JP7355828B2

JP7355828B2 - ヒトＬｅｆｔｙＡタンパク質変異体を含む融合タンパク質及びその用途

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Publication number: JP7355828B2
Application number: JP2021536331A
Authority: JP
Inventors: スンヨンチョン; ギョンウイ; スンギムン; ソンジュンカン; ビョンオクチェ; コンカク; ジョンウクチャン; ジョンヒョンキム
Original assignee: Chong Kun Dang Corp; Samsung Life Public Welfare Foundation
Current assignee: Chong Kun Dang Corp; Samsung Life Public Welfare Foundation
Priority date: 2018-12-20
Filing date: 2019-12-17
Publication date: 2023-10-03
Anticipated expiration: 2039-12-17
Also published as: AU2019404719B2; KR20200077436A; AU2019404719A1; CA3124338A1; TW202034940A; EP3898663A1; KR102359127B1; CA3124338C; US20220380424A1; BR112021011898A2; TWI748306B; JP2022514939A; WO2020130594A1; CN113195522A; MX2021007410A; EP3898663A4

Description

本発明は、生産性及び安定性が改善されたヒトＬｅｆｔｙＡタンパク質変異体、前記タンパク質変異体を含む融合タンパク質、及び前記タンパク質変異体又は融合タンパク質を含む神経筋肉疾患の予防及び／又は治療用組成物に関する。

Ｌｅｆｔｙ（ｌｅｆｔ－ｒｉｇｈｔｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｆａｃｔｏｒ）は、転換成長因子（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ）－ベータ（ＴＧＦ－β）上科（ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ）に属し、他のＴＧＦ－βリガンドに結合して胚芽の成長及び生存に決定的役割を担う形態分化因子である（ＳｈｉｒａｔｏｒｉＨａｎｄＨａｍａｄａＨ，ＳｅｍｉｎＣｅｌｌＤｅｖＢｉｏｌ．２０１４；３２：８０－４）。

ヒトＬＥＦＴＹ遺伝子は、独立した重複によって生成された２つの遺伝子（ＬｅｆｔｙＡタンパク質をコードするＬＥＦＴＹ２、及びＬｅｆｔｙＢタンパク質をコードするＬＥＦＴＹ１）を含む（ＧｈａｒｉｂＷＨ，Ｒｏｂｉｎｓｏｎ－ＲｅｃｈａｖｉＭ，ＢｒｉｅｆＢｉｏｉｎｆｏｒｍ．２０１１１２（５）：４３６－４１）。ＬｅｆｔｙＡとＬｅｆｔｙＢは約９６％のアミノ酸配列同一性を有する。

ヒトＬＥＦＴＹ遺伝子は、３６６個のアミノ酸からなるポリペプチドに翻訳され、Ｎ末端の２１個のアミノ酸からなるシグナルペプチドは、小胞体（ＥＲ）への転座中に切断され、最終４２ｋＤａサイズのプロタンパク質形態で細胞外に排出される。生成されたＬｅｆｔｙタンパク質は、そのＮ末端切断部位（ＲＸＸＲ）でプロテアーゼ切断によってプロ配列（ｐｒｏｐｅｐｔｉｄｅ）が除去されることによって加工され得る。Ｌｅｆｔｙタンパク質は、典型的なＴＧＦ－βの他のタンパク質と区別される特徴を有するが、１個ではなく２個の潜在的切断部位（ＲＸＸＲ）を有し、同質二量体の形成に必要なシステインを有していない（Ｊｕａｎｅｔａｌ．ＧｅｎｅｓｔｏＣｅｌｌｓ２００１）。

プロタンパク質転換酵素（ｐｒｏｐｒｏｔｅｉｎｃｏｎｖｅｒｔａｓｅ）のようなプロテアーゼによってＬｅｆｔｙタンパク質の各切断部位の二番目のアルギニンのカルボキシル側でペプチド鎖が切断され、より小さい形態の３４ｋＤａ或いは２８ｋＤａサイズのポリペプチドに加工され得る。一番目の切断部位の２個のアルギニンを両方ともグリシンに変異させたり、或いは二番目の切断部位における一番目のアルギニンをグリシンに変異させた場合、切断が起きないことが報告されている（ＵｌｌｏａＬｅｔａｌ．ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ２００１；２７６：２１７３８７－２１３９６）。

２８ｋＤａの成熟Ｌｅｆｔｙポリペプチドの他に４２ｋＤａのＬｅｆｔｙプロタンパク質も生物学的活性を有しており、特に、細胞内でＭＡＰＫを活性化させることができるものと報告された（ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ２００１；２７６：２１７３８７－２１３９６）。

Ｌｅｆｔｙは、中胚葉及び内胚葉分化誘導と左右非対称性調節など、脊椎動物発達において初期胚芽発達過程で重要な役割を担当するＮｏｄａｌの阻害剤として作用する（ＳｃｈｉｅｒＡＦ，ＡｎｎｕＲｅｖＣｅｌｌＢｉｏｌ２００３１９：５８９－６２１）。ＬｅｆｔｙのＮｏｄａｌ阻害作用機序はまだ不明であるが、ＬｅｆｔｙがＮｏｄａｌと直接結合し、ＮｏｄａｌがＡｃｔＲＩ或いはＡｃｔＲＩＩ及びコレセプター（ｃｏ－ｒｅｃｅｐｔｏｒ）であるＥＧＦ－ＣＦＣと結合することを阻害できることが知られている（Ｂｒａｎｆｏｒｄｅｔａｌ．ＣｕｒｒｅｎｔＢｉｏｌｏｇｙ２００４；Ｃｈｅｎｅｔａｌ．ＣｕｒｒｅｎｔＢｉｏｌｏｇｙ２００４）。その他にも、ＬｅｆｔｙはＴＧＦ－β或いはＢＭＰ信号伝達（ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を阻害するものと報告された（ＵｌｌｏａＬａｎｄＴａｂｉｂｚａｄｅｈＳ２００１２７６（２４）：２１３９７－２１４０４）。

ＢＭＰｓ、ＧＤＦｓ、Ｎｏｄａｌ、ａｃｔｉｖｉｎなどの多数のリガンドがＴＧＦ－β上科に属する。これらは、胚芽発達及び出生後に、多い細胞及び臓器の機能調節に重要な役割を担っている。例えば、ＴＧＦ－βファミリーによる信号伝達は、神経分化においても重要な役割を果たし、胚芽初期から成人に至るまで、中枢神経システムの様々な部分を調節すると知られている（ＭｙｅｒｓＥＡａｎｄＫｅｓｓｌｅｒＪＡ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂＰｅｒｓｐｅｃｔＢｉｏｌ．２０１７９（８））。ＴＧＦ－βは、神経分化過程中にシュワン細胞の生存を阻害する（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎｅｔａｌ．，２００１）。ＢＭＰ７は、末梢神経においてｐ３８を活性化させることによってシュワン細胞の髄鞘化過程を阻害する（ＬｉｕＸｅｔａｌ．，ＳｃｉＲｅｐ６：３１０４９（２０１６））。また、ミオスタチン（ｍｙｏｓｔａｔｉｎ）（ＧＤＦ－８）は筋肉消失条件で過発現して筋肉量を減らすことに寄与するものと知られている（ＥｌｋｉｎａＹｅｔａｌ．ＪＣａｃｈｅｘｉａＳａｒｃｏｐｅｎｉａＭｕｓｃｌｅ２００１２：１４３－１５１）。

遺伝性末梢神経病であるシャルコーマリートゥース（Ｃｈａｒｃｏｔ－Ｍａｉｒｅ－Ｔｏｏｔｈ病、ＣＭＴ）は、遺伝子異常によって運動神経と感覚神経の損傷が起き、腕／脚筋肉の力が弱くなり、感覚消失が発生する疾患である。今まで約８０余個の原因遺伝子が明らかにされた。発病頻度は人口２５００につき１人である希疾患である。

ＣＭＴは、様々な表現型を示しているが、発病位置によってシュワン細胞の異常による脱髄鞘型（１型、ＣＭＴ１）と神経細胞の軸索の異常による軸索型（２型、ＣＭＴ２）とに区別できる。このうち、脱髄鞘型は、全患者の７０％程度を占め、ＰＭＰ２２、ＭＰＺなどのミエリンタンパク質の過発現或いは変異によるミエリンの変性に起因する。また、主要発病機序としては、過発現したタンパク質或いは変異タンパク質が小胞体に蓄積されてストレスを誘導し、これによる細胞死滅が知られている。ＣＭＴに対する治療剤は皆無な状況であり、治療的観点からも大きく関心を集めている。

このような技術的背景下で、本発明者らは、神経病や筋肉疾患治療の目的でＬｅｆｔｙＡタンパク質が使用可能となるようにヒトＬｅｆｔｙＡタンパク質に変異を導入することによって生産性及び安定性が増大した変異体を作製し、本発明を完成するに至った。

本背景技術部分に記載された前記情報は、単に本発明の背景に関する理解を向上させるためのものであり、よって、本発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者にとって既に知られた先行技術を形成する情報を含まなくてもよい。

本発明の目的は、生産性及び安定性が増大したヒトＬｅｆｔｙＡタンパク質変異体を提供することにある。
本発明の他の目的は、前記タンパク質変異体を含む融合タンパク質を提供することにある。

本発明のさらに他の目的は、前記融合タンパク質をコードする核酸分子、前記核酸分子を含む発現ベクター、前記発現ベクターが導入された宿主細胞、前記宿主細胞を用いた融合タンパク質の生産方法を提供することにある。
本発明のさらに他の目的は、前記タンパク質変異体又は融合タンパク質を含む神経筋肉疾患の予防及び／又は治療用組成物を提供することにある。

本発明のさらに他の目的は、前記タンパク質変異体又は融合タンパク質を投与することを特徴とする、神経筋肉疾患の予防方法及び／又は治療方法を提供することにある。
本発明のさらに他の目的は、神経筋肉疾患の予防及び／又は治療のための前記タンパク質変異体又は融合タンパク質の用途を提供することにある。
本発明のさらに他の目的は、神経筋肉疾患治療用薬剤の製造のための前記タンパク質変異体又は融合タンパク質の使用を提供することにある。

上記の目的を達成するために、本発明は、配列番号１３１のアミノ酸配列を有するヒトＬｅｆｔｙＡタンパク質のＬ２２～Ｐ３６６のアミノ酸配列を含み、（１）プロセシング位置（Ｒ７４～Ｒ７７及びＲ１３２～Ｒ１３５）における一つ以上のアミノ酸残基の置換；及び（２）プロペプチド（Ｐｒｏｐｅｐｔｉｄｅ）領域（Ｌ２２～Ｓ７３）における一つ以上のアミノ酸残基の置換；を含むことを特徴とする、ヒトＬｅｆｔｙＡタンパク質変異体を提供する。
本発明はまた、前記ヒトＬｅｆｔｙＡタンパク質変異体を含む融合タンパク質を提供する。

本発明はまた、ヒトＬｅｆｔｙＡタンパク質変異体を含む融合タンパク質をコードする核酸分子、前記核酸分子を含む発現ベクター、前記発現ベクターが導入された宿主細胞及び前記宿主細胞を用いたヒトＬｅｆｔｙＡタンパク質変異体を含む融合タンパク質を生産する方法を提供する。
本発明はまた、前記ヒトＬｅｆｔｙＡタンパク質変異体又はこれを含む融合タンパク質を含む神経筋肉疾患の予防及び／又は治療用組成物を提供する。

本発明はまた、前記ヒトＬｅｆｔｙＡタンパク質変異体又はこれを含む融合タンパク質を個体に投与する段階を含む、神経筋肉疾患の予防及び／又は治療方法を提供する。
本発明はまた、神経筋肉疾患の予防及び／又は治療のための前記ヒトＬｅｆｔｙＡタンパク質変異体又はこれを含む融合タンパク質の用途を提供する。
本発明はまた、神経筋肉疾患治療用薬剤の製造のための前記ヒトＬｅｆｔｙＡタンパク質変異体又はこれを含む融合タンパク質の使用を提供する。

