JP7303551B2 - 改変されたコラーゲンタンパク質およびその用途 - Google Patents
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Description
[2]上記[1]に記載の改変されたコラーゲンタンパク質であって、上記改変が、上記コラーゲンをコードするヌクレオチド配列への上記コラーゲンとは異なるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの挿入または付加によるものである、改変されたコラーゲンタンパク質。
[3]上記挿入または付加が、コラーゲンタンパク質のN末端側またはC末端側の領域に対応する領域内の部位においてなされたものである、上記[1]または[2]に記載の改変されたコラーゲンタンパク質。
[4]上記コラーゲンとは異なるタンパク質が、標識用タンパク質および治療用タンパク質からなる群から選択される、上記[1]~[3]のいずれか一項に記載の改変されたコラーゲンタンパク質。
[5]上記標識用タンパク質が、蛍光タンパク質(例:GFP、iRFP、HaloTag7)または発光タンパク質(例:ルシフェラーゼ(遺伝子例:Luc(+), Luc2、CBGluc、CBRluc、ELuc、SLR、SLO、SLG))であり、上記治療用タンパク質が、抗体または特殊ペプチドである、上記[4]に記載の改変されたコラーゲンタンパク質。
[6]上記コラーゲンが、Type VコラーゲンまたはType XIコラーゲンである、上記[1]~[5]のいずれか一項に記載の改変されたコラーゲンタンパク質。
[7]上記コラーゲンが、Type V α1、Type V α3、Type XI α1、またはType XI α2コラーゲンである、上記[6]に記載の改変されたコラーゲンタンパク質。
[8]上記[1]~[7]のいずれか一項に記載の改変されたコラーゲンタンパク質であって、配列番号2および配列番号4からなる群から選択されるアミノ酸配列またはそれに対して、少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変されたコラーゲンタンパク質。
[9]上記[1]~[8]のいずれか一項に記載の改変されたコラーゲンタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
[10]配列番号1および配列番号3からなる群から選択されるヌクレオチド配列またはそれに対して少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有するヌクレオチド配列からなる、上記[9]に記載のポリヌクレオチド。
[11]上記[9]または[10]に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
[12]上記[9もしくは10]に記載のポリヌクレオチド、または上記[11]に記載の発現ベクターが導入された発現細胞株。
[13]上記[12]に記載の発現細胞株をコートしたコラーゲンコートディッシュ。
[14]上記[1]~[8]のいずれか一項に記載の改変されたコラーゲンタンパク質または上記[9]もしくは[10]に記載のポリヌクレオチドを含む薬物送達ビヒクル。
[15]上記[1]~[8]のいずれか一項に記載の改変されたコラーゲンタンパク質または上記[9]もしくは[10]に記載のポリヌクレオチドを含む組成物。
[16]上記[9もしくは10]に記載のポリヌクレオチド、上記[11]に記載の発現ベクター、上記[12]に記載の発現細胞株、上記[14]に記載のビヒクル、または上記[15]に記載の組成物が導入されたモデル動物。
[17]上記モデル動物がマウスである、上記[16]に記載のモデル動物。
[18]改変されたコラーゲンをコードする遺伝子を形質導入した細胞の細胞外において上記改変されたコラーゲンタンパク質を含むコラーゲン線維を形成させる方法であって、
上記[9]または[10]に記載のポリヌクレオチドを上記細胞に導入する工程を含む、方法。
[19]形質導入された上記細胞をインビトロでストレス下で培養する工程を含む、上記
[18]に記載の方法。
[20]モデル動物において上記改変されたコラーゲンタンパク質を含むコラーゲン線維を形成させる工程をさらに含む、上記[18]または[19]に記載の方法。
[21]上記改変されたコラーゲンタンパク質が、標識用タンパク質の挿入または付加により改変されており、
上記標識を検出するための可視化またはイメージングの工程をさらに含む、上記[18]~[20]のいずれか一項に記載の方法。
