CN110650972A - 对感兴趣的剂的纯化 - Google Patents
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Abstract
公开了一种方法，该方法利用碳水化合物结合模块(CBM)和纳米晶体纤维素(CNC)的组合特征来‘钓出’任选地存在于培养物中或在培养物中产生的特定的感兴趣的剂(AOI)，诸如蛋白质。
Description
技术领域
本发明总体上提供了使用纳米晶体纤维素(CNC)与蛋白质-纤维素结合结构域嵌合体的亲和结合从例如液体细胞培养混合物中分离材料例如蛋白质的方法。
发明背景
CBM是存在于不同生物体中的碳水化合物结合模块[1]。纤维素结合结构域(CBD)是CBM的一个实例。CBDclos[2]是从细菌嗜纤维梭菌(Clostridium cellulovorans)中分离的蛋白质结构域。它与纤维素有力地结合，并且形成稳定但可逆的连接，该连接可以承受剪切力以及酸性和碱性pH(pH 4至10)和盐度(10mM至饱和的NaCl)的轻微变化。CBD先前已经被用于在纤维素柱上进行蛋白质纯化[6]。然而，适合于高表面积的色谱法、能够承受高流速和高压力的可用的纤维素珠的缺乏限制了其应用。
纳米晶体纤维素(CNC或NCC))颗粒是通过不同方法从纤维素生产的小的(～300nm)、高纵横比的微晶[3-5]。每个颗粒可以结合超过10个CBDclos结构域。该材料是无毒且完全安全的。它对pH变化(1至13)和高剪切力也相当稳定。它是一种廉价且广泛可得的材料。
US 5,856,201[7]公开了纤维素结合结构域(CBD)蛋白对结晶纤维素和对CBD与第二种蛋白质的融合蛋白的高亲和力，以及使用该融合产物进行亲和分离的方法。
错流(Cross flow)过滤工艺是简单(终端)膜过滤工艺的改进。通过产生垂直于膜表面的湍流高剪切流，它们可以疏散在膜表面上形成的凝胶层，并且由此改善流量和操作时间[8]。膜错流过滤在食品工业中非常大规模(100m3/天)地用于乳制品、水果和蔬菜汁、饮料、啤酒、葡萄酒以及其他的净化和浓缩。另外的大规模应用是血液制品和废物处理[8]。取决于膜截止值，错流过滤膜可以净化宽范围尺寸的颗粒，从盐离子(反渗透)开始且直到沙粒。它们也可以在非常高的干固体含量(60gt/100gr-1)和粘度下操作[9]。然而，膜工艺主要被用于相对粗糙的上游纯化阶段，用于分离尺寸显著不同的颗粒或蛋白质。为了有效分离，分离的实体之间需要1个数量级(10倍)的尺寸差异[10]。这限制了该方法被用于其中需要从类似尺寸的蛋白质或颗粒群体中分离特定实体的下游纯化和改进。
色谱分离工艺(柱色谱法)在其中需要高纯度并且因此需要高选择性的情况下使用，并且基本上是生物制药工业中蛋白质分离的主要手段。然而，色谱工艺是昂贵的(占总下游成本的＞70％[11])、冗长的并且需要复杂的上游准备。由于其放大规模的成本和复杂性，它们不太适合于大批量工艺(volume process)。随着对大量高纯度蛋白质的需求扩大，对可选择的纯化方法的需求也增加[12]。
参考文献
[1]Shoseyov，O.；Shani，Z.；Levy，I.，Carbohydrate binding modules：biochemical properties and novel applications.Microbiology and MolecularBiology Reviews 2006，70(2)，283-295.
[2]Goldstein，M.A.；Takagi，M.；Hashida，S.；Shoseyov，O.；Doi，R.；Segel，I.，Characterization of the cellulose-binding domain of the Clostridiumcellulovorans cellulose-binding protein A.Journal of bacteriology 1993，175(18)，5762-5768.
[3]Charreau，H.；L Foresti，M.；Vázquez，A.，Nanocellulose patents trends：acomprehensive review on patents on cellulose nanocrystals，microfibrillatedand bacterial cellulose.Recent patents on nanotechnology 2013，7(1)，56-80.
[4]Rebouillat，S.；Pla，F.，State of the art manufacturing andengineering of nanocellulose：a review of available data and industrialapplications.2013.
[5]Peng，B.；Dhar，N.；Liu，H.；Tam，K.，Chemistry and applications ofnanocrystalline cellulose and its derivatives：a nanotechnologyperspective.The Canadian Journal of Chemical Engineering 2011，89(5)，1191-1206.
[6]Shpigel，E.；Goldlust，A.；Eshel，A.；Ber，I.K.；Efroni，G.；Singer，Y.；Levy，I.；Dekel，M.；Shoseyov，O.，Expression，purification and applications ofstaphylococcal Protein A fused to cellulose-binding domain.Biotechnology andapplied biochemistry 2000，31(3)，197-203.
[7]US Patent No.5,856,201.
[8]Marinaccio，P.J.；Repetti，R.V.，Cross-flow filtration.Google Patents：1989.
[9]Daufin，G.；Escudier，J.-P.；Carrere，H.；Berot，S.；Fillaudeau，L.；Decloux，M.，Recent and emerging applications of membrane processes in the foodand dairy industry.Food and Bioproducts Processing 2001，79(2)，89-102.
[10]Cheryan，M.，Ultrafiltration and Microfiltration Handbook.Taylor&Francis：1998.
[11]Azevedo，A.M.；Rosa，P.A.；Ferreira，I.F.；Aires-Barros，M.R.，Chromatography-free recovery of biopharmaceuticals through aqueous two-phaseprocessing.Trends in biotechnology 2009，27(4)，240-247.
[12]
J.；Etzel，M.，Alternatives to chromatographicseparations.Biotechnology progress 2007，23(1)，42-45.
[13]Forsgren，A.；
J.，“Protein A”from S.aureus I.Pseudo-immunereaction with human γ-globulin.The Journal of Immunology 1966，97(6)，822-827.
[14]Updyke，T.V.；Nicolson，G.L.，Immunoaffinity isolation of membraneantigens with biotinylated monoclonal antibodies and immobilized streptavidinmatrices.Journal of immunological methods 1984，73(1)，83-95.
[15]Stols，L.；Gu，M.；Dieckman，L.；Raffen，R.；Collart，F.R.；Donnelly，M.I.，Anew vector for high-throughput，ligation-independent cloning encoding atobacco etch virus protease cleavage site.Protein expression and purification2002，25(1)，8-15.
