JP7293237B2 - オートファジー回復用酸性ナノ粒子 - Google Patents

Description

（関連出願の相互参照）
この出願は、２０１９年１月２１日に出願された米国特許出願第１６／２５２、９２７号および２０１８年１月１９日に出願された米国特許仮出願第６２／６１９、５６５号の利益、およびこれらの出願に対する優先権を主張し、これらの全内容はすべて、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

オートファジーは、細胞が長寿命のタンパク質とオルガネラを分解する、進化的に保存された必須の維持メカニズムである。このハウスキーピングプロセスは、加齢とともに蓄積する損傷した物質を除去するためにオートファジーに依存する非増殖細胞では特に重要である。リソソームとオートファゴソームとの融合には、酸性リソソームも必要とする。したがって、リソソームの酸性度は、リソソーム機能およびオートファジーフラックスの維持に不可欠な重要な局所シグナルである。ただし、現在、インビトロとインビボの両方でリソソームの酸性度を操作するために利用できるツールはない。現在の薬理学的および分子的ツールは、リソソームの酸性度を低下させる可能性があるが、リソソームを増加させるための利用可能なツールは存在しないと考えられている。２型糖尿病、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）および神経変性を含むがこれらに限定されない多くの疾患状態は、損なわれたリソソームの酸性度に関連する。

非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）は、今日世界で最も一般的な肝疾患の１つであり、一般人口の２０～３０％が罹患している。様々な遺伝的および後成的要因がＮＡＦＬＤの病因に関与している。インスリン抵抗性は脂肪組織における脂肪分解の抑制を損ない、それによって血清遊離脂肪酸（ＦＦＡ）のレベルを増加させる。ＦＦＡは通常、肝臓に取り込まれ、中性トリグリセリドにエステル化されるが、過剰な飽和ＦＦＡは、ＦＦＡをエステル化する肝臓の能力を超え、脂肪毒性（ＬＴ）を誘発する。ＬＴ下の肝細胞では、損なわれたリソソームの酸性度に付随するオートファジーの破壊が報告されている。破壊は損傷したオルガネラとタンパク質を細胞に蓄積させ、細胞機能と生存率の低下を悪化させ、肝細胞死を促進し、進行性疾患を引き起こした。治療されていないＮＡＦＬＤは、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）になり、肝硬変に進行する可能性があり、肝機能を著しく損なう可能性がある。わずかな割合が肝癌に悪化し、その唯一の治療選択肢は肝移植であり、成功の見込みは低いと報告されている。

これまでのところ、ＮＡＦＬＤの治療のために特定の薬理学的薬剤は承認されていない。インスリン増感剤の処方に向けられたＮＡＦＬＤの現在の治療選択肢には、チアゾリジンジオン（ＴＺＤ）、メトホルミン、およびＧＬＰ－１受容体アゴニストなどの注射剤が含まれる。これらは副作用と長期治療の必要性を誘発する（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、（２０１６）１１３：２２８８－２２９３）。ｍＴＯＲ経路阻害剤であるラパマイシンなどのオートファジー経路を標的とする別のグループの薬理学的薬剤は、オートファジー関連代謝疾患の治療に使用されてきたが、この薬剤は、オートファジー誘導とは無関係に重要な代謝シグナル伝達経路への非特異的変化を伴い得る。このため、長期間の使用には望ましくない場合がある。最後に、ＧＦＴ－５０５（ＰＰＡＲアゴニスト）およびＯＣＡＬＩＶＡ（登録商標）（Ｉｎｔｅｒｃｅｐｔ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）を含む前臨床化合物は、その効率を完全に特徴付けるための臨床試験の段階にある。

非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）は、今日世界で最も一般的な肝疾患である。最近、脂肪毒性（ＬＴ）と呼ばれる肝臓遊離脂肪酸（ＦＦＡ）のレベルの増加が、オートファジーフラックスの阻害を引き起こし、同時にリソソームの酸性度の減少を引き起こし（すなわち、リソソームのｐＨが増加する）、これはＮＡＦＬＤの病因となることがわかっている。解決すべき問題は、リソソームの酸性度とオートファジーフラックスを回復する生体適合性のある方法を提供することである。したがって、本発明では、我々は、リソソーム酸性度およびオートファジーを操作するための標的化戦略として、新規の生分解性酸活性化酸放出ナノ粒子（ａｃＮＰ）を合成した。これらのａｃＮＰは、ｐＨ６．０（機能不全のリソソームで報告されるｐＨ）で分解されるフッ素化ポリエステルに基づいている。ナノ粒子からの酸成分の放出により、リソソームのｐＨがさらに低下し、ＬＴの下での肝細胞のオートファジーフラックスおよび細胞機能が増加する。したがって、本発明のａｃＮＰは、ＮＡＦＬＤを治療するための治療薬として有用である。さらに、本発明のａｃＮＰは、損なわれたリソソーム酸性度に関連する疾患の治療または予防にも有用である。このような疾患は、肥満、メタボリックシンドローム、２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、肝移植、神経変性（例えば、加齢性認知症、アルツハイマー病、パーキンソン病など）を含むが、これらに限定されない。

本発明の１つの態様では、酸放出性フッ素化ポリエステルナノ粒子が提供される。ナノ粒子は、ポリエステルおよびテトラフルオロコハク酸（ＴＦＳＡ）を含み、ナノ粒子は、約ｐＨ６．０のｐＨを有する環境に曝されたときに酸を放出する。フッ素化ポリエステルは、低い毒性、ならびにインビトロおよびインビボでの高い生体適合性を示すことにより、最小限の毒性で細胞に取り込まれるため、フッ素化ポリエステルナノ粒子は医療用途に有用である。

１つの実施形態では、ナノ粒子はコハク酸（ＳＡ）をさらに含む。ＴＦＳＡとＳＡとの比率は１００：０（ＴＦＳＡ：ＳＡ）～１０：９０（ＴＦＳＡ：ＳＡ）の範囲であり、例えば、ＴＦＳＡとＳＡとの比率は、約１０：９０、約１５：８５、約２０：８０、約２５：７５、約３０：７０、約３５：６５、約４０：６０、約４５：５５、約５０：５０、約５５：４５、約６０：４０、約６５：３５、約７０：３０、約７５：２５、約８０：２０、約１５：１５、約９０：１０、約９５：５、および約１００：０からなる群から選択される比率を含む。

別の実施形態では、ナノ粒子は、エチレングリコール、プロピレングリコール、ブチレングリコールからなる群から選択されるジオールを含むポリエステルを含む。例えば、酸放出性フッ素化ポリエステルナノ粒子は、ポリエステル、エチレングリコール、およびＴＦＳＡ（ＰＥＦＳＵ）；ポリエステル、プロピレングリコールおよびＴＦＳＡ（ＰＰＦＳＵ）またはポリエステル、ブチレングリコールおよびＴＦＳＡ（ＰＢＦＳＵ）を含んでよい。

本発明におけるナノ粒子は、１０％のＰＥＦＳＵ、１５％のＰＥＦＳＵ、２０％のＰＥＦＳＵ、２５％のＰＥＦＳＵ、３０％のＰＥＦＳＵ、３５％のＰＥＦＳＵ、４０％のＰＥＦＳＵ、４５％のＰＥＦＳＵ、５０％のＰＥＦＳＵ、５５％のＰＥＦＳＵ、６０％のＰＥＦＳＵ、６５％のＰＥＦＳＵ、７０％のＰＥＦＳＵ、７５％のＰＥＦＳＵ、８０％のＰＥＦＳＵ、８５％のＰＥＦＳＵ、９０％のＰＥＦＳＵ、９５％のＰＥＦＳＵ、１００％のＰＥＦＳＵ、１０％のＰＰＦＳＵ、１５％のＰＰＦＳＵ、２０％のＰＰＦＳＵ、２５％のＰＰＦＳＵ、３０％のＰＰＦＳＵ、３５％のＰＰＦＳＵ、４０％のＰＰＦＳＵ、４５％のＰＰＦＳＵ、５０％のＰＰＦＳＵ、５５％のＰＰＦＳＵ、６０％のＰＰＦＳＵ、６５％のＰＰＦＳＵ、７０％のＰＰＦＳＵ、７５％のＰＰＦＳＵ、８０％のＰＰＦＳＵ、８５％のＰＰＦＳＵ、９０％のＰＰＦＳＵ、９５％のＰＰＦＳＵ、１００％のＰＰＦＳＵ、１０％のＰＢＦＳＵ、１５％のＰＢＦＳＵ、２０％のＰＢＦＳＵ、２５％のＰＢＦＳＵ、３０％のＰＢＦＳＵ、３５％のＰＢＦＳＵ、４０％のＰＢＦＳＵ、４５％のＰＢＦＳＵ、５０％のＰＢＦＳＵ、５５％のＰＢＦＳＵ、６０％のＰＢＦＳＵ、６５％のＰＢＦＳＵ、７０％のＰＢＦＳＵ、７５％のＰＢＦＳＵ、８０％のＰＢＦＳＵ、８５％のＰＢＦＳＵ、９０％のＰＢＦＳＵ、９５％のＰＢＦＳＵ、および１００％のＰＢＦＳＵからなる群から選択されると考えられる。

１つの実施形態では、ナノ粒子は、１０％のＰＥＦＳＵ、１５％のＰＥＦＳＵ、２０％のＰＥＦＳＵ、２５％のＰＥＦＳＵからなる群から選択される。

さらなる実施形態では、ナノ粒子は、２５％のＰＰＦＳＵ、５０％のＰＰＦＳＵ、７５％のＰＰＦＳＵ、１００％のＰＰＦＳＵからなる群から選択される（１２）。さらに別の実施形態では、ナノ粒子は、３０％のＰＢＦＳＵ、５０％のＰＢＦＳＵ、７５％のＰＢＦＳＵ、１００％のＰＢＦＳＵからなる群から選択される。

別の実施形態では、ナノ粒子は、約２５ｎｍから、または約５０ｎｍから、約２００ｎｍまで、または約１５０ｎｍまで、または約１００ｎｍまでの範囲である平均直径を有する。

別の実施形態では、ナノ粒子の好ましい平均直径は、約１００ｎｍ未満である。

別の実施形態では、ナノ粒子の集団は、約０．２以下、または約０．１４以下の多分散指数（ＰＤＩ）を有する。

さらに別の実施形態では、ナノ粒子は、ナノ粒子が細胞と接触しているときにリソソームへの取り込みをもたらすサイズおよびゼータ電位を有する。

本発明の別の態様において、ナノ粒子は、リソソーム酸性化が損なわれた細胞によってナノ粒子が取り込まれたときに、細胞内のオートファジーフラックスを回復し、かつ／または細胞内のリソソーム－オートファゴソーム融合能力を増強するのに有用である。

１つの実施形態では、ナノ粒子は、脂肪酸に曝された肝細胞、または脂肪酸に曝されたＢ細胞において、リソソーム機能の短期および／または長期の回復を誘導するのに有効的である。

別の実施形態では、ナノ粒子は、肝細胞脂質含有量を正常化するのに有効である。

さらなる実施形態では、ナノ粒子は、グルコースに応答してインスリンを分泌するＢ細胞の能力を増強するのに有効である。

本発明の別の態様では、医薬製剤が提供される。製剤は、上記の複数のナノ粒子および薬学的に許容される担体を含む。医薬製剤は、実質的に無菌の単位投与製剤を含む。

一実施形態では、医薬製剤は、経口送達、等速送達、経皮送達、非経口送達、エアロゾル投与、吸入による投与、静脈内投与、および直腸投与からなる群から選択される経路による投与用に設計される。

本発明の別の態様は、細胞を上記の複数のナノ粒子と接触させることにより、哺乳動物の細胞におけるオートファジーを促進する方法を提供する。本方法は、哺乳動物に有効量のナノ粒子および／または上記の医薬製剤を投与することを含む。

１つの実施形態では、本方法は、医薬製剤中の有効量の本発明のナノ粒子を哺乳動物に投与することにより、リソソーム機能の回復に有利に反応する哺乳動物の病状を治療する。

別の実施形態では、本方法は、損なわれたリソソーム酸性度に関連する疾患状態を有する哺乳動物における治療を提供する。疾患状態は、肥満、メタボリックシンドローム、２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、および神経変性病状からなる群から選択される。

さらなる実施形態では、神経変性病状を含む疾患状態は、加齢性認知症、パーキンソン病、およびアルツハイマー病からなる群から選択される。

１つの実施形態では、本方法は、リソソームの酸性化を損なう条件下でオートファジーフラックスを回復させるのに有効である。

別の実施形態では、この方法は、リソソーム－オートファゴソーム融合能力を増強するのに有効である。

別の実施形態では、この方法は、リソソーム加水分解酵素活性を増強するのに有効である。

別の実施形態では、本方法は、リソソーム機能の短期または長期の回復をもたらす。例えば、本方法は、脂肪酸に曝された肝細胞においてリソソーム機能の短期または長期の回復をもたらすのに有効であり、肝細胞の脂質含有量を正常化する。

別のさらなる実施形態では、本方法は、脂肪酸に曝されたＢ細胞においてリソソーム機能の短期または長期の回復をもたらし、グルコースに応答してインスリンを分泌するＢ細胞の能力を増強するのに有効である。

さらに別の実施形態では、本方法は、有効量のａｃＮＰを投与することにより、ヒトまたは非ヒト哺乳動物である哺乳動物における治療を提供する。ａｃＮＰは、静脈内にまたは当技術分野で知られている他の方式で投与することができる。

前述の実施形態のある実施形態において、ＴＦＳＡは、他の酸、特に約２未満のｐＫａを有する他の酸、または本発明のナノ粒子について約１．６以下のｐＫａを有する他の酸で置換できることが認識されるであろう。

