JP7304811B2 - 修飾核酸モノマー化合物及びオリゴ核酸類縁体 - Google Patents
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Description
具体的なオリゴ核酸としては、アンチセンスや核酸アプタマー等のほか、近年はRNA干渉(RNAinterference:RNAi)を利用した治療法の開発が注目されている。
また、RNAのリボース部分を修飾した核酸として、下記式
で示されるUNA(unlocked nucleic acid:2’,3’-seco-RNA)モノマーをsiRNAに導入することにより、そのエキソヌクレアーゼ抵抗性が高まるとともに、オフ-ターゲット(off-targeting)効果を抑制し、標的遺伝子サイレンシング効果の特異性を向上しうることが報告されている(非特許文献2)。また、特許文献1には、下記式
で示されるUNAモノマーをsiRNAに導入することが提案されている。
また、非特許文献3には、リボース部分を下記式
したがって、本発明の課題は、医薬への応用に際して有用で、優れた生物学的安定性または標的遺伝子発現抑制活性の少なくとも一つを可能にする新規修飾核酸モノマー化合物、および該モノマー化合物を構成ユニットとして含むオリゴ核酸類縁体を提供することにある。
[1].下記式(I)
A2は、リン官能基、水酸基の保護基、または-C(=O)CH2CH2COOHを示し;
Bは核酸塩基を示し;
Lは、-OCH2CH2-または-CH2OCH2-を示す]
で表される化合物もしくはその塩、
[2].Bが、
下記式(II)、(III)、(IV)および(V):
R2およびR4はそれぞれ独立して水素原子、C1-6アルキル、C3-6アルケニル、C3-6アルキニル、C1-6アルキル-カルボニル、C1-6アルキルスルホニル、C6-14アリールオキシ-カルボニル、C6-14アリール-カルボニル、C6-14アリールスルホニル、または保護基を示し;
R3、R5およびR6はそれぞれ独立して、C1-6アルキル、C3-6アルケニル、C3-6アルキニル、C1-6アルキル-カルボニル、C1-6アルキルスルホニル、C6-14アリールオキシ-カルボニル、C6-14アリール-カルボニル、C6-14アリールスルホニル、または保護基を示す];
から選択される核酸塩基である、[1]に記載の化合物もしくはその塩、
[3].Lが、-OCH2CH2-である、[1]または[2]に記載の化合物またはその塩、
[4].A1が、トリチル、4-メトキシトリチル、4,4’-ジメトキシトリチル(DMTr)、4,4’,4’’-トリメトキシトリチルから選択される水酸基の保護基である、[1]から[3]のいずれか一に記載の化合物もしくはその塩、
[5].A2が、リン官能基である、[1]から[4]のいずれか一に記載の化合物もしくはその塩、
[6].A2が、-P(-OR7)-NR8R9であり、
R7はC1-6アルキルまたは2-シアノエチルを示し、
R8およびR9はそれぞれ独立してC1-6アルキルであるか、または、-NR8R9が一体となって
を形成する、
[1]から[5]のいずれか一に記載の化合物またはその塩。
[7].A2が、-C(=O)CH2CH2COOHである、[1]から[4]のいずれか一に記載の化合物またはその塩、
[8].R2、R3、R5およびR6における保護基はそれぞれ独立して、カーバメート系保護基、アシル系保護基、イミド系保護基、およびベンジル系保護基から選択され、
R4における保護基は、シリル系保護基、トリチル系保護基、複素環系保護基、ベンジル系保護基、脂肪族アシル系保護基、芳香族アシル系保護基、エーテル系保護基、カルバモイル系保護基、およびアルコキシカルボニル系保護基から選択される、[2]から[7]のいずれか一に記載の化合物またはその塩、
[9].下記式(VI)で表される、[2]に記載の化合物またはその塩。
[10].下記式(VII)で表される、[2]に記載の化合物またはその塩。
[11].下記(VIII)で表される、修飾核酸モノマー化合物由来の一価の基が、担体上のアミノ基を介して固相担体に保持されている修飾核酸モノマー担持物。
A3は、水素原子、または、トリチル、4-メトキシトリチル、4,4’-ジメトキシトリチル(DMTr)、4,4’,4’’-トリメトキシトリチルから選択される水酸基の保護基であり;
Bは核酸塩基を示し;
Lは、-OCH2CH2-または-CH2OCH2-を示す]
で表される修飾核酸モノマー担持物、
[12].Bが、下記式(II)、(III)、(IV)および(V):
R1は、水素原子またはメチルを示し;
R2およびR4はそれぞれ独立して水素原子、C1-6アルキル、C3-6アルケニル、C3-6アルキニル、C1-6アルキル-カルボニル、C1-6アルキルスルホニル、C6-14アリールオキシ-カルボニル、C6-14アリール-カルボニル、C6-14アリールスルホニル、または保護基を示し;
R3、R5およびR6はそれぞれ独立して、C1-6アルキル、C3-6アルケニル、C3-6アルキニル、C1-6アルキル-カルボニル、C1-6アルキルスルホニル、C6-14アリールオキシ-カルボニル、C6-14アリール-カルボニル、C6-14アリールスルホニル、または保護基を示す]
から選択される核酸塩基である、[11]に記載の修飾核酸モノマー担持物、
[13]. R2、R3、R5およびR6における保護基はそれぞれ独立して、カーバメート系保護基、アシル系保護基、イミド系保護基、およびベンジル系保護基から選択され、
R4における水酸基の保護基は、シリル系保護基、トリチル系保護基、複素環系保護基、ベンジル系保護基、脂肪族アシル系保護基、芳香族アシル系保護基、エーテル系保護基、カルバモイル系保護基、およびアルコキシカルボニル系保護基から選択される、[12]に記載の修飾核酸モノマー担持物、
[14].下記式(IX)で表される部分構造を1以上含有するオリゴ核酸類縁体またはその塩(ただし、該部分構造を2以上含有する場合は、該部分構造間でB3およびLはそれぞれ同一であっても異なってもよい。)
Bは核酸塩基を示し;
Lは、-OCH2CH2-または-CH2OCH2-を示す]、
[15].B3が、
下記式(II)’、(III)’、(IV)’および(V)’:
R1は、水素原子またはメチルを示し;
R2およびR4はそれぞれ独立して水素原子、C1-6アルキル、C3-6アルケニル、C3-6アルキニル、C1-6アルキル-カルボニル、C1-6アルキルスルホニル、C6-14アリールオキシ-カルボニル、C6-14アリール-カルボニル、C6-14アリールスルホニル、または保護基を示し;
R3、R5およびR6はそれぞれ独立して、水素原子、C1-6アルキル、C3-6アルケニル、C3-6アルキニル、C1-6アルキル-カルボニル、C1-6アルキルスルホニル、C6-14アリールオキシ-カルボニル、C6-14アリール-カルボニル、C6-14アリールスルホニル、または保護基を示す]、
から選択される核酸塩基である、[14]に記載のオリゴ核酸類縁体またはその塩、
[16]. R2、R3、R5およびR6における保護基はそれぞれ独立して、カーバメート系保護基、アシル系保護基、イミド系保護基、およびベンジル系保護基から選択され、
R4における水酸基の保護基は、シリル系保護基、トリチル系保護基、複素環系保護基、ベンジル系保護基、脂肪族アシル系保護基、芳香族アシル系保護基、エーテル系保護基、カルバモイル系保護基、およびアルコキシカルボニル系保護基から選択される、[15]に記載のオリゴ核酸類縁体またはその塩、
[17].B3は、下記式(X)、(XI)、(XII)および(XIII)から選択され;
から選択される置換基である[16]に記載のオリゴ核酸類縁体またはその塩、
[18].Lが、-OCH2CH2-である、[15]から[17]のいずれか一に記載のオリゴ核酸類縁体またはその塩、
[19].一鎖あたり含有する核酸塩基単位の総数が4~100である、[15]から[18]のいずれか一に記載のオリゴ核酸類縁体もしくはその塩、
[20].一鎖あたり含有する核酸塩基単位の総数が4~30である、[15]から[18]のいずれか一に記載オリゴ核酸類縁体もしくはその塩、
に関するものである。
C1-6アルキル基は、例えば、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、イソブチル、t-ブチル、n-ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、n-ヘキシル、1-メチルプロピル、1,2-ジメチルプロピル、1-エチルプロピル、1-メチル-2-エチルプロピル、1-エチル-2-メチルプロピル、1,1,2-トリメチルプロピル、1-メチルブチル、2-メチルブチル、1,1-ジメチルブチル、2,2-ジメチルブチル、2-エチルブチル、1,3-ジメチルブチル、2-メチルペンチル、3-メチルペンチルを示す。一つの態様としては、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピルである。
C2-6アルキニル基は、例えば、エチニル、1-プロピニル、2-プロピニル、ブチニル、ペンチニル、ヘキシニルを示す。C3-6アルキニル基は、C2-6アルキニル基からエチニルを除いた基である。
C1-6アルコキシ基は、例えば、メトキシ、エトキシ、n-プロポキシ、イソプロポキシ、n-ブトキシ、イソブトキシ、sec-ブトキシ、t-ブトキシ、n-ペントキシ、イソペントキシ、sec-ペントキシ、t-ペントキシ、n-ヘキソキシ、イソヘキソキシ、1,2-ジメチルプロポキシ、2-エチルプロポキシ、1-メチル-2-エチルプロポキシ、1-エチル-2-メチルプロポキシ、1,1,2-トリメチルプロポキシ、1-ジメチルブトキシ、2,2-ジメチルブトキシ、2-エチルブトキシ、1,3-ジメチルブトキシ、2-メチルペントキシ、3-メチルペントキシ、ヘキシルオキシを示す。一つの態様としては、メトキシである。
C1-6アルキルスルホニル基は、例えば、メチルスルホニル、エチルスルホニル、n-プロピルスルホニル、イソプロピルスルホニル、n-ブチルスルホニル、イソブチルスルホニル、t-ブチルスルホニル、n-ペンチルスルホニル、イソペンチルスルホニル、ネオペンチルスルホニル、n-ヘキシルスルホニル、1-メチルプロピルスルホニルを示す。
C6-14アリールオキシ-カルボニル基は、例えば、フェニルオキシカルボニル、ナフチルオキシカルボニルを示す。
C6-14アリール-カルボニル基は、例えば、ベンゾイル、ナフトイルを示す。一つの態様としては、ベンゾイルである。
C6-14アリールスルホニル基は、例えば、ベンゼンスルホニル、ナフチルスルホニルを示す。
ジC1-6アルキルアミノ基は、例えば、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、ジn-プロピルアミノ、ジイソプロピルアミノ、ジn-ブチルアミノ、ジイソブチルアミノ、ジt-ブチルアミノ、ジn-ペンチルアミノ、ジイソペンチルアミノ、ジネオペンチルアミノを示す。
「ヌクレオチド」は、モノマー単位としての、または核酸中の、ヌクレオシドのリン酸エステルを意味する。
「ヌクレオチド類縁体」は、ペントース糖および/またはヌクレオチド塩基および/またはヌクレオシドの1個もしくは複数のリン酸エステルが、そのそれぞれの類縁体で任意に置換された化合物を指す。
