JP7401440B2 - 心筋細胞及び心筋細胞の拍動を変化させる方法 - Google Patents
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Description
本発明の心筋細胞は、光活性化アデニル酸シクラーゼ(PAC)遺伝子を有する。本明細書において、PAC遺伝子を有する心筋細胞を、PAC発現心筋細胞ともいう。PAC発現心筋細胞の拍動は、後述の方法により変化させることができる。
本発明の一形態に係る、心筋細胞の拍動を変化させる方法は、心筋細胞にPAC遺伝子を導入する工程と、PAC遺伝子が導入された心筋細胞、すなわち、PAC発現心筋細胞に光を照射して、cAMPを細胞内で産生させる工程と、を備える。この方法はイン・ビトロの方法であってよい。
本発明の別の一形態に係る、心筋細胞の拍動を変化させる方法は、PAC遺伝子を有する改変細胞を心筋細胞に接触させる工程と、心筋細胞と接触している改変細胞に光を照射して、cAMPを改変細胞内で産生させる工程と、を備える。この方法はイン・ビトロの方法であってよい。本明細書において、PAC遺伝子を有する改変細胞を、PAC発現細胞という場合もある。
本発明の一形態に係る心筋細胞を成熟させる方法は、心筋細胞にPAC遺伝子を導入する工程と、PAC遺伝子が導入された心筋細胞、すなわちPAC発現心筋細胞を、該心筋細胞に光を照射しながら培養する工程と、を備える。この方法はイン・ビトロの方法であってよい。
本発明の別の一形態に係る、心筋細胞を成熟させる方法は、PAC遺伝子を有する改変細胞、すなわちPAC発現細胞を心筋細胞に接触させる工程と、心筋細胞を、該心筋細胞と接触している改変細胞に光を照射しながら培養する工程と、を備える。この方法はイン・ビトロの方法であってよい。
<材料及び方法>
(1)細胞
心筋細胞としては、株式会社マイオリッジから購入したヒトiPS細胞由来の心筋細胞を用いた。特に断りがない限り、PAC発現心筋細胞は次のようにして調製した。まず、フィブロネクチンコートを施したφ35mmディッシュに心筋細胞を播種し、株式会社マイオリッジ製の専用培地にて、37℃、5%CO2の条件下で2日間培養した。次いで、AAVベクターを用いて、心筋細胞にPAC遺伝子を導入した。得られたPAC発現心筋細胞は、遺伝子導入後4日~10日の間に使用した。
心筋細胞内のカルシウムイオン濃度の変化は、カルシウムイオン指示薬Calbryte 590 AM(AATバイオクエスト社製)を用いて捉えた。メーカーのプロトコルに従って、ジメチルスルホキシド(DMSO)に溶解したCalbryte 590 AMを終濃度20μMでHanks and Hepes bufferに混合し、混合液に終濃度0.04%でプルロニック(登録商標)F-127を添加することにより、working solutionを調製した。心筋細胞に1mLの維持培地と1mLのworking solutionとを添加し、心筋細胞をインキュベータ(37℃、5%CO2)内で45分間静置することで、心筋細胞にカルシウム指示薬を導入した。培地及びworking solutionは、蛍光観察を行う前にHanks and Hepes bufferに置換した。
照射光の光源として、ロイヤルブルーLED(LXML-PR01-0425、フィリップス・ルミレッズ・ライティング・カンパニー製:ピーク波長447.5nm;半値全幅20nm)を用いた。ロイヤルブルーLEDは顕微鏡の近傍に設置し、NDフィルタを複数枚取り付け可能なフォルダを、光源と顕微鏡の間に固定した。光強度は、1枚又は複数枚のNDフィルタ(ND1、ND3、ND10、又はND30)を用いて、0.01W/m2、0.05W/m2、0.38W/m2、2.33W/m2、又は9.28W/m2(すなわち0.048μmol/m2/s、0.19μmol/m2/s、1.41μmol/m2/s、8.76μmol/m2/s、又は34.9μmol/m2/s)に調節した。1回の光照射の長さは20秒に設定した。
細胞及び細胞から発せられる蛍光は、倒立蛍光顕微鏡(DMI6000B、ライカ社製)及び内蔵された蛍光観察フィルタセットM2(BP546/14、DM/580、及びLP590)を用いて、EM-CCDカメラ(ImagEM C9100-23B、浜松ホトニクス株式会社製)により観測した。観測の条件は、以下の通りである。
電子増倍ゲイン(EMゲイン):100
フォトンイメージングモード:2
露光時間:60ミリ秒
撮影速度:200フレーム/21.2~21.6秒
EM-CCDカメラによる視野の撮影は、次の各段階において、20秒ずつ行った:LED照射前、LED照射中、LED照射終了の直後、LED照射終了の1分後、3分後、5分後、及び7分後、並びに拍動数がLED照射前の値に戻るまで2分毎
上述の方法により調製したPAC発現心筋細胞に強度8.76μmol/m2/sの光を照射し、拍動の変化を観察した。PAC発現心筋細胞を1つ有するコロニーの、(A)光照射前、(B)光照射中、(C)光照射直後、(D)光照射から1分後、(E)光照射から3分後、及び、(F)光照射から5分後のカルシウム指示薬の蛍光強度を、図1に示す。図1に示されるように、拍動速度は、光照射を開始した直後に加速し、その後の20秒間で最も高くなり、その後徐々に元に戻った。