ヒトＬｅｆｔｙＡ融合タンパク質作製のためのベクター模式図である。ウェスタンブロットを用いた、細胞培養液でＨＳＡ融合ヒトＬｅｆｔｙＡタンパク質変異体発現の分析結果を示す。４２ＬＦｃタンパク質をＰｒｏＡ親和性（ＰｒｏＡＡｆｆｉｎｉｔｙ）精製後に、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析した結果を示す。ＬｅｆｔｙＡタンパク質変異体（Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）をＰｒｏＡ親和性精製後に、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びＳＥＣ分析した結果を示す。間葉幹細胞の共同培養が小胞体ストレス環境でシュワン細胞に及ぼす影響に対する結果である。ＣＭＴ疾患マウスＴｒ－Ｊにおいて電気生理学的検査によってヒトＬｅｆｔｙＡ融合タンパク質変異体の治療効能を示す結果である。ヒトＬｅｆｔｙＡ融合タンパク質変異体の機序及び治療効能に対する細胞実験結果である。ヒトＬｅｆｔｙＡ融合タンパク質変異体をＣＭＴ疾患マウスＣ２２に腹腔内投与後、電気生理学的検査を用いた神経機能評価結果である。ヒトＬｅｆｔｙＡ融合タンパク質変異体を腹腔内投与後、野生型とＣＭＴ疾患マウスＣ２２のロータロッド（ｒｏｔａｒｏｄ）とグリップ強度（ｇｒｉｐｓｔｒｅｎｇｔｈ）試験を用いた下肢筋力評価結果である。ヒトＬｅｆｔｙＡ融合タンパク質変異体を腹腔内投与後、磁気共鳴映像分析を用いた野生型とＣＭＴ疾患マウスＣ２２の筋肉量分析結果である。ヒトＬｅｆｔｙＡ融合タンパク質変異体投与後、野生型とＣＭＴ疾患マウスＣ２２の歩きぶり（Ｇａｉｔ）分析結果である。Ｃ２２マウスにおいてヒトＬｅｆｔｙＡ融合タンパク質変異体の電気生理学的検査を用いた治療効能を示す結果である。ヒトＬｅｆｔｙＡ融合タンパク質変異体投与後、ＣＭＴ疾患マウスＣ２２ロータロッド（ｒｏｔａｒｏｄ）とグリップ強度（ｇｒｉｐｓｔｒｅｎｇｔｈ）試験を用いた下肢筋力評価結果である。ヒトＬｅｆｔｙＡ融合タンパク質変異体投与後、ＣＭＴ疾患マウスＣ２２の歩きぶり（Ｇａｉｔ）分析結果である。ヒトＬｅｆｔｙＡ融合タンパク質変異体を３週齢のＣＭＴ疾患マウスＣ２２に皮下投与後、電気生理学的検査を用いた神経機能評価結果である。ヒトＬｅｆｔｙＡ融合タンパク質変異体を３週齢のＣＭＴ疾患マウスＣ２２に皮下投与後、グリップ強度（ｇｒｉｐｓｔｒｅｎｇｔｈ）試験を用いた下肢筋力評価結果である。ヒトＬｅｆｔｙＡ融合タンパク質変異体によるミオスタチン活性阻害能評価結果を示す。Ｃ２２マウスにおいて坐骨神経の髄鞘化関連タンパク質ウェスタンブロット分析結果である。ヒトＬｅｆｔｙＡ融合タンパク質変異体を５週齢のＣＭＴ疾患マウスＣ２２に皮下投与後、電気生理学的検査を用いた神経機能評価結果である。ヒトＬｅｆｔｙＡ融合タンパク質変異体を５週齢のＣＭＴ疾患マウスＣ２２に皮下投与後、ロータロッド（ｒｏｔａｒｏｄ）とグリップ強度（ｇｒｉｐｓｔｒｅｎｇｔｈ）試験を用いた下肢筋力評価結果である。ヒトＬｅｆｔｙＡ融合タンパク質変異体によるＮｏｄａｌ活性阻害能評価結果を示す。本発明に係るヒトＬｅｆｔｙＡ融合タンパク質変異体のアミノ酸配列である。本発明に係るヒトＬｅｆｔｙＡ融合タンパク質変異体のアミノ酸配列である。

別に断りのない限り、本明細書で使われる全ての技術的及び科学的用語は、本発明の属する技術の分野における熟練した専門家によって通常理解されるのと同じ意味を有する。一般に、本明細書における命名法は、本技術分野でよく知られており、通常用いられるものである。

本発明の生産性及び安定性が増加したヒトＬｅｆｔｙＡ（ＵｎｉｐｒｏｔＮｏ．Ｏ００２９２；ＮＣＢＩＤＢＮＭ＿００３２４０）タンパク質変異体を含む融合タンパク質は、野生型及び従来報告されたヒトＬｅｆｔｙＡ変異体に比べて、ＣＨＯ細胞において生産性及び安定性が向上し、またヒトＮｏｄａｌに結合して信号伝達阻害を誘導して末梢神経病関連指標を改善するので、単独で、又は通常の薬剤学的に許容される担体、神経疾患治療剤、筋肉疾患治療剤などと共に、神経病及び筋肉疾患予防又は治療のための組成物として有用に用いることができる。

したがって、本発明は、一観点において、配列番号１３１のアミノ酸配列を有するヒトＬｅｆｔｙＡタンパク質のＬ２２～Ｐ３６６のアミノ酸配列を含み、（１）プロセシング位置（Ｒ７４～Ｒ７７及びＲ１３２～Ｒ１３５）における一つ以上のアミノ酸残基の置換；及び（２）プロペプチド（Ｐｒｏｐｅｐｔｉｄｅ）領域（Ｌ２２～Ｓ７３）における一つ以上のアミノ酸残基の置換；を含むことを特徴とする、ヒトＬｅｆｔｙＡタンパク質変異体に関する。

前記配列番号１３１のアミノ酸配列を有するヒトＬｅｆｔｙＡタンパク質におけるＭ１～Ａ２１は、シグナルペプチド（ｓｉｇｎａｌｐｅｐｔｉｄｅ）に該当する。
本発明に係るヒトＬｅｆｔｙＡタンパク質変異体は、特定のアミノ酸残基位置においてアミノ酸残基が保存的に置換された変異体も含む意味で解釈される。

本明細書において“保存的置換”とは、１個以上のアミノ酸を、当該ＬｅｆｔｙＡタンパク質変異体の生物学的又は生化学的機能の損失を引き起こさない類似の生化学的特性を有するアミノ酸に置換することを含む、ＬｅｆｔｙＡタンパク質変異体の変形を意味する。

“保存的アミノ酸置換”は、アミノ酸残基を、類似の側鎖を有するアミノ酸残基に代替させる置換である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基の部類は、当該技術の分野に規定されており、よく知られている。これらの部類は、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン（ｌｙｓｉｎｅ）、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、帯電していない極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分枝された側鎖を有するアミノ酸（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、及び芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む。
本発明のＬｅｆｔｙＡタンパク質変異体は、保存的アミノ酸置換を有しても、相変らず活性が保有できると予想される。

また、本発明に係るヒトＬｅｆｔｙＡタンパク質変異体は、本発明に係るＬｅｆｔｙＡタンパク質変異体と実質的に同じ機能及び／又は効果を有し、８０％又は８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、最も好ましくは９９％以上のアミノ酸配列相同性を有するＬｅｆｔｙＡタンパク質変異体も含む意味で解釈される。

好ましくは、本発明に係るヒトＬｅｆｔｙＡタンパク質変異体は、配列番号８６～配列番号１１１のアミノ酸配列からなる群から選ばれるいずれか一つの配列のＬ２２～Ｐ３６６のアミノ酸配列、又は配列番号１１２～配列番号１２９及び配列番号１３３のアミノ酸配列からなる群から選ばれるいずれか一つの配列のＬ２３～Ｐ３６７のアミノ酸配列を含むことができるが、これに限定されない。

本発明に係るヒトＬｅｆｔｙＡタンパク質変異体は、Ｎ末端、Ｃ末端又は内部アミノ酸配列における一部のアミノ酸残基が切断又は置換されていても、本発明に係るヒトＬｅｆｔｙＡタンパク質変異体と実質的に同じ効果を有するものも含まれるものと解釈されるべきである。

野生型ＬｅｆｔｙＡタンパク質において、Ｒ７４～Ｒ７７位置における変異、すなわち、アミノ酸残基の置換がないため当該部位におけるプロテアーゼによる切断が起きる場合、３４ｋＤａサイズのＬｅｆｔｙＡタンパク質切片が得られ、Ｒ１３２～Ｒ１３５位置における変異がないため当該部位におけるプロテアーゼによる切断が起きる場合、２８ｋＤａサイズのＬｅｆｔｙＡタンパク質切片が得られる。

これによって、本発明におけるヒトＬｅｆｔｙＡタンパク質変異体は、好ましくは、Ｒ７４～Ｒ７７及びＲ１３２～Ｒ１３５のプロセシング位置の両方で一つ以上のアミノ酸置換を含むことを特徴とする。

本発明において、前記プロペプチド領域（Ｌ２２～Ｓ７３）におけるアミノ酸残基の置換は、Ｅ２４、Ｌ２７、Ｒ３３、Ｓ３８、Ｖ４０、Ｖ４２、Ｒ４５、Ｍ４８、Ｋ５０、Ａ５５、Ｖ６３、Ｒ６６、Ｒ６７、Ｇ７０及びＤ７１位置から選ばれる一つ以上の位置におけるアミノ酸残基の置換であることを特徴とし得るが、これに制限されない。

好ましくは、前記プロペプチド領域（Ｌ２２～Ｓ７３）におけるアミノ酸残基の置換は、Ｅ２４Ｇ、Ｓ３８Ｋ、Ｖ４２Ｔ、Ｋ５０Ｅ、Ａ５５Ｔ、Ｖ６３Ａ及びＲ６６Ｑからなる群から選ばれる一つ以上のアミノ酸残基の置換であることを特徴とし得る。

最も好ましくは、本発明において、前記プロペプチド領域（Ｌ２２～Ｓ７３）におけるアミノ酸残基の置換は、Ｖ６３Ａを含み、Ｅ２４Ｇ、Ｓ３８Ｋ、Ｖ４２Ｔ、Ｋ５０Ｅ、Ａ５５Ｔ及びＲ６６Ｑからなる群から選ばれる一つ以上のアミノ酸残基の置換をさらに含むことを特徴とし得る。

本発明において、前記プロセシング位置（Ｒ７４～Ｒ７７及びＲ１３２～Ｒ１３５）における一つ以上のアミノ酸残基の置換は、Ｒ７４Ｇ、Ｒ７７Ｇ、Ｒ７７Ｖ．Ｒ１３２Ｇ及びＲ１３５Ｇから選ばれる一つ以上のアミノ酸残基の置換であることを特徴とし得る。

前記プロセシング位置（Ｒ７４～Ｒ７７及びＲ１３２～Ｒ１３５）における一つ以上のアミノ酸残基の置換によるＲ７４～Ｒ７７位置のアミノ酸配列はＲＧＫＲ、ＧＧＫＧ、ＲＧＫＡ、ＲＧＫＶ、又はＲＨＧＧであり、Ｒ１３２～Ｒ１３５位置のアミノ酸配列はＲＨＧＲ、ＧＨＧＲ、ＲＨＧＧ、ＲＨＥＲ、ＧＨＧＧ、ＲＨＧＡ又はＲＨＧＶであることを特徴とし得る。

本発明において、前記ヒトＬｅｆｔｙＡタンパク質変異体は、トロンビン切断位置（Ｔｈｒｏｍｂｉｎｃｌｅａｖａｇｅｓｉｔｅ）（Ｌ３１１、Ｐ３１３、Ｒ３１４、Ｌ３５９、Ｐ３６１又はＲ３６２）における一つ以上のアミノ酸残基の置換をさらに含むことを特徴とし得るが、これに制限されない。

好ましくは、前記トロンビン切断位置であるＬ３１１、Ｐ３１３、Ｒ３１４、Ｌ３５９、Ｐ３６１及びＲ３６２位置から選ばれる一つ以上のアミノ酸残基が、アスパラギン酸（Ａｓｐａｒｔｉｃａｃｉｄ，Ｄ）、グルタミン酸（Ｇｌｕｔａｍｉｃａｃｉｄ，Ｅ）、セリン（Ｓｅｒｉｎｅ，Ｓ）、リジン（Ｌｙｓｉｎｅ，Ｋ）及びグルタミン（Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ，Ｑ）からなる群から選ばれるアミノ酸残基に置換されたことを特徴とし得る。

本発明において、前記ヒトＬｅｆｔｙＡタンパク質変異体は、フラグメンテーション（Ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ）位置（Ｓ２０２又はＳ２２３）における一つ以上のアミノ酸残基が、セリン及びシステイン（Ｃｙｓｔｅｉｎｅ，Ｃ）を除く他のアミノ酸残基への置換をさらに含むことを特徴とし得る。
本発明において、前記ヒトＬｅｆｔｙＡタンパク質変異体は、Ｎ末端にシグナルペプチド（ｓｉｇｎａｌｐｅｐｔｉｄｅ）をさらに含むことを特徴とし得る。

本明細書において、シグナルペプチド（ｓｉｇｎａｌｐｅｐｔｉｄｅ）は、信号配列（ｓｉｇｎａｌｓｅｑｕｅｎｃｅ）と同じ意味で使われ、短いアミノ酸配列として新しく発現したポリペプチドを小胞体にターゲッティングさせて分泌経路に進入させるのに重要な役割を担当する。細胞内でタンパク質が合成されて細胞外に出る時、信号配列は切られ、ＬｅｆｔｙＡタンパク質変異体のＮ末端はＬ２２から始まる。前記信号配列は、ＬｅｆｔｙＡタンパク質由来の信号配列（Ｍ１～Ａ２１）を使用できるが、これに制限されない。ＬｅｆｔｙＡタンパク質以外の他のタンパク質由来の信号配列を使用することができ、例えば、ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＦＰＧＳＲＣ（ＵｎｉＰｒｏｔ：Ａ０Ａ０Ｃ４ＤＨ７３；配列番号１３２）のような抗体由来の配列であり得るが、これに制限されない。
本発明は、他の観点において、前記ヒトＬｅｆｔｙＡタンパク質変異体を含む融合タンパク質に関する。
本発明において、“ＬｅｆｔｙＡタンパク質変異体を含む融合タンパク質”は、“ＬｅｆｔｙＡ融合タンパク質変異体”と同じ意味で使われる。

本発明において、前記融合タンパク質は、ヒトＬｅｆｔｙＡタンパク質変異体とＦｃ又はアルブミンが融合していることを特徴とし得るが、これに制限されない。

好ましくは、本発明に係る融合タンパク質は、前記ヒトＬｅｆｔｙＡタンパク質変異体のＮ末端又はＣ末端、好ましくはＣ末端にＦｃ又はアルブミンが融合していることを特徴とし得る。また、本発明に係る融合タンパク質は、前記ヒトＬｅｆｔｙＡタンパク質変異体とＦｃ又はアルブミンがリンカーを媒介にして融合していることを特徴とし得る。

本発明におけるＦｃは、抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）のＦｃ（Ｆｒａｇｍｅｎｔｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｂｌｅｒｅｇｉｏｎ）を意味し、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ及びＩｇＥからなる群から選ばれる抗体のＦｃ、好ましくは、ヒト由来のＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ及びＩｇＥからなる群から選ばれる抗体のＦｃが用いられ得るが、これに限定されない。

