JP7295545B2

JP7295545B2 - アポトーシス誘導剤と癌治療剤

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Publication number: JP7295545B2
Application number: JP2017216740A
Authority: JP
Inventors: 麗子杉浦; 輝恒高崎; 亮介佐藤; 修村岡; 元三田邉
Original assignee: Kinki University
Current assignee: Kinki University
Priority date: 2017-11-09
Filing date: 2017-11-09
Publication date: 2023-06-22
Anticipated expiration: 2037-11-09
Also published as: JP2019085381A

Description

特許法第３０条第２項適用会見場所：一般財団法人大阪科学技術センター（ＯＳＴＥＣ）ビル６０５号室、平成２９年５月９日会見〔刊行物等〕ＧｅｎｅｓｔｏＣｅｌｌｓ、２２巻７号、Ｐ６０８～Ｐ６１８、平成２９年５月９日発行〔刊行物等〕２０１７年５月９日掲載、掲載アドレス：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｂｓｊ．ｊｐ／ｇｔｃ／ＴＯＣ／２２＿０７．ｈｔｍｌｈｔｔｐ：／／ｏｎｌｉｎｅｌｉｂｒａｒｙ．ｗｉｌｅｙ．ｃｏｍ／ｄｏｉ／１０．１１１１／ｇｔｃ．１２４９９／ａｂｓｔｒａｃｔ〔刊行物等〕平成２９年５月９日掲載、掲載アドレス：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｅｗｓ２ｕ．ｎｅｔ／ｒｅｌｅａｓｅｓ／１５３７１３〔刊行物等〕講演会名：基盤研セミナー「酵母モデル生物とケミカルゲノミクスを用いたＭＡＰキナーゼシグナル制御機構の解明と創薬への展開」、平成２９年６月６日開催〔刊行物等〕講演会名：先端ゲノム医療、ゲノム創薬と再生医療、平成２９年６月３０日開催〔刊行物等〕平成２９年７月８日掲載、掲載アドレス：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍａｃｒｏｌｉｄｅ．ｊｐ／２４ｔｈ＿ｍｅｅｔｉｎｇ．ｈｔｍｌ〔刊行物等〕講演会名：先端ゲノム医療、ゲノム創薬と再生医療、平成２９年７月１３日開催〔刊行物等〕講演会名：第２４回マクロライド新作用研究会、平成２９年７月２２日開催〔刊行物等〕近畿大学大学院サイエンスネットワーク２０１７・第７回院生サミット要旨集、第１３４頁、平成２９年９月２日発行〔刊行物等〕講演会名：近畿大学大学院サイエンスネットワーク２０１７・第７回院生サミット、平成２９年９月２日開催〔刊行物等〕ＹｅａｓｔＧｅｎｅｔｉｃｓａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙＮｅｗｓＪＡＰＡＮ、Ｎｏ．５０、平成２９年９月１１日発行〔刊行物等〕集会名：酵母遺伝学フォーラム第５０回研究報告会、平成２９年９月１２日開催〔刊行物等〕講演会名：分子ゲノム薬科学、バイオ・ゲノム薬科学、平成２９年９月１５日開催〔刊行物等〕講演会名：医療イノベーション学、平成２９年１０月５日開催〔刊行物等〕第３５回メディシナルケミストリーシンポジウム講演要旨集、ＩＳＳＮＯ９１９－２１４Ｘ、Ｐ８０（１Ｐ－０１８）、２０１７年１０月４日発行〔刊行物等〕講演会名：第３５回メディシナルケミストリーシンポジウム、平成２９年１０月２５日開催

本発明は、ＥＲＫが恒常的に活性化している細胞のＥＲＫをさらに活性化（過活性化）するアポトーシス誘導剤と、それを用いた癌治療剤を提供するものである。

癌治療剤の開発は非常に重要な課題である。近年の分子標的治療薬は、がん細胞を特異的に活性化している遺伝子産物に焦点をあて、それらの活性を阻害するような抗がん剤の開発が主流である。特にＥＲＫＭＡＰＫシグナル伝達経路は多くのがん細胞で恒常的に活性化されていることから、ＥＲＫシグナルの活性を阻害する薬剤の開発が行われてきた。

例えば、特許文献１は、前立腺癌細胞の増殖が、アンギオテンシンＩＩの刺激により、細胞増殖を制御するＭＡＰｋｉｎａｓｅ（以後「ＭＡＰＫ」とする。）が活性化されることを明らかにし、アンギオテンシンＩＩの刺激を阻害する化合物が前立腺癌細胞の増殖抑制剤として有効であることを示している。

また、特許文献２は、がん遺伝子と相互作用する特定アミノ酸配列を有するタンパク質によって、がん遺伝子の発現を阻害することを開示している。

特開２００４－２２８２号公報（特許第４３９０４４１号）国際公開第２００４／０９３９００号

Ｍａｓｕｋｏ，Ｔ．，Ｓｕｇａｈａｒａ，Ｋ．，Ｋｏｚｏｎｏ，Ｍ．，Ｏｔｓｕｋｉ，Ｓ．，Ａｋｉｙａｍａ，Ｔ．，Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｔ．，Ｔｏｙｏｓｈｉｍａ，Ｋ．＆Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，Ｙ．"ＡＭｕｒｉｎｅＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｙｔｈａｔＲｅｃｏｇｎｉｚｅｓａｎＥｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒＤｏｍａｉｎｏｆｔｈｅＨｕｍａｎｃ－ｅｒｂＢ－２ＰｒｏｔｏｏｎｃｏｇｅｎｅＰｒｏｄｕｃｔ"ＪａｐａｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ（１９８９），８０，１０－１４．Ａｋｉｙａｍａ，Ｔ．，Ｍａｔｓｕｄａ，Ｓ．，Ｎａｍｂａ，Ｙ．，Ｓａｉｔｏ，Ｔ．，Ｔｏｙｏｓｈｉｍａ，Ｋ．＆Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｔ．"Ｔｈｅｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇｐｏｔｅｎｔｉａｌｏｆｔｈｅｃ－ｅｒｂＢ－２ｐｒｏｔｅｉｎｉｓｒｅｇｕｌａｔｅｄｂｙｉｔｓａｕｔｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎａｔｔｈｅｃａｒｂｏｘｙｌ－ｔｅｒｍｉｎａｌｄｏｍａｉｎ"．ＭｏｌｅｃｕｌａｒａｎｄＣｅｌｌｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ（１９９１）１１，８３３－８４２．ＫａｏｒｉＨａｒａ，ＨｉｒｏｓｈｉＫｕｄｏｈ，ＴａｋｅｍｉＥｎｏｍｏｔｏ，ＹｏｓｈｉｙｕｋｉＨａｓｈｉｍｏｔｏ，ａｎｄＴａｋａｓｈｉＭａｓｕｋｏ "ＭａｌｉｇｎａｎｔＴｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆＮＩＨ３Ｔ３ＣｅｌｌｓｂｙＯｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＥａｒｌｙＬｙｍｐｈｏｃｙｔｅＡｃｔｉｖａｔｉｏｎＡｎｔｉｇｅｎＣＤ９８" ＢｉｏｃｈｅｃｉｍａｌａｎｄＢｉｏｐｈｙｓｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈＣｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ（１９９９），２６２，７２０－７２５ＴａｔｓｕｋｉＫｕｎｏｈ，ＷｅｉｘｉａｎｇＷａｎｇ，ＨｉｒｏａｋｉＫｏｂａｙａｓｈｉ，ＤａｉｓｕｋｅＭａｔｓｕｚａｋｉ，ＹｕｋｉＴｏｇｏ，ＭａｓａｈｉｒｏＴｏｋｕｙａｍａ，ＭｉｈｏＨｏｓｏｉ，ＫｏｉｃｈｉＫｏｓｅｋｉ，Ｓｈｕ－ｉｃｈｉＷａｄａ，ＮｏｂｕｏＮａｇａｉ，ＴｏｓｈｉｎｏｂｕＮａｋａｍｕｒａ，ＳｈｉｎｔａｒｏＮｏｍｕｒａ，ＭａｋｏｔｏＨａｓｅｇａｗａ，ＲｙｕｚｏＳａｓａｋｉ，ＴａｍｉｏＭｉｚｕｋａｍｉ" ＨｕｍａｎＤｙｎａｃｔｉｎ－ＡｓｓｏｃｉａｔｅｄＰｒｏｔｅｉｎＴｒａｎｓｆｏｒｍｓＮＩＨ３Ｔ３ＣｅｌｌｓｔｏＧｅｎｅｒａｔｅＨｉｇｈｌｙＶａｓｃｕｌａｒｉｚｅｄＴｕｍｏｒｓｗｉｔｈＷｅａｋＣｅｌｌ－ＣｅｌｌＩｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ"ＰＬＯＳＯＮＥ（Ａｕｇｕｓｔ１８，２０１５）ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０１３５８３６ＶａｎＢｒｏｃｋｌｉｎＭＷ，ｅｔａｌ． "Ｍｉｔｏｇｅｎ－ａｃｔｉｖａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｉｎｄｕｃｅｓｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎｏｆＢｍｆｔｏｐｒｏｍｏｔｅａｐｏｐｔｏｓｉｓｉｎｍｅｌａｎｏｍａ．"ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ２００９Ｍａｒ１；６９（５）：１９８５－９４．Ｂｏｉｓｖｅｒｔ－ＡｄａｍｏＫ，ｅｔａｌ．" Ｍｃｌ－１ｉｓｒｅｑｕｉｒｅｄｆｏｒｍｅｌａｎｏｍａｃｅｌｌｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｔｏａｎｏｉｋｉｓ． "ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ２００９Ａｐｒ；７（４）：５４９－５６．ＧａｇｇｉｏｌｉＣ，ｅｔａｌ． "Ｔｕｍｏｒ－ｄｅｒｉｖｅｄｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎｉｓｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｍｅｌａｎｏｍａｃｅｌｌｉｎｖａｓｉｏｎａｎｄｒｅｇｕｌａｔｅｄｂｙＶ６００ＥＢ－Ｒａｆｓｉｇｎａｌｉｎｇｐａｔｈｗａｙ．" ＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅＤｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ２００７；１２７（２）：４００－１０．

