CN112004555A - 用于恢复自噬的酸性纳米颗粒 - Google Patents

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Abstract

在各个实施例中，提供了新颖的可生物降解的酸活化的酸释放型纳米颗粒(acNP)，所述纳米颗粒用作操纵溶酶体酸度和自噬的靶向策略。在某些实施例中，这些基于氟化聚酯的acNP在pH 6.0(功能障碍性溶酶体中报告的pH)下降解，并释放出进一步降低溶酶体pH的成分酸，从而在LT下增加肝细胞的自噬通量和细胞功能。所述acNP可以充当恢复肝脏疾病的治疗剂。

Description

用于恢复自噬的酸性纳米颗粒
相关申请的交叉引用
本申请要求于2019年1月21日提交的美国专利申请第16/252,927号和2018年1月19日提交的美国专利临时申请第62/619,565号的权益和优先权，所述申请的全部内容通过引用整体并入本文。
背景技术
自噬是细胞降解长寿蛋白和细胞器所必需的、进化上保守的维持机制。这种内务处理对于非增殖性细胞尤为关键，所述非增殖性细胞依靠自噬来去除随年龄增长而积累的受损物质。溶酶体与自噬体的融合也需要酸性溶酶体。因此，溶酶体酸度是溶酶体功能和维持自噬通量所必需的重要局部信号。然而，目前尚无可用于在体外和体内操纵溶酶体酸度的工具。当前的药理学和分子工具可以降低溶酶体的酸度；然而，据信不存在可用的工具来增加溶酶体。许多疾病状态与受损的溶酶体酸度相关联，包含但不限于2型糖尿病、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)和神经变性。
非酒精性脂肪肝病(NAFLD)是当今世界上最常见的肝病之一，影响了20％到30％的普通人群。多种遗传和表观遗传因素促成NAFLD的发病。胰岛素抵抗会削弱脂肪组织中的脂解的抑制作用，从而增加血清游离脂肪酸(FFA)的水平。FFA通常被肝脏摄入并酯化为中性甘油三酯；然而，过量的饱和FFA会淹没肝脏将FFA酯化的能力，并诱导脂毒性(LT)。在LT条件下的肝细胞中，已经报告了伴随溶酶体酸度下降的自噬的破坏。所述破坏导致受损的细胞器和蛋白质积累在细胞中，并加剧细胞功能和生存力的下降，从而促进肝细胞死亡并导致进行性疾病。未经治疗的NAFLD会变成非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，其可发展为肝硬化，这可能会严重损害肝脏的功能。一小部分恶化为肝癌，据报告肝癌唯一的治疗选择是肝移植，并且成功的可能性很低。
迄今为止，尚未批准任何特定的药理学药剂治疗NAFLD。针对处方胰岛素增敏剂的NAFLD的当前治疗选择包含噻唑烷二酮(TZD)、二甲双胍和注射剂(如GLP-1受体激动剂)。这些治疗选择诱导副作用并且可能需要长期疗法(Liu等人,《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》,(2016)113:2288-2293)。另一组靶向自噬途径的药理学药剂(如mTOR途径抑制剂-雷帕霉素)已被用于治疗自噬相关的代谢性疾病，然而，此药剂可能涉及重要的代谢信号传导途径的非特异性变化，所述变化与自噬诱导无关。因此，长期使用可能是不期望的。最后，包含GFT-505(PPAR激动剂)和
Figure BDA0002589558380000021
(英特塞普特药物公司(Intercept Pharmaceuticals))的临床前化合物仍处于临床试验过程中，以充分表征其功效。
发明内容
非酒精性脂肪肝病(NAFLD)是当今世界上最常见的肝病。最近，已经发现被称为脂毒性(LT)的肝游离脂肪酸(FFA)水平的增加会引起自噬通量的抑制，同时溶酶体酸度降低(即，溶酶体中的pH升高)，从而导致NAFLD的发病机理。要解决的问题是提供一种恢复溶酶体酸度和自噬通量的生物相容性方法。因此，在本发明中，我们合成了新颖的可生物降解的酸活化的酸释放型纳米颗粒(acNP)，作为操纵溶酶体酸度和自噬的靶向策略。这些acNP基于氟化聚酯，所述氟化聚酯在pH 6.0(功能障碍性溶酶体中报告的pH)下降解。一个或多个酸组分从纳米颗粒中的释放进一步降低了溶酶体pH，从而提高了LT条件下肝细胞的自噬通量和细胞功能。因此，本发明的acNP可用作治疗NAFLD的治疗剂。此外，本发明的acNP也可用于治疗或预防与受损的溶酶体酸度相关联的疾病。此类疾病包含但不限于肥胖症、代谢综合症、2型糖尿病(T2D)、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、肝移植、神经变性(例如，与年龄有关的痴呆、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病等)。