より好ましくは、ヒトＩｇＧ由来のヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４から選ばれるもの、最も好ましくはヒトＩｇＧ１由来のＦｃが用いられ得るが、これに限定されない。また、野生型Ｆｃ又はそのアミノ酸配列変異体であってもよい。

また、本発明におけるアルブミンは、ヒトを含む動物由来のあらゆるアルブミンを含む意味で使われ、好ましくは、ヒトアルブミンが用いられ得るが、これに限定されない。

本発明において、前記融合タンパク質は、配列番号１３４～配列番号１７８のアミノ酸配列からなる群から選ばれるいずれか一つのアミノ酸配列で表されることを特徴とし得るが、これに限定されない。

本発明において、前記配列番号１３４～配列番号１５９のアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号８６～配列番号１１１のアミノ酸配列から信号配列を除外したＬ２２～Ｋ６１４のアミノ酸配列を意味し、前記配列番号１６０～配列番号１７８のアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号１１２～配列番号１２９及び配列番号１３３のアミノ酸配列から信号配列を除外したＬ２３～Ｋ６１５のアミノ酸配列を意味する（図２２Ａ～図２２Ｊ及び図２３Ａ～図２３Ｍ）。

本発明に係る融合タンパク質は、Ｎ末端にシグナルペプチド（ｓｉｇｎａｌｐｅｐｔｉｄｅ）をさらに含むことを特徴とし、融合タンパク質Ｎ末端に結合可能なシグナルペプチドは、前記ヒトＬｅｆｔｙＡタンパク質変異体の場合と類似に、ＬｅｆｔｙＡタンパク質由来の信号配列（Ｍ１～Ａ２１）を使用できるが、これに制限されない。ＬｅｆｔｙＡタンパク質以外の他のタンパク質由来の信号配列を使用することができ、例えば、ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＦＰＧＳＲＣ（ＵｎｉＰｒｏｔ：Ａ０Ａ０Ｃ４ＤＨ７３；配列番号１３２）のような抗体由来の配列でよいが、これに制限されない。

本発明は、さらに他の観点において、前記融合タンパク質をコードする核酸分子、該核酸分子を含む発現ベクター、該発現ベクターが導入された宿主細胞、該宿主細胞を用いたヒトＬｅｆｔｙＡタンパク質変異体を含む融合タンパク質を生産する方法に関する。

本明細書で使われる用語、“核酸分子”は、ＤＮＡ（ｇＤＮＡ及びｃＤＮＡ）及びＲＮＡ分子を包括的に含む意味を有し、核酸分子において基本構成単位であるヌクレオチドは、自然のヌクレオチドの他、糖又は塩基部位が変形された類似体（ａｎａｌｏｇｕｅ）も含む（Ｓｃｈｅｉｔ，ＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅＡｎａｌｏｇｓ，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９８０）；Ｕｈｌｍａｎ及びＰｅｙｍａｎ，ＣｈｅｍｉｃａｌＲｅｖｉｅｗｓ，（１９９０）９０：５４３－５８４）。本発明のヒトＬｅｆｔｙＡ融合タンパク質変異体をコードする核酸分子の配列は変形されてよく、前記変形は、ヌクレオチドの追加、欠失、又は非保存的置換又は保存的置換を含む。

本明細書で使われる用語、“ベクター”とは、宿主細胞において目的遺伝子を発現させるための手段であり、プラスミドベクター；コスミドベクター；及び、バクテリオファージベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター及びアデノ関連ウイルスベクターのようなウイルスベクターなどを含み、好ましくはプラスミドベクターでよいが、これに制限されない。

本発明のベクターにおいて、ヒトＬｅｆｔｙＡタンパク質変異体を含む融合タンパク質をコードする核酸分子は、プロモーターと作動可能に連結（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙｌｉｎｋｅｄ）されたものでよい。

本明細書で使われる用語“作動可能に連結された”とは、核酸発現調節配列（例えば、プロモーター、シグナル配列、又は転写調節因子結合位置のアレイ）と他の核酸配列との機能的な結合を意味し、これによって、前記調節配列は前記他の核酸配列の転写及び／又は解読を調節する。

本発明の組換えベクターシステムは、当業界に公知の様々な方法によって構築されてよく、これに関する具体的な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ（２００１）に開示されており、この文献は本明細書に参照によって組み込まれる。

本発明のベクターは、典型的に、クローニングのためのベクター又は発現のためのベクターとして構築されてよい。また、本発明のベクターは、原核細胞又は真核細胞を宿主として構築されてよい。

例えば、本発明のベクターが発現ベクターであり、原核細胞を宿主とする場合には、転写を進行させ得る強力なプロモーター（例えば、ｔａｃプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｌａｃＵＶ５プロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｐＬλプロモーター、ｐＲλプロモーター、ｒａｃ５プロモーター、ａｍｐプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ＳＰ６プロモーター、ｔｒｐプロモーター及びＴ７プロモーターなど）、解読の開始のためのリボソーム結合座及び転写／解読終結配列を含むのが一般的である。宿主細胞としてＥ．ｃｏｌｉ（例えば、ＨＢ１０１、ＢＬ２１、ＤＨ５αなど）が用いられる場合、Ｅ．ｃｏｌｉトリプトファン生合成経路のプロモーター及びオペレーター部位（Ｙａｎｏｆｓｋｙ，Ｃ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，（１９８４）１５８：１０１８－１０２４）とファージλの左向きプロモーター（ｐＬλプロモーター、Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ，Ｉ．ａｎｄＨａｇｅｎ，Ｄ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．，（１９８０）１４：３９９－４４５）が調節部位として用いられ得る。宿主細胞としてバチルス菌が用いられる場合、バチルスチューリンゲンシスの毒素タンパク質遺伝子のプロモーター（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９９８）６４：３９３２－３９３８；Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．（１９９６）２５０：７３４－７４１）又はバチルス菌において発現可能ないかなるプロモーターも調節部位として利用可能である。

一方、本発明の組換えベクターは、当業界で通常用いられるプラスミド（例えば、ｐＣＬ、ｐＳＣ１０１、ｐＧＶ１１０６、ｐＡＣＹＣ１７７、ＣｏｌＥ１、ｐＫＴ２３０、ｐＭＥ２９０、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ８／９、ｐＵＣ６、ｐＢＤ９、ｐＨＣ７９、ｐＩＪ６１、ｐＬＡＦＲ１、ｐＨＶ１４、ｐＧＥＸシリーズ、ｐＥＴシリーズ及びｐＵＣ１９など）、ファージ（例えば、λｇｔ４・λＢ、λ－Ｃｈａｒｏｎ、λΔｚ１及びＭ１３など）又はウイルス（例えば、ＳＶ４０など）を操作して作製できる。例えば、本発明の組換えベクターは、ｐＣＬ発現ベクター、具体的にｐＣＬＳ０５（大韓民国登録特許第１０－１４２０２７４号）発現ベクターを操作して作製できるが、これに制限されない。

また、本発明のベクターが発現ベクターであり、真核細胞を宿主とする場合には、哺乳動物細胞のゲノムから由来したプロモーター（例えば、メタロチオニンプロモーター、β－アクチンプロモーター、ヒトヘモグロビンプロモーター及びヒト筋肉クレアチンプロモーター）又は哺乳動物ウイルスから由来したプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＨＳＶのｔｋプロモーター、マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ＨＩＶのＬＴＲプロモーター、モロニーウイルスのプロモーター、エプスタインバールウイルス（ＥＢＶ）のプロモーター及びラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）のプロモーター）が用いられてよく、一般に、転写終結配列としてポリアデニル化配列を有する。具体的に、本発明の組換えベクターは、ＣＭＶプロモーターを含む。

本発明の組換えベクターはそれから発現する組換えタンパク質の精製を容易にするために他の配列と融合され得る。融合される配列は、例えば、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，ＵＳＡ）、マルトース結合タンパク質（ＮＥＢ，ＵＳＡ）、ＦＬＡＧ（ＩＢＩ，ＵＳＡ）及び６ｘＨｉｓ（ｈｅｘａｈｉｓｔｉｄｉｎｅ；Ｑｕｉａｇｅｎ，ＵＳＡ）などがある。また、本発明のベクターによって発現するタンパク質にはＦｃが融合されているため、精製のための更なる配列無しにも、発現したタンパク質を、タンパク質Ａカラムなどを用いて容易に精製できる。

一方、本発明の組換えベクターは、選択標識として当業界で通常用いられる抗生剤耐性遺伝子を含み、例えば、アンピシリン、ゲンタマイシン、カベニシリン、クロラムフェニコール、ストレプトマイシン、カナマイシン、ジェネティシン、ネオマイシン及びテトラサイクリンに対する耐性遺伝子を含むことができる。

本発明のベクターを安定ながらも連続してクローニング及び発現させ得る宿主細胞は、当業界に公知のいかなる宿主細胞も利用可能であり、例えば、エスケリチアコリー（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）、バチルスサブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）及びバチルスチューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）のようなバチルス属の菌株、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）（例えば、シュードモナスプチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐｕｔｉｄａ））、プロテウスミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓｍｉｒａｂｉｌｉｓ）又はスタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）（例えば、スタフィロコッカスカルノーサス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｕｓｃａｒｎｏｓｕｓ））のような原核宿主細胞を含むが、これに制限されない。

前記ベクターの好適な真核細胞宿主細胞は、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｓｐｅｃｉｅｓ）のような真菌、ピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）、サッカロミケスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミケス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）及びニューロスポラクラサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａｃｒａｓｓａ）のような酵母、その他下等真核細胞、昆虫由来細胞のような高等真核生物の細胞、そして植物又は哺乳動物から由来した細胞を用いることができる。

具体的に、宿主細胞は、サル腎臓細胞７（ＣＯＳ７：ｍｏｎｋｅｙｋｉｄｎｅｙｃｅｌｌｓ）、ＮＳＯ細胞、ＳＰ２／０、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ：Ｃｈｉｎｅｓｅｈａｍｓｔｅｒｏｖａｒｙ）細胞、Ｗ１３８、仔ハムスター腎臓（ＢＨＫ：ｂａｂｙｈａｍｓｔｅｒｋｉｄｎｅｙ）細胞、ＭＤＣＫ、骨髄腫細胞株、ＨｕＴ７８細胞又は２９３細胞であってよい。

Ｅ．ｃｏｌｉなどの微生物を用いる場合、生産性は動物細胞などに比べて高い方であるが、二硫化結合（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅｂｏｎｄ）又は糖化（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）の問題からタンパク質生産に好ましくないが、ＰＥＧ化（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）などを通じて薬剤の体内安定性を増加させる目的で生産に用いられ得る。

本発明において、宿主細胞への“形質転換”及び／又は“形質感染”は、核酸を有機体、細胞、組織又は器官に導入するいかなる方法も含まれ、当分野で公知の通り、宿主細胞に応じて適合な標準技術を選択して行うことができる。このような方法には、電気衝撃遺伝子伝達法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、原形質融合、リン酸カルシウム（ＣａＰＯ_４）沈殿、塩化カルシウム（ＣａＣｌ_２）沈殿、シリコンカーバイド繊維を用いた撹拌、アグロバクテリア媒介された形質転換、ＰＥＧ、デキストラン硫酸、リポフェクタミン及び乾燥／抑制媒介された形質転換方法などが含まれるが、これに制限されない。

本発明は、前記宿主細胞を用いた組換えタンパク質を生産する方法を提供する。具体的に、前記生産方法は、（ａ）本発明の組換えベクターで形質転換された宿主細胞を培養する段階；及び（ｂ）前記宿主細胞において組換えタンパク質を発現させる段階を含むヒトＬｅｆｔｙＡ融合タンパク質変異体の製造方法であり得る。

前記組換えタンパク質製造において、形質転換された宿主細胞の培養は、当業界に知られた適当な培地及び培養条件で行うことができる。このような培養過程は、当業者であれば、選択される菌株に応じて容易に調整して使用することができる。このような様々な培養方法は、様々な文献（例えば、ＪａｍｅｓＭ．Ｌｅｅ，ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｐｒｅｎｔｉｃｅ－ＨａｌｌＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＥｄｉｔｉｏｎｓ，１３８－１７６）に開示されている。細胞培養は、細胞の成長方式によって懸濁培養と付着培養、培養方法によって回分式、流加式及び連続培養式の方法に区分される。培養に用いられる培地は、特定の菌株の要求条件を適切に満足させなければならない。

動物細胞培養において、前記培地は、様々な炭素源、窒素源及び微量元素成分を含む。使用可能な炭素源の例は、ブドウ糖、ショ糖、乳糖、果糖、マルトース、澱粉及びセルロースのような炭水化物、大豆油、ひまわり油、ひまし油及びココナッツオイルのような脂肪、パルミチン酸、ステアリン酸及びリノレン酸のような脂肪酸、グリセロール及びエタノールのようなアルコール、及び酢酸のような有機酸を含むことができ、これらの炭素源は単独で又は組み合わせて使用できる。

本発明で使用可能な窒素源は、例えば、ペプトン、酵母抽出物、肉汁、麦芽抽出物、とうもろこし浸漬液（ＣＳＬ）及び大豆、麦のような有機窒素源、及び尿素、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム及び硝酸アンモニウムのような無機窒素源を含むことができ、これらの窒素源は単独で又は組み合わせて使用することができる。前記培地には、リン源として、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム及び対応するソジウム含有塩が含むことができる。また、硫酸マグネシウム又は硫酸鉄のような金属塩を含むことができる。その他に、アミノ酸、ビタミン、及び適切な前駆体などを含むことができる。