従来のいわゆる分子標的剤は、がん細胞において活性化している遺伝子やその産物の作用を阻害することを目的とするものであった。しかしながら、このような薬剤は、抗がん剤耐性が出現するなど、臨床上重大な課題が多く、その治療効果は十分ではない場合も多かった。

本発明の発明者らは、上記の課題を解決すべく鋭意検討した結果、ＥＲＫＭＡＰＫシグナル伝達経路をさらに活性化させることによりＥＲＫが恒常的に活性化されている細胞（癌細胞を含む）を死滅させることができることを見出し、本発明を完成するに至った。

より具体的に本発明に係るアポトーシス誘導剤は、
リン酸化ＥＲＫが正常の場合と比較して恒常的に多い細胞に対してリン酸化ＥＲＫおよび切断カスパーゼ３をさらに増加させ、前記細胞に選択的にアポトーシスを誘導することを特徴とする。また、それを用いた癌治療剤である。

従来の分子標的治療薬がシグナル伝達経路中の分子や遺伝子の阻害活性により、抗がん作用を期待するのに対して、本発明に係るアポトーシス誘導剤は、がん細胞で既に活性化しているＥＲＫをさらに活性化させ、かつカスパーゼ３の切断を亢進させ、結果細胞のアポトーシスを誘導する。

さらに、本発明に係るアポトーシス誘導剤は、正常細胞におけるリン酸化ＥＲＫを幾分増加させるが、切断カスパーゼ３の量をほとんど増加させない。すなわち、正常細胞に対しては、アポトーシスを誘導しにくく、効果に選択性がある。

多くの癌細胞においてＥＲＫが活性化していることが報告されている。一方、本発明に係るアポトーシス誘導剤の作用機序は、ＥＲＫを活性化させる（リン酸化ＥＲＫの増大）ことで生じるため、癌種を問わず、効果を奏するという効果が期待できる。これは、従来のシグナル伝達経路中の分子や遺伝子活動を阻害することで癌細胞を死滅させようとするアプローチとは、全く逆の発想であり、新たな創薬の指針となるものである。

ＡＣＡ－２８を正常細胞（ＮＨＥＭ）と癌細胞（ＳＫ－ＭＥＬ－２８）に作用させたときのイムノブロッティングの結果を示す図である。正常細胞（ＮＨＥＭ）と癌細胞（ＭｅＷｏ，ＳＫ－ＭＥＬ－２、ＳＫ－ＭＥＬ－２８）の顕微鏡写真および細胞生存率（％）を示すグラフである。ＮＩＨ／３Ｔ３およびＡ４－１５におけるリン酸化ＥＲＫ、総ＥＲＫ１／２、切断カスパーゼ３、α－チューブリンについてのイムノブロッティングの結果を示す図である。図３のリン酸化ＥＲＫの程度を数値化したグラフである。ＡＣＡ－２８を作用させたときの、ＮＩＨ／３Ｔ３およびＡ４－１５の細胞生存率（％）を表すグラフである。ＮＩＨ／３Ｔ３にＣＤ９８ｈｃを過剰発現させた細胞（「ＮＩＨ／３Ｔ３ＣＤ９８ｈｃＯＰ」と記載。）にＡＣＡ－２８を作用させた場合の切断カスパーゼ３の発現状態を示す図である。ＮＩＨ／３Ｔ３に活性化型ＲａｓであるＲａｓＧ１２Ｖを過剰発現させた細胞「ＮＩＨ／３Ｔ３ＥＧＦＰｖＨａｒｖｅｙ－ＲａｓＧ１２ＶＯＰ」と記載。）にＡＣＡ－２８を作用させた場合の切断カスパーゼ３の発現状態を示す図である。ＡＣＡ－２８とＵ０１２６を併用した時のＮＨＥＭとＳＫ－ＭＥＬ－２８および、ＮＩＨ／３Ｔ３とＡ４－１５のイムノブロッティングの結果およびその結果を数値化したグラフである。ＮＨＥＭとＳＫ－ＭＥＬ－２８および、ＮＩＨ／３Ｔ３とＡ４－１５の細胞生存率を表すグラフである。ＡＣＡＧＴ－００７ａを用いたイムノブロッティングの結果を示す図である。ＡＣＡＧＴ－００７ａを用いた時の細胞生存率（％）の結果を示すグラフである。正常細胞としてＨＥＫ２９３Ｆ（胎児腎由来細胞：ＥＣＡＣＣ株番号８５１２０６０２）と、癌細胞としてＡＣＨＮ（ヒト腎腺癌細胞：ＥＣＡＣＣ株番号８８１００５０８）にＡＣＡ－２８を作用させた場合の結果である。

以下に本発明に係るアポトーシス誘導剤およびそれを用いた癌治療剤について説明を行う。なお、以下の説明は本発明の一実施の形態および一実施例についての例示であって、本発明は以下の説明に限定されるものではない。本発明の趣旨を逸脱しない限りにおいて、以下の実施の形態は変更することができる。

また、以下の説明において、ＥＲＫ（細胞外シグナル制御キナーゼ：Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｓｉｇｎａｌ－ＲｅｇｕｌａｔｅｄＫｉｎａｓｅ）の活性化とはＥＲＫがリン酸化することを言い、リン酸化ＥＲＫの量が増大することと同義である。また、カスパーゼ３（Ｃａｓｐａｓｅ３）の活性化とは、カスパーゼ３が切断されることを言い、切断カスパーゼ３の量が増大することと同義である。

本発明に係るアポトーシス誘導剤は、ヒトを含む哺乳類の細胞のうち、ＥＲＫが正常の場合と比較して恒常的に活性化されている細胞（「恒常的ＥＲＫ活性化細胞」とも呼ぶ。）に対して、その細胞のＥＲＫをさらに活性化する（過活性化する）。また、カスパーゼ３の切断も亢進する。カスパーゼ３は、切断されることで、活性化し、重要な細胞内タンパク質を切断・分解することで細胞は死滅する。なお、カスパーゼ３が切断されたものを「切断カスパーゼ３（ＣｌｅａｖｅｄＣａｓｐ．－３）」と呼ぶ。

