JP7388787B2 - 質量分析フローサイトメトリーにより血液腫瘍の免疫表現型検査を行うための抗体組み合わせ - Google Patents
質量分析フローサイトメトリーにより血液腫瘍の免疫表現型検査を行うための抗体組み合わせ Download PDFInfo
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Description
本発明の第一の態様は、質量分析フロー式血液腫瘍の免疫表現型検査における側方散乱光信号を代替する抗体組み合わせを提供する。上記抗体の組み合わせはLactoferrin(ラクトフェリン)抗体とLysozyme(リゾチーム)抗体であり、Lactoferrin抗体とLysozyme抗体はそれぞれ金属タグを有し、Lactoferrin抗体とLysozyme抗体が有する金属タグは異なる。
さらに、以下のステップを含む:
(1)成熟顆粒球亜集団、単球亜集団、及び他の細胞亜集団は、Lactoferrin抗体及びLysozyme抗体によって区別される。
(2)他の細胞亜集団は、原始及び幼若細胞亜集団および/または異常細胞亜集団、有核赤血球亜集団およびリンパ球亜集団を含み、さらにCD45抗体により区別される。
(3)血液腫瘍免疫表現型検査に一般的に使用される他の抗体による関連亜集団の抗原発現を分析し、関連亜集団の抗原に異常発現が存在するかどうかを判断する。
そのうち、Lactoferrin抗体、Lysozyme抗体、CD45抗体、血液腫瘍免疫表現型検査に一般的に使用される他の抗体はそれぞれ金属タグを付け、各抗体が付ける金属タグは異なる。
(1)成熟顆粒球亜集団、単球亜集団、及び他の細胞亜集団は、Lactoferrin抗体及びLysozyme抗体によって区別される。
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(3)血液腫瘍免疫表現型検査に一般的に使用される他の抗体による関連亜集団の抗原発現を分析し、関連亜集団の抗原に異常発現が存在するかどうかを判断する。
そのうち、Lactoferrin抗体、Lysozyme抗体、CD45抗体、血液腫瘍免疫表現型検査に一般的に使用される他の抗体はそれぞれ金属タグを付け、各抗体が付ける金属タグは異なる。
ここで、番号1、3、12、14、17、23、26、34、38は細胞内抗体であり、その他は細胞外抗体である。
さらに、以下のステップを含む:
(1)骨髄試料に前処理を行い、骨髄試料中の成熟赤血球を除去する。
(2)質量分析フローサイトメーターにより骨髄試料中の43個の抗体に対応する抗原の発現存在量を検出する。
(3)骨髄試料における43個の抗体に対応する抗原の発現存在量に基づき、フローサイトメトリー解析用ソフトウェアを用いて分析し、上記フローサイトメトリー解析用ソフトウェアはFlowjo解析用ソフトウェアを含み、具体的には以下のとおりである:
(3.1)成熟顆粒球亜集団、単球亜集団、及び他の細胞亜集団は、Lactoferrin抗体及びLysozyme抗体によって区別される。
(3.2)他の細胞亜集団は、原始及び幼若細胞亜集団および/または異常細胞亜集団、有核赤血球亜集団およびリンパ球亜集団を含み、さらにCD45抗体により区別される。
(3.3)他の抗体による関連亜集団の抗原発現を分析し、関連亜集団の抗原に異常発現が存在するかどうかを判断する。
2、本発明は、質量分析フロー式血液腫瘍の免疫表現型検査のゲーティング方法を提供する。まず成熟顆粒球亜集団、単球亜集団、及び他の細胞亜集団は、Lactoferrin抗体及びLysozyme抗体によって区別されており、そして、他の細胞亜集団は、原始及び幼若細胞亜集団および/または異常細胞亜集団、有核赤血球亜集団およびリンパ球亜集団を含み、さらにCD45抗体により区別されており、続いて血液腫瘍免疫表現型検査に一般的に使用される他の抗体による関連亜集団の抗原発現を分析し、関連亜集団の抗原に異常発現が存在するかどうかを判断し、質量分析フロー式の血液腫瘍に対する免疫表現型検査を実現する。