JP7309197B2 - 関心のある作用物質の精製 - Google Patents
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Description
・CBM-タンパク質キメラ、例えばCBM-HPキメラを含む粗混合物を第1ろ過膜に通して、CBM-タンパク質、例えばCBM-HPを含む透過液を得ることと(一方で、保持液に廃棄することができる高分子量又はサイズの大きな不純物を残すこと);
・このキメラ、例えばCMB-HPをCNCと接触させて、例えばCBM-HPキメラと相互作用させ、キメラ-CNC複合体、例えばCBM-HP-CNC複合体を含む混合物を得ることと;
・キメラ-CNC複合体、例えばCBM-HP-CNC複合体を含む混合物を第2ろ過膜でろ過して、この複合体を含む保持液を得ることと;
・タンパク質、つまりHPを単離するため、CBM-HP-CNC複合体からCBM-HP及び/又はHPを任意に分離することと;を含み、
第1及び第2ろ過膜のそれぞれが同じ又は異なり、CBM-タンパク質キメラを透過(あるいはろ過又は通過)させ、複合体の透過を妨げる(又は阻む)ように選択される細孔径を有する。
・CBM-HPキメラを含む粗混合物を、第1ろ過膜に通し、ろ過して、CBM-HPを含む透過液を得ることと(一方で、保持液に廃棄することができる高分子量又はサイズが大きな不純物を残す);
・CBM-HPキメラをCNCと接触させて、CBM-HPキメラと相互作用させ、CBM-HP-CNC複合体を含む混合物を得ることと;
・CBM-HP-CNC複合体を含む混合物を、第2ろ過膜に通し、ろ過して、CBM-HP-HP-CNC複合体を含む保持液を得ることと;
・任意にCBM-HP-CNC複合体からCBM-HP及び/又はHPを分離することと;を含み、
第1及び第2ろ過膜のそれぞれが同じ又は異なり、CBM-HPキメラを透過(あるいはろ過又は通過)させ、CBM-HP-CNC複合体の透過を妨げる(又は阻む)ように選択される細孔径を有する。
・核酸増幅又は核酸発現に用いられるかどうか;
・ベクターに挿入される核酸のサイズ;
・ベクターで形質転換される宿主細胞、である。
・少なくとも1つのAOIを含む培地をCBM-HPキメラ(上記で定義された本発明の方法に従って任意に得られ、単離される;又は任意の他の方法により調製、単離される)を用い、AOI及びCBM-HPキメラ間を会合させる条件下で処理して、CBM-HP-AOI複合体を含む混合物を得ることと;
・CBM-HP-AOI複合体を含む混合物にCNCを添加して、CNC-CBM-HP-AOI複合体を形成することと;
・CNC-CBM-HP-AOI複合体を含む混合物をCNC-CBM-HP-AOI複合体を透過させないろ過膜に通して、CNC-CBM-HP-AOI複合体を含む保持液を得ることと;
・複合体からAOIを単離することと、を含む。
・少なくとも1つの糖結合モジュール及び少なくとも1つのHPのキメラ(CBM-HPキメラ)を含む粗混合物を第1ろ過膜に通して、CBM-HPキメラを含む透過液を得ることと;
・CBM-HPキメラをセルロースナノ結晶(CNC)と接触させて、CBM-HPキメラと相互作用させ、CBM-HP-CNC複合体を含む混合物を得ることと;
・CBM-HP-CNC複合体を含む混合物を第2ろ過膜に通して、CBM-HP-CNC複合体を含む保持液を得ることと;
・CBM-HP-CNC複合体からHP及び/又はCBM-HPキメラを分離することと、を含み
同じ又は異なる第1及び第2ろ過膜は、同じ又は異なり、CBM-HPキメラを透過させ、CBM-HP-CNC複合体の透過を妨げるように選択される細孔径を有する。
・本発明の方法に従って、CBM-HPキメラを得ることと;
・少なくとも1つのAOIを含む液体培地を、CBM-HPキメラを用い、少なくとも1つのAOI及びCBM-HPキメラ間に会合を生じさせる条件下で処理して、CBM-HP-AOI複合体を含む混合物を得ることと;
・CBM-HP-AOI複合体を含む混合物にCNCを添加して、CNC-CBM-HP-AOI複合体を形成することと;
・CNC-CBM-HP-AOI複合体を含む混合物を、CNC-CBM-HP-AOI複合体を透過させない細孔径を有するろ過膜に通して、CNC-CBM-HP-AOI複合体を含む保持液を得ることと;