結果、本発明に係るアポトーシス誘導剤を癌細胞に作用させると、リン酸化ＥＲＫと切断カスパーゼ３の量が、作用させる前よりも増加する。その結果、この細胞は死滅する。ここで、ＥＲＫが活性化されている細胞は、主として癌細胞である。後に示すように、人工的にＥＲＫを活性化させた細胞（癌細胞モデル）に対しても同様の効果を示す。

ここで、「ＥＲＫが正常の場合と比較して恒常的に活性化している」とは、「リン酸化ＥＲＫが正常の場合と比較して恒常的に多い」と同義である。また、「正常の場合と比較して」とは、例えばＥＲＫが恒常的に活性化している癌細胞に対して、癌化されていない（若しくは「癌化していない」）同じ種類の細胞のＥＲＫの活性状況（リン酸化ＥＲＫの量）と比較すると言い換えてもよい。また、ここで「正常」とは、少なくともＥＲＫを含むシグナル伝達経路に変異が生じていない細胞である。

よく知られているように、多くの癌細胞では、恒常的にＥＲＫが活性化されている。ＥＲＫは、ＭＡＰＫ（Ｍｉｔｏｇｅｎ－ａｃｔｉｖａｔｅｄＰｒｏｔｅｉｎＫｉｎａｓｅ）の一種であり、リン酸化して活性化すると細胞核内に作用し、細胞増殖などの機能を制御する。多くの癌細胞は、このシグナル伝達経路の活性及び抑制が制御されていないので、際限なく増殖するとも考えられている。

したがって、癌細胞の増殖を抑制するための手段の１つとして、従来はＥＲＫＭＡＰＫ経路の活性化を阻害することが提案されていた。ＥＲＫＭＡＰＫ経路の活性化は細胞分裂を促す効果があることが分かっているので、増殖（細胞分裂）を抑制するために、ＥＲＫＭＡＰＫ経路の活性化を阻害すればよいというのは、理解しやすい癌細胞の増殖抑制のための方針であると言える。

しかし、今回我々は、癌細胞において活性化しているＥＲＫをさらに活性化（過活性化）させることにより癌細胞がアポトーシスを起こし、死滅することを見出した。

さらに、本発明に係るアポトーシス誘導剤は、正常細胞に対して切断カスパーゼ３の量をほとんど増加させない。したがって、正常細胞にはアポトーシスを誘導しにくい。結果、本発明に係るアポトーシス誘導剤は、ＥＲＫが恒常的に活性化された細胞を特異的に死滅させるという選択能（若しくは選択性）を有するといえる。これは本発明に係るアポトーシス誘導剤が、ＥＲＫが恒常的に活性化された細胞（恒常的ＥＲＫ活性化細胞）に選択的にアポトーシスを誘導すると言ってよい。

つまり、本発明に係る物質は、ＥＲＫが活性化されている細胞、すなわち癌細胞を選択的にアポトーシスさせることができる。これは、従来の癌細胞の増殖抑制の指針とは全く逆の思想であり、極めてユニークなアプローチであると言える。

なお、このアポトーシス誘導剤を含む癌治療剤を得ることができる。本発明にかかる癌治療剤は、上記のアポトーシス誘導剤を含む。この際にアポトーシス誘導剤は、薬学的に許容される塩を含んでもよい。また、アポトーシス誘導剤の効果を阻害しない範囲で、公知の材料を加えることができる。また、注射剤、経口剤といった薬剤の形態も限定されるものではない。

本発明に係るアポトーシス誘導剤は、上記の効果を発揮する化合物であれば、特に限定されるものではない。しかし、現在のところこのような作用を有する化合物として、以下の２つの化合物（ＡＣＡ－２８およびＡＣＡＧＴ－００７ａ）が見出されている。それぞれ構造および製造方法を示す。

（１）４－（Ｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌｏｘｙ）ｂｅｎｚｈｙｄｒｙｌＭｅｔｈｙｌＣａｒｂｏｎａｔｅ：（４－（メトキシカルボニルオキシ）ベンズヒドリルメチルカーボネート、若しくは炭酸４－（メトキシカルボニルオキシ）ベンズヒドリルメチル）。以後「ＡＣＡ－２８」と記す。

４－ヒドロキシベンズヒドロール（８００ｍｇ、４ｍｍｏｌ）の乾燥ピリジン溶液（２ｍＬ）に、０℃にてクロロギ酸メチル（０．７７ｍＬ、９．９ｍｍｏｌ）を加えた。反応液を０℃にて３０分攪拌した後、氷水（２０ｍＬ）で希釈し、酢酸エチル（３０ｍＬ×３）にて抽出した。引き続いて抽出液は、１０％塩酸、重炭酸ナトリウム水溶液および飽和食塩水で順次洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下で溶媒除去した後、残渣をカラムクロマトグラフィー（ｎ－ヘキサン／酢酸エチル＝３０／１）で精製し無色針状結晶として、４－（メトキシカルボニルオキシ）ベンズヒドリルメチルカーボネートを得た。

mp. 73-74 °C. IR(KBr): 2963, 2851, 1763, 1748, 1508, 1439, 1257, 1223, 1069, 968, 937 cm^-1.¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃) δ: 3.79(3H, s), 3.90 (3H, s), 6.70, (1H, s), 7.16 (2H, dm, J = 8.7 Hz), 7.28-7.37 (5H, m) 7.39 (2H, dm, J = 8.7 Hz). ¹³C-NMR (125 MHz,CDCl3) δ: 55.0 (q), 55.4 (q), 80.1 (d), 121.1 (d),126.9 (d), 128.26 (d), 128.28 (d), 128.6 (d), 137.4 (s), 139.2 (s), 150.7 (s),154.0 (s), 155.0 (s). HRMS (ESI) m/z: [M+Na]⁺ 計算値（ C₁₇H₁₆O₆Na ）：339.0839; 実測値： 339.0842.

（２）４－（Ｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌｏｘｙ）ｂｅｎｚｈｙｄｒｙｌＥｔｈｙｌＣａｒｂｏｎａｔｅ：（４－（メトキシカルボニルオキシ）ベンズヒドリルエチルカーボネート、若しくは炭酸４－（メトキシカルボニルオキシ）ベンズヒドリルエチル）。以後「（ＡＣＡＧＴ－００７ａ）」と呼ぶ。

４－ヒド溶液にロキシベンゾフェノン（５００ｍｇ、２．５３ｍｍｏｌ）の乾燥ピリジン溶液（４ｍＬ）に、０℃にてクロロギ酸メチル（３９０μＬ、５．０４ｍｍｏｌ）を加えた。反応液を０℃にて１時間攪拌した後、氷水（５０ｍＬ）に注加し、酢酸エチル（５０ｍＬ×１、３０ｍＬ×２）にて抽出した。引き続いて抽出液は、１０％硫酸、重炭酸ナトリウム水溶液および飽和食塩水で順次洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。

減圧下で溶媒除去することで、無色固体（６４９ｍｇ）の４－（メトキシカルボニルオキシ）ベンゾフェノン（４－ヒドロキシベンゾフェノン－４－イルメチルカーボネート、若しくは炭酸４－ヒドロキシベンゾフェノン－４－イルメチル）を得た。その固体は次の反応に十分な純度であった。一部を分析用としてカラムクロマトグラフィー（ｎ－ヘキサン／酢酸エチル＝３０／１）で精製し無色針状結晶を得た。

mp 95-96 °C (fromn-hexane). IR (KBr): 3070, 2955, 1762, 1651, 1597, 1439, 1315, 1249, 1253, 1216cm^-1. ¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃) δ: 3.94 (3H, s), 7.31 (2H, dm, J = 8.9), 7.49 (2H, tm, J = ca.7.4),7.60 (1H, tm, J = ca. 7.4), 7.80 (2H, dm, J = ca. 7.4), 7.87 (2H, dm, J = 8.9).¹³C-NMR (125 MHz, CDCl₃) δ: 55.6(q), 120.9(d), 128.3(d), 129.9(d), 131.7(d), 132.5 (d), 135.3 (s),137.4(s),153.6 (s),154.1 (s), 195.4 (s). HRMS (ESI) m/z: [M+Na]⁺計算値（C₁₅H₁₂O₄Na）：279.0628; 実測値：279.0631.

