互作用を招く。
本発明はさらに、活性化好中球（actPMN）および／またはネトーシスにより誘導、駆動および／または伝播される病原性カスケードを伴う病態または疾患の処置のための、DEspR阻害化合物を含む組成物およびこれらのDEspR阻害化合物を使用する方法に関する。
好中球は、核に2～5葉を有する多形核細胞（PMC）であり、ヒトに最も大量に存在する種類の白血球である。生理条件で、好中球は、6～8時間という短い循環半減期で構成的にアポトーシス性である。炎症において起こるように活性化すると、好中球は、侵入病原体に対して宿主を防御することに極めて重大な役割を果たすために、延長した生存期間または遅延したアポトーシス（1～2日を超える）を有する。好中球は、自然免疫における最初の応答因子であり、数分以内に傷害または感染部位に局在する。好中球は、1）活性酸素種、プロテアーゼ、ミエロペルオキシダーゼ、エラスターゼを放出して細菌を死滅させることが可能で、ならびに2）細菌を好中球細胞外トラップ（NET）（「直径15～17nmの脱凝縮クロマチン線維、ヒストンおよびDNA含有抗菌酵素から構成されるクモの巣様構造」）中に物理的にトラップし、死滅させる可能な、炎症の特徴である。
しかし、まさに同じ細菌死滅メカニズムが、好中球パラドックスという組織傷害（細菌死滅とほぼ類似している）を直接引き起こす不適応病原性カスケードを招く可能性がある。そのうえ、活性化好中球の不適応作用は、サイトカインなどのメディエーターにより活性化好中球と他の細胞（リンパ球、抗原提示細胞、内皮細胞、がん細胞）との間のクロストークにより拡大され、フィードフォワード相互作用を設定する。まさに同じNETが、深部静脈血栓症およびがん微小血栓症ならびにアテローム性動脈硬化性血栓症で見られるように血栓症を引き起こす可能性がある。
活性化好中球媒介組織傷害メカニズムは、以下の例（すべてを含むわけでない）などの異なる器官系疾患において病原カスケードを駆動する可能性がある。
急性肺傷害（ALI）および急性呼吸窮迫症候群（ARDS）における肺
脳卒中における出血性変化において、
慢性腎臓病において、
侵襲性がんおよび転移において［参考文献13～25］
高い好中球数（高い好中球/リンパ球比、NLR）は、複数の種類のヒトがん：膵管腺癌、肝細胞癌、結腸直腸癌、腎癌、非小細胞肺癌 黒色腫、胃癌、膠芽腫、および頭頸部癌における臨床成績不良と関連する
好中球は、腫瘍の進行における活発なプレーヤーであり、膵管腺癌、乳癌および結腸直腸癌に見られる上皮間葉転換および増加した転移能を有する侵襲性の腫瘍成長を促進する。
ネトーシスによる血栓症
NETは、血小板およびRBCの接着および凝集のための足場を提供し、凝固を高めることによって血栓症を促進する。ネトーシス関連血栓およびネトーシスマーカーは、がん、深部静脈血栓症、およびアテローム血栓症における血栓性微小血管障害で報告されるような血栓疾患活動性と相関関係にある。
糖尿病創傷治癒不良において
いくつかの肺疾患において：
NETは、肺胞においてより容易に拡大することができ、肺傷害を引き起こすので、過剰のNET放出の有害作用は、肺疾患に特に重要である。そのうえ、NETおよびその関連分子は、上皮および内皮細胞死を直接誘導することができる。これに関して、大量のNET形成が、とりわけ喘息、慢性閉塞性肺疾患、嚢胞性線維症、呼吸器合胞体ウイルス細気管支炎、インフルエンザ、細菌性肺炎、および結核を含めたいくつかの肺疾患で報告されている。したがって、NET媒介組織損傷を避けるために、NET形成は、厳密に調節されなければならない。
アルツハイマー病において。
複数の疾患における過剰で制御できない好中球機能的活性および過剰なネトーシス［参考文献8～35］は、止めるのが難しい「餌の奪い合い様」病原性カスケードの一因である。新規な治療法が必要である。今までに、潜在的な新療法は、急性肺傷害および急性呼吸窮迫症候群に見られるように有効性を示さなかった。
活性化好中球主導病原性カスケードの速いペースのせいで、例えば、本明細書記載の抗DEspR humab療法により提供されるような速応療法が必要である。ちょうど抗DEspRがCSCの生存期間を減少させるように、抗DEspRは活性化好中球における生存期間延長を抑止し、したがって、不適応の過剰好中球媒介組織傷害およびNET媒介病原性カスケードを防止する。
抗DEspRは、Mcl1のSTAT3媒介アップレギュレーションを遮断することにより好中球のアポトーシスメカニズムに再関与するのみならず、Mcl1の減少を引き起こす。Mcl1は、静止状態で構成的にアポトーシス性である活性化好中球の生存期間延長に関係付けられている。活性化好中球のアポトーシス（マクロファージにより貪食される）を誘導することにより、抗DEspRは、好中球媒介組織傷害の病原性カスケード（プロテアーゼ、カテプシンG、プロテイナーゼ3、ミエロペルオキシダーゼを介する）を防止する。活性化好中球のネトーシスへの進行防止は、したがって、非感染性疾患におけるNET媒介病原性カスケードを防止する。抗DEspRはまた、循環、組織（例えば、肺、関節、筋肉、心臓など）、または病状（例えば、血栓、腫瘍、潰瘍、創傷）における活性化好中球浸潤物、循環好中球、およびNETを標的とするナノ複合体／薬物複合体についてのターゲティング部分として使用することができる。
過剰の好中球が媒介する餌の奪い合い様病原性カスケードに対する抗DEspR mAb療法。
DEspRは、アイソタイプ対照（図1B）と対照的に、活性化ヒト好中球上（図1A）およびネトーシスを起こしている好中球中（図1C～D）で発現される。抗DEspR mAbは、ラットLPS活性化好中球上のDEspRの発現を検出する（図2A）。とりわけ、低用量（通常の15～20mg/kg/回の代わりに1～2mg/kg/回）のリポ多糖で活性化された好中球は、非活性化または静止状態の好中球（Q4）と比較してCD11b（Mac1）誘導によってマークされる。大部分のCD11b活性化好中球は、CD11b+であるがDEspR（-）（黄色の円）の活性化好中球とは対照的にDEspR+（赤の太線円）である（図2A）。エクスビボで、活性化好中球の抗DEspR mab［抗ラットDEspR 10a3レーン2、および汎種反応性抗ヒト／ラット／サルDEspR mAb、6g8］処理は、対照の未処理活性化好中球と比較してその生存期間を減少させた（一元配置ANOVA、チューキーの事後多重比較、P＜0.0001）（図2B）。
インビボ有効性：抗DEspR mAbは、中等度～重度慢性腎臓病を有する雌性（表1）および雄性（表2）高血圧ラットの両方においてアルブミン尿/タンパク尿を減少させた（図5）。
図3A～3Fに示されるように、脳卒中易発性ラットにおける低用量LPS（1.8mg/kg/回）は、対照の正常ラット脳（図3A）と比較して24時間で重症出血性脳炎を誘導した（図3B）。重要なことに、抗DEspR mAbを用いた1回処置（1mg/kg/回 iv）は、生命にかかわる出血性脳炎の進行を弱めた（図3C）。抗DEspRターゲティング効果の確認として、本発明者らは、LPS誘発出血性脳炎を有しない対照正常脳、および対照の未処置LPS誘発出血性脳炎ラット脳（図3D）と対比して、処置されたラットの脳（図3D）における抗DEspRマウスIgGを検出することにより標的の会合を実証する。それと合致して、活性化好中球の機能的活性における減少は、対照の未処置LPS誘発出血性脳炎ラット脳と比較して、処置されたラット脳において減少したミエロペルオキシダーゼレベルと共に検出される（図3E）。脳ミエロペルオキシダーゼレベルは、活性化好中球による放出を受けて増加し、したがって、観察された減少は、脳内の活性化好中球における減少を示す。
好中球を抑止するインビボ有効性をさらに確認するために、本発明者らは、脳浮腫の減少を示している脳アルブミン含量の減少を分析および検出した（図3F）。脳浮腫の減少は、活性化好中球媒介出血性脳症の抗DEspR媒介減弱による血液脳関門の安定化を示す。好中球媒介組織傷害は、血液脳関門の破壊または傷害に関係付けられている。
臨床的に意義のある成績に対する抗DEspRの効果を実証するために、本発明者らは、抗DEspRが急性発症型のLPS誘発出血性脳症を有するラットの生存期間を増加できるかどうかを判定した。図4に示すように、抗DEspR mAb処置は、処置されたラット8匹中5匹において生存期間を増加させ、処置ラットの50％（8匹中4匹）が完全寛解に達し、死亡危険性を食い止めた、生存分析のp=0.0007。
インビボ有効性：抗DEspR mAbは、中等度～重度慢性腎臓病を有する雌性（表1）および雄性（表2）高血圧ラットの両方においてアルブミン尿/タンパク尿を減少させた（図5）。
慢性腎臓病を有する雌ラットにおける結果の概要。
（表１）HSDを給餌したDahl S雌性ラットにおけるCKDに対するhu-6g8の効果。
Figure 0007404230000007
D0で20週齢のDahl S雌性ラット；HSD、高食塩食（飲料水中に2％のNaCl、D0～D14）；変化％、D7からの変化％；D7でhu-6g8 3mg/kgのIV；UACR、尿中アルブミン／尿中クレアチニン比。平均±SDとしてデータを示す。
（表２）HSDを給餌したTg25+雄性ラットにおけるCKDに対するhu-6g8の効果
Figure 0007404230000008
D0で12週齢のTg25+雄性ラット；HSD、高食塩食（8％ NaClの食物ペレット、D0～D21；飲料水中に2％のNaCl、D21～D28）；変化％、D14からの変化％；D0、D7、D14およびD21にhu-6g8 3mg/kgのIV；UACR、尿中アルブミン/尿中クレアチニン比。平均±SDとしてデータを示す。
完全ヒト化抗DEspR 6g8-IgG4 humab、hu-6g8は、対応物の抗DEspR 6g8-マウス mAbと比較して改善されたIC50で活性化好中球の生存を阻害する（図6）。
NET媒介病原性カスケードを抑止するための潜在的治療法の概略図を図7に提供する。抗DEspR mAb療法は、タンパク質分解酵素の好中球過剰放出［脱顆粒］およびネトーシスからの組織傷害を停止するために、活性化好中球の生存期間延長をアポトーシスに向けて戻すことを目的とする。
参考文献：
Figure 0007404230000009
Figure 0007404230000010
Figure 0007404230000011
実施例2：抗DEspR mAb療法［hu-6g8］：有効性－安全性の利点
安定化されたS228P IgG4骨格：受容体の遮断に基づきADCCまたはCDCに基づかない有効性
免疫療法と組み合わせた抗DEspRについての理論的根拠および作用機序の概要：
相補的作用機序：CSCの生存／自己再生、腫瘍細胞の侵襲性、血管新生の抗DEspR（hu-6g8、またはABT-468）阻害は、一緒になって、転移播種と進行とのサイクルにおける減少につながり、これは、免疫療法の免疫サーベイランスを補完して腫瘍細胞を除去する。これは、免疫適格ラットにおける異種移植膵臓腫瘍および膠芽腫における退縮ではなく腫瘍成長速度の阻害と比較した、自然発生乳房腫瘍の抗DEspRによるより強い腫瘍退縮に見られる（図16）74。
