JP7401440B2 - 心筋細胞及び心筋細胞の拍動を変化させる方法 - Google Patents
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Description
本発明は、心筋細胞と、心筋細胞の拍動を変化させる方法とに関する。
光遺伝学（オプトジェネティクス）は、脳神経分野において世界的な発展を遂げる一方、脳神経以外の分野での成果は乏しい。脳神経以外の分野での研究例として、心筋の拍動を光でコントロールした研究が知られる（非特許文献１）。この研究では、光活性化非選択的陽イオンチャネルロドプシン２（ＣｈＲ２）を導入した心筋細胞を用いる。ＣｈＲ２のイオンチャネルは光照射によって開かれるため、ＣｈＲ２に光を照射することにより心筋細胞内へのイオン輸送を直接的に引き起こし、心筋を収縮させることができる。１回の光の照射で１回の収縮が起るため、この技術では、光パルスの周期によって人為的な拍動ペースを作り出す。
Ｚｈｉｈｅｎｇ Ｊｉａら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ：Ａｒｒｈｙｔｈｍｉａ ａｎｄ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．４，ｎｏ．５，ｐｐ．７５３－７６０、２０１１年８月９日
Ｉｓｅｋｉら、Ｎａｔｕｒｅ，ＶＯＬ．４１５，ｐｐ．１０４７－１０５１、２００２年２月２８日
非特許文献１に記載の方法は、光パルスにより心筋細胞に人為的に拍動を起こさせており、非特許文献１に記載の方法により心筋細胞の自発的な拍動を変化させることは困難であった。そこで、本発明は、心筋細胞の自発的な拍動を光によりｃＡＭＰシグナル伝達を介して変化させることを目的とする。
本発明の心筋細胞は、光活性化アデニル酸シクラーゼ遺伝子を有する。
本発明の一形態に係る、心筋細胞の拍動を変化させる方法は、心筋細胞に光活性化アデニル酸シクラーゼ遺伝子を導入する工程と、光活性化アデニル酸シクラーゼ遺伝子が導入された心筋細胞に光を照射して、ｃＡＭＰを細胞内で産生させる工程と、を備える。ここで、心筋細胞の拍動は、心筋細胞内のｃＡＭＰ濃度に応じて変化する。
本発明の別の一形態に係る、心筋細胞の拍動を変化させる方法は、光活性化アデニル酸シクラーゼ遺伝子を有する改変細胞を心筋細胞に接触させる工程と、心筋細胞と接触している改変細胞に光を照射して、ｃＡＭＰを改変細胞内で産生させる工程と、を備える。ここで、心筋細胞の拍動は、改変細胞内のｃＡＭＰ濃度に応じて変化する。改変細胞は、光活性化アデニル酸シクラーゼ遺伝子を導入した、ヒト胎児腎臓細胞又はヒト新生児皮膚線維芽細胞を含んでもよい。
上記いずれの方法においても、光は、３５０ｎｍ～５００ｎｍの波長を有する光を含んでよい。
本発明の一形態に係る心筋細胞を成熟させる方法は、心筋細胞に光活性化アデニル酸シクラーゼ遺伝子を導入する工程と、光活性化アデニル酸シクラーゼ遺伝子が導入された心筋細胞を、該心筋細胞に光を照射しながら培養する工程と、を備える。
本発明の別の一形態に係る心筋細胞を成熟させる方法は、光活性化アデニル酸シクラーゼ遺伝子を有する改変細胞を心筋細胞に接触させる工程と、心筋細胞を、該心筋細胞と接触している改変細胞に光を照射しながら培養する工程と、を備える。
心筋細胞を成熟させる上記いずれの方法においても、光は、３５０ｎｍ～５００ｎｍの波長を有する光を含んでよい。
心筋細胞を成熟させる上記いずれの方法においても、光の照射は、心筋細胞の拍動周期が０．５Ｈｚ～５Ｈｚに維持されるように行われてよい。
心筋細胞を成熟させる上記いずれの方法においても、心筋細胞は幹細胞に由来してよい。
本発明によれば、光により心筋細胞の自発的な拍動を変化させることができる。
また、本発明によれば、未熟な心筋細胞を成熟させることができる。従来、未熟な心筋細胞を成熟させる方法として、例えば、心筋細胞に周期的な電気的刺激を与える方法、及び、心筋細胞を封入したコラーゲンゲルに周期的な機械的伸展刺激を与える方法が知られている。しかしながら、これらの方法は大量生産に向かず、また、特殊な装置を必要とした。本発明者らの新たな知見によれば、心筋細胞は、本来の拍動周期よりも高い拍動周期で拍動させることにより成熟させることができるとものと考えられる。したがって、光を用いることにより心筋細胞の拍動速度を高めることができる本発明によれば、これらの問題を解決しつつ、未熟な心筋細胞を成熟させることができる。さらに、本発明によれば、生体と同様の作用機序により、すなわちｃＡＭＰの細胞内濃度を変化させることにより、拍動周期を増加させることができる。そのため、細胞に損傷を与える、電気刺激を用いた方法とは対照的に、細胞に優しい、自然な成熟を促すことができる。本発明の方法により成熟させた心筋細胞は、移植用心筋組織の材料として、又は、心毒性試験の対象としての利用が期待できる。
＜ＰＡＣ遺伝子を有する心筋細胞＞
本発明の心筋細胞は、光活性化アデニル酸シクラーゼ（ＰＡＣ）遺伝子を有する。本明細書において、ＰＡＣ遺伝子を有する心筋細胞を、ＰＡＣ発現心筋細胞ともいう。ＰＡＣ発現心筋細胞の拍動は、後述の方法により変化させることができる。
本発明の心筋細胞は、光活性化アデニル酸シクラーゼ（ＰＡＣ）遺伝子を有する。本明細書において、ＰＡＣ遺伝子を有する心筋細胞を、ＰＡＣ発現心筋細胞ともいう。ＰＡＣ発現心筋細胞の拍動は、後述の方法により変化させることができる。
心筋細胞が由来する動物は特に限定されず、心筋細胞は、例えば、ヒト、サル、ブタ、ウシ、ヒツジ、ウサギ、ラット、爬虫類、両生類、魚類、鳥類又はマウス由来であってよい。また、心筋細胞は、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞等の幹細胞に由来する心筋細胞であってよく、具体的には、例えば、ヒトｉＰＳ細胞由来の心筋細胞であってもよい。
ＰＡＣ遺伝子は、ＰＡＣとして機能するタンパク質をコードする核酸であれば限定されず、そのような核酸にはｃＤＮＡも包含される。ＰＡＣは、光により活性化されてｃＡＭＰを産生する天然又は人工のタンパク質であり、ＢＬＵＦ（ｓｅｎｓｏｒ ｏｆ Ｂｌｕｅ Ｌｉｇｈｔ Ｕｓｉｎｇ ＦＡＤ）ドメイン及びシクラーゼ触媒ドメインを有する。ＢＬＵＦドメインは、ＦＡＤが結合するドメインであり、ＦＡＤを利用した青色光の感知に関与するドメインである。シクラーゼ触媒ドメインは、ＡＴＰをｃＡＭＰに変換するドメインである。ＰＡＣ遺伝子は様々な生物において見つかっており、ＰＡＣにおける保存アミノ酸は公知である（非特許文献２）。