４－（メトキシカルボニルオキシ）ベンゾフェノン（６４９ｍｇ）と、テトラヒドロフラン（１５ｍＬ）、酢酸緩衝液（ｐＨ＝５、３ｍＬ）の混合液にＮａＢＨ_４（１０５ｍｇ、２．８ｍｍｏｌ）を０℃で加え、その混合溶液を０℃で１時間攪拌した。反応液を氷水（５０ｍＬ）に注加し、酢酸エチル（５０ｍＬ×１、３０ｍＬ×２）にて抽出した。引き続いて抽出液は、飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。

減圧下で溶媒除去した。残渣をカラムクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ_３）で精製し、４－（メトキシカルボニルオキシ）ベンズヒドリル（５１２ｍｇ、４－ヒドロキシベンゾフェノンから７８％）を無色オイルとして得た。

IR (neat): 3421, 2958, 2854, 1767, 1604, 1508, 1454, 1369, 1257,1215, 1061, 1015 cm^-1. ¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃)δ: 2.34 (1H, d, J = 3.1), 3.89 (3H, s), 5.83 (1H, d, J= 3.1), 7.13 (2H, dm, J = 8.7), 7.25-7.41 (7H, m). ¹³C-NMR(125 MHz, CDCl₃) δ: 55.4 (q), 75.6 (d),121.0 (d), 126.5 (d), 127.65 (d), 127.73 (d), 128.6 (d), 141.6 (s), 143.4 (s),150.3 (s), 154.5 (s). HRMS (ESI) m/z: [M+Na]⁺ 計算値（C₁₅H₁₄O₄Na）：281.0784; 実測値：281.0788.

４－（メトキシカルボニルオキシ）ベンズヒドロール（２７１ｍｇ、１．０５ｍｍｏｌ）の乾燥ピリジン溶液（２ｍＬ）に、０℃にてクロロギ酸エチル（２００μＬ、２．１ｍｍｏｌ）を加えた。反応液を０℃にて１．５時間攪拌した後、氷水（２０ｍＬ）に注加し、酢酸エチル（１０ｍＬ×３）にて抽出した。引き続いて抽出液は、１０％硫酸、重炭酸ナトリウム水溶液および飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下で溶媒除去した後、残渣をカラムクロマトグラフィー（ｎ－ヘキサン／酢酸エチル＝１０／１）で精製し、ＡＣＡＧＴ－００７ａを無色針状結晶として得た。

mp 69-70 °C. IR(KBr): 2982, 2959, 1774, 1751, 1508, 1443, 1369, 1273, 1246, 1227, 987 cm^-1.¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃) δ: 1.31(3H, t, J = 7.0), 3.89 (3H, s), 4.02 (2H, q, J = 7.0), 6.70 (1H, s), 7.16 (2H,dm, J = 8.7), 7.27-7.41 (7H, m). ¹³C-NMR(125 MHz, CDCl₃) δ: 14.2 (q), 55.4 (q), 64.3(t), 79.9 (d), 121.1 (d), 126.9 (d), 128.2 (d), 128.3 (d), 128.6 (d), 137.6(s), 139.3 (s), 150.7 (s), 154.1 (s), 154.4 (s). HRMS (ESI) m/z: [M+Na]⁺計算値（C₁₈H₁₈O₆Na ）：353.0996; 実測値：353.0996.

＜１．ＥＲＫの過活性化とカスパーゼ３の活性化＞
次にこれらの物質の効果について調べた実施例を示す。使用した細胞は、癌細胞としてＳＫ－ＭＥＬ－２８－Ｌｕｃ（メラノーマ：癌細胞、ＪＣＲＢ細胞バンクにおける細胞番号ＪＣＲＢ１３７６、以後「ＳＫ－ＭＥＬ－２８」と記す。）であり、正常細胞としてＮＨＥＭ（正常ヒト表皮メラノサイト、ＮｏｒｍａｌＨｕｍａｎＥｐｉｄｅｒｍａｌＭｅｌａｎｏｃｙｔｅｓ）を用いた。

培地はＳＫ－ＭＥＬ－２８に対してＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓＭｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅ’ｓＭｅｄｉｕｍ）と全量の１０％のＦＢＳ（ウシ胎児血清、Ｆｅｔａｌｂｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍ）を加えたもの（以下「ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ」と記す。）を用い、ＮＨＥＭに対してＤｅｒｍａＬｉｆｅＭＣｏｍｐｋｉｔを用いた。

アポトーシス誘導剤として、ＡＣＡ－２８と、比較例としてＡＣＡ－２８に構造が似ているＡＣＡ、およびコントロールとしてＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド、Ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）として用いた。なお、ＡＣＡ（１’－Ａｃｅｔｏｘｙｃｈａｖｉｃｏｌａｃｅｔａｔｅ（１’－アセトキシカビコールアセテート））は以下の構造をしている。ＣＡＳ番号は、５３８９０－２１－４である。

ＳＫ－ＭＥＬ－２８とＮＨＥＭは、それぞれ６ウェルプレートに播種し、３７℃、二酸化炭素５％の環境で２４時間培養した。２４時間培養後、ＤＭＳＯあるいは終濃度が１０μＭになるようにＡＣＡ－２８またはＡＣＡを、ＳＫ－ＭＥＬ－２８とＮＨＥＭが培養されたウェルに入れた。計６種類の試料を作製した。これらの試料は、３７℃、二酸化炭素５％の環境で６時間培養した。

６時間培養後、細胞溶解液で各試料からタンパク質を抽出し、サンプルとした。

各サンプルをＳＤＳ－ＰＡＧＥ後、ＰＶＤＦ膜に転写し、抗リン酸化ＥＲＫ１／２抗体、抗ＥＲＫ１／２抗体、抗切断カスパーゼ３抗体、抗チューブリン抗体を用いてリン酸化ＥＲＫ、総ＥＲＫ、切断カスパーゼ３および、チューブリンの量を検討した。結果はＬＡＳ４０００ｍｉｎｉを用いて撮影し、画像処理ソフトウェア（ＭｕｌｔｉＧａｕｇｅＶｅｒ．３．２）によって陰影の濃さを数値化した。

結果を図１に示す。図１（ａ）には、イムノブロッティングの結果を示す。図１（ａ）には、横長の４列の枠が示されており、各枠には６個の写真が示されている。４列の枠はそれぞれ上からリン酸化ＥＲＫ１／２（「リン酸化ＥＲＫ」と記載）、総ＥＲＫ１／２、切断カスパーゼ３、α－チューブリンである。

また、６個の写真は縦方向に左から１番目から３番目までがＮＨＥＭ（正常細胞）に対するものであり、４番目から６番目までＳＫ－ＭＥＬ－２８（メラノーマ）に対するものである。各細胞毎にアポトーシス誘導剤としてＤＭＳＯ（コントロール）、ＡＣＡ（比較例）、ＡＣＡ－２８（実施例）の結果が示されている。

各写真の濃淡が各タンパク質の量に比例する。図１（ａ）のリン酸化ＥＲＫ１／２の濃淡を数値化したものが、図１（ｂ）である。図１（ｂ）を参照して、横軸は、各細胞毎のアポトーシス誘導剤の種類を示し、縦軸は図１のリン酸化ＥＲＫ１／２の写真の濃淡を数値化した値を総ＥＲＫ１／２の写真の濃淡を数値化した値で除したものである。したがって、縦軸はＥＲＫ１／２のリン酸化の程度を表している。つまり、ＥＲＫ経路の活性化を表しているといってよい。なお、縦軸はＮＨＥＭ（正常細胞）のＤＭＳＯ（コントロール）の濃さを１００％として規格化されている。

ＮＨＥＭとＳＫ－ＭＥＬ－２８のＤＭＳＯによる結果を比較すると、ＮＨＥＭ（正常細胞）よりＳＫ－ＭＥＬ－２８（癌細胞）の方が数値が高くなっている。これは、癌化している細胞が示す特徴で、ＥＲＫ経路が活性化されているために、皮膚細胞が癌化しているためと考えられる。このような状態は恒常的にＥＲＫが活性化されていると言える。