本発明は初めてLactoferrin抗体とLysozyme抗体を採用し、且つCD45抗体を結合して二段階ゲーティングを行い、質量分析フローサイトメーターと組み合わせて、従来のフロー式のCD45/SSCの骨髄における成熟顆粒球亜集団、単球亜集団、有核赤血球亜集団、リンパ球亜集団、原始及び幼若細胞亜集団、異常細胞亜集団等の各亜集団に対する区別を代替することができる。質量分析フロー式が血液腫瘍細胞分析においてSSCを検出できないという技術的難題を克服し、質量分析フロー式のマルチパラメータ・ハイスループットの特性を結合し、現在の血液腫瘍の免疫表現型検査の深さを向上させることができ、臨床医が従来のフロー式モードで血液腫瘍を分析しやすい。
3、本発明は、質量分析フロー式血液腫瘍の免疫表現型検査のキットを提供し、43種類の金属タグ付きのモノクローナル抗体で構成される。本発明のキットは質量分析フロー式が血液腫瘍細胞分析においてSSCを検出できないという技術的難題を克服し、質量分析フロー式が血液腫瘍細胞に対する正確なタイピングを実現する。単一の血液腫瘍細胞に同時に43個のタンパク質マーカーを検出することができ、検出の感度、正確性及び経済性を向上させる。本発明のキットは単管検出をテストすることによって従来のフローサイトメーターが8-10本を用いて検出することによって実現できる効果を実現できる。血液腫瘍関連免疫表現型分析の範囲及び能力を拡大する。各チャネル単一染色対照を必要とせず、蛍光補償を調整する必要がなく、実験操作ステップ及びサンプル量需要を減少させ、血液腫瘍免疫表現型検査のインテリジェント化及び自動化をさらに実現するために基礎を定める。本発明の試薬キットを利用し、且つ質量分析フローサイトメーターの補助を借り、血液腫瘍細胞の種類・性質を迅速且つ正確に分析し、陽性細胞のレベルを判断することができ、予後予測及び臨床治療手段の作成に重要な指導意義を有する。同時に検査サンプルを節約し、単一細胞に対してより多くのマーカーを同時に検出することができ、血液腫瘍の研究により多くの豊富な資料を提供した。
4、本発明の抗体組み合わせ、ゲーティング方法及びキットを利用し、質量分析フロー式を血液腫瘍免疫表現型検査の標準化、正規化、自動化及びインテリジェント化に応用することに有利である。
表1
ここで、番号1、3、12、14、17、23、26、34、38のcCD3、cIgM、MPO、Lambda、Lactoferrin、Kappa、Lysozyme、CD79a、TdT抗体は細胞内抗体であり、他は細胞外抗体である。
健康なヒトの骨髄細胞の免疫表現型検査である。
1)、健康なヒトの新鮮な骨髄を準備し、成熟赤血球を除去する。
2)、1-3×10^6個の細胞を取り、PBSで再懸濁し、体積を1mLに調節し、50μl-1mLの194Pt(0.1-1μM)を加え、室温で2分間染色し、細胞の死活を区別する。
3)、2mLのウシ血清アルブミン溶液(ウシ血清アルブミン375~625質量部、アジ化ナトリウム15~25質量部、リン酸緩衝液75~125容量部を含む)を加え、500g/5分間で遠心分離し、上清を吸引除去し、50μLのブロッキング液を加え、氷上で20分間ブロッキングする。そのうち、ブロッキング溶液は、0.5μLのヒト免疫グロブリン溶液(ヒト免疫グロブリン15~25質量部、アジ化ナトリウム0.15~0.25質量部、リン酸緩衝液0.75~1.25容量部を含む)、0.5μLのマウス免疫グロブリン溶液(マウス免疫グロブリン15~25質量部、アジ化ナトリウム0.15~0.25質量部、リン酸緩衝液0.75~1.25容量部を含む)、0.5μLのラット免疫グロブリン溶液(ラット免疫グロブリン15~25質量部、アジ化ナトリウム0.15~0.25質量部、リン酸緩衝液0.75~1.25容量部を含む)、0.5μLのハムスター免疫グロブリン溶液(ハムスター免疫グロブリン15~25質量部、アジ化ナトリウム0.15~0.25質量部、リン酸緩衝液0.75~1.25容量部を含む)、及び48μLのウシ血清アルブミン溶液(ウシ血清アルブミン375~625質量部、アジ化ナトリウム15~25質量部、リン酸緩衝液75~125容量部を含む)からなる。