ＰＡＣ遺伝子の由来は特に限定されず、ＰＡＣ遺伝子は、真核生物に由来しても、原核生物に由来してもよい。真核生物として、例えば、ミドリムシ（ユーグレナ・グラシリス（Euglena gracilis））、ユートレプティエラ（Eutreptiella）、ユートレプティア（Eutreptia）、コラキウム（Colacium）、カウキネア（Khawkinea）等のユーグレナ目藻類；及び鞭毛性アメーバのネグレリア・グルベリ（Neagleria gruberi）等のネグレリア属微生物が挙げられる。原核生物として、例えば、ベギアトア（Beggiatoa sp）等のガンマプロテオバクテリア；オスキラトリア（Oscillatoria）、シュードアナベナ（Pseudanabaena）等のシアノバクテリア；及びトルネリエラ（Turneriella）等のスピロヘータが挙げられる。
ＰＡＣは、例えば、配列番号１、配列番号２、若しくは配列番号３で示されるアミノ酸配列を有するＰＡＣ、又は、配列番号１、配列番号２、若しくは配列番号３で示されるアミノ酸配列と、３０％以上、５０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、又は９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＰＡＣであってよい。配列番号１、配列番号２、及び配列番号３で示されるアミノ酸配列を有するＰＡＣは、それぞれ、ベギアトアのＰＡＣ（ＢｓＰＡＣ）、ミドリムシのＰＡＣのαサブユニット（ＰＡＣａ）、及びミドリムシのＰＡＣのβサブユニット（ＰＡＣｂ）に対応する。
ＰＡＣ遺伝子のコドンは、心筋細胞の種類に応じて最適化してもよい。例えば、心筋細胞の由来がヒトである場合、コドンを哺乳類に最適化するようにＰＡＣ遺伝子の配列を改変することが好ましい。コドンの最適化方法は当業者にとって周知であり、コドンの最適化のために種々のソフトウェアを利用することができる。
ＰＡＣ発現心筋細胞において、ＰＡＣ遺伝子は一過性であってもよく、安定的であってもよい。一過性のＰＡＣ遺伝子は、例えば、非エピソーム型のプラスミドとして保持されていてもよい。安定的なＰＡＣ遺伝子は、ゲノムに組み込まれていてもよく、エピソーム型のプラスミドとして保持されていてもよい。
ＰＡＣ発現心筋細胞は、心筋細胞に上記ＰＡＣ遺伝子を導入することにより得ることができる。心筋細胞にＰＡＣ遺伝子を導入する方法は特に限定されず、公知の一過性トランスフェクション又は安定的トランスフェクションの方法を利用することができる。例えば、ＰＡＣ遺伝子を任意の一過性又は安定的発現ベクターに組み込み、公知の化学的、物理的、又は生物学的方法により心筋細胞内に導入することができる。物理的方法は、例えば、直接注入法、粒子衝撃法、エレクトロポレーション、レーザー照射法、ソノポレーション、又はマグネトフェクションである。化学的方法は、例えば、カチオン性ポリマー、リン酸カルシウム、又はカチオン性脂質を利用する方法である。生物学的方法は、例えば、ウイルスを利用する方法である。好ましい具体例として、ＰＡＣ遺伝子は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを用いて、ウイルス感染により心筋細胞に導入することができる。別の具体例として、ＰＡＣ遺伝子は、エピソーム型ベクターを用いて、エレクトロポレーションにより心筋細胞に導入することができる。エピソーム型ベクターとしては、例えば、エプスタイン・バール・ウイルス（ＥＢＶ）由来の複製起点及びＥＢＶ抗原１（ＥＢＮＡ１）遺伝子を含むエピソーム型ベクターが挙げられ、ｐＥＢＭｕｌｔｉベクター（富士フイルム和光純薬株式会社製）等の市販品を利用することができる。
ＰＡＣ発現心筋細胞には、ＰＡＣ遺伝子とともに、発現マーカーとしてはたらくタンパク質をコードする遺伝子など、他の遺伝子を導入してもよい。発現マーカーとしては、例えば、公知の蛍光タンパク質が挙げられる。蛍光タンパク質は、その蛍光がＰＡＣを活性化しない限り限定されず、例えば、Ｒｕｄｏｌｐｈ ＲＦＰであってよい。
ＰＡＣ遺伝子と上記他の遺伝子とは、適切なリンカーで結合されていてもよい。リンカーは、好ましくは細胞内で切断可能であり、このようなリンカーの例として、２Ａペプチドが挙げられる。
＜心筋細胞の拍動を変化させる方法１＞
本発明の一形態に係る、心筋細胞の拍動を変化させる方法は、心筋細胞にＰＡＣ遺伝子を導入する工程と、ＰＡＣ遺伝子が導入された心筋細胞、すなわち、ＰＡＣ発現心筋細胞に光を照射して、ｃＡＭＰを細胞内で産生させる工程と、を備える。この方法はイン・ビトロの方法であってよい。
本発明の一形態に係る、心筋細胞の拍動を変化させる方法は、心筋細胞にＰＡＣ遺伝子を導入する工程と、ＰＡＣ遺伝子が導入された心筋細胞、すなわち、ＰＡＣ発現心筋細胞に光を照射して、ｃＡＭＰを細胞内で産生させる工程と、を備える。この方法はイン・ビトロの方法であってよい。
心筋細胞が由来する動物は特に限定されず、心筋細胞は、例えば、ヒト、サル、ブタ、ウシ、ヒツジ、ウサギ、ラット、爬虫類、両生類、魚類、鳥類又はマウス由来であってよい。また、心筋細胞は、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞等の幹細胞に由来する心筋細胞であってよく、具体的には、例えば、ヒトｉＰＳ細胞由来の心筋細胞であってもよい。心筋細胞は、単一の心筋細胞であっても、複数の心筋細胞の集団であって、心筋細胞が互いに接着している集団であってもよい。心筋細胞が集団で存在する場合、ＰＡＣ遺伝子は、集団中の少なくとも一つの心筋細胞に導入すればよい。ＰＡＣ遺伝子の詳細及び心筋細胞にＰＡＣ遺伝子を導入する方法は、上述したとおりである。
ＰＡＣ発現心筋細胞に照射する光は、ＰＡＣを活性化することができる光であれば限定されない。ＰＡＣは青色光で活性化されるため、光は、３５０ｎｍ～５００ｎｍの領域の波長を含む光である。光のピーク波長は、好ましくは、４００ｎｍ～５００ｎｍであり、より好ましくは４３０ｎｍ～４７０ｎｍであり、さらに好ましくは４３０ｎｍ～４６０ｎｍである。光の光源としては、例えば、青色発光ダイオードを用いることができる。