在本发明的一方面，提供了一种酸释放型氟化聚酯纳米颗粒。所述纳米颗粒包括聚酯和四氟琥珀酸(TFSA)，其中当暴露于pH约为pH 6.0的环境中时，所述纳米颗粒释放酸。由于氟化聚酯展现出低毒性并且具有高的体外和体内生物相容性，因此氟化聚酯纳米颗粒可用于医疗应用，因为所述氟化聚酯纳米颗粒容易以最小的毒性被细胞摄入。
在一个实施例中，所述纳米颗粒进一步包括琥珀酸(SA)，TFSA与SA的比率在100:0(TFSA:SA)到10:90(TFSA:SA)的范围内，例如，TFSA与SA的所述比率包括选自由以下组成的组的比率：约10:90、约15:85、约20:80、约25:75、约30:70、约35:65、约40:60、约45:55、约50:50、约55:45、约60:40、约65:35、约70:30、约75:25、约80:20、约15:15、约90:10、约95:5和约100:0。
在另一个实施例中，所述纳米颗粒包括聚酯，所述聚酯包括选自由以下组成的组的二醇：乙二醇、丙二醇、丁二醇。例如，所述酸释放型氟化聚酯纳米颗粒可以包括聚酯、乙二醇和TFSA(PEFSU)；聚酯、丙二醇和TFSA(PPFSU)或聚酯、丁二醇和TFSA(PBFSU)。
设想本发明中的纳米颗粒选自由以下组成的组：10％PEFSU；15％PEFSU、20％PEFSU、25％PEFSU、30％PEFSU、35％PEFSU、40％PEFSU、45％PEFSU；50％PEFSU；55％PEFSU、60％PEFSU、65％PEFSU、70％PEFSU、75％PEFSU、80％PEFSU、85％PEFSU、90％PEFSU、95％PEFSU、100％PEFSU、10％PPFSU；15％PPFSU、20％PPFSU、25％PPFSU、30％PPFSU、35％PPFSU、40％PPFSU、45％PPFSU；50％PPFSU；55％PPFSU、60％PPFSU、65％PPFSU、70％PPFSU、75％PPFSU、80％PPFSU、85％PPFSU、90％PPFSU、95％PPFSU、100％PPFSU、10％PBFSU；15％PBFSU、20％PBFSU、25％PBFSU、30％PBFSU、35％PBFSU、40％PBFSU、45％PBFSU；50％PBFSU；55％PBFSU、60％PBFSU、65％PBFSU、70％PBFSU、75％PBFSU、80％PBFSU、85％PBFSU、90％PBFSU、95％PBFSU和100％PBFSU。
在一个实施例中，所述纳米颗粒选自由以下组成的组：10％PEFSU、15％PEFSU、20％PEFSU、25％PEFSU。
在另外的实施例中，所述纳米颗粒选自由以下组成的组：25％PPFSU、50％PPFSU、75％PPFSU、100％PPFSU、12。在又另一个实施例中，所述纳米颗粒选自由以下组成的组：30％PBFSU、50％PBFSU、75％PBFSU、100％PBFSU。
在另一个实施例中，所述纳米颗粒的平均直径在约25nm或约50nm到高达约200nm或高达约150nm或高达约100nm的范围内。
在另一个实施例中，所述纳米颗粒的优选平均直径小于约100nm。
在另一个实施例中，所述纳米颗粒的群体具有约0.2或以下，或约0.14或以下的多分散指数(PDI)。
在又另一个实施例中，当所述纳米颗粒与细胞接触时，所述纳米颗粒所具有的大小和ζ电位导致摄入到溶酶体中。
在本发明的另一方面，当所述纳米颗粒被溶酶体酸化受损的细胞摄入时，所述纳米颗粒可用于恢复所述细胞中的自噬通量和/或增强所述细胞中的溶酶体-自噬体融合能力。
在一个实施例中，所述纳米颗粒可有效地诱导暴露于脂肪酸的肝细胞或暴露于脂肪酸的B细胞中的溶酶体功能的短期和/或长期恢复。