[22]上記改変されたコラーゲンが、N末端ドメインとヒンジ部位との間の部位に標識用タンパク質を挿入したType Vコラーゲンα1である、上記[18]~[21]のいずれか一項に記載の方法。
[23]コラーゲン分泌および/またはコラーゲン線維形成の阻害剤のスクリーニング方法であって、
上記[12]に記載の発現細胞株をインビトロでストレス条件下で培養する工程であって、改変されたコラーゲンタンパク質が標識用タンパク質の挿入または付加により改変されている、工程、
上記ストレス条件下での培養の前に、上記培養物に上記阻害剤の候補物質を添加する工程、ならびに
上記候補物質の上記添加後、上記培養物において、上記細胞の細胞外においてコラーゲン分泌および/またはコラーゲン線維形成を観察し、上記コラーゲン分泌および/またはコラーゲン線維形成を、上記候補物質の上記添加がなかった場合と比較して低減させる作用を有する上記候補物質を上記阻害剤として選択する工程を含む、方法。
[24]上記選択する工程が、上記標識を検出するための可視化またはイメージングの工程を含む、上記[23]に記載の方法。
配列番号1は、図10に模式的に示すGFP挿入Type Vコラーゲンα1をコードするヌクレオチド配列を示す。
配列番号2は、図10に模式的に示すGFP挿入Type Vコラーゲンα1のアミノ酸配列を示す。
配列番号3は、図11に模式的に示すHaloTag7挿入Type Vコラーゲンα1をコードするヌクレオチド配列を示す。
配列番号4は、図11に模式的に示すHaloTag7挿入Type Vコラーゲンα1のアミノ酸配列を示す。
配列番号5は、本発明の実施例に係るプラスミドベクターpEB6CAGcol5α1-EGFPのヌクレオチド配列を示す。
配列番号6は、本発明の実施例に係るプラスミドベクターpEB6CAGcol5α1-Halo7のヌクレオチド配列を示す。
配列番号7は、本発明の実施例に係る改変されたコラーゲンタンパク質を作製する際に用いたリンカーのヌクレオチド配列を示す(図10および図11を参照)。
配列番号8は、配列番号7のヌクレオチド配列がコードするアミノ酸配列を示す。
配列番号9は、マウス由来のType Vコラーゲンα1をコードするヌクレオチド配列(XM_006497644)を示す。
配列番号10は、マウス由来のType Vコラーゲンα1のアミノ酸配列(XP_006497707)を示す。
配列番号11は、マウス由来のType Vコラーゲンα3をコードするヌクレオチド配列(XM_017313471)を示す。
配列番号12は、マウス由来のType Vコラーゲンα3のアミノ酸配列(XP_017168960)を示す。
配列番号13は、マウス由来のType XIコラーゲンα1をコードするヌクレオチド配列(NM_007729)を示す。
配列番号14は、マウス由来のType XIコラーゲンα1のアミノ酸配列(NP_031755)を示す。
配列番号15は、マウス由来のType XIコラーゲンα2をコードするヌクレオチド配列(NM_001317722)を示す。
配列番号16は、マウス由来のType XIコラーゲンα2のアミノ酸配列(NP_001304651)を示す。
配列番号17は、本発明の実施例に係る改変されたコラーゲンタンパク質を作製する際に用いたクローニングベクターpEGFP-N1のヌクレオチド配列(U55762)を示す(図10を参照)。
配列番号18は、配列番号17のクローニングベクターpEGFP-N1によってコードされた増強された緑色蛍光タンパク質(enhanced green fluorescent protein)のアミノ酸配列(AAB02574)を示す。
配列番号19は、本発明の実施例に係る改変されたコラーゲンタンパク質を作製する際に用いたCMV Flexi Vector pFN21K (HaloTag 7)のヌクレオチド配列(EU621375)を示す(図11を参照)。
配列番号20は、配列番号19のCMV Flexi Vector pFN21K (HaloTag 7)によってコードされたカナマイシン抵抗性タンパク質(kanamycin resistance protein)のアミノ酸配列(ACF22985)を示す。
以下に示す実施例において用いた材料および方法は、以下の通りである。
1.細胞培養
細胞はマウス由来骨芽細胞株MC3T3-E1とマウス線維芽細胞Balb3T3を用いた。
通常培養は以下の材料を用いて、MC3T3-E1は10%血清を含む αMEM培地で、Balb3T3は10%血清を含むMEM培地で、37℃、5%CO2下で行った。
・血清:Fetal bovine serum(Gibco)
・培地:Minimum Essential Medium Alpha(Gibco)