「オリゴ核酸」または「オリゴヌクレオチド」は、一般に一分子内に少数の核酸塩基を有する核酸分子またはその類縁体を指す。一方、多数の核酸塩基を有する核酸分子またはその類縁体についてはポリ核酸またはポリヌクレオチドと称するが、これらとオリゴ核酸またはオリゴヌクレオチドとの重合数の境界は明確には定まっていない。本明細書中においてオリゴ核酸またはオリゴヌクレオチドは、一分子内に4~100(さらには4~50)の核酸塩基を有する核酸分子またはその類縁体を指す。オリゴ核酸またはオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体であるモノマーユニット(ヌクレオチドサブユニット)の直線状オリゴマーである。
オリゴ核酸またはオリゴヌクレオチドに関する「類縁体」は、たとえば、修飾もしくは置換された糖部分、修飾もしくは置換された塩基部分、または修飾もしくは置換された糖結合部分から選択される少なくとも一つの改変部分またはこれらの組合せを有し得る。
以下、本発明の修飾核酸モノマー化合物およびそれを少なくとも構成ユニットの一として含むオリゴ核酸類縁体について詳細に説明する。
本発明の修飾核酸モノマー化合物は、下記式(I)
ここで、式(I)において、プロパン骨格炭素原子の番号はIUPACの命名法では、A1、A2の種類により変動しうるが、本発明の説明上、下記式のとおりの番号を用いるものとする。
Bの一つの態様としては、下記式(II)、(III)、(IV)および(V)から選択される核酸塩基である。
R2およびR4はそれぞれ独立して水素原子、C1-6アルキル、C3-6アルケニル、C3-6アルキニル、C1-6アルキル-カルボニル、C1-6アルキルスルホニル、C6-14アリールオキシ-カルボニル、C6-14アリール-カルボニル、C6-14アリールスルホニル、または保護基を示し;
R3、R5およびR6はそれぞれ独立して、C1-6アルキル、C3-6アルケニル、C3-6アルキニル、C1-6アルキル-カルボニル、C1-6アルキルチオ、C1-6アルキルスルホニル、C6-14アリールオキシ-カルボニル、C6-14アリール-カルボニル、C6-14アリールスルホニル、または保護基を示す。
R2、R3、R4、R5およびR6はそれぞれ同一であっても異なっていてもよい。
水酸基の保護基としては、特に制限されず、例えば、核酸の水酸基の保護基として通常使用されているものであればいずれの保護基も使用し得る。このような保護基としては、例えば、トリメチルシリル(TMS)、トリイソプロピルシリル、t-ブチルジメチルシリル(TBS)、(トリフェニルメチル)ジメチルシリル、t-ブチルジフェニルシリル(TBDPS)、トリベンジルシリル、トリフェニルシリルなどのシリル系保護基;トリチル、4-モノメトキシトリチル(MMTr)、4,4’-ジメトキシトリチル(DMTr)、4,4’,4’’-トリメトキシトリチルなどのトリチル系保護基;テトラヒドロピラニル、3-ブロモテトラヒドロピラニル、テトラヒドロチオピラニル、4-メトキシテトラヒドロピラニル、4-メトキシテトラヒドロチオピラニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチオフラニルなどの複素環系保護基;ベンジル、4-メトキシベンジル、2-ニトロベンジル、4-ニトロベンジル、4-シアノベンジルなどのベンジル系保護基;アセチル、クロロアセチル、トリクロロアセチル、トリフルオロアセチル、ブチリル、プロピオニル、ピバロイル、レブリニル、ペンタノイル、バレリルなど脂肪族アシル系保護基;ベンゾイル、2,6-ジクロロベンゾイル、2-トルオイル、4-メトキシベンゾイル、2,4,6-トリメチルベンゾイルなどの芳香族アシル系保護基;t-ブトキシメチル、メトキシメチル、1-エトキシエチル、1-(2-クロロエトキシ)エチル、2-トリメチルシリルエトキシエチル(SEM)、2-(シアノエトキシ)エチル(CEE)、2-ナフチルメトキシメチル(NAPOM)、ジフェニルメチル、などのエーテル系保護基;ジメチルカルバモイル、ジフェニルカルバモイルなどのカルバモイル系保護基;メシル、トシル、トリフルオロメタンスルホニルなどのスルホニル系保護基;9-フルオレニルメトキシカルボニルなどのアルコキシカルボニル系保護基が挙げられる。
Y1のリン酸の保護基としては、例えば、2-シアノエチル、2-(フェニルスルホニル)エチル、2,2,2-トリクロロエチル(TCE)、2,2,2-トリブロモエチルなどのβ脱離により除去できる保護基;2-トリメチルシリルエチル(TMSE)、2-(ジフェニルメチルシリル)エチル(DPSE)などのフッ化物イオンで除去できる保護基;4-[N-メチル-N-(トリフルオロアセチル)アミノ]ブチル(TFAB)、2-[(1-ナフチル)カルバモイルオキシ]エチル(NCE)、4-オキソペンチルなどの環化反応により除去できる保護基;メチルなどのアルキル(例えばC1-6アルキル)、2,4-ジニトロベンジルなどの炭素原子上での求核置換反応により除去できる保護基;ベンジルなどの加水素化分解により除去できる保護基;アリルなどのパラジウム触媒による置換反応で除去できる保護基が挙げられる。これらの中でも、メチルなどのC1-6アルキル、2-シアノエチル、2-トリメチルシリルエチルなどがホスホロアミダイト法で汎用されている。Y1の一つの態様としては、脱離条件に優れる点で、2-シアノエチルである。また、Y1の他の一つの態様としては、脱離性の点で、メチルである。
式(i)の-NZ1Z2としては、例えば、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、ジn-プロピルアミノ、ジイソプロピルアミノ(-N(i-Pr)2)、ジn-ブチルアミノ、ジイソブチルアミノ、ジt-ブチルアミノ、ジn-ペンチルアミノ、ジイソペンチルアミノ、ジネオペンチルアミノなどを挙げることができる。Z1およびZ2が一緒になってそれらが結合する窒素原子と共に形成する更に複素原子を含んでいてもよい5ないし7員含窒素複素環としては、例えば、モルホリン-1-イル、ピペリジン-1-イルなどを挙げることができる。ここで、複素原子としては、窒素原子、酸素原子、硫黄原子などが挙げられる。これらの中でも、ジイソプロピルアミノ、ジメチルアミノなどがホスホロアミダイト法で汎用されている。-NZ1Z2の一つの態様としては、ジイソプロピルアミノである。また、-NZ1Z2の他の一つの態様としては、ジメチルアミノである。
式(ii)におけるY1およびY2としてのリン酸の保護基としては、式(i)のY1として前記したリン酸の保護基と同様に挙げることができる。
式(iii)におけるZ+のカチオンとしては、例えば、メチルアンモニウムイオン、エチルアンモニウムイオン、イソブチルアンモニウムイオンなどのモノC1-6アルキルアンモニウムイオン;ジメチルアンモニウムイオン、ジエチルアンモニウムイオン、ジイソブチルアンモニウムイオンなどのジC1-6アルキルアンモニウムイオン;カリウムイオン、リチウムイオンなどの金属イオンを挙げることができる。
ここで、R7はC1-6アルキルまたは2-シアノエチルを示す。好ましくは、選択的な脱離条件の点で、メチル、2-シアノエチルであり、より好ましくは2-シアノエチルである。
R8およびR9はそれぞれ独立して、C1-6アルキルであるか、または-NR8R9が一体となって
を形成する。
例えば、R8およびR9は独立して、C1-3アルキルであるか、または-NR8R9が一体としてモルホリン-1-イルもしくはピペリジン-1-イルから選択される基を形成する。
A2の他の一つの態様としては、-P(OCH2CH2CN)N(i-Pr)2である。
以下に、本発明の式(I)の修飾核酸モノマー化合物の製造方法について説明する。
以下の反応における、原料または製造中間体は、それぞれ塩であってもよい。そのような塩としては、本発明の式(I)の修飾核酸モノマー化合物の塩として例示したものが挙げられる。
以下の反応において、最終工程を除き、生成物は反応液のまま、または粗生成物として次反応に用いてもよい。あるいは、公知の分離手段(例えば、再結晶、蒸留、クロマトグラフィー)を用いて、反応混合物から単離して、次反応に用いてもよい。最終工程の生成物の単離および精製は、同様に公知の分離手段を用いて、さらに必要に応じてこれら手段を種々組み合わせることにより、行うことができる。
式(I)の化合物(以下、化合物(I)と言うこともある)において、Lが-OCH2CH2-の場合は、例えば、以下の反応スキーム1に示す工程により製造することできる。
工程1において、式(a)で表される、PG1およびPG2で表される1位および3位を保護したグリセロール化合物(以下、化合物(a)という)の2位水酸基をヒドロキシエチル化し、式(b)で表される2-ヒドロキシエチルエーテル化合物(以下、化合物(b)という)を製造する。
化合物(a)は、例えばグリセロールの2つの1級水酸基を同時にまたは別々に保護基で保護することにより得ることができる。PG1とPG2は同一または異なってもよい水酸基の保護基であり、先述のGreeneらの文献を参照して選択することができる。ここで、PG1とPG2が異なる置換基の場合には、例えば光学分割やキラルカラムなどの公知の手段によって、所望の2位炭素原子の立体配置を有する異性体を得ることもできる。
また、公知の光学活性1位または3位-O-モノ置換グリセロール誘導体から、それぞれ他方の3位または1位の1級水酸基を保護基で保護することにより化合物(a)を光学活性体として得ることもできる。
さらに、本明細書中の実施例などに記載の方法、すなわち公知の光学活性1、2位または2、3位-O-ジ置換グリセロール誘導体から、それぞれ3位または1位の1級水酸基を順に保護基で保護した後、2位水酸基の保護基を除去し、必要な場合、例えば脱保護の際にそれぞれ1位または3位の保護基が併せて除去される場合にはそれぞれ1位または3位を再保護することにより、化合物(a)を光学活性体として得ることもできる。
具体的には、まず、化合物(a)の2位水酸基のアリル化を行う。アリル化工程は、化合物(a)、アリル化試薬、塩基を溶媒中で攪拌することにより実施できる。アリル化試薬としては、例えばアリルブロミド、メタンスルホン酸アリル、p-トルエンスルホン酸アリルなどを用いることができる。塩基としては、例えばトリエチルアミンなどの3級アミン、水素化ナトリウムなどを用いることができる。溶媒としては、化合物(a)または使用されるアルキル化試薬に対して非反応性であり、用いられる反応条件下でそれ自体が非反応性である溶媒(非反応性溶媒)を用いる。そのような非反応性溶媒の例としては、限定されないが、例えば、テトラヒドロフラン、N,N-ジメチルホルムアミド、1,4-ジオキサン、tert-ブチルメチルエーテル、アセトニトリル、ベンゼン、トルエンまたはそれらの混合物などである。反応の温度は、用いる試薬、溶媒に応じて調整することができるが、好ましくは、-80℃~80℃、より好ましくは室温~50℃の範囲となる。
炭素-炭素2重結合の酸化開裂には、四酸化オスミウムおよび過ヨウ素酸塩、四酸化オスミウムおよび四酢酸鉛、四酸化ルテニウムおよび過ヨウ素酸塩などの触媒を用いることができる。反応後の触媒を再酸化するために、触媒とともにN-メチルモルホリン N-オキシド(NMO)などの再酸化剤を用いてもよい。
溶媒としては、用いられる反応条件下でそれ自体が非反応性である溶媒(非反応性溶媒)を用いる。そのような非反応性溶媒の例としては、限定されないが、例えば、テトラヒドロフラン、1,4-ジオキサン、アセトニトリル、四塩化炭素もしくはそれらの混合物、またはそれらとtert-ブタノールおよび水との混合物などである。反応の温度は、用いる試薬、溶媒に応じて調整することができるが、好ましくは、-30℃~80℃、より好ましくは-10℃~50℃の範囲となる。
