JP7297220B2 - 抗ｈｉｖ活性を有するｃｄ４ミミック化合物 - Google Patents

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Description

本発明は、抗HIV活性を有する新規CD4ミミック化合物に関する。より詳細には、本発明は、体内動態が向上したCD4ミミック化合物に関する。
ヒト免疫不全ウイルス（human immunodeficiency virus: HIV）は、後天性免疫不全症候群（acquired immunodeficiency syndrome: AIDS）を引き起こすウイルスとして知られている。HIVの感染経路は、性的接触、輸血または血液製剤による感染、母子感染の3つが主なものであり、空気感染の危険性はない。現在までに全世界で約7490万人がHIVに感染し、そのうち3200万人がAIDSに関連する疾病で死亡している。現在、薬剤を用いた化学療法でAIDSを抑制することには成功しているものの、AIDSの根治は未だ達成されていない。
HIVには、HIV-1及びHIV-2が存在し、さらにHIV-1はA～Kのサブタイプに分類される。HIV-1は西半球、ヨーロッパ、アジア、アフリカ中央部・南部・東部で多くみられ、HIV-2はアフリカ西部で多くみられる。感染例の多いHIV-1に比べHIV-2は感染力が弱く、流行している地域も限定的であるため、抗HIV薬やエイズワクチン開発は主にHIV-1を標的として行われている。
HIV-1はレトロウイルスの一種である。成熟したウイルスは直径100-110 nmの球状であり、2コピーの一本鎖RNAゲノムや逆転写酵素、インテグラーゼなどを含む砲弾型のコア構造を持ち、脂質二重膜と外被タンパク質からなるエンベロープ構造に包まれている。ウイルス粒子の表面には、外被タンパク質であるgp120とgp41が三量体を形成して存在しており、これらは、ヒトCD4陽性T細胞であるヘルパーT細胞やマクロファージ上に存在するCD4、CXCR4、CCR5に対して特異的に結合し、HIVの宿主細胞への侵入において重要な役割を果たしている。
現在、臨床で用いられている抗HIV薬は、「逆転写酵素阻害剤」、「プロテアーゼ阻害剤」、「インテグラーゼ阻害剤」など、HIV特有の酵素の働きを阻害する酵素阻害剤が主になっている。複数の薬剤を組み合わせて投与する多剤併用療法（anti-retroviral therapy: ART）が確立されているが、HIVの細胞への侵入を阻害する侵入阻害剤は少なく、膜融合阻害剤としてエンフュービルタイド（enfuvirtide）、CCR5阻害剤としてマラビロク（maraviroc）が臨床応用されているのみである。しかしながら、これらの薬剤は、ウイルスの増殖を抑制することはできるが、死滅させることはできないため、生涯にわたる定期的な薬剤投与を必要とする。そのため、長期投与による副作用蓄積の危険性、及び高額な治療費が問題となっている。さらに、HIVは容易に変異を起こすため、薬剤耐性ウイルスの出現が大きな問題となっており、またワクチン開発も困難である。
HIV-1の宿主細胞への侵入過程の第一段階は、HIV-1の外被タンパク質gp120と宿主細胞表面タンパク質CD4（第一受容体）の相互作用である。この相互作用に伴い、gp120の構造が大きく変化し、V3ループと呼ばれる領域が露出する。次に、このV3ループと第二受容体（コレセプター、CCR5またはCXCR4）が相互作用することで、gp41が表面に露出し、宿主細胞の膜を貫き、膜融合を経て宿主細胞に侵入する。
2005年、HIV-1の合胞体形成阻害スクリーニングにより、上記侵入を阻害する作用を有する低分子化合物NBD-556が報告された（非特許文献１）。NBD-556はまた、CD4の相互作用部位であるgp120のPhe43-キャビティに結合してgp120の構造変化を誘起することができるため、低分子CD4模倣体(ミミック)化合物として注目された（非特許文献２～４）。しかしながら、NBD-556は、抗HIV活性の低さや細胞毒性の高さ、水溶性の低さなどの問題点があり、NBD-556をリード化合物とした構造活性相関研究が盛んに行われている（非特許文献５～８）。
本発明者等のグループはこれまでに、NBD-556のピペリジン環部位を改変して2つのシクロヘキシル基を有する化合物HAR-171を合成し、この化合物が、NBD-556に比べて細胞毒性が低く、より強力な抗HIV活性を示すことを見出している（非特許文献６）。また、NBD-556のピペリジン環にシクロヘキシル基を1つ導入したモノシクロヘキシル型の化合物で親水性を高めた種々の新規誘導体を設計・合成し、それらの抗HIV活性、細胞毒性、gp120構造変化誘起能の評価、及び統合計算化学システムMolecular Operating Environment (MOE, Chemical Computing Group Inc.) を用いたドッキングシミュレーションによる相互作用様式の予測を行った結果、優れた抗HIV活性を有すると共に、細胞毒性が低いものを取得することができた（特許文献１）。これらの化合物は、HIV侵入機構の途中で露出するV3ループを特異的に認識する中和抗体と併用した場合に相乗的な抗HIV効果をもたらすことも見出された。
上記特許文献１で報告された化合物中で、NBD-556と比較して抗HIV活性が顕著に高く、細胞毒性が大幅に低下したCD4ミミック化合物の一つとして、下記の構造を有するN1-(4-クロロフェニル)-N2-(1-(2-(5-グアニジノバレルアミド)エチル)-2-シクロヘキシルピペリジン-4-イル)オキサルアミド（本明細書中においてYIR-821と記載する）が見出されている。
Figure 0007297220000001
国際公開第2016/190331号公報
Qian, Z. et al., Virology 339, 213-225 (2005) Schon, A. et al., Biochemistry 45, 10973-10980 (2006) Madani, N. et al., Structure 16, 1689-1701 (2008) Hillel, H. et al., Plos Pathogens 5, e1000360 (2009) Yamada, Y. et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 20, 354-358 (2010) Narumi, T. et al., Bioorg. Med. Chem. 19, 6735-6742 (2011) Nguyen, W. et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 22, 7106-7109 (2012) Narumi, T. et al., Bioorg. Med. Chem. 21, 2518-2526 (2013)
上記の通り、本発明者等は、高い抗HIV活性を有すると共に細胞毒性が低く、かつ中和抗体と併用した場合に相乗的な抗HIV活性をもたらすことができるCD4ミミック化合物を報告しているが、更に構造活性相関研究を進めることで、より体内動態が向上した化合物の取得を課題として種々検討してきた。
上記の課題に鑑み、上記YIR-821を親化合物として種々の誘導体を合成し、検討を重ねた結果、本発明者等は、YIR-821に側鎖としてPEG鎖又はアルキル鎖を付加することで、in vitro及びin vivoにおいてYIR-821よりも顕著に長い半減期を有し、従って長期間の効果が持続し得る新規CD4ミミック化合物を取得することに成功し、本発明を完成するに到った。
すなわち、本発明は以下を提供するものである。
１． 下記の一般式(I)：
Figure 0007297220000002
 ［式中、R1はC2H4(OC2H4)n-OCH3、又はCmH2m+1を示し、R2はO又はNHを示し、nは3～25、mは4～22である。］
で示される化合物又はその塩。
２． 下記式：
Figure 0007297220000003
 ［式中、nは3～25である。］
で示される、上記１記載の化合物又はその塩。
３． nが4～23である、上記２記載の化合物又はその塩。
４． 上記１～３のいずれか記載の化合物又はその塩を有効成分として含む、HIV感染阻害剤。
５． 上記４記載のHIV感染阻害剤を含む、HIV感染の治療又は予防のための医薬組成物。