培養中に水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、アンモニア、リン酸及び硫酸のような化合物を培養物に適切な方式で添加し、培養物のｐＨを調整することができる。また、培養中には脂肪酸ポリグリコールエステルのような消泡剤を用いて気泡生成を抑制することができる。また、培養物の好気状態を維持するために、培養物中に酸素又は酸素含有気体（例、空気）を注入する。培養物の温度は一般に２０℃～４５℃、好ましくは２５℃～４０℃である。

形質転換された宿主細胞を培養して得た組換えタンパク質は、精製しない状態で使用してもよく、さらに様々な通常の方法、例えば、透析、塩沈殿及びクロマトグラフィーなどを用いて高純度に精製して使用してもよい。特にクロマトグラフィーを利用する方法が最も多く用いられ、カラムの種類と順序は、組換えタンパク質の特性、培養方法などに応じてイオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィーなどから選択できる。

本発明は、さらに他の観点において、前記ヒトＬｅｆｔｙＡタンパク質変異体又は前記融合タンパク質を含む、神経筋肉疾患の予防及び／又は治療用組成物に関する。

本発明は、さらに他の観点において、前記ヒトＬｅｆｔｙＡタンパク質変異体又はこれを含む融合タンパク質を個体に投与する段階を含む、神経筋肉疾患の予防及び／又は治療方法に関する。

本発明は、さらに他の観点において、神経筋肉疾患の予防及び／又は治療のための前記ヒトＬｅｆｔｙＡタンパク質変異体又はこれを含む融合タンパク質の用途に関する。

本発明は、さらに他の観点において、神経筋肉疾患治療用薬剤の製造のための前記ヒトＬｅｆｔｙＡタンパク質変異体又はこれを含む融合タンパク質の使用に関する。

本明細書で使われる用語“予防”は、本発明の組成物の投与によって神経筋肉病などの疾患を抑制させたり或いは進行を遅延させるあらゆる行為を意味し、“治療”は、神経筋肉病などの疾患の発展の抑制、症状の軽減又は除去を意味する。

本発明の一実施例において、本発明に係るヒトＬｅｆｔｙＡタンパク質変異体を含む融合タンパク質がＮｏｄａｌに結合して信号伝達を阻害することによって末梢神経病関連指標を改善できることを確認した。また、本発明の一実施例において、ヒトＬｅｆｔｙＡ融合タンパク質変異体が容量依存的にミオスタチン信号伝達を抑制することを確認し、髄鞘化の陰性調節子のｐ３８信号伝達を遮断することによって末梢神経病、特に脱髄鞘化による神経病の治療剤として利用できることを確認した。

したがって、本発明において、前記神経筋肉疾患は、具体的に末梢神経又は筋肉に生じる疾病であり得、好ましくは、Ｎｏｄａｌ及び／又はミオスタチン信号伝達関連疾患であることを特徴とし得るが、これに制限されない。前記Ｎｏｄａｌ及び／又はミオスタチン信号伝達関連疾患は、ミオパシー、末梢神経障害又は強直性脊椎症候群であることを特徴とし得る。

前記ミオパシーは、筋肉減少症（Ｓａｒｃｏｐｅｎｉａ）、筋ジストロフィー（Ｍｕｓｃｕｌａｒｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、重症筋無力症（ｍｙａｓｔｈｅｎｉａｇｒａｖｉｓ）、筋萎縮性側索硬化症（Ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃｌａｔｅｒａｌｓｃｌｅｒｏｓｉｓ、ルーゲリック病）、原発性側索硬化症（Ｐｒｉｍａｒｙｌａｔｅｒａｌｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、進行性筋萎縮症（Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅｍｕｓｃｕｌａｒａｔｒｏｐｈｙ）、ケネディ病（Ｓｐｉｎｏｂｕｌｂａｒｍｕｓｃｕｌａｒａｔｒｏｐｈｙ、球脊髄性筋萎縮症）、脊髄性筋萎縮症（Ｓｐｉｎａｌｍｕｓｃｕｌａｒａｔｒｏｐｈｙ）及び末梢性ミオパシー（Ｄｉｓｔａｌｍｙｏｐａｔｈｙ）からなる群から選ばれることを特徴とし得る。

前記末梢神経障害は、シャルコーマリートゥース病（Ｃｈａｒｃｏｔ－Ｍａｒｉｅ－Ｔｏｏｔｈｄｉｓｅａｓｅ）、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパシー（Ｃｈｒｏｎｉｃｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙｄｅｍｙｅｌｉｎａｔｉｎｇｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ）、手根管症候群（ｃａｒｐａｌｔｕｎｎｅｌｓｙｎｄｒｏｍｅ）、糖尿病性末梢神経障害（Ｄｉａｂｅｔｉｃｐｅｒｉｐｈｅｒａｌｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ）及びギランバレー症候群（Ｇｕｉｌｌａｉｎ－Ｂａｒｒｅｓｙｎｄｒｏｍｅ）からなる群から選ばれることを特徴とし得る。
前記組成物は、薬学的組成物、医薬外品組成物、健康食品用組成物の形態であり得る。
本発明の疾患予防又は治療用組成物は、薬剤学的に許容される担体をさらに含むことができる。

本発明において用語“薬学的に許容可能な担体”とは、生物体を刺激せず、投与化合物の生物学的活性及び特性を阻害しない担体又は希釈剤のことを指す。液状溶液として製剤化される組成物において薬学的に許容可能な担体には、滅菌及び生体に適するものとして、食塩水、滅菌水、緩衝食塩水、アルブミン注射溶液、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール及びこれら成分のいずれかを混合して使用することができ、必要によって、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤などの他の通常の添加剤を添加してもよい。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤及び潤滑剤をさらに添加し、水溶液、懸濁液、乳濁液などのような注射用剤形、丸薬、カプセル、顆粒又は錠剤として製剤化できる。

本発明の前記薬学的組成物は、経口又は非経口の様々な剤形であってよい。製剤化する場合には、一般に使用する充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤などの希釈剤又は賦形剤を用いて調製する。経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれ、このような固形製剤は、一つ以上の化合物に少なくとも一つの賦形剤、例えば、澱粉、炭酸カルシウム、スクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）又はラクトース（ｌａｃｔｏｓｅ）、ゼラチンなどを混ぜて調製する。また、単純な賦形剤の他、ステアリン酸マグネシウム、タルクなどのような潤滑剤も用いられる。経口投与のための液状製剤には、懸濁剤、耐溶液剤、乳剤、シロップ剤などが該当するが、一般に使用される単純希釈剤である水、リキッドパラフィンの他、様々な賦形剤、例えば、湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤なども含まれてよい。非経口投与のための製剤には、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、坐剤が含まれる。非水性溶剤、懸濁溶剤としては、プロピレングリコール（ｐｒｏｐｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性油、オレイン酸エチルのような注射可能なエステルなどを用いることができる。坐剤の基剤としては、ウィテップゾール（ｗｉｔｅｐｓｏｌ）、マクロゴール、ツイン（ｔｗｅｅｎ）６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチンなどを用いることができる。

このような薬学的に許容可能な担体及び製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ（１９ｔｈｅｄ．，１９９５）に詳細に記載されている。

本発明の組成物は、経口又は非経口で投与でき、非経口投与の場合には、静脈内投与、皮下投与、筋肉投与、腹腔投与、内皮投与、局所投与、鼻内投与、肺内投与及び直腸内投与などで投与できる。経口投与時にタンパク質又はペプチドが消化されるため、経口用組成物は、活性薬剤をコーティングしたり或いは胃での分解から保護されるように剤形化でき、本発明の組成物は、活性物質を標的細胞に移動可能にする任意の装置によって投与できる。

本発明の疾患予防又は治療用組成物の適切な投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性別、病的状態、食べ物、投与時間、投与経路、排泄速度及び反応感応性のような要因によって様々であり、熟練した通常の医師は、所望する治療又は予防に効果的な投与量を容易に決定及び処方できる。

本発明の一具現例によれば、本発明の薬剤学的組成物の１日投与量は、０．００１～１００ｍｇ／ｋｇでよい。本明細書における用語“薬剤学的有効量”は、神経筋肉病などの疾患を治療、予防及び診断するのに十分な量を意味する。

本発明の疾患予防又は治療用組成物は、当該発明の属する技術分野における通常の知識を有する者が容易に実施できる方法によって、薬剤学的に許容される担体及び／又は賦形剤を用いて製剤化することによって単位容量の形態にしてもよく、或いは多回容量容器内に内入させて製造してもよい。このとき、剤形は、オイル又は水性媒質中溶液、懸濁液又は乳化液の形態であってもよく、エキス剤、散剤、坐剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤又はカプセル剤の形態であってもよく、また、分散剤又は安定化剤をさらに含むことができる。

好ましくは、注射可能な形態で剤形化でき、このとき、注射可能な形態の剤形は、凍結乾燥した形態であって、再構成（ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）して使用する形態であるか、或いは、直ちに注射可能なＲＴＩ（Ｒｅａｄｙ－ｔｏ－Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）形態の液状剤形であり得るが、これに限定されない。
本発明の組成物は、個別治療剤として投与されてもよく、他の治療剤と併用して投与されてもよく、従来の治療剤とは順次に又は同時に投与されてよい。

以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は単に本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されると解釈されないことは、当業界における通常の知識を有する者にとって明らかであろう。

実施例１：ヒトＬｅｆｔｙＡ融合タンパク質の作製
実施例１－１：ヒトＬｅｆｔｙＡタンパク質変異体の作製
野生型ヒトＬｅｆｔｙＡタンパク質のアミノ酸配列は次の通りである。
ＭＷＰＬＷＬＣＷＡＬＷＶＬＰＬＡＧＰＧＡＡＬＴＥＥＱＬＬＧＳＬＬＲＱＬＱＬＳＥＶＰＶＬＤＲＡＤＭＥＫＬＶＩＰＡＨＶＲＡＱＹＶＶＬＬＲＲＳＨＧＤＲＳＲＧＫＲＦＳＱＳＦＲＥＶＡＧＲＦＬＡＳＥＡＳＴＨＬＬＶＦＧＭＥＱＲＬＰＰＮＳＥＬＶＱＡＶＬＲＬＦＱＥＰＶＰＫＡＡＬＨＲＨＧＲＬＳＰＲＳＡＱＡＲＶＴＶＥＷＬＲＶＲＤＤＧＳＮＲＴＳＬＩＤＳＲＬＶＳＶＨＥＳＧＷＫＡＦＤＶＴＥＡＶＮＦＷＱＱＬＳＲＰＲＱＰＬＬＬＱＶＳＶＱＲＥＨＬＧＰＬＡＳＧＡＨＫＬＶＲＦＡＳＱＧＡＰＡＧＬＧＥＰＱＬＥＬＨＴＬＤＬＲＤＹＧＡＱＧＤＣＤＰＥＡＰＭＴＥＧＴＲＣＣＲＱＥＭＹＩＤＬＱＧＭＫＷＡＫＮＷＶＬＥＰＰＧＦＬＡＹＥＣＶＧＴＣＱＱＰＰＥＡＬＡＦＮＷＰＦＬＧＰＲＱＣＩＡＳＥＴＡＳＬＰＭＩＶＳＩＫＥＧＧＲＴＲＰＱＶＶＳＬＰＮＭＲＶＱＫＣＳＣＡＳＤＧＡＬＶＰＲＲＬＱＰ（配列番号１３１）

前記配列において、Ｍ１～Ａ２１はシグナルペプチド配列であり、Ｌ２２～Ｓ７３はプロペプチド（Ｐｒｏｐｅｐｔｉｄｅ）領域であり、Ｒ７４～Ｒ７７及びＲ１３２～Ｒ１３５はプロセシング位置である。

野生型ヒトＬｅｆｔｙＡタンパク質は、プロセシング以前に４２ｋＤａ形態であるが、タンパク質転換酵素（ｐｒｏｐｒｏｔｅｉｎｃｏｎｖｅｒｔａｓｅ）系列の酵素によってプロペプチド領域を含む部位が除去されながら３４ｋＤａ或いは２８ｋＤａの形態にプロセシングされる。３つの形態のタンパク質切片の機能を糾明するために、４２、３４、２８タンパク質発現ベクターを作製した。

４２ｋＤａ、３４ｋＤａ形態のタンパク質は、追加切断を防ぐためにプロセシング位置変異（４２：Ｒ７４Ｇ／Ｒ７７Ｇ／Ｒ１３２Ｇ、３４：Ｒ１３２Ｇ）を導入してそれぞれ作製した（ＴＨＥＪＯＵＲＮＡＬＯＦＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬＣＨＥＭＩＳＴＲＹ，Ｖｏｌ．２７６，Ｎｏ．２４，ＩｓｓｕｅｏｆＪｕｎｅ１５，ｐｐ．２１３８７－２１３９６，２００１）。ヒトＬｅｆｔｙＡ４２切片（Ｌ２２～Ｐ３６６、Ｒ７４Ｇ／Ｒ７７Ｇ／Ｒ１３２Ｇ）、３４切片（Ｆ７８～Ｐ３６６、Ｒ１３２Ｇ）、２８切片（Ｌ１３６～Ｐ３６６）遺伝子は、バイオニア社（韓国）から合成してＰＣＲ鋳型として使用した。Ｌ１＿Ｆ（配列番号１３）とＬ２＿Ｒ（配列番号１４）プライマー対とＰｒｏＦｌｅｘ装備（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、米国）を用いて、メーカーの指針に従ってＥｘｔａｑ（Ｔａｋａｒａ、日本）で次のように増幅過程を行った。
９５℃で６０秒間変性、５８℃で６０秒間プライマー結合、及び７２℃で６０秒間延長させる増幅過程を２２回行い、ヒトＬｅｆｔｙＡ４２、３４、２８切片を得た。