光の強度は、ＰＡＣ遺伝子の種類、ＰＡＣ遺伝子の発現量、及び所望の拍動速度に応じて調節することができる。一実施形態において、光は、例えば、０．００１μｍｏｌ／ｍ２／ｓ～１０００００μｍｏｌ／ｍ２／ｓの光量子束密度を有していてもよいが、光量子束密度はこれに限定されない。例えば、心筋細胞の拍動速度をより高めるためには、光量子束密度は、０．１μｍｏｌ／ｍ２／ｓ以上、１μｍｏｌ／ｍ２／ｓ以上、又は５μｍｏｌ／ｍ２／ｓ以上であってもよい。効率良く拍動を変化させる観点から、光量子束密度は、１００μｍｏｌ／ｍ２／ｓ以下、又は５０μｍｏｌ／ｍ２／ｓ以下であってよい。上記光量子束密度は、好ましくは、光の一部であって上記ピーク波長に対応する部分の、光量子束密度である。光の強度は公知の方法で調節することができ、例えば、減光フィルタ（ＮＤフィルタ）を用いて調節することができる。
光の照射時間及び照射回数は、ＰＡＣ遺伝子の種類、ＰＡＣ遺伝子の発現量、及び所望の拍動パターンに応じて調節することができる。一実施形態において、光の照射時間は、例えば、０．１秒以上、１秒以上、又は２０秒以上であってよい。光の照射は、１度のみ行ってもよく、断続的に複数回行ってもよい。一実施形態において、光の照射を複数回行う場合、光の照射は、例えば、１５分以下、１０分以下、７分以下、５分以下、又は３分以下の間隔をおいて行うことができる。本実施形態に係る、心筋細胞の拍動を変化させる方法によれば、光照射の間隔が１５分以下であっても、拍動速度が高まった状態を維持することができる。一方、別の観点から、本実施形態に係る、心筋細胞の拍動を変化させる方法によれば、１回の光照射から１５分以内、１０分以内、７分以内、５分以内、又は３分以内で拍動速度が光照射前と同程度に戻るため、心筋細胞の拍動速度を高精度に制御することができるともいえる。
ＰＡＣを有する又は有しない複数の心筋細胞が互いに接着して集団として存在する場合、ＰＡＣを有する少なくとも一つの心筋細胞に光を照射すればよい。
ＰＡＣ発現心筋細胞に光を照射することで、ＰＡＣにより心筋細胞内でｃＡＭＰが産生される。細胞内のｃＡＭＰ濃度の上昇は、細胞内へのカルシウムイオン（Ｃａ２＋）の流入を亢進させる。心筋細胞の収縮、すなわち心筋細胞の拍動は、カルシウムイオン濃度の上昇により起こるため、ＰＡＣ発現心筋細胞に光を照射することで、ＰＡＣ発現心筋細胞の拍動速度を高めることができる。
心筋細胞の収縮及び弛緩は、それぞれ細胞内のカルシウムイオン濃度の上昇及び低下により起こるため、心筋細胞の拍動の変化は、カルシウムイオン濃度の変化を観察することにより捉えることができる。細胞内のカルシウムイオン濃度の変化は、カルシウム指示薬を用いることにより観察できる。カルシウム指示薬は、その励起光及び蛍光がＰＡＣを活性化しない限り限定されず、公知のカルシウム指示薬を用いることができる。このようなカルシウム指示薬の例は、５７３ｎｍの励起波長及び５８８ｎｍの蛍光波長を有するＣａｌｂｒｙｔｅ（商標）５９０ ＡＭ（ＡＡＴバイオクエスト社製）である。カルシウム指示薬の他の例は、Ｃａｌｂｒｙｔｅ（商標）６３０ ＡＭ、Ｆｌｕｏ－３ ＡＭ、Ｆｌｕｏ－４ ＡＭ、及びＲｈｏｄ－２ ＡＭ、Ｒｈｏｄ－５Ｎ ＡＭ、Ｒｈｏｄ－ＦＦ ＡＭ、Ｃａｌｃｉｕｍ Ｏｒａｎｇｅ（商標），ＡＭ（サーモフィッシャーサイエンティフィック製）である。
＜心筋細胞の拍動を変化させる方法２＞
本発明の別の一形態に係る、心筋細胞の拍動を変化させる方法は、ＰＡＣ遺伝子を有する改変細胞を心筋細胞に接触させる工程と、心筋細胞と接触している改変細胞に光を照射して、ｃＡＭＰを改変細胞内で産生させる工程と、を備える。この方法はイン・ビトロの方法であってよい。本明細書において、ＰＡＣ遺伝子を有する改変細胞を、ＰＡＣ発現細胞という場合もある。
本発明の別の一形態に係る、心筋細胞の拍動を変化させる方法は、ＰＡＣ遺伝子を有する改変細胞を心筋細胞に接触させる工程と、心筋細胞と接触している改変細胞に光を照射して、ｃＡＭＰを改変細胞内で産生させる工程と、を備える。この方法はイン・ビトロの方法であってよい。本明細書において、ＰＡＣ遺伝子を有する改変細胞を、ＰＡＣ発現細胞という場合もある。
心筋細胞の詳細は、上述のとおりである。心筋細胞はＰＡＣ遺伝子を有していてもよいが、本方法の有用性の観点から、心筋細胞は、好ましくはＰＡＣ遺伝子を有さない。
ＰＡＣ発現細胞は、任意の細胞にＰＡＣ遺伝子を導入することにより得ることができる。かかる細胞は、特に限定されず、例えば、ヒト胎児腎臓細胞（ＨＥＫ細胞）、ヒト新生児皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）、ヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ－ＡＴ）、及びヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）からなる群より選ばれる１種以上の細胞であってよい。改変細胞には、上記心筋細胞とは別の心筋細胞が含まれてもよいが、本方法の有用性の観点から、改変細胞は、好ましくは心筋細胞以外の細胞である。
任意の細胞にＰＡＣ遺伝子を導入する方法は、上述した、心筋細胞にＰＡＣ遺伝子を導入する方法に準ずる。ただし、ＰＡＣ遺伝子を導入する細胞が心筋細胞以外の細胞である場合、ＰＡＣ遺伝子は、ウイルスを利用しない方法で導入することが好ましい。
ＰＡＣ発現細胞を心筋細胞に接触、より具体的には接着させる方法は特に限定されず、例えば、心筋細胞を含む培地にＰＡＣ発現細胞を含む培養液を添加することにより、ＰＡＣ発現細胞を心筋細胞に接触させることができる。これらの細胞を一定時間一緒に培養することで、ＰＡＣ発現細胞を心筋細胞に接着させることができる。ここで、接着は、好ましくはギャップ結合を有する細胞―細胞接着である。心筋細胞が集団で存在する場合、少なくとも一つの心筋細胞に改変細胞を接触させればよい。
改変細胞に照射する光の詳細及びその照射の仕方は、上述したＰＡＣ発現心筋細胞に照射する光の詳細及びその照射の仕方に準ずる。心筋細胞と接触しているＰＡＣ発現細胞が複数存在する場合、複数のＰＡＣ発現細胞のうちの少なくとも一つのＰＡＣ発現細胞に光を照射すればよい。