６． 抗-HIV抗体と組み合わせて投与されることを特徴とする、上記４記載のHIV感染阻害剤、又は上記５記載の医薬組成物。
７． 抗-HIV抗体が、HIV-1表面上のV3ループに対して特異的な中和抗体である、上記６記載のHIV感染阻害剤、又は医薬組成物。
本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2019-195967号の開示内容を包含する。
本発明により、高い抗HIV活性を有すると共に細胞毒性が低く、かつ半減期が顕著に延長されたCD4ミミック化合物、及びこれを有効成分として含む新規HIV感染阻害剤を提供することができる。
静脈内注射による投与後のYIR-821の血中濃度変化を示す。 静脈内注射による投与後のTKB-002・2TFAの血中濃度変化を示す。 アルキル鎖を放出するYIR-821誘導体のin vitroにおける経時的分解を示す。 PEG鎖を放出するYIR-821誘導体のin vitroにおける経時的分解を示す。
以下、本発明を詳細に説明する。
上記の通り、本発明は一般式(I)：
Figure 0007297220000004
 ［式中、R1はC2H4(OC2H4)n-OCH3、又はCmH2m+1を示し、R2はO又はNHを示し、nは3～25、mは4～22である。］
で示される化合物又はその塩を提供する。
上記の化合物は、YIR-821の側鎖にPEG鎖又はアルキル鎖を有するYIR-821誘導体である。CD4ミミック化合物として好適な活性を有し、毒性が低く、かつ好適な溶解性を有するものとするためには、PEG鎖長又はアルキル鎖長の範囲が特定の範囲内であることが必要であり、従って、上記の一般式において、PEG鎖を有する誘導体ではnが3～25の範囲内であり、例えば、nは4～23、3～7、3～5、9～13、10～12、21～25、22～24の範囲内であり得る。アルキル鎖を有する誘導体ではmが4～22の範囲内であることが好ましく、例えば、mは5～21、6～20、7～19、8～18の範囲内であり得る。
一実施形態では、本発明の化合物は、PEG鎖を有するものであり、上記の一般式(I)におけるR1がC2H4(OC2H4)n-OCH3であり、R2がNHのものである。この実施形態の化合物は下記の式で示され、PEG鎖を放出する分解反応が生じにくく、より長い半減期をもたらし得る。
Figure 0007297220000005
 ［式中、nは3～25である。］
別の一実施形態では、本発明の化合物は、PEG鎖を有するものであり、上記の一般式(I)におけるR1がC2H4(OC2H4)n-OCH3であり、R2がOのものである。この実施形態の化合物は下記の式で示され、-C(=O)O-基の加水分解によりPEG鎖を放出する反応が比較的早期に生じ得る。
Figure 0007297220000006
 ［式中、nは3～25である。］
一実施形態では、本発明の化合物は、アルキル鎖を有するものであり、上記の一般式(I)におけるR1がCmH2m+1であり、R2がNHのものである。この実施形態の化合物は下記の式で示され、アルキル鎖を放出する分解反応が生じにくく、より長い半減期をもたらし得る。
Figure 0007297220000007
 ［式中、mは4～22である。］
別の一実施形態では、本発明の化合物は、アルキル鎖を有するものであり、上記の一般式(I)におけるR1がCmH2m+1であり、R2がOのものである。この実施形態の化合物は下記の式で示され、-C(=O)O-基の加水分解によりアルキル鎖を放出する反応が比較的早期に生じ得る。
Figure 0007297220000008
 ［式中、mは4～22である。］
本発明の好適な態様では、本発明の化合物は、上記の一般式(I)におけるR1がC2H4(OC2H4)n-OCH3であり、R2がNHであり、かつnが4である、下記の構造を有するものである。本明細書において、下記の化合物をTKB-001と称する。
Figure 0007297220000009
本発明の別の好適な態様では、本発明の化合物は、上記の一般式(I)におけるR1がC2H4(OC2H4)n-OCH3であり、R2がNHであり、かつnが11である、下記の構造を有するものである。本明細書において、下記の化合物をTKB-002と称する。TKB-002は、実施例に示すように血中半減期がYIR-821よりも3.48倍長く、ヒト肝ミクロソームの共存下でも安定であることが見出されている。
Figure 0007297220000010
本発明の更に別の好適な態様では、本発明の化合物は、上記の一般式(I)におけるR1がC2H4(OC2H4)n-OCH3であり、R2がNHであり、かつnが23である、下記の構造を有するものである。本明細書において、下記の化合物をTKB-003と称する。
Figure 0007297220000011
本発明の化合物は、本願明細書の記載、及び当分野において通常用いられる技術を使用して、例えば親化合物であるYIR-821から出発する合成経路により、合成することができるが、合成方法は特に限定するものではない。YIR-821の合成は、限定するものではないが、例えば国際公開第2016/190331号公報の記載に基づいて行うことができる。
本発明の化合物は、ピペリジン環窒素原子及びグアニジノ基の窒素原子のいずれか又は双方の部分で無機又は有機の塩基と塩を形成することができる。塩としては、特に限定するものではないが、製薬上許容される塩が好ましく、例えば塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩、コハク酸塩、フマル酸塩、メシル酸塩、トシル酸塩、臭化水素酸塩、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩等を好適に使用することができる。
本発明の化合物又はその塩は、CD4ミミック化合物として機能し、HIVのgp120のPhe43-キャビティとCD4との結合を競合的に阻害することができる。また、いかなる理論に拘束されるものでもないが、本発明の化合物又はその塩によって引き起こされるgp120の構造変化は、CD4との相互作用によって生じる変化と同一のものではなく、V3ループを露出させるが、その後のコレセプターとの結合は生じさせないため、HIVの宿主細胞への侵入を阻害することができる。従って、本発明は、上記の本発明の化合物又はその塩を有効成分として含むHIV感染阻害剤を提供する。
本発明の化合物又はその塩は、そのままHIV感染阻害剤として投与することも可能であるが、この有効成分に加えて、医薬組成物において通常使用される担体、賦形剤、防腐剤、酸化安定剤等を適宜添加して、医薬組成物として投与することもできる。従って、本発明はまた、上記のHIV感染阻害剤を含む、HIV感染の治療又は予防のための医薬組成物を提供する。
本発明のHIV感染阻害剤及び医薬組成物は、経口投与及び非経口投与が可能であり、例えば経口；静脈内、筋肉内、経皮、皮下、皮内、腹腔内への注射もしくは注入による投与等が挙げられるが、特に限定するものではない。投与経路は、好ましくは静脈内、筋肉内又は皮下注射であり得る。当業者であれば、本発明のHIV感染阻害剤及び医薬組成物の投与のための好適な投与経路を適宜決定することができる。
本発明のHIV感染阻害剤のヒトへの投与量は、投与対象の患者の年齢、体重、症状等に依存し、特に限定されないが、例えば1日当たり100μg/kg体重～100mg/kg体重、好適には500μg/kg体重～50mg/kg体重、より好適には1mg/kg～30mg/kg体重の範囲とすることができる。
更に、本発明のHIV感染阻害剤は、単独でも使用可能であるが、異なるメカニズムによる阻害作用を有する他の抗HIV薬剤と併用することも意図される。他の抗HIV薬剤としては、特に限定するものではないが、逆転写酵素阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、インテグラーゼ阻害剤等が挙げられる。限定することを意図するものではないが、例えば逆転写酵素阻害剤として、ジドブジン、ラミブジン、アバカビル、テノホビル、エムトリシタビン、エファビレンツ等、プロテアーゼ阻害剤として、アタザナビル、ダルナビル、リトナビル等、インテグラーゼ阻害剤として、ラルテグラビル等を挙げることができる。抗HIV感染阻害剤と、他の抗HIV薬剤とは、同一又は異なる医薬組成物中に含めることができる。本発明のHIV感染阻害剤と、他の抗HIV薬剤との投与は、同時であっても、連続的であっても、あるいは全く異なっていても良い。また、本発明のHIV感染阻害剤と、他の抗HIV薬剤との投与経路は同じであっても、又は異なっていても良い。