肥満、２型糖尿病、および非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）の治療のための本発明のａｃＮＰの使用を示す。肥満、２型糖尿病、およびＮＡＦＬＤは、オートファジーフラックスの停止とオートファゴソームの蓄積につながる、損なわれたリソソームの酸性化に関連している。本明細書に記載されるａｃＮＰはリソソームを標的とする。損傷のある細胞では、リソソームのｐＨは部分的に酸性化されているため、オートファゴソームと融合しない。オートファジーフラックスが抑制され、脂質を封入するオートファゴソームが細胞内に蓄積され、脂質のクリアランスが減少する。リソソームに入った後、ａｃＮＰは酸を放出してリソソームの酸性度を回復し、それによりオートファゴソームとの融合、リソソーム加水分解酵素活性およびオートファジーフラックスを回復する。 パネルＡは、ＰＢＦＳＵの合成の概略図を示し、パネルＢは、ＰＢＦＳＵポリマーの化学的および物理的特性の概要を示す。パネルＣ～Ｅ：ＰＢＦＳＵポリマーのＮＭＲスペクトル：^１Ｈ（パネルＣ）、^１３Ｃ（パネルＤ）、および^１９Ｆ（パネルＥ）。 パネルＡおよびＢ：示差熱量走査（ＤＳＣ）によるＰＢＦＳＵポリエステルの熱挙動：１０℃／分、加熱曲線（パネルＡ）と５℃／分、冷却曲線（パネルＢ）。 パネルＡおよびＢ：示差熱量走査（ＤＳＣ）によるＰＢＦＳＵポリエステルの熱挙動：１０℃／分、加熱曲線（パネルＡ）と５℃／分、冷却曲線（パネルＢ）。 パネルＣ：ＰＢＦＳＵポリエステルの熱重量分析（ＴＧＡ）曲線。対照ポリマーはＰＢＳＵであった。 ＰＢＦＳＵ ａｃＮＰのＳＥＭ画像である。 ａｃＮＰ形成に対する溶媒の影響を示す。 ａｃＮＰ形成に対する透析温度の影響を示す。 ａｃＮＰ形成に対する透析時間の影響を示す。 パネルＡは、様々なＰＢＦＳＵ ａｃＮＰをｐＨ６の２０ｍＭ ＰＢＳでインキュベートした場合の経時的なｐＨ変化に対する影響を示す。 パネルＢは、ナノ粒子を３７℃の水中でインキュベートしたときのＰＢＦＳＵ ａｃＮＰの分解と分子量の変化を示す。 ａｃＮＰの細胞傷害性アッセイである。ＰＢＦＳＵ ａｃＮＰは、１０００μｇ／ｍＬでも有意な細胞死を引き起こさない。 ａｃＮＰの細胞傷害性アッセイである。ＰＢＦＳＵ ａｃＮＰは、１０００μｇ／ｍＬでも有意な細胞死を引き起こさない。 パネルＡは、ＢＳＡ（対照）、パルミテートまたはパルミテート＋ＰＢＦＳＵ ａｃＮＰで処理したＨｅｐＧ２細胞の共焦点画像を示す。 パネルＢは、ＭｅｔａＭｏｒｐｈ（登録商標）解析ソフト、ｎ＝３、＊Ｐ＜０．０５を用いて測定された、リソソームのｐＨおよびサイズの定量化を示す。 ａｃＮＰ、ＰＥＳＵ、ＰＥＦＳＵの合成を示す。 パネルＡ～Ｃは、ＮＭＲスペクトルを用いたＰＥＳＵおよび２５％のＰＥＦＳＵの特性を示す。パネルＡ：^１Ｈ ＮＭＲ、パネルＢ：^１３Ｃ ＮＭＲ、およびパネルＣ：^１９Ｆ ＮＭＲスペクトル。 パネルＡおよびＢは、ａｃＮＰのサイズとインビトロでの機能の特徴を示す。（パネルＡ）様々なａｃＮＰの走査型電子顕微鏡写真（スケールバー＝２００ｎｍ）。（パネルＢ）ｐＨ６．０およびｐＨ７．４のバッファー中の異なるポリマー組成のａｃＮＰの経時的なｐＨ変化。２５％のＰＥＦＳＵをｐＨ７．４のバッファーに添加しても、ｐＨ６．０のバッファーと比較してｐＨは大きく変化しなかったことに留意されたい。このことは、ｐＨ６．０でのみ酸性化の活性化を示す。 パネルＢおよびＣ：パネルＢ：ａｃＮＰの直径とゼータ電位を決定するために動的光散乱を使用したａｃＮＰ、ＰＥＳＵ、および２５％のＰＥＦＳＵの特性（ＳＥＭ図にラベル付けされたサイズとゼータ電位）。パネルＣ：４８時間にわたる２０ｍＭ ｐＨ６．０（左パネル）およびｐＨ７．４（右パネル）ＰＢＳバッファー中のａｃＮＰのｐＨ変化。 パネルＡ～Ｂは、ＰＥＳＵ、２５％のＰＥＦＳＵ ａｃＮＰおよびＰＬＧＡ ＮＰのｐＨ変化を示す。ナノ粒子は、２０ｍＭ ｐＨ６．０のバッファー（パネルＡ）および２０ｍＭ ｐＨ７．４のバッファー（パネルＢ）中でインキュベートした。２５％のＰＥＦＳＵ ａｃＮＰは、ＰＬＧＡ ＮＰと比較して、リソソームｐＨのより高い低下（より低いｐＨ）を示す。 パネルＡ～Ｂは、ＰＥＳＵ、２５％のＰＥＦＳＵ ａｃＮＰおよびＰＬＧＡ ＮＰのｐＨ変化を示す。ナノ粒子は、２０ｍＭ ｐＨ６．０のバッファー（パネルＡ）および２０ｍＭ ｐＨ７．４のバッファー（パネルＢ）中でインキュベートした。２５％のＰＥＦＳＵ ａｃＮＰは、ＰＬＧＡ ＮＰと比較して、リソソームｐＨのより高い低下（より低いｐＨ）を示す。 パネルＡおよびＢは、リソソームにおけるａｃＮＰの細胞取り込みと局在を示す。パネルＡは、ローダミン標識ａｃＮＰ（赤）で処理され、リソソーム色素ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ（商標）で染色されたＨｅｐＧ２細胞の超解像画像を示す。パネルＢは、細胞へのａｃＮＰの取り込みとａｃＮＰの標的経路を特定するのに役立つ阻害剤のリストである。 パネルＡ～Ｃは、細胞生存率および細胞とリソソームへの取り込みに対するａｃＮＰの効果である。パネルＡ：ＰＥＳＵまたは２５％のＰＥＦＳＵとインキュベートした細胞の生存率に対する様々なａｃＮＰ濃度の影響。細胞は、一連のａｃＮＰ濃度で２４時間インキュベートした。１０００μｇ／ｍｌまでの濃度のａｃＮＰは、有意な細胞死を誘発しなかった。この研究に基づいて、１００μｇ／ｍｌの治療用量がさらなる研究のために選択された。パネルＢ：フローサイトメトリーによるＨｅｐＧ２細胞でのローダミン標識ａｃＮＰ（Ｒｈｏ－ａｃＮＰ）取り込みの定量。Ｒｈｏ－ａｃＮＰの取り込みは４時間以内に起こり、２４時間のインキュベーション後に完全に取り込まれる。（データ＝平均±ＳＤ、ｎ＝３、＊＝ｐ＜０．０５）。（パネルＣ）ＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ（商標）で染色されたリソソーム区画（左パネル）に共局在している（青いチャネル（中央パネル））ＨｅｐＧ２細胞（右パネル）でのＲｈｏ－ａｃＮＰの取り込みを示す共焦点顕微鏡画像。バー、１０μｍ。 パネルＡ～Ｃは、ａｃＮＰがリソソームの酸性度を改善し、脂肪毒性下で細胞死を救うことを示す。（パネルＡ）ａｃＮＰを含むまたは含まない複合体化されたパルミテート：ＢＳＡ（４：１の比率）で慢性的に処理されたＩＮＳ１細胞のＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ（商標）画像。（パネルＢ）パルミテート：ＢＳＡとａｃＮＰによって引き起こされるｐＨの変化の定量化。（パネルＣ）ａｃＮＰは細胞死を防ぐ。パルミテートによる処理：ＢＳＡは、ＢＳＡ対照と比較して７倍多い細胞死を誘発した。２５％のＰＥＦＳＵ ａｃＮＰを追加すると、ＢＳＡ対照と比較して細胞死が有意に減少した（データ＝平均値±ＳＤ、ｎ＝３、＊＝Ｐ＜０．０５）。 パネルＡ～Ｄは、ａｃＮＰの存在下または非存在下でＢＳＡ（対照）またはパルミテートで処理した細胞のリソソーム酸性度およびカテプシンＬの変化に対するａｃＮＰの影響を示す。パネルＡ：２５％のＰＥＦＳＵ ａｃＮＰの非存在下（対照）または存在下でＢＳＡ（対照）またはパルミテートとインキュベートした細胞の実験プロトコルの概略図と、それに続くリソソームの酸性度、オートファジー、または細胞機能のアッセイ。 パネルＢ：ＢＳＡ（上、左パネル）、パルミテート（右上のパネル）、パルミテートおよび２５％のＰＥＦＳＵ（右下のパネル）、およびリソソーム酸性化の阻害剤（左下のパネル）のバフィロマイシン（Ｂａｆ）とインキュベートしたＨｅｐＧ２細胞の共焦点顕微鏡画像パネル。細胞をｐＨ感受性ＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ（商標）色素で染色して、リソソームの酸性度を評価した。１００μＭ Ｂａｆを使用して、リソソームのＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ（商標）染色の特異性を実証した。バー、１０μｍ。 パネルＣ：ＢＳＡ（対照）、パルミテート（対照）、パルミテートおよび２５％のＰＥＦＳＵによる、細胞処理後の細胞あたりの平均リソソームｐＨ（□）とリソソーム領域（◇）。結果は、パルミテートのみで処理された細胞と比較して、パルミテートおよび２５％のＰＥＦＳＵで処理された細胞でのリソソームｐＨの有意な回復を示した（実験ごとに分析された２０～３０細胞でのｐＨ値およびサイズ値についてのｎ＝３実験）。 パネルＤ：ＢＳＡ（対照）、パルミテート（対照）、パルミテートおよび２５％のＰＥＦＳＵで処理されたＨｅｐＧ２細胞におけるＭａｇｉｃ ｒｅｄカテプシンＬ蛍光基質アッセイによるリソソームカテプシンＬ活性の評価。結果は、２５％のＰＥＦＳＵ ａｃＮＰ処理でリソソーム酵素活性の有意な回復を示した（データ＝平均±ＳＤ、ｎ＝３、＊＝ｐ＜０．０５）。 パルミテート対照と比較した、ＨｅｐＧ２細胞における２５％のＰＥＦＳＵ ａｃＮＰおよびＰＬＧＡ ＮＰのリソソームｐＨ変化を示す。１００ｕｇ／ｍＬのａｃＮＰは、１ｍｇ／ｍＬのＰＬＧＡ ＮＰよりも高いリソソームｐＨ変化を生成でき、はるかに強い酸性化効果を示した。 パネルＡ～Ｃは、ＢＳＡ（対照）、パルミテート（対照）およびパルミテート２５％のＰＥＦＳＵで処理されたＨｅｐＧ２細胞のオートファジーフラックスに対するａｃＮＰの機能的効果を示す。パネルＡ～Ｃ：ＬＣ３－ＩＩ、ＧＡＰＤＨおよびｐ６２のタンパク質レベルは、ウエスタンブロットデンシトメトリー分析によって決定された。２５％のＰＥＦＳＵ ａｃＮＰによる治療で観察すると、パルミテートによる処理はＬＣ３ＩＩおよびｐ６２の蓄積を誘導し、蓄積したオートファゴソーム、ＬＣ３－ＩＩおよびｐ６２タンパク質のクリアランスを観察した。（データ＝平均±ＳＤ、ｎ＝３、＊＝ｐ＜０．０５）。 パネルＡ～Ｃは、ＢＳＡ（対照）、パルミテート（対照）およびパルミテート２５％のＰＥＦＳＵで処理されたＨｅｐＧ２細胞のオートファジーフラックスに対するａｃＮＰの機能的効果を示す。パネルＡ～Ｃ：ＬＣ３－ＩＩ、ＧＡＰＤＨおよびｐ６２のタンパク質レベルは、ウエスタンブロットデンシトメトリー分析によって決定された。２５％のＰＥＦＳＵ ａｃＮＰによる治療で観察すると、パルミテートによる処理はＬＣ３ＩＩおよびｐ６２の蓄積を誘導し、蓄積したオートファゴソーム、ＬＣ３－ＩＩおよびｐ６２タンパク質のクリアランスを観察した。（データ＝平均±ＳＤ、ｎ＝３、＊＝ｐ＜０．０５）。 パネルＡ～Ｃは、ＢＳＡ（対照）、パルミテート（対照）およびパルミテート２５％のＰＥＦＳＵで処理されたＨｅｐＧ２細胞のオートファジーフラックスに対するａｃＮＰの機能的効果を示す。パネルＡ～Ｃ：ＬＣ３－ＩＩ、ＧＡＰＤＨおよびｐ６２のタンパク質レベルは、ウエスタンブロットデンシトメトリー分析によって決定された。２５％のＰＥＦＳＵ ａｃＮＰによる治療で観察すると、パルミテートによる処理はＬＣ３ＩＩおよびｐ６２の蓄積を誘導し、蓄積したオートファゴソーム、ＬＣ３－ＩＩおよびｐ６２タンパク質のクリアランスを観察した。（データ＝平均±ＳＤ、ｎ＝３、＊＝ｐ＜０．０５）。 パネルＡおよびＢは、ａｃＮＰによって誘発されるカテプシンＬ活性とオートファジーフラックスの機能変化を示す。パネルＡ：パルミテートと慢性的にインキュベートされたＨｅｐＧ２細胞は、ａｃＮＰによって救出されたカテプシンＬ活性を低下させる。 パネルＢ：パルミテートと慢性的にインキュベートされたＨｅｐＧ２細胞は、ｐ６２およびａｃＮＰによって部分的に逆転されるＬＣ３ＩＩ蓄積を増加させる。（データ＝平均値±ＳＤ、ｎ＝３、＊＝ｐ＜０．０５）。 パネルＡ～Ｃは、ＢＳＡ、パルミテートおよび２５％のＰＥＦＳＵ ａｃＮＰでの処理後のＨｅｐＧ２細胞における脂肪滴の蓄積に対するａｃＮＰの効果を示す。パネルＡ：Ｎｉｌｅ Ｒｅｄ色素で１５分間染色されたＨｅｐＧ２細胞は、脂質小胞への蓄積を示した。蛍光顕微鏡法は、パルミテートに曝されたＨｅｐＧ２細胞で２５％のＰＥＦＳＵ ａｃＮＰ処理を行った後、脂肪滴密度の有意な低下を示し、条件ごとにｎ＝３０～５０細胞であった。 パネルＢ：ＢＳＡ、パルミテートまたはパルミテート＋２５％のＰＥＦＳＵで処理したＨｅｐＧ２細胞の脂肪滴の定量化。 パネルＣ：１００ｎＭインスリンによって刺激されたＨｅｐＧ２細胞の糖新生。 パネルＡおよびＢは、それぞれ高脂肪食で１６週間飼育したマウスでの２４時間と６日間のａｃＮＰ処置（低用量と高用量）後の、アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）、ビリルビン（ＢＩＬ）、およびトリグリセリド（ＴＲＩＧ）の血清レベルを示す。６日間のａｃＮＰ処置により、血清中のトリグリセリドレベルが有意に低下した。 パネルＡおよびＢは、それぞれ高脂肪食で１６週間飼育したマウスでの２４時間と６日間のａｃＮＰ処置（低用量と高用量）後の、アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）、ビリルビン（ＢＩＬ）、およびトリグリセリド（ＴＲＩＧ）の血清レベルを示す。６日間のａｃＮＰ処置により、血清中のトリグリセリドレベルが有意に低下した。 ２４時間または６日間のいずれかの低用量と高用量ａｃＮＰで処置した、１６週間の高脂肪食マウスの肝臓切片のＨＥ染色。脂肪症、線維症、および炎症の程度は、ＨＥ染色から特徴付けられた。ＨＦＤ対照マウスでは、肝臓の断面に肝細胞の肥大と脂肪滴の蓄積が見られるが、低用量または高用量のａｃＮＰを６日間投与すると、脂肪滴の蓄積が有意に減少することを示す。