実施例１－２：Ｃ末端Ｆｃ融合タンパク質の作製
実施例１－１のヒトＬｅｆｔｙＡタンパク質変異体とヒトＩｇＧ１Ｆｃとが連結された４２Ｆｃ（配列番号１）、３４Ｆｃ（配列番号２）、２８Ｆｃ（配列番号３）Ｃ末端Ｆｃ融合タンパク質の３種の発現ベクターを作製した。前記２８Ｆｃ、３４Ｆｃ及び４８Ｆｃは、それぞれ、２８、３４及び４２ｋＤａサイズのＬｅｆｔｙＡタンパク質のＣ末端にＦｃが融合しているものを意味する。

ヒトＩｇＧ１（Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ０１８５７）配列をコードするＤＮＡを鋳型とし、Ｌ３＿Ｆ（配列番号１５）とＬ４＿Ｒ（配列番号１６）プライマー対を用いてヒトＬｅｆｔｙＡ切片ＰＣＲ条件と同じ条件で増幅し、ヒトＩｇＧ１切片を得た。得られたＰＣＲ反応物を１．５％アガロースゲル電気泳動して分離精製した後、同じ条件でアセンブリーＰＣＲ反応（ａｓｓｅｍｂｌｙＰＣＲ）を行った。生成された反応物を１．５％アガロースゲル電気泳動して分離精製した後、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＸｈｏＩ（ＮＥＢ社、米国）を用いて切断した。制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＸｈｏＩで切断されたｐＣＬＳ０５ベクター（大韓民国出願番号：第２０１１－００５６６８５号）と２５℃で６０分間ライゲーションした後、反応物を大腸菌ＤＨ５αに形質転換した。１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有しているＬＢ培地で一晩培養した後、生成されたコロニーからプラスミドを抽出した後、コスモジンテック社（韓国）の配列分析サービスを用いてＣ末端Ｆｃ融合タンパク質３種の発現ベクター作製を確認した。

実施例１－３：Ｃ末端リンカーＦｃ融合タンパク質の作製
ヒトＬｅｆｔｙＡとヒトＩｇＧ１ＦｃとをＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳリンカー（配列番号１３０）で連結した４２ＬＦｃ（配列番号４）、３４ＬＦｃ（配列番号５）、２８ＬＦｃ（配列番号６）Ｃ末端リンカーＦｃ融合タンパク質３種の発現ベクターを作製した。前記２８ＬＦｃ、３４ＬＦｃ及び４８ＬＦは、それぞれ、２８、３４及び４２ｋＤａサイズのＬｅｆｔｙＡタンパク質のＣ末端にＦｃがリンカーを媒介にして融合したものを意味する。

ヒトＬｅｆｔｙＡ４２、３４、２８切片は、Ｃ末端Ｆｃ融合タンパク質発現ベクターの作製と同じ方法で得、リンカーＦｃ切片は、ヒトＩｇＧ１（Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ０１８５７）配列をコードするＤＮＡを鋳型とし、Ｌ５＿Ｆ（配列番号１７）とＬ４＿Ｒ（配列番号１６）プライマー対を用いて同じＰＣＲ条件でヒトリンカーＩｇＧ１切片を得た。以降の過程は、Ｃ末端Ｆｃ融合タンパク質の作製と同一である。

実施例１－４：Ｎ末端Ｆｃ融合タンパク質の作製
Ｆｃ４２（配列番号７）、Ｆｃ３４（配列番号８）、Ｆｃ２８（配列番号９）Ｎ末端Ｆｃ融合タンパク質３種の発現ベクターを作製した。前記Ｆｃ２８、Ｆｃ３４及びＦｃ４８は、それぞれ２８、３４及び４２ｋＤａサイズのＬｅｆｔｙＡタンパク質のＮ末端にＦｃが融合しているものを意味する。

Ｌ６＿Ｆ（配列番号１８）、Ｌ７＿Ｆ（配列番号１９）、Ｌ８＿Ｆ（配列番号２０）とＬ９＿Ｒ（配列番号２１）プライマー対を用いてそれぞれヒトＬｅｆｔｙＡ４２、３４、２８切片を得た。生成された反応物を１．５％アガロースゲル電気泳動して分離精製した後、制限酵素ＸｈｏＩで切断されたヒトＩｇＧ１Ｆｃ配列をコードしているｐＣＬＳ０５ベクターＤＮＡとＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤクローニングキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，６３９６５０）を用いて５０℃で１５分間ライゲーションした。以降の過程は、Ｃ末端Ｆｃ融合タンパク質の作製と同一である。

実施例１－５：Ｃ末端ＨＳＡ融合タンパク質の作製
ヒトＩｇＧ１Ｆｃ融合タンパク質の場合、動物細胞で発現する時にホモ二量体を形成するため、単量体形態の融合タンパク質を作製するために、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）分子を融合させたタンパク質を製造した。４２ＨＳＡ（配列番号１０）、３４ＨＳＡ（配列番号１１）、２８ＨＳＡ（配列番号１２）Ｃ末端ＨＳＡ融合タンパク質３種の発現ベクターを作製した。前記２８ＨＳＡ、３４ＨＳＡ及び４８ＨＳＡは、それぞれ２８、３４及び４２ｋＤａサイズのＬｅｆｔｙＡタンパク質のＣ末端にＨＳＡが融合しているものを意味する。

Ｌ１＿Ｆ（配列番号１３）とＬ９＿Ｒ（配列番号２１）プライマー対を用いて実施例１と同じ方法で増幅し、ヒトＬｅｆｔｙＡ４２、３４、２８切片を得た。制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＸｈｏＩを用いて切断し、ＨｉｎｄＩＩＩとＸｈｏＩで切断されたｐＣＬＳ０５ベクターと２５℃で６０分間ライゲーションした後、反応させた反応物を大腸菌ＤＨ５αに形質転換した。１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有しているＬＢ培地で一晩培養した後、生成されたコロニーからプラスミドを抽出した後、配列分析を用いて１段階クローニングを確認した。

２段階クローニングは、バイオニア社から合成されたヒト血清アルブミン遺伝子を鋳型とし、Ｌ１０＿Ｆ（配列番号２２）とＬ１１＿Ｒ（配列番号２３）プライマー対を用いて実施例１と同じＰＣＲ条件でヒト血清アルブミンを含む切片を得た。生成された反応物を１．５％アガロースゲル電気泳動して分離精製した後、１段階クローニングで得たヒトＬｅｆｔｙＡ４２、３４、２８切片をコードするＤＮＡを制限酵素ＸｈｏＩで切断したベクターと、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤクローニングキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，６３９６５０）方法を用いて５０℃で１５分間ライゲーションした。以降の過程は、Ｃ末端Ｆｃ融合タンパク質の作製と同一である。

実施例１－１～実施例１－５によって作製された発現ベクターの模式図は図１に、アミノ酸配列は表１に示し、融合タンパク質の作製に使用されたプライマーは表２に示す。

実施例１－６：ヒトＬｅｆｔｙＡ融合タンパク質臨時発現及び精製分析
ヒトＬｅｆｔｙＡとその変異タンパク質は、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ^ＴＭＭＡＸＣＨＯ発現システムを用いて発現させた。具体的に、Ｆｒｅｅｓｙｔｌｅ^ＴＭＣＨＯ－Ｓ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）を前記構築された発現ベクターで一時的形質感染させ、ＣＨＯ無血清培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）で数日間増殖させた。培養培地を遠心分離して上澄液を回収してろ過した後、以降、培養培地内ＬｅｆｔｙＡのタンパク質量（発現量）分析及び精製に使用した。

培養液からのＦｃ融合タンパク質は、ＭａｂＳｅｌｅｃｔＰｒｏｔｅｉｎＡレジン（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ，ＵＳＡ）を用いてタンパク質Ａベースの親和性クロマトグラフィー（ＰｒｏｔｅｉｎＡ－ｂａｓｅｄａｆｆｉｎｉｔｙｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）を用いて精製した。タンパク質Ａレジン（ＰｒｏｔｅｉｎＡｒｅｓｉｎが）が充填されたカラムをＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ｂｕｆｆｅｒｅｄｓａｌｉｎｅ，ｐＨ７．４）で平衡（ｅｑｕｉｌｉｂｒａｔｉｏｎ）させた後、濾過した細胞培養上澄液をロードした。１０ＣＶ（ｃｏｌｕｍｎｖｏｌｕｍｅ）のＰＢＳで洗浄した後、５ＣＶの溶出緩衝液（０．１Ｍクエン酸ナトリウム）でタンパク質を溶出し、２００μｌの１ＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０を添加して溶出溶液を中和させた。組換えタンパク質が溶出された分画（ｆｒａｃｔｉｏｎ）に対してＰＢＳ（ｐＨ７．４）にバッファー交換するために、ＭＷＣＯ３００００であるＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ－１５遠心濾過機（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｃａｔ．Ｎｏ．ＵＦＣ９０３０９６）を使用した。精製されたタンパク質分画プーリング（ｐｏｏｌｉｎｇ）試料を入れて４，０００ｒｐｍ、４℃、１０分遠心分離して１０倍希釈させた後、遠心分離を３回反復することによって１，０００倍以上バッファー交換（ｂｕｆｆｅｒｃｈａｎｇｅ）させた。精製された組換えタンパク質はクリーンベンチ中で２５ｍｍＰＥＳシリンジフィルター（０．２２μｍ；Ｎａｌｇｅｎｅ，Ｃａｔ．Ｎｏ．ＮＡＬ－１９４－２５２０）で試料の損失を最小化して濾過後に密封し、外部に露出されない状態で４℃で保管した。

ＨＳＡ融合タンパク質は、ＨＳＡのみに特異的に結合するＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ^ＴＭＨＳＡ親和性マトリックス（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳＡ）或いはＨｉＴｒａｐＢｌｕｅＨＰレジンを用いて精製した。ＰＢＳで満たされたＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ親和カラムに濾過した培養上澄液を通過させた後、１ＭＮａＣｌ含有２０ｍＭＴｒｉｓ－Ｃｌで洗浄した後、１Ｍアルギニン及び１ＭＮａＣｌを含有している２０ｍＭＴｒｉｓ－Ｃｌを用いて溶出した。又は、結合緩衝溶液２０ｍＭＮａＰＯ_４（ｐＨ７．０）で満たされたＨｉＴｒａｐＢｌｕｅＨＰカラムに準備された培養上澄液を通過させて所望のタンパク質のみをレジンと結合させた後、２ＭＮａＣｌ含有の２０ｍＭＮａＰＯ_４（ｐＨ７．０）を用いて溶出させた。精製完了後、分画は、ＮＡＮＯＤＲＯＰ２０００分光測色器（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｃａｔ．Ｎｏ．ＮＤ－２０００）を用いて２８０ｎｍ波長で濃度を測定し、各分画については、所望のタンパク質の含有測定のために、サイズ排除ＨＰＬＣをＳＷｘｌＧｕａｒｄｃｏｌｕｍｎ（ＴＯＳＯＨ，Ｃａｔ．Ｎｏ．０８５４３）とＴＳＫｇｅｌＧ３０００ＳＷｘｌ（ＴＯＳＯＨ，Ｃａｔ．Ｎｏ．０８５４１）を用いて１２００シリーズＨＰＬＣ（ＡｇｉｌｅｎｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で確認した。

精製された融合タンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を用いて分析した。トリス／グリシン４～１２％アクリルアミドゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）でＳＤＳ－ＰＡＧＥを行った。分析用ゲルをクマシ－ブルー（ＣｏｏｍａｓｓｉｅＢｌｕｅ）で染色し、デジタルスキャニングして画像を取得した。精製された各タンパク質は、０．５ｍｌ／分の流速で、０．０２％ＮＡＮ_３を含有するリン酸塩緩衝塩水中で平衡されたＴＳＫ－ＧＥＬＧ３００ＳＷＸＬカラム（７．８×３００ｍｍ，Ｔｏｓｏｈａａｓ、米国）を使用するサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）で分析し、タンパク質の発現量及び純度を確認した。その結果を表３に示す。

３４或いは２８Ｆｃ融合タンパク質は、Ｆｃ融合位置に関係なく発現しなかった。４２切片の場合、Ｃ末端Ｆｃ融合時（“４２Ｆｃ”）にＮ末端融合（“Ｆｃ４２”）に比べてタンパク質発現効率が大きく増加し、特に、リンカーを媒介にＦｃと融合した場合（“４２ＬＦｃ”）にタンパク質発現効率が大きく増加した。ＨＳＡ融合タンパク質の場合も、４２ＨＳＡのみ発現し、３４ＨＳＡ或いは２８ＨＳＡは発現しなかった。これは、培養液のウェスタンブロット分析からも確認された（図２）。

下記の実施例６に見られるように、ＣＭＴモデルマウスにおいて４２Ｆｃ又は４２ＬＦｃが４２ＨＳＡに比べて神経改善能力に優れており、４２Ｆｃ又は４２ＬＦｃを以降の変異体作製の鋳型として使用した。

実施例２：生産性及び安定性改善されたヒトＬｅｆｔｙＡ融合タンパク質変異体の作製
タンパク質安定性及び動物細胞内発現量が４２ＬＦｃ分子に比べてより高く、実施例１に記載した構造物から発現したヒトＬｅｆｔｙＡ融合タンパク質変異体を作製した。