また、本発明のHIV感染阻害剤は、HIVに対して特異的な抗体との併用も意図される。抗体としては、特に限定するものではないが、本発明のHIV感染阻害剤が、HIVとの結合によってgp120に構造変化を引き起こし、V3ループを露出させることができるため、中和抗体、特にHIVのV3ループに対して特異的な中和モノクローナル抗体及びその機能性断片を使用することが好ましい。
抗HIVモノクローナル抗体については、当分野において種々研究開発が進んでおり、HIVのV3ループに対するモノクローナル抗体の代表として、現在臨床試験が進行中であるKD-247（一般名：スビズマブ(suvizumab)）を挙げることができる。抗HIVモノクローナル抗体の詳細は、例えばJournal of Virology, June 2006, p.5552-5562；Journal of Virology, June 2006, p.5563-5570；化血研所報 黎明, 23: 42-54 (2014)；特許第2989862号及び特許第5526386号等が挙げられ、KD-247のVH及びVL領域のアミノ酸配列も上記のJournal of Virology, June 2006, p.5552-5562に開示されている。当業者であれば、これらの情報に基づいて、KD-247抗体及び他の抗HIV抗体を取得することが可能である。
従って、本願発明は、抗HIV抗体と組み合わせて投与されることを特徴とする、上記のHIV感染阻害剤、又は上記の医薬組成物を提供する。限定するものではないが、好適な実施形態では、抗-HIV抗体は、HIV-1表面上のV3ループに対して特異的な中和抗体である。
本発明のHIV感染阻害剤と、抗HIV抗体との投与は、同時であっても、連続的であっても、あるいは全く異なっていても良い。また、本発明のHIV感染阻害剤と、抗HIV抗体との投与経路は同じであっても、又は異なっていても良い。
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
［参考例１ YIR-821の血中半減期の測定］
マカクザル（MM616、体重8.00kg）に対して、192mg（10.1mg/mL）のYIR-821を静脈内注射し、21分、39分、63分、91分、98分、113分、143分、201分、328分、453分後に採血し、HPLCにより血中濃度を測定した。
HPLC条件は以下の通りである。
測定装置：JASCO PU-2089 plus（JASCO Corporation, Ltd.）
カラム：Cosmosil 5C18-ARIIカラム（4.6×250mm, Nacalai Tesque, Inc.）
溶媒Ａ：0.1％(v/v)TFA含有H2O
溶媒Ｂ：0.1％(v/v)TFA含有CH3CN
勾配：溶媒Ａ中20-50％溶媒Ｂ、30分間
流速：1cm3/分
検出：260nmのUVによる検出
その結果、YIR-821の血中濃度は図１に示すように推移し、血中半減期は31.0分であることが算出された。
［実施例１ 本発明の化合物の合成１］
以下のステップの合成スキームにより、PEG鎖を有する本発明の化合物を合成した。
Figure 0007297220000012
化合物１（13.0 g, 20.0 mmol）のMeOH（67 mL）溶液に、0℃でSOCl2（1.6 mL, 22 mmol）を添加した。反応混合液を室温で17時間撹拌した後、混合液を減圧下で濃縮して粗混合物を白色粉末として得た。CH2Cl2（219 mL）中の粗混合物にピペリジン（9.32 g, 109.5 mmol）を添加した。反応混合液を室温で2時間撹拌した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（CHCl3/MeOH = 10/1）にて精製し、化合物３（メチルNω-((2,2,4,6,7-ペンタメチル-2,3-ジヒドロベンゾフラン-5-イル)スルホニル)-L-アルギニネート）を白色粉末として得た（7.61 g, 収率87％）。
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 1.45 (s, 6H), 1.59-1.66 (m, 2H), 1.79-1.82 (m,1H), 1.87 (s, 3H), 2.09 (s, 3H), 2.51 (s, 3H), 2.57 (s, 3H), 2.95 (s, 2H), 3.16-3.21(m, 2H), 3.48-3.51 (m, 1H), 3.69 (s, 3H), 6.22 (br, 2H), 6.31 (br, 1H); 13C NMR (500 MHz, CDCl3) δ 12.6, 18.1, 19.4, 25.9, 28.8, 31.5, 41.1, 43.5, 51.0, 52.4, 54.1, 86.6, 117.7, 124.8, 132.5, 133.3, 138.6, 156.4, 159.0, 176.1; [α]D= +4.90 (c 1.02, CHCl3); HRMS (ESI), C20H33N4O5S+[M+H]+m/z：計算値441.2166, 実測値441.2165。
Figure 0007297220000013
化合物３（6.81 g, 15.5 mmol）のCH2Cl2（155 mL）溶液に、室温で無水コハク酸（1.64 g, 16.3 mmol）及びEt3N（2.38 mL, 17.1 mol）を添加した。反応混合液を室温で17時間撹拌した後、混合液を減圧下で濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（CHCl3/MeOH = 5/1）にて精製し、化合物４（(S)-4-((1-メトキシ-1-オキソ-5-(3-((2,2,4,6,7-ペンタメチル-2,3-ジヒドロベンゾフラン-5-イル)スルホニル)グアニジノ)ペンタン-2-イル)アミノ)-4-オキソブタン酸）を白色粉末として得た(5.04 g, 9.32 mmol, 収率60％)。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 1.46 (s, 7H), 1.58 (b, 2H), 1.68-1.75 (m, 1H), 1.89-1.91 (m, 1H), 2.09 (s, 3H), 2.44-2.48 (m, 4H), 2.55-2.66 (m, 6H) 2.78-2.85 (m, 1H), 2.95 (s, 2H), 3.18 (b, 2H), 3.73 (s, 3H), 4.60 (b, 1H), 6.36(b, 2H), 6.91 (b, 1H); 13C NMR (500 MHz, CDCl3) δ 12.8, 18.2, 19.6, 25.1, 28.9, 29.8, 31.0, 41.0 (2C), 43.5, 52.0, 52.1, 52.2, 53.0, 86.9, 118.0, 125.1, 132.9, 138.9, 156.6, 159.4, 172.8, 173.1, 176.5; [α]D= +22.7 (c 1.02, CHCl3); HRMS (ESI), C24H35N4O8S-[M-H]-m/z：計算値539.2181, 実測値 539.2179。
Figure 0007297220000014
化合物４（540 mg, 1 mmol）のCHCl3（10 mL）溶液に、HOBt・H2O（203 mg, 1.5 mmol）、EDCI・H2O（288 mg, 1.5 mmol）、m-PEG4-アミン・HCl（288 mg, 1 mmol）、及びDIPEA（697μL, 4 mmol）を0℃で添加した。反応混合液を室温で一晩撹拌した後、飽和NH4Cl水溶液を添加して反応を停止させ、CH2Cl2で抽出した後、有機相をMgSO4上で濃縮乾固させた。THF（10 mL）中の粗混合物に室温で1M LiOH水溶液（2 mL）を添加した。反応混合液を室温で30分間撹拌した後、混合液をろ過し、1N HCl水溶液を添加してクエンチし、CHCl3で抽出した。有機相をMgSO4上で乾燥させ、減圧下で濃縮して化合物６（N2-(18-オキソ-2,5,8,11,14-ペンタオキサ-17-アザヘニコサン-21-オイル)-Nω-((2,2,4,6,7-ペンタメチル-2,3-ジヒドロベンゾフラン-5-イル)スルホニル)-L-アルギニン）を得た。
