CN101152561A - Lefty蛋白在抑制器官纤维化病变中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种Lefty蛋白在抑制器官纤维化病变中的应用,该Lefty蛋白作为制备拮抗TGF-β、Nodal、BMP、p38MAPK信号通路的药物在基础研究中的应用和将Lefty蛋白作为制备治疗或预防在肝、肾、肺、心肌、皮肤等器官和组织纤维化病变的药物中的应用。抑制纤维化疾病相关信号通路(如TGF-β/Smad、Nodal信号通路)和活化具有抑制纤维化的相关蛋白水解酶类(如MMP、明胶酶等)两大方面。是极具潜在临床应用价值的生物制剂,还可为进一步探讨纤维化疾病的发生机制提供帮助。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学和细胞信号转导领域。涉及将Lefty蛋白用于抑制多种器官及组织的纤维化病变,该蛋白一方面通过抑制纤维化相关的信号转导通路(转化生长因子[TGF]-β、Nodal等)而下调组织胶原蛋白的产生,另一方面则通过上调多种蛋白水解酶的活性而促进纤维化组织的分解。同时涉及该蛋白的制备方法,以及该蛋白作为制备治疗或预防在肝、肾、肺、心肌、皮肤等器官和组织纤维化病变的机制研究和临床药物中的应用。
背景技术
各种原因诱发的重要脏器的慢性纤维化,常伴有器官功能的进行性下降,最终导致器官衰竭甚至患者的死亡,目前纤维化疾病还是医学领域的主要难题之一。近年来,各种细胞信号转导通路在纤维化发生发展过程中的作用已越来越受到人们的关注,报道较多的有TGF-β/Smad通路[见参考文献:Mauviel A.Transforming growth factor beta:a keymediator of fibrosis.Methods Mol Med,2005,11(7):69-80.]、p38丝裂原激活的蛋白激酶(MAPK)通路[见参考文献:Stambe C,Atkins RC,Tesch GH,et al.The role of p38alphamitogen-activated protein kinase activation in renal fibrosis.J Am Soc Nephrol.2004,15(2):370-379.]、Rho-ROCK通路[见参考文献:Nagatoya K,Moriyama T,Kawada N,et al.Y-27632prevents tubulointerstitial fibrosis in mouse kidney with unilateral ureteralobstruction.Kidney Int,2002,61(5):1684-1695.]、PI-3K通路[见参考文献:Derynck R,Zbang YE.Smad-dependent and Smad-independent pathways in TGF-beta family signaling.Nature,2003,425(6958):577-584.]等等。目前,针对各信号通路发现或寻找出的干预靶点已有数十种之多,而针对这些靶点进行基础研究和临床应用的药物或制剂更是数不胜数。总的说来,这些治疗方法(方案)均有其各自的不足,要么仅减少胶原基质的生成,要么仅增加胶原基质的降解,几乎没有在整体上同时从这两个方面“双管齐下”的治疗手段。然而,尽管以上信号通路各自的作用效果及其相关关系尚未完全明了,但TGF-β已被大多数学者公认为是纤维化形成与发展的启动枢纽,是最为关键性细胞因子[见参考文献:Mauviel A.Transforming growth factor beta:a key mediator of fibrosis.MethodsMol Med,2005,11(7):69-80.],可以说,针对该信号通路找到有效的干预手段,将有助于延缓或逆转组织、脏器的纤维化进程,这一点依然是我们在研究工作中应当重点考虑的。
1996年,Meno等[见参考文献:Meno C,Saijoh Y,Fujii H,et al.Left-right asymmetricexpression of the TGF beta-family member lefty in mouse embryos.Nature,1996,381(6578):151-155.]首次在小鼠的胚胎中发现了一种呈左右不对称性表达的蛋白。因检测出该蛋白仅(短暂)出现于小鼠原肠胚(gastrulating mouse embryos)的左半部分组织,遂将其命名为Lefty蛋白,并推测这种蛋白与胚胎发育的左-右不对称性(left-right asymmetry)有关,这一发现被刊登于当年的《Nature》杂志上。1999年,Thisse等[见参考文献:Thisse C,Thisse B.Antivin,a novel and divergent member of the TGF-beta superfamily,negatively regulates mesoderm induction.Development,1999,126(2):229-240.]在研究TGF-β诱导斑马鱼(Zebrafish)胚胎中胚层发生的机制时,发现了Lefty对TGF-β信号通路具有抑制作用,从而开创了利用Lefty蛋白的作用来治疗纤维化疾病的新领域。其后,国外的几家实验室对该问题进行了更加深入的研究,所获得成果令人振奋!