ＤＭＳＯとＡＣＡの場合における正常細胞と癌細胞のリン酸化ＥＲＫの量の違いと比較して、ＡＣＡ－２８の場合は正常細胞と癌細胞のリン酸化ＥＲＫの量の違いは非常に大きく、２倍以上になっている。すなわち、ＡＣＡ－２８は、正常細胞と比較してそもそも活性化している癌細胞のＥＲＫ経路を、より活性化させている（過活性させている）と言える。

ここで、図１（ａ）を再び参照して、ＳＫ－ＭＥＬ－２８（癌細胞）の切断カスパーゼ３のＤＭＳＯとＡＣＡ－２８の場合とを比較すると、明らかにＡＣＡ－２８の方が色が濃く映っている。つまり、メラノーマにＡＣＡ－２８を添加すると、無添加（メラノーマのＤＭＳＯ）より添加（メラノーマのＡＣＡ－２８）の方がリン酸化ＥＲＫの量が増えており、切断カスパーゼ３の量も増えている。

図２には、メラノサイトおよびメラノーマにＤＭＳＯ、ＡＣＡ、ＡＣＡ－２８を作用させた時の細胞の生存率（％）を示す。ＳＫ－ＭＥＬ－２８とＮＨＥＭは、それぞれ９６ウェルプレートに播種し、３７℃、二酸化炭素５％の環境で２４時間培養した。２４時間培養後、ＤＭＳＯあるいは終濃度が１０μＭになるようにＡＣＡ－２８またはＡＣＡを、ＳＫ－ＭＥＬ－２とＮＨＥＭが培養されたウェルに入れた。これらの試料は、３７℃、二酸化炭素５％の環境で４８時間培養した。４８時間培養後、生細胞数測定試薬ＳＦ（ナカライテスク株式会社）を各ウェルに５μＬ加え、３７℃、二酸化炭素５％の環境で３時間培養した。

３時間培養後にマイクロプレートリーダーにて４５０ｎｍと６００ｎｍの吸光度を測定した。６００ｎｍを参照波長とし、４５０ｎｍの吸光度から６００ｎｍの吸光度を引いた値を生存率とした。なお、縦軸はＤＭＳＯ（コントロール）を加えた場合の生存率を１００％として規格化されている。

また図２には、癌細胞としてＳＫ－ＭＥＬ－２８だけではなく、ＳＫ－ＭＥＬ－２－Ｌｕｃ（ＪＣＲＢ細胞バンクにおける細胞番号ＪＣＲＢ００６６、以後「ＳＫ－ＭＥＬ－２」と記す。）、ＭｅＷｏ（ＪＣＲＢ細胞バンクにおける細胞番号ＪＣＲＢ１３９３）も使用した。これらの細胞は、全てＥＲＫが活性化していることが知られている（非特許文献４、５、６参照）。培養方法はＳＫ－ＭＥＬ－２８およびＮＨＥＭの場合と同じである。各細胞には便宜的に（１）から（４）までの数字を当てる。

図２を参照する。図２（ａ）は、各細胞に対してアポトーシス誘導剤を添加し、４８時間後の状態の顕微鏡写真である。写真は全て同倍率であり、ＳＫ－ＭＥＬ－２８にＡＣＡ－２８を添加した写真の右下のスケールバーが１００μｍである。ＤＭＳＯの場合と、ＡＣＡの場合を比較すると、いずれの細胞でも、細長い細胞が、ほぼ同じような密度で存在しているのが分かる。

一方、ＡＣＡ－２８の場合は、ＮＨＥＭでは、細胞が十分に確認できる程度に存在しているのに対して、ＭｅＷｏ、ＳＫ－ＭＥＬ－２およびＳＫ－ＭＥＬ－２８では、ほとんど細胞が確認されない。また、確認できても丸くなって見えている。これは細胞が生きている場合は培養皿にへばりつき、長細くなっている状態であったのが、細胞増殖が停止あるいは死亡してしまい、培養皿の培地に浮かんでいるためである。つまり、丸くなって見える細胞は細胞増殖が停止あるいは死亡している。

この細胞数の変化を数値化したものが図２（ｂ）である。横軸は、アポトーシス誘導剤の種類毎の細胞種である。細胞種は、図２（ａ）で割り振った数字であらわしている。縦軸は上述したように細胞生存率（％）を示す。各細胞はＤＭＳＯの場合の生存数を１００％として規格化してある。

図２（ｂ）を見ると、ＡＣＡでは、ほぼすべての細胞が２０％ほど減っている。しかし、ＡＣＡ－２８では、ＮＨＥＭ（正常細胞）が４０％ほどに減少しているのに対して、３種の癌細胞（メラノーマ）は、ほぼ１０％以下にまで減少している。

以上のことから、本発明に係るアポトーシス誘導剤は、悪性黒色腫に代表されるＥＲＫが恒常的に活性化している癌細胞のＥＲＫをより活性化させると共に、切断カスパーゼ３も活性化させることで、アポトーシスを誘導し、細胞を死滅させる。一方、正常細胞に対しては、その効果が発揮されにくく、結果、癌細胞に対して選択的にアポトーシスを誘導することができる。

＜２．癌細胞モデルでの検証＞
次に本発明に係るアポトーシス誘導剤の作用が、特定の癌細胞に対するものでなく、ＥＲＫが活性化されている細胞であれば、同様の効果を発揮することを示す。

使用した細胞はＮＩＨ／３Ｔ３（ＪＣＲＢ細胞バンクにおける細胞番号ＪＣＲＢ０６１５）と、ＮＩＨ／３Ｔ３のＨＥＲ２（細胞表面に存在する糖タンパクで、受容体型チロシンキナーゼ）を過剰発現させたＡ４－１５（非特許文献１および非特許文献２参照）を用いた。ＮＩＨ／３Ｔ３はマウスの胎児皮膚から分離した培養細胞である。

Ａ４－１５は、ＮＩＨ／３Ｔ３の細胞表面のＨＥＲ２を人工的に過剰発現させた細胞であり、癌細胞ではないが、ＥＲＫは正常の細胞より過剰に発現している。癌細胞のモデル細胞である。

これらの細胞の培養には、培地としてＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳを用いた。ＮＩＨ／３Ｔ３とＡ４－１５は、それぞれ６ウェルプレートに播種し、３７℃、二酸化炭素５％の環境で２４時間培養した。２４時間培養後、ＤＭＳＯあるいは終濃度が１０μＭになるようにＡＣＡ－２８またはＡＣＡを、ＮＩＨ／３Ｔ３とＡ４－１５が培養されたウェルに入れた。計６種類の試料を作製した。

これらの試料は、３７℃、二酸化炭素５％の環境で６時間培養した。６時間培養後、細胞溶解液で各試料からタンパク質を抽出し、サンプルとした。各サンプルをＳＤＳ－ＰＡＧＥ後、ＰＶＤＦ膜に転写し、抗リン酸化ＥＲＫ１／２抗体、抗ＥＲＫ１／２抗体、抗切断カスパーゼ３抗体、抗チューブリン抗体を用いてリン酸化ＥＲＫ、総ＥＲＫ、切断カスパーゼ３および、チューブリンの量を検討した。結果はＬＡＳ４０００ｍｉｎｉを用いて撮影し、画像処理ソフトウェア（ＭｕｌｔｉＧａｕｇｅＶｅｒ．３．２）によって陰影の濃さを数値化した。結果を図３および図４に示す。

図３は、リン酸化ＥＲＫ、総ＥＲＫ、切断カスパーゼ３、α－チューブリンについてのイムノブロッティングの結果である。また、図４は、図３のリン酸化ＥＲＫの濃淡を数値化したものである。横軸は細胞毎のアポトーシス誘導剤の種類を示し、縦軸はリン酸化ＥＲＫの程度を示す。図４を参照して、アポトーシス誘導剤がＤＭＳＯ（コントロール）の場合を見ると、ＮＩＨ／３Ｔ３の場合と比較してＡ４－１５は、非常にリン酸化ＥＲＫの量が多い。なお、縦軸はＮＩＨ／３Ｔ３（正常細胞）のＤＭＳＯ（コントロール）の濃さを１００％として規格化されている。