心筋細胞に108VG/mLのAAVを添加することにより、心筋細胞にPAC遺伝子を導入した。得られたPAC発現心筋細胞に強度1.41μmol/m2/sの光を、20秒間隔で8回断続的に照射し、拍動の変化を観察した。カルシウム指示薬の蛍光強度の変化を図4に示す。図4は、光照射開始1分前、光照射直前(光照射開始20秒前)、n回目の光照射中(図中、nBで示す)、n回目のインターバル(図中、nDで示す)、並びに8回目の光照射終了から3分、6分、9分、及び12分後の拍動速度を示す(nは1~8である)。これら各段階において、拍動速度は、拍動数を20秒間計測することにより求めた。図4に示すとおり、心筋細胞に繰り返し光を照射することにより、高い拍動速度を持続的に維持することに成功した。
PAC非発現心筋細胞を含むディッシュにPAC発現HEK細胞を添加した。インキュベータ内に2時間静置後、HEK細胞の生着を確認した。HEK細胞と心筋細胞は、細胞の大きさ及び形状が異なるため、明視野観察で判別が可能であった。明視野像中、HEK細胞はひし形であり、心筋細胞に比べて小さく見えた。両細胞が互いに接着していることを確認し、これらの細胞に強度266μmol/m2/sの光を照射した。PAC非発現心筋細胞の光照射前後のカルシウム指示薬の蛍光強度を図5に示す。拍動速度は光照射に伴い高まっていた。この結果から、心筋細胞がPACを発現していなくても、PACを発現する他種細胞の添加により、心筋細胞の拍動の光制御が可能であることが明らかとなった。なお、図5中、光照射中に蛍光強度のバックグラウンドが高くなっているのは、カルシウム指示薬の蛍光とともに光源からの光を直接検出したためである。
PAC非発現心筋細胞を含むディッシュに、1×105個又は5×105個のPAC発現HEK細胞を添加し、実施例3と同様にしてPAC非発現心筋細胞の拍動の変化を調べた。1×105個のPAC発現HEK細胞を添加した場合、光照射前は33ビート/分であった拍動速度が光照射直後には36ビート/分に上昇し、光照射から5分以内に再び33ビート/分に戻った。5×105個のPAC発現HEK細胞を添加した場合、光照射前は63ビート/分であった拍動速度が光照射直後には69ビート/分に上昇し、光照射から7分以内に再び63ビート/分に戻った。これらの結果から、添加するPAC発現細胞の量を変えることによって、心筋細胞の拍動を分単位で制御することができることが示唆された。
PAC非発現心筋細胞を含むディッシュに、1×105個のPAC発現NHDFを添加し、実施例3と同様にしてPAC非発現心筋細胞の拍動の変化を調べた。光照射前は42ビート/分であった拍動速度が光照射直後には45ビート/分に上昇し、光照射から3分以内に再び42ビート/分に戻った。
<実施例6>
心筋細胞(製品名:iCell心筋細胞2.0-01434、製品コード:CMC-100-012-000.5、フジフイルム セルラー ダイナミクス社)を製造元のプロトコルに従って溶解し、5μg/mLのフィブロネクチンでコートしたディッシュに1.6×105細胞/cm2の密度で播種した。培地として、iCell心筋細胞解凍用培地(製品コード:M1001、製造元:フジフイルム セルラー ダイナミクス社)及びiCell心筋細胞維持用培地(製品コード:M1003、製造元:フジフイルム セルラー ダイナミクス社)を用いた。細胞の播種から2日後にAAVベクター(力価:1×1010VP/mL)を用いてPAC遺伝子及びlifeact-Rudolph RFP遺伝子を、又はlifeact-Rudolph RFP遺伝子のみを心筋細胞に導入した。lifeact-Rudolph RFPは、アクチンフィラメントに結合するペプチドlifeactとRudolph RFPとの融合タンパク質であり、筋原線維の蛍光可視化に用いた。AAVの添加から2日後に、AAVを含まない心筋細胞維持培地で培地を交換し、青色光をディッジュの下から細胞に照射しながら細胞を培養した。光照射の詳細は次のとおりである。
光源:ピーク波長450nmのLED(品番:LXML-PR01-0425、ルクシオン・レベル、フィリップス・ルミレッズ社)
光の強度:1.3μmol/m2/s
照射周期:15分(15分の点灯と15分の消灯の繰り返し)
照射期間:6日間
心筋細胞の拍動を、試験例1と同様に、カルシウム指示薬を用いてカルシウムイオン濃度の変化を捉えることにより観察した。光照射により、PAC発現心筋細胞の拍動周期は、照射開始時は2Hzに、照射期間の最終日は0.5Hzに維持されていた。
Claims (7)
- 心筋細胞の拍動を変化させる方法であって、
光活性化アデニル酸シクラーゼ遺伝子を有する改変細胞を心筋細胞に接触させる工程と、
心筋細胞と接触している改変細胞に光を照射して、cAMPを改変細胞内で産生させる工程と、備え、
心筋細胞の拍動は、改変細胞内のcAMP濃度に応じて変化する、方法。 - 改変細胞が、光活性化アデニル酸シクラーゼ遺伝子を導入した、ヒト胎児腎臓細胞又はヒト新生児皮膚線維芽細胞を含む、請求項1に記載の方法。
- 光が、350nm~500nmの波長を有する光を含む、請求項1又は2に記載の方法。
- 心筋細胞を成熟させる方法であって、
心筋細胞に光活性化アデニル酸シクラーゼ遺伝子を導入する工程と、
光活性化アデニル酸シクラーゼ遺伝子が導入された心筋細胞を、該心筋細胞に光を照射しながら培養する工程と、を備える、方法。 - 光が、350nm~500nmの波長を有する光を含む、請求項4に記載の方法。
- 光の照射が、心筋細胞の拍動周期が0.5Hz~5Hzに維持されるように行われる、請求項4又は5に記載の方法。
- 心筋細胞が幹細胞に由来する、請求項4~6のいずれか一項に記載の方法。
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