抗DEspRによる活性化好中球（腫瘍関連好中球またはTANおよび循環好中球）の除去は、PD1/PD-L1阻害剤の存在下であっても継続する、したがって免疫療法抵抗性の主要なメカニズムである、T細胞の活性化および増殖の好中球媒介阻害を排除する。そのうえ、活性化好中球はまた、PD-L1を発現し、したがって、それ自体の生存期間を延長しながらT細胞におけるアポトーシスを誘導することが可能である。
CSCおよび腫瘍細胞のアポトーシス誘導は、T細胞の免疫サーベイランスの有効性を高める。HU-6G8は、生存促進タンパク質（Mcl1、BIRC3）を減少させ、アポトーシス促進遺伝子を増加させ、したがって、活性化好中球のアポトーシスを誘導し、それは次いで好中球媒介T細胞抑制を除去することによりT細胞の免疫サーベイランスの有効性を高める。
腫瘍血管系の安定化は腫瘍への免疫療法の送達を推進するのみならず、転移性腫瘍細胞の血管外漏出を最小限にする。
データは、以下の治療仮説を検証する。
治療仮説：抗DEspRは、生存成績を向上させ、免疫療法に必要な用量を下げることもできる新規のターゲティング有効性および安全上の利点をもたらすので、Hu-6g8は、PD1/PD-L1阻害剤の副作用を低減するための、ステージIVの進行がんにおけるPD1/PD-L1阻害剤（または化学療法）併用療法についての潜在的パートナーである。計画された患者の層別化因子：PD-L1+腫瘍/DEspR+腫瘍関連好中球（TAN）、腫瘍細胞、CSC（がん幹細胞もしくは転移開始細胞）、および／または腫瘍微小血管。
Figure 0007404230000012
Figure 0007404230000013
Figure 0007404230000014
治療仮説。Hu-6g8は、原発性腫瘍の外科的切除後の潜在的な新規補助単剤療法（潜在的適応症：PDAC、GBM、NSCL、TNBC）または補助療法に関して承認されたPD1/PD-L1阻害剤との併用療法である。
Figure 0007404230000015
Figure 0007404230000016
異なる前臨床モデルにおける抗DEspR mAbの累積安全性プロファイル：安全上の利点
Figure 0007404230000017
以下について報告されているように、使用した用量で前臨床モデルにおいて生死に関わる副作用の観察なし：
a）キイトルーダIgG4（10mg/kg q 2週間）：死亡例を含む急性輸液反応、免疫介在性肺炎；免疫介在性肝炎、腎炎、1型糖尿病、糖尿病性ケトアシドーシス、大腸炎
b）オプジーボIgG4（3mg/kg q 2週間）：）：急性輸液反応、どちらも死亡例を含む免疫介在性肺炎および脳炎、肺塞栓症、胸水、呼吸不全；免疫介在性肝炎、腎炎、内分泌障害、大腸炎；重症炎症症候群、心筋炎
c）化学療法：感染の危険性のある重症好中球減少症、創傷治癒障害、貧血
注：補助化学療法は、手術後2週間を経過して初めて与えることが推奨される
d）アバスチン：脳卒中、出血、血栓症、腸穿孔、高血圧クリーゼ、溶血性尿毒症症候群、タンパク尿
注：アバスチンを手術の前後28日以内に与えることは推奨されない
抗DEspRの多面的MoAを示しているインビトロおよびインビボデータの統一した枠組み - 1］がん幹様細胞（CSC）、2］血管新生および3］活性化好中球の阻害ならびに主要ながん転移の特徴：腫瘍の播種、シーディングまたはイニシエーション、微小腫瘍の増殖/増大、腫瘍の進行および侵襲性に対するそれぞれの影響（図9）。
参考文献
Figure 0007404230000018
実施例3
DEspRは、ヒト活性化好中球（actPMN）上、およびネトーシスを起こしたactPMN上にも発現されることが実証されている。抗DEspR mAbは、ヒトactPMNの生存期間を減少させ、actPMNの生存期間を減少させることによりactPMNのネトーシスを防止し、したがって、NETの放出を防止または抑止する。
正常なPMNまたは静止状態のPMNまたは非活性化PMNは、構成的にアポトーシス性で、2～8時間だけ生存する（時間範囲の報告は様々である）が、それにもかかわらず、非活性化PMNは、循環中で数時間だけ生存することが確認されている。活性化好中球は、この「構成的アポトーシス」を遅延させることができ、したがって、増加した生存期間を有してその機能－プロテアーゼ、ROS、ミエロペルオキシダーゼ（MPO）、およびNET（好中球細胞外トラップ）により「細菌を死滅させる」こと－を果たすことができる。しかし、活性化好中球の機能性（プロテアーゼ、エラスターゼ、MPO、NETの放出が不適応になる可能性がある。これは、「好中球パラドックス」であり、すなわち、細菌を死滅させるものが、組織傷害も引き起こす可能性があり、特にNETは、例えばいくつか挙げると、脳卒中におけるBBB破壊、がんにおけるマトリックス分解および転移促進、糖尿病における創傷治癒遅延、ならびにがん、敗血症、脳卒中、全身性エリテマトーデス（SLE）、急性呼吸窮迫症候群（ARDS）、深部静脈血栓症における微小血栓のような様々な疾患に関与するという結果が増え続けている。
抗DEspR mAb療法は、本明細書において、活性化好中球およびNETが病原性事象の基礎をなす、またはそれを悪化させる疾患に関して考えられている。例えば、下記に対する治療法が必要であり、抗DEspRは、actPMN媒介性またはNET媒介性の病原性事象を停止または減速する「ブレークスルー」療法を提供することができる。例えば、抗DEspRは、以下のためのクラス最初の生物学的治療薬となる潜在性を有する：
a. 糖尿病における創傷治癒を改善する、
b. 好中球関連血栓症および微小血栓形成、ならびに敗血症、がん、ARDS、ならびに脳卒中および急性冠症候群において見られるように、結果として起こる多臓器不全を低減する、
c. ARDSにおける肺内の浸潤好中球の量を低減し、したがって、呼吸補助介入について、したがってARDSの死亡率について、より大きい成功を可能にする、
d. 脳卒中だけでなく外傷性脳損傷で見られるような、脳浮腫ならびに微小出血および大出血につながる好中球媒介性の血液脳関門破壊による脳卒中（すべての種類）の死亡率を低減する、
e. 免疫抑制、したがって腫瘍免疫回避への循環好中球および腫瘍関連好中球の寄与を低減する。
抗DEspR mAbは、NET+微小血栓を検出するための診断のためのターゲティング部分として使用することができる
本明細書記載の方法は、有効な治療法がない場合の治療法を提供することができ、または現行の治療法を改善することができる：
1. NETにより遅延する、糖尿病における創傷治癒を改善する
2. 外傷性脳損傷、脳卒中、無酸素性脳損傷、脳腫瘍におけるBBB破壊、したがって脳浮腫および微小出血を低減する
3. 急性肺傷害またはARDSおよび多臓器不全へのその進行を減弱する
4 （腫瘍塊自体よりも多臓器不全により瀕死状態である）敗血症の末期がん患者における全身微小血栓および結果として起こる多臓器不全を減弱する
5. DNAseまたはヒストン阻害剤（排出されたDNAおよびヒストンから作られたNETを除去することが見出された）と共にナノ粒子を送達するための、NETに対するターゲティング部分として役立つ
6. 関節リウマチにおいて好中球により媒介される組織傷害を減少させ、NET中のシトルリン化ヒストンからのネオエピトープ由来の自己抗原の供給源としてのNETを減少させる
抗DEspR療法は、好中球が長く関係付けられている種々の疾患への、不適応の活性化好中球および／またはNETが媒介する病原性寄与を低減することができる。現行の治療法と比べた利点として、以下を挙げることができる：
1. より安全：正常な静止状態の好中球を除去もしくは枯渇せずに、または他の白血球に影響せずに、活性化好中球の生存期間を減少させることが、より安全な治療プロファイルを提供することもできる。
2. より有効：
a. すでに遊出した好中球に対して効果を有しず、および好中球をさらに活性化もする、好中球の接着遮断（例えば、抗ICAM mAb）よりも、抗DEspRは、循環中のactPMNおよび組織中の浸潤PMNの生存を低下させるであろう。血管内皮または上皮（肺内）を通過した遊出は、好中球を活性化する。
b. NETを解体しようとすることは、「遅すぎる」アプローチであり得、ならびに/またはNETの形成および組成が複雑であることから困難であり得るので、それよりも、NETの新たな出現が、有効な治療法を有しない種々の疾患におけるいくつかの病原性事象に関係付けられていることを考え、actPMNがNETを形成しないようにその生存期間を減少させることの方が望ましい。
c. 古典的ET1 a型およびb型受容体アンタゴニストががん、脳卒中、心不全に対する臨床試験で失敗したことを考えると、脳卒中、がん、心不全において増加し、その予後不良と関連するエンドセリン-1（ET1）の効果を抗DEspRは遮断するであろう。
3. がんに対する多面的な治療法としての抗DEspR mAbの開発はまた、治療抵抗性の基礎をなす好中球媒介免疫回避およびT細胞抑制、腫瘍の局所侵襲性および転移の一因となる好中球媒介マトリックスの分解、ならびにがんにおける好中球媒介血栓症を標的とし、したがって、単に現行の化学療法薬よりも安全な方法で転移を減弱することから全生存期間の増加を実現するだけでなく、末期がんにおける多臓器不全につながるがん関連血栓症および全身微小血栓も低減する。実際に、微小血栓は、いくつかのがんに関連する重度の疼痛、膵臓腹膜転移で見られるような腸管虚血の一因となる可能性もある。
活性化好中球、および今日はNETも、組織傷害および多臓器微小血栓が起こる種々の病原性事象にますます関係付けられている。ActPMNおよびNETの関与は、かなり「劇症」の経過をたどり、すなわち、いったん開始したら何ものも減衰または減弱できるように見えない。抗接着mAb療法は、効果的に働かず、これは、振り返ってみると「少なすぎ、遅すぎ」のシナリオであり得る。動物モデルにおいて、好中球の役割は、好中球枯渇試験により実証されている。本明細書記載のように、本発明者らは、DEspRが活性化好中球上に発現され、その阻害が活性化好中球の生存期間を減少させることを発見した。活性化好中球は、DEspR陰性であり数時間の寿命で構成的にアポトーシス性である正常な静止状態の好中球と対照的に、アポトーシスが遅延している（したがって生存期間が増加している）ことが公知である。特に、IgG4/カッパFc領域上の抗DEspR完全ヒト化抗体が活性化好中球と結合し、その生存を阻害し、したがって、好中球媒介組織傷害の形成、血液脳関門（BBB）の破壊、血管新生およびNET形成を防止することが本明細書において実証されている。
実施例4
急性肺傷害（ALI）ならびに急性呼吸窮迫症候群（ARDS）および多臓器不全（MOF）へのその進行は、世界的にICU入院の5～10％に起こり1、米国において年間約200,000症例（3）およびEUにおいて約175,000症例である。根底となる原因にかかわらず4、および集中治療医学におけるすべての介入にかかわらず、死亡率は、約40％と高いままである（2,5）。ARDSの生存者は、若い生存者の中であっても慢性後遺症および能力障害を有する2,6。幅広い研究および多数の臨床試験にかかわらず7、ALI/ARDS/MOFに対する第3相試験を通過した新しい治療法はなく、生存を改善するおよび／または後遺症を減少させることができる新規な処置が大いに必要であると繰り返されているが、まだ対処されていない2,8。