发明概述
本发明的发明人已经开发了一种方法，该方法利用碳水化合物结合模块(CBM)和纳米晶体纤维素(CNC)的组合特征来“钓出”任选地存在于培养物中或在培养物中产生的特定的感兴趣的剂(AOI)，例如蛋白质(POI-感兴趣的蛋白质)。该方法基于在细胞培养物中CBM-蛋白质嵌合体的表达，该CBM-蛋白质嵌合体包含附接至异源蛋白质(HP)的CBM或具有对HP的强亲和力的亲和结构域，随后是一系列过滤步骤，其中CNC与CBM-HP嵌合体的CBM部分的附接能够最终分离期望的蛋白质。如本文所提到的，蛋白质可以以纯的或大体上纯的形式分离，或者可作为融合产物被分离。
本发明的方法允许使用过滤装置和技术(诸如中空纤维、错流过滤以及其他)进行快速、经济且有效的三阶段纯化/分离方法。该方法基于包含CBM和AOI(诸如蛋白质，例如异源蛋白质(HP))的嵌合体与CNC通过嵌合体的CBM部分通过产生大的蛋白质/CNC加合物的可逆结合，该加合物借助于过滤与污染物分离并且然后可以“按原样”使用。CBM-AOI，例如CBM-蛋白质嵌合体或CBM-HP嵌合体可以通过各种手段，例如通过改变pH或通过蛋白水解而从CNC颗粒释放，并且蛋白质例如HP可以通过各种裂解或分离技术而进一步被从CBM分离，如下文描述的。
本发明的优点在于，它组合了中空纤维分离工艺和色谱分离工艺两者的优点，从而能够处理非常大量的具有各种各样的蛋白质和颗粒物质的溶液，同时提供通常仅在亲和色谱法中出现的非常高的选择性。本文描述的方法避免了对装填柱的需求和所涉及的限制，诸如高压力、低流速和阻塞。虽然在亲和色谱法中，树脂与靶蛋白的结合容量高达几十毫克/1克树脂，但在本发明中，每1grCNC的容量达到数百毫克。此外，与通常与高压力、相对慢的过滤速率和阻塞问题相关的超滤相比，在使用微滤的同时将靶蛋白选择性地保留在渗余物中的能力是巨大的优点。
因此，在本发明的方面的一个方面，本发明提供了一种用于从液体混合物中分离蛋白质诸如异源蛋白质(HP)的方法，该方法包括：
-使包含CBM-蛋白质嵌合体(例如，CBM-HP嵌合体)的粗混合物通过第一过滤膜，以获得包含CBM-蛋白质(例如，CBM-HP)的渗透物(同时将可以被弃去的高分子量或大尺寸的杂质留在渗余物中)；
-使嵌合体(例如，CMB-HP)与允许与例如CBM-HP嵌合体相互作用的CNC接触，以获得包含嵌合体-CNC复合体例如，CBM-HP-CNC复合体的混合物；
-通过第二过滤膜过滤包含嵌合体-CNC复合体(例如，CBM-HP-CNC复合体)的混合物，以获得包含该复合体的渗余物；以及
-任选地从CBM-HP-CNC复合体中分离CBM-HP和/或HP，以便分离蛋白质或HP；
相同或不同的第一过滤膜和第二过滤膜各自具有被选择为允许CBM-蛋白质嵌合体渗透穿过其中(或过滤或穿过)并防止(或阻止)该复合体渗透的孔径。
在一些实施方案中，本发明提供了一种用于从液体混合物中分离异源蛋白质(HP)的方法，该方法包括：
-使包含CBM-HP嵌合体的粗混合物通过第一过滤膜、通过第一过滤膜过滤包含CBM-HP嵌合体的粗混合物，以获得包含CBM-HP的渗透物(同时将可以被弃去的高分子量或大尺寸的杂质留在渗余物中)；
-使CMB-HP嵌合体与允许与该CBM-HP嵌合体相互作用的CNC接触，以获得包含CBM-HP-CNC复合体的混合物；
-使包含CBM-HP-CNC复合体的混合物通过第二过滤膜、通过第二过滤膜过滤包含CBM-HP-CNC复合体的混合物，以获得包含CBM-HP-HP-CNC复合体的渗余物；以及
-任选地从CBM-HP-CNC复合体中分离CBM-HP和/或HP；
相同或不同的第一过滤膜和第二过滤膜各自具有被选择为允许CBM-HP嵌合体渗透穿过其中(或过滤或穿过)并防止(或阻止)CBM-HP-CNC复合体渗透的孔径。
在一些实施方案中，第一过滤膜和第二过滤膜是相同的，并且在一些实施方案中，在所述方法中使用单个膜。
在一些实施方案中，第一过滤膜和第二过滤膜选自中空纤维膜。
在一些实施方案中，第一过滤膜和第二过滤膜是微滤膜。
在一些实施方案中，过滤膜具有在0.2μm至60kDa之间的孔径。
在一些实施方案中，所述方法包括获得粗混合物中的CBM-HP嵌合体。在一些实施方案中，CBM-HP在宿主细胞，例如植物细胞中产生/表达。在一些实施方案中，CBM-HP是植物来源的。
在一些实施方案中，所述方法包括在允许CBD-HP嵌合体和CNC之间的相互作用的条件下，将CNC添加至包含CBM-HP嵌合体的渗透物中，从而获得包含CBM-HP-CNC复合体的混合物。
术语“异源蛋白质”通常是指源自与产生其的生物体相比相同或不同的生物体(例如，在异源表达系统中用编码哺乳动物蛋白质的载体转化或转导的细菌细胞系)的蛋白质。异源蛋白质通常经由重组DNA技术通过将编码蛋白质的DNA插入到用于转化宿主生物体(例如，酵母宿主细胞)的表达媒介物中来产生。异源蛋白质的一些非限制性实例是酶(例如，核酸修饰酶)及其底物结合结构域、蛋白酶、淋巴因子、干扰素、激素和激素前体、多肽、肽、抗体和抗体片段、抗原、抗原表位及其变体、DNA结合蛋白、受体及其片段、病毒抗原或免疫原以及可以在与作为所述蛋白质来源的生物体不同的宿主生物体中表达的任何多肽和糖蛋白。因此，嵌合体可以在CBM和以下中的任一种或更多种之间形成：酶(例如，核酸修饰酶)及其底物结合结构域、蛋白酶、淋巴因子、干扰素、激素和激素前体、多肽、肽、抗体和抗体片段、抗原、抗原表位及其变体、DNA结合蛋白、受体及其片段、病毒抗原或免疫原以及可以在与作为所述蛋白质来源的生物体不同的宿主生物体中表达的任何多肽和糖蛋白，以及其他。
HP可以在通常呈“液体混合物”的形式的粗混合物或介质中，该粗混合物或介质还包含杂质的剂、竞争反应的产物、细胞碎片和/或多种其他材料。待从中选择性分离HP(或感兴趣的剂，如下文所示的)的杂质可以包括以下中的任一种或更多种：有机化合物(例如，蛋白质、核酸)；细胞；细胞组分(大分子、细胞碎片)；小分子诸如多酚；生物碱；不溶性物质，诸如细胞壁组分(例如，纤维素、木质素)；病毒；细菌；灰尘颗粒；盐；杀虫剂；以及聚合物，诸如淀粉和糖原。
如本文使用的，“CBM-HP嵌合体”(可与融合蛋白互换使用)通常是指通过将至少两种蛋白质连接在一起而制成的蛋白质，所述至少两种蛋白质中的一种是CBM并且另一种是HP。CBM是碳水化合物结合模块，其具有碳水化合物活性酶内具有碳水化合物结合活性的谨慎折叠的连续氨基酸序列。如本领域已知的，CBM的一些非限制性实例是碳水化合物结合模块家族1至83，并且可在CAZy数据库中获得这些家族的结构相关的催化和碳水化合物结合模块或酶的功能结构域。CBM可能在底物特异性方面表现出显著差异，因此以不同的亲和力结合分子，诸如单糖(例如，半乳糖、乳糖、阿拉伯糖)、糖苷键连接和多糖(例如，纤维素、葡甘露聚糖、木聚糖、淀粉、甲壳质)。
在一些实施方案中，CBM是纤维素结合结构域(CBD)。
CBD是存在于蛋白质内的能够结合纤维素/结晶纤维素的连续氨基酸序列模块。当产生根据本发明的CBD-HP嵌合体时，CBD可以附接在蛋白质的C-末端或N-末端。本发明的CBM-HP嵌合体，在一些实施方案中是CBD-HP嵌合体，具有在约0.5μM和约5μM之间的纤维素结合亲和力(如通过解离常数[Kd]测量的)。该结合亲和力可以在一定范围的pH值内和不同的缓冲条件下维持，并且可以例如通过使pH升高至高于约11被打破以例如从结合至其的CNC释放CBD。
HP可以包含多于一个CBD单元(例如，一个CBD单元在HP的C-末端而另一个CBD单元在HP的N-末端)。根据本发明，CBD蛋白可以是如例如在http://www.cazy.org/ carbohydrate-binding-modules.html可得的CAZy数据库中描述的任何蛋白质或蛋白质结构域的变体、衍生物、片段或化学修饰物，只要该片段、衍生物、变体或修饰物保持了CNC结合性质。在一些实施方案中，每个CBD单元可以与一个或更多个HP缔合，所述HP可以相同或不同。
在一些实施方案中，CBD蛋白是CBD功能同源物，该CBD功能同源物与具有在http://www.cazy.org/carbohydrate-binding-modules.html提供的GeneBank登录号的氨基酸序列具有至少70％、80％、90％或95％的同源性。术语“同源性”通常是指与参考序列(例如，GeneBank SEQ ID NO)的互补程度，其中序列可以呈现出与参考序列的部分同源性(例如，70％同源性)或完全同源性(即，100％同一性)。术语“X％同源性”(例如70％同源性)不限于在蛋白质的全长上具有X％同源性的序列。因此，70％同源性也意图包括存在于已鉴定的功能区域的同源性。
