JP7303550B2 - フィブリルの製造方法 - Google Patents
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[1] 以下(A)~(C)の工程を含む、フィブリルの製造方法。
(A)式[(A)nモチーフ-REP]mで表されるドメイン配列を含むフィブロインを、可溶化剤を用いて可溶化して、可溶化溶液を得る工程、
(B)上記可溶化剤の濃度が上記フィブロインの凝集体が生じる濃度になるまで前記可溶化溶液を希釈し、その濃度を維持することで、フィブリルを含む懸濁液を生成する工程、及び
(C)(B)工程において生成したフィブリルを回収する工程。
[式中、(A)nモチーフは4~27アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列を示し、かつ(A)nモチーフ中の全アミノ酸残基数に対するアラニン残基数が65%以上である。REPは10~200アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列を示す。mは2~300の整数を示す。複数存在する(A)nモチーフは、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。複数存在するREPは、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。]
[2] 上記(B)工程で生じる凝集体中のフィブロイン量が、上記(A)工程で用いたフィブロイン量の0.1~10重量%である、上記[1]記載の製造方法。
[3] 上記(C)工程が、上記懸濁液を遠心分離し、上清を回収する工程である、上記[1]又は[2]に記載の製造方法。
[4] 可溶化剤がカオトロピック剤である上記[1]~[3]のいずれかに記載の製造方法。
[5] カオトロピック剤が尿素、塩酸グアニジウム、ヨウ化ナトリウム及び過塩素酸塩からなる群より選ばれる、上記[4]記載の製造方法。
(A)式[(A)nモチーフ-REP]mで表されるドメイン配列を含むフィブロインを、可溶化剤を用いて可溶化し、可溶化溶液を得る工程、
(B)上記可溶化剤の濃度を凝集体が生じる濃度に希釈し、その濃度を維持することで、フィブリルを含む懸濁液を生成する工程、
(C)(B)工程において生成したフィブリルを回収する工程。
本発明に係るフィブロインは、式[(A)nモチーフ-REP]mで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。
本発明において、フィブリルとは、直径が1nmから100nm、長さが直径に比べて大きいものであって、例えば、長さが直径の10倍以上の繊維状物質を意味する。フィブリルは、ナノファイバーあるいはナノロッドと称されることもある。フィブロインからなるフィブリルとは、繊維状物質の構成成分がフィブロインであるフィブリルを意味する。フィブロインからなるフィブリルは、図1(b)に示されるような円柱状のフィブリルであることが好ましい。フィブリルの長さは式:[(A)nモチーフ-REP]mで表されるドメイン配列の繰り返し数mに依存しており、mが大きくなる程長いフィブリルを得ることができる。フィブリルの長さは、フィブロインの分子量及び濃度に依存して長くすることができるが、例えば、分量約50kDaで濃度が約1mg/mlでは30~150nmであってよく、濃度が約2.5mg/mlでは50~250nmであってよい。フィブリルの直径(高さ)は、例えば2~5nmであってよい。本発明によれば、均一な長さのフィブリルが得られる。ここで均一とは、ヒストグラム上で極大値を示す長さに対して±50%の範囲に70%が含まれることを意味する。
(A)工程は、[(A)nモチーフ-REP]mドメイン配列を含むフィブロインを、可溶化剤を用いて可溶化して、可溶化溶液を得る工程である。
(B)工程は、前記可溶化剤の濃度が前記フィブロインの凝集体が生じる濃度になるまで前記可溶化溶液を希釈し、その濃度を維持することで、フィブリルを含む懸濁液を生成する工程である。
(C)工程は、(B)工程において生成したフィブリルを回収する工程である。
(1)紫外・可視吸収測定による溶解の状況の評価
フィブロインの溶解の状況及びタンパク質(フィブロイン)濃度はNanoDrop(登録商標)(サーモフィッシャーサイエンティフィック社製)による紫外・可視吸収スペクトルを測定することにより確認することができる。フィブロインの紫外・可視吸収スペクトルは、280nmを極大とする吸収スペクトルを示し、完全に溶解している場合には顕著な散乱は見られない。
可溶化溶液の希釈によるフィブロインの構造変化は、CD(Circular Dichroism)スペクトルにより確認することができる。完全なアルファへリックス構造をとる場合、208nmと222nmに負の極大、193nmに正の極大を示す。完全なβシート構造をとる場合、218nm付近に負の極大、195nm付近に正の極大を示す。完全なランダムコイル構造をとる場合、217nm付近に正の極大、195nm付近に負の極大を示す(図2)。フィブロインがフィブリルを形成していれば、βシート構造を確認することができる。
ATR-FTIRで測定した場合、アミロイド繊維がβシート構造が一方向に並んだ構造(クロスβシート構造、ポリアラニン結晶構造)にシフトすると、シフトに依存した特有のIRスペクトル変化が見られる。同様のIRスペクトル変化が見られるか確認することにより、フィブロイン可溶化溶液中のフィブロインがβシート構造が一方向に並んだ構造をとっているか確認することができる。