Ulloa等[见参考文献:Ulloa L,Tabibzadeh S.Lefty inhibits R-Smad phosphorylationinduced by activated TGF-beta receptor.J Biol Chem.2001,276(14):21397-21404.]的研究结果提示,经过Lefty的干预,TGF-β受体对Smad2(受体激活型Smad,R-Smad)的磷酸化作用受到抑制;R-Smad与Smad4(通用型Smad,Co-Smad)的结合以及结合后所形成之共聚物的核转移亦受到了抑制;同时发现TGF-β所诱导的p21、cdc25、结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)以及由Smad结合元件(Smad-bindingelement,SBE)所调控的一组报告基因的表达水平显著降低;另外Smad5的磷酸化和基因转录(受骨形成蛋白[bone morphogenetic protein,BMP]的介导)也受到了抑制。因此,该小组得出结论:Lefty能够影响TGF-β和BMP相关基因的表达,能够通过抑制R-Smad的磷酸化而参与TGF-β和BMP信号通路的负调节,而这些作用均不依赖于任何抑制性蛋白的合成,包括抑制型Smad(I-Smad)。
Mason等[见参考文献:Mason JM,Xu HP,Rao SK,et al.Lefty contributes to theremodeling of extracellular matrix by inhibition of connective tissue growth factor andcollagen mRNA expression and increased proteolytic activity in a fibrosarcoma model.J BiolChem,2002,277(1):407-415.]将转染了leftyA基因的小鼠纤维瘤(GP+E86)细胞接种至裸鼠皮下,结果发现,转染leftyA后的GP+E86细胞在体内产生胶原的能力显著降低甚至消失;胞内CTGF和其下游的I型胶原(Collagen type I,Col-I)的mRNA表达分别降低了4.7倍和2.8倍;蛋白水解酶活性分析提示细胞内溶胶原、溶明胶、促组织离解等酶的活性均明显增加;组织学图片显示实验组ECM的面积远远小于对照组。该结果提示:Lefty蛋白能够通过抑制CTGF、Col-I等蛋白的基因转录和诱导数种蛋白水解酶的活化,从而表现出减少胶原蛋白沉积的作用,暗示了其在抗纤维化疾病中的诱人前景。
发明内容
本发明的目的是提供一种Lefty蛋白(Locus:NM003240)作为制备拮抗TGF-β、Nodal、BMP、p38MAPK信号通路的药物中的应用。该蛋白能够明显抑制TGF-β、Nodal、BMP、p38MAPK信号通路的关键因子如CTGF、goosecoid、BMPR-I和p38MAPK等的表达,从而发挥其减少纤维化胶原基质产生的作用。
本发明的另一个目的是提供一种Lefty蛋白作为制备治疗或预防在肝、肾、肺、心肌、皮肤等器官和组织纤维化病变的药物中的应用。该蛋白能够有效上调肝、肾、肺、心肌、皮肤纤维瘤组织中几种蛋白水解酶的活性,包括明胶酶、酪蛋白酶、基质金属蛋白酶(MMP)等,从而发挥其增加胶原基质降解的作用。两方面作用相结合,最终起到抑制以上各器官和组织纤维化病变的作用。
本发明技术方案如下:
1.Lefty蛋白的制备方法
A.lefty基因的转染:lefty-A/pcDNA1质粒[见参考文献:Tabibzadeh S.Role ofEBAF/Lefty in implantation and uterine bleeding.Ernst Schering Res Found Workshop,2005,(52):159-189.]-脂质体转染GP+E86细胞(购于美国典型培养物保藏中心,ATCC),令其强制表达所需Lefty蛋白。
B.Lefty蛋白的亲和与纯化:将兔源性抗Lefty A抗体(A353或A44)[见参考文献:Ulloa L,Creemers JW,Roy S,et al.Lefty proteins exhibit unique processing and activate theMAPK pathway.J Biol Chem,2001,276(24):21387-21396.]加入到氰基活化的Sepharose4B以制备A353或A44亲和柱。将lefty转染细胞的条件培养基[DMEM+0.015mg/mlhypoxanthine+0.25mg/ml xanthine+0.025mg/ml mycophenolic acid+90%calf serum(10%)]加入到A353/A44-Sepharose 4B悬液,室温(20-25℃)孵育1小时后将结合了Lefty蛋白的Sepharose 4B倒入亲和柱,反复清洗3次。洗脱的蛋白经PBS透析于4℃下保存。鉴定所得纯化Lefty蛋白的量。
2.Lefty蛋白在体外作为制备抑制纤维化病变相关信号通路的药物中的应用
A.Lefty蛋白作为制备拮抗TGF-β信号通路的药物中的应用