在另一个实施例中，所述纳米颗粒可有效地使肝细胞脂质含量正常化。
在另外的实施例中，所述纳米颗粒可有效地增强B细胞响应于葡萄糖而分泌胰岛素的能力。
在本发明的另一方面，提供了一种药物调配物。所述调配物包括多个上述纳米颗粒和药学上可接受的载剂。所述药物调配物包括基本上无菌的单位剂量调配物。
在一个实施例中，所述药物调配物被设计成用于通过选自由以下组成的组的途径进行施用：口服递送、等容递送、透皮递送、亲本递送、气雾剂施用、通过吸入施用、静脉内施用和直肠施用。
本发明的另一方面提供了一种通过使所述细胞与所述多个上述纳米颗粒接触来促进哺乳动物细胞中的自噬的方法。所述方法涉及向所述哺乳动物施用有效量的纳米颗粒和/或上述药物调配物。
在一个实施例中，所述方法通过向对溶酶体功能的恢复反应良好的哺乳动物施用有效量的药物调配物形式的本发明的纳米颗粒，来治疗所述哺乳动物的病状。
在另一个实施例中，所述方法在患有与受损的溶酶体酸度相关联的疾病状态的哺乳动物中提供治疗。所述疾病状态选自由以下组成的组：肥胖症、代谢综合症、2型糖尿病(T2D)、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)和神经退行性病变。
在另外的实施例中，包括神经退行性病变的所述疾病状态选自由以下组成的组：与年龄有关的痴呆、帕金森氏病和阿尔茨海默氏病。
在一个实施例中，所述方法可有效地用于在损害溶酶体酸化的条件下恢复自噬通量。
在另一个实施例中，所述方法可有效地增强溶酶体-自噬体融合能力。
在另一个实施例中，所述方法可有效地增强溶酶体水解酶活性。
在另一个实施例中，所述方法产生溶酶体功能的短期或长期恢复。例如，所述方法可有效地产生暴露于脂肪酸的肝细胞中的溶酶体功能的短期或长期恢复，并使所述肝细胞中的脂质含量正常化。
在另一个另外的实施例中，所述方法可有效地产生暴露于脂肪酸的B细胞中的溶酶体功能的短期或长期恢复，并增强B细胞响应于葡萄糖而分泌胰岛素的能力。
在又另一个实施例中，所述方法通过施用有效量的acNP在哺乳动物中提供治疗，所述哺乳动物是人类或非人类哺乳动物。可以静脉内施用或通过本领域已知的其它方式施用所述acNP。
尽管在某些前述实施例中，针对本发明的纳米颗粒，将认识到TFSA可以被其它酸取代，具体地说，pKa小于约2或pKa为
Figure BDA0002589558380000041
或以下的其它酸。
附图说明
图1展示了本发明的acNP在治疗肥胖症、II型糖尿病和非酒精性脂肪肝病(NAFLD)中的用途。肥胖症、II型糖尿病和NAFLD与受损的溶酶体酸化相关联，受损的溶酶体酸化导致自噬通量的阻滞和自噬体的积累。本文所描述的acNP靶向溶酶体。在受损的细胞中，溶酶体的pH被部分酸化，因此不会与自噬体融合。自噬通量被抑制，并且包裹脂质的自噬体在细胞中积累，从而减少了脂质的清除。进入溶酶体后，acNP将释放酸以恢复溶酶体的酸度，从而恢复与自噬体的融合、溶酶体水解酶活性和自噬通量。
图2：图片A示出了PBFSU的合成示意图，图片B：PBFSU聚合物的化学和物理特性的概述。图片C-E：PBFSU聚合物的NMR光谱：1H(图片C)、13C(图片D)和19F(图片E)。
图3图片A和B：通过差示量热扫描(DSC)在以下速率下PBFSU聚酯的热行为：10℃/分钟，加热曲线(图片A)；和5℃/分钟，冷却曲线(图片B)。图片C：PBFSU聚酯的热重分析(TGA)曲线。对照聚合物是PBSU。
图4示出了PBFSU acNPS的SEM图像。
图5示出了溶剂对acNP形成的影响。
图6示出了透析温度对acNP形成的影响。
图7示出了透析时间对acNP形成的影响。
图8：图片A示出了当不同的PBFSU acNP在pH 6下于20mM PBS中孵育时，对pH随时间变化的影响。图片B示出了当纳米颗粒在37℃的水中孵育时，PBFSU acNP的降解和分子量变化
图9：acNP的细胞毒性测定。PBFSU acNP即使在1000μg/mL下也不会诱导显著的细胞死亡
图10：图片A示出了用BSA(对照)、棕榈酸酯或棕榈酸酯+PBFSU acNP处理的HepG2细胞的共聚焦图像。图片B示出了使用
Figure BDA0002589558380000051
分析软件测量的溶酶体的pH和大小的定量(图片B)，n＝3，*p<0.05。
