JP7401498B2 - 低分子rna、並びに線維増殖性疾患及び/又は症候群の予防及び/又は治療におけるその応用 - Google Patents
低分子rna、並びに線維増殖性疾患及び/又は症候群の予防及び/又は治療におけるその応用 Download PDFInfo
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Description
従って、効果的な線維化治療又は予防用医薬品に対する大きなニーズは、依然として存在する。
A)SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16及び17のいずれか1つに示される配列、又はその相補的配列、
B)線維化を予防/治療するための能力をもつ、A)に示される配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%又は98%の同一性を有する配列、
C)線維化を予防/治療するための能力をもつ、ストリンジェントな条件下でA)に示される配列とハイブリダイズする配列、
D)線維化を予防/治療するための能力をもつ、A)に示される配列において1つ又は複数のヌクレオチドが付加、欠失、置換された配列、又は
E)線維化を予防/治療するための能力をもつ、A)、B)、C)又はD)に示される配列の前駆体または修飾された変異体、を含むポリヌクレオチドを提供する。
A)SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16及び17のいずれか1つに示される配列、又はその相補的配列、
B)線維化を予防/治療するための能力をもつ、A)に示される配列と少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%又は99%の同一性を有する配列、
C)線維化を予防/治療するための能力をもつ、ストリンジェントな条件下でA)に示される配列とハイブリダイズする配列、
D)線維化を予防/治療するための能力をもつ、A)に示される配列において1つ又は複数のヌクレオチドが付加、欠失、置換された配列、又は
E)線維化を予防/治療するための能力をもつ、A)、B)、C)又はD)に示される配列の前駆体または修飾された変異体、を含むポリヌクレオチドを提供する。
珪肺症、石綿肺及び炭鉱夫塵肺を含む無機粉塵職業病;農夫肺、空調肺・加湿器肺、鳥飼育者肺及び砂糖きび肺を含む有機粉塵及び過敏性肺炎;抗生物質、非ステロイド性抗炎症薬、心血管薬、抗腫瘍薬、経口血糖降下薬、及びモルヒネ系薬物から選ばれる医薬/治療関連疾患;結核、ウイルス性肺炎、感染性肺嚢胞などの感染症;心不全、先天性心疾患、成人呼吸窮迫症候群、慢性心不全、移植拒絶反応に関連する肺疾患を含む続発性肺疾患;特発性間質性肺炎、器質化肺炎を伴う閉塞性細気管支炎、肺リンパ管平滑筋腫を含む原発性肺疾患;全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、進行性全身性硬化症、多発性筋炎、皮膚筋炎、混合性結合組織病に関連する肺疾患を含むコラーゲン血管疾患に関連する肺疾患;びまん性肺胞出血症候群、肺胞蛋白症、好酸球性肺炎、肺血管炎、リンパ球性間質性肺炎、壊死性結節性肉芽腫、家族性肺線維症を含む肺胞充填性病変;
眼の外傷・術後の眼線維増殖性疾患及び/又は症候群、増殖性糖尿病網膜線維症;
1.実験関連方法及びプロセス
新鮮なイワベンケイに由来する低分子RNAの抽出は、miRNeasy Mini Kit(QIAGEN#217004)の製造元によって提供される取扱説明書に従って行う。
汁液RNAの抽出は、
(1)イワベンケイの汁液200μlには、CTABライセート1mlを加え、さらに20μlβ-メルカプトエタノールを加え、激しく振盪するステップと、
(2)65℃、30minで、渦巻きを発生させながら連続的に振盪するステップと、
(3)12,000rpm、4℃で7min遠心させた後、上清800μlを採取し、エタノール 380μlを加え、均一に混合するステップと、
(4)4℃で20min放置するステップと、