還元処理は生じたO-置換グルタルアルデヒドから化合物(b)を製造する工程で、水素化ホウ素ナトリウム(NaBH4)、ジボラン(B2H6)、水素化ジイソブチルアルミニウム(DIBAL-H)、シアノ水素化ホウ素ナトリウム(NaBH3CN)、水素化トリエチルホウ素リチウム(LiBH(C2H5)3)などの金属水素化物もしくはその他の水素化物またはそれらの錯化合物を還元剤として用いる方法により実施することができる。これらの方法は、例えば、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、ジクロロメタン、クロロホルム、1,4-ジオキサン、アセトニトリル、トルエンなどの反応を阻害しない有機溶媒中、または前記還元剤によってはこれら有機溶媒と水との混合溶媒中で、還元剤の存在下、0℃~40℃で5分間から24時間攪拌することにより実施できる。
工程2では、化合物(b)で形成された水酸基を式Bで表される核酸塩基に変換した式(c)で表される2-ヘテロアリールエチルエーテル化合物(以下、化合物(c)という)を製造する。
工程2は、例えば、化合物(b)の2位に導入された2-ヒドロキシエチル基の水酸基を脱離基、例えば、ハロゲン、アルキルスルホン酸エステル、アリールスルホン酸エステルなどに変換し、塩基、例えば水素化ナトリウムの存在下、式BH[式中、Bは前記の定義と同じである。]で表される複素環化合物と反応させることにより実施することができる。
工程2を本明細書中の実施例などに記載の方法により実施する場合、溶媒としては、用いられる反応条件下でそれ自体が非反応性である溶媒(非反応性溶媒)を用いる。そのような非反応性溶媒の例としては、限定されないが、例えば、テトラヒドロフラン、1,4-ジオキサン、トルエン、四塩化炭素もしくはそれらの混合物などである。反応の温度は、用いる試薬、溶媒に応じて調整することができるが、好ましくは、0℃~100℃、より好ましくは10℃~80℃の範囲となる。反応雰囲気は特に制限されないが、窒素雰囲気またはアルゴン雰囲気下などの不活性雰囲気下で行うことが好ましい。
工程3では、化合物(c)の3位水酸基を保護するPG2の脱保護を行い、式(d)で表される化合物(以下、化合物(d)という)を製造する。保護基を除去する反応条件は保護基PG2の種類により異なり、先述のGreeneらの文献を参照して選択することができる。
一例をあげると、例えば、PG2がTBDMSなどのシリル系保護基の場合にはフッ化物の塩またはフッ化水素の付加体により脱保護することができる。例えば、溶媒中でフッ化テトラ-n-ブチルアンモニウム(TBAF)を作用させる手法が挙げられる。溶媒としては、用いられる反応条件下でそれ自体が非反応性である溶媒(非反応性溶媒)を用いる。そのような非反応性溶媒の例としては、限定されないが、例えば、テトラヒドロフラン、1,4-ジオキサン、アセトニトリル、トルエン、塩化メチレンまたはそれらの混合物などである。
工程4では、化合物(d)の3位水酸基をリン官能基または-C(=O)CH2CH2COOHであるP2へ変換し、式(e)で表される化合物(以下、化合物(e)という)を製造する。
P2がリン官能基である場合、リン官能基としては、式(I)の修飾核酸モノマー化合物を用いて、式(VII)のオリゴ核酸類縁体を、核酸合成法として知られているトリエステル法、ホスホロアミダイト法、ジクロロホスフィン誘導体を用いる方法、H-ホスホネート法などにより製造する際のリン酸反応性基であるリン官能基を挙げることができる。
工程4においてリン酸反応性基を本明細書中の実施例などに記載のホスホロアミダイトに変換する場合について詳細に説明する。
リン官能基への変換反応は、P2のリン官能基として、前記した式(i)のリン官能基へ変換するには、例えば、対応する下記式(i’)、
で表わされるリン酸化試薬と、化合物(d)とを反応させることにより製造することができる。これらの反応は、例えば、テトラヒドロフラン、N,N-ジメチルホルムアミド、クロロホルム、1,4-ジオキサン、アセトニトリル、トルエン、塩化メチレンなどの反応を阻害しない溶媒に溶解し、必要に応じて、例えば、トリエチルアミン、トリブチルアミン、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(DIPEA)、コリジン、2,6-ルチジン等の存在下、室温で5分間から24時間攪拌することにより実施することができる。
P2が-C(=O)CH2CH2COOHである場合、工程4は化合物(d)の3位水酸基をコハク酸のモノエステル化合物(e)とする工程である。例えば、化合物(d)を、塩基の存在下、無水コハク酸と反応させることにより製造することができる。また、化合物(d)とコハク酸の一方のカルボン酸を保護した誘導体、例えばコハク酸モノエステルとを、活性化剤または縮合剤、例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド、1-[3―(ジメチルアミノ)プロピル]-3-エチルカルボジイミド、N,N’-カルボニルジイミダゾール、トリフェニルホスフィン-アゾジカルボン酸ジエチルなどの存在下で縮合した後、保護基を除去して製造することができる。コハク酸上の保護基を除去する反応条件は保護基の種類により異なり、先述のGreeneらの文献を参照して選択することができる。
化合物(e)は同位元素(例、3H、11C、14C、18F、35S、125I等)等で標識されていてもよく、このような同位元素等で標識された化合物も化合物(e)に包含される。
さらに、化合物(e)において、1Hは2H(D)に変換されていてもよく、このような変換をされた重水素変換体も化合物(e)に包含される。
また、化合物(e)は、溶媒和物(例えば、水和物など)であっても、無溶媒和物であってもよく、いずれも化合物(e)に包含される。
化合物(I)において、Lが-CH2OCH2-の場合は、例えば、以下の反応スキーム2に示す工程により製造することができる。
工程1においては、式(f)で表される、1つの水酸基がPG3で表される保護基で保護された2-(保護)ヒドロキシメチル-1,3-プロパンジオール(以下、化合物(f)という)の非保護の2つの水酸基をメチレン基を介して脱水閉環させ、式(g)で表される1,3-ジオキサン化合物(以下、化合物(g)という)を製造する。
化合物(f)は、例えば2-ヒドロキシメチル-1,3-プロパンジオールの3つの1級水酸基のうち1つを保護基PG3で保護することにより得ることができる。PG3は、先述のGreeneらの文献を参照して選択することができる。
工程1aにおいては、2-ヒドロキシメチル-1,3-プロパンジオール(以下、化合物(q)という)の2つの水酸基をメチレン基を介して脱水閉環させ、式(r)で表される1,3-ジオキサン化合物(以下、化合物(r)という)を製造する。例えば、化合物(q)とホルムアルデヒド誘導体(例えば、パラホルムアルデヒド、トリオキサン、ホルムアルデヒドジアルキルアセタールなど)とを酸の存在下反応させることにより実施することができる。酸としては、塩酸、硫酸などの無機酸、p-トルエンスルホン酸、カンファースルホン酸などの有機酸、塩化スズ(II)、塩化亜鉛などのルイス酸を用いることができる。反応選択性を向上させるために臭化リチウムを用いることもできる。溶媒としては、用いられる反応条件下でそれ自体が非反応性である溶媒(非反応性溶媒)を用いる。そのような非反応性溶媒の例としては、限定されないが、例えば、テトラヒドロフラン、1,4-ジオキサン、アセトニトリル、トルエン、塩化メチレンまたはそれらの混合物などである。
工程2においては、化合物(g)と核酸塩基またはその誘導体とを酸の存在下反応させることにより式(h)で表される化合物(以下、化合物(h)という)を製造する。酸としては、塩酸、硫酸などの無機酸、p-トルエンスルホン酸、カンファースルホン酸などの有機酸、塩化スズ(II)、塩化亜鉛、トリフルオロメタンスルホン酸トリアルキルシリル、tert-ブチルジフェニルシリルトリフラートなどのルイス酸を用いることができる。核酸塩基は、そのまま用いることもできるが、化合物(h)と反応させる前にあらかじめシリル化剤とトリアルキルシリル化反応を行うか、かかるシリル化剤の共存下で化合物(h)と反応させることもできる。シリル化剤としては、クロロトリメチルシラン、N,O-ビス(トリメチルシリル)アセトアミドなどを用いることができる。溶媒としては、用いられる反応条件下で、それ自体が非反応性である溶媒(非反応性溶媒)を用いる。そのような非反応性溶媒の例としては、限定されないが、例えば、テトラヒドロフラン、1,4-ジオキサン、アセトニトリル、トルエン、1,2-ジクロロエタンまたはそれらの混合物などである。
工程3では、化合物(h)の1位水酸基を保護基PG1で保護した、式(i)で表される化合物(以下、化合物(i)という)を製造する。水酸基を保護する反応条件は保護基PG1の種類により異なり、先述のGreeneらの文献を参照して選択することができる。
工程4では、化合物(i)の3位水酸基を保護するPG3の脱保護を行い、式(j)で表される化合物(以下、化合物(j)という)を製造する。保護基を除去する反応条件は保護基PG3の種類により異なり、先述のGreeneらの文献を参照して選択することができる。
工程5では、化合物(j)の3位水酸基をリン官能基または-C(=O)CH2CH2COOHであるP2へ変換し、式(k)で表される化合物(以下、化合物(k)という)を製造する。
本工程は出発物質を化合物(j)として、スキーム1の工程4と同様にして行うことができる。
工程1においては、式(l)で表される、1位および3位水酸基をそれぞれPG4およびPG3で表される保護基で保護した2-ヒドロキシメチル-1,3-プロパンジオール(以下、化合物(l)という)の残る水酸基の水素原子を、L1で置換されたメチルで置換し、式(m)で表される化合物(以下、化合物(m)という)を製造する。
PG3とPG4は同一または異なってもよい水酸基の保護基であり、先述のGreeneらの文献を参照して選択することができる。
L1はアルコキシ(例えばメトキシ、エトキシ)、アシルオキシ(例えばアセトキシ)または脱離基である。脱離基としては、特に限定されず、例えば、ハロゲン原子、トシル基などが挙げられる。
出発物質となる化合物(l)は、例えば2-ヒドロキシメチル-1,3-プロパンジオールの3つの1級水酸基のうち2つを同時にまたは別々に保護基で保護することにより得ることができる。ここで、PG3とPG4が異なる置換基の場合には、例えば光学分割やキラルカラムなどの自体公知の手段によって、所望の2位炭素原子の立体配置を有する異性体を得ることもできる。
また、例えば、酵素による不斉加水分解を用いて2-ヒドロキシメチル-1,3-プロパンジオールの3つの1級水酸基のうち2つを異なる保護基で保護した光学活性な化合物(l’)を得ることもできる。(Liebigs Ann. Chem. 1990, 379 - 388,Org. Process Res. Dev. 2012, 16, 1527-1537)化合物(l’)は、以降の工程の反応条件により、光学活性な化合物(l)としてそのまま使用可能な場合もあり、また、公知の保護・脱保護手段を用いて所望の保護基に変換した光学活性な化合物(l)を得ることもできる。