ＰＡＣ発現細胞に光を照射することで、ＰＡＣにより該細胞内でｃＡＭＰが産生される。ｃＡＭＰは互いに接着した細胞の間で輸送される。したがって、心筋細胞自体がＰＡＣ遺伝子を有していなくても、ＰＡＣ発現細胞で産生されたｃＡＭＰが該ＰＡＣ発現細胞と接着する心筋細胞に輸送されて、心筋細胞内のｃＡＭＰ濃度の上昇をもたらす。したがって、本実施形態に係る方法によれば、心筋細胞自体にはＰＡＣ遺伝子を導入する必要なしに、光により心筋細胞の拍動を変化させることができる。一般に、心筋細胞への遺伝子導入は難しく、また、心筋細胞に遺伝子を導入するのに最も効果的であるＡＡＶを使用する方法は、ＡＡＶの作製に時間、手間、及び高額な費用を要する。したがって、心筋細胞にＰＡＣ遺伝子を導入する必要のない本実施形態に係る方法は、有用である。
＜心筋細胞を成熟させる方法１＞
本発明の一形態に係る心筋細胞を成熟させる方法は、心筋細胞にＰＡＣ遺伝子を導入する工程と、ＰＡＣ遺伝子が導入された心筋細胞、すなわちＰＡＣ発現心筋細胞を、該心筋細胞に光を照射しながら培養する工程と、を備える。この方法はイン・ビトロの方法であってよい。
本発明の一形態に係る心筋細胞を成熟させる方法は、心筋細胞にＰＡＣ遺伝子を導入する工程と、ＰＡＣ遺伝子が導入された心筋細胞、すなわちＰＡＣ発現心筋細胞を、該心筋細胞に光を照射しながら培養する工程と、を備える。この方法はイン・ビトロの方法であってよい。
心筋細胞にＰＡＣ遺伝子を導入する工程の詳細は、ＰＡＣ発現心筋細胞を用いて心筋細胞の拍動を変化させる方法において述べたとおりである。
培養方法は特に限定されず、心筋細胞の培養に通常用いられる培地及び培養条件を適用することができる。例えば、培地としては、ＰＳＣ Ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ Ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ Ｍｅｄｉｕｍ（カタログ番号：Ａ２９２０８０１、サーモフィッシャーサイエンティフィッ社）、ｉＣｅｌｌ（登録商標） 心筋細胞 維持用培地（製品コード：Ｍ１００３、製造元：フジフイルム セルラー ダイナミクス社）等の市販品を用いることができる。培養は、例えば、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で行うことができる。十分に成熟させた心筋細胞を得る観点から、培養期間は、好ましくは６日以上又は１週間以上である。培養期間は、例えば１週間～２週間であってよい。
ＰＡＣ発現心筋細胞に照射する光の詳細は、上述のとおりである。光照射によりＰＡＣ発現心筋細胞の拍動周期を増加させることができ、これにより心筋細胞を成熟させることができる。光の照射の仕方は、心筋細胞の拍動速度が高まりさえすれば、特に制限されない。光の照射は、例えば、心筋細胞の拍動周期が０．５Ｈｚ～５Ｈｚ、１Ｈｚ～５Ｈｚ、１．５Ｈｚ～４Ｈｚ、又は２Ｈｚ～４Ｈｚに維持されるように行ってよい。本明細書において、Ｈｚは、１秒あたりの拍動回数を示す。拍動周期は、例えば、０．５Ｈｚ、１Ｈｚ、１．５Ｈｚ、２Ｈｚ、３Ｈｚ、４Ｈｚ、又はそれ以上であってよい。心筋細胞の拍動周期は、通常、成熟が進むにつれて減少するため、拍動周期の下限値は成熟の度合いに依存する。拍動周期は、５Ｈｚ、４Ｈｚ、３Ｈｚ、２Ｈｚ、１．５Ｈｚ、１Ｈｚ又はそれ以下であってよい。心筋細胞の拍動周期は、例えば、光の強度、照射の間隔、照射時間、及び照射回数を調節することにより制御することができる。培養中、光の照射は、ずっと行ってもよく、断続的に行ってもよい。光の照射を断続的に行う場合、より短い期間で心筋細胞を成熟させる観点から、光の照射は、３分以下、５分以下、１０分以下、又は１５分以下の間隔をおいて行うことが好ましい。光強度を上げれば、照射の間隔が長くても心筋細胞の拍動周期を０．５Ｈｚ～５Ｈｚに維持することが可能である。一例として、０．２μｍｏｌ／ｍ２／ｓの光を１０分の間隔をおいて心筋細胞に照射することで、拍動周期を０．５Ｈｚ～５Ｈｚに維持することができる。また、光の照射を断続的に行う場合、一回の照射の時間は、例えば、０．１秒以上、１秒以上、２０秒以上、３分以上、５分以上、１０分以上、又は１５分以上であってよい。
ＰＡＣを有する又は有しない複数の心筋細胞が互いに接着して集団として存在する場合、ＰＡＣを有する少なくとも一つの心筋細胞に光を照射すればよい。上述のとおり、光照射によりＰＡＣ発現心筋細胞内で産生されたｃＡＭＰは、互いに接着した心筋細胞の間で輸送される。したがって、少なくとも一つのＰＡＣ発現心筋細胞に光を照射することで、集団中の全ての心筋細胞の拍動を同時に制御でき、すなわち、集団中の全ての心筋細胞を同時に成熟させることができる。また、ＰＡＣ遺伝子又はＰＡＣ発現心筋細胞は、成熟後に取り除くことができるし、万が一これらが残存したとしても、ＰＡＣの活性化に必要な光は体内に届かないため、本実施形態に係る方法により成熟させた心筋細胞は、移植用途に安全に用いることができる。
心筋細胞の成熟は、例えば、心筋細胞の大きさの増大により、複数の核の存在により、又は筋原線維の規則的な配列により、確認することができる。
＜心筋細胞を成熟させる方法２＞
本発明の別の一形態に係る、心筋細胞を成熟させる方法は、ＰＡＣ遺伝子を有する改変細胞、すなわちＰＡＣ発現細胞を心筋細胞に接触させる工程と、心筋細胞を、該心筋細胞と接触している改変細胞に光を照射しながら培養する工程と、を備える。この方法はイン・ビトロの方法であってよい。
本発明の別の一形態に係る、心筋細胞を成熟させる方法は、ＰＡＣ遺伝子を有する改変細胞、すなわちＰＡＣ発現細胞を心筋細胞に接触させる工程と、心筋細胞を、該心筋細胞と接触している改変細胞に光を照射しながら培養する工程と、を備える。この方法はイン・ビトロの方法であってよい。
ＰＡＣ発現細胞を心筋細胞に接触させる工程の詳細は、ＰＡＣ発現細胞を用いて心筋細胞の拍動を変化させる方法において述べたとおりである。ただし、本実施形態に係る方法においては、本実施形態に係る方法により成熟させた心筋細胞を移植用途に用いる観点から、改変細胞が成熟した又は未熟な心筋細胞であることが好ましい。