βシート構造に強く反応する蛍光色素チオフラビンT(ThT)を用い、蛍光強度による解析を、蛍光光度計及びプレートリーダーで行うことにより、フィブロイン可溶化溶液中のフィブロインのβシート構造の形成状況を確認することができる。
フィブロイン尿素可溶化原液又は尿素を希釈した希釈液中に形成されたフィブリルは、透過型電子顕微鏡(TEM)、走査型プローブ顕微鏡(SPM)を用いて観察することができる。観察は機器付属のマニュアルに準じて行えばよい。ImageJソフト等の解析ソフトを利用することにより、フィブリルの長さ、直径の計測解析ができる。
フィブロインの粉末試料5.1mgに尿素バッファー(6M尿素、10mMtrisHCl、pH7.0)を222μl加え、5分間振とう(1800rpm)後、ソニケーション(20%、10秒、4回、インターバル10分)を行い、フィブロインを完全に可溶化させた。当該可溶化溶液を、フィルタ(Ultrafree-MC-GV、DuraporePVDF0.22μm)を用いて濾過し、不純物を取り除いた。その際、フィルタが目詰まりしないように、50μlずつ流した。フィルタ濾過をした可溶化溶液の紫外・可視吸収を、NanoDrop(登録商標)で測定した。可溶化溶液は、280nmを極大とする紫外・可視吸収スペクトルを示し、顕著な散乱は見られなかったことから、フィブロインが完全に溶解していることが確認された(図3のスペクトル1)。
6M 尿素可溶化溶液(尿素可溶化原液)及び顕著な沈殿物が生じていない3M 尿素可溶化(2倍希釈液)中におけるフィブロインの二次構造を、JASCO J-725(日本分光株式会社製)を用いて、CD測定により評価した。
測定範囲:250~195nm、感度:standard
走査速度:20nm/分、レスポンス:4秒
積算回数:4バンド幅:1.0nm
測定濃度:0.2mg/ml
2倍希釈液中のフィブロインがβシート構造を形成していると推定されたため、ATR-FTIR測定により更なる解析を行った。
積算回数:バックグラウンド-512、サンプル-128
分解:4 cm-1、干渉計速度:4mm/秒、検出器:MCT
感度:×1、フィルタ:10kHz、測定範囲:700-7800cm-1
アパーチャー:1.8mm、アポタイゼーション:cosine
インターバル測定:5分、インターバル:100秒
サンプルマウント量:9μl
βシート構造に強く反応する蛍光色素チオフラビンT(ThT)を用い、蛍光強度スペクトルによる解析を行った。蛍光光度計による測定には、JASCO FP-8200(日本分光株式会社)を、プレートリーダーによる測定には、SYNERGY HTX(バイオテック株式会社)を用いた。測定には、フィブロイン可溶化溶液に、ThTを0.1mg/mlとなるように添加したものを用いた。
測定範囲440~600nm
励起波長450nm
測定濃度0.1mg/ml
スキャンスピード Medium
測定回数 試料ごとに3回
(kinetic)Run:96h、インターバル15分、振とう15秒
Read1:(bottom)440/30、500/27
Read2:UV600
プレート:48flat bottom Nuclon
測定濃度10mg/ml
2倍希釈液と同じ濃度の尿素を含有する尿素緩衝液を添加して、2倍希釈液中のフィブロイン濃度1mg/mL及び2.5mg/mLの希釈溶液について、フィブロインを0.02mg/mLになるように調製し、SPMで解析した。調製した試料をマイカ基盤にキャストし、SPM(SPM-9700、島津製作所)でナノファイバーの形態を観察した。SPMによりフィブロインが、アミロイド線維や絹糸と同様に、フィブリルを形成していることが確認できた(図10)。
Claims (4)
- 以下(A)~(C)の工程を含む、フィブリルの製造方法。
(A)式[(A)nモチーフ-REP]mで表されるドメイン配列を含むフィブロインを、カオトロピック剤を用いて可溶化して、可溶化溶液を得る工程、
(B)前記カオトロピック剤の濃度が前記フィブロインの凝集体が生じる濃度になるまで前記可溶化溶液を希釈し、その濃度を維持することで、フィブリルを含む懸濁液を生成する工程、及び
(C)(B)工程において生成したフィブリルを回収する工程。
[式中、(A)nモチーフは4~27アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列を示し、かつ(A)nモチーフ中の全アミノ酸残基数に対するアラニン残基数が65%以上である。REPは10~200アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列を示す。mは2~300の整数を示す。複数存在する(A)nモチーフは、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。複数存在するREPは、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。] - 前記(B)工程で生じる凝集体中のフィブロイン量が、前記(A)工程で用いたフィブロイン量の0.1~10重量%である、請求項1に記載の製造方法。
- 前記(C)工程が、前記懸濁液を遠心分離し、上清を回収する工程である、請求項1又は2に記載の製造方法。
- 前記カオトロピック剤が尿素、塩酸グアニジウム、ヨウ化ナトリウム及び過塩素酸塩からなる群より選ばれる、請求項1~3のいずれか一項に記載の製造方法。
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