将lefty基因转染至P19细胞(购于美国典型培养物保藏中心,ATCC)。向条件培养基[90%的最低基础培养基α+核糖核苷+脱氧核糖核苷+7.5%小牛血清+2.5%胎牛血清]中分别加入不同浓度的TGF-β1,37℃,5%CO2温箱孵育,再分别于不同时间用PBS反复洗涤5次后收获细胞。裂解后用Western blotting法检测各时间点的反应产物中磷酸化的Smad2、Smad3、Smad5和Smad4、α-SMA的表达。
B.Lefty蛋白作为制备拮抗Nodal信号通路的药物中的应用
将lefty基因转染至成纤维细胞(Fibroblast,FB)。分别于不同时间用PBS反复洗涤3次收获细胞。裂解后提取总RNA,分别检测各时间点细胞中Nodal相关基因cyclops、squint、goosecoid、no-tail和pitx2等的表达情况。
C.Lefty蛋白作为制备抑制BMP信号通路的药物中的应用
将lefty基因转染至293T细胞(购于美国典型培养物保藏中心,ATCC)。向条件培养基[DMEM+4mM L-谷氨酰胺+1.5g/L Na2CO3+4.5g/L葡萄糖+90%胎牛血清(10%)]中分别加入不同浓度的TGF-β1,再分别于不同时间用PBS反复洗涤3次后收获细胞。用Western blotting法检测各时间点Lefty对磷酸化Smad5和BMPR-II、BMPR-I、Smad6、GDF-8、BMP2、BMP7表达的影响,以及应用Real time PCR技术检测各指标mRNA的表达情况。
D.Lefty蛋白作为制备拮抗p38MAPK信号通路的药物中的应用
将lefty基因转染至成纤维细胞。反复洗涤5次收获细胞。超声粉碎后留取上清,测定样品的总蛋白浓度。取含总蛋白200g的相应体积的上清液,用免疫沉淀结合特异性底物磷酸化法测定其中p38MAPK的活性。
3.Lefty蛋白在体内作为制备治疗或预防纤维化病变的药物中的应用
A.Lefty蛋白在体内作为制备治疗或预防肝纤维化病变的药物中的应用
用改良硫代乙酸胺(TAA)法建立大鼠肝纤维化模型[见参考文献:张杰,陈积圣,王坤,等.硫代乙酰胺诱导肝硬化模型方法的改进.中华实验外科杂志,1999,16:567-568.]。麻醉后先取小块肝组织标本。再将脂质体-lefty-A/pcDNA1质粒复合物注入肝脏并标记注射部位用。3周后,取注射部位和非注射部位的肝组织标本,行HE染色,采用免疫组化、Western-blotting和RT-PCR法分别检测肝组织中Lefty蛋白、α-SMA、基质金属蛋白酶、明胶酶、I型胶原、II型胶原、III型胶原、IV型胶原的蛋白表达和mRNA的表达。
B.Lefty蛋白在体内作为制备治疗或预防肾纤维化病变的药物中的应用
建立大鼠UUO-肾纤维化模型[见参考文献:Jeremiah M,Keith H,Guo GJ,et al.Bonemorphogenetic protein-7 improves renal fibrosis and accelerates the return of renal function.J Am Soc Nephrol,2002,13:S14-S21.]。2周后经鼠尾静脉注射脂质体-lefty-A/pcDNA1质粒复合物,分别于术后不同时间处死动物并摘取患肾,用Real time PCR技术检测纤维化肾脏组织中结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)、I型胶原、II型胶原、III型胶原、IV型胶原基因的表达水平;应用磷酸化Smad2、Smad3、Smad5和Smad4、α-SMA抗体,经Western blotting法检测各时间点的反应产物中磷酸化的Smad2、Smad3、Smad5和Smad4、α-SMA的表达;用比色测定法检测蛋白水解酶的活性;用酪蛋白和明胶酶谱法检测相应的两种蛋白酶的活性。
C.Lefty蛋白在体内作为制备治疗或预防肺纤维化病变的药物中的应用
先通过气管内滴人lefty-A/pcDNA1质粒或空质粒向小鼠肺组织给药。然后以全胸腔射线照射,以建立肺纤维化模型。建模完成后取新鲜肺组织,测I型胶原、III型胶原、CTGF和TGF-β的表达。在光学显微镜下观察并评价肺泡炎及肺纤维化的程度。
D.Lefty蛋白在体内作为制备治疗或预防心肌纤维化病变的药物中的应用
建立大鼠高血压-心肌纤维化模型。同时经腹腔注射脂质体-lefty-A/pcDNA1质粒复合物。所有动物8周后处死并摘取心脏。用Real time PCR技术检测纤维化肾脏组织中CTGF、I型胶原、II型胶原、III型胶原、IV型胶原基因的表达水平;应用磷酸化Smad2、Smad3、Smad5和Smad4、α-SMA抗体,经Western blotting法检测各时间点的反应产物中磷酸化的Smad2、Smad3、Smad5和Smad4、α-SMA的表达;用比色测定法检测蛋白水解酶的活性;用明胶酶谱法检测明胶酶的活性。
E.Lefty蛋白在体内作为制备治疗或预防皮肤纤维瘤的药物中的应用
取孵育之经leftyA基因转染的GP+E86细胞,吹打成单细胞悬液,注射于无胸腺裸鼠背部皮下。分别于术后不同时间处死动物摘取肿瘤,用Real time PCR技术检测肿瘤组织中CTGF、I型胶原、II型胶原、III型胶原、IV型胶原基因的表达水平;用Westernblotting技术检测以上各指标的蛋白表达情况;用比色测定法检测蛋白水解酶的活性;用酪蛋白和明胶酶谱法检测相应的两种蛋白酶的活性。