オートファジーは、細胞が長寿命のタンパク質とオルガネラを分解する、進化的に保存された必須の維持メカニズムである。このハウスキーピングプロセスは、オートファジーに依存して老化とともに蓄積する損傷した物質を除去する非増殖細胞では特に重要である。オートファジーの重要なステップは、オートファゴソームの動員と細胞内容の取り込みであり、その後に酸性リソソームとのオートファゴソームの融合が続く。リソソーム内のヒドロラーゼ酵素は、取り込まれた物質を適切に分解するために十分に低いｐＨに依存する。リソソームとオートファゴソームとの融合には、酸性リソソームも必要とする。したがって、リソソームの酸性度は、リソソーム機能とオートファジーフラックスの維持に不可欠な重要な局所シグナルである。

本明細書に記載される組成物および方法は、とりわけ、インビトロおよびインビボの両方でリソソーム酸性度を操作するための利用可能なツールの欠如から生じた。具体的には、リソソームの酸性度を低下させる、すなわち、ｐＨを上昇させることができる現在の薬理学的および分子的ツール（例えば、バフィロマイシン）が知られている。しかしながら、リソソームの酸性度を上げる、つまりｐＨを下げるツールはない。

メタボリックシンドローム、２型糖尿病、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、神経変性、肥満の心筋症など、多くの疾患状態が、損なわれたリソソーム酸性度に関連する。疾患の進行を直接決定する能力は、リソソームのｐＨを適切に操作できないことによって著しく妨げられてきた。例えば、研究により、グルコースおよび飽和脂肪酸の上昇に慢性的に曝された膵臓のβ細胞は、リソソームの酸性化の欠陥に起因するオートファジーフラックスを減少させたことが示された。β細胞機能障害におけるリソソーム酸性化の低減の役割を決定するために、我々は、紫外線による急性活性化時に欠陥のあるリソソームを酸性化する新規ナノ粒子（ＮＰ）を合成し、特徴付けた。これらのナノ粒子の光活性化により、リソソームの酸性度が２時間回復した。その後の分析により、糖脂質毒性に曝された膵臓β細胞におけるリソソーム酸性の実際の回復は、オートファジーフラックスおよびグルコース刺激インスリン分泌を正常化することが実証された。

しかしながら、外部トリガー（すなわち、紫外線）が必要であり、リソソームの酸性度の回復は短期間（２時間）であるため、光活性化可能なナノ粒子（ｐａＮＰ）の使用は短期間の実験に限定され、機能不全のリソソームを持つヒトまたは非ヒト動物における、リソソーム酸性度の長期およびインビボでの回復の利点の評価を許容しない。したがって、我々は、内部のリソソームトリガーによって活性化される新世代のナノ粒子を開発し、特徴付けた。これらの新世代のナノ粒子（酸で活性化された酸放出ナノ粒子またはａｃＮＰ）は、弱酸性の環境（約ｐＨ６）を保持している損傷のあるリソソームによっても活性化され得る。

これらの酸活性化酸放出ナノ粒子（ａｃＮＰ）は、非アルコール性脂肪性肝疾患とβ細胞機能障害の細胞モデルでオートファジーフラックスと細胞機能を復元するために使用できる。図１は、高脂質環境に曝された細胞でオートファジーフラックスを回復させるａｃＮＰの能力を詳述するモデルを示す。

特定の理論に縛られることなく、これらのナノ粒子は、静脈内投与または当技術分野で知られている他の投与方法によってインビボで利用することができる。これらのナノ粒子は、リソソームの酸性化を回復させてこれらの疾患を治療するための使用を含め、リソソームの酸性度が損なわれた疾患を研究するための重要な発展となる可能性がある。さらに、薬剤開発者はａｃＮＰを使用して、対象の疾患のリソソーム酸性化経路における薬剤標的を検証できる。

リソソームの酸性化の長期の回復はこれまで不可能であったため、ここで説明するａｃＮＰは最初のものである。

（１）リソソームの酸性化を長期間継続して回復させ、機構研究を促進するためのツール。
（２）研究者が損なわれたリソソーム酸性化を標的とすることの利点を調査できるようにするためのツール。したがって、医薬品開発者がリソソーム酸性化を治療標的として検証できるようにする。
（３）標的細胞小器官への侵入を感知し、細胞小器官内で自己活性化されるＮＰ。
（４）リソソームを他のオルガネラｐＨに干渉させることなく酸性化できる標的化された介入。
（５）インビボでのＮＰ使用の前例を考慮した、インビボでの利用に適したリソソーム酸性化介入。

非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）は、今日、世界で最も一般的な肝疾患であることが指摘されている。最近、脂肪毒性（ＬＴ）と呼ばれる肝臓遊離脂肪酸（ＦＦＡ）のレベルの増加が、オートファジーフラックスの阻害を引き起こし、同時にＮＡＦＬＤの病因となる、リソソームの酸性度の減少となることがわかっている。本発明の１つの態様では、新規の生分解性酸活性化酸放出ナノ粒子（ａｃＮＰ）を合成して、リソソーム酸性度およびオートファジーを戦略的に標的とし、操作する。本発明の１つの態様では、ａｃＮＰは、ｐＨ６．０（これは機能不全のリソソームで報告されるｐＨである）で分解されて、リソソームのｐＨをさらに下げて、それによってＬＴの下で肝細胞のオートファジーフラックスおよび細胞機能を増加させる酸成分であるＴＦＳＡ（テトラフルオロコハク酸）およびＳＡ（コハク酸）を放出することができるフッ素化ポリエステルに基づく。本明細書に記載されるａｃＮＰは、ＮＡＦＬＤおよび他の機能不全のリソソーム疾患を回復させる潜在的な治療法として役立ち得る。

本発明のａｃＮＰは、心筋症、加齢性認知症、アルツハイマー病、パーキンソン病、およびリソソーム蓄積症の治療、ならびにリソソーム機能の回復に有利に反応する哺乳動物の病状の治療を含む、多くの状況でオートファジーを促進するために使用することができる。本発明の１つの態様では、ａｃＮＰは、損なわれたリソソーム酸性度に関連する疾患の治療または予防として使用することができる。そのような疾患には、肥満、高脂血症、高血圧、メタボリックシンドローム、２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）、肝疾患、例えば非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肝硬変または肝臓癌、神経変性（例えば、加齢性認知症、アルツハイマー病、パーキンソン病など）を含むが、これらに限定されない。別の実施形態では、移植を必要とする対象に移植される肝臓にａｃＮＰを投与することができる。別の実施形態では、移植用の肝臓は、肝臓を本発明のａｃＮＰで灌流することにより脱脂質化される。

特定の理論に束縛されることなく、本明細書に記載され、実施例に示されるナノ粒子（ａｃＮＰ）は、過剰な脂質がオートファジーを阻害する細胞系において、リソソームｐＨ、オートファジーフラックス、および細胞機能の局所的回復を可能にするものと考えられる。これらの観察はインビボのモデルに拡張される。これらの新しいａｃＮＰは、内部のリソソームトリガーを介して、損なわれたリソソーム区画に酸を送達し、オートファジーフラックスと細胞機能を復元する。本発明のａｃＮＰは、リソソームのｐＨを、リソソームが正常に機能するために必要な酸性条件に調整することができる最初の利用可能な薬理学的または分子的ツールであると考えられている。

リソソームの酸性度の低下（ｐＨ＞６）は、高レベルの脂肪酸（ＦＡ）に曝された肝細胞およびβ細胞のオートファジーフラックスを阻害する。１つの態様では、フッ素化ポリエステルから調製されたａｃＮＰは、ｐＨ６の機能不全のリソソームに取り込まれ、構成的に活性化される。リソソームの酸性化を阻害する条件下で、適切な酸性化率、リソソームの標的化、およびリソソームの酸性度の回復を示す処方を決定するために、ポリマーの様々な組成が処方され、使用された。

特定の実施形態では、ａｃＮＰは、弱酸性環境に曝されるとそれらの酸およびアルコール成分に分解するポリエステルから調製される。酸が機能不全のリソソームにのみ放出され、さらなる酸性化が起こることを確実にするために、特定の実施形態では、テトラフルオロコハク酸（ＴＦＳＡ）を含有するフッ素化ポリエステルが使用される。フッ素化ポリエステルは、医療用途で広く使用されており、毒性が低く、インビトロおよびインビボでの生体適合性が高い。一般に、ポリエステルはｐＨ７～７．４の水性環境では容易に加水分解しない。しかしながら、わずかに酸性の環境（ｐＨ６．０）の存在下では、加水分解を受け、酸を分解および放出する。したがって、課題は、加水分解およびＮＰ分解時に周囲のｐＨをさらに下げることであった。比較的高いｐＫａ値を有するグリコール酸またはコハク酸（ＳＡ）（例えば、グリコール酸＝３．８３、コハク酸＝５．６および４．２）などの酸で構成される以前に合成された生分解性ポリエステルは、ｐＨをわずかに下げただけで、リソソームのｐＨを回復するには不十分である。しかしながら、本明細書で示すポリエステルナノ粒子では、我々は、約１．６の低いｐＫａを持つＴＦＳＡを使用した。したがって、ａｃＮＰは、より強い酸の放出を介して、リソソームのｐＨのより有意な回復を可能にする。

我々は、ポリエステルのａｃＮＰ組成が以下を有すると仮定した。（１）ＳＡに対するＴＦＳＡの量が多いと、バッファーとリソソーム区画で酸性応答が大きくなり、（２）より高い疎水性（例えば、ポリエステル内のジオール中に存在するメチレン炭素の数、例えば、エチレンからプロピレンからブチレングリコールへの増加により）は、よりゆっくりと分解し、より長い時間にわたって酸を供給する。したがって、１つの実施形態では、ａｃＮＰの合成において、ＴＦＳＡからＳＡの含有量が変化する。別の実施形態では、グリコール鎖の長さが変化する。グリコール鎖が短いと、酸性化が大きくなり、グリコール鎖が長いと、ａｃＮＰの分解が遅くなり、酸を長時間送達できるようになる。酸性化の度合いを調整するために、我々は、ＴＦＳＡ：ＳＡの様々な比率と、ｐＨ約６で活性化して、リソソームルーメンを通常レベル（ｐＨ約４．５）にさらに酸性化する様々な種類のジオール、すなわち、エチレングリコール、プロピレングリコールまたはブチレングリコールに基づいて、一連のポリエステルと対応するａｃＮＰを合成した。エチレングリコール、プロピレングリコール、およびブチレングリコールジオールは例示であり、非限定的であることが認識される。他の直鎖炭化水素型のジオール、例えば、ヘキサンジオール、ポリエチレングリコールも、ａｃＮＰを生成するために使用することができる。別の実施形態では、分岐したジオールを使用して、本発明のａｃＮＰを生成する。分枝状ジオールの例には、グリセロールおよびポリ（エチレングリコール）星形ポリマーが含まれるが、これらに限定されない。本明細書で提供される教示を使用して、他の好適なジオールが当業者により認識される。

さらなる実施形態では、ａｃＮＰは、ジオールの鎖長およびテトラフルオロコハク酸とコハク酸との比率が変化するポリエステルを含む。ポリマー組成および／またはａｃＮＰのテトラフルオロコハク酸とコハク酸との比率を変えることにより、酸性化の速度と程度を調整することができる。ＴＦＳＡの含有量が高いほど、リソソームの酸性化率が高くなる。

さらに、ａｃＮＰにおけるポリマー組成および／またはテトラフルオロコハク酸とコハク酸との比率を変化させることにより、ａｃＮＰを、短期または長期の治療を必要とするヒトまたは非ヒト哺乳動物に投与することができる。加えて、ポリマー組成および／またはテトラフルオロコハク酸とコハク酸との比率を変化させることにより、安定性が提供され、したがって、ａｃＮＰが保存される温度を制御する必要なしに、保存が提供される。

１つの例示的であるが非限定的な実施形態において、ポリマーは、以下のスキームＩによる重縮合法によって合成された。

様々な実施形態では、モノマー比率、およびグリコールの種類は、結果として生じるポリマーを変えるために変更される。最終的な組成および分子量は、例えば^１Ｈ、^１３Ｃ ＮＭＲおよびゲル浸透クロマトグラフィー技術を介して特徴付けおよび検証される。結果を実施例１および２に示す。ＴＦＳＡ：ＳＡ比率と、エチレングリコール、プロピレングリコール、またはブチレングリコールの両方が異なるポリマーのライブラリーを合成した（表１を参照）。特性化の化学組成および分子量数平均分子量Ｍｎ、重量平均分子量Ｍｗ、および多分散性、特にポリエステル１（１０％のＰＥＦＳＵ）、４（２５％のＰＥＦＳＵ）、５（ＰＥＳＵ）および１２（５０％のＰＢＦＳＵ）の多分散性Ｄを表１に示す（また、実施例１および２におけるこれらのポリマーの特徴付けも参照）。