培養方法は、上記実施形態に係る心筋細胞を成熟させる方法において述べたとおりである。また、改変細胞に照射する光の詳細及びその照射の仕方は、上記実施形態に係る心筋細胞を成熟させる方法において述べた、ＰＡＣ発現心筋細胞に照射する光の詳細及びその照射の仕方に準ずる。心筋細胞と接触しているＰＡＣ発現細胞が複数存在する場合、複数のＰＡＣ発現細胞のうちの少なくとも一つのＰＡＣ発現細胞に光を照射すればよい。
本実施形態に係る方法によれば、心筋細胞自体にはＰＡＣ遺伝子を導入する必要なしに、心筋細胞を成熟させることができる。ＰＡＣ発現細胞は、成熟後に取り除くことができるため、本実施形態に係る方法により成熟させた心筋細胞は、移植用途に安全に用いることができる。
１．試験例１
＜材料及び方法＞
（１）細胞
心筋細胞としては、株式会社マイオリッジから購入したヒトｉＰＳ細胞由来の心筋細胞を用いた。特に断りがない限り、ＰＡＣ発現心筋細胞は次のようにして調製した。まず、フィブロネクチンコートを施したφ３５ｍｍディッシュに心筋細胞を播種し、株式会社マイオリッジ製の専用培地にて、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で２日間培養した。次いで、ＡＡＶベクターを用いて、心筋細胞にＰＡＣ遺伝子を導入した。得られたＰＡＣ発現心筋細胞は、遺伝子導入後４日～１０日の間に使用した。
＜材料及び方法＞
（１）細胞
心筋細胞としては、株式会社マイオリッジから購入したヒトｉＰＳ細胞由来の心筋細胞を用いた。特に断りがない限り、ＰＡＣ発現心筋細胞は次のようにして調製した。まず、フィブロネクチンコートを施したφ３５ｍｍディッシュに心筋細胞を播種し、株式会社マイオリッジ製の専用培地にて、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で２日間培養した。次いで、ＡＡＶベクターを用いて、心筋細胞にＰＡＣ遺伝子を導入した。得られたＰＡＣ発現心筋細胞は、遺伝子導入後４日～１０日の間に使用した。
ＡＡＶベクターを用いたＰＡＣ遺伝子導入の詳細は次のとおりである。セルバイオラボ社から購入したＡＡＶヘルパーフリー発現システム（２型血清）を用いて、ｐＡＡＶ－ｍＢｓＰＡＣ－２Ａ－ＲｕｄｏｌｐｈＲＦＰ－ＷＰＲＥ発現ベクター、ｐＡＡＶ－ＲＣベクター及びｐＨｅｌｐｅｒベクターを宿主細胞に導入し、パッケージングすることで組換えアデノ随伴ウイルス粒子（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＡＡＶ）であるｒＡＡＶ－ｍＢｓＰＡＣ－２Ａ－ＲｕｄｏｌｐｈＲＦＰ－ＷＰＲＥを構築した。なお、ＷＰＲＥ（ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント）は、ＡＡＶの力価と感染性を向上させる作用を有する配列である。パッケージング及び精製は、シグナジェンラボラトリーズ社に委託した。得られたＡＡＶの力価は１．４６×１０１３ＶＧ／ｍＬであった。ＡＡＶを１×１０８ＶＧ／ｍＬ～１×１０１１ＶＧ／ｍＬの割合で心筋細胞に添加して心筋細胞に感染させ、組換えアデノ随伴ウイルス粒子ｒＡＡＶ－ｍＢｓＰＡＣ－２Ａ－ＲｕｄｏｌｐｈＲＦＰを有する心筋細胞を得た。２日後にＲＦＰ蛍光により発現を確認した。プラスミド中のｍＢｓＰＡＣは、哺乳類に最適化されたコドンを有するベギアトアのＰＡＣ遺伝子であり、その塩基配列は配列番号４で示される。
心筋細胞以外の細胞として、ＨＥＫ細胞及びＮＨＤＦを使用した。
ＨＥＫ細胞としては、国立研究開発法人医薬基盤・健康・栄養研究所ＪＣＲＢ細胞バンクから購入した、ＨＥＫ２９３（細胞番号ＪＣＲＢ９０６８）を使用した。ＨＥＫ細胞は、ダルベッコ改変イーグル培地（Ｄ－ＭＥＭ培地）＋１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を用いて、３７℃、５％ＣＯ２条件下で、培養及び維持した。ｐＥＢＭｕｌｔｉ－Ｈｙｇベクター（富士フイルム和光純薬株式会社製）を用いて、ｍＢｓＰＡＣ遺伝子をエレクトロポレーション（ＤＮＡ１０μｇ／２×１０７細胞、２６０Ｖ、９５０μＦ）によりＨＥＫ細胞に導入することにより、ＰＡＣ発現ＨＥＫ細胞を調製した。エレクトロポレーションには、ミラスバイオ社製のＩｎｇｅｎｉｏ（登録商標）Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ｋｉｔ ｗｉｔｈ ０．４ｃｍ ｃｕｖｅｔｔｅｓを使用した。
ＮＨＤＦは、ロンザ株式会社から購入した。ＮＨＤＦは、同社製の専用培地を用いて、３７℃、５％ＣＯ２条件下で、培養及び維持した。上記と同様の方法により、ｐＥＢＭｕｌｔｉベクターを用いてｍＢｓＰＡＣ遺伝子をＮＨＤＦに導入することにより、ＰＡＣ発現ＮＨＤＦを調製した。
（２）カルシウムイオン濃度の観察
心筋細胞内のカルシウムイオン濃度の変化は、カルシウムイオン指示薬Ｃａｌｂｒｙｔｅ ５９０ ＡＭ（ＡＡＴバイオクエスト社製）を用いて捉えた。メーカーのプロトコルに従って、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解したＣａｌｂｒｙｔｅ ５９０ ＡＭを終濃度２０μＭでＨａｎｋｓ ａｎｄ Ｈｅｐｅｓ ｂｕｆｆｅｒに混合し、混合液に終濃度０．０４％でプルロニック（登録商標）Ｆ－１２７を添加することにより、ｗｏｒｋｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎを調製した。心筋細胞に１ｍＬの維持培地と１ｍＬのｗｏｒｋｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎとを添加し、心筋細胞をインキュベータ（３７℃、５％ＣＯ２）内で４５分間静置することで、心筋細胞にカルシウム指示薬を導入した。培地及びｗｏｒｋｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎは、蛍光観察を行う前にＨａｎｋｓ ａｎｄ Ｈｅｐｅｓ ｂｕｆｆｅｒに置換した。