ＡＣＡを添加した場合は、ＮＩＨ／３Ｔ３およびＡ４－１５は共にリン酸化ＥＲＫの量は増えているが、同程度の増え方である。一方、ＡＣＡ－２８を添加した場合は、共にリン酸化ＥＲＫの量は増大している。また、図３の切断カスパーゼ３を見ると、Ａ４－１５にＡＣＡ－２８を添加した部分で切断カスパーゼ３の量が非常に多い（写真では影が濃い）のが分かる。

図５はＮＩＨ／３Ｔ３およびＡ４－１５の細胞生存率（％）を表すグラフである。ＮＩＨ／３Ｔ３およびＡ４－１５は、それぞれ９６ウェルプレートに播種し、３７℃、二酸化炭素５％の環境で２４時間培養した。２４時間培養後、ＤＭＳＯあるいは終濃度が１０μＭになるようにＡＣＡ－２８を、ＮＩＨ／３Ｔ３とＡ４－１５が培養されたウェルに入れた。これらの試料は、３７℃、二酸化炭素５％の環境で４８時間培養した。

４８時間培養後、生細胞数測定試薬ＳＦ（ナカライテスク株式会社）を各ウェルに５μＬ加え、３７℃、二酸化炭素５％の環境で３時間培養した。３時間培養後にマイクロプレートリーダーにて４５０ｎｍと６００ｎｍの吸光度を測定した。６００ｎｍを参照波長とし、４５０ｎｍの吸光度から６００ｎｍの吸光度を引いた値を生存率とした。

横軸はアポトーシス誘導剤を添加した場合としない場合（ＤＭＳＯの場合）を示している。また縦軸はアポトーシス誘導剤を添加しなかった場合の細胞数を１００％として規格した細胞生存率（％）である。アポトーシス誘導剤（ＡＣＡ－２８）を添加すると、正常細胞（ＮＩＨ／３Ｔ３）が６０％程度の生存率になるのに対して、ＥＲＫ活性化細胞（Ａ４－１５）は、１０％程度の生存率となり、アポトーシスの効果はおよそ６倍の効果を有すると言える。

再度図４を参照して、リン酸化ＥＲＫの量については、ＮＩＨ／３Ｔ３とＡ４－１５はそれほど大きな違いはないように見える。しかし、図５の生存率の結果からＡ４－１５については、図４程度にリン酸化ＥＲＫの活性化が過剰になると、そこで死滅してしまっているからと考えられる。ＮＩＨ／３Ｔ３はリン酸化ＥＲＫが過剰に発生しているようにみえるが、図３の切断カスパーゼ３のバンドは薄い。したがって、カスパーゼ３の活性化はあまりない。

＜３．他の癌細胞モデルで確認図６＞
図６は、ＮＩＨ／３Ｔ３にＣＤ９８ｈｃを過剰発現させた細胞（「ＮＩＨ／３Ｔ３ＣＤ９８ｈｃＯＰ」と記載。非特許文献３参照）の場合の切断カスパーゼ３の発現状態を確認したものである。培地はＤＭＥＭ＋７％ＦＢＳを用いた。ＣＤ９８は細胞表面に位置する。ＣＤ９８は、８５ｋＤａの重鎖（ｈｃ）と４０ｋＤａの軽鎖（ｌｃ）のヘテロ二量体から成り、ｌｃが膜１２回貫通型のアミノ酸トランスポーターであることが報告され、その他にも細胞内へのＣａ^２＋の流入、インテグリンの活性制御などに関わる多機能分子であることが報告されている。ＣＤ９８は、ＥＲＫシグナル伝達経路の上流側に位置する。

図６（ａ）は、ＮＩＨ／３Ｔ３にＡＣＡ－２８を添加したもので、図６（ｂ）は、ＣＤ９８ｈｃを過剰発現させた細胞にＡＣＡ－２８を添加した場合である。横方向は培養時間（ｈｒ）を表し、縦方向は切断カスパーゼ３とα－チューブリンのイムノブロッティングの結果である。図６（ａ）を参照すると、正常細胞であるＮＩＨ／３Ｔ３では、切断カスパーゼ３の発現をほとんど確認できない。一方、図６（ｂ）では、５時間以降で切断カスパーゼ３が強く発現しているのが分かる。

ＣＤ９８ｈｃを過剰発現させた細胞はＡ４－１５同様に癌細胞のモデル細胞であり、癌細胞ではないが、ＥＲＫは恒常的に発現していると考えられる。本発明に係るアポトーシス誘導剤がＥＲＫが恒常的に活性化されている細胞に対してアポトーシスを誘導するのは明らかである。

図７（ａ）は、ＮＩＨ／３Ｔ３－ＥＧＦＰにＡＣＡ－２８を添加したもので、図７（ｂ）は、ＮＩＨ／３Ｔ３－ＥＧＦＰのＲａｓタンパク質（以後単に「Ｒａｓ」と呼ぶ。）を変異させたＮＩＨ／３Ｔ３－ＥＧＦＰｖＨａｒｖｅｙ－ＲａｓＧ１２ＶＯＰにＡＣＡ－２８を添加した場合である。

ＮＩＨ／３Ｔ３－ＥＧＦＰは、ＮＩＨ／３Ｔ３に対照として緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を導入した細胞であり、ＮＩＨ／３Ｔ３－ＥＧＦＰｖＨａｒｖｅｙ－ＲａｓＧ１２ＶＯＰは、ＮＩＨ／３Ｔ３に、ＥＧＦＰ融合Ｈａｒｖｅｙ－ＲａｓＧ１２Ｖを過剰発現させた癌細胞モデルである（非特許文献４参照）。ＲａｓＧ１２Ｖは、正常なＲａｓタンパク質では１２番目のグリシン（Ｇ）であるところがバリン（Ｖ）に変異した活性化したＲａｓタンパク質である。

このタンパク質は、活性化型のＲａｓとして、下流のＥＲＫＭＡＰＫシグナルを恒常的に活性化させることが広く知られている。そのため、１２番目のグリシン（Ｇ）をバリン（Ｖ）に変異させたＲａｓを細胞に発現させることは、人工的にＥＲＫＭＡＰＫを活性化させる手段として、また癌細胞モデルを作成する手法として汎用されている。

図７（ａ）、図７（ｂ）では、横方向は培養時間（ｈｒ）を表し、縦方向は切断カスパーゼ３とα－チューブリンのイムノブロッティングの結果を表す。図７（ａ）を参照すると、正常細胞であるＮＩＨ／３Ｔ３－ＥＧＦＰでは、切断カスパーゼ３の発現をほとんど確認できない。一方、図７（ｂ）の癌細胞モデルであるＮＩＨ／３Ｔ３－ＥＧＦＰｖＨａｒｖｅｙ－ＲａｓＧ１２ＶＯＰでは、５時間以降で切断カスパーゼ３が強く発現しているのが分かる。

つまり、図６のＣＤ９８ｈｃの変異モデルだけでなく、Ｒａｓの変異モデルにおいても、ＥＲＫが恒常的に発現している細胞に対しては、ＡＣＡ－２８は切断カスパーゼ３を活性化させアポトーシスを誘導する。

以上のことから、本発明に係るアポトーシス誘導剤は、癌細胞か否かというよりも、ＥＲＫが恒常的に活性化している細胞に作用し、アポトーシスを誘導するものであることがわかる。言い換えると、特定の癌細胞に対してアポトーシスを誘導するのではなく、ＥＲＫが恒常的に活性化している癌細胞に対してアポトーシスを誘導し、細胞死に至らしめることができると考えられる。また、恒常的にＥＲＫが活性化していない細胞（正常細胞）に対しては、カスパーゼ３を活性化させず、アポトーシスも誘導しない。