Figure 0007297220000015
化合物７（49.7 mg, 127.8μmol）のTHF（1.3 mL）溶液に、0℃でLiAlH4（16.0 mg, 421.7μmol）を添加した。混合液を室温で1.5時間撹拌した後、飽和酒石酸カリウムナトリウム水溶液を0℃で添加し、1M NaOH水溶液（pH = 13～14）で塩基性化した。CHCl3で抽出し、有機相をMgSO4上で乾燥し、減圧下で濃縮した。粗混合物をCH2Cl2（1 mL）に溶解し、HOBt・H2O (10.4 mg, 71.1μmol)、EDCI・H2O (13.6 mg, 71.1μmol)、上記の化合物６（49.1 mg）、及びDIPEA（22μL, 129.2μmol）を0℃で添加した。反応混合液を室温で16時間撹拌した後、飽和NaHCO3水溶液を添加して反応を停止させ、CHCl3で抽出した後、有機相をMgSO4上で乾燥させた。粗生成物を0℃でTFA（540μL）/H2O（30μL）に溶解した。混合液を室温で1時間撹拌した後、飽和NaHCO3水溶液でクエンチし、CHCl3で抽出した。有機相をMgSO4上で乾燥した。減圧下で濃縮した後、HPLCで精製して、化合物１０のトリフルオロ酢酸塩（N1-((2S)-1-((2-(4-(2-((4-クロロフェニル)アミノ)-2-オキソアセトアミド)-1-アザスピロ[5.5]ウンデカン-1-イル)エチル)アミノ)-5-グアニジノ-1-オキソペンタン-2-イル)-N4-(2,5,8,11,14-ペンタオキサヘキサデカン-16-イル)スクシンアミド・2TFA (TKB-001 テトラフルオロ酢酸塩)）を無色の油として得た（34.3 mg, 30.9μmol, 収率24％ (3 ステップ)）; tR = 11.7 分 (A中のBの線形勾配, 15分間で30～50％); HRMS (ESI), C54H96FN10O17 +[M+H]+m/z 計算値 882.4850 実測値 882.4852。
［実施例２ 本発明の化合物の合成２］
実施例１と同様にして、PEG鎖長の異なる化合物を合成した。
Figure 0007297220000016
化合物４（1.06 g, 1.97 mmol）のCHCl3（17.9 mL）溶液に、HOBt・H2O（301.7 mg, 1.97 mmol）、EDCI・H2O（0.378 g, 1.97 mmol）、m-PEG11-アミン（1.00 g, 1.79 mmol）、及びDIPEA（0.61 mL, 3.58 mmol）を0℃で添加した。反応混合液を室温で一晩撹拌した後、飽和NH4Cl水溶液を添加して反応を停止させ、CH2Cl2で抽出した後、有機相をMgSO4上で濃縮乾固させた。THF（19.7mL）中の粗混合物に1N LiOH水溶液（0.39 mL）を室温で添加した。反応混合液を室温で30分間撹拌した後、混合液をろ過し、1N HCl水溶液を添加してクエンチし、CHCl3で抽出した。有機相をMgSO4上で乾燥させ、減圧下で濃縮して化合物１２（N2-(39-オキソ-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35-ドデカオキサ-38-アザドテトラコンタン-42-オイル)-Nω-((2,2,4,6,7-ペンタメチル-2,3-ジヒドロベンゾフラン-5-イル)スルホニル)-L-アルギニン）を得た。
Figure 0007297220000017
実施例１と同様にして、上記化合物１４のトリフルオロ酢酸塩（N1-((2S)-1-((2-(4-(2-((4-クロロフェニル)アミノ)-2-オキソアセトアミド)-1-アザスピロ[5.5]ウンデカン-1-イル)エチル)アミノ)-5-グアニジノ-1-オキソペンタン-2-イル)-N4-(2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35-ドデカオキサヘプタトリアコンタン-37-イル)スクシンアミド・2TFA (TKB-002 トリフルオロ酢酸塩)）を無色の油として得た。
tR = 15.3 分 (A中のBの線形勾配, 15分間で30～50%); HRMS (ESI), C55H97ClN9O17 +[M+H]+m/z 計算値 1190.6685 実測値 1190.6688。
［実施例３ 本発明の化合物の合成３］
実施例１と同様にして、PEG鎖長の異なる化合物を合成した。
Figure 0007297220000018
化合物４（49 mg, 91.9μmol）のCH2Cl2（91μL）溶液に、m-PEG23-アミン（100 mg, 91.9μmol）、EDCI・H2O（19.4 mg, 101μmol）、HOBt・H2O（13.7 mg, 101μmmol）、及びDIPEA（32μL, 184μmol）を0℃で添加した。反応混合液を室温で一晩撹拌した後、飽和NH4Cl水溶液で反応を停止させ、CH2Cl2で抽出した後、有機相をMgSO4上で濃縮乾固させた。THF（426μL）中の粗混合物に、1N LiOH水溶液（92.2μL）を室温で添加した。反応混合液を室温で30分間撹拌した後、混合液をろ過し、NH4Cl水溶液でクエンチし、CHCl3で抽出した。有機相をMgSO4上で濃縮乾固させて、化合物１６（N2-(75-オキソ-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-テトラコサオキサ-74-アザオクタヘプタコンタン-78-オイル)-Nω-((2,2,4,6,7-ペンタメチル-2,3-ジヒドロベンゾフラン-5-イル)スルホニル)-L-アルギニン）を得た。
Figure 0007297220000019
実施例１と同様にして、上記化合物１８のトリフルオロ酢酸塩（N1-((2S)-1-((2-(4-(2-((4-クロロフェニル)アミノ)-2-オキソアセトアミド)-1-アザスピロ[5.5]ウンデカン-1-イル)エチル)アミノ)-5-グアニジノ-1-オキソペンタン-2-イル)-N4-(2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-テトラコサオキサトリヘプタコンタン-73-イル)スクシンアミド・2TFA（TKB-003テトラフルオロ酢酸塩）を無色の油として得た。
tR = 16.8 分 (A中のBの線形勾配, 15分間で30～50%); HRMS (ESI), C79H145ClN9O29 +[M+H]+m/Z 計算値 1718.9831 実測値 1718.9830。
［実施例４ 本発明の化合物の血中半減期の測定］
参考例１と同様にして、マカクザル（MM616、体重8.78kg）に対して、実施例２で取得したTKB-002のトリフルオロ酢酸塩23.4μmol（33.2 mg/20 mL）を静脈内注射し、注射前、投与中、投与後10分、37分、1時間、2.5時間、4.5時間、6.5時間、24時間の時点で採血し、参考例１と同じ条件を用いたHPLCにより血中濃度を測定した。
その結果、TKB-002トリフルオロ酢酸塩の血中濃度は図２に示すように推移し、血中半減期は107.9分であることが算出され、YIR-821と比較して半減期が3.48倍であることが確認された。
［実施例５ 本発明の化合物の合成４］
以下の合成スキームにより、アルキル鎖を有する本発明の化合物を合成した。
Figure 0007297220000020
化合物１９（2.4 g, 10 mmol）のDCM（50 mL）溶液に、無水コハク酸（1.1 g, 11 mmol）及びEt3N（2.77 mL, 20 mmol）を室温で添加した。反応混合液を室温で３時間攪拌した後、減圧下で濃縮した。残渣をアセトンから結晶化させて化合物２０（4-(ヘキサデシルアミノ)-4-オキソブタン酸、3.34 g、収率98％）を固体として得た。
1H-NMR (500 MHz, MeOH) δ0.80-0.83 (t, 3H), 1.20-1.22 (m, 26H), 1.39-1.42 (m, 2H), 2.35-2.37 (t, 2H), 2.48-2.50 (t, 2H), 3.05-3.08 (t, 2H); 13C NMR (125 MHz, MeOH) δ 14.4, 23.7, 28.0, 30.4(12C), 31.6, 33.1, 40.5, 174.4, 176.4; HRMS (ESI), C20H38NO3[M-H]- m/z 計算値 340.2857, 実測値 340.2853。
Figure 0007297220000021