在一些实施方案中，CBD选自CBM2至CBM13、CBM16至CBM17、CBM20至CBM28、CBM40至CBM46以及CBM61至CBM67，如本领域已知的。为了完整起见，在http://www.cazy.org/ carbohydrate-binding-modules.html提供的CAZY数据库通过引用以其整体并入本文。
在一些实施方案中，功能区域是确定的一组氨基酸，这些氨基酸具有以高亲和力和可逆方式结合纤维素的能力。在一些实施方案中，功能区域由约200个氨基酸组成。在一些其他实施方案中，功能区域由约185个氨基酸组成。在一些其他实施方案中，功能区域由约50个氨基酸组成。
在一些实施方案中，CBD蛋白具有Ruminiclostridium thermocellum的氨基酸序列，该氨基酸序列具有GeneBank编号EEU00265.1和序列QLNLKVEFYNSNPSDTTNSINPQFKVTNTGSSAIDLSKLTLRYYYTVDGQKDQTFWCDHAAIIGSNGSYNGITSNVKGTFVKMSSSTNNADTYLEISFTGGTLEPGAHVQIQGRFAKNDWSNYTQSNDYSFKSASQFVEWDQVTAYLNGVLVWGKEPGGSVVPSTQPVTTPPATTKPPATTIPPT。
在一些实施方案中，CBD是CBD功能衍生物。
如本文使用的，术语“CBD功能衍生物”是指在以上GeneBank序列中示出的CBD蛋白氨基酸序列的任何“片段”、“变体”、“类似物”或“化学衍生物”，它们保持以高亲和力和可逆方式结合纤维素的能力。
在一些实施方案中，CBD功能衍生物的长度在约2个和约160个氨基酸之间。在一些其他实施方案中，CBD功能衍生物的长度在约25个和约125个氨基酸之间。仍在其他实施方案中，CBD功能衍生物的长度在约50个和约100个氨基酸之间。
如本文使用的，术语“片段”通常是指源自如本文定义的具有天然存在的序列的CBD蛋白的CBD蛋白。在一些实施方案中，CBD片段通过全长CBD蛋白的蛋白水解裂解产生。在其他实施方案中，通过适当地修饰编码CBD蛋白的DNA序列，通过使C-末端、N-末端和/或天然存在的序列内的一个或更多个位点处的一个或更多个氨基酸缺失，来通过重组获得CBD片段。根据本发明，用于产生本文描述的例如CDB-HP嵌合体的CBD片段可以被筛选以高亲和力和可逆方式结合纤维素的能力，以便确定功能衍生物的身份或效用。
“变体”是这样的分子，在该分子中天然存在的分子的氨基酸序列、糖基化模式或其他特征已经被共价或非共价地修饰，并且意图包括突变体。变体的一些非限制性实例包括氨基酸置换、缺失和/或插入，条件是最终的构建体具有期望的以高亲和力和可逆方式结合纤维素的能力。
CBD蛋白中的氨基酸置换可以基于所包含的残基的极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或两亲性的相似性来进行。例如，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电荷的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；具有类似亲水性值的具有不带电荷的极性头基或非极性头基的氨基酸包括以下：亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸；甘氨酸、丙氨酸；天冬酰胺、谷氨酰胺；丝氨酸、苏氨酸；苯丙氨酸和酪氨酸。变体还可以在C-末端、N-末端以及天然存在的CBD序列内的一个或更多个位点处包含另外的氨基酸，只要变体保持以高亲和力和可逆方式结合纤维素的能力。
术语“化学衍生物”通常是指通过对天然存在的或变体CBD蛋白的化学修饰而产生的CBD蛋白。化学修饰的一些非限制性实例是用例如烷基基团、酰基基团或氨基基团取代H。
为了产生本文描述的CBD-HP嵌合体，编码CBD的核酸可以用于构建能够表达CBD蛋白或CBD-HP嵌合体的重组表达载体。用于表达所述嵌合体的表达载体(即核酸构建体)通常包含含有转录和翻译调节信息的核苷酸序列，所述核苷酸序列被可操作地连接(即，被连接使得调节性DNA序列和待表达的DNA序列以允许RNA转录和最终翻译成CBD-HP嵌合多肽的此类方式连接)。根据本发明，在构建CBD-HP嵌合体表达载体时，编码CBD蛋白的核酸与编码HP的核酸连接(link)或连接(join)，使得CBD蛋白和第二蛋白的开放阅读框是完整的，允许CBD融合蛋白的翻译发生。CBD核酸可以从多种细胞来源获得，这些细胞来源产生以高亲和力和可逆方式结合的纤维素结合结构域或者产生编码CBD的mRNA。
在一些实施方案中，编码CBD蛋白的核酸从嗜纤维梭菌中获得。
在其他实施方案中，编码CBD的核酸如美国专利5,856,201中描述的获得，该专利通过引用并入本文。
根据本发明，编码CBD蛋白的核酸可以从来自细胞来源的分离且纯化的DNA获得或通过基因组克隆获得。当基因克隆是CBD蛋白的来源时，克隆的cDNA或基因组文库可以使用本领域熟知的技术制备。可以用与基因的任何部分大体上互补的核苷酸探针来对文库筛选特定的编码CBD的核酸。如果期望检测编码CBD蛋白的保守核苷酸区域，则核苷酸探针是基于物种与物种间保守的CBD核苷酸序列。如果期望检测编码CBD蛋白的独特的核苷酸区域，则核苷酸探针基于独特的CBD核苷酸序列。可选择地，cDNA或基因组DNA可以被用作用于用合适的寡核苷酸引物进行PCR克隆的模板。可以选择全长克隆，即包含期望的CBD蛋白的整个编码区域的那些克隆以用于构建表达载体，或者可以将重叠的cDNA连接在一起以形成完整的编码序列。可选择地，使用被认为是本领域标准的技术，编码CBD的DNA可以完全或部分地通过化学合成来合成。
如技术人员容易理解的，合适的表达载体的选择取决于各种参数，例如：
-它是用于核酸扩增还是用于核酸表达；
-待插入到载体中的核酸的尺寸；
-待用载体转化的宿主细胞。
根据本发明，每个载体取决于其功能(核酸的扩增或核酸的表达)和对其相容的宿主细胞可以包含不同组分。
可以通过将CBD-HP DNA亚克隆到表达载体中来获得CBD-HP融合蛋白，所述表达载体(例如大肠杆菌(Escherichia coli)表达载体)在重组质粒载体的指导/控制下在宿主细胞(即基于细胞的培养系统)中产生所述CBD-HP嵌合融合蛋白。“宿主细胞”(在本文中可与'基于细胞的培养系统'互换)是能够在培养物中生长并且能够表达CBD蛋白或CBD-HP嵌合体的细胞类型。宿主细胞可以是在体外培养物中生长的细胞，包括原核细胞、真核细胞和昆虫细胞。宿主细胞可以选自调节插入序列的表达或者以期望的特定方式修饰和加工基因产物的菌株。例如，在某些诱导剂(例如，用于金属硫蛋白启动子的锌离子和镉离子)的存在下，从某些启动子的表达可以提高。可以选择宿主细胞以分泌最少量的蛋白水解酶。
在一些实施方案中，基于细胞的培养系统是选自大肠杆菌、棒状杆菌属(Corynebacterium)和荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)的细菌系统。在其他实施方案中，基于细胞的培养系统是选自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、巴斯德毕赤酵母(Pichia Pastoris)、丝状真菌(Filamentous fungi)、杆状病毒(Baculovirus)感染的细胞、非裂解性昆虫细胞表达系统和利什曼原虫属(Leishmania)的真核系统。在其他实施方案中，基于细胞的培养系统是选自中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、人胚肾(HEK)细胞、中国仓鼠卵巢细胞、小鼠骨髓瘤类淋巴母细胞、人胚肾细胞(HEK-293)、人胚视网膜细胞和人羊水细胞(例如Glycotope和CEVEC)的哺乳动物系统。仍在其他实施方案中，基于细胞的培养系统是含有蛋白质合成所需的所有细胞组分的无细胞系统，其中蛋白质使用纯化的RNA聚合酶、核糖体、tRNA和核糖核苷酸在体外产生。
CBD或CBD-HP嵌合体可以如美国专利第5,856,201号中描述的产生，该专利通过引用并入本文。
因此，可以控制CBD蛋白或CBD-HP融合蛋白的表达。如果CBD蛋白或CBD-HP融合蛋白对宿主细胞是致死的，控制表达的能力是重要的。在一些实施方案中，HP是与CBD蛋白被制备为嵌合体的重组蛋白，其中CBD融合至HP的N-末端或C-末端。在一些实施方案中，嵌合体的HP部分可以融合或连接至第三蛋白质。
在一些实施方案中，HP与另一种要素(例如，链霉亲和素、Fc片段、抗原以及其他)被制备为嵌合体，该另一种要素随后可以结合CBM(或结合与该要素的对应物附接的CBM)。因此，根据本发明，HP例如当其通过重组手段作为连续氨基酸链段产生时可以直接附接至CBM，或者HP可以通过另一结构域或相互作用(例如蛋白A/Fc片段、链霉亲和素/生物素等)结合至CBM。在一些实施方案中，HP经由裂解位点(例如TEV结构域)连接至CBM，或者形成CBD-HP嵌合体。