特定の例示的であるが非限定的な実施形態では、５０～１００ｎｍのＮＰがエンドサイトーシス経路を介してリソソームに容易に取り込まれるため、この直径が選択される（２０、２１）。ポリエステル１（１０％のＰＥＦＳＵ）、４（２５％のＰＥＦＳＵ）、５（ＰＥＳＵ）および１２（５０％のＰＢＦＳＵ）から形成されたａｃＮＰの例示的な結果は、動的光散乱と走査型電子顕微鏡の研究による、比較的小さいサイズと均一な分布（直径＜１００ｎｍ、ＰＤＩ＜０．１４）を証明する。

特定の実施形態では、ｐＨ５～ｐＨ６．０である場合、インビボで血漿ｐＨを変化させるａｃＮＰ。ａｃＮＰは、ｐＨを６～３に有意に下げることができる。

パルミテート細胞の取り込み率およびエンドソーム／リソソーム区画への局在。

細胞およびリソソームへのａｃＮＰの取り込み速度の特徴付け。

本発明は、ポリエステルおよびａｃＮＰのライブラリーを提供する。特定の実施形態では、ポリマー合成収率は＞６０％であり、分散度（Ｍｗ／Ｍｎ）は＜１．４であり、ＭＷは予想されるＭＷの１０％以内である。ある実施形態では、ａｃＮＰの直径は、ＰＤＩ＜０．１で約７５ｍｍである。さらなる実施形態では、ａｃＮＰの直径は約１００～１２０ｎｍであり、ＰＤＩは０．１～０．２である。別の実施形態では、ａｃＮＰの直径は約５０～１００ｎｍである。本発明のａｃＮＰは、ミニエマルジョン技術を使用することによって、またはＬＶ－１マイクロフルイダイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ Ｃｏｒｐ）を使用することによって生成することができる。ａｃＮＰ組成物の酸性化、すなわちＴＦＳＡ含有量とグリコール鎖長との関係は、ポリマー組成物とリソソーム酸性化を最適化するために決定される。本発明のａｃＮＰは、細胞に対して細胞傷害性ではなく、そしてマイクロピノサイトーシス、エンドサイトーシス（クラスリンまたはカベオリン媒介）、食作用、またはマイクロピノサイトーシスを介して細胞によって取り込まれ得る。細胞内に入った後、ａｃＮＰはリソソームに局在化し、ａｃＮＰはリソソームを４時間以内に約４～約４．５の通常のｐＨに酸性化する。

ＮＰの合成における潜在的な制限は、凝集のために長期保存（＞３０日）でのａｃＮＰの不安定性である。１つの実施形態では、ＮＰは、合成後に凍結乾燥される。別の実施形態では、１つ以上の凍結保護剤（例えば、トレハロース、マンノースまたはスクロース）が添加される。凍結防止剤は、ＮＰ懸濁液を安定化させ、さらなる使用のための再懸濁の容易さを高める働きをする。本発明のａｃＮＰは、リソソーム酸性化を損なう条件下でのオートファジーフラックスの長期回復を可能にする。

本発明の１つの態様では、ａｃＮＰは、リソソーム酸性化が損なわれた罹患細胞において、リソソーム機能およびオートファジーフラックスの短期および長期の回復を提供する。１つの実施形態では、ａｃＮＰは、過剰なＦＡに曝された肝細胞およびβ細胞におけるリソソーム機能およびオートファジーフラックスの短期および長期の回復を提供する。１つの実施形態では、ａｃＮＰは、ＦＡに慢性的に曝されている細胞におけるリソソーム－オートファゴソーム融合能力、リソソーム加水分解酵素活性、およびオートファジーフラックスを増強する。ａｃＮＰは、最適なリソソームｐＨの継続的かつ長期の回復を可能にする。検証実験により、ａｃＮＰは、β細胞機能障害のインビトロ疾患モデルにおいて、リソソーム機能とオートファジーフラックスの短期および長期の回復を提供できることが示された（ａｃＮＰは、４時間のインキュベーション後にＢ細胞のリソソームｐＨを低下させることができる）。

ＦＡへの慢性的な曝露によって引き起こされるオートファジーフラックスの抑制は、リソソームの酸性度の低下の結果であり、オートファゴソームとのリソソームの融合とオートファゴソームの内容の劣化が損なわれる。１つの実施形態では、ａｃＮＰは、ＦＡに慢性的に曝されている細胞におけるリソソーム－オートファゴソーム融合能力、リソソーム加水分解酵素活性、およびオートファジーフラックスを増強する。

別の実施形態では、ａｃＮＰはリソソームのヒドロラーゼ活性を回復させる。細胞内のリソソーム酵素活性には、カテプシン（すなわち、カテプシンＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｌ、Ｏ、Ｓ、Ｖ）、グルコセレブロシダーゼ（ＧＢＡ）、またはＬＡＭＰ（すなわち、ＬＡＭＰ１、ＬＡＭＰ２、ＬＡＭＰ５）を含む。

別の実施形態では、ａｃＮＰは、リソソーム機能不全を有する細胞におけるオートファジーフラックスを回復させる。リソソーム機能不全の細胞には、脂質または脂肪酸に慢性的に曝された細胞が含まれる場合がある。オートファゴソーム形成中、ホスファチジルエタノールアミンはサイトゾルＬＣ３（ＬＣ３－Ｉ）に結合して、オートファゴソーム膜に隔離されたＬＣ３－ＩＩを形成する。ＬＣ３は、オートファゴソーム内容物のマーカーとして機能する。したがって、機能細胞では、リソソームの酸性化によりオートファゴソームとの融合が起こり、オートファゴソームとＬＣ３－ＩＩを含むその内容物の分解が可能になる。損なわれたリソソームの酸性化は、オートファゴソームの分解を減らす。したがって、融合はＬＣ３－ＩＩの蓄積をもたらす。オートファジーフラックスへの影響を推定するために、２つの試験が適用された。第１に、オートファゴソームで分解されたｐ６２の測定である。第２に、オートファゴソームの分解を完全にブロックすることは、オートファゴソーム形成への影響を推定できた（ＬＣ３－ＩＩの測定）。機能不全のオートファゴソームの蓄積を防ぐためのａｃＮＰの能力を試験するために、脂肪毒性への１６時間の曝露全体の間に細胞をａｃＮＰで処理した。慢性のＦＡ曝露により、細胞内のＬＣ３－ＩＩおよびｐ６２レベルが増加し、ａｃＮＰによる処理により、これら２つのタンパク質のレベルが正常化した。

別の実施形態では、ａｃＮＰは、リソソーム機能不全を有する細胞におけるタンパク質およびミトコンドリアターンオーバーを正常化する。タンパク質のターンオーバーとミトコンドリアのターンオーバーを測定することにより、オートファジーの特定の結果に対するａｃＮＰの影響を定量化できる。オートファジーの２つの重要な生理学的役割は、タンパク質とミトコンドリアのターンオーバーである。ミトコンドリアのターンオーバーは、細胞内のミトファジーの割合をモニターするプローブ、Ｆｉｓ１－ＧＦＰ－ｍＣｈｅｒｒｙ（Ａｎｎｅ Ｂｕｒｎｅｔ博士によって寄託されたＡｄｄｇｅｎｅプラスミド）を使用して決定された。Ｆｉｓ１－ＧＦＰ－ｍＣｈｅｒｒｙは、ミトコンドリアが酸性のオートファゴソームに入り、蛍光が消光することを報告する。

ミトコンドリアのタンパク質ターンオーバーは、プローブであるＭｉｔｏＴｉｍｅｒ（Ｒｏｂｅｒｔａ Ｇｏｔｔｌｉｅｂ博士によって寄託されたＡｄｄｇｅｎｅプラスミド）を使用して測定され、バフィロマイシンによるリソソームプロトンポンプの阻害に強く影響される（３２）。Ｍｉｔｏｔｉｍｅｒは、タンパク質の年齢に基づいて発光スペクトルを（緑から赤に）変更する。構成的発現の間のより高い赤／緑の蛍光比率は、ミトコンドリア内の古いタンパク質の蓄積を示し、オートファジーを介してミトコンドリアを効果的に取り除くことができないと解釈される。

オートファジーに対するａｃＮＰの効果を確認するには、ＩＮＳ１細胞とＨｅｐＧ２細胞を過剰な脂質で処理し、プロテアーゼ阻害剤、例えばペプスタチン＋Ｅ６４Ｄ、の存在下または非存在下でａｃＮＰをインキュベートする。プロテアーゼ阻害剤は、オートファゴソームの内容物の分解を防ぐ。我々は、慢性的なＦＡ曝露によって引き起こされるリソソームの酸性化の低下により、β細胞および肝細胞における赤／緑のＭｉｔｏＴｉｍｅｒタンパク質の比率が増加すると考えている。ａｃＮＰによるオートファジーフラックスのレスキューは、マイトファジーを回復し、ＦＡで処理された細胞の赤／緑の蛍光を正常化する。

インビボでのリソソーム酸性化の薬理学的阻害は脂肪肝をもたらし、オートファジーの阻害はグルコース刺激インスリン分泌を損なう。今日まで、酸性化の増加が脂肪肝およびインスリン抵抗性（ＩＲ）を逆転させることができるかどうかは不明である。特定の理論に縛られることなく、我々は。リソソームの酸性度とオートファジーフラックスの回復は肝細胞の脂質含有量を正常化し、グルコースに応答してインスリンを分泌するβ細胞の能力を高めると考えている。

オートファジーはリポファジーと呼ばれるプロセスで脂肪滴を消費し、肝細胞内での脂肪滴の蓄積はインスリン抵抗性（ＩＲ）の発生に因果的役割を果たす。本発明の１つの態様では、ａｃＮＰによるオートファジーの活性化は、リポファジーを増加させることにより、肝細胞への脂質負荷を減少させた。別の実施形態では、過剰なＦＡ曝露の結果としてのリソソーム機能障害を有する対象のａｃＮＰ治療は、プロテインキナーゼＢ（Ａｋｔ）のリン酸化を増加させた。プロテインキナーゼＢ（Ａｋｔ）は、インスリン受容体の刺激に応答して、ＰＩ３Ｋによって直接リン酸化される。Ａｋｔのリン酸化はＳｅｒ４７３で起こる。インスリン抵抗性（ＩＲ）の状態では、ＩＲを誘発するＦＡ曝露の結果として、Ｓｅｒ４７３のリン酸化が減少する。別の実施形態では、ａｃＮＰは、インスリン抵抗性肝細胞におけるグルコース産生に対するインスリン阻害効果を回復させた。

肝細胞によるグルコース産生を低下させるインスリンの能力は、肥満したインスリン抵抗性のヒトでは減少し、肝臓の脂質蓄積と強く相関する。ａｃＮＰがインスリン抵抗性肝細胞のグルコース産生に対するインスリン阻害効果を回復できるかどうかを判断するには、肝細胞を分離し、ａｃＮＰの存在下または非存在下で、ＦＡで慢性的に培養する。

本発明の１つの態様において、過剰な脂質環境に曝された細胞のａｃＮＰ処理は、長期間にわたって酸性化を回復し、細胞におけるグルコース刺激インスリン分泌の完全かつ持続的な回復をもたらした。１つの実施形態では、グルコース刺激インスリン分泌の欠陥は、哺乳動物に有効量のａｃＮＰを投与することにより、過剰な脂質に曝露された哺乳動物で防止された。

本発明の１つの態様では、ａｃＮＰは、異なるポリエステル組成のポリマーを含む。１つの実施形態では、ａｃＮＰは、ジオールの鎖長が変化するポリエステルを含む。異なる鎖長のジオールを有するポリエステルは、エチレングリコール、プロピレングリコール、ブチレングリコール、ヘキサンジオール、ポリエチレングリコールからなる群から選択される。

別の実施形態では、ポリエステルは、異なる鎖長の直鎖または分岐炭化水素である。別の実施形態では、ａｃＮＰは、コハク酸（ＳＡ）に対するテトラフルオロコハク酸（ＴＦＳＡ）の様々な比率を含む。ＴＦＳＡとＳＡの比率は、約１０：９０、約１５：８５、約２０：８０、約２５：７５、約３０：７０、約３５：６５、約４０：６０、約４５：５５、約５０：５０、約５５：４５、約６０：４０、約６５：３５、約７０：３０、約７５：２５、約８０：２０、約１５：１５、約９０：１０、約９５：５、および約１００：０からなる群から選択される。

本発明の１つの態様では、ａｃＮＰを含む医薬製剤およびその使用方法が提供される。

前述および本明細書で提供される例を考慮して、当業者は、リソソーム酸性度およびオートファジーを戦略的に標的とし、操作するために、新規の生分解性酸活性化酸放出ナノ粒子（ａｃＮＰ）を合成したことを認識するであろう。これらのａｃＮＰはｐＨ６．０で分解される（機能不全のリソソームで報告されたｐＨは、リソソームのｐＨをさらに下げる成分の酸を放出するため、ＬＴの下で肝細胞のオートファジーフラックスおよび細胞機能が増加する）。ａｃＮＰは、ＮＡＦＬＤまたは他のリソソーム機能不全疾患と診断された個人のリソソーム機能を回復させる治療薬として有用である。

以下の実施例は、例示のために提供されるが、特許請求される発明を限定するものではない。

実施例１
生分解性ポリエステルは脂肪毒性下の細胞におけるリソソーム酸性化を調節する。

ポリエステルのライブラリーの合成

ポリエステルの調製には重縮合を使用し、ＴＦＳＡ：ＳＡの比率に基づいて反応温度と時間をわずかに変更した。ＴＦＳＡ：ＳＡ比率が５０％を超えるポリエステルを１３０℃で反応させ、他のポリエステルでは１５０℃で反応させた。ポリマー組成、分子量、およびＰＤＩは、^１Ｈ ＮＭＲ、^１３Ｃ ＮＭＲ、^１９Ｆ ＮＭＲ（ＳＩ）およびゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）を使用して特性評価した（図２、パネルＡ～Ｅ）。ＮＭＲスペクトルからの結果は、ポリエステルの組成を確認し、理論比と一致した。同じシリーズの分子量は同じ順序である。