・培地:Minimum Essential Medium (Gibco)
・細胞培養用ディッシュ:Cell culture dish 60×15 mm(Falcon)
・細胞培養用フラスコ:Cell culture flask(12.5 cm2スラントネック/プラグシール)25 ml(Falcon)
シェイカーはミニシェーカーSHM-2002(LMS)を用い、サンフラワー方式の振とうで振とう角度7°、回転速度20 rpmで培養を行った。
ベクター構築には、当研究室で開発されたpEB6CAGベクターを基本骨格に用いた。クローニングしたType VコラーゲンのN末球状ドメインとヒンジ部の間に、それぞれGFP、HaloTag(R)7(Promega)を挿入し、以下のベクターを作製した(図3、9、10、11を参照)。
・pEB6CAGCol5α1-GFP
・pEB6CAGCol5α1-Halo7
本研究ではマウス頭蓋骨由来の細胞株であるMC3T3-E1細胞およびマウス線維芽細胞株Balb3T3を用いた。遺伝子導入はリポフェクション法で行い、ScreenFectTMA(和光純薬)を試薬として用いた。遺伝子導入から36時間後、細胞を0.05%Trypsin・0.02%EDTA-2Na・PBS(-)溶液(Trypsin溶液)で処理したのち60 mm dishに継代し、終濃度1.5 μg/mlのGeneticin(G418)を含むαMEM培地またはMEM培地により5日間セレクションを行った。形成されたコロニーを採取し、培養を継続した後、蛍光の輝度が高いクローンを選別した。
pEB6CAGCol5α1-Halo7を導入したMC3T3-E1細胞は、以下の3種類の色素を 0.1 μMになるように添加し、1時間染色後、培地で洗浄して色素を除去し、1時間脱色後に蛍光観察を行った。
・HaloTag-OregonGreen(細胞膜透過性、緑)
・HaloTag-TMR(細胞膜透過性、赤)
・HaloTag-Alexa488(細胞膜非透過性、緑)
蛍光顕微鏡撮影には、OLYMPUS LX73を用いた。蛍光撮影には、以下のフィルターセットを用いた。
・緑色蛍光:U-EGFP(OLIMPUS)Ex:470/20、Em:518/45
・赤色蛍光:BrightLine(R)SpGold-B-000-ZERO(Semrock)Ex:534/20、Em:572/28
・近赤外蛍光:BrightLine(R)Cy5.5-B-000(Semrock)Ex:655/40、Em:716/40
超解像顕微鏡撮影は、Zeiss LSM880 Airscanを用いて、細胞核をHoechst33342で対比染色して観察した。
MC3T3-E1およびBalb3T3のコラーゲンプローブ安定発現株1x106個の細胞を50 μlのPBS(-)に懸濁し、MC3T3-E1細胞はC57BL/6 アルビノマウスの背部皮下に、Balb3T3細胞はBalb/cマウスの背部皮下に移植した。2週間後、皮膚を切開し実体顕微鏡MVX(OLYMPUS)に設置した マルチスペクトルCCDカメラNuance(PerkinElmer)を使い倍率2.5倍で撮影した。GFP挿入の場合はそのまま観察し、HaloTag挿入の場合はStella700HaloTagリガンドを0.5 μMにPBS(-)で希釈した溶液50 μlを細胞移植部位に投与して1時間染色後に撮影した。蛍光撮影には、以下のフィルターを用いた。
・緑色蛍光:U-FGFP(OLIMPUS)Ex:470/20、Em:518/45
・近赤外蛍光:BrightLine(R)Cy5.5-B-000(Semrock)Ex:655/40、Em:716/40
移植3週間後に蛍光を含む皮膚片を摘出し固定後、蛍光の線維を切断する方向に切片を作成して、H&E染色、マッソントリクローム染色、エラスチカワンギーソン染色にて、コラーゲン線維の蓄積を検出した。
コラーゲンには専用の細胞内輸送系が必要だと考えられていることを考慮し、コラーゲンを産生していると報告のあるマウスMC3T3-E1細胞を使用し、GFP挿入Type Vコラーゲンα1を導入・発現させた。蛍光顕微鏡で観察したところ、細胞質内に顆粒状の緑色蛍光が観察され、膜小胞で輸送されていると考えられるが、ゴルジ体が暗く抜けていた(図4)。これにより、通常の培養方法では、正しく輸送されず、分泌もされていないことが推定された。
培養方法の改良を検討するため、北川鉄工所製Zeromo(登録商標)によって、フラスコを回転させ重力変化のストレスを与えた場合のMC3T3-E1細胞の形態を観察した。図5に示すように、通常培養では薄く広がった上皮様の形態であるのに対して、重力変化ストレス3日後には細胞が細く折り重なって密集した線維芽細胞様の形態に変化した(図5)。