在一些实施方案中，CDM-HP嵌合体包含至少一个接头(例如可裂解的接头)。接头可以具有约1个和100个氨基酸之间或2个至20个氨基酸之间的长度，可以插入在CBM和HP之间，并且可以在CBD-HP嵌合体在细胞培养物中增殖期间(例如在重复传代期间)增强CBD-HP嵌合体的蛋白水解稳定性。
待从中分离出作为与CBD的嵌合体的AOI，例如HP的“粗混合物”通常是液体细胞培养混合物(即宿主细胞培养物，诸如酵母或大肠杆菌细胞培养物)，该液体细胞培养混合物包含富含本文定义的CBD-HP蛋白嵌合体的完整细胞和分级分离细胞的混合物。粗混合物还可以包含其他组分(例如大分子)，诸如核酸、蛋白质、碳水化合物、多酚和大的非聚合物分子诸如脂质。在一些实施方案中，粗混合物是通过破坏细胞培养物中含有的细胞的细胞膜而形成的匀浆。
根据本发明使用的“过滤膜”通常是微膜，该微膜能够使(例如污染的或粗的)流体流过以分离流体中含有的微生物和悬浮颗粒。第一过滤膜和第二过滤膜可以相同或不同，并且可以具有允许CBM-HP嵌合体渗透穿过其中同时防止所定义的CBM-HP-CNC复合体渗透的孔径。在一些实施方案中，该工艺中使用的过滤膜对于两个过滤步骤是相同的。在一些实施方案中，过滤膜具有在0.2μm至60kDa分子量截止值之间的孔径。
膜可以是可充当物理屏障的本领域已知的任何合适的过滤膜，该物理屏障允许某些组分(例如，蛋白质)通过，这取决于组分的物理性质和/或化学性质。过滤膜适合于从本文描述的粗混合物中过滤出期望的分子(例如CDB-HP嵌合体)。过滤膜的特征在于足够的强度(例如，在过滤期间抵抗破裂和撕裂)和足够的亲水性(以允许充分润湿)。根据本发明，过滤膜的第一分子量截止值(即以道尔顿计的最低分子量溶质，其中90％的溶质被膜保留)为约50kDa。
在一些实施方案中，用于任何过滤步骤的过滤膜可以是相同的，并且可以以类似的方式制造、配置、构建或使用。由于膜的孔径被表述为在0.2μm至60kDa分子量截止值之间选择，这样的孔径选择旨在包括具有从0.1μm至10μm的范围内的孔径的微滤膜，以及具有从0.1μm至0.01μm的范围内的孔径的超滤构件。可选择地，过滤膜可以基于它们的分子量截止值(即不大于60kDa)选择。
因此，可以选择具有0.2μm和10μm之间或0.01μm和0.1μm之间的孔径或分子量截止值高达60kDa的膜。
在一些实施方案中，基于孔径(即0.2μm)选择较低的膜尺寸，并且基于分子量截止值(即不大于60kDa)选择最高的尺寸。
在一些实施方案中，过滤膜中的任一个或两个具有在0.45μm至60kDa(分子量截止值)之间的孔径。在其他实施方案中，过滤膜具有在1μm至50kDa(分子量截止值)之间的孔径。在一个实施方案中，过滤膜具有约0.2μm的孔径。
根据本发明，过滤膜用于从含有产生嵌合体的宿主细胞的粗混合物中过滤本文描述的CBD-HP嵌合体(例如，通过重组工艺产生的)。粗混合物通常包含CBD-HP嵌合体以及如本文描述的各种可溶性和不溶性的污染物。因此，例如在约300kDa的分子量截止值，过滤膜保留大的颗粒和细菌，其中大多数球状蛋白质和小分子容易与CBM-HP嵌合体一起渗透通过。在大多数CBM-HP已经通过膜过滤之后，弃去渗余物(主要含有污染物)。
过滤膜可以选自中空纤维膜，中空纤维膜可以是本领域中可得的任何材料，诸如由Pall membralox、GEA、Novasep Kerasep制造的陶瓷中空纤维膜和由GE、Sartorius制造的聚合物中空纤维膜，以及其他。
在分离嵌合体后，添加CNC(例如CNC颗粒)并且允许其与嵌合体相互作用以获得在CNC结合至CBM-HP嵌合体的CBM部分之后形成的CBM-HP-CNC复合体。根据本发明，CNC可以以在水或低电导率磷酸盐缓冲液中的CNC颗粒的悬浮液的形式添加，其中悬浮液中的CNC颗粒的浓度在约0.01％和10wt％之间或在0.5％和2％之间。
在一些实施方案中，CNC与CBM-HP嵌合体的结合在pH 7.4的10mM磷酸盐缓冲液中进行。
在一些实施方案中，将CNC与包含嵌合体的渗透物在4℃至20℃之间或约4℃的温度在中性pH(例如pH 7.4的1mM至100mM磷酸盐缓冲液)下孵育持续约10min和约240分钟之间的时间段，之后使包含CBM-HP-CNC复合体的混合物通过过滤膜。
“结晶纳米纤维素”(CNC)是呈纤维素晶体形式的、具有纳米尺寸范围(在尺寸、高度、长度和宽度所有方面)的源自纤维素的材料。CNC可以由任何类型的纤维素产生，包括细菌纤维素、植物纤维素以及其他。根据本发明，在本文描述的方法中使用的CNC可以来自商业可得的来源或者根据已知的方法诸如在WO 2012/014213或其等同的美国申请中描述的工艺制备，该专利通过引用并入本文。
在一些实施方案中，CNC的特征在于具有至少50％的结晶度。在一些其他实施方案中，CNC是单晶的。在一些实施方案中，CNC从各种来源的纤维素作为颗粒(例如原纤维，或在其他情况下作为结晶材料)产生，并且被选择为至少约100nm的长度。在一些实施方案中，CNC的长度为至多约1,000μm。在其他实施方案中，CNC颗粒为在约100nm和1,000μm之间的长度、在约100nm和900μm之间的长度、在约100nm和600μm之间的长度或在约100nm和500μm之间的长度。仍在其他实施方案中，CNC颗粒为在约100nm和1,000nm之间的长度、在约100nm和900nm之间的长度、在约100nm和800nm之间的长度、在约100nm和600nm之间的长度、在约100nm和500nm之间的长度、在约100nm和400nm之间的长度、在约100nm和300nm之间的长度或在约100nm和200nm之间的长度。
根据本发明，CNC的厚度可以在约5nm和100nm之间，并且CNC可以被选择为具有10和更大的纵横比(长度直径比)。在一些实施方案中，纵横比在67和100之间。在一些实施方案中，CNC被选择为长度在约100nm和400nm之间以及厚度在约5nm和30nm之间。
根据本发明的方法，使包含CBM-HP-CNC(例如，CBD-HP-CNC)复合体的混合物通过不同或相同的过滤膜，由于尺寸的增加，该过滤膜不允许CBD-HP-CNC复合体渗透通过。弃去渗透物(例如含有各种植物蛋白质)，并且然后处理含有(纯化的)CBM-HP-CNC复合体的渗余物以分离(isolate)或分离(separate)HP。从CBM-HP-CNC复合体中分离HP可以使用本领域中常见的各种化学程序(例如，使用pH升高的洗脱、蛋白水解)进行。例如，CBM-HP嵌合体从CNC颗粒中的释放可以通过升高pH从而获得CBM-HP嵌合体来实现，该CBM-HP嵌合体在用合适的蛋白水解酶进行蛋白水解之后从CBM-HP嵌合体中释放HP。在一些实施方案中，HP的分离可以通过以下进行：将pH升高至约11至12的pH水平以从NCC中释放CBM-HP嵌合体，随后添加至少一种蛋白水解酶以从HP中释放CBM。蛋白水解酶的一些非限制性实例是烟草蚀纹病毒的核内包涵体(nuclear-inclusion)-一种内肽酶(TEV)、因子X、肠激酶、凝血酶HRV-3C、无花果蛋白酶和木瓜蛋白酶。
在本发明的方法中获得的HP可以被用于“钓出”感兴趣的剂(AOI)，感兴趣的剂可以是基于氨基酸的剂或基于非氨基酸的剂。因此，该方法还可以包括允许分离的HP或HP嵌合体(例如，CBM-HP嵌合体)和至少一种AOI之间相互作用的步骤。AOI可以是能够与HP亲和结合的任何剂或材料。这样的剂可以选自基于氨基酸的剂，其中HP是抗体、受体、酶、底物等或其片段；基于核酸的剂，其中HP是核酸结合蛋白或其片段；糖、脂肪酸或具有能够与之亲和结合的肽部分的小的有机分子。
因此，在本发明的多个方面的另一个方面，本发明提供了一种用于从液体混合物中分离感兴趣的剂(AOI)的方法，该方法包括：
-在允许AOI和CBM-HP嵌合体之间的缔合的条件下，用CBM-HP嵌合体(其是根据如上文定义的本发明的方法任选地获得和分离的；或者是通过任何其他方式制备和分离的)处理包含至少一种AOI的介质，以获得包含CBM-HP-AOI复合体的混合物；
-将CNC添加至包含CBM-HP-AOI复合体的混合物中，以形成CNC-CBM-HP-AOI复合体；
-使包含CNC-CBM-HP-AOI复合体的混合物通过不允许CNC-CBM-HP-AOI复合体渗透的过滤膜，以获得包含CNC-CBM-HP-AOI复合体的渗余物；以及
-从该复合体中分离AOI。
过滤膜可以是如上文定义的。
在一些实施方案中，该方法还包括获得包含待分离的AOI的介质的步骤。在一些实施方案中，介质是如本文定义的含有AOI的粗混合物，并且因此可以通过具有约0.2微米的孔径的过滤膜，以从该介质中部分地清除杂质。