ARDSについての臨床試験における失敗した結果または不確かな結果からの教訓は、スタチン（ロスバスタチン9、シンバスタチン10）の多面的な内皮効果、β-アゴニスト（サルブタモール）11肺血管拡張剤による気管支拡張および一酸化窒素12による酸素化改善、グルココルチコステロイド13,14による炎症遺伝子発現の非特異的阻害が、ALI/ARDSに対する治療法として無効の有効性/安全性プロファイルを有すると教示している。機構的に、根底の原因にかかわらず、活性化好中球は、ALI/ARDSの発症およびMOFへの進行の中心である15。実際、好中球減少症の患者におけるARDSはまた、ALI/ARDSが好中球減少症の患者における好中球回復16または好中球回復の顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）誘導（17）と関連するので、好中球主導である。ALI/ARDS/MOFにおける治療有効性を知ることは、重病の患者における基礎をなす敗血症または多臓器機能不全を悪化しないであろう安全性プロファイルを有してALI/ARDS（19,20,21）における自己増幅性の不適応の好中球媒介組織傷害（18）の直接阻害を必要とする。好中球中心のアプローチは、動物モデルでALI/ARDSを低減することへの総好中球の枯渇の前臨床有効性により支持されており（22）、ARDSにおける主な死因であるMOFへの進行も弱めると予想することができる（23）。それは、活性化好中球が、好中球が媒介する微小血管内皮傷害、毛細血管透過性（25）、ならびに好中球細胞外トラップ（NET）が関連する微小血栓（26,27）、内皮および肺上皮傷害を介してMOFに主要な役割を果たすからである（24）。予想通り、好中球エラスターゼの阻害は無効（28）、またはせいぜい議論を呼び（29）、1つの特異的プロテアーゼだけではなく、ARDSにおけるすべての好中球の役割を除去することの重要性を指し示している。他方で、抗MCP1 mAb（31）およびマクロファージ枯渇（32）によるマクロファージ動員の阻害がARDSを悪化させることを示すインビボ前臨床研究により裏付けられたように、ARDSにおける超炎症状態の収束に向けたアポトーシス細胞のエフェロサイトーシスに機能性マクロファージが必要であることから、汎抗炎症アプローチもまた無効である（30）。
本明細書記載のように、本発明者らは、抗DEspRがラットにおいてLPS-活性化好中球のエクスビボ生存を阻害し、LPS誘発出血性脳症からの生存を増加させることを発見した。本発明者らはまた、DEspRがヒト活性化好中球およびネトーシスを起こしている活性化好中球上で発現されることを見出した。これらのデータは、抗DEspRが好中球枯渇に変換可能な相当物を提供するという治療仮説を支持するものであり、したがって、ALI/ARDS/MOFにおける中心的な病原性主導物を抑止している。
ARDS患者における好中球減少症からの安全性への懸念なしに「好中球枯渇」の治療パラダイムを変換するために、新規な標的特異的生物学的治療剤、ヒンジ安定化S228P IgG4骨格を有するヒト化/脱免疫化抗DEspRモノクローナル抗体（mAb）、hu-6g8が、本明細書に記載され、このモノクローナル抗体は、
1] ALI-ARDS-MOFの進行のドライバーとしてのDEspR(+)活性化好中球およびNETの抑止、したがって、好中球媒介傷害カスケードの悪循環を断つが
2] DEspR(-)の静止状態の好中球、単球、内皮細胞、および肺上皮細胞を温存し、したがって、DEspR+活性化好中球が阻害された後、エフェロサイトーシスおよびALI/ARDSにおける超炎症状態の回復に向けてバランスを傾ける最適な安全性プロファイルを達成する（図10）。
推定値は、米国において200,000例/年のARDS（37,38）およびEUにおいて約175,000である。ALI/ARDSは、複数の疾病単位：敗血症、肺炎、外傷、直接肺傷害、および人工呼吸器誘発損傷で起こる。5大陸50施設試験において、ARDSの2014年期間有病率は、ICU入院の10.4％であり；院内死亡率は、34.9％（軽度）、40.3％（中等度）、および46.1％（重度ARDS）であった（39）。
本明細書記載の治療法は、例えば、以下を処置するために使用することができる：
1. ICU内のALI/ARDS患者
2. 好中球増悪肺疾患：活性化好中球およびNETが増悪発作に直接関与する（42）、a）慢性閉塞性肺疾患（COPD）（40）およびb）嚢胞性線維症（41）。
3. 好中球媒介傷害カスケード：a）虚血性脳卒中後の二次傷害、b）敗血症、c）外傷性脳損傷における、血管原性浮腫および出血性合併症が後続する血液脳関門（BBB）破壊
4. a）膵管腺癌、b）膠芽腫、c）トリプルネガティブ乳癌、d）非小細胞肺癌、e）結腸直腸癌、f）黒色腫を有するがん患者における転移、治療抵抗性、および免疫回避を促進する好中球細胞間クロストーク。前臨床試験は、転移および微小腫瘍の増殖を防止する、ならびに/または腫瘍の進行を減速するための潜在的な新規補助療法またはネオアジュバント療法としてのhu-6g8を裏付けている。
現行および予測される標準治療と比べた抗DEspR mAb療法。ALI/ARDSのための現行の標準治療は、肺保護換気および体液管理（fluid-conservative）戦略、ならびに根底の原因の処置に限られるが、有効な薬物療法は利用不可能である（43）。肺保護換気戦略および支持療法以外にALI/ARDSに対する治療法はない。「ALIに対する処置として外因性界面活性剤、吸入一酸化窒素、静脈内プロスタグランジンE1、グルココルチコイド、ケトコナゾール、リソフィリン、N-アセチルシステイン、および活性化プロテインCの初期の励みになる前臨床の証拠にかかわらず、第3相試験は、その使用を支援しなかった」（52）。最近では、ロスバスタチン療法もまた、敗血症関連ARDSを有する患者において臨床成績を改善せず、肝および腎の臓器機能不全の一因となった場合がある（53）。追加的に、ARDS生存者の1年にわたる経過観察で、ロスバスタチンは、ARDS/ALIからの慢性後遺症に対して無効であった（54）。同様に、β-遮断薬は、ARDSを減弱せず、その代わりに、成績を悪化させる一因となった場合がある55。これらの累積的な失敗は、新規な治療法の必要性を強調している。
ALIまたはARDSを有する患者は、集中救命治療、機械換気を必要とし、MOFおよび死亡の危険性が高い。患者には、実質的な医療コストがかかり、生存している患者は、持続性の重大な能力障害45およびより低い健康関連の生活の質46を有する。ALI/ARDSに対しても、好中球主導二次性組織傷害により増悪する他の疾患（脳卒中、外傷性脳損傷、急性腎障害など）にも、有効な治療法はない。
一態様では、集中救命状況の薬物療法に必要な、バランスのとれた有効性-安全性-時間活性プロファイルを示す汎種反応性ヒト化脱免疫化抗DEspR IgG4 mAb、hu-6g8が、本明細書に記載される。図10に、hu-6g8の作用機序を図示する：これは、後続のエフェロサイトーシスおよび回復のためにアポトーシスを誘導することにより活性化好中球を除去する。このMoAは、ARDS／多臓器不全（MOF）または多臓器機能障害症候群における好中球媒介組織傷害の複数のメカニズム：内皮および肺胞細胞膜を破壊するプロテアーゼの好中球放出、ならびにネトーシス媒介肺胞および内皮損傷、ならびにMOFへのARDS進行において見られる微小血栓－血管障害を減少させる。
簡潔には、この抗DEspRアプローチは、以下に概略を示す実験データにより裏付けられる：
1. 標的としてのDEspRの検証。DEspRは、活性化ヒト好中球（図1A、1C、1D）上に発現される。抗DEspRの免疫染色特異性は、アイソタイプ対照好中球における無シグナルによって示される（図1B）。ネトーシスを起こしている大部分のヒト好中球は、DEspR+である（図1C～1D）。NET（好中球細胞外トラップ）は、MOFにおける器官微小血栓と関連し、そのすべてがARDSにおける病原性事象である内皮および上皮細胞死を直接誘導する56。
2. 非生存者であるARDS患者およびLPS誘導ヒト好中球において、主としてDEspR(-)であるCD11b(-)好中球と対照的に、CD11b+活性化好中球の大部分は、DEspR+である（図2A）。2つの抗DEspR mab［抗ratDEspR-10a3、および汎種反応性抗DEspRヒト/ラット/サルmAb、6g8による処置は、対照の未処置ヒトおよびラット好中球と対照的に、LPS活性化好中球の生存率を減少させた（P＜0.0001）（図2B）。
これらのデータは、いくつかの独立した実験系：好中球、腎細胞および内皮細胞、がん幹細胞から推定される作用メカニズムを裏付けるものである。静止状態の好中球（大部分がDEspR陰性）は、短い循環寿命（例えば、4～8時間）で構成的にアポトーシス性である。活性化好中球（大部分がDEspR陽性）は、延長した寿命または増加した生存期間および遅延したアポトーシスを有する。浸潤組織または腫瘍を有する好中球が活性化され；血管から組織内への好中球遊出は好中球を活性化する。CD11b(-）静止状態好中球の大部分（98％）（図2A、Q4）は、DEspR(-）であり、抗DEspR処置が好中球減少症を引き起こさないことを示している。これは、腫瘍モデルにおける複数回処置（図11）のみならず、単回処置脳卒中モデルにおいてインビボで示される。
マウス前駆抗DEspR抗体、6g8-mumabを、ARDSおよび敗血症における多臓器不全（MOF）のパラダイムとしてのLPS誘発出血性脳症のラットモデルで研究した（図3A～3F）。正常ラット脳（図3A）または6g8-mumabで処置されなかったLPS処置脳（図3B）と比較して、単回の抗DEspR mAb（1mg/kg/回 iv）は、生命にかかわる出血性脳症への進行を減弱した（図3C）。処置されたラットの脳内で抗DEspRマウスIgGによる標的会合が示される（図3D）。
これと一致して、6g8 mumab処置ラットの脳内で減少したミエロペルオキシダーゼレベルにより活性化好中球の機能的活性減少が示される（図3E）。好中球を抑止することへのインビボ有効性をさらに確認するために、脳浮腫減少を示す脳アルブミン含量の減少を分析および検出し（図3F）、これは、血液脳関門が抗DEspR処置により安定化されたことを示している。血管-組織関門は解剖学的に別個であるものの、血液脳関門および肺胞-毛細血管関門の好中球媒介傷害における共通性－すなわち、どちらも浮腫、組織傷害、出血を示す－は、器官および原因にかかわらず「血管-組織関門傷害」における好中球の主要な主導的役割を伝えている。
抗DEspRがLPS誘発出血性脳症MOFラットモデルにおいてラットの生存を増加させることができるかどうかも判定した。簡潔には、抗DEspR mAb処置は、処置されたラット8匹中5匹において生存期間を増加させ、処置されたラットの50％（8匹中4匹）は、試験の終わりに正常な活性および健康を再獲得した（中央値＞30d；試験を33日目に中止、それに対して未処置は16時間）、生存分析のp=0.0007（図4）。