(5)12,000rpm、4℃で15min遠心し、上清800μlを採取し、0.8倍の体積のクロロホルムを添加し、均一に激しく混合するステップと、
(6)10min放置し、12,000rpm、4℃で15min遠心するステップと、
(7)上清600μlを採取し、予備冷却されたイソプロパノール600μlを加え、均一に混合した後、-20℃で20min放置させるステップと、
(8)12,000rpm、4℃で10min遠心し、上清を捨てた後、沈殿物を75%エタノールで2回洗浄するステップと、
(9)DEPCで処理されたH2OでRNAを溶解させるステップと、を含む。
(1)細胞にTRIzolライセートを加え、室温で5分間放置し、十分に溶解させる(マウス肺組織の場合、組織100mgにTRIzolライセート1.0mlを加え、ホモジナイザーで研磨させ、12,000rpm、4℃で10min遠心し、よくホモジナイズされていない組織沈殿物を除去する)ステップと、
(2)12,000rpm、4℃で5min遠心し、沈殿物を捨てるステップと、
(3)200μl/ml TRIzolの割合でクロロホルムを加え、十分に振盪してよく混合させ、室温で15min放置するステップと、
(4)12,000rpm、4℃で15min遠心し、上層の水相を吸い取り、別の遠心管に入れるステップと、
(5)ステップ(4)を繰り返し、上層の水相と同じ量のクロロホルムを加え、よく混合した後、室温で10min放置し、12,000rpm、4℃で15min遠心するステップと、
(6)上層の水相を吸い取り、別の新たなEPチューブに0.5ml/ml TRIzolでイソプロパノールを加えてよく混合し、室温で5~10min放置するステップと、
(7)12,000rpm、4℃で10min遠心し、上清を捨てるステップと、
(8)75% エタノールを1ml加え、遠心管を温和に振盪させ、沈殿物を懸濁させるステップと、
(9)8000g、4℃で5min遠心し、上清をできるだけ捨てるステップと、
(10)室温で5~10min乾燥させ、DEPC 50μlで処理されたH2OでRNAサンプルを溶解させるステップと、を含む。
1)sRNAをcDNAに逆転写し、逆転写キット(High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kits、Applied Biosystems、cat.no.4368813)で、ステムループ法(Stem-loop法)によりsRNAをcDNAに逆転写し、逆転写系は、テンプレートRNA(150ng/μl)10μl、10X RT Buffer 2.0μl、25X dNTP Mix(100mM)0.8μl、U6RTプライマー(10μM)2.0μl、HJT-sRNA-m7RTプライマー(10μM)2.0μl、MultiScribeTM逆転写酵素1.0μl、RNase阻害剤1.0μl、Nuclease-free H2O 1.2μl、一過性遠心分離後、PCR機器にセットし反応させ、反応条件は、(1)25℃、10min、(2)37℃、120min、(3)85℃、5min、(4)4℃で反応を終了させることである。反応終了後、RNase Free dH2O 20μlを加え、最終的な容量が40μlになるように補充する。使用したプライマー配列は、以下の通りであり、
ヒトU6RT:GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAAAAATATG(配列番号18)、
HJT-sRNA-m7RT:GTCGTATCCAGTGCACGCTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACGCTTACAA(配列番号19)。
2)定量PCR増幅反応は、qPCR反応系の全容量が10μlであり、2×SYBR Green Master Mix 5μL、フォワードプライマー(10μM)0.5μl、リバースプライマー(10μM)0.5μl、逆転写されたcDNA 1μl、RNase Free dH2O 3μlを含む。LightCycler 480リアルタイムPCR装置を使用し、PCR反応条件は、95℃で5min予備変性し、PCR増幅サイクルを開始させ、(1)95℃、10s、(2)55℃、10s、(3)72℃、20s、合計40サイクルを行い、最後、40℃で10s維持して降温させる。増幅反応のフォワードプライマー及びリバースプライマーは、いずれも北京ケイ科新業生物技術有限公司(TsingkeBiologicalTechnologyCo.,Ltd,Beijing)によって設計、合成されたものである。使用したプライマー配列は、以下の通りであり、