图11：展示了acNP、PESU和PEFSU的合成
图12，图片A-C示出了使用NMR光谱对PESU和25％PEFSU进行的表征。图片A：1HNMR，图片B：13C NMR和图片C：19F NMR光谱。
图13，图片A和B展示了acNP的大小和体外功能的表征。(图片A)各种acNP的扫描电子显微照片(比例尺＝200nm)。(图片B)在pH 6.0和pH 7.4缓冲液中具有不同聚合物组成的acNP随时间的pH变化。注意，与pH 6.0缓冲液相比，当向pH 7.4缓冲液中添加25％PEFSU时，pH没有显著变化，这表明仅在pH 6.0下激活酸化。
图14，图片B和C：图片B：使用动态光散射确定acNP的直径和ζ电位(在SEM图上标记的大小和ζ电位)来对acNP、PESU和25％PEFSU进行的表征。图片C：在48小时内，acNP在20mMpH 6.0(左图)和pH 7.4(右图)PBS缓冲液中的pH变化。
图15图片A-B示出了PESU、25％PEFSU acNP和PLGA NP的pH变化。将纳米颗粒在20mM pH 6.0缓冲液(图片A)和20mM pH 7.4缓冲液(图片B)中孵育。与PLGA Np相比，25％PEFSU acNP显示出更高的溶酶体pH的降低(更低的pH)。
图16图片A和B展示了溶酶体中acNP的细胞摄入和定位。图片A示出了用罗丹明标记的acNP(红色)处理并用溶酶体染料LysoTrackerTM染色的HepG2细胞的超分辨率图像。图片B是可用于鉴定acNP摄入到细胞中以及acNP的靶途径的抑制剂的列表。
图17，图片A-C：acNP对细胞生存力以及摄入到细胞和溶酶体中的影响。图片A：各种acNP浓度对用PESU或25％PEFSU孵育的细胞的生存力的影响。将细胞以一系列acNP浓度孵育24小时。高达1000μg/ml的acNP浓度并未诱导显著的细胞死亡。基于这项研究，选择100μg/ml的治疗剂量用于进一步研究。图片B：通过流式细胞术对HepG2细胞中罗丹明标记的acNP(Rho-acNP)的摄入的定量。Rho-acNP摄入发生在4小时内，孵育24小时后完全摄入。(数据＝平均值±SD，n＝3，*＝p<0.05)。图片C)共聚焦显微镜图像示出了HepG2细胞中Rho-acNP的摄入(右图)并共定位在用LysoSensorTM染色的溶酶体区室(左图)中；蓝色通道(中间图)。尺，10μm。
图18图片A-C表明，acNP改善溶酶体酸度并在脂毒性下拯救细胞死亡。图片A)在有或没有acNP的情况下用复合的棕榈酸酯:BSA(4:1比率)长期处理的INS1细胞的LysoSensorTM图像。图片B)由棕榈酸酯:BSA和acNP引起的pH的变化的定量。图片C)acNP防止细胞死亡。与BSA对照相比，用棕榈酸酯:BSA进行的处理诱导了7倍多的细胞死亡。与BSA对照相比，添加25％PEFSU acNP显著减少了细胞死亡。(数据＝平均值±SD，n＝3，*＝P<0.05)
图19图片A-D示出了acNP对在存在或不存在acNP的情况下用BSA(对照)或棕榈酸酯处理的细胞中溶酶体酸度和组织蛋白酶L的变化的影响。图片A：在不存在25％PEFSUacNP(对照)或存在25％PEFSU acNP的情况下，将细胞与BSA(对照)或棕榈酸酯一起孵育然后针对溶酶体酸度、自噬或细胞功能进行测定的实验方案的示意图。图片B：与BSA(左上图)、棕榈酸酯(右上图)、棕榈酸酯和25％PEFSU(右下图)以及巴弗洛霉素(Baf)(一种溶酶体酸化抑制剂)(左下图)一起孵育的HepG2细胞的共聚焦显微镜图像。用pH敏感的LysoSensorTM染料对细胞进行染色，以评估溶酶体酸度。使用100μM Baf显示溶酶体的LysoSensorTM染色的特异性。尺，10μm。图片C：用BSA(对照)、棕榈酸酯(对照)以及棕榈酸酯和25％PEFSU处理后，每个细胞的平均溶酶体pH(□)和溶酶体区域(◇)。结果表明，与仅用棕榈酸酯处理的细胞相比，用棕榈酸酯和25％PEFSU处理的细胞的溶酶体pH有了显著恢复，针对pH值和大小值，n＝3个实验，每个实验分析20-30个细胞。图片D：在用BSA(对照)、棕榈酸酯(对照)以及棕榈酸酯和25％PEFSU处理的HepG2细胞中，通过魔术红组织蛋白酶L荧光底物测定法对溶酶体组织蛋白酶L活性进行的评估。结果表明，通过25％PEFSU acNP处理，溶酶体酶的活性显著恢复(数据＝平均值±SD，n＝3，*＝p<0.05)。