为了从CNC-CBD-HP-AOI复合体中分离(isolate)/分离(separate)AOI，可以执行本领域中常见的多种化学程序。例如，AOI可以通过将pH降低至1.5至3之间的pH，添加特定的盐诸如NaCl、氯化胍或金属乙酸盐诸如乙酸锂或溶剂诸如乙醇和正丁醇来释放。AOI在释放之后不得不通过膜，并且由此从溶液中清除。在一些实施方案中，包含CNC-CBM-HP-AOI复合体的混合物借助于进一步的透析(通过溶液中的分子通过半透膜的扩散速率的差异来分离这些分子)或过滤被进一步纯化，之后从该CNC-CBD-HP-AOI复合体中分离AOI。
在一些实施方案中，收集并储存包含CNC-CBM-HP-AOI复合体的渗余物(混合物)以便在需要时进一步处理。
在其他实施方案中，为了从在本发明的方法中获得的CNC-CBM-HP-AOI复合体或CNC-CBM-HP复合体中释放CNC，将包含该复合体的混合物的pH升高至约10和约13之间。根据这样的实施方案，可以弃去CNC或使CNC再循环，并且可以收集CBM-HP-AOI复合体(例如通过过滤)。
在其他实施方案中，为了分离纯的HP，可以使用如本文描述的合适的蛋白酶。根据这样的实施方案，存在于CBM蛋白和HP蛋白之间的接头蛋白被消化，并且HP因此可以渗透通过膜并且被收集在渗透物中。CNC-CBM复合体与渗余物一起被弃去。
仍在其他实施方案中，当待从CNC-CBM-HP-AOI复合体中分离AOI时(其中HP与AOI(例如，为另一种蛋白质、小分子核酸序列等)亲和结合)，使用合适的化学程序(例如，pH变化或盐浓度变化)裂解结合的HP和AOI。因此，例如如果抗体(为AOI)与连接至CBM-CNC的蛋白A(为HP)结合，低的pH将仅使抗体从蛋白A释放，而CBD不从CNC释放。
在一些实施方案中，CBM是如本文定义的CBD。
根据本发明，在本文描述的方法中的任何过滤步骤可以重复至少一次(例如，使用若干个缓冲液体积)，直到达到期望的纯度。
在图1A-图1E中提供了根据本发明的方法的示意图，其中如图1A所示，将包含嵌合体和各种尺寸的污染物的粗混合物例如用0.2μm的膜过滤。仅保留大的不溶性颗粒，并且一旦所有嵌合体都渗透，则可以弃去这些大的不溶性颗粒。然后如图1B所示，使包含嵌合体的渗透物与添加至混合物中的CNC接触，并且在短的孵育时间段之后通过不同、相似或相同的过滤膜，例如0.2μm的膜过滤。仅小的可溶性分子和污染物蛋白质渗透并且被弃去。如图1C所示，一旦达到期望的纯度，升高pH，并且CBD从NCC颗粒中释放。嵌合体(例如，感兴趣的蛋白质POI的嵌合体)自由地渗透通过膜并且被收集。渗余物(现在仅含有NCC)被弃去。
如果仅需要纯的嵌合体，而不需要CBD部分，如图1D所示，可以添加合适的蛋白水解酶。在破坏CBD和AOI/HP(例如，POI)之间的连接之后，CBD仍然与NCC结合，并且AOI/HP(例如，POI)自由地渗透通过膜并且被收集。然而，如图1E所示，如果NCC-CBD-HP/AOI复合体(例如，NCC-IL-2-TEV-CBD)是期望的，它可以在阶段B之后被直接收集。因此，本发明还提供了一种用于从液体混合物中分离HP的方法，该方法包括：
-使包含至少一种碳水化合物结合模块和至少一种HP的嵌合体(CBM-HP嵌合体)的粗混合物通过第一过滤膜，以获得包含CBM-HP嵌合体的渗透物；
-使CBM-HP嵌合体与允许与该CBM-HP嵌合体相互作用的纤维素纳米晶体(CNC)接触，以获得包含CBM-HP-CNC复合体的混合物；
-使包含CBM-HP-CNC复合体的混合物通过第二过滤膜，以获得包含CBM-HP-CNC复合体的渗余物；以及
-从该CBM-HP-CNC复合体中分离HP和/或CBM-HP嵌合体；
相同或不同的第一过滤膜和第二过滤膜具有被选择为允许CBM-HP嵌合体渗透穿过其中并且防止CBM-HP-CNC复合体渗透穿过其中的孔径。
在一些实施方案中，该方法还包括获得粗混合物中的CBM-HP嵌合体，使得其可以从粗混合物中分离出来。在一些实施方案中，粗混合物还包含至少一种选自核酸、蛋白质、碳水化合物、多酚和大的非聚合物分子的其他材料。在一些实施方案中，粗混合物是通过破坏细胞培养物中含有的细胞的细胞膜而形成的匀浆。
在一些实施方案中，CBM-HP嵌合体在宿主细胞中产生或表达。
在一些实施方案中，CBM-HP嵌合体在植物细胞中产生。
在一些实施方案中，该方法还包括分离CBM-HP嵌合体和/或HP。在一些实施方案中，首先分离CBM-HP嵌合体，并且随后从其中分离HP。
在一些实施方案中，该方法还包括在允许至少一种AOI和CBM-HP嵌合体之间的缔合的条件下，用CBM-HP嵌合体处理包含至少一种感兴趣的剂(AOI)的液体介质，以获得包含CBM-HP-AOI复合体的混合物。
在一些实施方案中，该方法包括从CBM-HP-AOI复合体中分离AOI。
在一些实施方案中，CBM是纤维素结合结构域(CBD)。
在一些实施方案中，第一过滤膜和第二过滤膜相同。
在一些实施方案中，CBM-HP嵌合体是CBD-HP嵌合体。
在一些实施方案中，HP被分离为适合于在分离感兴趣的剂的方法中使用的形式。
本发明还提供了一种用于从液体混合物中分离感兴趣的剂(AOI)的方法，该方法包括：
-根据本发明的方法获得CBM-HP嵌合体；
-在允许至少一种AOI和CBM-HP嵌合体之间的缔合的条件下，用CBM-HP嵌合体处理包含至少一种AOI的液体介质，以获得包含CBM-HP-AOI复合体的混合物；
-将CNC添加至包含CBM-HP-AOI复合体的混合物中，以形成CNC-CBM-HP-AOI复合体；
-使包含CNC-CBM-HP-AOI复合体的混合物通过具有不允许CNC-CBM-HP-AOI复合体渗透的孔径的过滤膜，以获得包含CNC-CBM-HP-AOI复合体的渗余物；以及
-从该复合体中分离AOI。
本发明还提供了一种用于从液体混合物中分离感兴趣的剂(AOI)的方法，该方法包括：
-在允许至少一种AOI和CBM-HP嵌合体之间的缔合的条件下，用CBM-HP嵌合体处理包含至少一种AOI的液体介质，以获得包含CBM-HP-AOI复合体的混合物；
-将CNC添加至包含CBM-HP-AOI复合体的混合物中，以形成CNC-CBM-HP-AOI复合体；
-使包含CNC-CBM-HP-AOI复合体的混合物通过具有不允许CNC-CBM-HP-AOI复合体渗透的孔径的过滤膜，以获得包含CNC-CBM-HP-AOI复合体的渗余物；以及包括
-从复合体中分离AOI。
附图简述
以下附图表明本发明的某些有利的特征。应强调，示出的详情是通过实例的方式并且出于本发明的实施方案的说明性讨论的目的。
图1A-图1E提供了根据本发明的分离方法的示意图。
实施方案的详细描述
除非另外定义，否则本文使用的所有技术术语和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。虽然与本文描述的那些方法和材料相似或等效的任何方法和材料都可以用于实践或测试本发明，但现在描述优选的方法和材料。
在本发明的主要方面的一个方面中，本发明提供了一种用于获得液体混合物中存在的异源蛋白质的方法，该方法包括：
-产生在第一粗混合物中的附接至纤维素结合结构域(CBD)的异源蛋白质(HP)；
-使第一粗混合物通过具有60kDa(UF范围)至0.45微米(MF范围)的第一截止值的第一过滤膜，并且弃去包含大污染颗粒的渗余物以获得渗透物；
-向(2)的渗透物中添加CNC颗粒，以获得第二混合物；
-使(3)的第二混合物通过具有高达0.45微米的截止值的第二过滤膜，并且从而获得附接至CNC颗粒的纯化的异源蛋白质。
异源蛋白质(HP)可以是需要在产物末端获得的感兴趣的蛋白质，例如与CBD蛋白被制备为嵌合体的重组蛋白、或与可以随后结合至CBD(或结合至附接该要素的对应物的CBD)的另一种要素(链霉亲和素、Fc片段、抗原等)被制备为嵌合体的重组蛋白。
HP可以用于从粗混合物中“钓出”感兴趣的剂(其可以是基于氨基酸的剂或基于非氨基酸的剂)。
根据该第二方面，本发明涉及获得能够与异源蛋白质亲和结合的、存在于液体混合物中的感兴趣的剂，该方法包括：
-向液体混合物中添加第一粗混合物中附接至纤维素结合结构域(CBD)的异源蛋白质(HP)；
-在添加CBD-HP嵌合体之前或之后，使第一粗混合物通过具有10kDa(UF)至0.45微米(MF范围)的第一截止值的第一过滤膜，并且弃去包含大污染颗粒的渗余物以获得渗透物；
-向(2)的渗透物中添加CNC颗粒，以获得第二混合物；
-使(3)的第二混合物通过具有高达0.45微米的截止值的第二过滤膜，并且获得渗余物，从而获得感兴趣的剂。
应注意的是，在步骤2中，优选地在第一过滤之后添加CBD-HP嵌合体，从而能够使用较低截止值的膜，并且因此改善纯化。