さらに、これらの観察は、急性脳卒中段階で注入された単回抗DEspR mAbが急性脳卒中死からの生存期間を増加させ、神経障害（発作、不全麻痺、意識消失）を収束させることを示すインビボ脳卒中モデルのデータにより確証され、それは、虚血後の好中球媒介血液脳関門（BBB）破壊、血管原性浮腫および出血性合併症の低減が原因である可能性が最も高い（図12）。好中球媒介BBB破壊、浮腫および出血性合併症が、ALI/ARDSにおける好中球媒介肺胞－毛細血管関門の破壊、浮腫および出血に対応することを考えると63、虚血後脳卒中期間中に好中球媒介傷害を減少させる抗DEspR mAbの有効性は、好中球媒介ALI/ARDSにおける抗DEsprR療法の有効性を裏付けている。
本明細書においてhu-6g8またはABT-468と称されるS228Pヒンジ安定化IgG4/カッパFC領域を有する完全ヒト化抗DEspR mAbの作製、特徴付け、および検証が、本明細書に記載される。DEspR+ヒト細胞との高い結合親和性および活性化好中球の生存阻害のためにhu-6g8を設計した。hu-6g8は、ヒト、霊長類およびげっ歯類において同一のエピトープを有するすべての種において反応性であり、このことは、治療先導物を使用した前臨床試験および臨床試験を推進する。そのマウス前駆体6g8-mumabと比較して、インビトロ分析は、hu-6g8のより大きな結合親和性［EC50＜5nM］および好中球の生存の用量依存的阻害［IC50＜8nM］を実証している（図6）。a）低い免疫原性のためのT細胞エピトープの回避－「脱免疫化」、b）可変ドメインの安定性のための重鎖および軽鎖相互作用の最適化、ならびにc）不安定化する翻訳後修飾部位の排除［脱アミド、酸化、酸不安定性、不適切なN-グリコシル化、異性化およびピログルタメート形成］により最適な生物物理特性を有するhu-6g8を組換えDNA技法によって設計した。
ALI/ARDS/MOFに対するFDA承認の薬物治療薬がないのに対し、hu-6g8は、第3相試験に失敗したまたは現在第3相試験中（FP-1201）の治療法と比較して固有の利点を有する。
1］有効性の利点：
a）第3相試験中のFP-1201および第3相試験に失敗した過去の候補薬と対照的に、hu-6g8は、二重に活性化好中球の生存期間を減少させアポトーシスを増加させるが、DEspR(-)単球／マクロファージを阻害しないことによって、ALI/ARDS/MOFにおける中心的主導物である活性化好中球を標的とする。DEspR(-)単球／マクロファージは、有害な好中球プロテアーゼを放出せずにアポトーシス性好中球のエフェロサイトーシス（または排除）に必要とされる。抗DEspR hu-6g8は、ARDSを予防した好中球枯渇の治療パラダイムを変換し、ARDSを悪化させたマクロファージ枯渇により教示された教訓を守っている。
b）追加的に、FP-1201および失敗した候補薬と対照的に、hu6g8による活性化好中球の除去は、（NETがactPMN由来であることから）NETを事前に減少させることができ、このことは、次いでNET媒介性のARDSにおける肺胞および毛細血管傷害、ならびにARDS-MOFに直接関連する微小血栓形成を減弱する。
2］安全上の利点：集中治療の状況で、安全性プロファイルは、有効性と等しい重要性を帯びる。異なる異種移植腫瘍または自然発生腫瘍を有する＞65匹のラット、および＞20匹の脳卒中易発性高血圧ラットの本発明者らの観察に基づき、以下が抗DEspR療法の有望な安全性プロファイルを表す：
a）感染症についての危険性を増加させ68、創傷治癒を損なうグルココルチコイドとは対照的に、抗DEspR mAb療法は、使用した用量で感染症についての危険性を増加させず、または創傷治癒を損なわない（図13）。
b）抗DEspRは、好中球減少症、貧血または血小板減少症を引き起こさない（図11）。
c）抗DEspRは、腎機能不全を増悪せず（図5）、または高血圧を悪化させない（図14）。
hu-6g8が、ALI患者およびARDS患者からのDEspR陽性(+)活性化好中球の生存期間を低減し、そのアポトーシスを増加させること、ならびに大部分のNET+好中球はDEspR+であるので、DEspR+好中球の除去がネトーシスを有意に減少させることが、本明細書に記載されている。
MOFの進行と共にヒトのARDSを全体として再現する、ARDSの「判断基準」となる動物モデルが欠如しているため、および先行する第II相での好結果の指標にかかわらず第III相試験で失敗したため、ARDSの進行または重症度と関連するバイオマーカーの患者特異的レベルとペグ付けされたARDS患者血液試料から得られたヒト好中球に対する抗DEspR処置の効果のエクスビボ分析が、本明細書に記載される。
ARDSバイオマーカーおよびDEspRメカニズム関連バイオマーカーによる患者試料応答者の特徴付けは、臨床試験に関するALI/ARDS患者の最適な層別化への重要な洞察を提供している。そのうえ、ALI/ARDS/MOFの急速進行性の経過、および患者の試料採取時に異なる進行段階である可能性のせいで、ARDSの重症度の臨床パラメーター（PaO2/FiO2またはO2飽和）、好中球をモジュレートする主要なARDSバイオマーカー（IL-6）、NET媒介MOFの潜在的バイオマーカー（citH3）、およびDEspRメカニズムに関連するバイオマーカー（好中球/リンパ球比またはNLR、DEspR+/CD11b+好中球）から構成される、試料採取時のベースラインの患者特徴を特徴付けることができる。
エクスビボアッセイの最適化は、a）患者試料中のhu-6g8のエクスビボ有効性、b）hu-6g8応答者に関連するARDSバイオマーカー、およびc）ARDS臨床成績を伴う活性化好中球上のDEspR発現の複数の試験を最大化することができる。最適化は、1）活性化好中球の生存を阻害するために3×または10×IC50のいずれかのhu-6g8の用量、および2）6時間（ラット好中球アッセイから検証（図2B）、またはPanc1-腫瘍細胞に対する2時間までのhu-6g8の効果に基づく3時間（図15）のいずれかの処置期間を試験する。
正常なヒト志願者好中球を全血中で高用量10μg/ml LPS×30分により活性化し、次いでCO2インキュベーター中においてhu-6g8（好中球の生存阻害のために3×もしくは10×IC50）またはビヒクルで37℃、3時間または6時間処理することができる。有効性の分析は、生/死細胞およびネトーシスについてのFACSパラメーターにより行うことができる。潜在毒性－溶血の研究は、血漿遊離Hgbの分析により行って評価する。
CD11b+活性化好中球のアポトーシス％（アネキシンV-FITC）および死滅％（ヨウ化プロピジウム）は、トリプル染色FACs分析により測定することができる。hu-6g8の有効性は、未処置NHV CD11b+好中球と比べてCD11b+活性化好中球におけるアポトーシス好中球および／または死滅好中球の％が大きいことと定義される。
ビヒクル処置個体適合対照と比較したhu-6g8処置、LPS活性化NHV好中球におけるネトーシスの減少％は、記載されるように全血中のNETの検証されたFACS測定により行うことができる：排出されたDNAを検出するためのDAPI、排出されたシトルリン化ヒストン-3を染色するためのcitH3、および活性化好中球を標識するためのCD11b。最適なアッセイ条件は、hu-6g8の有効性の両方のパラメーター［％生存、％NET+］に最大差％を与える条件として定義することができる。
ALI/ARD患者30人のパイロット群において、DEspR+/CD11b+好中球を有するALI/ARDS患者のコホートサイズ、ならびにARDSの重症度の量的尺度：低酸素血症、ネトーシスの程度、人工呼吸器装着日数、および最大28日までの生存期間（日数）へのDEspR+/CD11b+好中球の臨床的意義を決定することができる。ARDSにおいてDEspRを標的とする臨床的影響は、DEspR+活性化好中球を有するALI/ARDS患者の％およびDEspR+発現とARDS重症度の尺度との相関関係に反映されることができる。
ARDS患者24～30人は、ベルリンARDSアルゴリズムにより同定し、新鮮血液試料［チューブ2本に7ml（1本目に2ml+2本目：5ml）を入手し、EDTAで抗凝固処理し、適切な臨床的人口統計を集め、3a-1に従って進むことができる：ARDS患者同定の基準：a）急性疾患；b）PEEP=5cm H2O以上で人工呼吸器装着；c）胸部写真で両側に浸潤；d）動脈血液ガス（ABG）が決定された場合、PaO2/FiO2＜300、またはABGが決定されず、O2飽和＜97％の場合、飽和％/FiO2＜315；e）心不全なし。f）年齢＞18歳。除外基準は、以下を含むことができる［FP-1201または組換えヒトIFNβ1aに対する進行中の第III相試験に適合］：
a）BL-3またはBL-4バイオセーフティーレベルを必要とする感染症、b）以前に肝不全、腎不全、心不全を有した患者、c）患者が人工呼吸器から離脱できない可能性を有する基礎疾患（運動ニューロン疾患、筋ジストロフィーなど）、d）長期にわたり在宅酸素療法または人工呼吸療法を受けているCOPD；e）妊婦、f）患者が別の薬物療法プロトコールに参加している。
DEspR+/CD11b+好中球の％と相関するALI/ARDS患者の患者特徴を評価することができる。得られた臨床情報は：a）診断時および採血日（診断から＜48時間）のPaO2/FiO2または酸素飽和度、b）人工呼吸器装着日数、c）基礎をなす診断、d）年齢、e）性別、f）診断時および採血日のCBC；g）ALI/ARDSの診断から28日以内の生存期間を含むことができる。得られたバイオマーカー情報は、：a）好中球/リンパ球比（CBCから）、b）DEspR+活性化CD11b+好中球の％、DEspR(-）CD14単球の％（FACS分析：DEspR、CD11b、CD14）、c）ARDSバイオマーカーIL-6、およびネトーシスバイオマーカー：citH3の血漿中レベル。
ALI/ARDSにおけるDESPRの臨床的意義の分析は、以下により評価することができる：
何人のALI/ARDS患者が上昇したDEspR+活性化好中球を有するか、
DEspR+活性化好中球の％はARDS患者におけるベースラインのネトーシスマーカー、citH3レベル、ならびに/またはARDS重症度のバイオマーカーIL-6および／もしくはNLRと相関するか、
DEspR+/CD11b+好中球の％は、低酸素血症（PaO2/FiO2）、重症度（採血からの生存日数および人工呼吸器装着日数）のレベルとして測定したARDSの臨床的重症度と相関するか。
DEspR+ CD11b+好中球の％を、より不良の予後と関連する異なるバイオマーカー（IL-6、NET citH3、NLR）および試料採取日に得られたARDS患者の特徴（PaO2/FiO2；人工呼吸器装着日数および生存日数と比較して、スピアマンの順位相関分析（n=30）を行うことができる。患者30人の試験は、スピアマンの順位相関係数r=0.5について十分な検出力0.8を有意水準0.05で提供する。相関係数0.5は、大きな効果、0.3は中等度、0.1は小さな効果を示す。