4)、50μLの細胞外抗体混合液(表1において34種類の細胞外抗体はそれぞれ0.5μl、各抗体濃度は0.1-1μg/μL、及びウシ血清アルブミン溶液(ウシ血清アルブミン375~625質量部、アジ化ナトリウム15~25質量部、リン酸緩衝液75~125容量部を含む)33μl)を加え、細胞を再懸濁し、氷上で30分間染色する。
5)、2mLのウシ血清アルブミン溶液(ウシ血清アルブミン375~625質量部、アジ化ナトリウム15~25質量部、リン酸緩衝液75~125容量部を含む)を添加し、500g/5分間で遠心分離し、上清を吸引除去し、0.5v/v‰の単細胞指示薬191/193Irを含む固定-破膜溶液1mlを添加し、細胞を再懸濁し、4℃で一晩放置する。
6)、2mLのウシ血清アルブミン溶液(ウシ血清アルブミン375~625質量部、アジ化ナトリウム15~25質量部、リン酸緩衝液75~125容量部を含む)を加え、800g/5分間で遠心分離し、上清を吸引除去する。対照群に50μLの固定-破膜溶液を加えてブランク対照とし、実験群に50μLの細胞内抗体混合液(表1において9種類の細胞内抗体はそれぞれ0.5μl、各抗体濃度は0.1-1μg/μL、及びウシ血清アルブミン溶液(ウシ血清アルブミン375~625質量部、アジ化ナトリウム15~25質量部、リン酸緩衝液75~125容量部を含む)45.5μl)を加え、細胞を再懸濁し、氷上で30分間放置する。
7)、2mLのウシ血清アルブミン溶液(ウシ血清アルブミン375~625質量部、アジ化ナトリウム15~25質量部、リン酸緩衝液75~125容量部を含む)を加え、800g/5分間で遠心分離し、上清を吸引除去する。
8)、2mLのウシ血清アルブミン溶液(ウシ血清アルブミン375~625質量部、アジ化ナトリウム15~25質量部、リン酸緩衝液75~125容量部を含む)を加え、800g/5分間で遠心分離し、上清を吸引除去する。
9)、2mLの脱イオン水を加え、800g/5分間で遠心分離し、上清を吸引除去する。
10)、2mLの脱イオン水を加え、800g/5分間で遠心分離し、上清を吸引除去する。
11)、サンプルを濾過し、細胞を計数し、体積を調整し、オンマシンに準備し、質量分析フロー式検出を行う。
分析結果は図1Aに示すように、lysozymeとLactoferrinを用いて作図し、当該骨髄サンプルは三群に分けられ、そのうちlactoferrin+とLysozyme+の細胞集団は成熟顆粒球亜集団であり、成熟顆粒球マーカーのCD33と、CD11bと、CD15とを発現する(図1B、図1C)。Lactoferrinは中程度の強度であり、Lysozyme+の細胞集団は単球亜集団であり、単球マーカーのCD14と、CD64とを発現する(図1D)。LactoferrinおよびLysozymeの低発現細胞集団は、有核赤血球亜集団およびリンパ球亜集団である。図1Eに示すように、LactoferrinおよびLysozymeが低発現する細胞集団にCD45を用いて次の段階のゲーティングを行い、CD45+のリンパ球亜集団およびCD45-の有核赤血球亜集団を得る。図1Fに示すように、CD19およびCD3を用いてCD45+リンパ球を群分け、CD3+CD19-のT細胞(図1H)、CD3-CD19+のB細胞(図1G)、およびCD3-CD19-のNK細胞(図1I)を得る。
急性リンパ芽球性白血病患者の骨髄細胞の免疫表現型検査である。
1)、急性リンパ芽球性白血病患者の新鮮な骨髄を準備し、成熟赤血球を除去する。
2)、1-3×10^6個の細胞を取り、PBSで再懸濁し、体積を1mLに調節し、50μl-1mLの194Pt(0.1-1μM)を加え、室温で2分間染色し、細胞の死活を区別する。