ポリエステルの熱特性

ポリエステルの熱挙動は、示差熱量走査（ＤＳＣ）と熱重量分析（ＴＧＡ）で特徴付けられた。溶融温度、結晶化温度、ガラス転移温度、およびポリエステルが５％の分解（Ｔ_ｄ、５％）または最大の分解（Ｔ_{ｄ、ｍａｘ}）を示す温度を測定し、結果を表２に示す。特徴付けられた多くのポリエステルについて、溶融温度または結晶化点は検出されなかった。ほとんどのガラス転移温度は－２０°Ｃ未満である（図３Ａおよび３Ｂ）。この研究の結果は、ポリエステルがほとんどアモルファスであることを示す。ガラス転移温度は、使用したＴＦＳＡ：ＳＡの比率が増加するにつれて低下した。合成されたすべてのポリエステルは、２５０°Ｃまで分解を示さなかった（図３Ｃ）。

下の表２に、合成されたポリエステルの熱特性を示す。Ｔ_ｇは転移温度、Ｔ_ＣＣは冷結晶化温度、ΔＨ_ＣＣは冷結晶化の間の熱流の変化、Ｔ_ｍは融解温度、ΔＨ_ｍは溶融時の熱流の変化、Ｔ_Ｃは結晶化温度、ΔＨ_Ｃは熱結晶化中の流動変化、Ｔ_ｄ，_５％はポリエステルが５％の分解を示す温度、およびＴ_{ｄ，ｍａｘ}はポリエステルが最大の分解を示す温度、を示す。

単分散ナノサイズのａｃＮＰの合成

ポリエステルは、ナノ粒子を形成する能力について特徴付けられた。ナノ粒子を作製する方法には、これらに限定されないが、ミニエマルジョン、超音波処理^１２、溶媒置換、およびナノ沈殿が含まれる。ナノ沈殿は、高剪断応力なしで毒性のない溶媒の使用を可能にするシンプルで高速な方法である。さらに、この方法では、ａｃＮＰを生成するために工業規模に簡単にスケールアップできる。ナノ粒子の形成は、粒子の核形成、分子成長、および凝集に依存する。手短に言えば、ナノ粒子は、最初にポリマーを水混和性溶媒（すなわち、アセトン／ＤＭＦ）に溶解して形成し、２５Ｇシリンジニードルを介して、様々な種類の界面活性剤を含む高速攪拌水溶液に滴下した。時間をかけて透析することにより、有機溶媒と過剰の界面活性剤を除去した。サイズと安定性の異なるａｃＮＰを取得するために、（１）ポリマーの種類と量、（２）有機溶媒の種類、（３）溶媒と水溶液の比率、（３）界面活性剤の種類、（４）界面活性剤に対するポリマーの比率、（５）透析時間、および（６）温度（表３）。ａｃＮＰのサイズ、形態、および安定性は、動的光散乱（ＤＬＳ）、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）、およびゼータ電位計によって特徴付けられた。（図４）は、ブチレングリコール（ポリエステル）とＴＦＳＡ：ＳＡの比率で合成された様々なポリマーを使用して配合された代表的なａｃＮＰのＳＥＭ画像を示す。

溶媒種の影響

ａｃＮＰの形成に使用される様々な変数を調査するために、５０％のＰＢＦＳＵがモデルポリマーとして選択された。ａｃＮＰの調製には、様々な溶媒を使用した。使用した溶媒の中には、アセトン、ジクロロメタン（ＤＣＭ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）があった。ＤＭＦから形成されたａｃＮＰは最も球形で、多分散性が最も低く（０．１２５）、高い安定性を示す。ａｃＮＰｓのサイズも小さく、１３３．９ｎｍであった。表３は、アセトンから合成されたａｃＮＰがさらに小さいことを示すが、ＳＥＭ画像（図５、すなわち図５に変化すること）は、過剰な界面活性剤と不均一な形態を示し、不完全な粒子形成（ＳＩ）を示す。

界面活性剤の種類の影響

使用する溶媒の種類を決定した後、ａｃＮＰ形成に対する様々な界面活性剤の影響を検討した。ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）で作られたナノ粒子は、最小直径とＰＤＩを生成したが、ポリ－Ｌ－リジンのナノ粒子は、ＳＤＳを使用して得られたものよりも１桁大きく、有意な凝集をもたらした。２つの非イオン性界面活性剤、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）とプルロニック（登録商標）Ｆ１２７も、ＳＤＳよりも大幅に大きなナノ粒子を生成した。

ポリマーと界面活性剤との比率の影響

ポリマーと界面活性剤との比率は、ＤＭＦ中のポリマーとＮａｎｏｐｕｒｅ水中の界面活性剤のｍｇ／ｍＬでの最終濃度を変化させることによって決定された。界面活性剤の濃度が（１）より大きい、（２）等しい、または（３）使用されるポリマーの濃度未満である配合が行われた。ａｃＮＰ形成の最適な比率は１：４（つまり、５０％のＰＢＦＳＵの１ｍｇ／ｍＬ最終濃度：４ｍｇ／ｍＬのＳＤＳ）であることがわかった。その後の配合では、溶媒と水との比率を一定にし、ポリマーと界面活性剤の比率を１：４に保ち、これらのパラメーターの効果を決定するために単一のパラメーターを変化させた。

溶媒の水に対する比率の影響

溶媒と水との比率が低いほど、はるかに小さいナノ粒子が形成される。

透析温度の影響

ポリマー対界面活性剤の比率および溶媒対水溶液の比率が固定されたとき、透析温度および時間が決定された。ａｃＮＰｓ形成は０℃または２５℃のいずれかで試験された。これは、温度の操作が界面活性剤の臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）に影響を与えるためである。ＣＭＣは通常、温度の上昇とともにＣＭＣの上昇に対応する特定のポイントまで、温度の上昇とともに低下する。０℃では、水中のＳＤＳのＣＭＣは２．７５ｍｇ／ｍＬだったが、２５℃では、ＣＭＣは２．３０～２．５０ｍｇ／ｍＬの範囲内であった。ａｃＮＰ製剤は、ＣＭＣの上下で様々な濃度のＳＤＳを使用して０℃と２５℃の両方で試験された。２５℃でＣＭＣを超えるＳＤＳの濃度で最適なナノ粒子が形成された。ＳＥＭ画像は、この条件下で、形成されたａｃＮＰが球状であり、分散した集団を有していたことを示す（図６）。０℃では、サイズ、多分散性およびゼータ電位は２５℃で得られたものと同様であった。室温が２５℃を超える高温は、ＤＭＦの揮発性のため試験されなかった。さらに、高温での透析によりＣＭＣが低下し、界面活性剤がポリマーをカプセル化する能力が低下した。これは、迅速なミセル形成のために妨げられていた。

透析時間の影響

透析時間は、ナノ粒子のサイズに大きく影響することがわかった。２４～３６時間の時点を比較すると、２４時間の透析時間で、最適なサイズと安定性のナノ粒子が得られた。透析時間が３６時間に増加したとき、ａｃＮＰのサイズは有意に変化しなかった（図７）。

ポリマーの種類の影響

使用するポリマーの種類は、ａｃＮＰを形成するために必要な透析時間に影響する。ＴＦＳＡがより低いａｃＮＰ：ＳＡ含有量またはより短いグリコール長では、より短い透析時間が必要であった。つまり、７５％のＰＢＦＳＵと１００％のＰＢＦＳＵは６時間の透析で済んだ（形成されたａｃＮＰの平均直径は９４．６ｎｍで、ＰＤＩは０．１２４である）、２５％のＰＥＦＳＵの場合、透析はわずか８時間で済んだ。一方、２５％のＰＢＦＳＵまたは５０％のＰＢＦＳＵは、ａｃＮＰの形成に２４時間必要であった（平均直径１３３．９ｎｍ、ＰＤＩ ０．１２５）。ａｃＮＰの形成は、ＤＬＳおよびＳＥＭ画像の両方を使用して特徴付けられる（図４）。

ｐＨおよびＧＰＣ分析によるパルミテートの分解率の特性評価

上記の合成パルミテートを使用して、様々な種類の緩衝環境におけるｐＨ調節能力と分解速度を調べた。ａｃＮＰは、ＤＩ水またはｐＨ６．０の２０ｍＭ ＰＢＳバッファーに時間をかけて懸濁され、ｐＨと分子量の両方の変化が測定された。２０ｍＭ ＰＢＳバッファーｐＨ６．０は、１９±６ｍｍｏｌ／Ｐｈの機能不全のリソソームの緩衝能力をシミュレートするために選択された。ｐＨ６．０では、エチレングリコール含有ポリエステルは、ブチレングリコール含有ポリエステルと比較してより早く酸性化した（図１３、パネルＢ）。同じシリーズのａｃＮＰ、つまりＰＢＦＳＵ ａｃＮＰを比較すると、ＴＦＳＡ：ＳＡ比が高いＰＢＦＳＵ ａｃＮＰの方が、酸性化率が高かった（図８）。

ａｃＮＰの分解速度は、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）を使用して、３７℃の水中でのポリマーの分子量の減少率を測定することによって測定した。ａｃＮＰは水に懸濁され、３７℃で１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、１週間、２週間インキュベートされた。指定された各時点で、ポリマー溶液のアリコートを収集し、乾燥させ、ＧＰＣを使用して分析する前にテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）溶媒に再溶解した。図８Ｂは、ａｃＮＰが安定した速度で分解したことを示しており、分解が中央からではなく末端基から起こったことを示す。ＰＢＦＳＵシリーズでは、ＴＦＳＡ：ＳＡ比率が高いほど、劣化率が遅くなる。

異なるポリエステルを使用して調製されたａｃＮＰを比較すると、より短いグリコール鎖を有するポリエステルはより速い分解を経験した。分解曲線に基づいて、ＰＢＦＳＵポリエステルは不均一な二相分解を受けた。最初のフェーズ（０～２４時間）では、ＰＢＦＳＵエステル結合が全体にわたってゆっくりと加水分解された。第２フェーズ（２４～４８時間）では、分解生成物のカルボン酸末端基（つまり、ＴＦＳＡまたはＳＡ）がｐＨを下げ、ナノ粒子の内部のさらなる分解を触媒した。これにより、水の浸透が速くなり、分解速度の増加に見られるように、ナノ粒子が大量に失われる。

ａｃＮＰの細胞傷害性およびａｃＮＰによるリソソームｐＨ回復能力

ＰＢＦＳＵ ａｃＮＰの細胞傷害性は、ＨｅｐＧ２細胞株で測定された。ＨｅｐＧ２細胞を、１０００μｇ／ｍＬまでの濃度の異なるポリマー：ＴＦＳＡ／ＳＡ比率を使用して調製したａｃＮＰとインキュベートした場合、有意な死は観察されなかった（図９）。パルミテートによって誘発された細胞死を救済するＰＢＦＳＵ ａｃＮＰの能力が決定された。（図９Ｂ）。より高い酸放出速度および放出量を有するａｃＮＰが細胞生存率を高めることができることが見出された。

さらに、ａｃＮＰは、脂肪毒性条件下でＨｅｐＧ２細胞のリソソームｐＨを調節する能力について試験された。ＨｅｐＧ２細胞は、（１）ＢＳＡに複合化されたパルミテート（パルミテート：ＢＳＡ）と１６時間インキュベートされ、または（２）パルミテート：ＢＳＡと様々なａｃＮＰ（５０％、７５％、１００％のＰＢＦＳＡ ａｃＮＰ）で１６時間インキュベートされた。リソソームのｐＨは、ＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ（商標）黄色／青色染料と共焦点画像解析で評価した。ＭｅｔａＭｏｒｐｈ分析ソフトウェアを使用して、画像を定量化した（図１９ＡおよびＢ）。結果は、ブチレン型のａｃＮＰが、急速な分解速度と一致して、インキュベーションの１６時間以内にリソソームのｐＨを回復することを示した。

実施例２
分解性酸性ナノ粒子は脂肪毒性下の細胞のリソソームｐＨとオートファジーフラックスを回復する。

生分解性ａｃＮＰ（ＰＥＦＳＵ ａｃＮＰ）の合成と特性評価、および溶液中での分解速度論

酸で活性化された酸性ナノ粒子は、周囲のｐＨを著しく低下させた、生分解してカルボン酸成分－テトラフルオロコハク酸（ＴＦＳＡ）とコハク酸（ＳＡ）を放出することができる一連の合成ポリ（エチレンコハク酸－コ－テトラフルオロコハク酸）ポリマー（ＰＥＳＵおよび２５％のＰＥＦＳＵ）に基づいて合成した（図１１）。

一般に、ポリエステルはｐＨ７～７．４の水性環境では容易に加水分解しない。しかしながら、わずかに酸性の環境（ｐＨ６．０）の存在下では、加水分解を受け、分解されて酸を放出する。課題は、加水分解とＮＰ分解により周囲のｐＨがさらに低下することである。グリコール酸や乳酸など、ｐＫａ値が比較的高い（グリコール酸＝３．８３、乳酸＝３．８６など）酸で構成される以前に合成された生分解性ポリエステルは、ｐＨをわずかに下げるだけである。本発明のポリエステルは、約１．６のはるかに低いｐＫａを有するＴＦＳＡを組み込んでいる。これらのＴＦＳＡ／ＳＵポリエステルから作られたａｃＮＰは、ＤＬ－ラクチド－ｃｏ－グリコリドから合成されたＰＬＧＡナノ粒子よりも強い酸を放出することにより、リソソームのｐＨの大幅な回復を可能にする。

ａｃＮＰ酸性化能力

これらのａｃＮＰの酸放出およびｐＨ低下特性を実証するために、２つの異なるポリマー（ＰＥＳＵおよび２５％のＰＥＦＳＵ）を、ＴＦＳＡおよびＳＡの比率を様々な分解および酸放出速度で変化させることによって合成した。^１Ｈ、^１３Ｃおよび^１９Ｆ ＮＭＲスペクトルおよびポリマーの特徴付けを図１１に示す。

ポリエステル、１０％のＰＥＦＳＵ、２５％のＰＥＦＳＵ、ＰＥＳＵおよび５０％のＰＢＦＳＵから形成されたａｃＮＰの例示的な結果は、動的光散乱および走査型電子顕微鏡研究によると、比較的小さいサイズおよび均一な分布（直径＜１００ｎｍ、ＰＤＩ＜０．１４）を示す（図４（上記のＰＢＦＳＵ）、パネルＡおよび図１３（ＰＥＦＳＵ）、パネルＡ）。