该方法还可以包括本领域已知的用于分离感兴趣的剂和异源蛋白质的亲和结合的另外的步骤，包括但不限于pH调节、离子调节、添加离液剂(chaotropic agent)或(cosmotropic剂、尿素、有机溶剂或洗涤剂、糖、核苷酸(例如ATP)，温度调节或切离亲和结合结构域。任何添加的材料可以在之后借助于进一步透析或过滤而弃去。
能够与异源蛋白质亲和结合的感兴趣的剂(AOI)可以是基于氨基酸的剂(HP是抗体、受体、酶、底物等或其片段)、基于核酸的剂(并且HP是核酸结合蛋白或其片段)、糖、脂肪酸或具有能够与之亲和结合的基于氨基酸的分子(为HP)的小的有机分子。
以下段落与第一选择和第二选择两者相关。
通常，第一膜和第二膜相同，具有0.2微米的截止值。
膜可以是中空纤维或错流过滤膜。
HP例如通过重组手段作为连续氨基酸链段产生时直接附接至CBD，或者通过另一结构域或相互作用(例如蛋白A/Fc片段、链霉亲和素/生物素等)结合至CBD。经由裂解位点，诸如TEV结构域，将HP连接至CBD也是可能的。这将形成CBD-HP嵌合体。
在本发明的方法的步骤(4)中获得的渗余物可以通过以下进一步处理：
-如果整个CNC-CBD-HP复合体是期望的，则可以简单地收集CNC-CBD-HP复合体。
-如果CBD-HP嵌合体是期望的产物，并且应弃去CNC，则将pH升高至约pH 10.5-13，蛋白质迅速地释放并且渗透通过膜以被收集。将CNC颗粒弃去(因为它们的成本可忽略不计)或再循环。
-如果仅期望纯的HP，则将合适的蛋白酶添加至溶液中，并且消化CBD蛋白和HP蛋白之间的接头蛋白，由此从保持与NCC结合的CBD释放HP。游离的HP现在能够渗透通过膜并且被收集在渗透物中，并且CNC-CBD复合体与渗余物一起被弃去。
从切离的CBD中分离HP仅在其中CBD-HP嵌合体被切离并且CBD从CNC释放的非常特定的情况下是必要的；否则CBD与CNC保持结合并且与CNC一起被弃去。
如果确实嵌合体首先从CNC释放，并且然后消化，则分离可以借助色谱法或取决于特定蛋白质生化性质的其他分离方法进行。
本发明的优点在于，它将膜分离工艺和色谱分离工艺两者的益处组合在一起：它可以处理非常大量的含有宽范围的蛋白质和颗粒物质的溶液，同时提供仅在亲和色谱法中出现的非常高的选择性。它避免了对柱装填的需求和所涉及的限制，诸如高压力、低流速和阻塞。
通常在亲和色谱法中，亲和色谱树脂与靶蛋白的结合容量高达数十毫克/1克树脂。在本发明中，1gr CNC的容量达到数百毫克/1克CNC。此外，与通常与高压力、相对慢的过滤速率和阻塞问题相关的超滤相比，使用微滤时将靶蛋白选择性地保留在渗余物中的能力是巨大的优点。
所描述的纯化方法允许使用现有的过滤装置和技术(诸如中空纤维和错流过滤等)进行快速、经济且有效的三阶段蛋白质纯化。本发明的方法基于包含纤维素结合结构域(CBD)和异源蛋白质(HP)的嵌合体通过嵌合体的CBD部分与结晶纳米纤维素(CNC)的可逆结合，并且由此产生大的蛋白质/CNC加合物。该加合物借助于过滤与污染物分离，并且然后“按原样”使用，或者嵌合体(CBD-HP)通过pH变化或蛋白水解从CNC颗粒释放，或者HP通过各种裂解或分离技术与CBD分离，如将在下文解释的。
HP直接附接至CBD或通过另一结构域或相互作用(例如蛋白A/Fc片段、链霉亲和素/生物素等)结合至CBD。经由裂解位点，诸如TEV结构域，将HP连接至CBD也是可能的。这将形成CBD-HP嵌合体。
异源蛋白质(HP)可以是需要在产物的末端处获得的感兴趣的蛋白质，例如与CBD蛋白被制备为嵌合体的重组蛋白、或与可以随后结合CBD(或具有该要素的对应物的CBD)的另一种要素(链霉亲和素、Fc片段、抗原)被制备为嵌合体的重组蛋白。
可选择地，HP是能够与需要分离的存在于样品中的感兴趣的蛋白质亲和结合的蛋白质(抗体或片段、受体或片段、酶的底物结合结构域、底物、DNA结合蛋白等)。
CBD-HP嵌合体可以通过例如重组工艺产生，并且需要从制备它的粗混合物中纯化。在这样的情况下，首先通过0.1μm-0.45μm，优选地0.2μm的微滤膜，优选地中空纤维膜或错流装置来过滤含有CBD-HP嵌合体和各种类型和尺寸的(可溶性和不溶性)污染物的粗混合物。在该截止值，膜保留了大的颗粒和细菌，但大多数球状蛋白质和小分子容易与CBD-HP嵌合体一起渗透通过。在大多数CBD-HP已经被分离之后，弃去渗余物(现在主要含有污染物)。
如果意图从感兴趣的蛋白质(其亲和结合至嵌合体的HP部分)的粗混合物中“钓出”CBD-HP，则可以进行与上文相同的步骤，或者可选择地，首先使粗混合物通过0.1μm-0.45μm，优选地0.2μm的微滤膜，优选地中空纤维膜或错流装置过滤粗混合物。在该截止值，膜保留了大的颗粒和细菌，但不保留大多数球状蛋白质，并且仅在该步骤之后，添加CBD-HP。
在第二阶段中，添加CNC，CBD-HP结合CNC颗粒并且形成大的加合物，该加合物现在比膜的截止值0.1μm-0.45μm，优选地0.2μm的膜截止值大，并且不能渗透膜。因此，它们保留在渗余物中，而所有其他污染小分子和蛋白质被除去。可以更换任何数目的缓冲液体积，直到达到期望的纯度。
在最后的阶段，收获产物。这可以通过以下四种方式中的一种进行：
在HP是感兴趣的蛋白质(例如以重组技术产生的)的情况下：
1.如果整个CNC-CBD-HP复合体是期望的，则可以简单地收集CNC-CBD-HP复合体。
2.如果CBD-HP嵌合体是期望的产物，并且CNC应弃去，则将pH升高至约pH 10.5-11，蛋白质迅速地释放并且渗透通过膜以被收集。将CNC颗粒弃去(因为它们的成本可忽略不计)或再循环。
3.如果仅期望纯的HP，则将合适的蛋白酶添加至溶液中，并且消化CBD蛋白和HP蛋白之间的接头蛋白，由此从保持与NCC结合的CBD中释放HP。被释放的HP现在能够渗透通过膜并且被收集在渗透物中，并且CNC-CBD复合体与渗余物一起被弃去。
4.在HP与作为感兴趣的剂的另一种剂(另一种蛋白质、小分子核酸序列等)亲和结合的情况下，当HP仍然如上文(1)中所述或者如上文2或3中例如通过pH变化或盐浓度变化分离时，HP和感兴趣的剂之间的亲和结合被破坏。必须定义合适的条件，其中仅亲和结合被破坏，而CBD不从CNC释放。
结晶纳米纤维素(如本文中使用的CNC)是指所有尺寸(长度和宽度)的在纳米尺寸范围内的来自任何类型的纤维素(包括细菌纤维素、植物纤维素等)的纤维素晶体。
在一些实施方案中，纳米纤维素材料的特征在于具有至少50％的结晶度。在另外的实施方案中，纳米纤维素材料是单晶的。
在一些实施方案中，从各种来源的纤维素作为颗粒(例如原纤维，或在其他情况下作为结晶材料)产生的纳米纤维素材料被选择为至少约100nm的长度。在其他实施方案中，它们的长度为至多约1,000μm。在其他实施方案中，纳米纤维素材料颗粒为在约100nm和1,000μm之间的长度、在约100nm和900μm之间的长度、在约100nm和600μm之间的长度或在约100nm和500μm之间的长度。
在一些实施方案中，CNC颗粒为在约100nm和1,000nm之间的长度、在约100nm和900nm之间的长度、在约100nm和800nm之间的长度、在约100nm和600nm之间的长度、在约100nm和500nm之间的长度、在约100nm和400nm之间的长度、在约100nm和300nm之间的长度或在约100nm和200nm之间的长度。
CNC的厚度可以在约5nm和100nm之间变化。
CNC的原纤维可以被选择为具有10和更大的纵横比(长度直径比)。在一些实施方案中，纵横比是67-100。
NCNC被选择为长度在约100nm和400nm之间且厚度在约5nm和30nm之间。
NCC可以如商业可得的那样使用或者可以根据已知的方法诸如在WO 2012/014213或其等同的美国申请中描述的工艺制备，该专利通过引用并入本文。
CBD蛋白质
CBD蛋白可以是在http://www.cazy.org/carbohydrate-binding-modules.html中呈现的任何蛋白质或蛋白质结构域的变体、衍生物、片段或化学修饰物，只要该片段、衍生物、变体或修饰物保持CNC结合性质。
本发明的CBD蛋白是与上文的GeneBank登录号的氨基酸序列具有至少70％同源性，优选地至少80％同源性，更优选地至少90％同源性，并且最优选地至少95％同源性的蛋白质。术语“X％同源性”不意图限于在蛋白质的全长上具有X％同源性的序列。70％同源性还意图包括在上文的GeneBank登录号的CBD蛋白中的鉴定的功能区域中存在的X％同源性。功能区域的实例是确定的一组氨基酸，这组氨基酸具有以高亲和力和可逆方式结合纤维素的能力。这样的蛋白质同源物在本文中也可以被称为“CBD功能同源物”。在本发明的一个实施方案中，这样的功能区域可以具有约100个氨基酸。在本发明的另一个实施方案中，这样的功能区域可以具有约50个氨基酸。本发明的最期望的CBD蛋白是包含上文所指出的氨基酸序列的蛋白。