＜４．ＭＡＰＫ経路阻害剤によるアポトーシス誘導のキャンセル図８＞
次に本発明のアポトーシス誘導剤の効果は、ＭＡＰＫ経路の阻害剤によってキャンセルされることを示す。これは、本発明に係るアポトーシス誘導剤が、ＥＲＫの過活性を発生させた結果としてカスパーゼ３の活性化を生じさせることを示すものである。

使用した細胞はヒト由来のＮＨＥＭとＳＫ－ＭＥＬ－２８および、マウス由来のＮＩＨ／３Ｔ３とＡ４－１５である。ＮＨＥＭとＳＫ－ＭＥＬ－２８は、正常細胞と癌細胞の対比であり、ＮＩＨ／３Ｔ３とＡ４－１５は正常細胞と癌細胞のモデル細胞との比較でもある。

培地はＮＨＥＭに対してＤｅｒｍａＬｉｆｅＭＣｏｍｐｋｉｔを用い、それ以外の細胞に対してはＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳを用いた。各細胞は、それぞれ６ウェルプレートに播種し、３７℃、二酸化炭素５％の環境で２４時間培養した。２４時間培養後、ＤＭＳＯあるいは終濃度が１０μＭになるようにＡＣＡ－２８を、ＮＩＨ／３Ｔ３とＡ４－１５が培養されたウェルに入れた。さらに、その上からＤＭＳＯあるいは終濃度が１０μＭになるようにＵ０１２６（ＭＥＫ阻害剤）を入れた。計６種類の試料を作製した。

これらの試料は、３７℃、二酸化炭素５％の環境で６時間培養した。６時間培養後、細胞溶解液で各試料からタンパク質を抽出し、サンプルとした。各サンプルをＳＤＳ－ＰＡＧＥ後、ＰＶＤＦ膜に転写し、抗リン酸化ＥＲＫ１／２抗体、抗ＥＲＫ１／２抗体、抗切断カスパーゼ３抗体、抗チューブリン抗体を用いてリン酸化ＥＲＫ、総ＥＲＫ、切断カスパーゼ３および、チューブリンの量を検討した。結果はＬＡＳ４０００ｍｉｎｉを用いて撮影し、画像処理ソフトウェア（ＭｕｌｔｉＧａｕｇｅＶｅｒ．３．２）によって陰影の濃さを数値化した。

なお、Ｕ０１２６は、ＥＲＫシグナル経路ではＭＡＰＫの上流側に位置するＭＡＰＫＫの阻害剤である。ＭＡＰＫＫ（ＭＡＰＫキナーゼ）の活性化（リン酸化）がＥＲＫの活性化を誘導する。したがって、ＭＡＰＫＫ阻害剤は、下流のＥＲＫの活性化を抑制する。

図８（ａ）は、ＮＨＥＭとＳＫ－ＭＥＬ－２８のイムノブロッティングの結果である。図８（ｂ）は図８（ａ）のリン酸化ＥＲＫの程度を数値化したものである。なお、横軸はＮＨＥＭ（正常細胞）のＤＭＳＯ（コントロール）の濃さを１００％として規格化されている。図９（ａ）は、ＮＨＥＭとＳＫ－ＭＥＬ－２８の細胞生存率（％）である。

また、図８（ｃ）は、ＮＩＨ／３Ｔ３とＡ４－１５のイムノブロッティングの結果である。図８（ｄ）は図８（ｃ）のリン酸化ＥＲＫの程度を数値化したものである。なお、横軸はＮＩＨ／３Ｔ３（正常細胞）のＤＭＳＯ（コントロール）の濃さを１００％として規格化されている。図９（ｂ）は、ＮＩＨ／３Ｔ３とＡ４－１５の細胞生存率（％）である。

図８（ｂ）と図８（ｄ）を参照する。横軸は細胞の種類を表し、縦軸は相対的なリン酸化ＥＲＫ量（％）を表す。なお、各細胞毎に、（１）ＤＭＳＯ、（２）ＡＣＡ－２８、（３）ＡＣＡ－２８とＵ０１２６の混合剤の結果（各薬剤は、番号で示した。）を示している。

まず図８（ｂ）のＤＭＳＯ同士を比較すると、ＮＨＥＭよりＳＫ－ＭＥＬ－２８はリン酸化ＥＲＫの量が多い。そしてＡＣＡ－２８（アポトーシス誘導剤）を添加すると、リン酸化ＥＲＫの量は、ＮＨＥＭに対してＳＫ－ＭＥＬ－２８は２倍以上に増加している。そして、ＡＣＡ－２８とＵ０１２６の混合剤の場合で比較すると、リン酸化ＥＲＫは激減している。

図８（ｄ）の場合でも、ＡＣＡ－２８を添加した場合は、リン酸化ＥＲＫの量は増加し、Ａ４－１５（癌細胞モデル）は、ＮＩＨ／３Ｔ３（正常細胞）よりリン酸化ＥＲＫの量が２倍以上になっている。そして、ＡＣＡ－２８とＵ０１２６の混合剤の場合で比較すると、リン酸化ＥＲＫは激減している。

次に図９（ａ）と図９（ｂ）を参照する。これらのグラフでは、横軸がＡＣＡ－２８の量（０か１０μＭ）と、各細胞毎のＵ０１２６の量（０か１０μＭ）を表し、縦軸は細胞生存率（％）である。有意水準については、非有意を「ｎ．ｓ．」で表し、「＊」は有意水準０．０５、「＊＊」は有意水準０．０１を表す。

図９（ａ）を見ると、ＮＨＥＭ（正常細胞）では、ＡＣＡ－２８を添加することで、細胞生存率は半分程度まで低下している。そして、ＡＣＡ－２８とＵ０１２６の混合剤を加えた場合は、同程度（非有意）に低下している。

ＳＫ－ＭＥＬ－２８の場合では、ＡＣＡ－２８を添加することで、細胞はおよそ６０％にまで減少している。しかし、ＡＣＡ－２８とＵ０１２６の混合剤を加えた場合は、９０％近く細胞生存率が上昇している（有意水準０．０１）。これは、Ｕ０１２６がＭＡＰＫを阻害した結果、ＥＲＫの過活性が解消され、アポトーシスが誘導されなかったためと考えられる。

図９（ｂ）を参照する。ＮＩＨ／３Ｔ３とＡ４－１５の場合は、より典型的な結果であった。ＡＣＡ－２８を添加すると、ＮＩＨ／３Ｔ３（正常細胞）も、Ａ４－１５（癌細胞モデル）も、生存率が２５％程度まで低下している。しかし、ＡＣＡ－２８とＵ０１２６の混合剤を加えると、ＮＩＨ／３Ｔ３は変化がなく（非有意）、Ａ４－１５は４０％程度まで細胞生存率が回復している（有意水準０．０５）。

以上のことより、本発明に係るアポトーシス誘導剤は、まずＥＲＫの過活性を発生させ、その結果カスパーゼ３の活性化が生じ、アポトーシスを誘導すると考えられる。

さて、癌種によってＥＲＫシグナル経路の特定の位置（分子）が変異しているのが報告されている。例えば、肺がんの約１０％、乳癌の約３０％の患者では、細胞表面の増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）に変異があると言われている。また細胞内でのＥＲＫシグナル経路の上流に位置するＲａｓの変異は、脾臓がんの患者の約９０％、大腸がんの約５０％で確認されている。また、Ｒａｓの下流に位置するＲａｆの変異は、悪性黒色腫の患者の約６６％で確認されている。したがって、癌細胞の発生は、ＥＲＫシグナル経路のさまざまなレベルで発生し得る。

しかし、ＥＲＫシグナル経路のどの位置で変異があっても、最終的にはＥＲＫが正常細胞より活性化され、細胞増殖が際限なく生じるのが癌細胞である。本発明のアポトーシス誘導剤は、上記の変異している部分を阻害するのではなく、その下流にあるＥＲＫをさらに活性化（過活性状態）にすることで、カスパーゼ３の活性化を促し、アポトーシスを誘導するものである。したがって、様々な癌細胞に対して癌細胞を抑制する効果があると言える。