酸性化の速度と程度は、ａｃＮＰをｐＨ６．０、７．４、８．０の２０ｍＭ ＰＢＳバッファー、ならびに２５および３７℃の両方のＤＩ水で長時間インキュベートすると、容易に決定できる。２０ｍＭ ＰＢＳバッファーｐＨ６．０は、機能不全のリソソーム（１９±６ｍＭ、ｐＨ＝６．０）の緩衝能力をシミュレートするため選択された（２２）。さらに、これは生体内の血漿環境をより代表するものであるため、実験は血漿中、ｐＨ７．４で繰り返される。血漿ｐＨを変化させるａｃＮＰは、インビボ試験との互換性がない可能性が高いため、これ以上考慮する必要はない。予備データは、ｐＨ７．４バッファーに曝された場合、２５％のＰＥＦＳＵ（２５：７５ ＴＦＳＡ：ＳＡおよびエチレングリコール）で構成されるａｃＮＰはｐＨを変化させなかったが、ｐＨ６．０バッファーでは、ｐＨが６から３に大幅に低下したことを示す（１４Ｂ）。対照的に、ポリエステル、５０％のＰＢＦＳＵ（５０：５０ ＴＦＳＡ：ＳＡおよびブチレングリコール）で構成されるａｃＮＰは、エチレングリコールと比較してブチレングリコールの疎水性が高いため、酸の放出が遅くなる。（図１３Ｂ）。１０％のＰＥＦＳＵ（１０％のＴＦＳＡ）で構成されるａｃＮＰは、ＴＦＳＡ含有量が少ないため酸性化速度が低下したため、２５％のＰＥＦＳＵよりもゆっくりと分解した。（図１３Ｂ）。これらの結果は、我々の仮説を裏付けている。したがって、我々は、ＴＦＳＡ：ＳＡ比率とグリコールの種類を変更することで、酸性化の程度を細かく制御できると考える。

ＴＦＳＡが０％とＳＡが１００％のＰＥＳＵは、分解速度が遅く、ｐＨに大きな変化がないと予想されるため、対照として機能した。一方、２５％のＰＥＦＳＵ（２５％のＴＦＳＡおよび０％のＳＡ）では、ＴＦＳＡ含有量が増加し、酸性度およびｐＨ低下特性が向上する。単分散ａｃＮＰパルミテートは、ナノ沈殿技術によって合成されたポリマーを使用して形成された^１。ａｃＮＰのサイズ、形態、および安定性は、動的光散乱（ＤＬＳ）、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）、およびゼータ電位計によってそれぞれ特徴付けられた。（図１４、パネルＡ）。形成されたａｃＮＰの平均直径は１００ｎｍ、ゼータ電位は－２５～－３０ｍＶであり、溶液中での安定性が良好であることを示す（図１４、パネルＡ）。

ａｃＮＰの酸性化の程度を決定するために、４８時間にわたって、ＰＢＳであるｐＨ６．０バッファー（リソソーム環境模倣緩衝液）およびｐＨ７．４でのａｃＮＰの懸濁液のｐＨ変化を測定した。ｐＨ６．０では、２５％のＰＥＦＳＵ型のａｃＮＰが、最初の４時間以内にＰＢＳのｐＨバッファー（２０ｍＭ）を大幅に酸性化し、最大２４時間まで酸性化を継続した。（図１３Ｂおよび図１４Ｂ、左パネル）。対照的に、ＰＥＳＵ型のａｃＮＰは、おそらくポリマーの分解速度が遅いために放出されたコハク酸の量が少なく、ｐＨの低下に大きな影響を与えなかったため、ｐＨの変化を引き起こさなかった（図１３Ｂおよび図１４Ｂ、左パネル）。ｐＨ放出は、他の細胞株で同様のアプリケーションに使用されているＰＬＧＡ ＮＰとも比較されており、２５％のＰＥＦＳＵ ａｃＮＰよりもはるかに遅い酸放出速度を示した（図１５）。

ａｃＮＰの細胞の取り込み率およびエンドソーム／リソソーム区画への局在。

細胞およびリソソームへのａｃＮＰの取り込み速度の特徴付け。

細胞およびリソソームへのａｃＮＰ取り込みの経路を視覚化するために、ａｃＮＰはローダミン（Ｒｈｏ－ａｃＮＰ）で共有結合的に標識された。ＨｅｐＧ２およびＩＮＳ１細胞をＲｈｏ－ａｃＮＰと２４時間インキュベートした。リソソームを標識するＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎ ＤＮＤ－２６を追加して、共焦点画像解析の３０分前に培養液で５０ｎｍｏｌ／ｍＬの最終濃度を達成した（２５、２６）。Ｒｈｏ－ａｃＮＰとＬｙｓｏｔｒａｃｋｅｒ緑色色素の共局在を定量化して、Ｒｈｏ－ａｃＮＰがリソソーム内に局在するかどうかを確認した。Ｒｈｏ－ａｃＮＰ（２５％のＰＥＦＳＵ）は、Ｌｙｓｏｔｒａｃｋｅｒ緑色色素との共局在を示し、リソソームへの取り込みを示す（例えば、図１６を参照）。

細胞傷害性およびａｃＮＰの取り込み

ａｃＮＰの細胞傷害性は、ＨｅｐＧ２細胞株で測定された。有意な細胞死を誘発せずにＨｅｐＧ２細胞の治療に役立つ最適なａｃＮＰ（ＰＥＳＵおよび２５％のＰＥＦＳＵ）濃度を決定するために、２４時間、１０μｇ／ｍＬ～１０００μｇ／ｍＬの範囲の様々な濃度のａｃＮＰを使用して、用量反応細胞傷害性アッセイを行った。次に、異なる濃度の処理条件下での生存細胞の割合を、パルミテートまたはａｃＮＰのいずれかを使用して、対照の未処理細胞に対して正規化する。２つの種類のａｃＮＰは、１０００μｇ／ｍＬの濃度まで有意な細胞死をもたらさなかった（図１７Ａ）。最適な用量は１００μｇ／ｍＬであった、これは、細胞に対する細胞傷害性を回避するためのさらなるアッセイのために選択される。

ａｃＮＰはリソソームに局在した。

肝細胞への時宜を得たな取り込みとリソソームへの特定の局在は、ａｃＮＰがインビトロで効果を発揮するために重要である。ａｃＮＰのサイズ（約１００ｎｍ）は、エンドソーム－リソソームシステム内での取り込みと局在化につながると予想されていた。１００μｇ／ｍＬの選択した濃度を使用して、ローダミン標識パルミテート（Ｒｈｏ－ａｃＮＰ）をＨｅｐＧ２細胞と２４時間インキュベートした。フローサイトメトリーは、Ｒｈｏ－ａｃＮＰの取り込みのほとんどが最初の８時間以内に発生することを決定した（図１７Ｂ）。ＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ（商標）青色色素を用いた共局在顕微鏡検査により、Ｒｈｏ－ａｃＮＰがＨｅｐＧ２細胞のリソソームに局在化することが確認された（図１７Ｃ）。

１０％のＰＥＦＳＵ ａｃＮＰおよび２５％のＰＥＦＳＵ ａｃＮＰは、脂肪酸に曝露されたＨｅｐＧｓ細胞のリソソームｐＨおよび細胞生存率を回復する。

肝細胞およびβ細胞の機能不全のリソソームを酸性化するａｃＮＰの能力は、ｐＨに基づいて発光が変化するＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ（商標）黄色／青色色素を使用して共焦点画像解析により細胞をモニタリングすることにより定量化された。細胞は、４００μＭの４：１のパルミテートとウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（４：１のパルミテート：ＢＳＡ）との複合体でインキュベートし、０．１～１０００μｇ／ｍＬの範囲の様々な濃度の様々なａｃＮＰと１６～１８時間、共インキュベートした（ＨｅｐＧ２細胞では１６時間、Ｂ細胞では１８時間）。パルミテートまたはａｃＮＰを添加していない細胞と、ａｃＮＰのみで処理した細胞を対照として使用した。パルミテート：ＢＳＡ処理の１８時間の時点は、細胞における最高のリソソームのｐＨのアルカリ化をもたらした時点として、２０時間または２４時間と比較して、Ｂ細胞に対して選択された（１０）。処理後、１μＭのＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ（商標）黄色／青色色素を添加し、アルカリ化を最小限に抑えるために、色素添加後５分以内に細胞を画像化した。比率の値は、以前に決定された標準曲線に基づいて、リソソームのｐＨに合わせて調整された（１４）。パルミテートで１６時間処理したＨｅｐＧ２細胞は、リソソームのｐＨが大幅に上昇した（約０．６のｐＨ単位）。

結果は、１０％のＰＥＦＳＵまたは２５％のＰＥＦＳＵ（それぞれポリエステル１および４）で構成されるａｃＮＰの有無にかかわらず、４：１のパルミテート：ＢＳＡで処理されたＨｅｐＧ２細胞が、ＢＳＡ対照と同様にリソソームｐＨの有意な回復を示すことを示す（図１８ＡおよびＢ）。

細胞は、パルミテート－ＢＳＡ（４：１の比率）および様々な濃度（０．１～１０００ｕｇ／ｍＬ）のａｃＮＰを２４～７２時間インキュベートした後に評価された。１０％のＰＥＦＳＵまたは２５％のＰＥＦＳＵ（それぞれポリエステル１および４）のパルミテートＢＳＡおよびａｃＮＰで処理されたＨｅｐＧ２細胞の予備データは、未処理の対照と比較して細胞生存率の有意な救済を示した（図１８Ｃ）。

ａｃＮＰは、パルミテートに曝された肝細胞のリソソームのｐＨとサイズを復元する。

ａｃＮＰ機能とリソソームへの細胞取り込みを実証したので、本質的な問題は、ａｃＮＰがＬＴに曝された細胞のリソソーム酸性を回復できるかどうかである。ＨｅｐＧ２細胞を、２５％のＰＥＦＳＵ ａｃＮＰを含むまたは含まないＢＳＡ、ＢＳＡと複合体化した０．４ｍＭのパルミテート（パルミテート：ＢＳＡ）に曝露した（図１９Ａ）。インキュベーション後、ＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ（商標）黄色／青色染料（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）が７５ｎｍ濃度で添加し、リソソーム酸性度およびサイズは、共焦点画像解析によって評価し、そして画像分析は、リソソームのアルカリ化を防ぐために、色素添加の５分以内にＭｅｔａＭｏｒｐｈ（登録商標）を用いて行った。

リソソームのＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ（商標）染色の特異性を実証するために、細胞を１００μＭのバフィロマイシンで２時間処理した後、画像解析を行ったが、リソソームのｐＨの中和によりＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ（商標）染色は見られなかった。（図１９Ｂ）。図１８Ｃは、パルミテートへの曝露により、リソソームのｐＨ（□）が０．６のｐＨ単位で大幅に増加したことを示す。パルミテートへの曝露はまた、ＢＳＡ処理細胞と比較して、リソソームのサイズを増加させた（◇）。ＰＥＳＵ ａｃＮＰによる処理はｐＨの低下を引き起こさず、図１４Ｂと一致する。このことは、分解と酸放出の速度が遅いことを示す。一方、２５％のＰＥＦＳＵ ａｃＮＰによる処理は、ＨｅｐＧ２細胞においてそれぞれ０．３および０．５のｐＨ単位の減少を引き起こした（図１９Ｃ）。２５％のＰＥＦＳＵ ａｃＮＰを追加すると、おそらくオートファジーによるリソソームのターンオーバーの増加が原因で、平均リソソームサイズが大幅に減少した^３４。

１ｍｇ／ｍｌの濃度で使用した場合にリソソームを酸性化することが以前に示されているＰＬＧＡナノ粒子での処理^３９は、１ｍｇ／ｍｌの濃度でパルミテートの下でリソソーム酸性を部分的に回復した（図２０）。比較すると、２５％のＰＥＦＳＵ ａｃＮＰは、１００μｇ／ｍｌの１０分の１の低濃度でリソソーム酸性を回復した。リソソームカテプシンの活性はｐＨ依存性であり、脂肪酸への暴露はカテプシン活性の阻害をもたらすことが研究により示される^{１６、３４}。

ａｃＮＰがパルミテートでインキュベートした細胞のリソソーム酵素カテプシンＬ活性を回復するかどうかを判断するために、Ｍａｇｉｃ ＲｅｄカテプシンＬ蛍光基質アッセイを実施した。結果は、２５％のＰＥＦＳＵ ａｃＮＰによるリソソーム酸性度の回復が、リソソームカテプシンＬのｐＨ依存活性を大幅に増加させることを示した。カテプシンＬ活性のこの増加は、ａｃＮＰで処理されていないパルミテートでインキュベートされた細胞と比較して、ａｃＮＰで処理されたパルミテートでインキュベートされた細胞におけるＭａｇｉｃ Ｒｅｄ蛍光強度の増加（図１８）と相関した。これはさらに、リソソームの酸性度の低下が、１６時間以内に脂肪毒性下でリソソームの機能的救済を引き起こすことを確認する。

ａｃＮＰによって制御されるリソソームの酸性化は、脂肪酸にさらされたＨｅｐＧ２細胞のオートファジーフラックスを復元する。

オートファゴソームの形成中、ホスファチジルエタノールアミンはサイトゾルＬＣ３（すなわち、ＬＣ３－Ｉ）に結合してＬＣ３－ＩＩを形成し、これはオートファゴソーム膜に隔離される。したがって、ＬＣ３－ＩＩの蓄積は、オートファゴソームの蓄積の代理マーカーとして機能する。（図１を参照）。リソソームの酸性度の回復がパルミテートに曝露されたＨｅｐＧ２細胞のオートファジーフラックスの抑制を軽減するかどうかを調査するために、微小管関連タンパク質１Ａ／１Ｂ軽鎖３（ＬＣ３－ＩＩ）の細胞内蓄積を測定した。オートファジー分解に対するａｃＮＰの効果をさらに確認するために、オートファジー中に分解され、オートファジーフラックスのマーカーとして使用されるタンパク質であるｐ６２タンパク質のレベルも測定された^４４。パルミテートがＨｅｐＧ２細胞でオートファジーフラックスを阻害するのに必要な時間を検証および決定するために、ＨｅｐＧ２細胞をパルミテートと１６時間、２０時間、または２４時間インキュベートし、ＬＣ３ＩＩおよびｐ６２の発現レベルを、ウエスタンブロットを使用して分析した（データは２０および２４時間については非表示）。１６時間で、パルミテートへの曝露によりＬＣ３ＩＩおよびｐ６２のレベルが増加し、オートファジーフラックスの抑制とオートファジー基質の蓄積が示された。（図２１Ａ）。ＨｅｐＧ２細胞とＰＢＳＵ ａｃＮＰを１６時間インキュベートしても、ＬＣ３ＩＩおよびｐ６２発現レベルに大きな変化はなかった（データ非表示）。２５％のＰＥＦＳＵ ａｃＮＰでの処理はＬＣ３ＩＩレベルの有意な減少をもたらし、オートファゴソームのクリアランスを示した（図２１Ａ～Ｃ）。２５％のＰＥＦＳＵ ａｃＮＰもｐ６２レベルを大幅に下げた。