上述制备的蛋白的生物学特性、作用和功能:
本发明提供了一种能抑制器官纤维化病变的蛋白及其制备方法和应用。
Lefty是一种分泌性蛋白,其前原蛋白(pro-proprotein)相对分子量为42kDa,经过蛋白水解酶在Arg77和Arg135两个位点酶切后,分别形成34kDa和28kDa两种成熟多肽,进而被分泌出细胞执行各自的生理学功能。作为TGF-β超家族成员之一,Lefty具有该家族典型的蛋白结构特点,即含有7个保守的半胱氨酸残基以形成特殊的半胱氨酸结(cysteine knot)结构域(图1)。但Lefty蛋白又有着自己独特的结构特点,也是与TGF-β等的不同之处:(1)TGF-β等蛋白的羧基端常常为CX1CX1序列,而Lefty则含有更长的CX1CX13序列;(2)TGF-β等的前原蛋白常常在唯一的一个RXXR位点被酶切,进而释放出含110-140个氨基酸(amino acid,aa)的成熟蛋白,而Lefty的前原蛋白却含有RGKR(74-77)和RQKR(132-135)两个酶切位点;(3)Lefty蛋白的一级结构中缺少形成分子间二硫键的半胱氨酸残基(见图1),而该残基是TGF-β等形成二聚体所必须的结构,因此,Lefty是TGF-β超家族中为数不多的几个不以二聚体结构存在的成员之一[见参考文献:Tabibzadeh S,Hemmati BA.Lefty at the crossroads of″stemness″anddifferentiative events.Stem Cells,2006,24(9):1998-2006.]。不管是在人体还是小鼠体内,编码Lefty的基因均位于1号染色体长臂的1q42.1区域。
经过实验证明,该蛋白在体外能够抑制TGF-β/Smad信号通路、Nodal信号通路,能够抑制cyclops、squint、goosecoid、no-tail和pitx2的基因表达,能够抑制Smad2、Smad3和Smad5的磷酸化,能够抑制BMPR-II、BMPR-I、Smad6、GDF-8、BMP2、BMP7、α-SMA、CTGF、I型胶原、II型胶原、III型胶原、IV型胶原基因和蛋白的表达(表1、表2),能够增强p38MAPK的活性;在体内增强酪蛋白酶、明胶酶、MMP等水解酶的活性(表3),能够明显抑制肝、肾、肺、心肌和皮肤纤维瘤纤维化组织中细胞外基质的沉积,缩小组织切片中细胞间质的宽度和面积,改善组织的微观结构(图2、图3),对器官功能具有保护作用(图4、图5)。
发明优点和效果:
本发明提供了一种能抑制器官纤维化病变的蛋白及其制备方法和应用。其优点包括:抑制纤维化疾病相关信号通路(如TGF-β/Smad、Nodal信号通路)(表1、2)和活化具有抑制纤维化的相关蛋白水解酶类(如MMP、明胶酶等)(表3)两大方面。是极具潜在临床应用价值的生物制剂,还可为进一步探讨纤维化疾病的发生机制提供帮助。
表1各检测基因条带的相对吸光度(均数±标准差)
基因 | 组别 | 检测细胞/器官 | ||||||
FB | 293T | 肝 | 肾 | 肺 | 心肌 | 皮肤纤维瘤 | ||
cyclopssquintgoosecoidno-tailpitx2BMPR-IIBMPR-IGDF-8BMP-2BMP-7leftyAα-SMAMMPCol-ICol-IICol-III | ExpConExpConExpConExpConExpConExpC0nExpConExpConExpConExpConExpConExpConExpConExpConExpConExpCon | 0.76±0.232.44±0.310.58±0.221.81±0.450.51±0.070.94±0.130.49±0.161.73±0.320.63±0.112.10±0.24---------------------- | ----------1.12±0.401.97±0.160.67±0.242.06±0.110.64±0.071.23±0.310.93±0.221.52±0.260.77±0.152.40±0.30------------ | --------------------2.33±0.210.21±0.080.56±0.151.03±0.332.03±0.280.49±0.070.59±0.111.64±0.380.64±0.221.90±0.270.55±0.110.76±0.20 | ----------------------0.44±0.051.35±0.371.76±0.090.47±0.070.67±0.041.63±0.380.29±0.040.67±0.020.46±0.030.76±0.20 | ----------------------0.61±0.081.22±0.201.94±0.500.47±0.120.61±0.141.48±0.160.29±0.150.77±0.180.51±0.070.84±0.11 | ----------------------0.063±0.121.25±0..222.15±0.390.51±0.110.64±0.092.23±0.190.48±0.161.05±0.220.50±0.080.79±0.19 | ----------------------0.67±0.081.35±0.201.49±0.250.49±0.150.63±0.162.21±0.130.27±0.140.74±0.110.62±0.080.83±0.14 |