图20示出了与棕榈酸酯对照相比，HepG2细胞中25％PEFSU acNP和PLGA NP的溶酶体pH变化。与1mg/mL的PLGA NP相比，100ug/mL的acNP能够产生更高的溶酶体pH变化，从而示出更强的酸化作用。
图21图片A-C展示了acNP对用BSA(对照)、棕榈酸酯(对照)以及棕榈酸酯25％PEFSU处理的HepG2细胞中的自噬通量的功能性影响。图片A-C：通过蛋白质印迹密度分析法确定了LC3-II、GAPDH和p62的蛋白质水平。用棕榈酸酯处理会诱导LC3II和p62的积累，而当用25％PEFSU acNP处理时观察到积累的自噬体、LC3-II和p62蛋白的清除。(数据＝平均值±SD，n＝3，*＝p<0.05)。
图22图片A和B展示了由acNP诱导的组织蛋白酶L活性和自噬通量的功能性变化。图片A：与棕榈酸酯一起长期孵育的HepG2细胞降低了被acNP挽救的组织蛋白酶L活性。图片B：与棕榈酸酯一起长期孵育的HepG2细胞增加了部分被acNP逆转的p62和LC3II积累。(数据＝平均值±SD，n＝3，*＝p<0.05)
图23图片A-C示出了在用BSA、棕榈酸酯和25％PEFSU acNP处理后，acNP对HepG2细胞中脂滴积累的影响。图片A：用尼罗红染料染色15分钟的HepG2细胞显示出在脂质囊泡中的积累。荧光显微镜检查显示，在25％PEFSU acNP处理后，暴露于棕榈酸酯的HepG2细胞中脂滴密度显著降低，每种条件下n＝30-50个细胞。图片B：用BSA、棕榈酸酯或棕榈酸酯+25％PEFSU处理的HepG2细胞中的脂滴的定量。图片C：由100nM胰岛素刺激的HepG2细胞的糖异生作用。
图24图片A和B示出了分别在高脂饮食喂养16周的小鼠接受acNP治疗的24小时和6天(低剂量和高剂量)后，丙氨酸转氨酶(ALT)、胆红素(BIL)和甘油三酯(TRIG)的血清水平。acNP治疗6天导致血清中甘油三酯水平显著降低。
图25：用低剂量和高剂量acNP治疗24周或6天的16周高脂饮食小鼠的肝脏切片的H和E染色。脂肪变性、纤维化和炎症的程度由H和E染色表征。在HFD对照小鼠中，肝脏切片显示出增大肝细胞的显著区域和脂滴积累，而在低剂量或高剂量acNP下6天的小鼠显示出脂滴积累的显著减少。
具体实施方式
自噬是细胞降解长寿蛋白和细胞器所必需的、进化上保守的维持机制。这种内务处理对于非增殖性细胞尤为关键，所述非增殖性细胞依靠自噬来去除随年龄增长而积累的受损物质。自噬的关键步骤是自噬体募集和细胞内容物的吞噬，然后是自噬体与酸性溶酶体的融合。溶酶体中的水解酶依赖于足够低的pH以适当降解被包裹的物质。溶酶体与自噬体的融合也需要酸性溶酶体。因此，溶酶体酸度是溶酶体功能和维持自噬通量所必需的重要局部信号。
本文所描述的组合物和方法尤其始于缺乏用于在体外和体内操纵溶酶体酸度的可用工具。具体地说，能够降低溶酶体酸度(即，增加pH)的当前药理学和分子工具(例如，巴弗洛霉素)是已知的。然而，不存在增加溶酶体酸度(即降低pH)的工具。
多种疾病状态与受损的溶酶体酸度相关联，包含但不限于：代谢综合症、2型糖尿病、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、肥胖的神经变性和心肌病。由于无法适当地操纵溶酶体的pH，因此严重影响了直接确定疾病进展的能力。例如，研究表明，长期暴露于升高的葡萄糖和饱和脂肪酸的胰腺β细胞具有降低的自噬通量，这是由于溶酶体的酸化缺陷所致。为了确定降低的溶酶体酸化在β细胞功能障碍中的作用，我们合成并表征了新颖的纳米颗粒(NP)，所述纳米颗粒在受到紫外线的急性活化时酸化有缺陷的溶酶体。这些纳米颗粒的光活化提供了2小时的溶酶体酸度恢复。随后的分析显示，暴露于糖脂毒性的胰腺β细胞中溶酶体酸度的恢复确实使自噬通量和葡萄糖刺激的胰岛素分泌正常化。
然而，由于需要外部触发(即紫外线)并且溶酶体酸度的恢复是短暂的(2小时)，因此可光活化的纳米颗粒(paNP)的使用限于短期实验，并且无法评估溶酶体功能障碍的人类或非人类动物中溶酶体酸度的长期和体内恢复的益处。因此，我们研发并表征了由内部溶酶体触发物活化的新一代纳米颗粒。这些新一代的纳米颗粒(酸活化的酸释放型纳米颗粒或acNP)甚至可以被受损的溶酶体活化，所述溶酶体仍然保留弱酸性环境(