活性化好中球の生存期間およびNET形成を減少させることへのhu-6g8のエクスビボ有効性は、本明細書上記の処置の最適な試験用量および持続期間を使用して試験して、hu-6g8応答者をARDSバイオマーカーおよび重症度の臨床特徴ならびに溶血の危険性についても特徴付けることができる。10個のARDS患者試料を、DEspR+/CD11b+好中球の生存期間を低減することへのhu-6g8の有効性について試験することで、ラットモデル実験において観察された抗DEspRの有効性を確証することができる。
生存期間を低減する有効性。トリプル免疫染色FACS分析（活性化好中球をマークするためのCD11b）、アポトーシスをマークするためのアネキシン-V、死細胞をマークするためのヨウ化プロピジウム）を行って、hu-6g8がCD11b+好中球の生存期間を減少させ、アポトーシス（アネキシンV）またはネクロトーシス（ヨウ化プロピジウム）を誘導するかどうか評価することができる。ネトーシスを低減する有効性：トリプル染色FACS分析を行って、トリプル染色NET成分、すなわちシトルリン化ヒストン3（hitC3）および好中球ミエロペルオキシダーゼ（MPO）が結合した、排出されたDNA（DAPI）により、NET+好中球を検出することができる。好中球は、前方散乱またはFSC（サイズ）および側方散乱またはSSC（粒度）によりゲート設定して、それらを単球と識別することで、循環単球の同時分析を可能にすることができる。有効性の分析は、CD11b+好中球の生/死細胞数および処置試料と未処置試料（n=10/群）との間のNETレベルにおける差が、両側t検定によりP＜0.05で有意であるかどうかを検定することにより行うことができる。検出力の計算は、n=10/群について十分な検出力0.85、アルファ=0.05を表し、平均1は20および平均2は40であり、共通のsdは15である。ネトーシスにおける差、および活性化好中球の生存期間の減少の差だけではないことが、ARDS療法およびMOFの予防としてのhu-6g8の有効性を示す。
ARDSにおける超炎症状態からして、hu-6g8の溶血副作用が好中球のアポトーシス増加をエクスビボで誘導した可能性を除外するために、アポトーシス細胞の増加によりトリガーされる補体活性化から任意の溶血が偶然起こるかどうか判定することにより、ARDSの超炎症状態の状況での潜在的毒性を評価することができる。好中球のアポトーシスは、補体活性化をトリガーし、溶解させず、そのことは、炎症の収束に向けたマクロファージによるアポトーシス性好中球のエフェロサイトーシスの効率を顕著に増加させる。溶血の分析は、通常は血漿中に存在しない血漿遊離ヘモグロビン（PFHgb）の記載および検証されたPFHgb＞50μg/dlのELISA検出により定量的に行うことができる。
DESpR+/cd11b+好中球とは別のhu-6g8応答者のプロファイルの分析。hu-6g8の潜在的臨床的影響は、MOFおよび／または死亡に進行したARDS患者から得られた好中球において溶血を起こさないhu-6g8の有効性のエクスビボ実証により裏付けることができる。DEspR応答性の潜在的阻害剤があるかどうかも試験することができる。これを、DEspR応答％（生存期間またはネトーシスのいずれか）とDEspR+ cd11b+ 好中球の％とのスピアマンの順位相関により検定する。強い相関は、応答の交絡因子がないことを示し、すなわち、DEspR+ならば、応答がDEspRの発現％と対応することが予想される。無相関は、DEspR+cd11b+好中球であるにもかかわらずhu-6g8の有効性を阻害する潜在的交絡因子が血中にあることを示す。
ALI/ARDS/MOFにおける抗DEspR療法についての理論的根拠を強化するために、例えば、hu-6g8のエアロゾル化送達の有効性の試験に備えて、BAL液中の活性化好中球の生存を低減することにおけるhu-6g8の有効性を試験することができ、このことは、有効性を増加させ、かつ／または潜在的適用を広げることができる。これらの研究はまた、最適な投与経路または二重投与経路－静脈内およびエアロゾル化の基礎を解明することができる。追加的に、患者を自分自身の対照として使用して異なるステージのALI/ARDSでhu-6g8を試験することは、ARDSにおけるhu-6g8療法についての理論的根拠を強化し、治療可能時間域への洞察を与えることができる。
hu-6g8が（がん細胞中と同様に）好中球中にインターナリゼーションし、アポトーシスを誘導するかどうか、およびhu-6g8と結合した循環好中球が内皮傷害または肺胞上皮細胞傷害を引き起こさないことを決定することができる。追加的に、仮説を確認するために、生存促進タンパク質（例えば、Mcl1、BIRC3）およびアポトーシス促進タンパク質（例えば、Apaf1）の活性化好中球レベルに対するhu-6g8処置の影響を、処置された好中球と未処置の好中球とを比較することにより試験することができる。抗DEspRは、膵臓癌幹細胞においてMcl1、BIRC3を減少させ、Apaf1を増加させた74。
参考文献
Figure 0007404230000019
Figure 0007404230000020
Figure 0007404230000021
Figure 0007404230000022
Figure 0007404230000023
実施例5
ちょうど活性化PMNのように、NETの抗微生物死滅特性は、逆効果で直接組織傷害を引き起こし、傷害部位にNETが付着するせいで当該傷害部位に残る可能性がある。累積する研究は、NETが多数の主要疾患－急性呼吸窮迫症候群（ARDS）、急性冠症候群（ACS）、ARDSにおける多臓器不全（MOF）、糖尿病、COPDクリーゼ、鎌状赤血球クリーゼ、急性腎障害、外傷性脳損傷、および敗血症－における二次組織傷害の一因であることを示し、これらの疾患のすべては、多くの研究にもかかわらず必要性がまだ対処されていないままであり、したがって、ネトーシスを起こしているPMNおよびNETのターゲティング阻害の重要性を表している。
ヒト化抗DEspR IgG4S228P抗体（抗DEspR humab）により活性化PMNの生存期間をうまく中和することで、ARDS患者の血液試料におけるネトーシスへの進行を事前に防止すること、およびネトーシスを起こしているヒト好中球を抗DEspR mAbでうまくターゲティングすることが、本明細書に記載される。抗DEspR mAbのターゲティングは、次いでアポトーシスを促進し、したがって、ネトーシスを起こしている好中球の排除を推進し、それと並行してマクロファージによる排除またはエフェロサイトーシスのためのactPMNのアポトーシスを誘導する。
細菌、血小板を捕捉するのみならず、内皮に付着して損傷を引き起こすNETの生物物理学的な「メッシュ足場」に打ち勝つために必要な標的特異的有効性を達成するための、予備検証された成分によるターゲティング抗体-酵素複合体（AEC）の複合設計が、本明細書に記載される。FDAに承認された抗NET療法はないので、抗DEspR-DNAse-1 AECは、1）NETターゲティング部分および阻害剤（高特異性ヒト化ヒンジ安定化S228P IgG4 抗DEspR抗体、NETおよびネトーシスを起こしている好中球）と、2）NETの構造的中和物質および予備プロセシング物質（例えばDNase1）との新規なバイオコンジュゲートを提供する。DNAse-I単独では、インビトロおよびインビボで完全にはNETを分解できないが（Farrera C, Fadeel B. 2013. Macrophage clearance of neutrophil extracellular traps is a silent process. J Immunol 191:2647-2656）、抗DEspR抗体とDNAse-Iとのコンジュゲーションは、DNAse-IをNETにターゲティングし、結果としてDNAse-1によるNETの予備プロセシングが生じ、したがって、単球由来マクロファージによるNETの排除を治療的に高める。これは、NETのターゲティング阻害および生物物理学的中和および排除を提供するであろう。ちょうど好中球の溶解が有毒である可能性があるように、NETの分解では不十分であり、むしろ排除および回復のためのNETのターゲティング阻害および再プロセシングが十分である。
3つの成分：抗体ターゲティング部分、コネクター部分、およびペイロード部分を有する抗DEspR-humab-DNase1治療原型の調製が、本明細書に記載される。組換えDNA技法により、Fc領域のC末端にリンカーを有する抗DEspR-humabを産生する。適切なリンカー、例えば、切断可能リンカー、例えば、ヒト好中球-エラスターゼ（HNE）切断可能ペプチドリンカーが、当技術分野において公知である。3つのすべてが、確立された方法論に役立つ確立された成分であるのに対し、AEC原型の組み合わせは独特である。とりわけ、好中球エラスターゼは、NETに対して活性な成分であることで、NET上へのAECの抗DEspRターゲティング結合を受けてDNAse1を放出する。次いで、DNAse1の放出は、NET中のDNAを消化し、それは、十分でないことが示されているが、「プロセシングされた」NETを達成し、次いでマクロファージの排除を推進する。（Farrera C, Fadeel B. 2013. Macrophage clearance of neutrophil extracellular traps is a silent process. J Immunol 191:2647-2656）。
抗DEspRターゲティングAECの必要性。疾患にかかわらず、NETが多様で病原的に別個の疾患によく見られる犯人であるという事実は、NETを標的とする重要性および価値高い優先性を立証している。NET主導組織傷害を効果的に中和し、ARDS、出血性脳卒中などの死亡率を下げることができるFDAに承認された薬物がないので、AEC治療薬が必要である。研究は、デオキシリボヌクレアーゼI（DNase1）がNETを解体できるが、「DNase1単独」療法は、患者5,6および動物モデル7,8におけるNET媒介病状または組織傷害を収束させるには不十分であることを示しており、AECの必要性を指摘している。PAD4阻害剤またはPDA4の欠乏はネトーシスを予防するとはいえ7、それらは、すでに進行中の活動性のNET主導組織傷害を遮断することができない。
抗DEspR-mabターゲティングAECの開発がNETのマクロファージ排除を促進することができることで、ARDSにおけるNET誘導内皮傷害-ネトーシスの悪循環を断ち、ACSに対する治療応用のための門戸を開放するのみならず、ARDSでの多臓器不全、敗血症、および外傷におけるNET媒介血栓症を予防することが、本明細書に記載される。異なる臓器系の複数の疾患における累積データは、疾患進行に、および急性呼吸窮迫症候群（ARDS）、急性冠症候群（ACS）、ARDSにおける多臓器不全（MOF）、敗血症、がん、外傷1-3での生命にかかわる末期病理発生のフィードフォワードメカニズムに、好中球細胞外トラップ（NET）を関係付けている。多くの前臨床研究8,10,11および臨床試験5,12,13にかかわらず、NET主導病状または組織傷害に対する治癒目的のFDA承認治療薬はない。