工程1に用いる溶媒としては、化合物(l)、ホルムアルデヒド誘導体および使用される酸に対して非反応性であり、用いられる反応条件下でそれ自体が非反応性である溶媒(非反応性溶媒)を用いる。そのような非反応性溶媒の例としては、限定されないが、例えば、ベンゼン、トルエン、1,4-ジオキサン、ジクロロメタンなどである。反応の温度は、用いる試薬、溶媒に応じて調整することができるが、好ましくは、-30℃~50℃、より好ましくは-10℃~30℃の範囲となる。
また、工程1は、化合物(l)とMOMClを、トリアルキルアミンとヨウ化ナトリウム存在下反応させることにより実施することができ、L1がメトキシ基である化合物(m)を得ることができる。溶媒としては、用いられる反応条件下でそれ自体が非反応性である溶媒(非反応性溶媒)を用いる。そのような非反応性溶媒の例としては、限定されないが、例えば、テトラヒドロフラン、1,4-ジオキサン、1,2-ジメトキシエタンまたはそれらの混合物などである。反応の温度は、用いる試薬、溶媒に応じて調整することができるが、好ましくは、0℃~還流温度、より好ましくは室温~100℃の範囲となる。
工程2は、化合物(m)と核酸塩基BHとを反応させ、式(n)で表される化合物(以下、化合物(n)という)を製造する。化合物(m)においてL1が脱離基である場合、化合物(m)と核酸塩基BHとを塩基の存在下反応させ、化合物(n)を製造する。塩基としては、炭酸ナトリウムなどの無機塩基、トリエチルアミンなどの有機塩基を用いることができる。
工程2に用いる溶媒としては、化合物(m)、および使用される塩基に対して非反応性であり、用いられる反応条件下でそれ自体が非反応性である溶媒(非反応性溶媒)を用いる。そのような非反応性溶媒の例としては、限定されないが、例えば、例えば、テトラヒドロフラン、N,N-ジメチルホルムアミド、アセトン、クロロホルム、1,4-ジオキサン、ベンゼン、トルエン、ジクロロメタンなどである。反応の温度は、用いる試薬、溶媒に応じて調整することができるが、好ましくは、-30℃~80℃、より好ましくは-10℃~50℃の範囲となる。
また、工程2は、化合物(m)においてL1がメトキシ基である場合には、先述の化合物(h)を合成する場合、すなわちスキーム2の工程2と同じ方法により実施することが出来る。
工程3では、化合物(n)の1位水酸基PG4を脱保護し、式(o)で表される1位アルコール体(以下化合物(o)という)を製造する。保護基を除去する反応条件は保護基PG4の種類により異なり、先述のGreeneらの文献を参照して選択することができる。
工程4では、化合物(o)の1位水酸基を保護基PG1で保護した、式(p)で表される化合物(以下、化合物(p)という)を製造する。水酸基を保護する反応条件は保護基PG1の種類により異なり、先述のGreeneらの文献を参照して選択することができる。
本発明の一形態は、式(I)で表される修飾核酸モノマー化合物由来の一価の基が、担体上のアミノ基を介して固相担体に保持されている修飾核酸モノマー担持物を提供する。
式(VIII)中、A3は、水素原子または水酸基の保護基である。A3は、水素原子であってよいことを除き、上述したA1の定義と同一であり、A1について上述した具体的態様を同様に適用することができる。一つの態様では、A3は、トリチル、4-メトキシトリチル、4,4’-ジメトキシトリチル(DMTr)、4,4’,4’’-トリメトキシトリチルから選択される水酸基の保護基である。
具体的には、化合物(e)または化合物(k)を、溶媒中、縮合剤及び塩基の存在下、アミノ基を官能基として有する固相担体と反応させることにより、修飾核酸モノマー化合物(上記式(VIII)においてA3が水酸基の保護基(PG1)である化合物)由来の一価の基が担体に固定された担持物を得る。この担持物は、核酸オリゴマー原料としてそのまま核酸自動合成機に導入することができる。
また、PG1を脱保護反応に付することにより、上記式(VIII)においてA3が水素原子である化合物が担体に固定された担持物を得ることもできる。
本発明の一形態は、該モノマー化合物を構成ユニットの少なくとも一つとして含むオリゴ核酸類縁体を提供する。
式(IX)中、Lは、前記定義と同じである。
B3の一つの態様としては、下記式(II)’、(III)’、(IV)’および(V)’から選択される核酸塩基である。
式(II)’~(V)’中、R2およびR4はそれぞれ独立して、水素原子、C1-6アルキル、C1-6アルコキシ、C3-6アルケニル、C3-6アルキニル、C1-6アルキル-カルボニル、C1-6アルキルスルホニル、C6-14アリールオキシ-カルボニル、C6-14アリール-カルボニル、C6-14アリールスルホニル、または保護基を示す。
式(II)’~(V)’中、R3、R5およびR6はそれぞれ独立して水素原子、C1-6アルキル、C3-6アルケニル、C3-6アルキニル、C1-6アルキル-カルボニル、C1-6アルキルスルホニル、C6-14アリールオキシ-カルボニル、C6-14アリール-カルボニル、C6-14アリールスルホニル、または保護基を示す。
上記B3は、R3、R5およびR6がそれぞれ独立して水素原子であってよいことを除き、上述したBの定義と同一である。Bについて上述した具体的態様、さらには当該具体的態様においてR3、R5およびR6が水素原子へと置換された態様を同様に適用することができる。R3、R5およびR6が水素原子へと置換された部分構造を有するオリゴ核酸類縁体は、例えば、後述する固相法において、モノマー化合物を順次組み込んだオリゴマーを形成後、固相担体からの切り出しの前または後に、公知の脱保護手段を用いて保護基を除去することにより得られる。
式(IX)の部分構造以外のヌクレオシドサブユニットとしては、リボヌクレオシド、デオキシリボヌクレオシドのいずれでもよい。なお、本明細書において、「ヌクレオシドサブユニット」との語は、式(IX)の部分構造を有する構成ユニットを包含する。
サブユニットがリボヌクレオシドの場合にはリボース部分は公知の誘導体、例えば2’-O-メチルリボース、2’-フルオロリボースなどであってもよい。
ヌクレオシドサブユニットの塩基部分は、アデニン、グアニン、シトシン、ウラシル、チミンのいずれでもよく、また、それらの修飾体であってよい。塩基部分の修飾体としては、例えば、塩基部分が、ハロゲン原子、C1-6アルキル基、C1-6アルコキシ基、C2-6アルケニル基、C2-6アルキニル基、C1-6アルキル-カルボニル基、C1-6アルキルチオ基、C1-6アルキルスルホニル基、C6-14アリールオキシ-カルボニル基、C6-14アリール-カルボニル基、C6-14アリールスルホニル基、アミノ基、モノC1-6アルキルアミノ基、ジC1-6アルキルアミノ基、ニトロ基、水酸基、シアノ基、カルボキシ基などで置換された当業者に公知の修飾体などが挙げられる。
例えば、オリゴ核酸類縁体がDNAである場合には、一つの態様としては、一鎖あたり4から100個であり、他の一つの態様としては一鎖あたり4から30個である。
また、RNAである場合には、一つの態様としては、一鎖あたり4から50個であり、他の一つの態様としては一鎖あたり4から30個である。サブユニットとして式(IX)の部分構造は、一つの態様としてはオリゴ核酸類縁体中の核酸サブユニット総数に対して1%から100%の範囲に相当する整数個、他の一つの態様としてはサブユニット総数に対して2%から80%の範囲に相当する整数個、さらに他の一つの態様としては、2%から50%の範囲に相当する整数個、また別の一つの態様としては、2%から25%に相当する整数個、含有される。一つの態様としては、一鎖あたり4から30個(より好ましくは4から25個、さらに好ましくは4から21個)のサブユニット総数に対して、1~10個(より好ましくは1~8個、さらに好ましくは1~4個)の式(IX)の部分構造を含有する。また、そのオリゴ核酸類縁体中での含有位置は、いずれでもよく、使用目的に応じて、任意に決めることができる。
で表わされるオリゴ核酸類縁体において、その任意の位置における1つ以上の構造ユニットに代わって、下記式(IX)
で表される部分構造を含む構造(すなわち、下記式(XVII)および(XVIII)から選ばれる部分構造)を1つ以上含有するオリゴ核酸類縁体である。
aは、一つの態様としては3から49、他の一つの態様としては、3から29の整数である。
したがって、本発明のオリゴ核酸類縁体は、これらの使用用途に応じて、一本鎖オリゴヌクレオチド、二本鎖オリゴヌクレオチド等であってもよく、一本鎖DNA、二本鎖DNA、一本鎖RNA、二本鎖RNA、DNA/RNAキメラ体、DNA/RNAハイブリッド体であってもよい。
本発明のオリゴ核酸類縁体を、例えば、siRNAとして使用する場合には、標的遺伝子のセンス鎖およびアンチセンス鎖あるいはそれらの改変体からなる二本鎖RNAが好ましく、本発明の式(I)の部分構造は、センス鎖またはアンチセンス鎖あるいはそれらの改変体のいずれか一方に、または両者に含有させることができる。ここで改変体とは、前記したヌクレオシドの塩基部分の修飾体、糖部分の修飾体、天然体以外の各種ホスホジエステル結合を含むものが挙げられる。siRNAは、そのセンス鎖とアンチセンス鎖とが、両3’末端の2から5程度のリボヌクレオチド若しくはデオキシリボヌクレオチドあるいは公知の修飾ヌクレオチドからなるダングリングエンドを持つようにハイブリダイズして二本鎖を形成しているものであってもよい。
本発明のオリゴ核酸類縁体は、式(VI)または式(VII)の修飾核酸モノマー化合物を用いて、核酸合成法として公知のトリエステル法、ホスホロアミダイト法、ジクロロホスフィン誘導体を用いる方法、H-ホスホネート法などにより固相法または液相法で製造することができる。また、これらの製造は核酸自動合成機器によって行うこともできる。(N. Usman et al., J.Am.Chem.Soc., 109(25), 7845-7854 (1987)、Tetrahedron Lett.,25(7),713-716(1984))
Bz:ベンゾイル
CPG:Controlled pore glass
DIPEA:N,N-ジイソプロピルエチルアミン
DIAD:アゾジカルボン酸 ジイソプロピル
DMAP:4-(ジメチルアミノ)ピリジン
DMF:N,N-ジメチルホルムアミド
DMTr:4,4’-ジメトキシトリチル
DSPC:1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン
EDC:1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩
Et:エチル
HBTU:O-(ベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N’,N’-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート
LCAA:Long chain alkylamine
n-:ノルマル
NMO:N-メチルモルホリン N-オキシド
NaBH4:水素化ホウ素ナトリウム
Ph:フェニル
Pr:プロピル
iPr:イソプロピル
tert-:ターシャリー
TBAF:テトラn-ブチルアンモニウム フルオリド
TEA:トリエチルアミン
TFA:トリフルオロ酢酸
THF:テトラヒドロフラン
TBDPS:tert-ブチルジフェニルシリル