Figure BDA0002589558380000081
6)。
在非酒精性脂肪肝病和β细胞功能障碍的细胞模型中，这些酸活化的酸释放型纳米颗粒(acNP)可用于恢复自噬通量和细胞功能。图1提供了一个模型，所述模型详述了acNP恢复暴露于高脂质环境的细胞中的自噬通量的能力。
不受特定理论的束缚，可以通过静脉内施用或本领域已知的其它施用方式在体内利用这些纳米颗粒。这些纳米颗粒有潜力成为研究具有受损的溶酶体酸度的疾病的显著进展，所述显著进展包含将所述纳米颗粒用于恢复溶酶体酸化以治疗这些疾病。另外，药物研发人员可以使用acNP验证所关注疾病的溶酶体酸化途径中的药物靶标。
由于溶酶体酸化的长期恢复先前是不可能的，因此本文所描述的acNP是第一个：
(1)用于在延长的连续时间段内恢复溶酶体酸化以促进机理研究的工具；
(2)使研究人员能够查询靶向受损的溶酶体酸化的益处从而授权药物研发人员将溶酶体酸化验证为治疗靶标的工具；
(3)NP，所述NP将感知其进入靶向细胞器并在细胞器内部自我活化；
(4)靶向干预，通过所述靶向预，可以在不干扰其它细胞器的pH的情况下酸化溶酶体；
(5)溶酶体酸化干预，鉴于NP在体内使用的先例，所述溶酶体酸化干预适合在体内使用。
值得注意的是，非酒精性脂肪肝病(NAFLD)是当今世界上最常见的肝病。最近，已经发现被称为脂毒性(LT)的肝游离脂肪酸(FFA)水平的增加会引起自噬通量的抑制，同时溶酶体酸度降低，从而导致NAFLD的发病机理。在本发明的一方面，合成了新颖的可生物降解的酸活化的酸释放型纳米颗粒(acNP)，以策略性地靶向和操纵溶酶体酸度和自噬。在本发明的一方面，acNP基于氟化聚酯，所述氟化聚酯可在pH 6.0(功能障碍性溶酶体中报告的pH)下降解，以释放出进一步降低溶酶体pH的组分酸—TFSA(四氟琥珀酸)和SA(琥珀酸)，从而在LT下增加肝细胞的自噬通量和细胞功能。本文所描述的acNP可作为恢复NAFLD和其它功能障碍性溶酶体疾病的潜在疗法。
本发明的acNP可以在许多情况下用于促进自噬，包含治疗心肌病、与年龄有关的痴呆、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病和溶酶体贮积症以及用于治疗对溶酶体功能的恢复反应良好的哺乳动物的病状。在本发明的一方面，acNP可以用于治疗或预防与受损的溶酶体酸度相关联的疾病。此类疾病包含但不限于肥胖症、高脂血症(hyperlipidemia)、高血压、代谢综合症、II型糖尿病(T2D)、肝脏疾病(如非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、肝硬化或肝癌)、神经变性(例如，与年龄有关的痴呆、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病等)。在另一个实施例中，可以将acNP施用于肝脏，所述肝脏将被移植到需要移植的受试者中。在另一个实施例中，通过用本发明的acNP灌注肝脏，将用于移植的肝脏脱脂。
不受特定理论的束缚，据信本文所描述的和实例中说明的纳米颗粒(acNP)使得能够在过量脂质抑制自噬的细胞系统中局部恢复溶酶体pH、自噬通量和细胞功能。已将这些观察扩展到体内模型。这些新颖的acNP通过内部溶酶体触发物将酸递送到受损的溶酶体区室中，以恢复自噬通量和细胞功能。据信本发明的acNP是第一个能够将溶酶体pH调节到溶酶体正常运行所需的酸性条件的药理学或分子工具。
降低的溶酶体酸度(pH>6)会抑制暴露于高水平脂肪酸(FA)的肝细胞和β细胞的自噬通量。在一方面，摄入由氟化聚酯制备的acNP，并在pH 6下在功能障碍性溶酶体中将其组成性地活化。调配聚合物的不同组成，并将其用于确定在抑制溶酶体酸化的条件下具有适当酸化速率、溶酶体靶向性和恢复溶酶体酸度的调配物。