心筋細胞内のカルシウムイオン濃度の変化は、カルシウムイオン指示薬Ｃａｌｂｒｙｔｅ ５９０ ＡＭ（ＡＡＴバイオクエスト社製）を用いて捉えた。メーカーのプロトコルに従って、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解したＣａｌｂｒｙｔｅ ５９０ ＡＭを終濃度２０μＭでＨａｎｋｓ ａｎｄ Ｈｅｐｅｓ ｂｕｆｆｅｒに混合し、混合液に終濃度０．０４％でプルロニック（登録商標）Ｆ－１２７を添加することにより、ｗｏｒｋｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎを調製した。心筋細胞に１ｍＬの維持培地と１ｍＬのｗｏｒｋｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎとを添加し、心筋細胞をインキュベータ（３７℃、５％ＣＯ２）内で４５分間静置することで、心筋細胞にカルシウム指示薬を導入した。培地及びｗｏｒｋｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎは、蛍光観察を行う前にＨａｎｋｓ ａｎｄ Ｈｅｐｅｓ ｂｕｆｆｅｒに置換した。
（３）光照射
照射光の光源として、ロイヤルブルーＬＥＤ（ＬＸＭＬ－ＰＲ０１－０４２５、フィリップス・ルミレッズ・ライティング・カンパニー製：ピーク波長４４７．５ｎｍ；半値全幅２０ｎｍ）を用いた。ロイヤルブルーＬＥＤは顕微鏡の近傍に設置し、ＮＤフィルタを複数枚取り付け可能なフォルダを、光源と顕微鏡の間に固定した。光強度は、１枚又は複数枚のＮＤフィルタ（ＮＤ１、ＮＤ３、ＮＤ１０、又はＮＤ３０）を用いて、０．０１Ｗ／ｍ２、０．０５Ｗ／ｍ２、０．３８Ｗ／ｍ２、２．３３Ｗ／ｍ２、又は９．２８Ｗ／ｍ２（すなわち０．０４８μｍｏｌ／ｍ２／ｓ、０．１９μｍｏｌ／ｍ２／ｓ、１．４１μｍｏｌ／ｍ２／ｓ、８．７６μｍｏｌ／ｍ２／ｓ、又は３４．９μｍｏｌ／ｍ２／ｓ）に調節した。１回の光照射の長さは２０秒に設定した。
照射光の光源として、ロイヤルブルーＬＥＤ（ＬＸＭＬ－ＰＲ０１－０４２５、フィリップス・ルミレッズ・ライティング・カンパニー製：ピーク波長４４７．５ｎｍ；半値全幅２０ｎｍ）を用いた。ロイヤルブルーＬＥＤは顕微鏡の近傍に設置し、ＮＤフィルタを複数枚取り付け可能なフォルダを、光源と顕微鏡の間に固定した。光強度は、１枚又は複数枚のＮＤフィルタ（ＮＤ１、ＮＤ３、ＮＤ１０、又はＮＤ３０）を用いて、０．０１Ｗ／ｍ２、０．０５Ｗ／ｍ２、０．３８Ｗ／ｍ２、２．３３Ｗ／ｍ２、又は９．２８Ｗ／ｍ２（すなわち０．０４８μｍｏｌ／ｍ２／ｓ、０．１９μｍｏｌ／ｍ２／ｓ、１．４１μｍｏｌ／ｍ２／ｓ、８．７６μｍｏｌ／ｍ２／ｓ、又は３４．９μｍｏｌ／ｍ２／ｓ）に調節した。１回の光照射の長さは２０秒に設定した。
（４）細胞及び蛍光の観測
細胞及び細胞から発せられる蛍光は、倒立蛍光顕微鏡（ＤＭＩ６０００Ｂ、ライカ社製）及び内蔵された蛍光観察フィルタセットＭ２（ＢＰ５４６／１４、ＤＭ／５８０、及びＬＰ５９０）を用いて、ＥＭ－ＣＣＤカメラ（ＩｍａｇＥＭ Ｃ９１００－２３Ｂ、浜松ホトニクス株式会社製）により観測した。観測の条件は、以下の通りである。
電子増倍ゲイン（ＥＭゲイン）：１００
フォトンイメージングモード：２
露光時間：６０ミリ秒
撮影速度：２００フレーム／２１．２～２１．６秒
ＥＭ－ＣＣＤカメラによる視野の撮影は、次の各段階において、２０秒ずつ行った：ＬＥＤ照射前、ＬＥＤ照射中、ＬＥＤ照射終了の直後、ＬＥＤ照射終了の１分後、３分後、５分後、及び７分後、並びに拍動数がＬＥＤ照射前の値に戻るまで２分毎
細胞及び細胞から発せられる蛍光は、倒立蛍光顕微鏡（ＤＭＩ６０００Ｂ、ライカ社製）及び内蔵された蛍光観察フィルタセットＭ２（ＢＰ５４６／１４、ＤＭ／５８０、及びＬＰ５９０）を用いて、ＥＭ－ＣＣＤカメラ（ＩｍａｇＥＭ Ｃ９１００－２３Ｂ、浜松ホトニクス株式会社製）により観測した。観測の条件は、以下の通りである。
電子増倍ゲイン（ＥＭゲイン）：１００
フォトンイメージングモード：２
露光時間：６０ミリ秒
撮影速度：２００フレーム／２１．２～２１．６秒
ＥＭ－ＣＣＤカメラによる視野の撮影は、次の各段階において、２０秒ずつ行った：ＬＥＤ照射前、ＬＥＤ照射中、ＬＥＤ照射終了の直後、ＬＥＤ照射終了の１分後、３分後、５分後、及び７分後、並びに拍動数がＬＥＤ照射前の値に戻るまで２分毎
＜実施例１＞
上述の方法により調製したＰＡＣ発現心筋細胞に強度８．７６μｍｏｌ／ｍ２／ｓの光を照射し、拍動の変化を観察した。ＰＡＣ発現心筋細胞を１つ有するコロニーの、（Ａ）光照射前、（Ｂ）光照射中、（Ｃ）光照射直後、（Ｄ）光照射から１分後、（Ｅ）光照射から３分後、及び、（Ｆ）光照射から５分後のカルシウム指示薬の蛍光強度を、図１に示す。図１に示されるように、拍動速度は、光照射を開始した直後に加速し、その後の２０秒間で最も高くなり、その後徐々に元に戻った。
上述の方法により調製したＰＡＣ発現心筋細胞に強度８．７６μｍｏｌ／ｍ２／ｓの光を照射し、拍動の変化を観察した。ＰＡＣ発現心筋細胞を１つ有するコロニーの、（Ａ）光照射前、（Ｂ）光照射中、（Ｃ）光照射直後、（Ｄ）光照射から１分後、（Ｅ）光照射から３分後、及び、（Ｆ）光照射から５分後のカルシウム指示薬の蛍光強度を、図１に示す。図１に示されるように、拍動速度は、光照射を開始した直後に加速し、その後の２０秒間で最も高くなり、その後徐々に元に戻った。
上記実験において、図２の（Ａ）に示すとおり、同一コロニー中に存在する五つの心筋細胞のそれぞれに関心領域（ＲＯＩ）を設定し、各ＲＯＩにおける蛍光強度の変化を観察した。結果を図２の（Ｂ）に示す。蛍光強度、すなわちカルシウムイオン濃度は細胞毎に異なるものの、互いに接着しコロニーを形成した心筋細胞の収縮開始のタイミングは、同期していることが分かった。
さらに、ＰＡＣ発現心筋細胞に、強度の異なる光を、十分な間隔をあけて照射し、拍動の変化を観察した。観察対象は一つの細胞に固定した。光の照射は、前の照射により増加した拍動速度が元に戻ってから行った。それぞれの強度の光を照射した直後（すなわち、光照射から０秒後～２０秒後）の心筋細胞の拍動の波形を図３の（Ａ）に示す。また、光強度と拍動速度の関係を図３の（Ｂ）に示す。これらの図に示すとおり、光強度依存的な拍動速度の変化を確認することができた。特に、光強度０．１μｍｏｌ／ｍ２／ｓから１０μｍｏｌ／ｍ２／ｓの間では、拍動速度と光強度の高い相関が認められた（図３の（Ｂ））。また、図３の（Ａ）において、波形の振幅の大きさで表されるカルシウムイオン濃度の変化量は、照射光の強度に依存しないことが分かった。
＜実施例２＞