化合物２０（329 mg, 0.963 mmol）及びN-ヒドロキシスクシンイミド（222 mg, 1.92 mmol）をDME（6.4 mL）及びCH2Cl2（6.4 mL）中に添加した撹拌溶液に、室温でEDCI・HCl（308 mg, 1.61 mmol）を添加した。2時間後、反応混合液をEtOAcで希釈し、水、1% HCl、5% NaHCO3水溶液、H2O、及び食塩水で順次洗浄した。次いで、有機相を乾燥し（Na2SO4）、濃縮して活性化エステルを得た。中間化合物をMeCN（6.42 mL）に溶解し、DMAP（588 mg, 4.81 mmol）及び化合物２２（460 mg, 1.44 mmol）を室温で添加した。反応混合液を15時間撹拌した後、0℃のHCl（0.1 M）でpH 2まで酸性化した。溶液をEtOAcで抽出し、抽出物を合わせてH2O及び食塩水で洗浄した。混合液を乾燥し（Na2SO4）、濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー（1% AcOH中CH3Cl/MeOH = 30/1）で精製して化合物２３（2-((4-(ヘキサデシルアミノ)-4-オキソブタノイル)オキシ)-5-((4-ニトロフェニル)スルホンアミド)ペンタン酸）（355 mg, 収率57％）を固体として得た。
1H-NMR (500 MHz, MeOH) δ0.84-0.87 (t, 3H), 1.22 (m, 26H), 1.44-1.46 (m, 2H), 1.64-1.70 (m, 2H), 1.87-1.93 (m, 2H), 2.48-2.52 (m, 2H), 2.68-2.70 (m, 2H), 3.09-3.13 (m, 2H), 3.16-3.20 (m, 2H), 5.00-5.03 (m, 1H), 5.78 (br, 1H), 6.13 (br, 1H), 7.72-7.74 (m, 2H), 7.82-7.84 (m, 1H), 8.09-8.10 (m,1H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 14.0, 22.6, 26.8, 27.8, 29.2, 29.5(12C), 30.9, 31.8, 39.8, 43.1, 71.6, 125.2, 128.2, 129.0, 130.9, 132.8, 133.6, 148.0, 171.8, 172.4; HRMS (ESI), C31H52N3O9S [M+H]+ m/z 計算値 640.3273, 実測値 640.3275。
Figure 0007297220000022
DMF（2.82 mL）中の化合物２３（543 mg, 0.846 mmol）の溶液に、HOBt・H2O（216 mg, 1.41 mmol）、EDCI・HCl（270 mg, 1.41 mmol）、化合物８（111 mg, 0.282 mmol）及びNEt3（0.273 mL, 1.97 mmol）を0℃で添加した。反応混合液を室温で12時間撹拌した後、飽和NaHCO3水溶液を0℃で添加してクエンチし、CHCl3で抽出した。有機相をNa2SO4上で乾燥し、次いで減圧下で濃縮し、カラムクロマトグラフィー（CHCl3/MeOH = 10/1 ～ 6/1）で精製して化合物２４（1-((2-(4-(2-((4-クロロフェニル)アミノ)-2-オキソアセトアミド)-1-アザスピロ[5.5]ウンデカン-1-イル)エチル)アミノ)-5-((4-ニトロフェニル)スルホンアミド)-1-オキソペンタン-2-イル 4-(ヘキサデシルアミノ)-4-オキソブタノエート）（116.5 mg, 収率41％）を固体として得た。
1H-NMR (500 MHz, MeOH) δ0.84-0.87 (t, 3H), 1.10-1.14 (m, 3H), 1.23 (m, 28H), 1.34-1.65 (m, 12H), 1.88-1.93 (m, 4H), 2.13-2.34 (m, 3H), 2.53-2.80 (m, 6H), 2.94-3.00 (m, 2H), 3.09 (m, 2H), 3.14-3.37 (m, 4H), 3.93-3.98 (m, 1H), 5.20-5.22 (m, 1H), 5.70-5.84 (m, 2H), 7.29-7.31 (m, 2H), 7.57-7.60 (m, 2H), 7.71-7.73 (m, 2H), 7.82-7.84 (m, 1H), 8.08-8.11 (m, 1H), 9.36 (br, 1H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 14.1, 22.2, 22.6, 24.9, 25.1, 26.0, 26.9, 28.4, 28.6, 29.6(12C), 30.9, 31.4, 31.8, 37.4, 37.7, 38.0, 39.8, 43.1, 44.5, 45.2, 46.1, 46.3, 56.5, 72.9, 120.9(2C), 125.2(2C), 128.1, 129.0, 131.0, 132.7, 133.5, 135.0, 148.0, 157.5, 158.9, 169.1, 171.0, 171.7; HRMS (ESI), C51H79ClN7O10S [M+H]+ m/z 計算値 1016.5292, 実測値 1016.5292。
Figure 0007297220000023
MeCN（0.64 mL）中の化合物２４（65.0 mg, 0.064 mmol）の溶液に、PhSH（0.014 mL, 0.14 mmol）及び i-Pr2NEt（0.023 mL, 0.14 mmol）を室温で添加した。反応混合液を室温で43時間撹拌し、次いで減圧下で濃縮し、カラムクロマトグラフィー（CHCl3/MeOH = 10/1～6/1）で精製して化合物２５（5-アミノ-1-((2-(4-(2-((4-クロロフェニル)アミノ)-2-オキソアセトアミド)-1-アザスピロ[5.5]ウンデカン-1-イル)エチル)アミノ)-1-オキソペンタン-2-イル 4-(ヘキサデシルアミノ)-4-オキソブタノエート）（38.5 mg, 収率72％）を白色粉末として得た。
1H-NMR (500 MHz, MeOH) δ0.84-0.87 (t, 3H), 1.10-1.13 (m, 4H), 1.23 (m, 28H), 1.45-1.65 (m, 10H), 1.86-1.99 (m, 5H), 2.14-2.31 (m, 2H), 2.44-2.86 (m, 7H), 2.98-3.01 (m, 1H), 3.14-3.36 (m, 4H), 3.97 (m, 1H), 5.22 (m, 1H), 6.05 (br, 2H), 7.29-7.31 (m, 2H), 7.43 (m,1H), 7.57-7.59 (m, 2H), 9.39 (br, 1H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 14.1, 22.2, 22.6, 24.0, 25.2, 26.0, 27.0, 28.7, 29.3, 29.7(12C), 31.0, 31.3, 33.9, 37.2, 37.8, 39.8, 44.4, 45.3, 46.2, 46.5, 56.8, 70.5, 72.9, 120.9(2C), 129.1(2C), 130.2, 135.0, 157.6, 159.0, 169.5, 171.3, 171.7; HRMS (ESI), C45H76ClN6O6[M+H]+m/z 計算値831.5509, 実測値 831.5505。
Figure 0007297220000024
DMF（0.96 mL）中の化合物２５（39.9 mg, 0.048 mmol）の溶液に、i-Pr2NEt（0.01 mL, 0.059 mmol）及び1H-ピラゾール-1-カルボキシアミジン塩酸塩（7.7 mg, 0.053 mmol）を室温で添加した。反応混合液を室温で45時間撹拌し、次いで減圧下で濃縮し、HPLCで精製して化合物２６のトリフルオロ酢酸塩（1-((2-(4-(2-((4-クロロフェニル)アミノ)-2-オキソアセトアミド)-1-アザスピロ[5.5]ウンデカン-1-イル)エチル)アミノ)-5-グアニジノ-1-オキソペンタン-2-イル 4-(ヘキサデシルアミノ)-4-オキソブタノエート）を白色粉末として得た（36.7 mg, 収率88％）。化合物２６をYIS-527のトリフルオロ酢酸塩と命名した。化合物YIS-527は、本明細書における一般式(I)においてR1がC16H33であり（R1はCmH2m+1を示し、mは16である）、R2がOである、アルキル鎖を有する化合物である。