ヒトU6F:GCGCGTCGTGAAGCGTTC(配列番号20)、
ヒトU6R:GTGCAGGGTCCGAGGT(配列番号21)、
HJT-sRNA-m7F:TCGCGCTGAGGTAGTAGGTT(配列番号22)、
HJT-sRNA-m7R:GTGCACGCTCCGAGGT(配列番号23)。
3)ΔΔCt法によって相対発現量を計算する。
(1)培地を捨て、PBSバッファーで2回洗浄し、適量の予冷されたRIPAライセートを加え、細胞をピペットチップでこそげ遠心管に移し、氷上で20min溶解する。
(2)BCA試薬A及びB(50:1、v/v)を十分に混合し、BCAワーキング試薬を調製する。
(3)新鮮に調製されたBSA標準液及び被験サンプルを25μlずつ採取し、96ウェルプレートに加え、1ウェル当たりBCAワーキング試薬200μlを加え、よく混合する。
(4)37℃で30minインキュベートした後、室温まで冷却し、又は室温で2h放置する。
(5)紫外可視分光光度計(Synergy 4マルチファンクションマイクロプレートリーダー)を使用し、562nmでその吸光度を測定し、サンプル中のタンパク質濃度を標準曲線から計算する。
(6)RIPAライセートでサンプルの濃度を調整し、各サンプルの濃度の一貫性を確保する。
(1)ゲルの作製:濃度が10%の分離ゲル(下層ゲル)及び濃度が5%の濃縮ゲル(上層ゲル)、15ウェルのコームで構成されるレーンを採用し、各レーン当たりタンパク質サンプルのサンプルロード量が等しくなる。
(2)サンプルの処理:サンプルを等量の2×loading befferに加え、97℃で金属浴に10分間入れた後、氷上に置いて、用意する。
(3)タンパク質の電気泳動:電気泳動用バッファーを加え、電気泳動の初期電圧が80Vであり、ブロモフェノールブルー色素が分離ゲルに到達した後、電圧を120Vに上げ、ブロモフェノールブルー色素が分離ゲルの底部に達し、又は全てゲルから泳ぎ出すまでに電気泳動を続ける。
(4)ウェット式ブロッティング:(負極)スポンジ-ろ紙-ゲル-PVDFメンブレン-ろ紙-スポンジ(正極)の順序に従って組み込まれ、説明書に従って取り付け、ブロッティング装置全体を4℃の冷室にセットし、定電流300mAで、120minブロッティングする。
(5)ブロッキング:ブロッティング終了後、3% BSAブロッキング溶液中に入れ、室温で1hブロッキングする。
(6)一次抗体のインキュベーション:ブロッキング後のPVDFメンブレンをプラスチックバッグに移し、一次抗体を含有する3% BSAブロッキング溶液(一次抗体の濃度は抗体の説明書に従って決定する)、バッグ内の気泡を取り除き、密閉後、4℃で一晩インキュベートする。
(7)メンブレンの洗浄:PVDFメンブレンを取り出し、1回10分間、TBSTでメンブレンを3回洗浄する。
(8)二次抗体のインキュベーション:TBSTを捨て、二次抗体を含有する3% BSAブロッキング溶液を加え、室温で2時間インキュベートする。
(9)メンブレンの洗浄:PVDFメンブレンを取り出し、1回10分間、TBSTでメンブレンを3回洗浄する。
(10)現像:Western現像液を調製し、調製された現像液をメンブレン結合タンパク質の側面に均一に滴下し、メンブレンをしがみつくフィルムで慎重に包み、X線撮影用暗室にセットしてシートを10~20min押し、最後に現像液、定着液を加えて観察する。
(11)スキャン及び解析:ネガフィルムをQuantity Oneにより解析・処理し、Image Jによりグレースケールを解析する。