・複合体からAOIを単離することと、を含む。
・少なくとも1つのAOIを含む液体培地を、CBM-HPキメラを用い、少なくとも1つのAOI及びCBM-HPキメラ間に会合を生じさせる条件下で処理して、CBM-HP-AOI複合体を含む混合物を得ることと;
・CBM-HP-AOI複合体を含む混合物にCNCを添加して、CNC-CBM-HP-AOI複合体を形成することと;
・CBM-HP-AOI複合体を含む混合物を、CNC-CBM-HP-AOI複合体を透過させない細孔径を有するろ過膜に通して、CNC-CBM-HP-AOI複合体を含む保持液を得ることと;
・この複合体からAOIを単離することと、を含む。
・第1粗混合物において、セルロース結合ドメイン(CBD)に付着した異質タンパク質(HP)を作製することと;
・第1粗混合物を60kDa(UF範囲)から0.45ミクロン(MF範囲)までの第1カットオフを有する第1ろ過膜に通し、巨大汚染粒子から構成される保持液を廃棄して、透過液を得ることと;
・(2)の透過液にCNC粒子を添加して、第2混合物を得ることと;
・(3)の第2混合物を最大0.45ミクロンのカットオフを有する第2ろ過膜に通し、これにより精製されたCNC粒子に付着した異質タンパク質を得ることと、を含む。
・第1粗混合物におけるセルロース結合ドメイン(CBD)に付着した異質タンパク質(HP)を液体混合物に添加することと;
・CBD-HPキメラの添加前又は後のどちらかに、第1粗混合物を10kDa(UF)から0.45ミクロン(MF範囲)の第1カットオフを有する第1ろ過膜に通し、巨大汚染粒子から構成される保持液を廃棄して、透過液を得ることと;
・(2)の透過液にCNC粒子を添加して、第2混合物を得ることと;
・(3)の第2混合物を最大0.45ミクロンのカットオフを有する第2ろ過膜に通し、保持液を得て、これにより関心のある作用物質を得ることと、を含む。
・CNC-CBD-HP複合体全体が所望されるなら、単純に採取することができる。
・CBD-HPキメラが所望の産物であり、CNCが廃棄されるのであれば、pHを約pH10.5~13に上昇させて、タンパク質が直ちに放出され、膜を透過して採取される。CNC粒子は(コストがわずかであることから)廃棄されるか、再生利用される。
・純粋なHPのみが所望されるなら、好適なプロテアーゼが溶液に添加され、CBDタンパク質及びHPタンパク質間のリンカータンパク質を消化し、従ってNCCに結合したままのCBDからHPが放出される。放出されたHPは、膜を透過することができ、透過液に採取され、CNC-CBD複合体は保持液と共に廃棄される。
HPが(例えば、組み換え技術で作製される)関心のあるタンパク質である場合:
1.CNC-CBD-HP複合体全体が所望されるなら、簡単に採取することができる。
2.CBD-HPキメラが所望の産物であり、CNCが廃棄されるのであれば、pHを約pH10.5~11に上昇させ、タンパク質が直ちに放出され、膜を透過して採取される。CNC粒子は(コストがわずかであることから)廃棄されるか、又は再生利用される。
3.純粋なHPのみが所望されるなら、好適なプロテアーゼが溶液に添加され、CBDタンパク質及びHPタンパク質間のリンカータンパク質が消化され、NCCと結合したままのCBDからHPが放出される。放出されたHPは膜を透過することができ、透過液に採取され、CNC-CBD複合体は保持液と共に廃棄される。
4.HPが関心のある作用物質である別の作用物質(別のタンパク質、小分子、核酸配列等)と親和結合する場合において、HPが上記(1)のようにそのままであるか、あるいは例えば、pH又は塩濃度変化により上記2又は3のように分離される場合、HP及び関心のある作用物質間の親和結合は切断される。CNCからCBDを放出することなく、親和結合のみが切断される好適な条件が定義されなければならない。
CBDタンパク質は、断片、誘導体、変異体又は修飾がCNC結合性を保持しさえすれば、http://www.cazy.org/carbohydrate-binding-modules.htmlに示すタンパク質又はタンパク質ドメインのいずれかの変異体、誘導体、断片又は化学修飾であり得る。