1H-NMR:プロトン核磁気共鳴スペクトルメトリー
1H-NMRは、Varian/Agilent Mercury 400MHz system(400MHz)を使用して測定した。
クロマトグラフィーに関しては、YAMAZEN社製パラレルプレップ{カラム:YAMAZEN社製 Hi-FlashTM Column(Silicagel)、サイズ;S(16×60mm)、M(20×75mm)、L(26×100mm)、2L(26×150mm)}あるいはメルク社製シリカゲル(Silicagel60,70-230 mesh)、富士シリシア製シリカゲル(BW-Silicagel,200-400 mesh)を用いた。
超臨界流体クロマトグラフィー(SFC)による分取はWaters社製Prep100qを用いて行った。
siRNA合成のために用いる固相担体の合成においては、ChemGenes社製のAmino LCAA CPGサポート 1000Å(ローディング量:103μmol/g)を用いた。
本明細書中の化合物名の標記において、(±)-および(RS)-はラセミ体を、(+)-、(-)-、(R)-および(S)-はそれぞれエナンチオマーの(+)型、(-)型、(R)-体および(S)-体であることを示す。また、立体配置中の「*」は、相対配置を表し、特に記載がない場合にはいずれか1のエナンチオマーを示す。
(R)-2-[2-(3-ベンゾイル-5-メチル-2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロピリミジン-1(2H)-イル)エトキシ]-3-[ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ]プロピル(2-シアノエチル)ジイソプロピルホスホロアミダイトの合成
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm):1.05(s,9H),1.36(s,3H),1.39(s,3H),3.65(dd,J=6.4,10.4Hz,1H),3.73(dd,J=4.5,10.4Hz,1H),3.91(dd,J=6.1,8.2Hz,1H),4.07(dd,J=6.4,8.2Hz,1H),4.21(dddd,J=4.5,6.1,6.4,6.4Hz,1H),7.33-7.48(m,6H),7.62-7.71(m,4H).
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm):1.07(s,9H),1.99(dd,J=5.3,7.0Hz,1H),2.59(d,J=5.3Hz,1H),3.57-3.90(m,5H),7.35-7.49(m,6H),7.62-7.70(m,4H).
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm):0.99(s,9H),2.44(d,J=5.5Hz,1H),3.13-3.33(m,2H),3.70-3.81(m,2H),3.78(s,6H),3.83-3.93(m,1H),6.74-6.85(m,4H),7.09-7.49(m,15H),7.56-7.67(m,4H).
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm):0.96(s,9H),3.15-3.28(m,2H),3.59-3.67(m,1H),3.69-3.77(m,2H),3.77(s,6H),4.06-4.18(m,2H),5.10-5.18(m,1H),5.22-5.31(m,1H),5.84-5.97(m,1H),6.73-6.84(m,4H),7.13-7.49(m,15H),7.56-7.67(m,4H).
得られた残渣をTHF(45mL)に溶解し、四酢酸鉛(6.2g,13.4mmol)を内温が10℃以下になるように少しずつ加え、氷冷下20分間、室温で40分間攪拌した。不溶物を濾別したのち、THF(27mL)で洗浄した。
ろ液に、氷冷下、NaBH4(0.94g,24.9mmol)を1N水酸化ナトリウム(45mL)に溶解した溶液を、内温が10℃以下になるように加え、氷冷下15分間、室温で2時間攪拌した。反応液にpH=8まで飽和塩化アンモニウム水溶液を加え5分間攪拌した。酢酸エチル(54mL)を加え分離したのち、酢酸エチルで1回抽出した。有機相を0.5N水酸化ナトリウム水溶液(45mL)と飽和食塩水(36mL)の混合液で洗浄したのち、飽和食塩水で再度洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過後、溶媒を減圧下留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(n-ヘプタン/酢酸エチル/0.5%TEA)にて精製し、標記化合物6(7.6g,11.2mmol)を得た。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm):0.99(s,9H),2.59-2.74(m,1H),3.10-3.25(m,2H),3.60-3.76(m,6H),3.78(s,6H),6.74-6.85(m,4H),7.14-7.49(m,15H),7.56-7.68(m,4H).
得られた粗置換体をTHF(1.4mL)に溶解し、氷冷下、1M TBAF/THF溶液(6.5mL,6.5mmol)を加え、同温で2時間半攪拌した。反応混合物に水を加え、酢酸エチルで抽出した。有機相を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液と飽和食塩水の混合液(1:1)で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。濾過後、溶媒を減圧下留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(n-ヘプタン/酢酸エチル/0.5%TEA)にて精製し、標記化合物7(772mg,1.19mmol)を得た。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm):1.86(s,3H),1.95-2.03(m,1H),3.18-3.28(m,2H),3.47-3.92(m,6H),3.78(s,6H),3.94-4.06(m,1H),6.79-6.86(m,4H),7.18-7.34(m,9H),7.36-7.47(m,3H),7.55-7.65(m,1H),7.83-7.94(m,2H).
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm):1.07-1.21(m,12H),1.78-1.84(m,3H),2.48-2.62(m,2H),3.13-3.27(m,2H),3.43-4.01(m,11H),3.77(s,6H),6.77-6.86(m,4H),7.16-7.34(m,8H),7.35-7.46(m,4H),7.54-7.64(m,1H),7.83-7.92(m,2H).
(S)-2-[2-(3-ベンゾイル-5-メチル-2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロピリミジン-1(2H)-イル)エトキシ]-3-[ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ]プロピル (2-シアノエチル)ジイソプロピルホスホロアミダイトの合成
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm):0.99(s,9H),2.44(d,J=5.5Hz,1H),3.13-3.33(m,2H),3.70-3.81(m,2H),3.78(s,6H),3.83-3.93(m,1H),6.74-6.85(m,4H),7.09-7.49(m,15H),7.56-7.67(m,4H).
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm):0.96(s,9H),3.15-3.28(m,2H),3.59-3.67(m,1H),3.69-3.77(m,2H),3.77(s,6H),4.06-4.18(m,2H),5.10-5.18(m,1H),5.22-5.31(m,1H),5.84-5.97(m,1H),6.73-6.84(m,4H),7.13-7.49(m,15H),7.56-7.67(m,4H).
得られた残渣をTHF(2.6mL)に溶解し、氷冷下、四酢酸鉛(0.39g,0.788mmol)を内温が10℃以下になるように少しずつ加え、氷冷下20分間、室温で30分間攪拌した。反応液を濾過し不溶物を除去したのち、THFで洗浄した。
ろ液に、氷冷下、NaBH4(55mg,1.47mmol)を1N水酸化ナトリウム(2.6mL)に溶解した溶液を、内温が10℃以下になるように加え、氷冷下20分間、室温で1時間攪拌した。反応液にpH=8まで飽和塩化アンモニウム水溶液を加え5分間攪拌した。酢酸エチルを加え分離したのち、水層を酢酸エチルで1回抽出した。有機相を1N水酸化ナトリウム水溶液、飽和食塩水で洗浄したのち、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。濾過後、溶媒を減圧下留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(n-ヘプタン/酢酸エチル/0.5%TEA)にて精製し、標記化合物14(0.43g,0.635mmol)を得た。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm):0.99(s,9H),2.59-2.74(m,1H),3.10-3.25(m,2H),3.60-3.76(m,6H),3.78(s,6H),6.74-6.85(m,4H),7.14-7.49(m,15H),7.56-7.68(m,4H).
得られた粗置換体をTHF(1.7mL)に溶解し、氷冷下、1M TBAF/THF溶液(2.5mL,2.54mmol)を加え、氷冷下20分間、室温で1時間半攪拌した。反応液を減圧下濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(n-ヘプタン/酢酸エチル/0.5%TEA)にて精製し、標記化合物15(206mg,0.320mmol)を得た。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm):1.86(s,3H),1.95-2.03(m,1H),3.18-3.28(m,2H),3.47-3.92(m,6H),3.78(s,6H),3.94-4.06(m,1H),6.79-6.86(m,4H),7.18-7.34(m,9H),7.36-7.47(m,3H),7.55-7.65(m,1H),7.83-7.94(m,2H).
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm):1.07-1.21(m,12H),1.78-1.84(m,3H),2.48-2.62(m,2H),3.13-3.27(m,2H),3.43-4.01(m,11H),3.77(s,6H),6.77-6.86(m,4H),7.16-7.34(m,8H),7.35-7.46(m,4H),7.54-7.64(m,1H),7.83-7.92(m,2H).