実施例２－１：ヒトＬｅｆｔｙＡ融合タンパク質変異体発現ベクターの作製
実施例１で作製されたプロペプチドが除去された融合タンパク質は殆ど発現しなかった。最も収率が高い４２ＬＦｃタンパク質さえ、培養液上で低い発現量とＰｒｏＡ親和性精製後の低い純度という限界があった。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析から見られるように、プロセシング位置における切断或いはタンパク質不安定性による非特異的切断によって４２ＬＦｃ精製産物でいくつかの小さな切片が観察された（図３）。また、ＥｘＰＡＳｙＰｅｐｔｉｄｅＣｕｔｔｅｒＤＢ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｅｂ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｐｅｐｔｉｄｅ＿ｃｕｔｔｅｒ／）を用いて、ヒトＬｅｆｔｙＡを様々な酵素と化学物質によって切断される位置を予測した結果、３１１番と３５９番ロイシン残基にトロンビン酵素による切断位置が予測された。したがって、プロペプチド領域、プロセシング位置、Ｌ３１１、Ｐ３１３、Ｒ３１４、Ｌ３５９、Ｐ３６１及びＲ３６２位置に変異を導入して、ヒトＬｅｆｔｙＡ融合タンパク質変異体の発現量及び安定性を増加させ、精製純度を向上させようとした。４２ＬＦｃ遺伝子を鋳型とし、表４に記載のプライマー対を用いて、実施例１と同じ条件でＰＣＲしてそれぞれの切片を得た後、アセンブリーＰＣＲ反応を行った。生成された反応物を１．５％アガロースゲル電気泳動して分離精製した後、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＸｈｏＩで切断したｐＣＬＳ０５ベクターとＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤクローニングキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，６３９６５０）方法を用いて５０℃で１５分間ライゲーションした。以降の過程は、Ｃ末端Ｆｃ融合タンパク質の作製と同一である。

前記４２ＬＦｃの配列において、プロペプチド領域（Ｌ２２～Ｓ７３）でアミノ酸残基の置換が起きた変異体のアミノ酸配列を、下記表５に示す。

前記ＬＦＢ４２ＬＦｃは、４２ＬＦｃの配列において、Ｅ２４Ｇ、Ｓ３８Ｋ、Ｖ４２Ｔ、Ｋ５０Ｅ、Ａ５５Ｔ、Ｖ６３Ａ及びＲ６６Ｑのアミノ酸残基置換が起きた変異体である。

前記４２ＬＦｃの配列において、プロセシング位置（Ｒ７４～Ｒ７７及びＲ１３２～Ｒ１３５）でアミノ酸残基の置換が起きた変異体のアミノ酸配列を、下記表６に示す。

前記４２ＬＦｃＶ１は４２ＬＦｃの配列でＧ１３２Ｒのアミノ酸残基置換；４２ＬＦｃＶ２は４２ＬＦｃの配列でＧ１３２Ｒ及びＲ１３５Ｇのアミノ酸残基置換；４２ＬＦｃＶ３はＬＦｃの配列でＧ１３２Ｒ及びＧ１３４Ｅのアミノ酸残基置換が起きた変異体である。４２ＬＦｃＶ４は４２ＬＦｃの配列でＲ１３５Ｇのアミノ酸残基置換；４２ＬＦｃＶ５は４２ＬＦｃの配列でＧ７４Ｒ及びＧ７７Ａのアミノ酸残基置換；４２ＬＦｃＶ６は４２ＬＦｃの配列でＧ７４Ｒ、Ｇ７７Ａ、Ｇ１３２Ｒ及びＲ１３５Ａのアミノ酸残基置換が起きた変異体である。４２ＬＦｃＶ７は４２ＬＦｃの配列でＧ７４Ｒ、Ｇ７７Ａ、Ｇ１３２Ｒ及びＲ１３５Ｖのアミノ酸残基置換；４２ＬＦｃＶ８は４２ＬＦｃの配列でＧ７４Ｒ及びＧ７７Ｖのアミノ酸残基置換；４２ＬＦｃＶ９は４２ＬＦｃの配列でＧ７４Ｒ、Ｇ７７Ｖ、Ｇ１３２Ｒ及びＲ１３５Ａのアミノ酸残基置換が起きた変異体である。４２ＬＦｃＶ１０は４２ＬＦｃの配列でＧ７４Ｒ、Ｇ７７Ｖ、Ｇ１３２Ｒ及びＲ１３５Ｖのアミノ酸残基置換；４２ＬＦｃＶ１１は４２ＬＦｃの配列でＧ７４Ｒ、Ｇ７５Ｈ、Ｋ７６Ｇ、Ｇ１３２Ｒ及びＲ１３５Ｇのアミノ酸残基置換が起きた変異体である。４２ＬＦｃＶ１２は４２ＬＦｃの配列でＧ７４Ｒ、Ｇ１３２Ｒ及びＲ１３５Ｇのアミノ酸残基置換；４２ＬＦｃＶ１３は４２ＬＦｃの配列でＧ７４Ｒ、Ｇ７７Ａ、Ｇ１３２Ｒ及びＲ１３５Ｇのアミノ酸残基置換が起きた変異体である。

前記表５のプロペプチド領域（Ｌ２２～Ｓ７３）でアミノ酸残基の置換、前記表６のプロセシング位置（Ｒ７４～Ｒ７７及びＲ１３２～Ｒ１３５）でアミノ酸残基の置換、及びさらにフラグメンテーション位置（Ｓ２０２又はＳ２２３）におけるアミノ酸残基の置換が起きた変異体のアミノ酸配列を、下記表７に示す。

前記ＣＸ１９６は、４２ＬＦｃの配列でＥ２４Ｇ、Ｓ３８Ｋ、Ｖ４２Ｔ、Ｋ５０Ｅ、Ａ５５Ｔ、Ｖ６３Ａ、Ｒ６６Ｑ、Ｇ１３２Ｒ及びＲ１３５Ｇのアミノ酸残基置換が起きた変異体であり、ＣＸ１９７は、４２ＬＦｃの配列でＥ２４Ｇ、Ｓ３８Ｋ、Ｖ４２Ｔ、Ｋ５０Ｅ、Ａ５５Ｔ、Ｖ６３Ａ、Ｒ６６Ｑ、Ｇ１３２Ｒ及びＲ１３５Ａのアミノ酸残基置換が起きた変異体である。

ＣＸ２０１は、４２ＬＦｃの配列でＶ６３Ａ、Ｒ６６Ｑ、Ｇ１３２Ｒ及びＲ１３５Ａのアミノ酸残基置換が起きた変異体であり、ＣＸ２０３は、４２ＬＦｃの配列でＶ６３Ａ、Ｒ６６Ｑ、Ｇ１３２Ｒ及びＧ１３４Ｅのアミノ酸残基置換が起きた変異体である。

ＣＸ２０６は、４２ＬＦｃの配列でＶ６３Ａ、Ｒ６６Ｑ、Ｇ１３２Ｒ、Ｒ１３５Ｇ及びＳ２０２Ｔのアミノ酸残基置換が起きた変異体であり、ＣＸ２０７は、４２ＬＦｃの配列でＶ６３Ａ、Ｒ６６Ｑ、Ｇ１３２Ｒ、Ｒ１３５Ｇ及びＳ２２３Ｇのアミノ酸残基置換が起きた変異体であり、ＣＸ２０８は、４２ＬＦｃの配列でＶ６３Ａ、Ｒ６６Ｑ、Ｇ１３２Ｒ、Ｒ１３５Ｇ、Ｓ２０２Ｔ及びＳ２２３Ｇのアミノ酸残基置換が起きた変異体である。

前記表７のＣＸ２０１の配列においてトロンビン切断位置（Ｔｈｒｏｍｂｉｎｃｌｅａｖａｇｅｓｉｔｅ）（Ｌ３１１、Ｐ３１３、Ｒ３１４、Ｌ３５９、Ｐ３６１又はＲ３６２）でのアミノ酸残基置換がさらに起きた変異体を、下記表８に示す。

トロンビン位置変異体の場合、抗体由来ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＦＰＧＳＲＣ（ＵｎｉＰｒｏｔ：Ａ０Ａ０Ｃ４ＤＨ７３；配列番号１３２）配列を信号配列（ｓｉｇｎａｌｓｅｑｕｅｎｃｅ）として使用した。

実施例２－２：臨時発現及び精製分析
作製された発現ベクターを、実施例１と同じ方法で臨時発現及び精製した後、発現量及び純度を確認した。その結果を、表９～表１２に示す。

変異体作製の基本となる４２－ＬＦｃ融合タンパク質の場合、約２．８μｇ／ｍｌの発現量を示し、１次親和性（ａｆｆｉｎｉｔｙ）精製後にＳＥ－ＨＰＬＣで分析したタンパク質純度は、平均で約６４．３％と分析された。プロペプチド領域をＬＦＢに置換したＬｅｆｔｙＡ変異体は、約７．５倍の発現量増加を示し、ＳＥ－ＨＰＬＣで測定したタンパク質純度は約８３％であった。ヒトＬｅｆｔｙＡのプロペプチド領域に対するＶ６３Ａ置換は発現量を約２倍増加させ、Ｖ６３Ａ／Ｒ６６Ｑ二重置換は、発現量を約２．３倍増加させた（表９）。

プロセシング位置に対してシーケンス変異を導入した結果、ＳＥ－ＨＰＬＣで測定したタンパク質の純度は４２ＬＦｃＶ２で８４．１％を示し、発現量は変異導入前と類似であった。４２ＬＦｃＶ６でタンパク質純度が９０．９％と最も高く示されたが、発現量は変異導入前に比して約６０％と減少した（表１０）。

ヒトＬｅｆｔｙＡ融合タンパク質変異体（Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）に対する分析の結果、ＬＦＢプロペプチドを使用したＣＸ１９６は、発現量が約１．８倍増加、タンパク質純度が９４．１％と増加し、ヒトプロペプチドを使用したＣＸ２０１は、発現量が約１．９倍増加、タンパク質純度が９１．３％と増加した（表１１、図４）。

ヒトＬｅｆｔｙＡ融合タンパク質変異体（Ｔｈｒｏｍｂｉｎｃｌｅａｖａｇｅｓｉｔｅ）に対する分析の結果、Ｐ３６１Ｓ単一変異体（ｓｉｎｇｌｅｍｕｔａｎｔ）で発現量が約１．５倍増加した。Ｌ３１１Ｄ／Ｒ３６２Ｑ及びＬ３１１Ｅ／Ｒ３６２Ｑの二重変異体（ｄｏｕｂｌｅｍｕｔａｎｔ）とＬ３１１Ｄ／Ｐ３６１Ｄ／Ｒ３６２Ｑ及びＬ３１１Ｅ／Ｐ３６１Ｄ／Ｒ３６２Ｑの三重変異体（ｔｒｉｐｌｅｍｕｔａｎｔ）は両方も、発現量が１．５倍増加したとともに、タンパク質純度が９５％程度と約９％増加した（表１２）。

実施例３：血清内安定性改善
実施例２で作製したヒトＬｅｆｔｙＡ融合タンパク質変異体（Ｔｈｒｏｍｂｉｎｃｌｅａｖａｇｅｓｉｔｅ）を使用してｉｎｖｉｔｒｏ血清安定性試験を行った。各タンパク質変異体を最終１０μｇ／ｍｌの濃度でマウス血清或いは血漿に希釈し、３７℃で４時間培養（ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）後に、サンドイッチＥＬＩＳＡで分析した。マウス血清において安定性は、試験管条件で血清内ヒトＬｅｆｔｙＡ変異体の相対的残量を測定して分析し、ＣＸ２０１に対する相対的安定性を表１３に表した。Ｌ３１１Ｄ、Ｌ３１１Ｅ、Ｐ３６１Ｄ或いはＲ３６２Ｑのようにｐｕｔａｔｉｖｅｔｈｒｏｍｂｉｎｓｉｔｅｓ変形時に血清で安定性が増加することが確認できた。

実施例４：Ｎｏｄａｌに対する結合力測定
ヒトｎｏｄａｌタンパク質とヒトＬｅｆｔｙＡ融合タンパク質変異体の結合力をＢＩＡｃｏｒｅを用いて測定した。
具体的に、ＣＭ５センサーチップにヒトＮｏｄａｌ（Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓ，３２１８－ＮＤ－０２５／ＣＦ）タンパク質を５０ＲＵ固定させた。ヒトＬｅｆｔｙＡ融合タンパク質と変異体を５００、２５０、１２５、６２．５及び３１．２５ｎＭに希釈して使用し、低い濃度から順次に注入した。その後、３０μｌ／ｍｉｎの流速で３分間注入して結合させ、５分間ランニングバッファを注入して解離させた。１５μｌの５０ｍＭＮａＯＨを用いてチップを再生した。それぞれのサイクルに対する結合及び解離速度は、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアバージョン４．１で“Ｂｉｖａｌｅｎｔａｎａｌｙｔｅ”モデルを用いて評価し、ビアコアデータを表１４に要約した。

実施例５：ヒトＬｅｆｔｙＡタンパク質による末梢神経細胞増殖促進
本研究において、遺伝性末梢神経疾患の治療物質探索のために、小胞体ストレスを誘発する薬物を用いたシュワン細胞モデルを開発して薬物探索に活用した。

まず、小胞体ストレス細胞モデルで間葉幹細胞を共同培養したとき、小胞体ストレスの減少とともに細胞死滅が効果的に抑制されることを観察した。具体的にトランスウエルチャンバーでＳ１６シュワン細胞にタプシガルギン（Ｔｈａｐｓｉｇａｒｇｉｎ）誘導性小胞体ストレスを誘導した後、上部チャンバーに臍帯由来の間葉幹細胞を共同培養してＳ１６細胞の死滅を分析し、このとき、臍帯幹細胞の共同培養がＳ１６シュワン細胞の死滅を３０％以上抑制した（図５）。

このような結果から、臍帯幹細胞が分泌する傍分泌因子（ｐａｒａｃｒｉｎｅｆａｃｔｏｒ）がシュワン細胞の死滅を抑制していると類推でき、サイトカイン抗体アレイ（ｃｙｔｏｋｉｎｅａｎｔｉｂｏｄｙａｒｒａｙ）を行い、間葉幹細胞で分泌される治療効能タンパク質を同定しようとした。シュワン細胞と共同培養時に、臍帯幹細胞で分泌が２倍以上増えたタンパク質を分析し、特に、ＬｅｆｔｙＡタンパク質が有効に増加することを観察した。