Col-IVCTGF | ExpConExpCon | ---- | ---- | 0.77±0.212.55±0.130.59±0.060.94±0.03 | 0.74±0.042.25±0.170.67±0.132.02±0.12 | 0.91±0.162.06±0.140.45±0.091.15±0.31 | 0.88±0.032.31±0.190.65±0.051.72±0.16 | 0.95±0.172.16±0.170.49±0.171.23±0.21 |
表2Westem Blotting检测实验组各蛋白的表达量与对照组的比值
蛋白 | 检测细胞/器官 | ||||||
P19 | 293T | 肝 | 肾 | 肺 | 心肌 | 皮肤纤维瘤 | |
PSmad2* PSmad3* PSmad5*Smad4α-SMASmad6BMPR-IBMPR-IIGDF-8BMP2BMP7CTGFLefty ACol-ICol-IICol-IIICol-IV | 0.660.530.430.840.62------------ | -0.61--0.430.310.370.720.661.21------ | ----0.34-------3.110.310.530.440.28 | 0.530.390.670.730.53------------ | -----------0.46-0.37-0.64- | 0.490.420.570.590.44------------ | -----------0.57-0.490.540.430.21 |
*“P”表示磷酸化蛋白。
表3部分蛋白水解酶的活性比较,实验组吸光度值与对照组的吸光度值(AExp/ACon)
种类 | 检测细胞/器官 | |||
FB | 肾 | 心肌 | 皮肤纤维瘤 | |
p38MAPK酪蛋白酶明胶酶MMP | 0.64--- | -2.045.174.19 | --4.033.67 | -3.113.892.06 |
附图说明
图1Lefty蛋白的II级结构图(与TGF-β2比较)
图中灰色圆点表示两者共有的氨基酸序列,白色圆圈表示序列中的保守性置换,虚线线条表示分子内二硫键,箭头指示的是构成分子间二硫键的半胱氨酸残基。
图2肾组织扫描电镜照片(800×)
经鼠尾静脉给予脂质体-lefty-A/pcDNA1质粒后14天,UUO建模大鼠术侧肾组织中可见肾小管结构较为清晰,小管扩张明显,上皮变矮,小管间隙较窄,少量基质纤维填充其间。
图3肾组织扫描电镜照片(600×)
经鼠尾静脉给予脂质体-空载质粒(对照)后14天,UUO建模大鼠术侧肾组织中可见肾小管已明显失去正常结构,部分小管扩张明显,部分则塌陷而发生纤维化改变,小管间隙增宽明显,填充以大量的细胞外基质,表现为大面积的纤维化改变。
图4UUO大鼠模型术侧肾脏彩色多普勒超声显像+血流频谱图
经鼠尾静脉给予脂质体-lefty-A/pcDNA1质粒后14天,肾脏血流阻力指数RI为0.48,提示肾脏供血尚可,由此推测肾功能未受到较大损害。
图5UUO大鼠模型术侧肾脏彩色多普勒超声显像+血流频谱图
经鼠尾静脉给予脂质体-空载质粒(对照)后14天,肾脏血流阻力指数RI为0.72,提示肾脏供血受到影响,推测肾功能不良。
图6肺纤维化小鼠模型术侧肺叶中I型胶原mRNA的表达情况(RT-PCR)
图中N为正常对照,E1和C1分别代表建模2周时经气管给予脂质体-lefty-A/pcDNA1质粒(实验)组和给予脂质体-空载质粒(对照)组的情况,E2和C2分别代表建模4周时实验组和对照组的情况,M为GAPDH内参。可见在同一时间点,实验组肺组织I型胶原mRNA的表达均低于对照组,说明Lefty具有保护和延缓肺纤维化病变的作用。
具体实施方式
1.Lefty蛋白的制备方法
A.leftyA基因的转染:选用GP+E86细胞(购于美国典型培养物保藏中心,ATCC)用含有10%胎牛血清和100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素的DMEM培养基,至于含5%CO2的37℃孵箱中培养,采用胰蛋白酶(Invitrogen,Inc.)消化法进行细胞传代。细胞转染采用脂质体Lipofectamin 2000(Invitrogen,Inc.)转染试剂。在转染前24小时进行细胞传代,接种于35mm直径的培养皿中。待细胞长满平皿的30%-60%,即可进行转染。首先取4μg lefty-A/pcDNA1质粒用150ul无血清无双抗的DMEM培养基稀释、混匀、室温放置。取6μl Lipofectamin 2000脂质体,用150μl无血清无双抗的DMEM培养基稀释、混匀、室温孵育5分钟。将稀释好的脂质体逐滴加入质粒稀释液中,轻轻摇匀,室温放置20分钟。取出待转染细胞,换2ml无双抗的DMEM培养基,再加入脂质体-lefty-A/pcDNA1质粒复合物,轻摇令其均匀分布于平皿内。细胞置于5%CO2的37℃孵箱中孵育12小时后,将含有脂质体的无双抗培养基吸出,换含10%胎牛血清和100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素的DMEM培养基继续培养2天。