在某些实施例中，acNP是由聚酯制备的，所述聚酯在暴露于弱酸性环境时会降解成其酸成分和醇成分。为了确保所述酸仅被释放到功能障碍性溶酶体中并确保发生进一步酸化，在某些实施例中，使用了含有四氟琥珀酸(TFSA)的氟化聚酯。氟化聚酯广泛用于医疗应用，在医疗应用中氟化聚酯展现出低毒性以及高的体外和体内生物相容性。通常，聚酯在pH 7-7.4的水性环境中不易水解。然而，在弱酸性环境(pH 6.0)下，聚酯会经历水解、降解并释放酸。因此，挑战在于水解和NP降解时进一步降低周围的pH。先前合成的由酸(如乙醇酸或琥珀酸(SA)，二者具有相对较高的pKa值(例如，乙醇酸＝3.83，琥珀酸＝5.6和4.2))构成的生物可降解聚酯仅使pH降低一点，因此不足恢复溶酶体的pH。然而，在本文所说明的聚酯纳米颗粒中，我们使用了具有较低pKa
Figure BDA0002589558380000102
的TFSA。因此，acNP使得能够通过释放更强的酸来更显著地恢复溶酶体的pH。
我们假设聚酯的acNP组成具有：(1)TFSA对SA的量越大，在缓冲液和溶酶体区室中的酸性反应就越大；以及(2)更大的疏水性(通过在聚酯内增加二醇中存在的亚甲基碳的数量，例如乙烯到丙烯到丁二醇)将更缓慢地降解并在更长的时间内递送酸。因此，在一个实施例中，在acNP的合成中，TFSA对SA的含量是变化的。在另一个实施例中，二醇链的长度是变化的。较短的乙二醇链导致更大的酸化，而较长的乙二醇链导致更慢的acNP降解，从而允许在更长的时间内传递酸。为了调节酸化程度，我们基于不同比率的TFSA:SA以及不同类型的二醇(乙二醇、丙二醇或丁二醇)合成了一系列聚酯和对应的acNP，所述聚酯在
Figure BDA0002589558380000101
下活化以进一步将溶酶体腔酸化至正常水平(pH～4.5)。认识到的是，乙二醇、丙二醇和丁二醇二醇是说明性的而非限制性的。其它线性烃基二醇(例如，己二醇、聚乙二醇)也可用于生成acNP。在另一个实施例中，支链二醇用于产生本发明的acNP。支链二醇的实例包含但不限于甘油和聚(乙二醇)星形聚合物。使用本文提供的教导，其它合适的二醇是本领域技术人员所认识的。
在另外的实施例中，acNP包括聚酯，其中二醇的链长和四氟琥珀酸与琥珀酸的比率是变化的。通过改变acNP中的聚合物组成和/或四氟丁二酸与丁二酸的比率，可以调节酸化的速率和程度。较高的TFSA含量导致溶酶体酸化的速率增加。
此外，通过改变acNP中的聚合物组成和/或四氟琥珀酸与琥珀酸的比率，可以将acNP短时间或长期地施用于需要治疗的人类或非人类哺乳动物。另外，改变聚合物组成和/或四氟丁二酸与丁二酸的比率会提供稳定性，并且因此可在需要或不需要控制acNP储存温度的情况下进行储存。
在一个说明性而非限制性的实施例中，根据以下方案I通过缩聚方法合成聚合物：
Figure BDA0002589558380000111
在各个实施例中，改变单体比率和二醇类型以改变所得聚合物。通过例如1H、13CNMR和凝胶渗透色谱技术来表征和验证最终的组成和分子量。结果示出在实例1和2中。我们合成了在TFSA:SA比率以及乙二醇、丙二醇或丁二醇方面均不同的聚合物的文库(参见表1)。表1中尤其示出了聚酯1(10％PEFSU)、聚酯4(25％PEFSU)、聚酯5(PESU)和聚酯12(50％PBFSU)的表征化学组成以及分子量数均分子量Mn、重均分子量Mw和多分散度D(另参见实例1和2中这些聚合物的表征)。
表1.说明性而非限制性的acNP文库。
Figure BDA0002589558380000112
在某些说明性而非限制性的实施例中，选择此直径是因为50-100nm的NP容易通过内吞途径被摄入到溶酶体中(20，21)。根据动态光散射和扫描电子显微镜研究，由聚酯1(10％PEFSU)、聚酯4(25％PEFSU)、聚酯5(PESU)和聚酯12(50％PBFSU)形成的acNP的说明性结果显示了相对较小的大小和均匀的分布(直径<100nm，PDI<0.14)。
在某些实施例中，当介于pH 5与pH 6.0之间时，acNP改变体内血浆pH。acNP能够将pH从6显著降低至3。
acNP细胞摄入速率和定位到内体/溶酶体区室。
acNP摄入到细胞和溶酶体中的速率的表征。