実施例６：ＣＭＴ疾患モデルＴｒ－ＪマウスにおいてヒトＬｅｆｔｙＡ融合タンパク質の神経機能改善
ヒトＬｅｆｔｙＡ融合タンパク質が神経の機能的改善を起こし得るか否かを、ＣＭＴ１モデルＴｒ－Ｊ（Ｔｒｅｍｂｌｅｒ－Ｊ）マウスを用いて電気生理学的に分析した（Ｍｅｅｋｉｎｓｅｔａｌ．，ＪＰｅｒｉｐｈｅｒＮｅｒｖＳｙｓｔ９（３）：１７７－８２（２００４））。Ｔｒ－Ｊは、ＰＭＰ２２遺伝子においてＬ１６Ｐ変異が起きた自然発生突然変異マウスであり、末梢神経脱髄鞘化の表現型を有しており、ＣＭＴ１患者に見られるように、Ｔｒ－Ｊマウスは神経伝導速度と複合筋活動電位（ＣＭＡＰ）強度の低下を示す（Ｈｅｎｒｙｅｔａｌ．，ＪＮｅｕｒｏｐａｔｈｏｌＥｘｐＮｅｕｒｏｌ２（６）：６８８－７０６（１９８３）；Ｖａｌｅｎｔｉｊｉｎｅｔａｌ．，ＮａｔＧｅｎｅｔ２（４）：２８８－９１１９９２（１９９２））。

Ｔｒ－Ｊマウスに、出生後６日目から、ＰＢＳ或いはヒトＬｅｆｔｙＡ融合タンパク質（１μｇ／ｋｇ）を２日ごとに腹腔内注射した。注射は、生後２０日まで総８回行われた。神経伝導検査の前日にマウスの末端部から後足に至るまで毛髪を完全に除去し、翌日、坐骨神経で運動ニューロンの神経伝導速度を測定するために、活性録音針電極を腓腹筋肉に連結し、基準電極を腓腹筋肉に連結した。刺激陰極を記録電極から６ｍｍ離れた臀部領域に置き、複合筋活動電位と運動神経伝導速度（ＭＮＣＶ）をＮｉｃｏｌｅｔＶｉｋｉｎｇＱｕｅｓｔ（ＮａｔｕｓＭｅｄｉｃａｌ，ＳａｎＣａｒｌｏｓ，ＣＡ）機器を用いて測定した。
図６及び表１５に示すように、神経伝導検査から、４２ＬＦｃ融合タンパク質がＴｒ－Ｊマウスの神経機能を向上させることを確認した。

１μｇ／ｋｇの投与容量において、ＨＳＡ融合タンパク質に比べてＬＦｃ融合ヒトＬｅｆｔｙＡタンパク質が、複合筋肉活動電位（ｃｏｍｐｏｕｎｄｍｕｓｃｌｅａｃｔｉｏｎｐｏｔｅｎｔｉａｌ；ＣＭＡＰ）とＴｒ－Ｊマウスの神経伝導速度（ＭＮＣＶ）を非常に増加させた。このようなデータから、神経病症患者の神経機能向上のためにヒトＬｅｆｔｙＡ融合タンパク質を利用できることが分かる。

実施例７：ヒトＬｅｆｔｙＡ融合タンパク質変異体によるシュワン細胞髄鞘化促進
ＲＴ４－Ｄ６Ｐ２Ｔシュワン細胞をｅｆｔｙＡ融合タンパク質変異体（４２ＬＦｃ；Ｘ－４２）を処理時に、シュワン細胞髄鞘化に重要な転写調節因子であるＫｒｏｘ２０と、髄鞘化時に発現が誘導されるＭＢＰタンパク質発現が増加した（図７Ａ）。

一方、ＮｏｄａｌをＲＴ４－Ｄ６Ｐ２Ｔシュワン細胞に処理時にＫｒｏｘ２０の発現が阻害されたし、Ｎｏｄａｌによる髄鞘化阻害は、ＬｅｆｔｙＡ融合タンパク質変異体によって回復した（図７Ｂ及び図７Ｃ）。このような結果は、ＬｅｆｔｙＡ融合変異体がシュワン細胞髄鞘化を促進させ、これは、シュワン細胞髄鞘化の陰性調節子として働くｎｏｄａｌを阻害することによってなるということを示す。

実施例８：ＣＭＴ疾患モデルＣ２２マウスにおいてヒトＬｅｆｔｙＡ融合タンパク質変異体（Ｘ－４２）の腹腔内注射（ＩＰ）による神経機能及び運動機能改善（ｐ６マウス）
ヒトＬｅｆｔｙＡ融合タンパク質変異チェーンＸ－４２を、シャルコーマリートゥース１型（Ｃｈａｒｃｏｔ－Ｍａｒｉｅ－ＴｏｏｔｈＤｉｓｅａｓｅｔｙｐｅ１；ＣＭＴ１）動物モデルであるＣ２２［ｓｔｒａｉｎｏｆｏｒｉｇｉｎ：（Ｃ５７ＢＬ／６ＪｘＣＢＡ／ＣＡ）Ｆ１］マウスの髄鞘が形成される前である生後６日目（ｐ６マウス）から腹腔内注射（ＩＰ；ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）し、電気生理学的神経機能の改善及び行動評価による運動機能の改善を観察した。
Ｃ２２マウスは、ｈｕｍａｎＰＭＰ２２遺伝子７コピー（ｃｏｐｉｅｓ）を有する形質転換マウスであり、深刻な末梢神経脱髄鞘化の表現型を持っている（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎｅｔａｌ．，ＪＡｎａｔ２００（４）：３７７－９０（２００２）；Ｎｏｒｒｅｅｌｅｔａｌ．，Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ１１６（３）：６９５－７０３（２００３））。薬効評価のために１０μｇ／ｋｇの容量でヒトＬｅｆｔｙＡ融合タンパク質変異体を生後６日目から生後２４日目で２日ごとに総１０回マウス腹腔内に投与した後、神経伝導検査及び行動評価を行った。

実施例８－１：神経伝導検査
神経伝導検査の前日にマウスの末端部から後足に至るまで毛髪を完全に除去し、翌日、坐骨神経で運動ニューロンの神経伝導速度を測定するために、活性録音針電極を腓腹筋肉に連結し、基準電極を腓腹筋肉に連結した。刺激陰極を記録電極から６ｍｍ離れた臀部領域に置き、複合筋活動電位と運動神経伝導速度（ＭＮＣＶ）をＮｉｃｏｌｅｔＶｉｋｉｎｇＱｕｅｓｔ（ＮａｔｕｓＭｅｄｉｃａｌ，ＳａｎＣａｒｌｏｓ，ＣＡ）機器で測定した。野生型マウスに比べてＣ２２マウスは非常に低いＭＮＣＶ及びＣＭＡＰを示した。これに対し、ヒトＬｅｆｔｙＡ融合タンパク質変異体を投与したＣ２２マウスは、ビークル（ｖｅｈｉｃｌｅ）投与群に比べて神経伝達速度（ＭＮＣＳ）及び活動電位（ＣＭＡＰ）が有意に増加した（図８）。

実施例８－２：行動評価
行動評価としては、ロータロッド試験とグリップ強度分析を行った。
ロータロッド試験は、具体的に、３ｃｍ水平回転棒（２ｍ／分）にマウスを位置させた後、堪える時間を測定して行った。本実験前にマウスは３日間の訓練期間を有し、実験期間中に毎週４回実施した。記録を、回転棒上では最長５分まで測定して平均値を表示した。図８Ａに示すように、下肢筋力が、野生マウスと比較してＣ２２マウスは顕著に劣るが、ヒトＬｅｆｔｙＡ融合タンパク質変異体投与時にＣ２２マウスの下肢筋力が約２倍以上回復することを確認した（図９Ａ）。

グリップ強度（ｇｒｉｐｓｔｒｅｎｇｔｈ）分析は、マウスの神経筋機能を評価するために行われた。グリップ強度メーターを用いて、マウスが足指で金属取っ手又は三角形の引き棒を握るようにし、マウスの尾の起始部位を取って体を水平に維持させた後、一定の速度で引っ張る。棒を放す時点のゲージに表示された数値を記録した。ヒトＬｅｆｔｙＡ融合タンパク質変異体を投与したＣ２２マウスの坐骨神経調節下に筋肉の変化を観察するために、３～４週齢マウスで下肢のグリップ強度を測定した。ヒトＬｅｆｔｙＡ融合タンパク質変異体投与群のグリップ強度は約３倍向上した（図９Ｂ）。

実施例９：ＣＭＴ疾患モデルＣ２２マウスにおいてヒトＬｅｆｔｙＡ融合タンパク質変異体（Ｘ－４２）の腹腔内注射（ＩＰ）による筋肉量増加効果（ｐ６マウス）
ヒトＬｅｆｔｙＡ融合タンパク質変異体による筋肉量の変化を、６日目野生型マウス或いはＣ２２マウスから確認した。腹膜に２日に１回ずつＰＢＳ又はヒトＬｅｆｔｙＡ融合タンパク質変異体（１０μｇ／ｋｇ）を１０回投与した後、磁気共鳴映像を用いて腓腹筋肉面積を測定した。ヒトＬｅｆｔｙＡ融合タンパク質変異体投与時に、野生型マウスの他にＣＭＴ１モデルマウスでも筋肉量を有意に増加させる効果を確認した（図１０）。

実施例１０：Ｃ２２マウスにおいてヒトＬｅｆｔｙＡ融合タンパク質変異体（Ｘ－４２）の腹腔内注射（ＩＰ）によるマウスの歩きぶり改善効果（ｐ６マウス）
ＬｅｆｔｙＡ融合タンパク質変異体によるＣ２２マウスの歩きぶり改善効果を確認するために、６日目マウス腹膜に２日に１回ずつＰＢＳ又はヒトＬｅｆｔｙＡ融合タンパク質変異体（１０μｇ／ｋｇ）を１０回投与した後、歩幅（行動範囲）の向上と尻、膝、足首関節を含む関節角の変化を調査した（図１１）。マウスを制限された経路に通過させた後、歩行を追跡し、２つの媒介変数の歩幅（行動範囲）と支持基底面（ＢＯＳ）で比較した。歩幅（行動範囲）の長さ（ｓｔｒｉｄｅｌｅｎｇｔｈ）は、右後足、左後足の足跡を追跡して計算し、歩幅（行動範囲）の左側と右側を計算してＢＯＳ値を求めた。その結果、ＬｅｆｔｙＡ融合タンパク質変異体を投与したマウス群において骨盤歩幅（行動範囲）の改善が観察された（図１１の左上）。

野生型マウスと比較して、Ｃ２２マウスは、神経問題によって歩行時に臀部、膝及び足首の関節角度で急な変化を示すが、統計グラフに見られるように、ＬｅｆｔｙＡ融合タンパク質投与時にＣ２２マウス角度変化が改善された（図１１左下）。この結果は、野生型マウスのように完全には回復しなかったが、神経がある程度回復したことを示している。

実施例１１：Ｃ２２マウスにおいてヒトＬｅｆｔｙＡ融合タンパク質変異体（ＣＸ－２０１）の腹腔内注射（ＩＰ）による神経機能及び運動機能改善（ｐ６マウス）
ヒトＬｅｆｔｙＡ融合タンパク質変異体であるＣＸ－２０１を、０．２ｍｇ／ｋｇの容量でＣ２２マウスの髄鞘が形成される前である生後６日目（ｐ６マウス）から２４日目まで２日ごとに総１０回、腹腔内注射（ＩＰ；ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）し、実施例８におけるように、電気生理学的神経機能の改善及び行動評価による運動機能の改善を観察した。

ヒトＬｅｆｔｙＡ融合タンパク質変異体ＣＸ－２０１を投与したＣ２２マウスは、ビークル投与群に比べて、神経伝達速度（ＭＮＣＳ）及び活動電位（ＣＭＡＰ）が有意に増加した（図１２）。

また、図１３に示すように、ヒトＬｅｆｔｙＡ融合タンパク質変異体ＣＸ２０１投与時に、Ｃ２２マウスのグリップ強度及び下肢筋力も有意に改善することを確認した。

実施例１２：ＣＭＴ疾患モデルＣ２２マウスにおいてヒトＬｅｆｔｙＡ融合タンパク質変異体（ＣＸ－２０１）の腹腔内注射（ＩＰ）によるマウスの歩きぶり改善効果（ｐ６マウス）
ＬｅｆｔｙＡ融合タンパク質変異体ＣＸ２０１によるＣ２２マウスの歩きぶり改善効果を確認するために、６日目マウス腹膜に２日に１回ずつＰＢＳ又はヒトＬｅｆｔｙＡ融合タンパク質変異体（２００μｇ／ｋｇ）を１０回投与した後、実施例１０におけるように歩行分析を行った。特に、一足のかかとから次の同足のかかとまでの歩幅（行動範囲）の長さ（ｓｔｒｉｄｅｌｅｎｇｔｈ）測定時に、ＬｅｆｔｙＡ融合タンパク質変異体を投与したＣＭＴ疾患マウスＣ２２の歩行が統計的に有意に改善された（図１４）。

実施例１３：Ｃ２２マウスにおいてヒトＬｅｆｔｙＡ融合タンパク質変異体の皮下注射による神経機能及び運動機能改善（ｐ２１マウス）
ヒトＬｅｆｔｙＡ融合タンパク質変異体であるＣＸ－２０１を、Ｃ２２マウスの髄鞘が形成された後である生後２１日目（ｐ２１マウス）から４週間に皮下注射（ＳＱ；ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）し、電気生理学的神経機能及び行動評価による運動機能を測定した。

ＣＸ２０１を投与したＣ２２マウスはビークル投与群に比べて、神経伝達速度も活動電位も有意に増加した（図１５）。特に、雄マウスにおいてグリップ強度が有意に増加した（図１６）。この結果から、髄鞘形成時期の直前（生後６日）の他、髄鞘形成時期が経った（生後２１日）後に投与しても神経機能及び行同期能を改善できることが分かった。