B.LeftyA蛋白的亲和与纯化:将兔源性抗Lefty A抗体(A353或A44)加入到氰基活化的Sepharose 4B以制备A353或A44亲和柱。取lefty转染细胞的条件培养基[DMEM+0.015mg/ml hypoxanthine+0.25mg/ml xanthine+0.025mg/ml mycophenolicacid+90%calf serum(10%)]10ml,加入250μlA353/A44-Sepharose 4B悬液,室温下轻摇孵育1小时。然后将结合了Lefty蛋白的Sepharose 4B倒入一0.7×15cm的柱子。用20倍于其容积的Tris-HCl(50mM,pH 7.5)、NaCl(0.2M)和EDTA(5mM)混合液清洗。分别用0.5倍其容积的[2.5M的NaCl+10mM的Tris-HCl(pH 8.1)+5mM的EDTA]混合液和0.25倍其容积的[50mM的Tris-HCl(pH 7.5)+5mM的EDTA]混合液将结合的Lefty蛋白洗脱。洗脱的蛋白在4℃下经10mM的PBS透析,于4℃下保存。培养基首先用于A353亲和柱,洗脱后的蛋白再经过A44亲和柱,然后再洗脱。洗脱物用A353抗体经Western blotting法鉴定其亲和纯化的蛋白。由A353抗体制备的亲和柱能够结合所有的Lefty蛋白(包括42,34和28kDa三种成分)。A44亲和柱仅结合42kDa的蛋白成分,而是其他两种成分随液流被带走。大规模纯化操作所得纯化之蛋白(分别为Lefty蛋白42,34和28kDa三种成分)的量由Bio-Rad蛋白检测试剂盒鉴定。
2.Lefty蛋白在体外作为制备抑制纤维化病变相关信号通路药物中的应用
A.Lefty蛋白作为制备拮抗TGF-β信号通路的药物中的应用
将lefty基因转染至P19细胞(购于美国典型培养物保藏中心,ATCC)。3天后传代,待细胞进入指数生长期后,向条件培养基[90%的最低基础培养基α+核糖核苷+脱氧核糖核苷+7.5%小牛血清+2.5%胎牛血清]中分别加入含有0ng/ml、0.5ng/ml、1.0ng/ml、2.5ng/ml、5ng/ml五种浓度TGF-β1的DMEM培养基,37℃,5%CO2温箱孵育,再分别于1小时、2小时、3小时、6小时、12小时、24小时、48小时取出平皿,用PBS反复洗涤5次后收获细胞。采用超声破碎法裂解细胞后,于4℃下1000rpm离心3分钟,分别收集上清和沉淀。应用磷酸化Smad2、Smad3、Smad5和Smad4、α-SMA抗体,经Western blotting法检测各时间点的反应产物中磷酸化的Smad2、Smad3、Smad5和Smad4、α-SMA的表达。
B.Lefty蛋白作为制备拮抗Nodal信号通路的药物中的应用
将lefty基因转染至成纤维细胞中。2天后传代,待细胞进入指数生长期后,分别于1小时、2小时、3小时、6小时、12小时、24小时、48小时取出平皿,用PBS(137mMNaCl、22.7mM KCl、10mM Na2HPO4、2mM KH2PO4)反复洗涤3次收获细胞。采用超声破碎法裂解细胞后,于4℃下1000rpm离心3分钟,弃上清。用Promega的总RNA提取试剂盒(Invitrogen,Inc.)从上述制备好的细胞中提取总RNA,应用实时定量多聚酶链反应(Real time PCR)技术,分别检测各时间点细胞中Nodal相关基因cyclops、squint、goosecoid、no-tail和pitx2等的表达情况。
C.Lefty蛋白作为制备拮抗BMP信号通路的药物中的应用
将lefty基因转染至293T细胞(购于美国典型培养物保藏中心,ATCC)。3天后传代,待细胞进入指数生长期后,向条件培养基中分别加入含有0ng/ml、0.5ng/ml、1.0ng/ml、2.5ng/ml、5ng/ml五种浓度TGF-β1的DMEM培养基[DMEM+4mM L-谷氨酰胺+1.5g/L Na2CO3+4.5g/L葡萄糖+90%胎牛血清(10%)],37℃,5%CO2温箱孵育,再分别于1小时、2小时、3小时、6小时、12小时、24小时、48小时取出平皿,用PBS反复洗涤5次后收获细胞。采用超声破碎法裂解细胞后,于4℃下1000rpm离心3分钟,分别收集上清和沉淀。应用磷酸化Smad5和BMPR-II、BMPR-I、Smad6、GDF-8、BMP2、BMP7抗体,经Western blotting法检测各时间点Lefty对以上各指标表达的影响,以及应用Real time PCR技术检测各指标mRNA的表达情况。
D.Lefty蛋白作为制备拮抗p38MAPK信号通路的药物中的应用