(R)-2-[2-(3-ベンゾイル-5-メチル-2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロピリミジン-1(2H)-イル)エトキシ]-3-[ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ]プロピル (2-シアノエチル)ジイソプロピルホスホロアミダイトの合成
得られた粗置換体をTHF(2.6mL)に溶解し、氷冷下、1M TBAF/THF溶液(13.1mL,13.1mmol)を加え、氷冷下、2時間半攪拌した。反応混合物に水を加え、酢酸エチルで抽出した。有機相を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液と飽和食塩水の混合液(1:1)で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。濾過後、溶媒を減圧下留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(n-ヘプタン/酢酸エチル/0.5%TEA)にて精製し、標記化合物17(1.40g,2.20mmol)を得た。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm):1.89-2.03(m,1H),3.15-3.33(m,2H),3.48-3.58(m,1H),3.58-3.93(m,5H),3.78(s,6H),3.94-4.06(m,1H),5.69(d、J=7.8Hz,1H),6.77-6.89(m,4H),7.18-7.34(m,9H),7.36-7.47(m,3H),7.42(d,J=7.8Hz,1H),7.55-7.65(m,1H),7.83-7.94(m,2H).
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm):1.05-1.24(m,12H),2.48-2.63(m,2H),3.12-3.30(m,2H),3.43-4.04(m,11H),3.77(s,6H),5.58-5.69(m,1H),6.75-6.88(m,4H),7.16-7.34(m,8H),7.35-7.46(m,3H),7.47-7.55(m,1H),7.55-7.63(m,1H),7.83-7.93(m,2H).
(R)-3-[ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ]-2-[2-(4-イソブチルアミド-2-オキソピリミジン-1(2H)-イル)エトキシ]プロピル (2-シアノエチル)ジイソプロピルホスホロアミダイトの合成
得られた粗置換体をTHF(1.6mL)に溶解し、氷冷下、1M TBAF/THF溶液(7.3mL,7.3mmol)を加え、氷冷下、2時間攪拌した。反応混合物に水を加え、酢酸エチルで抽出した。有機相を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液と飽和食塩水の混合液(1:1)で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。濾過後、溶媒を減圧下留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(n-ヘプタン/酢酸エチル/0.5%TEA)にて精製し、標記化合物19(489mg,0.81mmol)を得た。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm):1.20-1.26(m,6H),1.88-1.98(m,1H),2.45-2.49(m,1H),3.11-3.26(m,2H),3.43-3.53(m,1H),3.54-3.73(m,2H),3.77-3.91(m,2H),3.80(s,6H),3.92-4.03(m,1H),4.07-4.18(m,1H),6.79-6.86(m,4H),7.18-7.34(m,8H),7.35-7.42(m,2H),7.66-7.72(m,1H),7.87(br s,1H).
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm):1.05-1.19(m,12H),1.19-1.25(m,6H),2.44-2.66(m,3H),3.05-3.25(m,2H),3.41-4.18(m,11H),3.80(s,6H),6.77-6.87(m,4H),7.16-7.33(m,8H),7.34-7.43(m,2H),7.72-7.81(m,1H),7.87(br s,1H).
9-{2-[((2R)-1-[ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ]-3-{[(2-シアノエトキシ)(ジイソプロピルアミド)フォスフィノ]オキシ}プロパン-2-イル)オキシ]エチル}-2-イソブチルアミド-9H-プリン-6-イル ジフェニルカーバメートの合成
得られた粗置換体をTHF(1.2mL)に溶解し、氷冷下、1M TBAF/THF溶液(4.8mL,4.8mmol)を加え、氷冷下、2時間攪拌した。反応混合物に水を加え、酢酸エチルで抽出した。有機相を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液と飽和食塩水の混合液(1:1)で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。濾過後、溶媒を減圧下留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(n-ヘプタン/酢酸エチル/0.5%TEA)にて精製し、標記化合物21(680mg,0.81mmol)を得た。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm):1.21-1.30(m,6H),2.39-2.49(m,1H),2.75-2.98(m,1H),3.11-3.22(m,2H),3.46-3.71(m,3H),3.77(s,6H),3.82-3.92(m,1H),3.92-4.03(m,1H),4.25-4.36(m,1H),4.38-4.51(m,1H),6.76-6.85(m,4H),7.15-7.52(m,19H),7.99(s,1H),8.06(s,1H).
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm):1.04-1.18(m,12H),1.22-1.30(m,6H),2.44-2.55(m,2H),2.83-3.02(m,1H),3.11-3.26(m,2H),3.40-3.82(m,7H),3.76(s,6H),3.82-4.01(m,2H),4.24-4.47(m,2H),6.76-6.85(m,4H),7.15-7.52(m,19H),7.99(s,1H),8.06(s,1H).
(R)-2-(2-(6-ベンズアミド-9H-プリン-9-イル)エトキシ)-3-(ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)プロピル (2-シアノエチル) ジイソプロピルホスホロアミドの合成
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm):1.03(s,9H),3.46-3.74(m,5H),3.76-4.00(m,3H),4.14-4.26(m,1H),4.38-4.52(m,1H),5.59(br s,2H),7.33-7.47(m,6H),7.58-7.67(m,4H),7.83(s,1H),8.34(s,1H).
得られた粗生成物をTHF(28mL)とEtOH(13mL)に溶解し、氷冷下、1N水酸化ナトリウム水溶液(5.9mL,5.9mmol)を加え、室温で1時間半攪拌した。反応混合物に飽和塩化アンモニウム水溶液(50mL)を加え、酢酸エチルで抽出した。有機相を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過後、溶媒を減圧下留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(MeOH/酢酸エチル)にて精製し、標記化合物24(900mg,1.51mmol)を得た。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm):1.03(s,9H),2.91-3.03(m,1H),3.42-3.77(m,6H),3.78-4.01(m,2H),4.25-4.38(m,1H),4.43-4.57(m,1H),7.32-7.48(m,6H),7.49-7.57(m,2H),7.58-7.67(m,5H),7.99-8.06(m,2H),8.09(s,1H),8.80(s,1H),8.99(s,1H).
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm):0.94(s,9H),2.91-3.03(m,1H),3.42-3.77(m,6H),3.78-4.01(m,2H),4.25-4.38(m,1H),4.43-4.57(m,1H),6.71-6.81(m,4H),7.15-7.27(m,7H),7.28-7.45(m,8H),7.47-7.67(m,7H),7.99-8.05(m,2H),8.06(s,1H),8.80(s,1H),8.99(s,1H).
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm):2.95-3.04(m,1H),3.10-3.20(m,2H),3.48-3.71(m,3H),3.88(s,6H),3.86-3.97(m,1H),3.98-4.09(m,1H),4.32-4.43(m,1H),4.48-4.60(m,1H),6.76-6.85(m,4H),7.15-7.32(m,7H),7.33-7.41(m,2H),7.49-7.57(m,2H),7.58-7.66(m,1H),7.99-8.07(m,2H),8.11(s,1H),8.80(s,1H),9.01(s,1H).
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm):1.02-1.20(m,12H),2.50-2.65(m,2H),3.08-3.26(m,2H),3.43-3.77(m,7H),3.77(s,6H),3.90-4.05(m,2H),4.39-4.50(m,2H),6.75-6.85(m,4H),7.15-7.33(m,7H),7.33-7.42(m,2H),7.48-7.58(m,2H),7.58-7.66(m,1H),7.99-8.08(m,2H),8.20(s,1H),8.81(s,1H),9.05(s,1H).
(R)-4-{3-[ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ]-2-[2-(2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロピリミジン-1(2H)-イル)エトキシ]プロポキシ}-4-オキソブタノエート-CPG サポートの合成
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm):1.93-2.00(m,1H),3.13-3.25(m,2H),3.46-3.55(m,1H),3.57-4.00(m,6H),3.80(s,6H),5.54-5.60(m,1H),6.83(d,J=9.0Hz,4H),7.18-7.34(m,4H),7.28(d,J=9.0Hz,4H),7.35-7.42(m,2H),8.03(br s,1H).
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm):1.27(t,J=7.4Hz,9H),2.58(s,4H),3.00(q,J=7.4Hz,6H)3.10-3.21(m,2H),3.56-3.68(m,1H),3.70-3.85(m,2H),3.80(s,6H),3.89-4.01(m,1H),4.05-4.18(m,2H),4.22-4.33(m,1H),5.54-5.60(m,1H),6.83(d,J=9.0Hz,4H),7.18-7.34(m,4H),7.28(d,J=9.0Hz,4H),7.35-7.42(m,2H).
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm):1.53(t,J=5.1Hz,1H),1.96(ddddd,J=3.9,5.9,6.6,11.3,11.7Hz,1H),3.76(dd,J=5.1,6.6Hz,1H),3.80(dd,J=5.9,11.7Hz,1H),4.02(dd,J=3.9,11.3Hz,2H),4.81(d,J=6.3Hz,1H),4.87(d,J=6.3Hz,1H).
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm):2.07(ddddd,J=4.1,6.6,7.4,11.3,11.5Hz,1H),3.65(d,J=6.6Hz,2H),3.72(dd,J=7.4,11.3Hz,1H),4.01(dd,J=4.1,11.5Hz,1H),4.81(d、J=6.0Hz,1H),4.87(d,J=6.0Hz,1H),7.34-7.47(m,6H),7.60-7.68(m,4H).
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm):1.05(s,9H),1.96-2.09(m,1H),2.11-2.20(m,1H),3.57-3.84(m,6H),5.08(s,2H),5.72(d,J=8.2Hz,1H),7.21(d,J=8.2Hz,1H),7.36-7.49(m,6H),7.60-7.67(m,4H),8.37(br s,1H).
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm):0.95(s,9H),2.07-2.21(m,1H),3.06-3.25(m,2H),3.57-3.66(m,2H),3.69-3.76(m,2H),3.78(s,6H),4.99(s,2H),5.61(d,J=8.2Hz,1H),6.75-6.84(m,4H),7.07(d,J=8.2Hz,1H),7.15-7.47(m,15H),7.54-7.63(m,4H),7.97(br s,1H).
得られた混合物(260mg)をダイセル製CHIRALPAK(登録商標)AD-H(2cmx25cm)を用いた超臨界流体クロマトグラフィー(移動相 CO2:2-プロパノール:アセトニトリル(70:15:15)、120bar、40℃、流速:100mL/分)にて一回あたり12mgずつ分取し、ダイセル製CHIRALPAK(登録商標)AD-H(4.6mmx150mm、移動相 2-プロパノール:n-ヘキサン(50:50)、流速:1mL/分)での分析結果の保持時間4.4分の標記化合物(36a:113mg、>99%ee)および保持時間4.9分の標記化合物(36b:123mg、>99%ee)を得た。
36a:
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm):2.02-2.15(m,1H),3.13-3.28(m,2H),3.62-3.76(m,4H),3.79(s,6H),5.08(s,2H),5.71(d,J=8.2Hz,1H),6.78-6.88(m,4H),7.15-7.43(m,9H),7.19(d,J=8.2Hz,1H),8.29(br s,1H).
36b:
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm):2.02-2.15(m,1H),3.13-3.28(m,2H),3.62-3.76(m,4H),3.79(s,6H),5.08(s,2H),5.71(d,J=8.2Hz,1H),6.78-6.88(m,4H),7.15-7.43(m,9H),7.19(d,J=8.2Hz,1H),8.29(br s,1H).