抗DEspR mAbターゲティングAECの利点が、本明細書に記載される。DEspR、二重エンドセリン1/シグナルペプチド受容体9は、ヒト活性化好中球およびNET上の検証された標的である。ヒト腎臓（K）および活性化好中球試料、act-NにおけるDEspRタンパク質のウエスタンブロット分析により確認されるように（図18C）、Hu6g8は、ヒト活性化好中球（図18A）およびNET（図18B）と結合する。ヒト化抗DEspR-mab（hu6g8 mab）は、理想的なターゲティング部分である。Hu6g8は、（ADCC-抗体依存性細胞性細胞毒性、CDC-補体依存性細胞毒性）を回避するため、およびネイティブなIgG4アイソタイプに典型的なFabアーム交換時のターゲティング欠如を除去するためのヒンジ安定化IgG4S228P/カッパFc領域を有する多種ヒト/NH霊長類/ラット反応性ヒト化-脱免疫化抗DEspR-mabである（図17A）。複数の候補から選択され、hu6g8は、そのマウス前駆mabと比較して無傷細胞上のDEspRと改善された結合親和性（図17B）、および活性化好中球のターゲティングに改善された機能性を示し、生存期間は、エクスビボ処置の6時間後に減少する（図17C）。組換えDNA技法により、抗体の設計は、a）低免疫原性のためのT細胞エピトープの回避；b）可変ドメインの安定性のための重鎖と軽鎖との相互作用の最適化；および、c）不安定化翻訳後修飾部位の排除［例えば、脱アミド、酸化］を組み入れている。抗DEspR mAbによりDEspR+NETを標的とするが、静止状態のDEspR(-)好中球を残すことも新規である。DNAse1（30.1kDa）の使用は、これが血漿中の循環タンパク質であり、したがって、外来物質応答を誘導しないと考えられ、嚢胞性線維症に対してFDAから承認されており17、酵素活性を失わずに複数部位がフルオロフォアとコンジュゲート可能であることが示されていることから、有利である。ヒト好中球エラスターゼ切断可能リンカーの使用は、このコネクターペプチドが組換え技法により付加でき、HNEがNET上に豊富に存在し、実際にNETの傷害特性の理由であるので、有利である。HNEは、治療薬の局所送達に望ましく[Owen CA, Campbell EJ. J Leukocyte Biol 1999, 65 (2) 137-150]、小型非荷電アミノ酸、特にアラニン（A）およびバリン（V）に対して特異性を有する［Meers P. Adv Drug Delivery Rev. 2001. 53 (3) 265-272］。合成ペプチドAla-Ala-Pro-Valは、HENに特異的で[Wiesner O, Litwiller RD, Hummel AM, Viss MA, McDonald CJ, Jenne DE, Fass DN, Specks U. FEBS Lett 2005, 579 (24)5305-5312]、薬物送達に成功することが示されている［Pak CC, Erukulla RK, Ahl PL, Janoff AS eers P. Biochim Biophys Acta 1999, 1419 (2) 111-126］。DNAse1のターゲティング送達およびNET上の放出が、インビトロで示されたこと、すなわちDNAse1がNET DNAを消化するときにマクロファージがNETの取り込みおよび排除を誘導することのインビボ有効性を達成できるので、AEC中の3つすべての利点は、新規であり、頑健である。要約、血管内NET部位のターゲティング。Fabアームのインビボ交換および結果として起こるターゲティングの欠如を回避するために、ヒンジ安定化IgG4/カッパFc領域を有するヒト化抗DEspR-mabを選択した。追加的に、これは、内皮傷害を悪化させるであろうIgG1 mAb（ADCC、CDC）の免疫エフェクター機能を回避する。重要なことに、抗体は、活性化好中球およびNETと結合し（図18A～18C）、活性化好中球の長期生存を阻害する。したがって、ターゲティング部分の機能に加えて、先手を打ってネトーシスを阻止するための活性化好中球の阻害が達成される。DNAseは、ヌクレオソームの間（DNase1過敏性部位）の「裸の」DNAのみならず、DARNS（ヌクレオソームの安定DNase1注釈つき領域（DNase 1 annotated regions of nucleosome stability））部位のヌクレオソーム中のヒストン周囲に巻き付いたDNAを消化するであろう16。
参考文献
Figure 0007404230000024
Figure 0007404230000025
実施例6
DEspR+CD11b+「ならず者」好中球またはネトーシス易発性好中球
特徴的な多分葉核を有するヒトストレス活性化好中球の免疫細胞染色により、後の排出に向けた異なる程度のDNA周縁化により特色付けられる好中球細胞外トラップ（NET）形成（ネトーシス）の様々なステージにおいてDEspR+発現が検出される（図21A～21B）。
活性化好中球上および初期のバイタルネトーシス（すなわち、無傷の細胞膜）においてDEspRが存在していることは、DEspR+活性化好中球およびバイタルネトーシスを起こしている活性化好中球を阻害するためのターゲティング療法として抗DEspRブロッキング抗体を支持するものである。
CD11b+好中球のすべてではなく一部にDEspR+/CD11b+好中球および初期バイタルネトーシス中のDEspR+/CD11b+好中球が検出されることは、ネトーシス易発性好中球であるCD11b+活性化好中球または初期のネトーシスを起こしている好中球のサブセットを特定するものである。NETはまた、好中球主導二次性組織傷害に関係付けられているので、好中球におけるDEspR+発現の増加は、NETおよびネトーシスを起こしている好中球についてのバイオマーカーとなり、抗DEspR mAbにより活性化好中球およびネトーシスを遮断するターゲティング療法のためのアクセス可能な膜受容体標的を提供する。好中球の生存に必要とされる厳密に調節された生存タンパク質であるMcl1を減少させるDEspRの下流の効果による活性化好中球の生存阻害の結果として、有害なプロテアーゼおよび活性酸素種（ROS）を放出せずに好中球の機能を効果的にシャットダウンする内因性メカニズムである好中球アポトーシスがもたらされる。アポトーシスの誘導はまた、単球/マクロファージのエフェロサイトーシスによる排除を促進し、したがって、超炎症状態の能動収束を推進する。
とりわけ、すべての活性化好中球がDEspR+のわけでない（図24）。これは、抗DEspR療法安全性についてのメカニズムを解明し、すなわち、すべてのCD11b+活性化好中球が阻害されるわけではなく、したがって、正常な調節された好中球の機能続行が可能になる。
ヒト活性化ストレス活性化好中球および細菌リポ多糖（LPS）活性化好中球上のDEspRの存在は、ヒト好中球のウエスタンブロット分析で確認される。ヒト腎組織は、陽性対照として役立つ（図25）。好中球試料N1およびN2中のDEspRのサイズがより小さいことは、グリコシル化DEspR（約17kDa）と対照的に非グリコシル化DEspR（約9.5kDa）と一致する。細胞内O-グリコシル化がリン酸化部位を妨げるとは言わないまでもモジュレートするメカニズムであるので、好中球における非グリコシル化DEspRは、リン酸化部位への「オープンアクセス」を反映する。グリコシル化および非グリコシル化DEspRタンパク質の検出は、O-グリコシル化としてのDEspRリン酸化のモジュレーションのメカニズムが、リン酸化のモジュレーションと関連し、N-グリコシル化が、観察されたDEspR-核輸送についてのシャトルメカニズムとして共に役立つことができるガレクチン1およびガレクチン3との細胞内相互作用を可能にすることを示す。
インシリコ解析は、DEspRが、カットオフ値よりも3.7～4.3倍大きい予測スコアでDEspR S72、およびT76、77、84に位置複数のセリンおよびトレオニンリン酸化部位を有することを実証している（図30）。DEspRのリン酸化、インターナリゼーション、および好中球におけるDEspRの核局在は、DEspRが低酸素または細胞毒性微小環境中で好中球の生存を促進および維持することを推進し、したがって、抗DEspR mAbの結合によるDEspR阻害がどのように好中球の生存を低下させるかを実証している。これらのセリンおよびトレオニンリン酸化部位は、永続的Cos1 DEspRトランスフェクタントにトランスフェクトされたヒトDEspRのリガンド特異的活性化から活性化シグナル伝達リンタンパク質の検出と一致する（Herrera et al 2014）。
インシリコ解析は、いくつかの推定上のセリン（S）およびトレオニン（T）、推定上のO-グリコシル化モチーフまたは「O-シークオン」を検出した（図27）。これらは、PNGase-Fにより不完全に消化されたウエスタンブロット分析でのグリコシル化DEspRプルダウンタンパク質の検出と一致し、したがって、非N-グリコシル化およびO-グリコシル化の両方を示している［Herrera et al 2016］。主に膜貫通ドメイン中のDEspR O-グリコシル化部位は、リガンドまたは抗体結合時にDEspRがインターナリゼーションすると細胞内O-グリコシル化に曝される。
急性呼吸窮迫症候群（ARDS）を有する患者からの患者血液試料のFAC分析は、ARDS患者の生存者で低いが（図27）、ARDS患者の非生存者で上昇しているCD11b+活性化好中球のサブセットとしてDEspR+/CD11b+活性化好中球を検出した（図28および29）。ARDS生存者において低レベルのDEspR+/CD11b+活性化好中球が検出されるのとは対照的に、ARDS患者の非生存者において高レベルのDEspR+/CD11b+活性化好中球が検出される（図29）。このようにレベルに差が観察されたことは、活性化好中球のDEspR+CD11b+サブセットが、ARDSからの死亡および長期後遺症の原因である多臓器不全（MOF）へのARDSの進行に関与する可能性もあることを示している。
追加的に、DEspR+/CD11b+単球もまた、非生存ARDS患者において検出され（図27）、したがって、DEspR+/CD11b+好中球とクロストークして｛組織傷害－好中球応答－組織傷害という好中球主導の悪循環を伝播する単球サブセットを特定している。好中球および単球の両方が、ARDSの発症に関係付けられている。
活性化好中球の新しいサブセット、DEspR+/CD11b+は、ARDSの死亡率と関連する。DEspR+/CD11b+好中球数の増加とは別に、年齢、性別、試料採取時間をマッチングしたARDS患者生存者と比べてARDS患者非生存者のA02において見られるように、これらのDEspR+好中球はまた、好中球1個あたりDEspR受容体の発現（強度）増加を示す（図30）。これは、好中球のDEspR+/CD11b+サブセットがARDSにおけるより悪い予後と関連することを確証するものであり、DEspR+/CD11b+「ならず者」好中球が、ARDSの進行および死亡率を増加させる好中球媒介病原性メカニズムの根底にあることを示している。したがって、このサブセットの阻害は、ARDS、脳卒中および脳外傷における二次浮腫拡大を減弱すること、ならびにがんにおけるチェックポイント阻害剤を強化するために好中球媒介免疫回避を止めることの鍵となる。抗DEspR mAb処置を使用してこのサブセットの阻害を検出した。