将lefty基因转染至FB细胞中,经3次传代后细胞进入指数生长期,用PBS(137mMNaCl、22.7mM KCl、10mM Na2HPO4、2mM KH2PO4)反复洗涤3次收获细胞。超声粉碎8次,每次10s,7000r/min离心10min,留取上清,即为p38MAPK粗提液。测定样品的总蛋白浓度。取含总蛋白200g的相应体积的上述上清,加20μl抗磷酸化p38MAPK单克隆抗体,4℃轻摇过夜;7000r/min离心30s,弃上清,用1×细胞裂解液500μl清洗2次;再用1×激酶缓冲液500血清洗2次。加1×激酶缓冲液48μl、200μmol/L ATP1μl和2μl ATF-2融合蛋白30℃孵育30min,加3×SDS加样缓冲液25μl终止反应,100℃水浴5min,离心2min,取样品20μl和溴酚蓝10μl混匀后进行10%SDS-PAGE电泳(100-150V),再转移至PVDF膜,加1×TBS 25mL洗硝纤膜室温孵育5min,加阻断液(5%BSA)10H1L室温孵育60min,加磷酸化ATF-2单克隆抗体10μl至10ml抗体稀释缓冲液中与硝酸纤维膜共同孵育(4℃)轻摇过夜,用TBST 10ml洗膜3次,每次5min,加HRP-抗兔二抗(1∶2000)和HRP-抗生物素二抗(1∶1000)至10ml阻断缓冲液与硝酸纤维膜室温下共同孵育60min,用TBST 10μl洗膜3次,每次5min。加luminol荧光显色液,暗房内X光片曝光显影。上述实验所获得X光片置于UVP凝胶成像系统(美国)进行图像输入分析(Labwork System软件),以吸光值(A)的大小为其活性的强弱(见表3)。
3.Lefty蛋白在体内作为制备治疗或预防纤维化病变的药物中的应用
A.Lefty蛋白在体内作为制备治疗或预防肝纤维化病变的药物中的应用
取成年雄性SD大鼠(购于武汉大学动物实验中心),采用改良硫代乙酸胺(TAA)法建立大鼠肝纤维化模型[见参考文献:张杰,陈积圣,王坤,等.硫代乙酰胺诱导肝硬化模型方法的改进.中华实验外科杂志,1999,16:567-568.]。在90mg/kg氯胺酮+9mg/kg甲苯噻嗪麻醉后开腹显露肝脏,先取小块肝组织标本。按100μg质粒DNA/动物,使用500μl的微量注射器和4号针头将脂质体-lefty-A/pcDNA1质粒复合物或生理盐水(作对照)分别多点缓慢地注入肝脏各叶的边缘,间距5mm,进针深度5mm。注射部位用丝线缝合标记。大鼠清醒后继续以0.01%浓度的TAA供水。3周后,同上麻醉下,下腔静脉采血,加入肝素抗凝;取注射部位(标记处)和非注射部位的肝组织标本,于10%的中性甲醛溶液中固定,石蜡包埋。对组织标本行HE染色,采用免疫组化、Western-blotting和RT-PCR法分别检测肝组织中Lefty蛋白、α-SMA、基质金属蛋白酶(MMP)、明胶酶、I型胶原、II型胶原、III型胶原、IV型胶原的蛋白表达和mRNA的表达。
B.Lefty蛋白在体内作为制备治疗或预防肾纤维化病变的药物中的应用
取成年雄性SD大鼠(购于武汉大学动物实验中心),采用输尿管完全结扎法建立大鼠UUO-肾纤维化模型[见参考文献:Jeremiah M,Keith H,Guo GJ,et al.Bonemorphogenetic protein-7improves renal fibrosis and accelerates the return of renal function.J Am Soc Nephrol,2002,13:S14-S21.]。于建模术后2周在90mg/kg氯胺酮+9mg/kg甲苯噻嗪麻醉后,从鼠尾静脉注射脂质体-lefty-A/pcDNA1质粒复合物或生理盐水(作对照),所有动物均于注射后分别于术后2天、14天和21天过量麻醉处死。手术摘取左侧肾脏,HE染色和扫描电镜观察组织微观结构(结果见图4、图5);用Realtime PCR技术检测纤维化肾脏组织中结缔组织生长因子CTGF、I、II、III、IV型胶原基因的表达水平;应用磷酸化Smad2、Smad3、Smad5和Smad4、α-SMA抗体,经Western blotting法检测各时间点的反应产物中磷酸化的Smad2、Smad3、Smad5和Smad4、α-SMA的表达;用比色测定法检测蛋白水解酶的活性;用酪蛋白和明胶酶谱法检测相应的两种蛋白酶的活性(结果见表3)。
C.Lefty蛋白在体内作为制备治疗或预防肺纤维化病变的药物中的应用
取成年雄性BALB/c小鼠(购于武汉大学动物实验中心),以3.8%水合氯醛(10ml/kg)腹腔麻醉后,直立固定于鼠板,9号注射弯针头气管内滴人lefty-A/pcDNA1质粒或空质粒。给药24h后,固定小鼠并以射线照射,源皮距(SSD)80cm,吸收剂量率137.96cGy/min,每只小鼠单次全胸腔照射,头部及腹部以下用5个半价层铅块屏蔽。此后动物每日照射2次,每次8Gy,两次照射间隔8h,分别在放射后0、1、2、4、8及12周,颈椎脱臼法处死小鼠,取出全肺,右肺中叶用10%甲醛溶液固定,余肺组织液氮冷冻,-80℃保存组织备用。取各肺叶组织70mg,加人PBS液700μl匀浆,13000r/min离心15min后取上清液,ELISA法检测I型胶原、III型胶原、CTGF和TGF-β的表达。甲醛溶液固定的小鼠肺组织经HE染色,按Szapiel方法[见参考文献:Szapiel SV,Elsen NA,Fulmer JD,et al.Bleomycin induced interstitial pulmonary diseases in the nude,athvmicmouse.Am Rev Respir Dis,1979,120:893-899],在光学显微镜下观察并评价肺泡炎及肺纤维化的程度。