GFP挿入Type Vコラーゲンα1を導入・発現させたMC3T3-E1細胞を図5と同様にZeromoによって重力ストレスを与えた場合、3日目には細胞の形態が上皮様から線維芽細胞様に変化するだけでなく、多くの結晶の出現を認め、また蛍光像にも部分的に線維状への変化が認められた。さらにZeromo培養を継続した結果12日目には、正常なコラーゲン様の線維像に完全に変化した(図6)。
重力ストレスの与え方が、Zeromoによる回転が必要なのか、より単純な震とうでよいのかを検討した。A) GFP挿入Type Vコラーゲンα1を導入・発現させたMC3T3-E1細胞を静置して通常培養しても、細胞は上皮様であり分泌は起こらなかった(図7A)。B)震とう培養すると、形態が線維芽細胞様に変化し、分泌されたコラーゲン線維が蛍光として可視化された(図7B)。C) HaloTag7挿入Type Vコラーゲンα1を導入・発現させ震とう培養後、TMR-HaloTagリガンドで染色すると、GFPの場合と同様にコラーゲン線維像が可視化された(図7C)。
図7で見られた線維が細胞外に分泌されたものであることを確認するため、染色方法を、まず膜透過性がなく細胞外タンパク質しか染色できないAlexa488-HaloTagリガンドで1時間染色後、膜透過性で細胞内も染色できるTMR-HaloTagリガンドでさらに1時間染色する2段階染色を行った。緑の蛍光像(図8;下欄中央)から、線維は細胞外に分泌して形成された線維を可視化したものであり、赤の蛍光像(図8;下欄右側)から、細胞内を輸送中のタンパク質は図4の分泌されなかった際の蛍光像と同様になったことが示された(図8)。
同じGFP挿入Type Vコラーゲンα1プローブが他の細胞でも機能するか確認するため、GFP挿入Type Vコラーゲンα1を導入・発現させたBalb3T3細胞株を樹立し解析を行った。通常の増殖培養の間は細胞質に顆粒状の蛍光が検出されるだけで、分泌は起こらなかった(図12A)。静置して通常培養を継続しても分泌は起こらず、2週間目にはかなりの細胞が死亡していた。(図12B)。ストレス誘導培養すると2週間目に分泌されたコラーゲン線維が蛍光として可視化された(図12C)。
MC3T3-E1およびBalb3T3のコラーゲンプローブ安定発現株1x106個の細胞を50 μlのPBS(-)に懸濁し、それぞれMC3T3-E1細胞はC57BL/6 アルビノマウスの背部皮下に、Balb3T3細胞はBalb/cマウスの背部皮下に移植した。2週間後、皮膚を裏返しにして蛍光撮影したところ、いずれのマウスにおいても、GFPの蛍光で光るコラーゲン線維様のかたまりが形成されていた。これらは、PBS(-)のみを注射した部位には見られなかった(図13)。
GFP挿入Type Vコラーゲンα1発現MC3T3-E1細胞を皮下移植後3週間目に実施例7と同一部位を観察したところ、線維状蛍光塊が継続して存在した。これを含むように皮膚を回収し、固定後に蛍光線維を横断する切片を作成し、ヘマトキシン・エオジン染色((Hematoxylin Eosin (HE) stain)、マッソントリクローム染色(Masson's Trichrome (MT) stain)、エラスチカワンギーソン染色(Elastica van Gieson (EVG) stain)を行った。蛍光が見られた皮膚の裏側に、通常はみられない瘤状の構造がみられ(図14矢頭)、これはマッソントリクローム染色で膠原線維を示す青色に、またエラスチカワンギーソン染色で膠原線維を示すピンク色に染色されていた。これらにより、本発明によるType Vコラーゲンα1プローブは、生きたマウス体内においてもコラーゲン線維を細胞外に形成し、観察できることが確認された。
Halotag挿入Type Vコラーゲンα1発現MC3T3-E1の安定発現株1x106個の細胞を50 μlのPBS(-)に懸濁し、C57BL/6 アルビノマウスの背部皮下に移植した。2週間後、Stella700HaloTagリガンドを0.5 μMにPBS(-)で希釈した溶液50 μlを細胞移植部位に投与して1時間染色後に皮膚を裏返しにして蛍光撮影したところ、Stella700の近赤外蛍光で光るコラーゲン線維のかたまりが形成されていた。(図15)。
GFP挿入Type Vコラーゲンα1発現MC3T3-E1をガラスボトム上で培養し、コラーゲン分泌を誘導できるストレス培養に切り替えて19日後に細胞外に緑の蛍光の線維構造が確認された(図16;写真の下段パネル)。これを4%パラフォルムアルデヒドで固定した後、細胞核をHoechst33342で対比染色して、Zeiss LSM880 Airyscanを用いて超解像観察した。コラーゲン線維と細胞が複雑に重なり合った3次元構造を形成していた。(図17)。