3)、2mLのウシ血清アルブミン溶液(ウシ血清アルブミン375~625質量部、アジ化ナトリウム15~25質量部、リン酸緩衝液75~125容量部を含む)を加え、500g/5分間で遠心分離し、上清を吸引除去し、50μLのブロッキング液を加え、氷上で20分間ブロッキングする。そのうち、ブロッキング溶液は、0.5μLのヒト免疫グロブリン溶液(ヒト免疫グロブリン15~25質量部、アジ化ナトリウム0.15~0.25質量部、リン酸緩衝液0.75~1.25容量部を含む)、0.5μLのマウス免疫グロブリン溶液(マウス免疫グロブリン15~25質量部、アジ化ナトリウム0.15~0.25質量部、リン酸緩衝液0.75~1.25容量部を含む)、0.5μLのラット免疫グロブリン溶液(ラット免疫グロブリン15~25質量部、アジ化ナトリウム0.15~0.25質量部、リン酸緩衝液0.75~1.25容量部を含む)、0.5μLのハムスター免疫グロブリン溶液(ハムスター免疫グロブリン15~25質量部、アジ化ナトリウム0.15~0.25質量部、リン酸緩衝液0.75~1.25容量部を含む)、及び48μLのウシ血清アルブミン溶液(ウシ血清アルブミン375~625質量部、アジ化ナトリウム15~25質量部、リン酸緩衝液75~125容量部を含む)からなる。
4)、50μLの細胞外抗体混合液(表1において34種類の細胞外抗体はそれぞれ0.5μl、各抗体濃度は0.1-1μg/μL、及びウシ血清アルブミン溶液(ウシ血清アルブミン375~625質量部、アジ化ナトリウム15~25質量部、リン酸緩衝液75~125容量部を含む)33μl)を加え、細胞を再懸濁し、氷上で30分間染色する。
5)、2mLのウシ血清アルブミン溶液(ウシ血清アルブミン375~625質量部、アジ化ナトリウム15~25質量部、リン酸緩衝液75~125容量部を含む)を添加し、500g/5分間で遠心分離し、上清を吸引除去し、0.5v/v‰の単細胞指示薬191/193Irを含む固定-破膜溶液1mlを添加し、細胞を再懸濁し、4℃で一晩放置する。
6)、2mLのウシ血清アルブミン溶液(ウシ血清アルブミン375~625質量部、アジ化ナトリウム15~25質量部、リン酸緩衝液75~125容量部を含む)を加え、800g/5分間で遠心分離し、上清を吸引除去する。対照群に50μLの固定-破膜溶液を加えてブランク対照とし、実験群に50μLの細胞内抗体混合液(表1において9種類の細胞内抗体はそれぞれ0.5μl、各抗体濃度は0.1-1μg/μL、及びウシ血清アルブミン溶液(ウシ血清アルブミン375~625質量部、アジ化ナトリウム15~25質量部、リン酸緩衝液75~125容量部を含む)45.5μl)を加え、細胞を再懸濁し、氷上で30分間放置する。
7)、2mLのウシ血清アルブミン溶液(ウシ血清アルブミン375~625質量部、アジ化ナトリウム15~25質量部、リン酸緩衝液75~125容量部を含む)を加え、800g/5分間で遠心分離し、上清を吸引除去する。
8)、2mLのウシ血清アルブミン溶液(ウシ血清アルブミン375~625質量部、アジ化ナトリウム15~25質量部、リン酸緩衝液75~125容量部を含む)を加え、800g/5分間で遠心分離し、上清を吸引除去する。
9)、2mLの脱イオン水を加え、800g/5分間で遠心分離し、上清を吸引除去する。
10)、2mLの脱イオン水を加え、800g/5分間で遠心分離し、上清を吸引除去する。
11)、サンプルを濾過し、細胞を計数し、体積を調整し、オンマシンに準備し、質量分析フロー式検出を行う。
分析結果は図2Aに示すように、lysozymeとLactoferrinを用いて作図し、当該骨髄サンプルは三群に分けられ、そのうちlactoferrin+とLysozyme+の細胞集団は成熟顆粒球亜集団(図2B、図2C)である。Lactoferrinは中程度の強度であり、Lysozyme+の細胞集団は単球亜集団(図2D)である。LactoferrinおよびLysozymeの低発現細胞集団は、異常細胞亜集団およびリンパ球亜集団である。図2Eに示すように、LactoferrinおよびLysozymeが低発現する細胞集団にCD45を用いて次の段階のゲーティングを行い、CD45+のリンパ球亜集団(図2F)およびCD45弱陽性の異常細胞亜集団を得る。当該異常細胞はCD34と、CD117と、HLA-DRと、CD19とを発現する(図2G、図2H、図2I)。