如本文中使用的术语“CBD功能衍生物”是指上文所示的GeneBank序列中示出的CBD蛋白氨基酸序列的任何“片段”、“变体”、“类似物”或“化学衍生物”，它们保持以高亲和力和可逆方式结合纤维素的能力，并且优选地长度在约2个和约160个氨基酸之间，更优选地长度在约25个和约125个氨基酸之间，并且最优选地长度在约50个和约100个氨基酸之间。
术语“片段”用于指示这样的CBD蛋白，其源自所示的CBD蛋白，并且具有天然存在的序列。这样的片段可以通过全长蛋白质的蛋白水解裂解来产生。可选择地，通过适当地修饰编码CBD蛋白的DNA序列以使在C-末端、N-末端和天然存在的序列内的一个或更多个位点处的一个或更多个氨基酸缺失而通过重组获得片段。CBD蛋白的片段可以关于以高亲和力和可逆方式结合纤维素的能力被筛选，以便确定功能衍生物的身份或效用。
如本文中使用的术语“变体”被定义为这样的分子，在该分子中天然存在的分子的氨基酸序列、糖基化模式或其他特征已经被共价或非共价地修饰，并且意图包括突变体。落入本发明的变体中的一些具有氨基酸置换、缺失和/或插入，条件是最终的构建体具有期望的以高亲和力和可逆方式结合纤维素的能力。CBD蛋白中的氨基酸置换可以基于所涉及的残基的极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或两亲性的相似性进行。例如，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电荷的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；具有相似亲水性值的具有不带电荷的极性头基或非极性头基的氨基酸包括以下：亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸；甘氨酸、丙氨酸；天冬酰胺、谷氨酰胺；丝氨酸、苏氨酸；苯丙氨酸、酪氨酸。只要变体保持以高亲和力和可逆方式结合纤维素的能力，变体的定义内还包括在C-末端、N-末端以及天然存在的CBD序列内的一个或更多个位点处具有另外的氨基酸的那些蛋白质。
如本文中使用的术语“化学衍生物”是指通过对天然存在的或变体CBD蛋白的化学修饰而产生的CBD蛋白。对化学修饰的实例的例示将是用烷基基团、酰基基团或氨基基团取代H。
CBD-HP嵌合体
如本文中使用的术语“CBD-HP嵌合体”是指将至少两种蛋白质(CBD蛋白和为HP的第二蛋白质)连接在一起。在本发明的一些实施方案中，HP可以融合或连接至第三蛋白质。在本发明中，HP的实例包括酶，诸如核酸修饰酶、蛋白酶、激素或激素前体、多肽、肽、抗体、抗原、抗原表位及其变体。
编码CBD的核酸可以被用于构建能够表达本发明的CBD蛋白或CBD-HP嵌合体的重组表达载体。如果核酸构建体包含含有转录和翻译调节信息的核苷酸序列并且这样的序列与核苷酸编码序列“可操作地连接”，则该核酸构建体能够表达蛋白质。“可操作地连接”是指一种连接，其中调节性DNA序列和待表达的DNA序列以允许转录和最终翻译的那类方式连接。
在构建CBD-HP嵌合体表达载体时，编码CBD蛋白的核酸与编码HP的核酸连接(link)或连接(join)，使得CBD蛋白和第二蛋白的开放阅读框是完整的，允许CBD融合蛋白的翻译发生。CBD核酸可以从多种细胞来源获得，这些细胞来源产生以高亲和力和可逆方式结合的纤维素结合结构域或者产生编码CBD的mRNA。编码CBD的核酸的优选来源是嗜纤维梭菌。编码CBD的核酸可以如美国专利5856201中描述的获得，该专利通过引用并入本文。
本发明的编码CBD蛋白的核酸可以从来自细胞来源的分离且纯化的DNA获得或者通过基因组克隆获得。克隆的cDNA或基因组文库可以使用本领域熟知的技术制备，并且可以用与基因的任何部分大体上互补的核苷酸探针来筛选编码特定CBD的核酸。如果期望检测编码CBD蛋白的保守核苷酸区域，则核苷酸探针应基于在物种与物种间保守的CBD核苷酸序列。如果期望检测编码CBD蛋白的独特的核苷酸区域，则核苷酸探针应基于独特的CBD核苷酸序列。可选择地，cDNA或基因组DNA可以被用作模板以便用合适的寡核苷酸引物进行PCR克隆。可以选择全长克隆，即包含期望的CBD蛋白的整个编码区域的那些克隆以用于构建表达载体，或者可以将重叠的cDNA连接在一起以形成完整的编码序列。可选择地，使用被认为是本领域标准的技术，编码CBD的DNA可以完全或部分地通过化学合成来合成。
许多载体是可用的，并且适当的载体的选择将取决于多种因素，诸如但不限于以下提供的因素：1)它是用于核酸扩增还是用于核酸表达，2)待插入载体中的核酸的尺寸，和3)待用载体转化的宿主细胞。每个载体取决于载体的功能(核酸的扩增或核酸的表达)和对其相容的宿主细胞包含不同的组分。
术语“宿主细胞”是指能够在培养物中生长并且能够表达CBD蛋白或CBD-HP嵌合体的那些细胞。本发明的宿主细胞包括体外培养的细胞，并且包括原核细胞、真核细胞和昆虫细胞。可以选择调节插入的序列的表达或者以期望的特定方式修饰和加工基因产物的宿主细胞株。在某些诱导剂(例如，用于金属硫蛋白启动子的锌离子和镉离子)的存在下，某些启动子的表达可以提高。因此，可以控制CBD蛋白或CBD融合蛋白的表达。如果CBD蛋白或CBD融合蛋白对宿主细胞是致死的，控制表达的能力将是重要的。蛋白质产物的修饰(例如，磷酸化)和加工(例如，裂解)对蛋白质的功能是重要的。不同的宿主细胞针对蛋白质的翻译后加工和修饰具有特征性和特定的机制。可以选择适当的细胞系或宿主系统来确保表达的CBD蛋白或CBD融合蛋白的正确修饰和加工。优选地，宿主细胞应分泌最少量的蛋白水解酶。
对于产生CBD或CBD-HP嵌合体的其他细节可以在美国公布5,856,201中找到，该公布通过引用并入本文。
Claims (45)
1.一种用于从液体混合物中分离异源蛋白质(HP)的方法，所述方法包括：
-使包含至少一种碳水化合物结合模块和至少一种HP的嵌合体(CBM-HP嵌合体)的粗混合物通过第一过滤膜，以获得包含所述CBM-HP嵌合体的渗透物；
-使所述CBM-HP嵌合体与允许与所述CBM-HP嵌合体相互作用的纤维素纳米晶体(CNC)接触，以获得包含CBM-HP-CNC复合体的混合物；
-使包含所述CBM-HP-CNC复合体的所述混合物通过第二过滤膜，以获得包含所述CBM-HP-CNC复合体的渗余物；以及
-从所述CBM-HP-CNC复合体中分离所述HP和/或所述CBM-HP嵌合体；
相同或不同的所述第一过滤膜和所述第二过滤膜具有被选择为允许所述CBM-HP嵌合体渗透穿过其中并且防止所述CBM-HP-CNC复合体渗透穿过其中的孔径。
2.根据权利要求1所述的方法，所述方法包括获得粗混合物中的所述CBM-HP嵌合体。
3.根据权利要求2所述的方法，所述粗混合物还包含至少一种选自核酸、蛋白质、碳水化合物、多酚和大的非聚合物分子的其他材料。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述粗混合物是通过破坏细胞培养物中含有的细胞的细胞膜而形成的匀浆。
5.根据权利要求2所述的方法，其中所述CBM-HP嵌合体在宿主细胞中产生或表达。
6.根据权利要求2所述的方法，其中所述CBM-HP嵌合体在植物细胞中产生。
7.根据权利要求1所述的方法，所述方法包括分离所述CBM-HP嵌合体。
8.根据权利要求1所述的方法，所述方法包括分离所述HP。
9.根据权利要求1所述的方法，所述方法包括分离所述CBM-HP嵌合体，并且随后从其中分离所述HP。
10.根据权利要求7所述的方法，所述方法还包括在允许至少一种感兴趣的剂(AOI)和所述CBM-HP嵌合体之间的缔合的条件下，用所述CBM-HP嵌合体处理包含所述至少一种AOI的液体介质，以获得包含CBM-HP-AOI复合体的混合物。
11.根据权利要求10所述的方法，所述方法包括从所述CBM-HP-AOI复合体中分离所述AOI。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述CBM是纤维素结合结构域(CBD)。
13.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一过滤膜和所述第二过滤膜相同。
14.根据权利要求1所述的方法，其中所述CBM-HP嵌合体是CBD-HP嵌合体。
15.根据权利要求8所述的方法，其中所述HP以适合于在分离感兴趣的剂的方法中使用的形式被分离。
16.一种用于从液体混合物中分离感兴趣的剂(AOI)的方法，所述方法包括：
-根据权利要求1所述的方法获得CBM-HP嵌合体；
-在允许至少一种AOI和CBM-HP嵌合体之间的缔合的条件下，用所述CBM-HP嵌合体处理包含所述至少一种AOI的液体介质，以获得包含CBM-HP-AOI复合体的混合物；