心筋細胞に１０８ＶＧ／ｍＬのＡＡＶを添加することにより、心筋細胞にＰＡＣ遺伝子を導入した。得られたＰＡＣ発現心筋細胞に強度１．４１μｍｏｌ／ｍ２／ｓの光を、２０秒間隔で８回断続的に照射し、拍動の変化を観察した。カルシウム指示薬の蛍光強度の変化を図４に示す。図４は、光照射開始１分前、光照射直前（光照射開始２０秒前）、ｎ回目の光照射中（図中、ｎＢで示す）、ｎ回目のインターバル（図中、ｎＤで示す）、並びに８回目の光照射終了から３分、６分、９分、及び１２分後の拍動速度を示す（ｎは１～８である）。これら各段階において、拍動速度は、拍動数を２０秒間計測することにより求めた。図４に示すとおり、心筋細胞に繰り返し光を照射することにより、高い拍動速度を持続的に維持することに成功した。
心筋細胞に１０８ＶＧ／ｍＬのＡＡＶを添加することにより、心筋細胞にＰＡＣ遺伝子を導入した。得られたＰＡＣ発現心筋細胞に強度１．４１μｍｏｌ／ｍ２／ｓの光を、２０秒間隔で８回断続的に照射し、拍動の変化を観察した。カルシウム指示薬の蛍光強度の変化を図４に示す。図４は、光照射開始１分前、光照射直前（光照射開始２０秒前）、ｎ回目の光照射中（図中、ｎＢで示す）、ｎ回目のインターバル（図中、ｎＤで示す）、並びに８回目の光照射終了から３分、６分、９分、及び１２分後の拍動速度を示す（ｎは１～８である）。これら各段階において、拍動速度は、拍動数を２０秒間計測することにより求めた。図４に示すとおり、心筋細胞に繰り返し光を照射することにより、高い拍動速度を持続的に維持することに成功した。
＜実施例３＞
ＰＡＣ非発現心筋細胞を含むディッシュにＰＡＣ発現ＨＥＫ細胞を添加した。インキュベータ内に２時間静置後、ＨＥＫ細胞の生着を確認した。ＨＥＫ細胞と心筋細胞は、細胞の大きさ及び形状が異なるため、明視野観察で判別が可能であった。明視野像中、ＨＥＫ細胞はひし形であり、心筋細胞に比べて小さく見えた。両細胞が互いに接着していることを確認し、これらの細胞に強度２６６μｍｏｌ／ｍ２／ｓの光を照射した。ＰＡＣ非発現心筋細胞の光照射前後のカルシウム指示薬の蛍光強度を図５に示す。拍動速度は光照射に伴い高まっていた。この結果から、心筋細胞がＰＡＣを発現していなくても、ＰＡＣを発現する他種細胞の添加により、心筋細胞の拍動の光制御が可能であることが明らかとなった。なお、図５中、光照射中に蛍光強度のバックグラウンドが高くなっているのは、カルシウム指示薬の蛍光とともに光源からの光を直接検出したためである。
ＰＡＣ非発現心筋細胞を含むディッシュにＰＡＣ発現ＨＥＫ細胞を添加した。インキュベータ内に２時間静置後、ＨＥＫ細胞の生着を確認した。ＨＥＫ細胞と心筋細胞は、細胞の大きさ及び形状が異なるため、明視野観察で判別が可能であった。明視野像中、ＨＥＫ細胞はひし形であり、心筋細胞に比べて小さく見えた。両細胞が互いに接着していることを確認し、これらの細胞に強度２６６μｍｏｌ／ｍ２／ｓの光を照射した。ＰＡＣ非発現心筋細胞の光照射前後のカルシウム指示薬の蛍光強度を図５に示す。拍動速度は光照射に伴い高まっていた。この結果から、心筋細胞がＰＡＣを発現していなくても、ＰＡＣを発現する他種細胞の添加により、心筋細胞の拍動の光制御が可能であることが明らかとなった。なお、図５中、光照射中に蛍光強度のバックグラウンドが高くなっているのは、カルシウム指示薬の蛍光とともに光源からの光を直接検出したためである。
＜実施例４＞
ＰＡＣ非発現心筋細胞を含むディッシュに、１×１０５個又は５×１０５個のＰＡＣ発現ＨＥＫ細胞を添加し、実施例３と同様にしてＰＡＣ非発現心筋細胞の拍動の変化を調べた。１×１０５個のＰＡＣ発現ＨＥＫ細胞を添加した場合、光照射前は３３ビート／分であった拍動速度が光照射直後には３６ビート／分に上昇し、光照射から５分以内に再び３３ビート／分に戻った。５×１０５個のＰＡＣ発現ＨＥＫ細胞を添加した場合、光照射前は６３ビート／分であった拍動速度が光照射直後には６９ビート／分に上昇し、光照射から７分以内に再び６３ビート／分に戻った。これらの結果から、添加するＰＡＣ発現細胞の量を変えることによって、心筋細胞の拍動を分単位で制御することができることが示唆された。
ＰＡＣ非発現心筋細胞を含むディッシュに、１×１０５個又は５×１０５個のＰＡＣ発現ＨＥＫ細胞を添加し、実施例３と同様にしてＰＡＣ非発現心筋細胞の拍動の変化を調べた。１×１０５個のＰＡＣ発現ＨＥＫ細胞を添加した場合、光照射前は３３ビート／分であった拍動速度が光照射直後には３６ビート／分に上昇し、光照射から５分以内に再び３３ビート／分に戻った。５×１０５個のＰＡＣ発現ＨＥＫ細胞を添加した場合、光照射前は６３ビート／分であった拍動速度が光照射直後には６９ビート／分に上昇し、光照射から７分以内に再び６３ビート／分に戻った。これらの結果から、添加するＰＡＣ発現細胞の量を変えることによって、心筋細胞の拍動を分単位で制御することができることが示唆された。
＜実施例５＞
ＰＡＣ非発現心筋細胞を含むディッシュに、１×１０５個のＰＡＣ発現ＮＨＤＦを添加し、実施例３と同様にしてＰＡＣ非発現心筋細胞の拍動の変化を調べた。光照射前は４２ビート／分であった拍動速度が光照射直後には４５ビート／分に上昇し、光照射から３分以内に再び４２ビート／分に戻った。
ＰＡＣ非発現心筋細胞を含むディッシュに、１×１０５個のＰＡＣ発現ＮＨＤＦを添加し、実施例３と同様にしてＰＡＣ非発現心筋細胞の拍動の変化を調べた。光照射前は４２ビート／分であった拍動速度が光照射直後には４５ビート／分に上昇し、光照射から３分以内に再び４２ビート／分に戻った。
実施例１～５の結果より、心筋細胞にＰＡＣ遺伝子を導入することにより、心筋細胞の拍動を光によって高精度で制御できることが分かった。また、同期して拍動するコロニー中の心筋細胞のうち少なくとも一つの心筋細胞がＰＡＣを発現していれば、コロニー全体の拍動を制御できることも分かった。さらに、細胞同士が接着していれば、ＰＡＣを発現した他種細胞の極少量の添加によっても、心筋細胞の拍動を制御できることも示された。
２．試験例２
＜実施例６＞