急性骨髄性白血病患者の骨髄細胞の免疫表現型検査である。
1)、急性骨髄性白血病患者の新鮮な骨髄を準備し、成熟赤血球を除去する。
2)、1-3×10^6個の細胞を取り、PBSで再懸濁し、体積を1mLに調節し、50μl-1mLの194Pt(0.1-1μM)を加え、室温で2分間染色し、細胞の死活を区別する。
3)、2mLのウシ血清アルブミン溶液(ウシ血清アルブミン375~625質量部、アジ化ナトリウム15~25質量部、リン酸緩衝液75~125容量部を含む)を加え、500g/5分間で遠心分離し、上清を吸引除去し、50μLのブロッキング液を加え、氷上で20分間ブロッキングする。そのうち、ブロッキング溶液は、0.5μLのヒト免疫グロブリン溶液(ヒト免疫グロブリン15~25質量部、アジ化ナトリウム0.15~0.25質量部、リン酸緩衝液0.75~1.25容量部を含む)、0.5μLのマウス免疫グロブリン溶液(マウス免疫グロブリン15~25質量部、アジ化ナトリウム0.15~0.25質量部、リン酸緩衝液0.75~1.25容量部を含む)、0.5μLのラット免疫グロブリン溶液(ラット免疫グロブリン15~25質量部、アジ化ナトリウム0.15~0.25質量部、リン酸緩衝液0.75~1.25容量部を含む)、0.5μLのハムスター免疫グロブリン溶液(ハムスター免疫グロブリン15~25質量部、アジ化ナトリウム0.15~0.25質量部、リン酸緩衝液0.75~1.25容量部を含む)、及び48μLのウシ血清アルブミン溶液(ウシ血清アルブミン375~625質量部、アジ化ナトリウム15~25質量部、リン酸緩衝液75~125容量部を含む)からなる。
4)、50μLの細胞外抗体混合液(表1において34種類の細胞外抗体はそれぞれ0.5μl、各抗体濃度は0.1-1μg/μL、及びウシ血清アルブミン溶液(ウシ血清アルブミン375~625質量部、アジ化ナトリウム15~25質量部、リン酸緩衝液75~125容量部を含む)33μl)を加え、細胞を再懸濁し、氷上で30分間染色する。
5)、2mLのウシ血清アルブミン溶液(ウシ血清アルブミン375~625質量部、アジ化ナトリウム15~25質量部、リン酸緩衝液75~125容量部を含む)を添加し、500g/5分間で遠心分離し、上清を吸引除去し、0.5v/v‰の単細胞指示薬191/193Irを含む固定-破膜溶液1mlを添加し、細胞を再懸濁し、4℃で一晩放置する。
6)、2mLのウシ血清アルブミン溶液(ウシ血清アルブミン375~625質量部、アジ化ナトリウム15~25質量部、リン酸緩衝液75~125容量部を含む)を加え、800g/5分間で遠心分離し、上清を吸引除去する。対照群に50μLの固定-破膜溶液を加えてブランク対照とし、実験群に50μLの細胞内抗体混合液(表1において9種類の細胞内抗体はそれぞれ0.5μl、各抗体濃度は0.1-1μg/μL、及びウシ血清アルブミン溶液(ウシ血清アルブミン375~625質量部、アジ化ナトリウム15~25質量部、リン酸緩衝液75~125容量部を含む)45.5μl)を加え、細胞を再懸濁し、氷上で30分間放置する。
7)、2mLのウシ血清アルブミン溶液(ウシ血清アルブミン375~625質量部、アジ化ナトリウム15~25質量部、リン酸緩衝液75~125容量部を含む)を加え、800g/5分間で遠心分離し、上清を吸引除去する。
8)、2mLのウシ血清アルブミン溶液(ウシ血清アルブミン375~625質量部、アジ化ナトリウム15~25質量部、リン酸緩衝液75~125容量部を含む)を加え、800g/5分間で遠心分離し、上清を吸引除去する。
9)、2mLの脱イオン水を加え、800g/5分間で遠心分離し、上清を吸引除去する。
10)、2mLの脱イオン水を加え、800g/5分間で遠心分離し、上清を吸引除去する。
11)、サンプルを濾過し、細胞を計数し、体積を調整し、オンマシンに準備し、質量分析フロー式検出を行う。