＜５．ＡＣＡＧＴ－００７ａの効果の確認図１０＞
本発明に係るアポトーシス誘導剤は、ＥＲＫが恒常的に活性化している細胞に対して、ＥＲＫを過活性化させ、カスパーゼ３を活性化させ、アポトーシスを誘導すれば、化合物として限定されるものではない。しかし、現在のところこのような化合物として確認されているのは、ＡＣＡ－２８およびＡＣＡＧＴ－００７ａの２種の化合物である。ＡＣＡＧＴ－００７ａもＡＣＡ－２８同様の特性を有することを示す。

以下実験方法について説明する。培地はＳＫ－ＭＥＬ－２８－Ｌｕｃに対してＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳを用い、ＮＨＥＭに対してＤｅｒｍａＬｉｆｅＭＣｏｍｐｋｉｔを用いた。ＳＫ－ＭＥＬ－２８とＮＨＥＭは、それぞれ６ウェルプレートに播種し、３７℃、二酸化炭素５％の環境で２４時間培養した。２４時間培養後、ＤＭＳＯあるいは終濃度が１０μＭになるようにＡＣＡ－３７あるいはＡＣＡＧＴ－００７ａを、ＳＫ－ＭＥＬ－２８－ＬｕｃとＮＨＥＭが培養されたウェルに入れた。計６種類の試料を作製した。

これらの試料は、３７℃、二酸化炭素５％の環境で６時間培養した。６時間培養後、細胞溶解液で各試料からタンパク質を抽出し、サンプルとした。各サンプルをＳＤＳ－ＰＡＧＥ後、ニトロセルロース膜に転写し、抗リン酸化ＥＲＫ１／２抗体、抗ＥＲＫ１／２抗体、抗切断カスパーゼ３抗体、抗チューブリン抗体を用いてリン酸化ＥＲＫ、総ＥＲＫ、切断カスパーゼ３および、チューブリンの量を検討した。結果はＬＡＳ４０００ｍｉｎｉを用いて撮影し、画像処理ソフトウェア（ＭｕｌｔｉＧａｕｇｅＶｅｒ．３．２）によって陰影の濃さを数値化した。なお、ＡＣＡ－３７は、以下の構造の酢酸１－（４－アセトキシフェニル）－２－フェニルエチルである。ＣＡＳ番号は９４８０４４－２７－７である。

図１０（ａ）にイムノブロッティングの結果を示す。リン酸化ＥＲＫ、総ＥＲＫ、切断カスパーゼ３、チューブリンの結果が示されている。図１０（ｂ）はこれを数値化したものである。横軸は、細胞毎にアポトーシス誘導剤の種類であり、縦軸は、総ＥＲＫ量でリン酸化ＥＲＫ量を割った値であり、さらに、ＮＨＥＭ（正常細胞）のＤＭＳＯ（コントロール）の時の値を１００％として規格化したグラフである。

ＮＨＥＭのＤＭＳＯに対してＳＫ－ＭＥＬ－２８のＤＭＳＯの値は２倍ほど高い。これはすでに示したようにＳＫ－ＭＥＬ－２８のＥＲＫが恒常的に活性化していることを表している。ＡＣＡＧＴ－００７ａは、正常細胞であるＮＨＥＭのＥＲＫを増やしているが、癌細胞であるＳＫ－ＭＥＬ－２８のＥＲＫはより増大させている。

そして、図１０（ａ）を参照すると、ＡＣＡＧＴ－００７ａは、ＳＫ－ＭＥＬ－２８の切断カスパーゼ３の量を増大させている。以上のようにＡＣＡＧＴ－００７ａはＡＣＡ－２８同様にＥＲＫが恒常的に活性化している細胞に対して、ＥＲＫを過活性化させ、カスパーゼ３を活性化させ、アポトーシスを誘導する。

図１１は、正常細胞ＮＨＥＭと癌細胞ＳＫ－ＭＥＬ－２８に対してＡＣＡＧＴ－００７ａとＡＣＡ－３７を作用させた場合の細胞生存率（％）を表すグラフである。図１１（ａ）はＡＣＡＧＴ－００７ａの場合であり、図１１（ｂ）は、ＡＣＡ－３７の場合である。両グラフとも、横軸はそれぞれの濃度（μＭ）であり、縦軸は濃度０μＭ時の生存率で規格化した細胞生存率（％）である。

ＡＣＡＧＴ－００７ａは、濃度が高くなるにつれ、正常細胞（ＮＨＥＭよりも癌細胞であるＳＫ－ＭＥＬ－２８を選択的に死亡させている。一方、ＡＣＡ－３７は、ＥＲＫの過活性やカスパーゼ３の活性化も誘導しないので、正常細胞ＮＨＥＭにも、癌細胞ＳＫ－ＭＥＬ－２８に対しても、増殖を抑制しない。

＜６．他種の細胞に対する効果の確認図１２＞
図１２には、細胞を正常細胞としてＨＥＫ２９３Ｆ（胎児腎由来細胞：ＥＣＡＣＣ株番号８５１２０６０２）と、癌細胞としてＡＣＨＮ（ヒト腎腺癌細胞：ＥＣＡＣＣ株番号８８１００５０８）にＡＣＡ－２８を作用させた場合の結果を示す。培地はＤＭＥＭ＋７％ＦＢＳを用いた。

図１２（ａ）および図１２（ｂ）は、ＨＥＫ２９３Ｆのイムノブロッティングの結果と、細胞生存率（％）のグラフである。また、図１２（ｃ）および図１２（ｄ）は、ＡＣＨＮのイムノブロッティングの結果と、細胞生存率（％）のグラフである。イムノブロッティングの結果は、横軸方向が培養時間（ｈｒ）であり、縦方向に切断カスパーゼ３とα－チューブリンの結果である。また、細胞生存率のグラフでは横軸がＡＣＡ－２８の濃度（μＭ）であり、縦軸は細胞生存率（％）を示す。

ＡＣＡ－２８は、正常細胞であるＨＥＫ２９３Ｆに対しては、切断カスパーゼ３を増大させず、細胞生存率も８０％程度に維持されている。一方ＡＣＨＮに対しては、濃度依存的に細胞生存率が低下している。したがって、癌細胞を選択的に死滅させているのが分かる。

イムノブロッティングの結果を示す。また図１２（ｂ）は、細胞生存率を示すグラフである。横軸はＡＣＡ－２８の濃度であり、縦軸は細胞生存率（％）である。図１２（ｃ）を参照して、横軸は培養時間（ｈｒ）である。１０時間経過後から切断カスパーゼ３の量が増大している。図１２（ｄ）を参照すると、ＡＣＡ－２８の濃度が増えることで、細胞生存率が低下している。

以上のように本発明に係るアポトーシス誘導剤は、ＥＲＫが恒常的に活性化している細胞に対して、ＥＲＫを過活性にし（リン酸化ＥＲＫ量の増大）、カスパーゼ３を活性化させ（切断カスパーゼ３量の増大）、アポトーシスを誘導することができる。また、このアポトーシスの誘導は正常細胞に対しては効果が少ない。したがって、本発明に係るアポトーシス誘導剤は、恒常的ＥＲＫ活性化細胞に対して選択的にアポトーシスを誘導する。

本発明に係るアポトーシス誘導剤は、各種の癌治療剤を始め、試薬や処理薬として広く利用することができる。

Claims

（２）式の４－（メトキシカルボニルオキシ）ベンズヒドリルエチルカーボネートからなり、リン酸化ＥＲＫが正常の場合と比較して恒常的に多い細胞に対してリン酸化ＥＲＫおよび切断カスパーゼ３をさらに増加させ、前記細胞に選択的にアポトーシスを誘導することを特徴とするアポトーシス誘導剤。
前記細胞は哺乳類の細胞であることを特徴とする請求項１に記載されたアポトーシス誘導剤。
リン酸化ＥＲＫが正常の場合と比較して恒常的に多い細胞に対してリン酸化ＥＲＫおよび切断カスパーゼ３をさらに増加させ、前記細胞に選択的にアポトーシスを誘導するアポトーシス誘導剤を含み、前記アポトーシス誘導剤が、（２）式の４－（メトキシカルボニルオキシ）ベンズヒドリルエチルカーボネートであることを特徴とする癌治療剤。
前記細胞は哺乳類の細胞であることを特徴とする請求項３に記載された癌治療剤。