ここで用いられるように、「CBD-HPキメラ」という用語は、少なくとも2つのタンパク質、つまりCBDタンパク質及びHPである第2のタンパク質の結合を指す。本発明のいくつかの実施形態において、HPは第3のタンパク質と融合するか、又は結合し得る。本発明において、HPの例としては、核酸修飾酵素、プロテアーゼなどの酵素、ホルモン又はホルモン前駆体、ポリペプチド、ペプチド、抗体、抗原、抗原エピトープ及びその変異体が挙げられる。
Claims (43)
- 液体混合物から異種タンパク質(HP)を単離する方法であって、
・少なくとも1つの糖結合モジュール及び少なくとも1つのHPのキメラ(CBM-HPキメラ)を含む粗混合物を第1ろ過膜に通して、前記CBM-HPキメラを含む透過液を得ることと;
・前記CBM-HPキメラをセルロースナノ結晶(CNC)と接触させて、前記CBM-HPキメラと相互作用させ、CBM-HP-CNC複合体を含む混合物を得ることと;
・前記CBM-HP-CNC複合体を含む前記混合物を第2ろ過膜に通して、前記CBM-HP-CNC複合体を含む保持液を得ることと;
・前記CBM-HP-CNC複合体から、前記HP及び/又は前記CBM-HPキメラを分離することと;
を含み、
同じ、又は異なる前記第1及び第2ろ過膜が、前記CBM-HPキメラを透過させ、前記CBM-HP-CNC複合体の透過を妨げるように選択される細孔径を有する、方法。 - 粗混合物に前記CBM-HPキメラを得ることを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記粗混合物が核酸、タンパク質、炭水化物、ポリフェノール及び巨大非重合体分子から選択される、少なくとも1つの他の物質をさらに含む、請求項2に記載の方法。
- 前記粗混合物が、細胞培養物に含有される細胞の前記細胞膜を破壊することにより形成されるホモジネートである、請求項3に記載の方法。
- 前記CBM-HPキメラが、宿主細胞において作製されるか、又は発現する、請求項2に記載の方法。
- 前記CBM-HPキメラが植物細胞において作製される、請求項2に記載の方法。
- 前記CBM-HPキメラを単離することを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記HPを単離することを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記CBM-HPキメラ、及びその後そこから前記HPを単離することを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記CBMがセルロース結合ドメイン(CBD)である、請求項1~9のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第1及び第2ろ過膜が同じである、請求項1に記載の方法。
- 前記CBM-HPキメラがCBD-HPキメラである、請求項1に記載の方法。
- 前記HPが関心のある作用物質を単離する方法における使用に好適な形態で単離される、請求項8に記載の方法。
- 液体混合物から関心のある作用物質(AOI)を単離する方法であって、
・請求項1に記載の方法により、CBM-HPキメラを得ることと;
・少なくとも1つのAOIを含む液体培地を前記CBM-HPキメラを用い、前記少なくとも1つのAOI及びCBM-HPキメラ間に会合を生じさせる条件下で処理して、CBM-HP-AOI複合体を含む混合物を得ることと;
・CNCを前記CBM-HP-AOI複合体を含む混合物に添加して、CNC-CBM-HP-AOI複合体を形成することと;
・前記CNC-CBM-HP-AOI複合体を含む前記混合物を、前記CNC-CBM-HP-AOI複合体を透過させない細孔径を有するろ過膜に通して、前記CNC-CBM-HP-AOI複合体を含む保持液を得ることと;
・前記複合体から前記AOIを単離することと、を含む方法。 - 液体混合物から関心のある作用物質(AOI)を単離する方法であって、
・少なくとも1つのAOIを含む液体培地をCBM-HPキメラを用い、前記少なくとも1つのAOI及びCBM-HPキメラ間に会合を生じさせる条件下で処理して、CBM-HP-AOI複合体を含む混合物を得ることと;
・CNCを前記CBM-HP-AOI複合体を含む前記混合物に添加して、CNC-CBM-HP-AOI複合体を形成することと;