分析結果は図3Aに示すように、lysozymeとLactoferrinを用いて作図し、当該骨髄サンプルは三群に分けられ、そのうちlactoferrin+とLysozyme+の細胞集団は成熟顆粒球亜集団(図3B、図3C)である。Lactoferrinは中程度の強度であり、Lysozyme+の細胞集団は単球亜集団(図3D)である。LactoferrinおよびLysozymeの低発現細胞集団は、有核赤血球亜集団、異常細胞亜集団およびリンパ球亜集団である。図3Eに示すように、LactoferrinおよびLysozymeが低発現する細胞集団にCD45を用いて次の段階のゲーティングを行い、CD45+のリンパ球亜集団(図3G)、CD45弱陽性の異常細胞亜集団、及びCD45陰性の有核赤血球亜集団(図3F)を得る。当該異常細胞はCD34と、CD117と、HLA-DRと、CD33と、CD13と、CD123とを発現する。(図3H、図3I、図3J、図3K、図3L、図3M)
骨髄異形成症候群(MDS)患者の骨髄細胞の免疫表現型検査である。
1)、骨髄異形成症候群患者の新鮮な骨髄を準備し、成熟赤血球を除去する。
2)、1-3×10^6個の細胞を取り、PBSで再懸濁し、体積を1mLに調節し、50μl-1mLの194Pt(0.1-1μM)を加え、室温で2分間染色し、細胞の死活を区別する。
3)、2mLのウシ血清アルブミン溶液(ウシ血清アルブミン375~625質量部、アジ化ナトリウム15~25質量部、リン酸緩衝液75~125容量部を含む)を加え、500g/5分間で遠心分離し、上清を吸引除去し、50μLのブロッキング液を加え、氷上で20分間ブロッキングする。そのうち、ブロッキング溶液は、0.5μLのヒト免疫グロブリン溶液(ヒト免疫グロブリン15~25質量部、アジ化ナトリウム0.15~0.25質量部、リン酸緩衝液0.75~1.25容量部を含む)、0.5μLのマウス免疫グロブリン溶液(マウス免疫グロブリン15~25質量部、アジ化ナトリウム0.15~0.25質量部、リン酸緩衝液0.75~1.25容量部を含む)、0.5μLのラット免疫グロブリン溶液(ラット免疫グロブリン15~25質量部、アジ化ナトリウム0.15~0.25質量部、リン酸緩衝液0.75~1.25容量部を含む)、0.5μLのハムスター免疫グロブリン溶液(ハムスター免疫グロブリン15~25質量部、アジ化ナトリウム0.15~0.25質量部、リン酸緩衝液0.75~1.25容量部を含む)、及び48μLのウシ血清アルブミン溶液(ウシ血清アルブミン375~625質量部、アジ化ナトリウム15~25質量部、リン酸緩衝液75~125容量部を含む)からなる。
4)、50μLの細胞外抗体混合液(表1において34種類の細胞外抗体はそれぞれ0.5μl、各抗体濃度は0.1-1μg/μL、及びウシ血清アルブミン溶液(ウシ血清アルブミン375~625質量部、アジ化ナトリウム15~25質量部、リン酸緩衝液75~125容量部を含む)33μl)を加え、細胞を再懸濁し、氷上で30分間染色する。
5)、2mLのウシ血清アルブミン溶液(ウシ血清アルブミン375~625質量部、アジ化ナトリウム15~25質量部、リン酸緩衝液75~125容量部を含む)を添加し、500g/5分間で遠心分離し、上清を吸引除去し、0.5v/v‰の単細胞指示薬191/193Irを含む固定-破膜溶液1mlを添加し、細胞を再懸濁し、4℃で一晩放置する。
6)、2mLのウシ血清アルブミン溶液(ウシ血清アルブミン375~625質量部、アジ化ナトリウム15~25質量部、リン酸緩衝液75~125容量部を含む)を加え、800g/5分間で遠心分離し、上清を吸引除去する。対照群に50μLの固定-破膜溶液を加えてブランク対照とし、実験群に50μLの細胞内抗体混合液(表1において9種類の細胞内抗体はそれぞれ0.5μl、各抗体濃度は0.1-1μg/μL、及びウシ血清アルブミン溶液(ウシ血清アルブミン375~625質量部、アジ化ナトリウム15~25質量部、リン酸緩衝液75~125容量部を含む)45.5μl)を加え、細胞を再懸濁し、氷上で30分間放置する。
7)、2mLのウシ血清アルブミン溶液(ウシ血清アルブミン375~625質量部、アジ化ナトリウム15~25質量部、リン酸緩衝液75~125容量部を含む)を加え、800g/5分間で遠心分離し、上清を吸引除去する。