(S*)-3-[ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ]-2-{[(2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロピリミジン-1(2H)-イル)メトキシ]メチル}プロピル (2-シアノエチル) ジイソプロピルホスホロアミダイト(化合物37)の合成
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm):1.04-1.20(m,12H),2.12-2.27(m,1H),2.50-2.61(m,2H),3.02-3.23(m,2H),3.42-3.84(m,8H),3.79(s,6H),5.06(s,2H),5.69(d,J=8.2Hz,1H),6.77-6.86(m,4H),7.15-7.44(m,9H),7.20(d,J=8.2Hz,1H),8.05(br s,1H).
(R*)-3-[ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ]-2-{[(2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロピリミジン-1(2H)-イル)メトキシ]メチル}プロピル (2-シアノエチル) ジイソプロピルホスホロアミダイト(化合物38)の合成
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm):1.04-1.20(m,12H),2.12-2.27(m,1H),2.50-2.61(m,2H),3.02-3.23(m,2H),3.42-3.84(m,8H),3.79(s,6H),5.06(s,2H),5.69(d、J=8.2Hz,1H),6.77-6.86(m,4H),7.15-7.44(m,9H),7.20(d,J=8.2Hz,1H),8.05(br s,1H).
(S*)-4-(3-[ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ]-2-{[(2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロピリミジン-1(2H)-イル)メトキシ]メチル}プロポキシ)-4-オキソブタノエート-CPG サポートの合成
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm):1.24(t,J=7.2Hz,9H),2.14-2.28(m,1H),2.55(br s,4H),2.98(q,J=7.4Hz,6H),3.07-3.17(m,2H),3.55-3.64(m,2H),3.79(s,6H),4.07-4.27(m,2H),5.05(s,2H),5.71(d,J=8.2Hz,1H),6.78-6.85(m,4H),7.14-7.44(m,9H),7.19(d,J=8.2Hz,1H),8.29(br s,1H).
(R*)-4-(3-[ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ]-2-{[(2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロピリミジン-1(2H)-イル)メトキシ]メチル}プロポキシ)-4-オキソブタノエート-CPG サポートの合成
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm):1.24(t,J=7.2Hz,9H),2.14-2.28(m,1H),2.55(br s,4H),2.98(q,J=7.4Hz,6H),3.07-3.17(m,2H),3.55-3.64(m,2H),3.79(s,6H),4.07-4.27(m,2H),5.05(s,2H),5.71(d、J=8.2Hz,1H),6.78-6.85(m,4H),7.14-7.44(m,9H),7.19(d,J=8.2Hz,1H),8.29(br s,1H).
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm):1.24(t,J=7.2Hz,9H),2.14-2.28(m,1H),2.55(br s,4H),2.98(q,J=7.4Hz,6H),3.07-3.17(m,2H),3.55-3.64(m,2H),3.79(s,6H),4.07-4.27(m,2H),5.05(s,2H),5.71(d、J=8.2Hz,1H),6.78-6.85(m,4H),7.14-7.44(m,9H),7.19(d,J=8.2Hz,1H),8.29(br s,1H).
実施例1から12で製造した修飾核酸モノマー化合物、非特許文献2記載の方法で製造した下記式
合成した各種siRNAについて、MALDI―TOF―MS(Tanaka, K., et al. Rapid Commun.Mass Spectrom 1988, 2: 151-153)による分子量([M―H]―)の測定を行った結果を表2に示す。
対照siRNAとして、実施例1から12で製造した修飾核酸モノマーを用いずにほぼ同様にホスホロアミダイト法により、以下の表3に示すセンス鎖およびアンチセンス鎖からなる対照siRNAを合成した。
対照siRNA
次に、製造した各種siRNAの評価を以下のようにして行った。
1)Dual-Luciferaseレポータアッセイを用いた各種siRNAのinvitro活性評価
表1および表3に記載の各種siRNA(終濃度1-10nM/well)、Firefly Luciferase発現ベクターpGL4.13(Promega社)、RenillaLuciferase発現ベクターpGL4.73(Promega社)をLipofectamine2000試薬(Invitrogen社)を用い、ヒト胎児腎細胞株HEK293細胞(ATCC)4.0×104個/100μL/wellで96 wellplateにリバーストランスフェクションした。一晩培養後、Dual-GloLuciferase Assayキット(Promega社)を用いて添付文書に従いFireflyLuciferase活性およびRenilla Luciferase活性を測定した。ControlとしてsiRNAを用いない細胞のLuciferase活性(Firefly/Renilla Intensity)を100%として、各種siRNA導入細胞のLuciferase活性(相対値)(i.e., Relative LuciferaseActivity)を計算した。結果を[表5]、[表6]、[表7]、[図1]、[図2]および[図3]に示す。
糖がリボースである天然のヌクレオチドからなるsiRNAと、一部を本願発明の修飾ヌクレオチドに置換したsiRNAについて、ヌクレアーゼ耐性を検討した。
各種siRNA(終濃度 0.5μM)および3’-エキソヌクレアーゼであるヘビ毒ホスホジエステラーゼSVPD(Sigma-Aldrich社)をTris-HCl(40mM, pH8.5),NaCl(100mM),MgCl2(15 mM)を含む溶液に混合した。37℃で60分間静置した後、等量のEDTA(0.5M)を混合させることで反応をクエンチさせた。溶液をTris-Glycine緩衝液、nativeゲルe-PAGEL(ATTO社)を用いて電気泳動後、SYBRGreen IIRNA gelstain(Invitrogen社)にて核酸を染色し、LAS-4000(Fujifilm社)にて画像解析をした。結果を[図4]に示す。
[図4]の結果に示す通り、通常のリボヌクレオチドから調製したsiRNAに比較して本願発明のモノマーを用いたsiRNAは、3’-エキソヌクレアーゼに対する耐性が認められ、生体内での分解の抑制が期待できる。
i)siRNA-LNP調製
各種siRNAを25 mM酢酸ナトリウムpH 4.0に溶解し、濃度0.053mg/mLのsiRNA希釈液とした。イオン化脂質、1-(2-オクチルシクロプロピル)ヘプタデカン-8-イル 1-メチルピペリジン-4-カルボキシレート、DSPC(日本精化株式会社)、Cholesterol(日本精化株式会社)、MPEG2000-DMG(日油株式会社)を、モル比60/8.5/30/1.5の割合でエタノールに溶解した。siRNAと脂質の比を重量比0.06とし、siRNA希釈液と脂質溶液をそれぞれ3 mL/min、1 mL/minの流速で混合することで、Lipid Nanoparticles(LNP)を得た。得られたLNP水溶液を100 kD Float-A-Lyzer G2 (SPECTRUM社)を用いて透析により外液をPBS pH7.4に置換した。透析後、濾過滅菌を行い、実験に用いた。siRNA濃度および封入率は、Quant-iT RiboGreen RNA Reagent(Invitrogen社)を用いて測定した(RNase Free Waterで希釈し測定したsiRNA濃度をLNP外液に存在するsiRNAとし、1% Triton X-100で希釈し測定したsiRNA濃度を製剤中の全siRNA濃度として封入率を算出した)。平均粒子径は、粒子径測定装置(Malvern社製Zetasizer Nano ZS)にて測定した。測定結果を[表8]に示す。
Factor VII siRNAを封入したLNPをマウス(n=3 per group)に尾静脈内投与し、投与から24時間後に麻酔下で採血を実施した。遠心により血液から血漿を分離し、血漿中のFactorVIIタンパク質濃度をBIOPHEN FVII キット(Aniara社)により定量した。Controlとして無処置のマウス血漿中のFactorVIIタンパク質濃度を100%とし、LNP投与群のFactor VIIタンパク質濃度(相対値)(「Relative Factor VII protein level in mouse plasma」)を算出した。結果を[表9]に示す。
Claims (14)
- 下記式(I)で表される化合物またはその塩。
A1は、トリチル、4-メトキシトリチル、4,4’-ジメトキシトリチル(DMTr)、4,4’,4’’-トリメトキシトリチルから選択される水酸基の保護基を示し;
A2は、リン官能基、水酸基の保護基、または-C(=O)CH2CH2COOHを示し;
前記リン官能基は、下記式(i)、式(ii)、または式(iii)で表され;
Bは下記式(II)、(III)、(IV)および(V)から選択される核酸塩基を示し;
R1は、水素原子またはメチルを示し;
R2は、水素原子、C1-6アルキル、C3-6アルケニル、C3-6アルキニル、C1-6アルキル-カルボニル、C1-6アルキルスルホニル、C6-14アリールオキシ-カルボニル、C6-14アリール-カルボニル、C6-14アリールスルホニル、またはアミノ基の保護基を示し;
R4は、水素原子、C1-6アルキル、C3-6アルケニル、C3-6アルキニル、C1-6アルキル-カルボニル、C1-6アルキルスルホニル、C6-14アリールオキシ-カルボニル、C6-14アリール-カルボニル、C6-14アリールスルホニル、または水酸基の保護基を示し;
R3、R5およびR6はそれぞれ独立して、C1-6アルキル、C3-6アルケニル、C3-6アルキニル、C1-6アルキル-カルボニル、C1-6アルキルスルホニル、C6-14アリールオキシ-カルボニル、C6-14アリール-カルボニル、C6-14アリールスルホニル、またはアミノ基の保護基を示す。)
Lは、-OCH2CH2-または-CH2OCH2-を示し、