DEspR+/CD11b+好中球レベルは、他の公知のARDS臨床パラメーターであるPaO2/FiO2、血清クレアチニン、好中球リンパ球比よりもよく非生存予後と関連した（図31）。これは、DEspR+/CD11b+の発現が、＜20％の低レベルの場合およびCD11b+であるがDEspR(-)の好中球と対照的に、＞50％に上昇した場合に好中球主導傷害の悪循環につながる「ならず者」活性化好中球の調節不全サブセットを特定するものであることを示す。DEspR免疫表現型の決定は、ARDSにおける肺または全身のみならず、脳卒中における二次性脳損傷、低酸素および外傷性脳損傷、外傷または感染による多臓器不全、その他のように、活性化好中球が同様に過剰および調節不全である他の病状における好中球主導二次性傷害の切迫した進行についてのバイオマーカーを提供する。
現行の臨床パラメーター（PaO2/FiO2比、血清クレアチニン、および好中球-リンパ球比（NLR）よりも優れた、ARDS患者におけるDEspR+/CD11b+と予後悪化との関連はまた、当該臨床パラメーターの傾向分析でも見られる（図32）。抗DEspRヒト化IgG4S228P抗体による処置は、cd11b+好中球におけるDEspR+の発現が上昇している場合（DEspR+/CD11b+好中球が平均59％の患者A02で見られる）にDEspR+/CD11b+好中球の生存率を減少させ、それに対して、DEspR+の発現上昇が最低限の場合（患者A04 1％、A05 3％で見られる）に効果がなかった（図33）。16％付近のDEspR+/CD11+好中球レベルでは、いくらかの有効性が観察されるが変動性である（A06で見られる）。これらの観察は、抗DEspR mAb療法が組織傷害発症の基礎をなすDEspR+/CD11b+活性化好中球を止められることを実証している。これらのデータを表4にまとめる。
（表４）ARDS患者の全血試料におけるDEspR+/CD11b+好中球の生存率に対するABTM-468処置（10μg/ml）の効果の概要。注：患者の循環環境をシミュレートするための全血におけるエクスビボ分析。
Figure 0007404230000026
a、ベースライン（インキュベーション時間=0時間）での平均DEspR+/CD11b+好中球の％；b、好中球生存率％における予想された減少；c、好中球生存率％における観測された減少；d、マン-ホイットニー順位和検定。実験を4～5回の反復で行った。
DEspR+/CD11b+好中球の増加した数および強度と、ARDS患者における非生存との関連は、DEspR+/CD11b+好中球が、過剰の好中球細菌死滅機能につながる調節不全の「ならず者」好中球であることを示している。正常な活性化-収束のメカニズムが脱共役すると調節不全の過剰が起こる。このことから、このメカニズムは、活性化したときに宿主を細菌から防御するまたは創傷治癒を促進し、能動収束を本来トリガーする正常な好中球応答を引き起こすよりも、むしろ組織傷害を駆動する。
DEspR+/CD11b+活性化好中球に対する抗DEspR処置の影響をさらに試験するために、Panc1がん幹細胞（CSC）の腹腔内注射により樹立された膵臓癌腹膜転移のヌードラット異種移植腫瘍モデルであるPanc1-CDX PPMラットモデルにおいて好中球-リンパ球比を追跡した。好中球はまた、膵臓癌を含めたがんの侵襲性の一因であり、増加したNLRは、転帰悪化および処置に対する応答不良と関連する。この比は、未処置の進行Panc1-CDX PPMで上昇した（図34）。これと一致して、21日目に開始した抗DEspR処置によりNLRは上昇せず、これはまた、腫瘍+ラットの全生存期間の増加も招いた。
ストレス状態における生存率を減少させることおよび好中球におけるアポトーシスを増加することへのDEspRの役割を確認するために、腫瘍細胞の生存率の調節およびアポトーシスにおけるDEspRの役割を試験した。腫瘍細胞におけるアポトーシスの誘導が化学療法の有効性を高めることは公知である。そこで、抗DEspR mAb処置と、膵臓癌に対する標準治療であるゲムシタビンとの組み合わせを試験した（図35A～35B）。ゲムシタビン標準治療およびhu-6g8抗DEspR mAb（ABTM-468）の併用療法による膵臓腫瘍細胞（2つの細胞株、Panc1およびMiaPaCa2）のインビトロ処置の結果として、相乗効果、すなわち化学療法のより大きい有効性が生じた。
抗DEspR/ゲムシタビンの相乗効果の観察は、抗DEspR mAb療法がチェックポイント阻害剤と組み合わせるための説得力のあるパートナーである可能性を裏付けている。とりわけ、ゲムシタビンとターゲティング療法との他の併用療法は、膵臓癌患者に説得力のある臨床的利益を有しなかった（例えば、膵臓癌におけるGEM+エルロチニブ、またはGEM+アバスチン、またはGEM+チェックポイント阻害剤）。独特な組み合わせ相乗効果のパラダイムをインビボでさらに試験した。図36に示すように、低用量（1mg/kg i.v.）の抗DEspRヒト化IgG4S228Pおよびゲムシタビンによるラットのインビボ処置は、ゲムシタビン単独よりも高い有効性を示した。併用療法（ComboTx）で処置された一部の腫瘍+ラットは、治療の開始時に腫瘍量が記録された後で腫瘍を有しなかったことから、併用［抗DEspR+ゲムシタビン］療法は、膵臓腹膜転移腫瘍を退縮させた。そのうえ、ComboTxラットに腹水はなかった。腸管機能不全による腸管拡張も、食塩水模擬処置（Tx）対照で明白である（図36）。
腫瘍量の定量は、comboTxラットがまた、模擬処置対照（食塩水）および標準治療ゲムシタビン（GEM）処置ラットと比較して大網および小網中に小さい腫瘍量を提示したことを示した（表5）。重要なことに、肝臓および後腹膜腔への転移、ならびに腹水はすべて、ComboTxにより予防/阻害された。
（表５）
Figure 0007404230000027
腫瘍の退縮は、免疫適格ラット宿主におけるラット自然発生乳房腫瘍モデルでの観察と一致する。免疫低下異種移植腫瘍宿主および免疫適格異種移植腫瘍宿主の両方における腫瘍退縮は、すべてが宿主の全生存期間の減少の一因である腫瘍進行、転移侵襲性、治療抵抗性に果たす好中球の役割を示している。これらの観察は、まとめると、それぞれ自然型および獲得型の治療抵抗性に好中球が関係付けられている化学療法またはチェックポイント阻害剤による新しい併用療法のための新規治療薬としてhu-6g8を支援している。
NET易発性好中球におけるDEspR+発現は、DEspR+腫瘍細胞、腫瘍血管（図19A～19F）と共に膵臓癌間質において検出され（図37A～37D）、これは、FAC分析によりインビボで（図19G～19J）および2つの膵臓細胞株のインビトロ組織培養研究（図20A～20F）により立証されている。このニッチ-共局在は、腫瘍の浸潤、転移、治療抵抗性および免疫回避を推進することへの好中球の役割のクロストークメカニズムを提供する。これは、DEspR阻害の有効性を示し（図21）、ボーラス注入後の血流中の抗DEspR抗体の存在を記録している（図22）、インビボ研究により裏付けられる。
DEspR+活性化好中球および／または活性化バイタルネトーシス易発性好中球はまた、膵臓腹膜転移または癌腫症における転移性PDAC腫瘍で検出される（図38A～38B）。転移性膵臓癌患者の腫瘍の腫瘍間質中にDEspR+ NET易発性活性化好中球および／またはNETが存在し、それと共に間質中で侵襲性腫瘍細胞と直接細胞間接触していること（図38A～38B）は、DEspR+好中球が、1～2mmを超える微小腫瘍のための血管新生スイッチおよび免疫回避スイッチ（両方が転移の成功または前がん病変からがんへの転換成功のために起こらなければならない）に及ぶ、微小腫瘍のミクロ～マクロスイッチを促進する腫瘍形成促進好中球サブセットを含むことを示している。特に、休止状態の転移性腫瘍のすべてが転移がんになるわけでなく、同時に、一部の前がん病変は退縮するので、すべての前がん病変ががんに進行するわけではない。
ヌードラットにおけるCSC由来膵臓癌腫症異種移植腫瘍モデルでは、抗DEspR mAb ABTM-468処置は、腸管虚血、漿液性または血性腹水、腸管拡張、および虚血性－出血性腸管（黒色腸管（black gut））および腸管機能不全を低減した（図39）。これらのデータは、抗DEspR処置が、がん共存症におけるDEspR+ NET易発性好中球および／またはNET媒介性の役割を低減することを示している。
膵臓腹膜癌腫症において、好中球媒介またはNET媒介組織傷害、血管閉塞および／または微小血栓症は、a）ARDS、脳卒中で見られるような活性化好中球およびNET主導型の二次組織傷害による腸管出血および微小血栓症（「黒色腸管」）、b）血性腹水、c）微小血栓症または微小出血による腸閉塞または機能不全（腸管拡張性の機能不全）などの併存合併症を誘導する。インビボ抗DEspR mAb処置（ヒト化抗DEspR mAbまたはABTM-468を使用）によるこれらの併存合併症のインビボ低減は、抗DEspR mAb療法が、膵臓癌において活性化ネトーシス易発性好中球およびNETが誘導する併存合併症を止めることができることを実証している。
DEspR+炎症細胞、ネトーシス易発性活性化好中球は、ステージIV-PDACに漸増傾向の転移腫瘍と同様に、すべてのステージの膵臓癌（PDAC）の腫瘍間質中に検出される（図40）。転移腫瘍を含むすべてのステージにおけるDEspR+「ならず者」好中球の存在は、最高ステージ方向の腫瘍進行への好中球-腫瘍細胞相互作用の重要性、およびPDAC連続体の他端での前がん病変から悪性腫瘍への進行における重要性を示している。抗DEspR mAb療法のネトーシス易発性好中球阻害は、前がん病変が悪性腫瘍に進行することを回避するための新規なアプローチである。
抗DEspR mAb処置は、中等度重症の糸球体腎硬化症を有する高血圧慢性腎臓病ラットにおけるアルブミン尿を低減した（図41A～41C）。1週間以内に応答が観察されたことから、データは、ABTM-468処置によるDEspR+ NET易発性活性化好中球の阻害を介した好中球媒介二次組織傷害の除去に基づく改善の迅速転換メカニズムを示している。これらのデータは、慢性腎臓病における活性化好中球およびネトーシス易発性好中球を阻害することにABTM-468が有効であり、アルブミン尿およびUACRの減少として測定された腎機能の改善を招くことを実証している。
抗DEspRは、ARDS患者の好中球において特異的に見られるような好中球主導二次性組織傷害と関連するヒト活性化CD11b+好中球の主要サブセットの生存率を効果的に減少させ、好中球媒介組織傷害を有するすべての他の疾患に適用可能である。ARDSは、好中球主導二次性組織傷害の最悪の極端の1つを代表している。
抗DEspR療法は、DEspR+活性化好中球および腫瘍関連好中球、ならびにDEspR+治療抵抗性アノイキス抵抗性腫瘍細胞から得られた治療抵抗性メカニズムを除去することによりゲムシタビンに対する感受性を増加させた。ヌードラット異種移植腫瘍モデルにおける抗DEspR+化学療法とチェックポイント阻害剤との併用の有効性がより高いことは、抗がん細胞傷害療法に対する自然型または獲得型治療抵抗性の一因である好中球主導メカニズムの阻害を実証し、したがって、化学療法および／またはチェックポイント阻害剤による併用療法を支援するものである。