心筋細胞（製品名：ｉＣｅｌｌ心筋細胞２．０－０１４３４、製品コード：ＣＭＣ－１００－０１２－０００．５、フジフイルム セルラー ダイナミクス社）を製造元のプロトコルに従って溶解し、５μｇ／ｍＬのフィブロネクチンでコートしたディッシュに１．６×１０５細胞／ｃｍ２の密度で播種した。培地として、ｉＣｅｌｌ心筋細胞解凍用培地（製品コード：Ｍ１００１、製造元：フジフイルム セルラー ダイナミクス社）及びｉＣｅｌｌ心筋細胞維持用培地（製品コード：Ｍ１００３、製造元：フジフイルム セルラー ダイナミクス社）を用いた。細胞の播種から２日後にＡＡＶベクター（力価：１×１０１０ＶＰ／ｍＬ）を用いてＰＡＣ遺伝子及びｌｉｆｅａｃｔ－Ｒｕｄｏｌｐｈ ＲＦＰ遺伝子を、又はｌｉｆｅａｃｔ－Ｒｕｄｏｌｐｈ ＲＦＰ遺伝子のみを心筋細胞に導入した。ｌｉｆｅａｃｔ－Ｒｕｄｏｌｐｈ ＲＦＰは、アクチンフィラメントに結合するペプチドｌｉｆｅａｃｔとＲｕｄｏｌｐｈ ＲＦＰとの融合タンパク質であり、筋原線維の蛍光可視化に用いた。ＡＡＶの添加から２日後に、ＡＡＶを含まない心筋細胞維持培地で培地を交換し、青色光をディッジュの下から細胞に照射しながら細胞を培養した。光照射の詳細は次のとおりである。
光源：ピーク波長４５０ｎｍのＬＥＤ（品番：ＬＸＭＬ－ＰＲ０１－０４２５、ルクシオン・レベル、フィリップス・ルミレッズ社）
光の強度：１．３μｍｏｌ／ｍ２／ｓ
照射周期：１５分（１５分の点灯と１５分の消灯の繰り返し）
照射期間：６日間
心筋細胞の拍動を、試験例１と同様に、カルシウム指示薬を用いてカルシウムイオン濃度の変化を捉えることにより観察した。光照射により、ＰＡＣ発現心筋細胞の拍動周期は、照射開始時は２Ｈｚに、照射期間の最終日は０．５Ｈｚに維持されていた。
＜実施例６＞
心筋細胞（製品名：ｉＣｅｌｌ心筋細胞２．０－０１４３４、製品コード：ＣＭＣ－１００－０１２－０００．５、フジフイルム セルラー ダイナミクス社）を製造元のプロトコルに従って溶解し、５μｇ／ｍＬのフィブロネクチンでコートしたディッシュに１．６×１０５細胞／ｃｍ２の密度で播種した。培地として、ｉＣｅｌｌ心筋細胞解凍用培地（製品コード：Ｍ１００１、製造元：フジフイルム セルラー ダイナミクス社）及びｉＣｅｌｌ心筋細胞維持用培地（製品コード：Ｍ１００３、製造元：フジフイルム セルラー ダイナミクス社）を用いた。細胞の播種から２日後にＡＡＶベクター（力価：１×１０１０ＶＰ／ｍＬ）を用いてＰＡＣ遺伝子及びｌｉｆｅａｃｔ－Ｒｕｄｏｌｐｈ ＲＦＰ遺伝子を、又はｌｉｆｅａｃｔ－Ｒｕｄｏｌｐｈ ＲＦＰ遺伝子のみを心筋細胞に導入した。ｌｉｆｅａｃｔ－Ｒｕｄｏｌｐｈ ＲＦＰは、アクチンフィラメントに結合するペプチドｌｉｆｅａｃｔとＲｕｄｏｌｐｈ ＲＦＰとの融合タンパク質であり、筋原線維の蛍光可視化に用いた。ＡＡＶの添加から２日後に、ＡＡＶを含まない心筋細胞維持培地で培地を交換し、青色光をディッジュの下から細胞に照射しながら細胞を培養した。光照射の詳細は次のとおりである。
光源：ピーク波長４５０ｎｍのＬＥＤ（品番：ＬＸＭＬ－ＰＲ０１－０４２５、ルクシオン・レベル、フィリップス・ルミレッズ社）
光の強度：１．３μｍｏｌ／ｍ２／ｓ
照射周期：１５分（１５分の点灯と１５分の消灯の繰り返し）
照射期間：６日間
心筋細胞の拍動を、試験例１と同様に、カルシウム指示薬を用いてカルシウムイオン濃度の変化を捉えることにより観察した。光照射により、ＰＡＣ発現心筋細胞の拍動周期は、照射開始時は２Ｈｚに、照射期間の最終日は０．５Ｈｚに維持されていた。
６日間の培養後、心筋細胞を蛍光顕微鏡で観察した。ＰＡＣを発現しない心筋細胞の蛍光画像を図６の（Ａ）に示し、ＰＡＣ発現心筋細胞の蛍光画像を図６の（Ｂ）に示す。図６中、スケールバーは５０μｍを示す。図６に示されるように、光を照射しながら培養したＰＡＣ発現心筋細胞（Ｂ）は、光を照射しながら培養したＰＡＣを発現しない心筋細胞（Ａ）よりも１０倍以上大きい細胞面積を有していた。また、ＰＡＣ発現心筋細胞（Ｂ）では、筋原線維が心筋細胞の長軸方向（画像の左下から右上）に規則的に整列しており、サルコメア構造がはっきりと現れていた。このことから、光を照射しながら培養したＰＡＣ発現心筋細胞は成熟していることが確認できた。
Claims (7)
- 心筋細胞の拍動を変化させる方法であって、
光活性化アデニル酸シクラーゼ遺伝子を有する改変細胞を心筋細胞に接触させる工程と、
心筋細胞と接触している改変細胞に光を照射して、ｃＡＭＰを改変細胞内で産生させる工程と、備え、
心筋細胞の拍動は、改変細胞内のｃＡＭＰ濃度に応じて変化する、方法。 - 改変細胞が、光活性化アデニル酸シクラーゼ遺伝子を導入した、ヒト胎児腎臓細胞又はヒト新生児皮膚線維芽細胞を含む、請求項１に記載の方法。
- 光が、３５０ｎｍ～５００ｎｍの波長を有する光を含む、請求項１又は２に記載の方法。
- 心筋細胞を成熟させる方法であって、
心筋細胞に光活性化アデニル酸シクラーゼ遺伝子を導入する工程と、
光活性化アデニル酸シクラーゼ遺伝子が導入された心筋細胞を、該心筋細胞に光を照射しながら培養する工程と、を備える、方法。 - 光が、３５０ｎｍ～５００ｎｍの波長を有する光を含む、請求項４に記載の方法。
- 光の照射が、心筋細胞の拍動周期が０．５Ｈｚ～５Ｈｚに維持されるように行われる、請求項４又は５に記載の方法。
- 心筋細胞が幹細胞に由来する、請求項４～６のいずれか一項に記載の方法。
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Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2015000021A (ja) | 2013-06-14 | 2015-01-05 | 浜松ホトニクス株式会社 | 細胞内ｃＡＭＰ濃度を制御する方法 |
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2019
- 2019-08-02 WO PCT/JP2019/030551 patent/WO2020044960A1/ja active Application Filing
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|---|---|---|---|---|
| JP2015000021A (ja) | 2013-06-14 | 2015-01-05 | 浜松ホトニクス株式会社 | 細胞内ｃＡＭＰ濃度を制御する方法 |
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Also Published As
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