GFP挿入Type Vコラーゲンα1発現MC3T3-E1をマルチウェルプレートで培養し、コラーゲン分泌を誘導できるストレス培養に切り替える際に、ピルフェニドン 1.0 mg/mlを添加して、無添加のウェルと比較した。28日後にピルフェニドン無添加のウェルでは細胞外に緑の蛍光の線維構造が確認されたが、添加したウェルでは、線維形成が阻害されていた。(図18)。これにより、本発明を利用することで、コラーゲン分泌・線維形成の阻害効果をもつ薬物を探索できることが明らかとなった。
Claims (32)
- 生体内で、形質転換細胞で発現され、前記細胞外にてコラーゲン線維を形成することができる改変されたコラーゲンタンパク質であって、前記細胞が哺乳動物細胞であり、前記形質転換が、前記改変されたコラーゲンタンパク質をコードするポリヌクレオチドの前記細胞への導入によるものであり、前記改変が、天然のコラーゲンタンパク質のN末端プロペプチド(N-プロペプチド)の領域に対応する領域内のNC3ドメインのC末端に隣接する部位においてなされた、前記天然のコラーゲンタンパク質をコードするヌクレオチド配列への前記天然のコラーゲンタンパク質とは異なるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの挿入または付加であり、前記天然のコラーゲンタンパク質が、Type VまたはType XIコラーゲンタンパク質である、改変されたコラーゲンタンパク質。
- 請求項1に記載の改変されたコラーゲンタンパク質であって、前記天然のコラーゲンタンパク質とは異なるタンパク質が、標識用タンパク質または治療用タンパク質である、改変されたコラーゲンタンパク質。
- 前記標識用タンパク質が、蛍光タンパク質(例:GFP、iRFP、HaloTag7)または発光タンパク質(例:ルシフェラーゼ(遺伝子例:Luc(+),Luc2、CBGluc、CBRluc、ELuc、SLR、SLO、SLG))であり、前記治療用タンパク質が、抗体または特殊ペプチドである、請求項2に記載の改変されたコラーゲンタンパク質。
- 前記部位が、Type Vコラーゲンタンパク質のN-プロペプチドの領域に対応する領域内にある、請求項1~3のいずれか一項に記載の改変されたコラーゲンタンパク質。
- 前記天然のコラーゲンタンパク質が、Type V α1、Type V α3、Type XI α1、またはType XI α2コラーゲンである、請求項1~4のいずれか一項に記載の改変されたコラーゲンタンパク質。
- 請求項1~5のいずれか一項に記載の改変されたコラーゲンタンパク質であって、配列番号2および配列番号4からなる群から選択されるアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変されたコラーゲンタンパク質。
- 請求項1~6のいずれか一項に記載の改変されたコラーゲンタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
- 配列番号1および配列番号3からなる群から選択されるヌクレオチド配列またはそれに対して少なくとも90%の同一性を有するヌクレオチド配列からなる、請求項7に記載のポリヌクレオチド。
- 請求項7または8に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
- 請求項7もしくは8に記載のポリヌクレオチド、または請求項9に記載の発現ベクターが導入された哺乳動物細胞である発現細胞株。
- 請求項10に記載の発現細胞株をコートしたコラーゲンコートディッシュ。
- 請求項1~6のいずれか一項に記載の改変されたコラーゲンタンパク質または請求項7もしくは8に記載のポリヌクレオチドを含む薬物送達ビヒクル。
- 請求項1~6のいずれか一項に記載の改変されたコラーゲンタンパク質または請求項7もしくは8に記載のポリヌクレオチドを含む、標識用または治療用の組成物。
- 請求項7もしくは8に記載のポリヌクレオチド、請求項9に記載の発現ベクター、請求項10に記載の発現細胞株、請求項12に記載のビヒクル、または請求項13に記載の組成物が導入されたモデル動物。
- 前記モデル動物がマウスである、請求項14に記載のモデル動物。
- 改変されたコラーゲンをコードする遺伝子を形質導入した哺乳動物細胞の細胞外において前記改変されたコラーゲンタンパク質を含むコラーゲン線維を形成させる方法であって、