ヒト血液試料中のDEspR+/CD11b+好中球およびNETの検出は、DEspRの阻害が好中球主導二次性組織傷害により増悪する、生命にかかわる複合疾患において病原性メカニズム対抗するための有効な治療法であるという事実によって強化された頑健な診断指標または予後指標を構成する。
実施例7
DEspRタンパク質は、膵臓腫瘍細胞の細胞核中でRNA作用型アデノシンデアミナーゼ-1［ADAR-1］と共局在する。好中球は、たとえ新鮮単離されても培養すると表現型を変えることが公知であるので、DEspRおよびADAR-1の共局在を、下記の標準的な方法に従って膵臓腫瘍細胞、Panc1で行った。免疫蛍光染色の共焦点顕微鏡分析は、核にDEspRおよびADAR1が存在し、核の全域ではなく一部の領域で共局在することを実証している（図42）。これらのデータは、二重特異性抗DEspR/抗ADAR1バイボディー（bibody）を支持している。
透過処理：PBS中0.5％のトリトンX-100 1mlをプレートに添加し、室温で15分間インキュベートした。トリトンX-100を除去し、プレートをPBSで3回洗浄した（ガラス製カバースリップを乱さないようにプレートの脇に添加し、脇から除去した）
ブロッキング：PBS中5％のBSA 2mlを添加し、プレートを4℃で2時間ブロッキングした。
染色（一次）：ブロッキング媒を除去後、1％ BSA中の抗DEspR AF568（HEK）抗体（10ug/ml）およびADAR1（0.73ug/ml）を4℃で4時間インキュベートした。一次染色液を除去し、PBS中に1％のBSA 1mlで3回洗浄した。
染色（二次）：1％ BSA中の二次抗ウサギIgG AF-488（0.5ug/ml）を4℃で2時間インキュベートした。一次染色液を除去し、PBS中に1％のBSA 1mlで3回洗浄し、PBS 1ml中で維持した。Leica SP5共焦点顕微鏡を用いてイメージングを行った。

Claims (25)

  1. 抗DEspR抗体試薬またはその抗原結合性フラグメントを含む、それを必要としている対象において、好中球細胞外トラップ（NET）放出またはactPMNネトーシスまたはバイタルネトーシスを防止または減少させるための薬学的組成物であって、該対象が健康な対象と比較してNETレベルが増加している、該薬学的組成物。
  2. NETが、DEspR+である、請求項1記載の薬学的組成物。
  3. 抗DEspR抗体試薬が、i）DEspRおよびii）PD1またはPD-L1と特異的に結合することができる二重特異性試薬である、請求項1または2記載の薬学的組成物。
  4. 抗好中球または抗NET試薬とコンジュゲートした抗DEspR抗体試薬を含む、それを必要としている対象において、NET放出、バイタルネトーシスまたはactPMNネトーシスを防止または減少させるための薬学的組成物であって、該対象が健康な対象と比較してNETレベルが増加している、該薬学的組成物。
  5. 抗DEspR抗体試薬が、モノクローナル抗体、またはその抗原結合性フラグメントである、請求項1～4のいずれか一項記載の薬学的組成物。
  6. 抗DEspR抗体試薬が、
    i）DespR；ならびに
    ii）a. 細胞表面受容体、
    b. リガンドまたは細胞外タンパク質、
    c. 細胞内タンパク質
    より選択される、免疫細胞の活性および／または生存をモジュレートする標的
    と特異的に結合してそれらを阻害することができる二重特異性抗体試薬である、請求項5記載の薬学的組成物。
  7. 細胞表面受容体が、PD1；CTLA-4；TLR-2；TLR-4；CD14；もしくはCD168である、かつ／または
    リガンドもしくは細胞外タンパク質が、PD-L1；CD80: CD86；G-CSF；GM-CSF；ミエロペルオキシダーゼ；カテプシン-G；好中球エラスターゼ；もしくはアルギナーゼ-1である、かつ／または
    細胞内タンパク質が、Mcl-1；cIAP2；STAT3；ERK1/2；ペプチジルアルギニンデアミナーゼ（PAD4）；ガレクチン-1/3；もしくはRNAアデノシンデアミナーゼ-1（ADAR-1）である、
    請求項6記載の薬学的組成物。
  8. 抗DEspR抗体試薬または二重特異性抗体試薬が、SEQ ID No：1～3、9～11、17～19、5～7、13～15、21～23、25～27、29～31、および33～35より選択される相補性決定領域を含む、請求項1～7のいずれか一項記載の薬学的組成物。
  9. 抗DEspR抗体試薬または二重特異性抗体試薬が、ヒンジ安定化IgG4抗体試薬である、請求項1～8のいずれか一項記載の薬学的組成物。
  10. ヒンジ安定化IgG4抗体試薬が、野生型IgG4配列と比べてS228P変異を含む、請求項9記載の薬学的組成物。
  11. 抗DEspR抗体試薬または二重特異性抗体試薬が細胞で発現し、該細胞が対象に投与される、請求項1～10のいずれか一項記載の薬学的組成物。
  12. 細胞が、T細胞、CAR-T細胞、または養子移入T細胞である、請求項11記載の薬学的組成物。
  13. 抗DEspR抗体試薬または二重特異性抗体試薬が、CARである、請求項12記載の薬学的組成物。
  14. 抗DEspR抗体試薬または二重特異性抗体試薬が、少なくとも1種の抗DEspR抗体試薬および該抗体試薬とコンジュゲートした少なくとも1種の薬物を含む抗体-薬物コンジュゲートである、請求項1～13のいずれか一項記載の薬学的組成物。
  15. 薬物が、血栓溶解薬、化学療法薬、ナノ粒子、ポリペプチド、イメージング剤、フルオロフォア、小分子、酵素、核酸分子、および化学物質からなる群より選択される、請求項14記載の薬学的組成物。
  16. 化学療法薬が、メルタンシン、エムタンシン、ゲムシタビン、テモゾロミド、パクリタキセル、もしくはシスプラチン/オキサリプラチンである、または
    ナノ粒子が、酸化鉄ナノ粒子（IONP）、ポリマーナノ粒子、もしくは金ナノ粒子、もしくはキメラナノ粒子である、または
    酵素が、DNaseI、マトリックスメタロプロテアーゼ1（MMP1）、マトリックスメタロプロテアーゼ2（MMP2）、マトリックスメタロプロテアーゼ3（MMP3）、組織メタロプロテアーゼ阻害物質（TIMP）、プロテアーゼ、リコンビナーゼ、もしくはプラスミノーゲン活性化因子である、または
    化学物質が、4-アミノ安息香酸ヒドラジドもしくはNX-059ニトロンである、または
    ポリペプチドが、キモスタチン、アンジオポエチン1/2、SDF-1である、
    請求項15記載の薬学的組成物。
  17. 対象が、好中球；NET；またはネトーシスを起こしている好中球もしくはNETを形成している好中球が疾患の発症、慢性化、または悪化の一因となる病態または疾患に対する処置を必要としている、請求項1～16のいずれか一項記載の薬学的組成物。
  18. 病態または疾患が、
    全身性炎症反応症候群（SIRS）；急性肺傷害（ALI）；急性呼吸窮迫症候群（ARDS）；例えば、ARDS、出血性ショック、手術、熱傷、または敗血症による多臓器不全または多臓器機能障害症候群（MODS）；敗血症；敗血症性凝固障害；外傷；多発性硬化症；急性腎障害（AKI）；AKI関連尿細管壊死および遠隔臓器損傷；外傷後手術；出血性ショック；感染症、または薬物もしくは任意の作用物質により誘発されるサイトカインストーム；虚血性または出血性脳卒中；脳卒中における二次性脳損傷；心筋虚血/梗塞；アテローム性動脈硬化性不安定プラーク；アテローム性動脈硬化性血栓症；冠動脈疾患；急性冠症候群；心不全；再灌流傷害；腎透析患者における共存症（例えば、血栓症および内皮機能障害）；脳の虚血性または薬物誘導出血性変化、出血性脳症、外傷性脳損傷；無酸素性脳損傷、慢性腎臓病；がん；膵管腺癌；膠芽腫；肺癌；トリプルネガティブ乳癌；黒色腫；結腸直腸癌、胃癌、卵巣癌；actPMN依存性がん；糖尿病；1型糖尿病；2型糖尿病；血管障害；脈管障害；終末器官合併症（例えば、網膜症または糖尿病性腎臓病）；糖尿病性潰瘍の創傷治癒不良；深部静脈血栓症；がん転移；全身性微小血栓症；化学療法誘導性微小血栓症；アテローム性動脈硬化性血栓症；全身性エリテマトーデス（SLE）；ループス腎炎；SLE促進アテローム性動脈硬化症；関節リウマチ；COPD；嚢胞性線維症；肺疾患；アルツハイマー病；鎌状赤血球症；炎症性腸疾患（IBD）；クローン病；潰瘍性大腸炎；ならびに分類不能大腸炎
    からなる群より選択される、請求項17記載の薬学的組成物。
  19. 対象が、がんの処置を必要としており、かつ
    PD-L1+/DespR+腫瘍；増加したレベルの循環もしくは腫瘍DEspR+好中球；増加したレベルのDEspR+活性化好中球；増加したレベルのNET；増加した血漿中レベルの好中球エラスターゼ（NE）；増加した血漿中レベルの好中球ミエロペルオキシダーゼ（MPO）；または
    DEspR+好中球、ネトーシスを起こしているDEspR+好中球、NET、増加したレベルの好中球放出免疫抑制物質、増加したレベルのシトルリン化ヒストン-3、および増加したレベルの好中球刺激物質のうちの1種もしくは複数種を含む腫瘍
    を有する、請求項18記載の薬学的組成物。
  20. 好中球放出免疫抑制物質が、アルギナーゼ-1；PD-L1；ミエロペルオキシダーゼ（MPO）；もしくは好中球エラスターゼ（NE）；もしくはカテプシンG（CG）である、または
    好中球刺激物質が、G-CSF、ET1、Hif1a、もしくはDAMPである、
    請求項19記載の薬学的組成物。
  21. 対象が、がんの処置を必要とし、かつ腫瘍切除により以前に処置されたことがある、請求項1～20のいずれか一項記載の薬学的組成物。
  22. 対象が、さらなる免疫療法もしくは化学療法をさらに施される、かつ／または
    対象が、さらなる免疫療法もしくは化学療法を以前に施されたことがある、かつ／または
    対象が、さらなる免疫療法もしくは化学療法を用いた処置に抵抗性である、かつ／または
    さらなる免疫療法もしくは化学療法を用いた処置により対象に毒性が発現したことがある、
    請求項1～21のいずれか一項記載の薬学的組成物。
  23. 免疫療法が、免疫チェックポイントタンパク質免疫療法、T細胞共刺激物質；CAR-T療法、もしくはPD1および／もしくはPD-L1阻害剤療法である、または
    化学療法が、ゲムシタビン、パクリタキセル、テモゾロミド、イリノテカン、アブラキサン、白金ベースの化学療法、シスプラチン、オキシロプラチン、もしくはそれらの組み合わせである、
    請求項22記載の薬学的組成物。
  24. 対象が哺乳動物またはヒトである、請求項1～23のいずれか一項記載の薬学的組成物。
  25. 対象が、DEspR+好中球を有するか、または有すると判定されたことがある、請求項1～24のいずれか一項記載の薬学的組成物。
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