D.Lefty蛋白在体内作为制备治疗或预防心肌纤维化病变的药物中的应用
取成年雄性SD大鼠(购于武汉大学动物实验中心),采用Guan等[见参考文献:Guan S,Fox J,Mitchell KD,et al.Angiotensin and angiotensin converting enzyme tissuelevels in two kidneys one clip hypertensive rat.Hypertension.1992,20(6):763-767.]介绍的方法建立大鼠高血压-心肌纤维化模型。其中实验组动物在给药的同时,经腹腔注射脂质体-lefty-A/pcDNA1质粒复合物(100μg质粒DNA/动物)或生理盐水(作对照)。所有动物均于给药8周后过量麻醉处死,手术摘取心脏。用Real time PCR技术检测纤维化肾脏组织中结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)、I型胶原、II型胶原、III型胶原、IV型胶原基因的表达水平;应用磷酸化Smad2、Smad3、Smad5和Smad4、α-SMA抗体,经Western blotting法检测各时间点的反应产物中磷酸化的Smad2、Smad3、Smad5和Smad4、α-SMA的表达;用比色测定法检测蛋白水解酶的活性;用明胶酶谱法检测溶明胶酶的活性。
E.Lefty蛋白在体内在体内作为制备治疗或预防皮肤纤维瘤的药物中的应用
取前述方法孵育之经leftyA基因转染的GP+E86细胞,待其进入指数生长期,加入含有0.05%胰蛋白酶和0.2%EDTA的消化液。室温(20~25℃)孵育5-10分钟后,将细胞及培养基吹打成单细胞悬液。室温下3000rpm离心5分钟,弃上清液,所得细胞用含有10%胎牛血清的DMEM培养基重悬。反复两次后,将细胞浓度调至5×107/ml作为注射用细胞悬液。取该悬液100μl注射于无胸腺裸鼠(购于武汉大学动物实验中心,90mg/kg氯胺酮+9mg/kg甲苯噻嗪麻醉)背部皮下,重复4-6次分别选取不同的部位注射。分别于术后2天、14天和21天过量麻醉处死动物,手术摘取肿瘤,观察相关纤维化指标:用Real time PCR技术检测肿瘤组织中CTGF、I型胶原、II型胶原、III型胶原、IV型胶原基因的表达水平;用Western blotting技术检测以上各指标的蛋白表达情况;用比色测定法检测蛋白水解酶的活性;用酪蛋白和明胶酶谱法检测相应的两种蛋白酶的活性。
Claims (9)
1.Lefty蛋白作为制备拮抗转化生长因子(TGF)-β信号通路的药物中的应用。
2.Lefty蛋白作为制备拮抗Nodal信号通路的药物中的应用。
3.Lefty蛋白作为制备拮抗骨形成蛋白(BMP)信号通路的药物中的应用。
4.Lefty蛋白作为制备拮抗p38丝裂原蛋白激酶(MAPK)信号通路的药物中的应用。
5.Lefty蛋白在制备治疗或预防肝纤维化病变的药物中的应用。
6.Lefty蛋白在制备治疗或预防肾纤维化病变的药物中的应用。
7.Lefty蛋白在制备治疗或预防肺纤维化病变的药物中的应用。
8.Lefty蛋白在制备治疗或预防心肌纤维化病变的药物中的应用。
9.Lefty蛋白在制备治疗或预防皮肤纤维瘤的药物中的应用。
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Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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CN102784395A (zh) * | 2012-08-08 | 2012-11-21 | 哈尔滨医科大学 | Mapk-erk1/2信号通路抑制剂在制备去除或抑制肿瘤细胞中双微体药物中的应用 |
EP3439741A4 (en) * | 2016-04-06 | 2020-05-06 | Acceleron Pharma Inc. | ALK7 ANTAGONISTS AND USES THEREOF |
CN113195522A (zh) * | 2018-12-20 | 2021-07-30 | 钟根堂股份有限公司 | 包含人类Lefty A蛋白变体的融合蛋白及其用途 |
US12024563B2 (en) | 2021-10-19 | 2024-07-02 | Acceleron Pharma Inc. | ALK7 antagonists and uses thereof |
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2007
- 2007-09-06 CN CNA2007100531462A patent/CN101152561A/zh active Pending
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