請求項7または8に記載のポリヌクレオチドが導入された前記細胞をインビトロでストレス下で培養する工程を含む、方法。 - 前記ストレスが前記細胞の形態を変化させるストレスであって、重力の変化、振動、および遠心力からなる群から選択される、請求項16に記載の方法。
- 改変されたコラーゲンをコードする遺伝子を形質導入した哺乳動物細胞の細胞外において前記改変されたコラーゲンタンパク質を含むコラーゲン線維を形成させる方法であって、
請求項7または8に記載のポリヌクレオチドが導入され、前記ポリヌクレオチドを安定に発現する前記細胞をモデル動物に移植する工程を含む、方法。 - 前記改変されたコラーゲンタンパク質が、標識用タンパク質の挿入または付加により改変されており、
前記標識を検出するための可視化またはイメージングの工程をさらに含む、請求項16~18のいずれか一項に記載の方法。 - 前記改変されたコラーゲンが、N末端ドメインとヒンジ部位との間の部位に標識用タンパク質を挿入したType Vコラーゲンα1である、請求項16~19のいずれか一項に記載の方法。
- コラーゲン分泌および/またはコラーゲン線維形成の阻害剤のスクリーニング方法であって、
請求項10に記載の発現細胞株をインビトロでストレス条件下で培養する工程であって、改変されたコラーゲンタンパク質が標識用タンパク質の挿入または付加により改変されている、工程、
前記ストレス条件下での培養の前に、前記培養物に前記阻害剤の候補物質を添加する工程、ならびに
前記候補物質の前記添加後、前記培養物において、前記細胞の細胞外においてコラーゲン分泌および/またはコラーゲン線維形成を観察し、前記コラーゲン分泌および/またはコラーゲン線維形成を、前記候補物質の前記添加がなかった場合と比較して低減させる作用を有する前記候補物質を前記阻害剤として選択する工程を含む、方法。 - 前記選択する工程が、前記標識を検出するための可視化またはイメージングの工程を含む、請求項21に記載の方法。
- 配列番号2または配列番号4のアミノ酸配列からなる改変されたコラーゲンタンパク質。
- 配列番号1または配列番号3のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド。
- 配列番号1または配列番号3のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを安定的に発現する細胞が移植されたモデル動物。
- モデル動物内で改変されたコラーゲンタンパク質を含むコラーゲン線維を形成させる方法であって、
配列番号1または配列番号3のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを安定的に発現する細胞をモデル動物に移植する工程、および
前記モデル動物内で前記改変されたコラーゲンタンパク質を前記細胞の外へ分泌させる工程
を含む、方法。 - 前記ストレス条件が、重力の変化、振動、および遠心力からなる群から選択される、請求項21または22に記載の方法。
- 配列番号1または配列番号3のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
- 配列番号1または配列番号3のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを安定的に発現するモデル実験動物細胞である発現細胞株。
- 前記モデル実験動物がマウスである、請求項29に記載の発現細胞株。
- 配列番号1または配列番号3のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを安定的に発現するマウス細胞である発現細胞株を含有する細胞をコーティングした細胞培養ディッシュ。
- 線維化抑制薬物のインビトロスクリーニング方法であって、
配列番号1または配列番号3のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを安定的に発現するマウス細胞株をインビトロで培養する工程であって、培養中に重力の変化、振動、および遠心力からなる群から選択されるストレスを前記細胞株に与える、工程、および
前記ストレス条件下での前記培養後に、前記細胞の細胞外でのコラーゲン線維の形成を蛍光観察により確認する工程を含み、
前記ストレスを前記細胞株に与える前に、候補薬物を前記細胞株に接触させた場合に、前記候補薬物を前記細胞株に接触させなかった場合よりも前記細胞外でのコラーゲン線維の形成の抑制が確認された場合に、前記候補薬物を前記線維化抑制薬物と評価する、方法。
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