6~8週齢で体重が20~25gの雄性C57BL/6マウスを選択し、麻酔下で気管支を介して生理食塩水で調製されたブレオマイシン溶液(3.5U/kg)100μLを投与し、対照群に100μLの生理食塩水を投与し、マウスの体重と死亡率を毎日記録し、21d日目にマウスを処理する。ヒドロキシプロリンの測定のために右肺を採取し、左肺を採取して4%パラホルムアルデヒドで固定した後、パラフィン包埋し、切片を作成し、ヘマトキシリン-エオシン染色(HE染色)、マッソントリクローム染色及び免疫細胞化学による検出を行う。組織の病理切片及び線維化指標の結果を組み合わせ、ブレオマイシン誘導性マウス肺線維症モデルの構築に成功したかどうかを評価する。
実験材料
ヒト胎児腎細胞293T;10%(v/v)ウシ胎児血清(FBS)を加えたDMEM培地(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium);ペ
ニシリン(100U/ml)及びストレプトマイシン(100mg/ml);トランスフェクト試薬:RNAiMax(Invitrogen)及びリポソームLipofectamine 2000(Invitrogen);デュアルルシフェラーゼレポーター遺伝子システム:psiCHECK2(Promega C2081)
実験方法
(1)10%FBSを含むDMEM培地で培養した293T細胞を48ウェルプレートに1ウェルあたり約3x104個細胞で分注し、接着後、RNAiMax(Invitrogen)で100nMのNC sRNA/sRNAをトランスフェクトする。
(2)24時間後、Lipofectamine 2000(Invitrogen)でpsiCHECK2-3’-UTR又はpsiCHECK2-3’-mUTRのプラスミドをトランスフェクトする。
(3)プラスミドをトランスフェクトした8時間、14時間又は24時間後にDual-luciferase Assay System(Promega E1910)のマニュアルにおける使用方法に従って蛍光強度を検出する。
2.試験の実施例
上記の項目1.1を参照すると、キット及び改良されたCTAB法を利用し、それぞれ新鮮なイワベンケイ及びイワベンケイ生薬の煎じ薬からRNAを抽出し、アガロースゲル電気泳動により、RNA断片は20nt以下の低分子RNA断片(small RNA、sRNA)であることを示した。次の試験では、イワベンケイの煎じ薬を7日連続で飲んだ後の0時間及び24時間のヒトの全血、イワベンケイ由来のRNAを3日連続で胃内投与した後の12時間、24時間及び48時間後のマウス的肺組織、並びにイワベンケイ由来のRNAを加えた後の24hのA549細胞についてはそれぞれハイスループットシーケンス(SE36、Illumina HiSeq2500)を行った。バイオインフォマティクスの方法により、次の条件に従ってマウス肺、ヒト血液又はA549細胞に進入した低分子RNA断片を識別した。即ち、(1)ヒト血液、マウス肺組織又はA549細胞に存在するイワベンケイ由来の低分子RNA、(2)ヒト又はマウスのゲノムに合わせないイワベンケイ由来の低分子RNA。上記の方法により、本発明者らは、予想外に、3つのヒト血液へ進入したイワベンケイ由来の低分子RNAを発見し(表1を参照)、ヒト血液におけるその存在比の順に応じて、HJT-sRNA-h1~3と順次に命名し、8つのマウス肺組織へ進入したイワベンケイ由来の低分子RNAを発見し(表2を参照)、マウス肺組織におけるその存在比の順に応じて、HJT-sRNA-m1~8と順次に命名し、2つのA549細胞へ進入したイワベンケイ由来の低分子RNAを発見し、A549細胞におけるその存在比の順に応じて、HJT-sRNA-a1~2と順次に命名した(表3を参照)。なお、本発明者は、さらに、イワベンケイのうち、miRbaseデータベースに合わせられる、4つの低分子RNAをスクリーニングし、後の実験を行った(表4を参照)。
2.2.1 TGF-β1で刺激されたMRC-5線維化細胞モデルにおけるイワベンケイ由来のsRNAのスクリーニング及び同定
TGF-β1 3ng/mlによりMRC-5細胞を48h(図1)又は72h(図2~図6)刺激した後、RNAサンプルを採取し、RT-PCR法で線維化関連遺伝子α-SMA、フィブロネクチン(Fibronectin)、COL1A1、PAI-1、SMAD4及びTGF-βのmRNAの相対発現を検出した。