・前記CNC-CBM-HP-AOI複合体を含む前記混合物を、前記CNC-CBM-HP-AOI複合体を透過させない細孔径を有するろ過膜に通して、前記CNC-CBM-HP-AOI複合体を含む保持液を得ることと;
・前記複合体から前記AOIを単離することと、を含む方法。 - 前記AOIを含む培地を得ることをさらに含み、前記AOIがこの培地から単離される、請求項14又は15に記載の方法。
- 前記CBM-HPキメラを含む培地を得ることをさらに含む、請求項15に記載の方法。
- 前記CBMがセルロース結合ドメイン(CBD)である、請求項14又は15に記載の方法。
- 前記CBM-HPキメラがCBD-HPキメラである、請求項14又は15に記載の方法。
- 前記CBM-HP-AOI複合体を単離することを含む、請求項14又は15に記載の方法。
- 前記CNC-CBM-HP-AOI複合体の形成後、前記CBM-HPキメラを単離することをさらに含む、請求項19に記載の方法。
- 前記CNC-CBM-HP-AOI複合体を含む前記混合物が、前記CNC-CBD-HP-AOI複合体から前記AOIを単離する前に、透析又はろ過によりさらに精製される、請求項14又は15に記載の方法。
- 同じ、又は異なる前記第1ろ過膜及び前記第2ろ過膜が、それぞれ0.2μmから60kDa分子量カットオフの間の細孔径を有する、請求項1~13のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第1及び第2ろ過膜が同じである、請求項23に記載の方法。
- 前記ろ過膜が、0.2μmから60kDa分子量カットオフの間の細孔径を有する、請求項14~24のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細孔径が0.45μmから60kDa分子量カットオフの間である、請求項23又は25に記載の方法。
- 前記細孔径が、1μmから50kDa分子量カットオフの間である、請求項26に記載の方法。
- 前記細孔径が0.2μmである、請求項26に記載の方法。
- 前記CBMがCBDであり、CBM2~13、CBM16~17、CBM20~28、CBM40~46及びCBM61~67から選択される、請求項1~28のいずれか1項に記載の方法。
- 前記CBDがCBD機能性誘導体である、請求項29に記載の方法。
- 前記HPが1つ以上のCBDと会合する、請求項1~30のいずれか1項に記載の方法。
- 前記CBDが1つ以上のHPと会合し、各HPが任意に互いに異なり得る、請求項1~31のいずれか1項に記載の方法。
- 前記キメラの前記HP部が、さらなるタンパク質と融合するか、又は結合する、請求項1又は13に記載の方法。
- 前記CBM-HPキメラの前記HP部が、その後にCBMと結合する他の要素とのキメラとして調製される、請求項1~33のいずれか1項に記載の方法。
- 前記CBM-HPキメラにおいて、前記HPが、任意に前記CBMに直接付着する、請求項1~34のいずれか1項に記載の方法。
- 前記CBM-HPキメラの前記HPが、他のドメイン又は相互作用により前記CBMと結合する、請求項35に記載の方法。
- 前記CBM-HPキメラが少なくとも1つのリンカーを含む、請求項35に記載の方法。
- 前記CBMが、GenBank番号EEU00265.1を有するCBDである、請求項1~37のいずれか1項に記載の方法。
- 前記CNCが、少なくとも50%の結晶化度を有することを特徴とする、請求項1~38のいずれか1項に記載の方法。
- 前記CNCが単結晶である、請求項39に記載の方法。
- 前記CNCが最大でも長さ約1,000μmである、請求項1~40のいずれか1項に記載の方法。
- 前記AOIがHPとの親和性を有する、請求項13又は14に記載の方法。
- 前記AOIが、前記HPが抗体、受容体、酵素、基質又はその断片であるアミノ酸系作用物質;前記HPが核酸結合タンパク質又はその断片である核酸系作用物質;前記HPと親和結合することができるペプチド部分を有する糖類、脂肪酸あるいは有機分子から選択される、請求項42に記載の方法。
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