Y1およびY2におけるリン酸の保護基は、2-シアノエチル、2-(フェニルスルホニル)エチル、2,2,2-トリクロロエチル、2,2,2-トリブロモエチル、2-トリメチルシリルエチル、2-(ジフェニルメチルシリル)エチル、4-[N-メチル-N-(トリフルオロアセチル)アミノ]ブチル、2-[(1-ナフチル)カルバモイルオキシ]エチル、4-オキソペンチル、C1-6アルキル、2,4-ジニトロベンジル、ベンジル、およびアリルから選択され、
R2、R3、R5およびR6におけるアミノ基の保護基はそれぞれ独立して、
t-ブトキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニル、9-フルオレニルメチルオキシカルボニル、2,2,2-トリクロロエトキシカルボニル、およびアリルオキシカルボニルから選択されるカーバメート系保護基;
アセチル、クロロアセチル、フルオロアセチル、トリフルオロアセチル、ブチリル、イソブチリル、ベンゾイル、および2-ニトロベンゾイルから選択されるアシル系保護基;
フタロイルであるイミド系保護基;および
ベンジル、4-メトキシベンジル、および3,4-ジメトキシベンジルから選択されるベンジル系保護基
から選択され、
R4およびA2における水酸基の保護基は、
トリメチルシリル、トリイソプロピルシリル、t-ブチルジメチルシリル、(トリフェニルメチル)ジメチルシリル、t-ブチルジフェニルシリル、トリベンジルシリル、およびトリフェニルシリルから選択されるシリル系保護基;
トリチル、4-モノメトキシトリチル、4,4’-ジメトキシトリチル、および4,4’,4’’-トリメトキシトリチルから選択されるトリチル系保護基;
テトラヒドロピラニル、3-ブロモテトラヒドロピラニル、テトラヒドロチオピラニル、4-メトキシテトラヒドロピラニル、4-メトキシテトラヒドロチオピラニル、テトラヒドロフラニル、およびテトラヒドロチオフラニルから選択される複素環系保護基;
ベンジル、4-メトキシベンジル、2-ニトロベンジル、4-ニトロベンジル、および4-シアノベンジルから選択されるベンジル系保護基;
アセチル、クロロアセチル、トリクロロアセチル、トリフルオロアセチル、ブチリル、プロピオニル、ピバロイル、レブリニル、ペンタノイル、およびバレリルから選択される脂肪族アシル系保護基;
ベンゾイル、2,6-ジクロロベンゾイル、2-トルオイル、4-メトキシベンゾイル、および2,4,6-トリメチルベンゾイルから選択される芳香族アシル系保護基;
t-ブトキシメチル、メトキシメチル、1-エトキシエチル、1-(2-クロロエトキシ)エチル、2-トリメチルシリルエトキシエチル、2-(シアノエトキシ)エチル、2-ナフチルメトキシメチル、ジフェニルメチルから選択されるエーテル系保護基;
ジメチルカルバモイルおよびジフェニルカルバモイルから選択されるカルバモイル系保護基;および
9-フルオレニルメトキシカルボニルであるアルコキシカルボニル系保護基
から選択される。] - Lが、-OCH2CH2-である、請求項1に記載の化合物またはその塩。
- A2が、リン官能基である、請求項1または2に記載の化合物またはその塩。
- A2が、-C(=O)CH2CH2COOHである、請求項1または2に記載の化合物またはその塩。
- 前記A2における水酸基の保護基は、シリル系保護基である、請求項1または2に記載の化合物またはその塩。
- 下記式(VIII)で表される、修飾核酸モノマー化合物由来の一価の基が、担体上のアミノ基を介して固相担体に保持されている修飾核酸モノマー担持物。
A3は、水素原子、または、トリチル、4-メトキシトリチル、4,4’-ジメトキシトリチル(DMTr)、4,4’,4’’-トリメトキシトリチルから選択される水酸基の保護基であり;
Bは下記式(II)、(III)、(IV)および(V)から選択される核酸塩基を示し;
R1は、水素原子またはメチルを示し;
R2は、水素原子、C1-6アルキル、C1-6-アルコキシ、C3-6アルケニル、C3-6アルキニル、C1-6アルキル-カルボニル、C1-6アルキルスルホニル、C6-14アリールオキシ-カルボニル、C6-14アリール-カルボニル、C6-14アリールスルホニル、またはアミノ基の保護基を示し;
R4はそれぞれ独立して水素原子、C1-6アルキル、C1-6-アルコキシ、C3-6アルケニル、C3-6アルキニル、C1-6アルキル-カルボニル、C1-6アルキルスルホニル、C6-14アリールオキシ-カルボニル、C6-14アリール-カルボニル、C6-14アリールスルホニル、または水酸基の保護基を示し;
R3、R5およびR6はそれぞれ独立して、C1-6アルキル、C1-6-アルコキシ、C3-6アルケニル、C3-6アルキニル、C1-6アルキル-カルボニル、C1-6アルキルチオ、C1-6アルキルスルホニル、C6-14アリールオキシ-カルボニル、C6-14アリール-カルボニル、C6-14アリールスルホニル、またはアミノ基の保護基を示す。)
Lは、-OCH2CH2-または-CH2OCH2-を示し、
R2、R3、R5およびR6におけるアミノ基の保護基はそれぞれ独立して、
t-ブトキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニル、9-フルオレニルメチルオキシカルボニル、2,2,2-トリクロロエトキシカルボニル、およびアリルオキシカルボニルから選択されるカーバメート系保護基;
アセチル、クロロアセチル、フルオロアセチル、トリフルオロアセチル、ブチリル、イソブチリル、ベンゾイル、および2-ニトロベンゾイルから選択されるアシル系保護基;
フタロイルであるイミド系保護基;および
ベンジル、4-メトキシベンジル、および3,4-ジメトキシベンジルから選択されるベンジル系保護基
から選択され、
R4における水酸基の保護基は、
トリメチルシリル、トリイソプロピルシリル、t-ブチルジメチルシリル、(トリフェニルメチル)ジメチルシリル、t-ブチルジフェニルシリル、トリベンジルシリル、およびトリフェニルシリルから選択されるシリル系保護基;
トリチル、4-モノメトキシトリチル、4,4’-ジメトキシトリチル、および4,4’,4’’-トリメトキシトリチルから選択されるトリチル系保護基;
テトラヒドロピラニル、3-ブロモテトラヒドロピラニル、テトラヒドロチオピラニル、4-メトキシテトラヒドロピラニル、4-メトキシテトラヒドロチオピラニル、テトラヒドロフラニル、およびテトラヒドロチオフラニルから選択される複素環系保護基;
ベンジル、4-メトキシベンジル、2-ニトロベンジル、4-ニトロベンジル、および4-シアノベンジルから選択されるベンジル系保護基;
アセチル、クロロアセチル、トリクロロアセチル、トリフルオロアセチル、ブチリル、プロピオニル、ピバロイル、レブリニル、ペンタノイル、およびバレリルから選択される脂肪族アシル系保護基;
ベンゾイル、2,6-ジクロロベンゾイル、2-トルオイル、4-メトキシベンゾイル、および2,4,6-トリメチルベンゾイルから選択される芳香族アシル系保護基;
t-ブトキシメチル、メトキシメチル、1-エトキシエチル、1-(2-クロロエトキシ)エチル、2-トリメチルシリルエトキシエチル、2-(シアノエトキシ)エチル、2-ナフチルメトキシメチル、ジフェニルメチルから選択されるエーテル系保護基;
ジメチルカルバモイルおよびジフェニルカルバモイルから選択されるカルバモイル系保護基;および
9-フルオレニルメトキシカルボニルであるアルコキシカルボニル系保護基
から選択される。] - 下記式(XVII)および(XVIII)から選択される部分構造を1以上含有するオリゴ核酸類縁体またはその塩(ただし、該部分構造を2以上含有する場合は、該部分構造間でB3およびLはそれぞれ同一であっても異なってもよい。)
B3は、下記式(II)’、(III)’、(IV)’および(V)’から選択される核酸塩基を示し;
R1は、水素原子またはメチルを示し;
R2は、水素原子、C1-6アルキル、C1-6-アルコキシ、C3-6アルケニル、C3-6アルキニル、C1-6アルキル-カルボニル、C1-6アルキルスルホニル、C6-14アリールオキシ-カルボニル、C6-14アリール-カルボニル、C6-14アリールスルホニル、またはアミノ基の保護基を示し;
R4は、水素原子、C1-6アルキル、C1-6-アルコキシ、C3-6アルケニル、C3-6アルキニル、C1-6アルキル-カルボニル、C1-6アルキルスルホニル、C6-14アリールオキシ-カルボニル、C6-14アリール-カルボニル、C6-14アリールスルホニル、または水酸基の保護基を示し;
R3、R5およびR6はそれぞれ独立して水素原子、C1-6アルキル、C3-6アルケニル、C3-6アルキニル、C1-6アルキル-カルボニル、C1-6アルキルスルホニル、C6-14アリールオキシ-カルボニル、C6-14アリール-カルボニル、C6-14アリールスルホニル、またはアミノ基の保護基を示す。)
Lは、-OCH2CH2-または-CH2OCH2-を示し;
TはOHまたはSHを示し、
R2、R3、R5およびR6におけるアミノ基の保護基はそれぞれ独立して、
t-ブトキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニル、9-フルオレニルメチルオキシカルボニル、2,2,2-トリクロロエトキシカルボニル、およびアリルオキシカルボニルから選択されるカーバメート系保護基;
アセチル、クロロアセチル、フルオロアセチル、トリフルオロアセチル、ブチリル、イソブチリル、ベンゾイル、および2-ニトロベンゾイルから選択されるアシル系保護基;
フタロイルであるイミド系保護基;および
ベンジル、4-メトキシベンジル、および3,4-ジメトキシベンジルから選択されるベンジル系保護基
から選択され、
R4における水酸基の保護基は、
トリメチルシリル、トリイソプロピルシリル、t-ブチルジメチルシリル、(トリフェニルメチル)ジメチルシリル、t-ブチルジフェニルシリル、トリベンジルシリル、およびトリフェニルシリルから選択されるシリル系保護基;
トリチル、4-モノメトキシトリチル、4,4’-ジメトキシトリチル、および4,4’,4’’-トリメトキシトリチルから選択されるトリチル系保護基;
テトラヒドロピラニル、3-ブロモテトラヒドロピラニル、テトラヒドロチオピラニル、4-メトキシテトラヒドロピラニル、4-メトキシテトラヒドロチオピラニル、テトラヒドロフラニル、およびテトラヒドロチオフラニルから選択される複素環系保護基;
ベンジル、4-メトキシベンジル、2-ニトロベンジル、4-ニトロベンジル、および4-シアノベンジルから選択されるベンジル系保護基;
アセチル、クロロアセチル、トリクロロアセチル、トリフルオロアセチル、ブチリル、プロピオニル、ピバロイル、レブリニル、ペンタノイル、およびバレリルから選択される脂肪族アシル系保護基;
ベンゾイル、2,6-ジクロロベンゾイル、2-トルオイル、4-メトキシベンゾイル、および2,4,6-トリメチルベンゾイルから選択される芳香族アシル系保護基;
t-ブトキシメチル、メトキシメチル、1-エトキシエチル、1-(2-クロロエトキシ)エチル、2-トリメチルシリルエトキシエチル、2-(シアノエトキシ)エチル、2-ナフチルメトキシメチル、ジフェニルメチルから選択されるエーテル系保護基;
ジメチルカルバモイルおよびジフェニルカルバモイルから選択されるカルバモイル系保護基;および
9-フルオレニルメトキシカルボニルであるアルコキシカルボニル系保護基
から選択される。] - Lが、-OCH2CH2-である、請求項10または11に記載のオリゴ核酸類縁体またはその塩。
- 一鎖あたり含有する核酸塩基単位の総数が4~100である、請求項10から12のいずれか一項に記載のオリゴ核酸類縁体またはその塩。
- 一鎖あたり含有する核酸塩基単位の総数が4~30である、請求項10から12のいずれか一項に記載のオリゴ核酸類縁体またはその塩。
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