8)、2mLのウシ血清アルブミン溶液(ウシ血清アルブミン375~625質量部、アジ化ナトリウム15~25質量部、リン酸緩衝液75~125容量部を含む)を加え、800g/5分間で遠心分離し、上清を吸引除去する。
9)、2mLの脱イオン水を加え、800g/5分間で遠心分離し、上清を吸引除去する。
10)、2mLの脱イオン水を加え、800g/5分間で遠心分離し、上清を吸引除去する。
11)、サンプルを濾過し、細胞を計数し、体積を調整し、オンマシンに準備し、質量分析フロー式検出を行う。
分析結果は図4Aに示すように、lysozymeとLactoferrinを用いて作図し、当該骨髄サンプルは三群に分けられ、そのうちlactoferrin+とLysozyme+の細胞集団は成熟顆粒球亜集団(図4B、図4C)である。Lactoferrinは中程度の強度であり、Lysozyme+の細胞集団は単球亜集団(図4D)である。LactoferrinおよびLysozymeの低発現細胞集団は、異常細胞亜集団およびリンパ球亜集団である。図4Eに示すように、LactoferrinおよびLysozymeが低発現する細胞集団にCD45を用いて次の段階のゲーティングを行い、CD45+のリンパ球亜集団(図4F、図4G)、及びCD45弱陽性の異常細胞亜集団を得る。当該異常細胞はCD33と、CD15と、CD13と、CD11bと、CD19と、CD64とを発現する(図4H、図4I、図4J、図4K、図4L)。
多発性骨髄腫患者の骨髄細胞の免疫表現型検査である。
1)、多発性骨髄腫患者の新鮮な骨髄を準備し、成熟赤血球を除去する。
2)、1-3×10^6個の細胞を取り、PBSで再懸濁し、体積を1mLに調節し、50μl-1mLの194Pt(0.1-1μM)を加え、室温で2分間染色し、細胞の死活を区別する。
3)、2mLのウシ血清アルブミン溶液(ウシ血清アルブミン375~625質量部、アジ化ナトリウム15~25質量部、リン酸緩衝液75~125容量部を含む)を加え、500g/5分間で遠心分離し、上清を吸引除去し、50μLのブロッキング液を加え、氷上で20分間ブロッキングする。そのうち、ブロッキング溶液は、0.5μLのヒト免疫グロブリン溶液(ヒト免疫グロブリン15~25質量部、アジ化ナトリウム0.15~0.25質量部、リン酸緩衝液0.75~1.25容量部を含む)、0.5μLのマウス免疫グロブリン溶液(マウス免疫グロブリン15~25質量部、アジ化ナトリウム0.15~0.25質量部、リン酸緩衝液0.75~1.25容量部を含む)、0.5μLのラット免疫グロブリン溶液(ラット免疫グロブリン15~25質量部、アジ化ナトリウム0.15~0.25質量部、リン酸緩衝液0.75~1.25容量部を含む)、0.5μLのハムスター免疫グロブリン溶液(ハムスター免疫グロブリン15~25質量部、アジ化ナトリウム0.15~0.25質量部、リン酸緩衝液0.75~1.25容量部を含む)、及び48μLのウシ血清アルブミン溶液(ウシ血清アルブミン375~625質量部、アジ化ナトリウム15~25質量部、リン酸緩衝液75~125容量部を含む)からなる。
4)、50μLの細胞外抗体混合液(表1において34種類の細胞外抗体はそれぞれ0.5μl、各抗体濃度は0.1-1μg/μL、及びウシ血清アルブミン溶液(ウシ血清アルブミン375~625質量部、アジ化ナトリウム15~25質量部、リン酸緩衝液75~125容量部を含む)33μl)を加え、細胞を再懸濁し、氷上で30分間染色する。
5)、2mLのウシ血清アルブミン溶液(ウシ血清アルブミン375~625質量部、アジ化ナトリウム15~25質量部、リン酸緩衝液75~125容量部を含む)を添加し、500g/5分間で遠心分離し、上清を吸引除去し、0.5v/v‰の単細胞指示薬191/193Irを含む固定-破膜溶液1mlを添加し、細胞を再懸濁し、4℃で一晩放置する。