α-SMA、フィブロネクチン(Fibronectin)、COL1A1及びPAI-1は、4つの線維化関連遺伝子である。イワベンケイ由来のsRNAを使用してTGF-β1で刺激されたMRC-5線維化細胞モデルを処理し、上記の4つの線維化関連遺伝子のmRNAレベルの発現を検出することにより、ヒト血液、マウス肺及びA549細胞へ進入した低分子RNAについて抗線維化機能のスクリーニングを行った。結果は図1及び2に示すように、予防及び治療の両方の試験において、多種のイワベンケイ由来のsRNAはいずれもMRC-5細胞中のmRNAレベルでの線維化関連遺伝子の発現を阻害することができる。
本発明者らは、イワベンケイ由来のsRNA(HJT sRNA)によるTGF-β1誘導性MRC-5線維化細胞モデルにおけるα-SMA、フィブロネクチンの2つの線維化関連遺伝子のタンパク質発現レベルをスクリーニングした。図13及び図14は、それぞれ、24時間前にNC sRNA及びHJT sRNAをトランスフェクトし、TGF-β1でMRC-5を72時間刺激した後、関連指標(予防群)を検出した実験結果を示した。図13及び図14に示すように、多種のイワベンケイ由来のsRNAは、いずれもタンパク質レベルでMRC-5細胞中の線維化関連遺伝子の発現を阻害することができる。中でも、SEQ ID NO:4、5、6、8、10に対応するHJT sRNAは、フィブロネクチンのタンパク質発現レベルを大幅に低減させることができ、SEQ ID NO:3、5、6、8、10、16、17に対応するHJT sRNAは、α-SMAのタンパク質発現レベルを低減させることができる。
上記の項目1.6によれば、ブレオマイシン誘導性マウス肺線維症モデルにおいて、上記の4つのイワベンケイ由来のsRNAの、線維化に対する効果を測定した。C57BL/6Jマウスは、ブレオマイシン(BLM、Nippon Kayaku、Tokyo、Japan)を用量3.5U/kgで気管内投与するとともに、NC sRNA、HJT-sRNA-m7、HJT-sRNA-a2、HJT-sRNA-h3及びppe-miR-169cのagomir(蘇州吉瑪遺伝子株式有限会社製)を用量8mg/kg、生理食塩水で希釈された100μl全容量で気管内投与した。ブレオマイシン投与後7日目、13日目及び16日目にそれぞれNC sRNA、HJT-sRNA-m7、HJT-sRNA-a2、HJT-sRNA-h3及びppe-miR-169cのagomirを用量4mg/kgで腹腔内投与した。図7~図9に示すように、本発明者らは、選択された4つのイワベンケイ由来のsRNAは、いずれも驚くほどマウスの死亡率を著しく低下させ、マウスの体重減少を大幅に遅らせ、マウスの肺線維症の症状を緩和できることを見出した。
上記の項目1.7によれば、ルシフェラーゼレポーター遺伝子システムを使用してイワベンケイ由来のsRNAの細胞内標的遺伝子を検出した。図10~図12に示すように、HJT-sRNA-m7は、α-SMA、フィブロネクチン及びCOL3A1を直接標的とすることにより抗線維化機能を発揮することができ、HJT-sRNA-a2は、COL1A1、COL3A1、TGF-β及びSMAD4を直接標的とすることにより抗線維化機能を発揮することができ、HJT-sRNA-h3は、COL1A1及びCOL3A1を直接標的とすることにより抗線維化機能を発揮することができる。
Claims (13)
- SEQ ID NO:8(GUAUGUAAACAUCCUCGACUGGAAGCU)で示される配列からなるポリヌクレオチド。
- 前記ポリヌクレオチドは、低分子RNAである、請求項1に記載のポリヌクレオチド。
- 前記ポリヌクレオチドは、一本鎖又は二本鎖である、請求項1に記載のポリヌクレオチド。
- 前記ポリヌクレオチドは、一本鎖である、請求項3に記載のポリヌクレオチド。
- 前記ポリヌクレオチドは、合成された又は人工染色体ベクターで発現されたものである、請求項1に記載のポリヌクレオチド。
- 請求項1~5のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドを含む又は発現する核酸発現ベクター。