1H-NMR (500 MHz, MeOH) δ0.87-0.90 (t, 3H), 1.26 (m, 26H), 1.48 (m, 3H), 1.54-1.99 (m, 15H), 2.17-2.23 (m, 2H), 2.56-2.78 (m, 5H), 2.91-2.93 (m, 1H), 3.13-3.23 (m, 4H), 3.38 (m, 2H), 3.58-3.78 (m, 4H), 4.16 (m, 1H), 5.07 (m, 1H), 7.33-7.35 (m, 2H), 7.72-7.74 (m, 2H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ14.4, 18.4, 22.4, 22.7, 23.7, 25.0, 25.7, 28.1, 29.7, 30.3(12C), 31.0, 33.1, 34.9, 36.8, 37.8, 40.6, 41.8, 42.8, 49.8, 51.4, 58.3, 74.6, 79.5, 122.9(2C), 129.9(2C), 131.1, 137.4, 158.7, 159.4, 161.4, 162.3, 174.1, 175.1; HRMS (ESI), C46H78ClN8O6[M+H]+ m/z 計算値 873.5727, 実測値 873.5724。
［実施例６ 本発明の化合物の合成５］
実施例５と同様にして、PEG鎖を有する本発明の化合物を合成した。
Figure 0007297220000025
化合物２８（2-(2-(2-メトキシエトキシ)エトキシ)エチル 4-メチルベンゼンスルホネート）は化合物２７から以前に報告されたようにして合成した（Sheik, DA.等, J. Am. Chem. Soc. 9, 1829-1836 (2015)）。
Figure 0007297220000026
化合物２９（2,5,8,11,14-ペンタオキサヘキサデカン-16-オール）は化合物２８から以前に報告されたようにして合成した（Zhao, B.等, Macromolecules. 38, 9509-9517 (2005)）。
Figure 0007297220000027
化合物３０（2,5,8,11,14-ペンタオキサヘキサデカン-16-イル 4-メチルベンゼンスルホネート）は化合物２９から以前に報告されたようにして合成した（Wolfe, AL.等, J. Med. Chem. 56, 6845-6857 (2013)）。
Figure 0007297220000028
DMF（2 mL）中の化合物３０（813 mg, 2 mmol）の撹拌溶液中に、NaN3（308 mg, 1.61 mmol）を室温で添加した。反応混合液を80℃で11.5時間撹拌し、次いで減圧下で濃縮した。沈殿物をろ取して化合物３１（16-アジド-2,5,8,11,14-ペンタオキサヘキサデカン）（355 mg, 収率57％）を固体として得た。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 3.37-3.40 (m, 5H), 3.53-3.56 (m, 2H), 3.63-3.68 (m, 16H; 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ50.7, 59.0, 70.0, 70.6(7C), 71.9; HRMS (ESI), C11H23N3NaO5[M+H]+m/z 計算値300.1530, 実測値 300.1526。
Figure 0007297220000029
化合物３２（2,5,8,11,14-ペンタオキサヘキサデカン-16-アミン）は化合物３１から以前に報告されたようにして合成した（Wolfe, AL.等, J. Med. Chem. 56, 6845-6857 (2013)）。
Figure 0007297220000030
DCM（50 mL）中の化合物３２（2.4 g, 10 mmol）の溶液に、無水コハク酸（1.1 g, 11 mmol）及びEt3N（2.77 mL, 20 mmol）を室温で添加した。反応混合液を室温で3時間撹拌し、次いで減圧下で濃縮した。残渣をアセトンから結晶化して化合物３３（18-オキソ-2,5,8,11,14-ペンタオキサ-17-アザヘニコサン-21-オイックアシッド）（3.34 g, 収率98%）を黄色油として得た。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 2.53-2.56 (t, 2H), 2.65-2.68 (t, 2H), 3.37 (s, 3H), 3.43-3.46 (m, 2H), 3.53-3.70 (m, 18H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 28.7, 30.9, 39.5, 58.9, 70.2, 70.4(7C), 71.8, 172.6, 172.7; HRMS (ESI), C15H30N7O8[M+H]+m/z 計算値 352.1966, 実測値 352.1967。
Figure 0007297220000031
DME（16.7 mL）及びCH2Cl2（16.7 mL）中の化合物３３（1.05 g, 2.5 mmol）及びN-ヒドロキシスクシンイミド（575 mg, 5 mmol）の撹拌溶液に、EDCI・HCl（800 mg, 4.175 mmol）を室温で添加した。2時間後、反応混合液をEtOAcで希釈し、水、1％ HCl、5％ NaHCO3水溶液、H2O、及び食塩水で洗浄した。次いで有機相を乾燥し（Na2SO4）、濃縮して活性化エステルを得た。中間体をMeCN（20 mL）に溶解し、DMAP（1.83 g, 15 mmol）及び化合物２２（1.43 g, 4.5 mmol）を室温で添加した。反応混合液を12時間撹拌し、次いで0℃でHCl（0.1 M）によりpH 2まで酸性化した。溶液をEtOAcで抽出し、抽出物を合わせてH2O及び食塩水で洗浄した。混合物を乾燥し（Na2SO4）、濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー（1％ AcOH中CH3Cl/MeOH = 30/1）で精製して化合物３５（2-((4-(ヘキサデシルアミノ)-4-オキソブタノイル)オキシ)-5-((4-ニトロフェニル)スルホンアミド)ペンタン酸）（36.3 mg, 収率2％）を黄色油として得た。
1H-NMR (500 MHz, MeOH) δ1.65-1.72 (m, 2H), 1.71-1.98 (m, 2H), 2.61-2.64 (m, 2H), 2.68-2.78 (m, 2H), 3.11-3.15 (m, 2H), 3.34 (s, 3H), 3.45-3.68 (m, 20H), 5.01-5.03 (m, 1H), 5.58 (br,1H), 7.37 (br, 1H), 7.74-7.76 (m, 2H), 7.84-7.86 (m, 1H), 8.10-8.11 (m, 1H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ25.3, 27.7, 29.8, 30.9, 39.8, 43.0, 58.7, 69.2, 69.7(7C), 71.5, 71.9, 125.4, 131.0, 132.9, 133.4, 133.7, 148.0, 172.2, 172.4, 174.1; HRMS (ESI), C26H42N3O14S [M-H]- m/z 計算値 650.2236, 実測値 650.2233。
Figure 0007297220000032
DMF（0.51 mL）中の化合物３５（99.0 mg, 0.152 mmol）の溶液に、HOBt・H2O（38.8 mg, 0.25 mmol）、EDCI・HCl（48.5 mg, 0.25 mmol）、化合物８（20 mg, 0.05 mmol）及びNEt3（0.026 mL, 0.15 mmol）を0℃で添加した。反応混合液を室温で12時間攪拌した後、0℃の飽和NaHCO3水溶液でクエンチし、CHCl3で抽出した。有機相をNa2SO4上で乾燥し、次いで減圧下で濃縮し、カラムクロマトグラフィー（CHCl3/MeOH = 10/1～6/1）で精製して化合物３６（1-((2-(4-(2-((4-クロロフェニル)アミノ)-2-オキソアセトアミド)-1-アザスピロ[5.5]ウンデカン-1-イル)エチル)アミノ)-5-((4-ニトロフェニル)スルホンアミド)-1-オキソペンタン-2-イル 18-オキソ-2,5,8,11,14-ペンタオキサ-17-アザヘニコサン-21-オエート）（21.3 mg, 収率41％）を黄色油として得た。