図２２は、１０％のＰＥＦＳＵがカテプシンＬ活性を局在化および回復し、２５％のＰＥＦＳＵが慢性的なパルミテート曝露のＨｅｐＧ２細胞にあることを示す。リソソームの酸性度の増加によるオートファジーフラックス回復の効果をさらに正確に示すために、細胞を、リソソームのｐＨを上昇させるＶ－ＡＴＰａｓｅ阻害剤であるバフィロマイシンで２時間処理した。ＬＣ３ＩＩとｐ６２のレベルは治療時に大幅に増加した。このことは、リソソームのｐＨが低下したため、ａｃＮＰがオートファジーを増加させたことを示す。一方、リソソームとの融合時にオートファゴソームの内容物の分解を防ぐリソソームプロテアーゼ阻害剤であるロイペプチンで処理した細胞も、ＬＣ３ＩＩおよびｐ６２レベルの増加を示した。結果は、ａｃＮＰによるオートファジーの回復がリソソームプロテアーゼの活性に依存することを示した。リソソーム酵素の分解は酸性度の上昇をもたらし、このことはリソソームｐＨを下げ、よってオートファジーを増加させるために重要である。

ａｃＮＰによって制御されるリソソームの酸性化は、脂肪滴の蓄積を減らす。

インビボでのリソソーム酸性化の薬理学的阻害は、脂肪肝と肝細胞内の脂肪滴の蓄積をもたらし、インスリン抵抗性の発生に原因となる役割を果たす。

オートファジーは脂肪滴（脂肪組織）を消費するため、我々は、ａｃＮＰによるオートファジーの活性化が、脂肪細胞が増加することにより、肝細胞への脂質負荷を軽減するという仮説を立てる。細胞ごとの脂肪滴含有量を測定するために、ＨｅｐＧ２細胞をａｃＮＰの有無にかかわらずパルミテートで処理し、Ｎｉｌｅ Ｒｅｄ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）染色を使用して生細胞で脂肪滴を可視化した。ＢＳＡ条件下のＨｅｐＧ２細胞の基礎脂肪滴数は１０であったが、パルミテートによる処理では、細胞あたりの脂肪滴数が約２０～２５に大幅に増加した。ＨｅｐＧ２細胞を２５％のＰＥＦＳＵで共処理すると、脂肪滴の蓄積が１細胞あたり１５に減少した。このことは、脂肪蓄積の増加と脂質蓄積の逆転を示す（図２３、パネルＡおよびＢ）。

肝細胞によるグルコース産生を低下させるインスリンの能力は、肥満したインスリン抵抗性のヒトでは低下し、肝臓の脂質蓄積と強く相関する^４７。糖新生能を評価するために、肝細胞は記載されているように様々な条件下で処理された。次に、それらを２ｍＭピルビン酸ナトリウムと２０ｍＭ乳酸に１６時間、急激に曝露した。糖新生のインスリン阻害は、肝細胞を１０ｎＭインスリンで処理した後、１０時間にわたって培地のグルコースレベル（２ＮＢＤＧ）をモニタリングすることで測定した。糖新生のインスリン阻害は、１０ｎＭインスリンで肝細胞を処理した後、３時間にわたって培地のグルコースレベルを監視することで測定される。図２３Ｃは、グルコースの類似体である２－ＮＢＤＧの取り込みを示す。インスリンの添加は、グルコース（２－ＮＢＤＧ）の取り込みの増加を通じて糖新生を阻害した。パルミテートの添加により、グルコースの取り込みが減少し、ａｃＮＰの添加により、グルコースの取り込みが増加し、糖新生が阻害された。

ａｃＮＰはＮＡＦＬＤの高脂肪食マウスモデルの血清トリグリセリドレベルを低下させる。

本発明のａｃＮＰがインビトロで機能的であることを示したので、ａｃＮＰの毒性および効力をＮＡＦＬＤのマウスモデルで試験した。ＮＡＦＬＤのインビボモデルとして、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ ＤＩＯマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）に、高脂肪食（ＨＦＤ）（Ｄ１２４９２：脂肪として６０％ｋｃａｌエネルギー、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔｓ，Ｉｎｃ）を１６週間与えた。ＨＦＤマウスは、１００ｍｇ／ｋｇ／日のａｃＮＰ（低用量）または３００ｍｇ／ｋｇ／日のａｃＮＰ（高用量）のいずれかを含む滅菌生理食塩水を１日または１日おきに６日間、１回静脈注射した。各処理の最後に、マウスを犠牲にし、血清をアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）とビリルビン（ＢＩＬ）レベルおよびトリグリセリド（ＴＲＩＧ）レベルの変化について試験した。血清中のＡＬＴおよびＢＩＬの血清レベルは、肝障害の指標である。１日目（２４時間）または６日目に低用量または高用量のａｃＮＰを追加しても、ＨＦＤ対照と比較して血清ＡＬＴおよびＢＩＬレベルは有意に変化しなかった。しかしながら、血清トリグリセリドレベルは、処置の６日後の低用量または高用量のいずれかでのａｃＮＰの添加により有意に減少した（図２４ＡおよびＢ）。

ａｃＮＰはＮＡＦＬＤの高脂肪食マウスモデルの脂肪滴レベルを低下させる。

代表的なマウス肝臓組織切片を得、脂肪滴の蓄積量（脂肪症）がＨ＆Ｅトリクローム染色を使用して評価した（図２５）。ＨＦＤ制御では、肝切片は肝細胞の肥大と脂肪滴の蓄積の重要な領域を示した。６日間の低用量ａｃＮＰまたは高用量ａｃＮＰによる処置は、脂肪滴の蓄積の有意な減少を示す（図２５）。

要約すると、酸放出の速度と程度を調整または制御するために、我々は、ジオールの鎖長を変更するか、テトラフルオロコハク酸とコハク酸との比率を増加させることにより、異なるポリエステルを合成した。異なるナノ粒子も合成し、これらの新しく合成されたポリマーに基づいて特徴付けを行った。我々は、ジオールの長さを増加させると酸放出の速度を低下させ、コハク酸へのテトラフルオロコハク酸の量を増加させると、放出される酸の量が増加することを見出した。簡単に言えば、ブチレングリコール型のナノ粒子が最も遅い速度を持っていた一方で、エチレングリコール型のナノ粒子（ＰＥＦＳＵ）は、酸の放出と分解の最高速度を示した。ナノ粒子を作成するためのパラメーターは、ポリマーの特性とも強く関連する。異なるポリエステルに基づくナノ粒子を、リソソームにおける細胞傷害性と酸回復度について評価して、リソソームのｐＨ機能不全疾患に対する異なる治療法のインビボでの治療戦略を開発した。

材料および方法

ａｃＮＰポリマーの合成と特性評価

二酸モノマーのテトラフルオロコハク酸（Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、コハク酸（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を丸底フラスコに様々な比率で加えた。エチレングリコール（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を金属触媒チタンイソプロポキシド（ＴＩＰＴ）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）とともに５または１０ｍｏｌ％過剰に加え、１２０℃で１６時間、共沸蒸留した。続いて、過剰な発泡を防ぎ、オリゴマーの昇華を最小限に抑え、過剰な水分を除去し、さらに凝縮して高分子量のポリマー鎖を形成するために、ゆっくりと真空を適用した。温度を少なくとも１２時間、１３０～１４０℃に上げた。反応を停止し、最終生成物を冷ジエチルエーテル中で沈殿させ、さらなる貯蔵および使用のために高真空下で乾燥させた。

ポリマーの特性評価（ＮＭＲおよびＧＰＣ）

^１Ｈ、^１３Ｃ、および^１９Ｆ ＮＭＲスペクトルは、Ａｇｉｌｅｎｔ ５００ＭＨｚ ＶＮＭＲＳ分光計で記録した。ＣＤＣｌ_３を溶媒として使用した。異なるポリマーの核磁気共鳴（ＮＭＲ）化学シフトを測定した。

^１Ｈ ＮＭＲ［（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：ＰＥＳＵ ２．６６（ｓ、１Ｈ）、４．２９（ｓ、１Ｈ）］、［２５％ ＰＥＦＳＵ ２．６６（ｓ、１Ｈ）、４．２９（ｓ、０．６９Ｈ）、４．３７（ｓ、０．２５Ｈ）、４．５６（ｓ、０．２５Ｈ）、４．６５（ｓ、０．０６Ｈ）］。^１３Ｃ ＮＭＲ［（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：ＰＥＳＵ、６２．３５、７６．７６］、［２５％ ＰＥＦＳＵ ２９．６６、６１．３７、６２．３５、６５．３７、７６．７７、１０７．８９、１５９．０６］。^１９Ｆ ＮＭＲ［（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：２５％ ＰＥＦＳＵ －１１９．９、－１２０．６］。

^１Ｈ ＮＭＲ［（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：ＰＢＳＵ １．５８（ｓ、１Ｈ）、１．７０（ｓ、２Ｈ）、２．６２（ｓ、２Ｈ）、４．１１（ｓ、２Ｈ）］、［５０％ ＰＢＦＳＵ １．７０（ｍ、２Ｈ）、１．８６（ｍ、２Ｈ）、２．６２（ｓ、２Ｈ）、４．１１（ｍ、２Ｈ）、４．３８（ｍ、２Ｈ）］、［１００％ ＰＢＦＳＵ １．８６（ｓ、１Ｈ）、４．３９（ｓ、１Ｈ）］。^１３Ｃ ＮＭＲ［（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：ＰＢＳＵ、２５．１９、２８．９９、６４．１５、７７．２８］、［５０％ ＰＢＦＳＵ ２５．１７、２８．９５、６４．１８、６７．５２、７６．７６、１０７．９８、１５９．２９］、［１００％ ＰＢＦＳＵ ２４．４８、６７．１７、７６．７４、１０７．９７］。^１９Ｆ ＮＭＲ［（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：５０％ ＰＢＦＳＵ －１２４．１８、－１２１．４０－ －１１９．２８］、１００％ ＰＢＦＳＵ －１２０．０４。

平均分子量（Ｍｎ）と多分散性（ＰＤＩ）は、Ｗａｔｅｒｓ ４１０屈折率検出器、Ｗａｔｅｒｓ ５１５ ＨＰＬＣポンプ、および３つのＵｌｔｒａＳｔｙｒａｇｅｌカラムを備えたゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）で、２５℃で、溶出液としてＴＨＦを用いて１．０ｍＬ／分の流速で測定した。単分散ポリスチレン標準をキャリブレーションとして使用した。

ａｃＮＰナノ粒子の合成と特性評価

ａｃＮＰは、ナノ沈殿を使用してａｃＮＰポリマーから形成した。簡単に言えば、５～８ｍｇのＰＥＳＵまたは２５％のＰＥＦＳＵまたはＰＢＦＳＵポリマーを０．５～０．６ｍＬのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）に溶解し、０．２μｍのシリンジフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で濾過して、大きな凝集物またはダストを除去した。ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）の界面活性剤（３０～３２ｍｇ）を２～４ｍＬナノポア水（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、エンドトキシン無し）に溶解し、１ｋ～１．７ｋまたは１ｋ～１．３ｋ ｒｐｍの高速で攪拌した。次に、ポリマーのＤＭＦ溶液を、高速で攪拌されている水溶液に滴下した。直後に、エマルジョンをＳｎａｋｅＳｋｉｎ透析チューブ（ＭＷＣＯ １０ＫＤａ）に入れ、ナノポア水に対して６～２４時間透析した。動的光散乱（ＤＬＳ）測定では、２００ｕＬの溶液を２．８ｍＬのＤＩ水で希釈し、サイズとゼータ電位をＢｒｏｏｋｅｈａｖｅｎ動的光散乱装置から取得した。すべての測定は３回実施した（ｎ＝３）。

走査型電子顕微鏡

ａｃＮＰはＤＩ水で１００倍に希釈した。アリコートをシリコンウエハーにプレーティングし、一晩風乾させた。ウェーハは、銅テープでアルミニウムスタブに固定し、５ｎｍ Ａｕ／Ｐｄでスパッタコーティングした。これらのサンプルは、２ｋＶの加速電圧と５．５ｃｍまたは６．０ｃｍの作動距離で、Ｓｕｐｒａ ５５ＶＰ電界放出走査型電子顕微鏡（ＺＥＩＳＳ）を使用して画像化した。

分子量分布（ＭＷＤ）は、Ａｇｉｌｅｎｔ－ＤＲＩ屈折率検出器と３つのカラム、すなわちＰＬゲル１０μｍガードカラムと２つのＰＬゲルＭｉｘｅｄ－Ｄ １０μｍカラム（５００から１０^６ｇ／ｍｏｌの範囲のＭＷＰＳの線形カラム）を装備したＳＥＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ １２００ ＳＥＣ）を使用して３０℃で測定した。溶媒としてテトラヒドロフランを使用した。試料溶液の濃度は約１ｍｇ／ｍＬで、溶離液の流速は１ｍＬ／分であった。キャリブレーションにはポリスチレン標準を使用した。

示差走査熱量測定および熱重量分析（ＤＳＣおよびＴＧＡ）

熱転移は、標準の加熱－冷却－加熱モードを備えたＱ２００サーマルアナライザー（ＴＡ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）のＤＳＣで記録した。加熱速度は１０℃／分で、冷却速度は５℃／分であった。熱分解挙動はＴＧＡ（Ｑ５００、ＴＡ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）で記録した。Ｎ_２雰囲気下でサンプルを室温から２０℃／分で６００まで加熱した。

分解アッセイ

ブチレン型の一連のポリエステルについて分解エッセイを行った。最初に、ブチレンシリーズのａｃＮＰを準備し、水または血清に懸濁し、３７℃で長時間インキュベートした。特定の時点で、ａｃＮＰを含む溶液を遠心分離し、ペレットをＮ_２雰囲気で一晩乾燥させ、ＧＰＣを使用した分析のためにＴＨＦ溶媒に再溶解した。