-将CNC添加至包含所述CBM-HP-AOI复合体的所述混合物，以形成CNC-CBM-HP-AOI复合体；
-使包含所述CNC-CBM-HP-AOI复合体的所述混合物通过具有不允许所述CNC-CBM-HP-AOI复合体渗透的孔径的过滤膜，以获得包含所述CNC-CBM-HP-AOI复合体的渗余物；以及
-从所述复合体中分离所述AOI。
17.一种用于从液体混合物中分离感兴趣的剂(AOI)的方法，所述方法包括：
-在允许至少一种AOI和CBM-HP嵌合体之间的缔合的条件下，用CBM-HP嵌合体处理包含所述至少一种AOI的液体介质，以获得包含CBM-HP-AOI复合体的混合物；
-将CNC添加至包含所述CBM-HP-AOI复合体的所述混合物，以形成CNC-CBM-HP-AOI复合体；
-使包含所述CNC-CBM-HP-AOI复合体的所述混合物通过具有不允许所述CNC-CBM-HP-AOI复合体渗透的孔径的过滤膜，以获得包含所述CNC-CBM-HP-AOI复合体的渗余物；以及包括
-从所述复合体中分离所述AOI。
18.根据权利要求16或17所述的方法，所述方法还包括获得包含所述AOI的介质，所述AOI待从所述介质中分离。
19.根据权利要求17所述的方法，所述方法还包括获得包含所述CBM-HP嵌合体的介质。
20.根据权利要求16或17所述的方法，其中所述CBM是纤维素结合结构域(CBD)。
21.根据权利要求16或17所述的方法，其中所述CBM-HP嵌合体是CBD-HP嵌合体。
22.根据权利要求16或17所述的方法，所述方法包括分离所述CBM-HP-AOI复合体。
23.根据权利要求21所述的方法，所述方法还包括在形成所述CNC-CBM-HP-AOI复合体后分离所述CBM-HP嵌合体。
24.根据权利要求16或17所述的方法，其中包含所述CNC-CBM-HP-AOI复合体的所述混合物借助于透析或过滤来进一步纯化，之后从所述CNC-CBD-HP-AOI复合体中分离所述AOI。
25.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中相同或不同的所述第一过滤膜和所述第二过滤膜各自具有0.2μm至60kDa分子量截止值之间的孔径。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述第一过滤膜和所述第二过滤膜相同。
27.根据权利要求16至26中任一项所述的方法，其中所述过滤膜具有0.2μm至60kDa分子量截止值之间的孔径。
28.根据权利要求25或27所述的方法，其中所述孔径在0.45μm至60kDa分子量截止值之间。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述孔径在1μm至50kDa分子量截止值之间。
30.根据权利要求28所述的方法，其中所述孔径是0.2μm。
31.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述CBM是CBD并且选自CBM2-13、CBM16-17、CBM20-28、CBM40-46和CBM61-67。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述CBD是CBD功能衍生物。
33.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述HP与多于一种CBD缔合。
34.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述CBD与多于一种HP缔合，每种HP可以任选地彼此不同。
35.根据权利要求1或15所述的方法，其中所述嵌合体的HP部分被融合或连接至另外的蛋白质。
36.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述CBM-HP嵌合体的HP部分与随后结合至CBM的另一要素被制备为嵌合体。
37.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在所述CBM-HP嵌合体中，所述HP任选地被直接附接至所述CBM。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述CBM-HP嵌合体的所述HP通过另一结构域或相互作用结合至所述CBM。
39.根据权利要求37所述的方法，其中所述CDM-HP嵌合体包含至少一个接头。
40.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述CBM是具有GeneBank编号EEU00265.1的CBD。
41.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述CNC的特征在于具有至少50％的结晶度。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述CNC是单晶的。
43.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述CNC的长度为至多约1,000μm。
44.根据权利要求15或16所述的方法，其中所述AOI具有对HP的亲和力。
45.根据权利要求44所述的方法，其中所述AOI选自基于氨基酸的剂，其中所述HP是抗体、受体、酶、底物或其片段；基于核酸的剂，其中所述HP是核酸结合蛋白或其片段；糖、脂肪酸或具有能够与所述HP亲和结合的肽部分的有机分子。
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Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1125452A (zh) * | 1993-04-14 | 1996-06-26 | 加州大学评议会 | 纤维素结合区域 |
| CN1842600A (zh) * | 2003-08-27 | 2006-10-04 | 奥夫莱夫塔埃克尼公司 | 蛋白水解裂解和纯化重组蛋白的方法 |
| CN102177438A (zh) * | 2008-07-25 | 2011-09-07 | 理查德·W·瓦格纳 | 蛋白筛选方法 |
| CN102947324A (zh) * | 2010-01-29 | 2013-02-27 | 阿切尔丹尼尔斯密德兰公司 | 结合有工业意义的小分子的肽结构域 |
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|---|---|---|---|---|
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| JP2005046031A (ja) * | 2003-07-31 | 2005-02-24 | Toyobo Co Ltd | α１，３−フコシルトランスフェラーゼＶＩ活性を有する融合タンパク質及びその製造方法 |
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|---|---|---|---|---|
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| CN1842600A (zh) * | 2003-08-27 | 2006-10-04 | 奥夫莱夫塔埃克尼公司 | 蛋白水解裂解和纯化重组蛋白的方法 |
| CN102177438A (zh) * | 2008-07-25 | 2011-09-07 | 理查德·W·瓦格纳 | 蛋白筛选方法 |
| CN102947324A (zh) * | 2010-01-29 | 2013-02-27 | 阿切尔丹尼尔斯密德兰公司 | 结合有工业意义的小分子的肽结构域 |
Non-Patent Citations (1)
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|---|
| JOZEF NAHALKA 等: "Fusion to a Pull-Down Domain: A Novel Approach of Producing Trigonopsis variabilis D -Amino Acid Oxidase as Insoluble Enzyme Aggregates", 《BIOTECHNOLOGY AND BIOENGINEERING》 * |
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