1H-NMR (500 MHz, MeOH) δ1.12-1.43 (m, 9H), 1.60-1.73 (m, 7H), 1.86-1.92 (m, 4H), 2.22-2.36 (m, 2H), 2.58-2.80 (m, 7H), 3.05-3.10 (m, 4H), 3.36 (s, 3H), 3.46-3.72 (m, 20H), 3.95-3.99 (m, 1H), 5.21-5.22 (m, 1H), 7.31-7.32 (m, 2H), 7.57-7.59 (m, 2H), 7.71-7.73 (m, 2H), 7.81-7.84 (m, 1H), 8.10-8.11 (m, 1H), 9.32 (br, 1H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 18.4, 22.1, 22.2, 25.0, 25.1, 25.9, 28.5, 29.6, 30.4, 30.6, 37.4, 39.4, 43.1, 44.3, 50.7, 58.4, 59.0, 69.7(2C), 70.1(7C), 70.4, 71.8, 72.8, 120.9(2C), 125.2(2C), 129.2, 130.3, 131.0, 132.6, 133.4, 133.6, 135.0, 148.0, 157.4, 159.0, 169.4, 171.4, 171.7; HRMS (ESI), C46H69ClN7O15S [M+H]+m/z 計算値 1026.4255, 実測値1026.4251。
Figure 0007297220000033
MeCN（0.21 mL）中の化合物３６（21.3 mg, 0.021 mmol）の溶液に、PhSH（0.005 mL, 0.05 mmol）及びi-Pr2NEt（0.007 mL, 0.04 mmol）を室温で添加した。反応混合液を室温で37時間攪拌し、次いで減圧下で濃縮し、カラムクロマトグラフィー（CHCl3/MeOH = 10/1～6/1）で精製して化合物３７（5-アミノ-1-((2-(4-(2-((4-クロロフェニル)アミノ)-2-オキソアセトアミド)-1-アザスピロ[5.5]ウンデカン-1-イル)エチル)アミノ)-1-オキソペンタン-2-イル 18-オキソ-2,5,8,11,14-ペンタオキサ-17-アザヘニコサン-21-オエート）（24.3 mg, 収率99％）を黄色油として得た。
1H-NMR (500 MHz, MeOH) δ1.11-1.33 (m, 11H), 1.53-1.72 (m, 7H), 1.83-2.01 (m, 4H), 2.18-2.31 (m, 2H), 2.56-3.02 (m, 9H), 3.26 (s, 3H), 3.53-3.65 (m, 20H), 3.95-3.97 (m, 1H), 4.43 (br, 2H), 5.30-5.32 (m, 1H), 7.31-7.33 (m, 2H), 7.57-7.59 (m, 2H), 9.30 (br, 1H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 18.4, 22.2, 22.3, 25.0, 25.2, 26.1, 28.6, 29.6, 30.2, 31.5, 37.3, 39.6, 44.6, 45.5, 46.6, 56.5, 58.9, 69.9(2C), 70.2(7C), 70.4, 71.6, 72.9, 120.9(2C), 129.2(2C), 130.3, 135.0, 157.5, 159.0, 169.5, 170.8, 172.6; HRMS (ESI), C40H66ClN6O11[M+H]+m/z 計算値841.4473, 実測値 841.4476。
Figure 0007297220000034
DMF（0.58 mL）中の化合物３７（24.3 mg, 0.029 mmol）の溶液に、i-Pr2NEt（0.06 mL, 0.035 mmol）及び1H-ピラゾール-1-カルボキシアミジン塩酸塩（4.6 mg, 0.032 mmol）を室温で添加した。反応混合液を室温で18時間撹拌し、次いで減圧下で濃縮し、HPLCで精製して化合物３８（1-((2-(4-(2-((4-クロロフェニル)アミノ)-2-オキソアセトアミド)-1-アザスピロ[5.5]ウンデカン-1-イル)エチル)アミノ)-5-グアニジノ-1-オキソペンタン-2-イル 18-オキソ-2,5,8,11,14-ペンタオキサ-17-アザヘニコサン-21-オエート）のトリフルオロ酢酸塩を黄色油として得た（24.1 mg, 収率45％）。化合物３８をYIS-540のトリフルオロ酢酸塩と命名した。化合物YIS-540は、本明細書における一般式(I)においてR1がC2H4(OC2H4)4-OCH3であり（R1は-C2H4(OC2H4)n-OCH3を示し、nは4である）、R2がOである、PEG鎖を有する化合物である。
1H-NMR (500 MHz, MeOH) δ 1.12-1.26 (m, 3H), 1.42-1.48 (m, 3H), 1.68-2.18 (m, 17H), 2.18-2.31 (m, 2H), 2.68-2.82 (m, 5H), 3.20 (br, 2H), 3.36-3.77 (m, 23H), 4.10 (m, 1H), 5.10 (m, 1H), 7.32-7.34 (m, 2H), 7.57-7.59 (m, 2H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 18.1, 21.2, 21.4, 24.5, 28.1, 28.5, 28.7, 29.3, 29.7, 30.1, 33.4, 35.1, 35.3, 39.3, 39.4, 40.5, 41.7, 50.7, 58.6, 69.7, 69.9, 70.0(7C), 71.4, 72.9, 121.1(2C), 129.3(2C), 130.6, 134.8, 157.0, 159.6, 160.4, 172.2, 173.6; HRMS (ESI), C41H68ClN8O11[M+H]+m/z 計算値883.4691, 実測値 883.4694。
［実施例７ 本発明の化合物の安定性１］
実施例５で得られた化合物（YIS-527）は、アルキル鎖が-C(=O)O-基を介してYIR-821の側鎖に結合しているため、in vitro及びin vivoにおいて加水分解することが想定される。従って、本実施例では、アルキル鎖のin vitroでの放出について測定した。
その結果、37℃、pH7.4のPBS中で、下記の分解反応が観察された。結果を図３に示す。
Figure 0007297220000035
［実施例８ 本発明の化合物の安定性２］
実施例７と同様に、実施例６で得られたPEG鎖が-C(=O)O-基を介してYIR-821の側鎖に結合している化合物（YIS-540）について、PEG鎖のin vitroでの放出を測定した。
その結果、37℃、pH7.4のPBS中で、下記の分解反応が観察された。結果を図４に示す。
Figure 0007297220000036
［実施例９ 活性評価１］
実施例１～３で合成したTKB-001、TKB-002、TKB-003について、抗ウイルス薬の一つであるエファビレンツ（EFV）、NBD-556、及びYIR-821と共に、細胞毒性及び抗HIV活性を評価した。本実施例では、いずれの評価についても、TZM-bl細胞（NIH AIDS Reagent Program (https://www.aidsreagent.org/Index.cfm)から入手）を用いて行った。TZM-bl細胞は、CD4/CCR5/CXCR4を表面に有すると共に、HIV感染によってルシフェラーゼが発現するインジケーター細胞である。この細胞には、HIV-1 LTR配列に連結されたβ-ガラクトシダーゼ遺伝子が組み込まれており、HIV-1に感染すると、感染したHIV-1のtat遺伝子から転写活性化因子Tatが発現され、このTatがLTRのプロモーター領域に作用することでβ-ガラクトシダーゼが発現するように構成されている。そこへ基質を添加することで酵素切断が起こり、ガラクトースとルシフェリンが生成するため、ルシフェラーゼによってルシフェリンが酸化されて発する化学発光量をルミノメーターで検出することで、HIV-1感染細胞数を測定することができる。