細胞培養と細胞傷害性

ＨｅｐＧ２細胞は、１０％ＦＢＳ、１ｍＭグルタミン、５０ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリン、および５０ｇ／ｍｌストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ培地で培養した。一部の研究では、初代肝細胞をＡＴＣＣから入手し、１０％のＦＢＳ、１ｍＭグルタミン、５０ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリン、および５０ｇ／ｍｌストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ培地で維持した。ａｃＮＰの細胞傷害性は、ＭＴＳ細胞増殖アッセイ（Ａｂｃａｍ）を使用して評価した。ＨｅｐＧ２または初代肝細胞を９６ウェルプレートで１５０００細胞／ウェルで１日間培養した後、処理を行わなかったか、０、５０、２５０、５００、または１０００μｇ／ｍＬのａｃＮＰを含む培地に培地を交換した。次に、細胞を処理とともに２４時間インキュベートし、その後、バックグラウンドの吸光度を補正した後、無処理（対照）と比較して細胞生存率を定量化した。処理濃度ごとに３つのウェルを使用し、アッセイを３回繰り返した。

パルミテート：ＢＳＡの準備

パルミテートをＤＭＳＯ（ミリポア）に溶解した。この溶液を４５℃で、６．７％の脂肪酸を含まないＢＳＡ（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を含むＭＥＭ培地に溶解して、４ｍＭ（１０ｘ）のストックを作製した。対照のＢＳＡ条件では、５％ＢＳＡおよび１％ＤＭＳＯを含むＭＥＭ培地の１０倍ストックを使用した。処理条件として、１０×ストックを１％のＦＢＳ、５０Ｕ／ｍｌペニシリン、５０ｇ／ｍｌストレプトマイシンおよび１０ｍＭのグルコースを含むＭＥＭ培地に加えた。次に、処理培地のｐＨを７．４に調整し、続いて滅菌ろ過を行った後、ＨｅｐＧ２細胞をパルミテートで１６時間、ａｃＮＰの有無で処理した。

フローサイトメトリー

ローダミン標識ａｃＮＰ処理細胞のＦＡＣＳ分析は、６２０ ＦＡＣＳｃａｎを使用して実行した。ＦＡＣＳデータ分析は、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して行った。細胞をトリプシン処理し、遠心分離によりＰＢＳで２回洗浄した後、フローサイトメトリーにかけた。前方および側方散布図でゲーティングすることにより、細胞破片を除外した。

ＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ（商標）染色および画像分析

共局在画像解析では、まず細胞をＲｈｏ－ａｃＮＰと２４時間インキュベートし、製造元のプロトコルに従ってＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ（商標）ｂｌｕｅ、ＤＮＤ－２２色素を２時間添加した。次に、細胞を新鮮な培地と交換し、共焦点顕微鏡を使用して画像解析し、ローダミンとＬｙｓｏｓｅｎｓｏｒの青いシグナルの重なりの量を測定した。リソソームのｐＨ測定では、細胞を１μＭ ＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ（商標）黄／青で５分間染色した後、３６０ｎｍの励起を使用して共焦点画像解析を行い、黄色の波長範囲（５１０～６４１ｎｍ）と青色の波長範囲（４０４～４５６ｎｍ）の画像を集めた。黄色と青の間の比率は、ＭｅｔａＭｏｒｐｈソフトウェア（登録商標）を用いて計算した。簡単に言えば、バックグラウンドノイズは中央値フィルターによって削除し、その後、個別のリソソームを識別するためのしきい値処理が行った。識別されたリソソームの平均黄色および青色蛍光強度を得、黄色／青色の比率の値が計算し。ｐＨの変化の定量化は、様々なｐＨの２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸バッファーでＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ（商標）蛍光を画像解析し、ｐＨに対するＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ（商標）蛍光の比率の標準曲線を確立することで達成した。ΔｐＨ値が表示される場合、別の標準曲線は取得されなかったが、ＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ（商標）比率の変化は以前の標準曲線の式を使用してΔｐＨに変換し、相対ｐＨの変化を計算できるが、絶対ｐＨ値は計算できない。表示されている代表的な画像では、比率画像は黄色と青色のＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ（商標）画像を分割して生成され、視覚化を改善するためにすべての画像でコントラストが同じように調整された。ＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ（商標）の比率変更の解像度を高めるために、疑似着色が適用された。

Ｍａｇｉｃ ＲｅｄカテプシンＬ活性アッセイ

細胞を１０μｇ／ｍｌのＭａｇｉｃ ＲｅｄカテプシンＬ（ＭＲ－カテプシンＬ；Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で１時間染色した。細胞をＰＢＳで３回洗浄し、Ｃｅｌｉｇｏ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｃｅｌｌ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Ｂｒｏｏｋｓ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して画像解析した。赤色（５３１／４０励起；６２９／５３発光）蛍光チャネルが各ウェルで画像解析した。Ｃｅｌｉｇｏ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｃｅｌｌ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒによって取得された画像の分析パラメーターは、蛍光に基づいて個々の細胞を識別するように最適化した。セル値ごとの平均蛍光強度は、識別されたセル領域に含まれるバックグラウンドピクセルからのエラーを除外するために、セル値ごとの平均積分強度によって決定した。１ウェルあたり少なくとも１，０００個の細胞を分析し、実験ごとに３～４ウェルのレプリケートを行った。

ウエスタンブロット法

Ｔｒｕｄｅａｕら^２に記載されているようにサンプルを調製した。サンプルを４～１２％のポリアクリルアミドゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にロードし、湿式（タンク）トランスファーマシンを使用してポリフッ化ビニリデンメンブレン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に移した。ＬＣ３（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、ＧＡＰＤＨ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、およびｐ６２（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）抗体を製造元の指示に従って使用した。

肝細胞でのグルコース産生

Ｈｅｒｚｉｇら^３に記載されているように、グルコース産生アッセイを実施した。簡単に言うと、細胞を培養し、異なる処理条件下でインキュベートした。次に、細胞培地を、２０ｍＭ乳酸ナトリウムおよび２ｍＭピルビン酸ナトリウムを補充した、グルコースおよびフェノールを含まないＤＭＥＭ（ｐＨ７．４）に１６時間切り替えた。治療終了の３時間前に１０ｎＭのインスリンを添加し、治療終了の１０分前に２－ＮＢＤＧを添加した。グルコース含有量は、グルコース取り込みアッセイキット（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を使用して測定した。

統計

研究結果の有意性を決定するために、所定の統計手法を使用した。細胞傷害性、リソソームのｐＨとサイズ、オートファジーフラックス、タンパク質発現レベル、脂質数／細胞などを平均±Ｓ．Ｄ．として表した。統計分析はＯｒｉｇｉｎ Ｌａｂ Ｐｒｏ ８．５ソフトウェアを使用して行われた。両側Ｐ値＜０．０５は統計的に有意であるとみなされた。

本明細書に記載されている例および実施形態は例示のみを目的としており、それに照らして様々な修正または変更が当業者に明らかであり、本出願および添付の特許請求の範囲の趣旨および範囲に含まれることが理解される。したがって、本発明の範囲は、上記の説明を参照して決定されるだけでなく、添付の特許請求の範囲を参照して、そのような請求項が権利を与えられる等価物の全範囲とともに決定されるべきである。本明細書に引用されるすべての出版物、特許、および特許出願は、あらゆる目的のためにそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。

Claims (16)

1. 酸放出フッ素化ポリエステルナノ粒子であって、
   ポリエステルを含み、
   前記ポリエステルは、テトラフルオロコハク酸（ＴＦＳＡ）を含み、
   前記ナノ粒子は、該粒子が約ｐＨ６．０のｐＨを有する環境に曝されたときに酸を放出する、ナノ粒子。
2. 前記ナノ粒子が、約ｐＨ７．０のｐＨでは、実質的に酸を放出しない、請求項１に記載のナノ粒子。
3. 前記ポリエステルがコハク酸（ＳＡ）をさらに含み、
   前記ポリエステルにおいて、前記テトラフルオロコハク酸（ＴＦＳＡ）と前記コハク酸（ＳＡ）との比率が１００：０（ＴＦＳＡ：ＳＡ）～１０：９０（ＴＦＳＡ：ＳＡ）の範囲である、請求項１または２に記載のナノ粒子。
4. 前記ポリエステルにおける前記テトラフルオロコハク酸（ＴＦＳＡ）と前記コハク酸（ＳＡ）との比率が、約１０：９０、約１５：８５、約２０：８０、約２５：７５、約３０：７０、約３５：６５、約４０：６０、約４５：５５、約５０：５０、約５５：４５、約６０：４０、約６５：３５、約７０：３０、約７５：２５、約８０：２０、約８５：１５、約９０：１０、約９５：５、および約１００：０からなる群から選択される比率を含む、請求項３に記載のナノ粒子。
5. 前記ポリエステルが、エチレングリコール、プロピレングリコール、およびブチレングリコールからなる群から選択されるジオールを含む、請求項１～４のいずれか１項に記載のナノ粒子。
6. 前記ナノ粒子が、１０％のＰＥＦＳＵ（エチレングリコールおよびＴＦＳＡ）、１５％のＰＥＦＳＵ、２０％のＰＥＦＳＵ、２５％のＰＥＦＳＵ、３０％のＰＥＦＳＵ、３５％のＰＥＦＳＵ、４０％のＰＥＦＳＵ、４５％のＰＥＦＳＵ、５０％のＰＥＦＳＵ、５５％のＰＥＦＳＵ、６０％のＰＥＦＳＵ、６５％のＰＥＦＳＵ、７０％のＰＥＦＳＵ、７５％のＰＥＦＳＵ、８０％のＰＥＦＳＵ、８５％のＰＥＦＳＵ、９０％のＰＥＦＳＵ、９５％のＰＥＦＳＵ、１００％のＰＥＦＳＵ、１０％のＰＰＦＳＵ（プロピレングリコールおよびＴＦＳＡ）、１５％のＰＰＦＳＵ、２０％のＰＰＦＳＵ、２５％のＰＰＦＳＵ、３０％のＰＰＦＳＵ、３５％のＰＰＦＳＵ、４０％のＰＰＦＳＵ、４５％のＰＰＦＳＵ、５０％のＰＰＦＳＵ、５５％のＰＰＦＳＵ、６０％のＰＰＦＳＵ、６５％のＰＰＦＳＵ、７０％のＰＰＦＳＵ、７５％のＰＰＦＳＵ、８０％のＰＰＦＳＵ、８５％のＰＰＦＳＵ、９０％のＰＰＦＳＵ、９５％のＰＰＦＳＵ、１００％のＰＰＦＳＵ、１０％のＰＢＦＳＵ（ブチレングリコールおよびＴＦＳＡ）、１５％のＰＢＦＳＵ、２０％のＰＢＦＳＵ、２５％のＰＢＦＳＵ、３０％のＰＢＦＳＵ、３５％のＰＢＦＳＵ、４０％のＰＢＦＳＵ、４５％のＰＢＦＳＵ、５０％のＰＢＦＳＵ、５５％のＰＢＦＳＵ、６０％のＰＢＦＳＵ、６５％のＰＢＦＳＵ、７０％のＰＢＦＳＵ、７５％のＰＢＦＳＵ、８０％のＰＢＦＳＵ、８５％のＰＢＦＳＵ、９０％のＰＢＦＳＵ、９５％のＰＢＦＳＵ、および１００％のＰＢＦＳＵからなる群から選択される材料を含む、請求項１～５のいずれか１項に記載のナノ粒子。
7. 前記ナノ粒子が、約２５ｎｍから、または約５０ｎｍから、約２００ｎｍまで、または約１５０ｎｍまでの範囲の平均直径を有するか、または、
   前記ナノ粒子が、約１００ｎｍ未満の平均直径を有する、請求項１～６のいずれか１項に記載のナノ粒子。
8. 前記ナノ粒子の集団が、約０．２以下、または約０．１４以下の多分散指数（ＰＤＩ）を有する、請求項１～７のいずれか１項に記載のナノ粒子。
9. 前記ナノ粒子は、前記ナノ粒子が細胞に接触したときに、エンドサイトーシス経路を介してリソソームへの取り込みをもたらすサイズおよびゼータ電位を有する、請求項１～８のいずれか１項に記載のナノ粒子。
10. 前記ナノ粒子または複数の前記ナノ粒子は、細胞に取り込まれたとき、または細胞に接触したときに、
    リソソームの酸性化を損なう条件下で前記細胞内のオートファジーフラックスを回復させるのに有効であるか、
    前記細胞におけるリソソーム－オートファゴソーム融合能力を増強するのに有効であるか、
    リソソーム加水分解酵素活性を増強するのに有効であるか、
    脂肪酸に曝された肝細胞または脂肪酸に曝されたＢ細胞においてリソソーム機能の短期および／または長期の回復を誘導するのに有効であるか、
    肝細胞脂質含有量を正常化するのに有効であるか、または、
    グルコースに応答してインスリンを分泌するＢ細胞の能力を増強するのに有効である、
    請求項１～９のいずれか１項に記載のナノ粒子。
11. 医薬製剤であって、
    請求項１～１０のいずれか１項に記載の複数のナノ粒子と、
    薬学的に許容される担体と、を含み、
    前記医薬製剤が単位用量製剤を含む、医薬製剤。
12. 前記医薬製剤が、経口送達、等速性送達、経皮送達、非経口送達、エアロゾル投与、吸入による投与、静脈内投与、および直腸投与からなる群から選択される経路による投与用に製剤化される、請求項１１に記載の医薬製剤。
13. 哺乳動物の細胞におけるオートファジーを促進するため、
    リソソーム機能の回復に有利に反応する哺乳動物の病状を治療するため、
    損なわれたリソソーム酸性度に関連する疾患状態を有する哺乳動物を治療するため、または、
    リソソーム加水分解酵素活性を増強するために使用される、請求項１～１０のいずれか１項に記載の複数のナノ粒子、または、請求項１１または１２に記載の医薬製剤。
14. 前記哺乳動物が、肥満、メタボリックシンドローム、２型糖尿病、非アルコール性脂肪肝疾患、および神経変性疾患からなる群から選択される疾患を有し、
    前記神経変性疾患が、加齢性認知症、パーキンソン病、およびアルツハイマー病からなる群から選択される疾患を含む、請求項１３に記載の組成物。
15. 哺乳動物に移植される肝臓を灌流するために使用される、
    請求項１～１０のいずれか１項に記載の複数のナノ粒子、または、請求項１１または１２に記載の医薬製剤。
16. 前記哺乳動物がヒトである、請求項１３～１５のいずれか１項に記載の複数のナノ粒子または医薬製剤。

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