6)、2mLのウシ血清アルブミン溶液(ウシ血清アルブミン375~625質量部、アジ化ナトリウム15~25質量部、リン酸緩衝液75~125容量部を含む)を加え、800g/5分間で遠心分離し、上清を吸引除去する。対照群に50μLの固定-破膜溶液を加えてブランク対照とし、実験群に50μLの細胞内抗体混合液(表1において9種類の細胞内抗体はそれぞれ0.5μl、各抗体濃度は0.1-1μg/μL、及びウシ血清アルブミン溶液(ウシ血清アルブミン375~625質量部、アジ化ナトリウム15~25質量部、リン酸緩衝液75~125容量部を含む)45.5μl)を加え、細胞を再懸濁し、氷上で30分間放置する。
7)、2mLのウシ血清アルブミン溶液(ウシ血清アルブミン375~625質量部、アジ化ナトリウム15~25質量部、リン酸緩衝液75~125容量部を含む)を加え、800g/5分間で遠心分離し、上清を吸引除去する。
8)、2mLのウシ血清アルブミン溶液(ウシ血清アルブミン375~625質量部、アジ化ナトリウム15~25質量部、リン酸緩衝液75~125容量部を含む)を加え、800g/5分間で遠心分離し、上清を吸引除去する。
9)、2mLの脱イオン水を加え、800g/5分間で遠心分離し、上清を吸引除去する。
10)、2mLの脱イオン水を加え、800g/5分間で遠心分離し、上清を吸引除去する。
11)、サンプルを濾過し、細胞を計数し、体積を調整し、オンマシンに準備し、質量分析フロー式検出を行う。
分析結果は図5Aに示すように、lysozymeとLactoferrinを用いて作図し、当該骨髄サンプルは三群に分けられ、そのうちlactoferrin+とLysozyme+の細胞集団は成熟顆粒球亜集団(図5B、図5C)である。Lactoferrinは中程度の強度であり、Lysozyme+の細胞集団は単球亜集団(図5D)である。LactoferrinおよびLysozymeの低発現細胞集団は、異常細胞亜集団およびリンパ球亜集団である。図5Eに示すように、LactoferrinおよびLysozymeが低発現する細胞集団にCD45を用いて次の段階のゲーティングを行い、CD45+のリンパ球亜集団(図5F、図5G)、及びCD45陰性の異常細胞亜集団を得る。当該異常細胞は、CD38と、CD138と、Kappaと、CD20とを発現する。一方、CD56、CD45は陰性である(図5H、図5I、図5J、図5K、図5L、図5M)。
Claims (2)
- それぞれ異なる金属タグを有するLactoferrin抗体とLysozyme抗体組み合わせであって、質量分析フローサイトメトリーにより血液腫瘍の免疫表現型検査を行うためのものであり、
質量分析フローサイトメトリーによる血液腫瘍の免疫表現型検査は、以下のステップを含み、
(1)成熟顆粒球亜集団、単球亜集団、及び他の細胞亜集団は、Lactoferrin抗体及びLysozyme抗体によって区別され、
(2)他の細胞亜集団は、原始及び幼若細胞亜集団および/または異常細胞亜集団、有核赤血球亜集団およびリンパ球亜集団を含み、さらにCD45抗体により区別され、
(3)血液腫瘍免疫表現型検査に一般的に使用される他の抗体により関連亜集団の抗原発現を分析し、関連亜集団の抗原に異常発現が存在するかどうかを判断し、
そのうち、Lactoferrin抗体、Lysozyme抗体、CD45抗体、血液腫瘍免疫表現型検査に一般的に使用される他の抗体はそれぞれ金属タグを有し、各抗体が有する金属タグは異なる、ことを特徴とする抗体組み合わせ。 - 前記金属タグは89Y、115In、139La、141Pr、142Nd、143Nd、144Nd、145Nd、146Nd、147Sm、148Nd、149Sm、150Nd、151Eu、152Sm、153Eu、154Sm、155Gd、156Gd、157Gd、158Gd、159Tb、160Gd、161Dy、162Dy、163Dy、164Dy、165Ho、166Er、167Er、168Er、169Tm、170Er、171Yb、172Yb、173Yb、174Yb、175Lu、176Yb、195Pt、197Au、198Pt、209Biから選択される、ことを特徴とする請求項1に記載の抗体組み合わせ。
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