1) CC50 （細胞毒性の算出）
各化合物を段階希釈後、TZM-bl細胞を1x104個加え、48時間培養後に回収し、Lucリポーター試薬を添加し、発光量を測定し（試薬名CTG）、CC50値を算出した。
2) IC50 （抗HIV活性の算出）
各化合物を段階希釈後、TZM-bl細胞を1x104cells加え、100TCID50のHIV分離株（KP5mvcR）を添加し、48時間培養後に、細胞を回収し、Lucリポーター試薬を添加し、発光量を測定し、感染抑制率（IC50）を算出した。HIV分離株（KP5mvcR）は、臨床分離株のKP-5(YTA)をPM1 CCR5細胞でMVC存在下に48パッセージして得たMVC耐性KP-5EnvをNL43のベクターに入れて作ったMVC耐性HIVクローンである（Yoshimura K, et al., J. Gen. Virol., 95, 1816-1826, 2014）。
各化合物の結果（CC50、IC50、及びSI（Selectivity index））を下記の表１に示す。
Figure 0007297220000037
表１の結果から明らかな通り、本発明の化合物であるTKB-001、TKB-002、及びTKB-003はいずれも、細胞毒性が低く、かつ高い抗HIV活性を有するため、既存の抗ウイルス薬に匹敵する有効性を有することが実証された。また、SIの結果から、TKB-002が特に安全性が高く、効果が良いことが示唆された。
［実施例１０ 活性評価２］
実施例５及び６で合成したYIS-527及びYIS-540について、実施例９と同様にして細胞毒性及び抗HIV活性を評価した。
下記の表２に、YIS-527及びYIS-540の活性評価結果を対照化合物としてのYIR-821の結果と合わせて示す。
Figure 0007297220000038
表２の結果から明らかな通り、本発明の化合物であるYIS-527及びYIS-540はいずれも、YIR-821と同程度に細胞毒性が低く、かつ高い抗HIV活性を有することが実証された。
［実施例１１ 安定性評価］
実施例２で合成したTKB-002について、生物学的安定性を評価した。
具体的には、TKB-002のトリフルオロ酢酸塩を100 mMのリン酸ナトリウムバッファー（NaPB、pH 7.4）に溶解して0.3 mMの溶液とした。この溶液183μLを、100 mM NaPB（pH 7.4）中20mMのNADPH 2μL、及び20 mg/mLのヒト肝ミクロソーム（Human Microsomes, 50 Donors (ThermoFisher Scientific, cat#: HMMCPL, Lot#: PL050E-A)）5μLと混合した。混合液を37℃で5分間プレインキュベートした後、これに20 mM NADPH溶液10μLを添加し、穏やかに撹拌しながら37℃で60分間インキュベートした。
次いで、200μLの酢酸エチルを添加して反応を停止させ、ボルテックスミキサーで撹拌し、3,000 rpmで5分間遠心分離した。上清をろ過した後、窒素ガスによって酢酸エチルを除去した。
この混合液に0.1％ TFA含有MeCN 50μLを添加し、参考例１、実施例４と同様の条件を用いてHPLCで分析した。
その結果、TKB-002は用いたHPLC条件において保持時間約20分の位置に単一のピークとして検出されたが、ヒト肝ミクロソームと共に60分間インキュベートした後もインキュベーション前と同様のピーク強度を示し、ヒト肝ミクロソームの存在下で非常に安定であることが示された。
本発明のCD4ミミック化合物は、従来報告されている抗ウイルス薬及び本発明者等が先に開発したCD4ミミック化合物と同程度以上の抗HIV活性を有すると共に細胞毒性が低く、かつin vitro及びin vivoにおける半減期が長いものとして提供することができるため、より長期間の作用の持続を期待することができ、従って治療にかかるコストを下げることができる。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (7)

  1. 下記の一般式(I)：
    Figure 0007297220000039
     ［式中、R1はC2H4(OC2H4)n-OCH3、又はCmH2m+1を示し、R2はO又はNHを示し、nは3～25、mは4～22である。］
    で示される化合物又はその塩。
  2. 下記式：
    Figure 0007297220000040
     ［式中、nは3～25である。］
    で示される、請求項１記載の化合物又はその塩。
  3. nが4～23である、請求項２記載の化合物又はその塩。
  4. 請求項１～３のいずれか１項記載の化合物又はその塩を有効成分として含む、HIV感染阻害剤。
  5. 請求項４記載のHIV感染阻害剤を含む、HIV感染の治療又は予防のための医薬組成物。
  6. 抗-HIV抗体と組み合わせて投与されることを特徴とする、請求項４記載のHIV感染阻害剤、又は請求項５記載の医薬組成物。
  7. 抗-HIV抗体が、HIV-1表面上のV3ループに対して特異的な中和抗体である、請求項６記載のHIV感染阻害剤、又は医薬組成物。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006510601A (ja) 2002-09-30 2006-03-30 マウンテン ビュー ファーマシューティカルズ，インコーポレイテッド 抗原性が低下したポリマー結合体、その調製方法および使用方法
WO2016190331A1 (ja) 2015-05-25 2016-12-01 国立大学法人東京医科歯科大学 Ｈｉｖ感染阻害剤

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5458252A (en) 1977-10-18 1979-05-10 Shimano Industrial Co Cool keeping vessel
JP2989862B2 (ja) 1990-07-02 1999-12-13 財団法人化学及血清療法研究所 モノクローナル抗体
JP7034005B2 (ja) 2018-05-10 2022-03-11 株式会社Ｓｃｒｅｅｎホールディングス インクジェット印刷装置

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006510601A (ja) 2002-09-30 2006-03-30 マウンテン ビュー ファーマシューティカルズ，インコーポレイテッド 抗原性が低下したポリマー結合体、その調製方法および使用方法
WO2016190331A1 (ja) 2015-05-25 2016-12-01 国立大学法人東京医科歯科大学 Ｈｉｖ感染阻害剤

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Ali EMILEH et al.，Covalent Conjugation of a Peptide Triazole to HIV-1 gp120 Enables Intramolecular Binding Site Occupancy，Biochemistry，2014年05月19日，Vol. 53，No. 21，pp. 3403-3414，<DOI: 10.1021/bi500136f>
Nami OHASHI et al.，Small-Molecule CD4 Mimics Containing Mono-cyclohexyl Moieties as HIV Entry Inhibitors，ChemMedChem，2016年02月17日，Vol. 11，No. 8，pp. 940-946，<DOI: 10.1002/cmdc.201500590>
池田豊，医薬品開発のためのＰＥＧ材料設計，Drug Delivery System，日本，2016年，Vol. 31, No. 4，pp. 268-274

Also Published As

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