実施例１４：ヒトＬｅｆｔｙＡ融合タンパク質変異体によるミオスタチン信号伝達（ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）阻害
ヒトＬｅｆｔｙＡ融合タンパク質変異体がミオスタチン信号伝達を阻害できる否かをレポーター遺伝子分析によって評価した。横紋筋肉腫Ａ２０４細胞をＳｍａｄ２／３－反応性ルシフェラーゼレポーターベクターｐＧＬ４．４８（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＵＳＡ）で形質感染させた後、抗生剤選別によって、安定してベクターが形質感染された細胞を選別した。ミオスタチンと様々な濃度のヒトＬｅｆｔｙＡ融合タンパク質変異体を含有する培養培地を細胞に添加する前に３７℃で４５分間反応させた。培地を添加した後、細胞を６時間培養した後、Ｂｉｏ－ｇｌｏｌｕｃｉｅｒａｓｅ分析試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＵＳＡ）を用いて、ミオスタチンによって誘導されたルシフェラーゼ活性を検出した。ミオスタチンは、ベクターが安定に導入された細胞株で強いルシフェラーゼ発現を誘導し、ヒトＬｅｆｔｙＡ融合タンパク質変異体は容量依存的にミオスタチン信号伝達を抑制した（図１７）。

実施例１５：ヒトＬｅｆｔｙＡ融合タンパク質変異体によるｐ－ｐ３８信号伝達抑制
ＴＧＦ－ｂファミリーＢＭＰ７は、末梢神経においてミエリン構成遺伝子の発現を阻害し、これはｐ３８のリン酸化によってなされると知られているので（ＬｉｕＸｅｔａｌ．，ＳｃｉＲｅｐ６：３１０４９（２０１６））、ヒトＬｅｆｔｙＡ融合タンパク質変異体がｐ３８リン酸化を阻害できる否かを調べてみた。具体的に、実施例７のようにＣ２２マウスにヒトＬｅｆｔｙＡ融合タンパク質変異体を投与後、坐骨神経のリン酸化されたｐ３８をウェスタンブロット法で分析した。

図１８に示すように、ヒトＬｅｆｔｙＡ融合タンパク質変異体が投与されたＣ２２マウスの坐骨神経では、ｐ３８のリン酸化が抑制され、ミエリン構成タンパク質であるＭＢＰタンパク質発現が増加した。すなわち、この結果から、ヒトＬｅｆｔｙＡ融合タンパク質変異体は、髄鞘化の陰性調節子であるｐ３８信号伝達を遮断することによって末梢神経病、特に脱髄鞘化による神経病治療剤として利用できることが分かる。

実施例１６：ヒトＬｅｆｔｙＡ融合タンパク質変異体生産細胞株の作製
ＣＨＯ－Ｓ（ｃＧＭＰ－ｂａｎｋｅｄ）細胞を１２５ｍＬ三角フラスコ（Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒｆｌａｓｋ）に１ｍＬにつき１×１０^６個でＣＤ－ＦｏｒｔｉＣＨＯ培地３０ｍＬに接種して準備した。５０ｍＬ円錐管（Ｃｏｎｉｃａｌｔｕｂｅ）にヒトＬｅｆｔｙＡ融合タンパク質変異体（ＣＸ２０１ｓ；ＣＸ２０１融合タンパク質において信号配列として抗体由来ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＦＰＧＳＲＣ配列を使用；ヒトＬｅｆｔｙＡとヒトＩｇＧ１Ｆｃとの間にＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳリンカーで連結；表１６、配列番号１３３）遺伝子が挿入された発現ベクター５０μｇを入れ、最終体積（ｆｉｎａｌｖｏｌｕｍｅ）が１．５ｍＬとなるようにＯｐｔｉＰＲＯＳＦＭを入れた後に混ぜた。別の５０ｍＬ円錐管にフリースタイルＭＡＸ試薬（ＦｒｅｅｓｔｙｌｅＭＡＸｓｏｌｕｔｉｏｎ）５０μＬを入れ、最終体積が１．５ｍＬとなるようにＯｐｔｉＰＲＯＳＦＭを入れた後に混ぜた。フリースタイルＭＡＸ溶液をＤＮＡ溶液に添加後に１０分間室温に放置した。１０分後、細胞の入っている三角フラスコにＤＮＡ－フリースタイルＭＡＸ試薬複合体を処理して形質転換した。

１次、２次選別を順次に行って遺伝子増幅を誘導した。１次及び２次選別が終了したプール（ｐｏｏｌ）のうち、最も発現量が高かった条件として選別されたプールでＣｌｏｎｅＰｉｘを用いてＣＸ２０１ｓ生産細胞株を選別した。選別されたクローンを６日間種培養した後、１．０×１０^７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ濃度となるように凍結培地（ＣＤ－ＦｏｒｔｉＣＨＯ培地９０％＋ＤＭＳＯ１０％）に懸濁して１ｍＬずつクライオチューブ（ｃｒｙｏｔｕｂｅ）に分注し、ＲＣＢ（Ｒｅｓｅａｒｃｈｃｅｌｌｂａｎｋ）を製造した。

実施例１７：Ｃ２２マウスにおいてヒトＬｅｆｔｙＡ融合タンパク質変異体の皮下注射による神経機能及び運動機能改善（ｐ３５マウス）
マウス末梢神経で髄鞘化が進行された後である５週齢（ｐ３５）時期のＣ２２マウスに、４週間皮下経路で、ヒトＬｅｆｔｙＡ融合タンパク質変異体であるＣＸ２０１ｓを５ｍｇ／ｋｇ容量で週２回又は１回、或いは１０ｍｇ／ｋｇ容量で週１回投与した。実施例８におけるように電気生理学的神経機能を評価した。ＣＸ２０１ｓを投与したＣ２２マウスはビークル投与群に比べて、神経伝達速度（ＮＣＶ）も活動電位（ＣＭＡＰ）も有意に増加した（図１９）。

運動機能評価のために、ロータロッド試験とグリップ強度分析を行った。ロータロッド試験は、１２ｒｐｍで回転する棒にマウスを位置させた後、堪える時間を測定して行った。回転棒上で最長２００秒まで測定し、３回実施した平均値を表示した。図１９に示すように、ＣＸ２０１ｓ投与時にビークル投与群に比べてＣ２２マウスの下肢筋力が統計的に有意に改善されることを確認した。また、マウスの神経筋機能を評価するために、グリップ強度メーターを用いてマウス四肢グリップ強度を測定した。ヒトＣＸ２０１ｓを５ｍｇ／ｋｇで週２回投与した時に、統計的に有意に四肢グリップ強度が改善された（図２０）。

要するに、ヒトＬｅｆｔｙＡ融合タンパク質変異体ＣＸ２０１ｓは、５週齢Ｃ２２マウスに４週以上皮下投与時にＣ２２マウスの神経伝導及び運動機能を改善させ、特に、５ｍｇ／ｋｇ容量で週２回投与時に改善効果が高かった。

実施例１８：ヒトＬｅｆｔｙＡ融合タンパク質変異体によるＮｏｄａｌ信号伝達阻害
ＮｏｄａｌはＴＧＦｂファミリーであり、Ｓｍａｄ信号伝達を活性化させる。ＮｏｄａｌがＡｃｔｉｖｉｎ受容体に結合すれば、これからＳｍａｄ２とＳｍａｄ３がリン酸化され、Ｓｍａｄ４と結合して核に移動した後、様々な遺伝子の転写を調節する。ヒトＬｅｆｔｙＡ融合タンパク質変異体がＮｏｄａｌによるＳｍａｄ信号伝達を阻害できるか否かを、Ｎｏｄａｌに反応性があるＰ１９マウス胚芽癌細胞株を用いて評価した。

具体的に、Ｎｏｄａｌと様々な濃度のヒトＬｅｆｔｙＡ融合タンパク質変異体ＣＸ２０１ｓとを３０分間あらかじめ反応させた。Ｎｏｄａｌ単独或いはＮｏｄａｌ－ＬｅｆｔｙＡ融合タンパク質変異体を細胞に１時間処理した後、細胞溶解物（ｃｅｌｌｌｙｓａｔｅｓ）からウェスタンブロット分析により、Ｎｏｄａｌによって誘導されたＳｍａｄ３リン酸化を検出した。Ｎｏｄａｌタンパク質を単独で処理した時、強いＳｍａｄ３リン酸化が誘導されることが確認され、ヒトＬｅｆｔｙＡ融合タンパク質変異体は容量依存的にＮｏｄａｌによるＳｍａｄ３リン酸化を抑制した（図２１）。

本発明は、ヒトＬｅｆｔｙＡタンパク質変異体及び前記変異体を含む融合タンパク質を作製することによって、自然的に存在するヒトＬｅｆｔｙＡタンパク質に比べて優れた安定性に基づいて動物細胞において発現量及び生産収率を向上させた。また、前記作製したヒトＬｅｆｔｙＡタンパク質変異体又は融合タンパク質を投与すれば神経疾患モデル動物の神経機能及び運動機能を回復させることができるので、ヒトＬｅｆｔｙＡタンパク質変異体又は融合タンパク質を用いて様々な神経疾患及び筋肉疾患を効果的に予防又は治療することができる。

以上、本発明内容の特定の部分を詳細に記述したところ、当業界における通常の知識を有する者にとって、このような具体的記述は単に好ましい実施様態であるだけで、これによって本発明の範囲が制限されない点は明らかであろう。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付する請求項及びそれらの等価物によって定義されるといえよう。

Claims

配列番号１３４～１７８で表されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列の１～３４５アミノ酸残基を含む、
ヒトＬｅｆｔｙＡタンパク質変異体。
前記ヒトＬｅｆｔｙＡタンパク質変異体は、Ｎ末端にシグナルペプチド（ｓｉｇｎａｌｐｅｐｔｉｄｅ）をさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載のヒトＬｅｆｔｙ
Ａタンパク質変異体。
請求項１又は２に記載のヒトＬｅｆｔｙＡタンパク質変異体を含み、前記ヒトＬｅｆｔｙＡタンパク質変異体と、Ｆｃ又はアルブミンとが融合している、融合タンパク質。
ヒトＬｅｆｔｙＡタンパク質変異体のＣ末端にＦｃ又はアルブミンが融合していることを特徴とする、請求項３に記載の融合タンパク質。
ヒトＬｅｆｔｙＡタンパク質変異体と、Ｆｃ又はアルブミンとはリンカーを媒介に融合していることを特徴とする、請求項３に記載の融合タンパク質。
配列番号１３４～配列番号１７８のアミノ酸配列からなる群から選ばれるいずれか一つのアミノ酸配列で表されることを特徴とする、請求項３に記載の融合タンパク質。
請求項３に記載の融合タンパク質をコードする核酸分子。
請求項７に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
請求項８に記載の発現ベクターが導入された宿主細胞。
請求項９に記載の宿主細胞を用いたヒトＬｅｆｔｙＡタンパク質変異体を含む融合タンパク質を生産する方法。
請求項１又は２に記載のヒトＬｅｆｔｙＡタンパク質変異体又はこれを含む融合タンパク質を含む、神経筋肉疾患の予防及び／又は治療用組成物。
前記神経筋肉疾患は、Ｎｏｄａｌ及び／又はミオスタチン信号伝達関連疾患であることを特徴とする、請求項１１に記載の神経筋肉疾患の予防及び／又は治療用組成物。
前記Ｎｏｄａｌ及び／又はミオスタチン信号伝達関連疾患は、ミオパシー、末梢神経障害又は強直性脊椎症候群であることを特徴とする、請求項１２に記載の神経筋肉疾患の予防及び／又は治療用組成物。
前記ミオパシーは、筋肉減少症（Ｓａｒｃｏｐｅｎｉａ）、筋ジストロフィー（Ｍｕｓｃｕｌａｒｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、重症筋無力症（ｍｙａｓｔｈｅｎｉａｇｒａｖｉｓ）、筋萎縮性側索硬化症（Ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃｌａｔｅｒａｌｓｃｌｅｒｏｓｉｓ、ルーゲリック病）、原発性側索硬化症（Ｐｒｉｍａｒｙｌａｔｅｒａｌｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、進行性筋萎縮症（Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅｍｕｓｃｕｌａｒａｔｒｏｐｈｙ）、ケネディ病（Ｓｐｉｎｏｂｕｌｂａｒｍｕｓｃｕｌａｒａｔｒｏｐｈｙ）、脊髄性筋萎縮症（Ｓｐｉｎａｌｍｕｓｃｕｌａｒａｔｒｏｐｈｙ）及び末梢性ミオパシー（Ｄｉｓｔａｌｍｙｏｐａｔｈｙ）からなる群から選ばれることを特徴とする、請求項１３に記載の神経筋肉疾患の予防及び／又は治療用組成物。
前記末梢神経障害は、シャルコーマリートゥース病（Ｃｈａｒｃｏｔ－Ｍａｒｉｅ－Ｔｏｏｔｈｄｉｓｅａｓｅ）、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパシー（Ｃｈｒｏｎｉｃｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙｄｅｍｙｅｌｉｎａｔｉｎｇｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ）、手根管症候群（ｃａｒｐａｌｔｕｎｎｅｌｓｙｎｄｒｏｍｅ）、糖尿病性末梢神経障害（Ｄｉａｂｅｔｉｃｐｅｒｉｐｈｅｒａｌｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ）及びギランバレー症候群（Ｇｕｉｌｌａｉｎ－Ｂａｒｒｅｓｙｎｄｒｏｍｅ）からなる群から選ばれることを特徴とする、請求項１３に記載の神経筋肉疾患の予防及び／又は治療用組成物。