- 請求項1~6のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドを含む、化粧品組成物。
- 請求項1~6のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドを含む、線維増殖性疾患及び/又は症候群を予防及び/又は治療するための医薬組成物。
- 前記線維増殖性疾患及び/又は症候群は、肺、心血管系、肝臓、膵臓、腎臓、脾臓、眼、神経系、骨髄及び皮膚の線維増殖性疾患及び/又は症候群から選ばれる請求項8に記載の医薬組成物。
- 前記線維増殖性疾患及び/又は症候群は、珪肺症、石綿肺及び炭鉱夫塵肺を含む無機粉塵職業病、農夫肺、空調肺、加湿器肺、鳥飼育者肺及び砂糖きび肺を含む有機粉塵・過敏性肺炎;抗生物質、非ステロイド性抗炎症薬、心血管薬、抗腫瘍薬、経口血糖降下薬、及びモルヒネ系薬物から選ばれる医薬/治療関連疾患;結核、ウイルス性肺炎、感染性肺嚢胞などの感染症;心不全、先天性心疾患、成人呼吸窮迫症候群、慢性心不全、移植拒絶反応に関連する肺疾患を含む続発性肺疾患;特発性間質性肺炎、器質化肺炎を伴う閉塞性細気管支炎、肺リンパ管平滑筋腫を含む原発性肺疾患;全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、進行性全身性硬化症、多発性筋炎、皮膚筋炎、混合性結合組織病に関連する肺疾患を含むコラーゲン血管疾患に関連する肺疾患;びまん性肺胞出血症候群、肺胞蛋白症、好酸球性肺炎、肺血管炎、リンパ球性間質性肺炎、壊死性結節性肉芽腫、家族性肺線維症を含む肺胞充填性病変;
心筋梗塞後の代替性及び反応性線維化を含む虚血性心疾患;高血圧性心疾患;ウイルス性心筋炎を含む炎症性心筋症;ヘモクロマトーシス型心筋症、アミロイドーシス型心筋症、グリコーゲン蓄積性心筋症、糖尿病性心筋症を含む代謝性心筋症;ケシャン病;拡張型心筋症;肥大型心筋症、制限型心筋症;不整脈原性右室心筋症;
B型、C型、およびD型ウイルス性肝炎を含むウイルス性肝硬変;住血吸虫性肝硬変;アルコール性肝硬変;原発性胆汁性肝硬変、続発性肝内胆石症、門脈周囲の炎症を含む胆汁性肝硬変;肝レンズ核変性症、ヘモクロマトーシスを含む代謝性肝硬変;有機リン中毒、四塩化炭素中毒、肝毒性薬剤例えばイソニアジド、テトラサイクリン、クロルプロマジン中毒を含む中毒性肝硬変;栄養失調性肝硬変;慢性うっ血性心不全を含む心原性肝硬変;
急性膵炎;膵管閉塞;慢性アルコール中毒;Oddi括約筋機能異常;膵虚血;
高血圧を含む血管腎線維増殖性疾患及び/又は症候群;糸球体腎炎、全身性エリテマトーデス、強皮症、腎移植拒絶を含む免疫腎線維増殖性疾患及び/又は症候群;腎盂腎炎、腎結石などの感染性腎線維増殖性疾患及び/又は症候群;高脂血症、糖尿病、高尿酸血症、高カルシウム尿症を含む代謝性腎線維増殖性疾患及び/又は症候群;
脾臓線維増殖性疾患;
眼の外傷・術後の眼線維増殖性疾患及び/又は症候群、増殖性糖尿病網膜線維症;
脊髄外傷後の線維増殖性疾患及び/又は症候群、脳卒中瘢痕形成、アルツハイマー病;特発性・薬物誘発性骨髄線維症、真性赤血球増加症、慢性骨髄性白血病およびホジキン病;
粘膜線維症、瘢痕、ケロイド、および皮膚肥厚を含む皮膚線維増殖性疾患及び/又は症候群から選ばれる、請求項9に記載の医薬組成物。 - さらに、他の抗線維化剤を含有する請求項8~10のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 皮膚若返り美容法であって、それを必要とする対象に請求項1に記載のポリヌクレオチド、請求項6に記載のベクター、請求項7に記載の化粧品組成物、又は請求項8に記載の医薬組成物を非侵襲的に投与する、美容法。
- 細胞をイン・ビトロで請求項1に記載のポリヌクレオチド、請求項6に記載のベクター、請求項7記載の化粧品組成物、又は請求項8に記載の医薬組成物と接触させることを含む、α-SMA、フィブロネクチン、COL1A1及びPAI-1から選択される、1つ又は複数の線維化関連遺伝子の発現を阻害する方法。
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