本发明提供了聚酯和acNP的文库。在某些实施例中，聚合物合成产率>60％，分散度(Mw/Mn)<1.4，并且MW在预期MW的10％以内。在一些实施例中，acNP的直径为约75mm，PDI<0.1。在另外的实施例中，acNP的直径为约100-120nm，PDI为0.1-0.2。在另一个实施例中，acNP的直径为约50-100nm。可以通过使用微乳液技术或通过使用LV-1微流化器(微流体公司(Microfluidics Corp))来产生本发明的acNP。确定acNP组成-酸化，即TFSA含量与二醇链长之间的关系，以优化聚合物组成和溶酶体酸化。本发明的acNP对细胞没有细胞毒性，并且可以通过微胞饮作用、内吞作用(网格蛋白或小窝蛋白介导的)、吞噬作用或微胞饮作用被细胞摄入。进入细胞后，acNP定位到溶酶体，在溶酶体中，acNP在四小时内将溶酶体酸化到其正常pH(约4到约4.5)
NP合成的潜在限制是由于聚集而导致acNP长期储存(>30天)的不稳定性。在一个实施例中，在合成后将NP冻干。在另一个实施例中，添加一种或多种冷冻保护剂(例如，海藻糖、甘露糖或蔗糖)。冷冻保护剂用于稳定NP悬浮液并增加其重新悬浮的方便性，以供进一步使用。本发明的acNP使得能够在损害溶酶体酸化的条件下长期恢复自噬通量。
在本发明的一方面，acNP在溶酶体酸化受损的患病细胞中提供溶酶体功能和自噬通量的短期和长期恢复。在一个实施例中，acNP在暴露于过量FA的肝细胞和β细胞中提供溶酶体功能和自噬通量的短期和长期恢复。在一个实施例中，acNP增强了长期暴露于FA的细胞中的溶酶体-自噬体融合能力、溶酶体水解酶活性和自噬通量。acNP使得能够连续和长期恢复最佳溶酶体pH。验证实验表明，在β细胞功能障碍的体外疾病模型中，acNP可以提供溶酶体功能和自噬通量的短期和长期恢复(孵育4小时后acNP可以降低B细胞中的溶酶体pH)。
由于长期暴露于FA而引起的自噬通量抑制是溶酶体酸度降低的结果，这破坏了溶酶体与自噬体的融合以及自噬体内容物的降解。在一个实施例中，acNP增强了长期暴露于FA的细胞中的溶酶体-自噬体融合能力、溶酶体水解酶活性和自噬通量。
在另一个实施例中，acNP恢复溶酶体中的水解酶活性。细胞中的溶酶体酶活性包含组织蛋白酶(即组织蛋白酶A、B、C、D、E、K、L、O、S、V)、葡糖脑苷脂酶(GBA)或LAMP(即LAMP1、LAMP 2、LAMP 5)。
在另一个实施例中，acNP恢复具有溶酶体功能障碍的细胞中的自噬通量。具有溶酶体功能障碍的细胞可以包含长期暴露于脂质或脂肪酸的细胞。在自噬体的形成期间中，磷脂酰乙醇胺与细胞质LC3(LC3-I)结合形成LC3-II，所述LC3-II被隔离在自噬体膜中。LC3用作自噬体内容物的标志物。因此，在功能性细胞中，溶酶体的酸化导致与自噬体融合，从而允许自噬体及其内容物(包含LC3-II)的降解。受损的溶酶体酸化会降低自噬体的降解。因此，融合导致LC3-II的积累。为了推论对自噬通量的影响，应用了两个测试。首先是测量在自噬体中降解的p62。其次，完全阻断自噬体的降解可以估计对自噬体形成的任何影响(LC3-II的测量)。为了测试acNP防止功能障碍性自噬体积累的能力，在暴露于脂毒性的整个16小时内，用acNPS处理细胞。长期的FA暴露会导致细胞中LC3-II和p62的水平增加，并且用acNP处理使得这两种蛋白的水平正常化。
在另一个实施例中，acNP使具有溶酶体功能障碍的细胞中的蛋白质和线粒体的转换正常化。可以通过测量蛋白质转换和线粒体转换来定量acNP对自噬的特定结果的影响—自噬的两个关键生理作用是蛋白质和线粒体的转换。使用探针Fis1-GFP-mCherry(AnneBurnet博士保藏的Addgene质粒)确定线粒体的转换，所述探针监测细胞中的线粒体自噬率。Fis1-GFP-mCherry报告了线粒体进入酸性自噬体时，荧光被猝灭。
使用探针MitoTimer(Roberta Gottlieb博士保藏的Addgene质粒)测量线粒体蛋白转换，并且所述线粒体蛋白转换受到巴弗洛霉素对溶酶体质子泵的抑制的强烈影响(32)。Mitotimer基于蛋白质的年龄改变发射光谱(从绿色到红色)。在组成性表达期间，较高的红色/绿色荧光比表示线粒体内的旧蛋白质的积累，并被解释为无法通过自噬有效清除线粒体。
为了确定acNP对自噬的影响，可以用过量的脂质处理INS1细胞和HepG2细胞，然后在存在或不存在蛋白酶抑制剂(例如，胃抑素+E64D)的情况下孵育acNP。蛋白酶抑制剂可防止自噬体内容物的降解。我们相信，由于长期的FA暴露而导致的溶酶体酸化降低将增加β细胞和肝细胞中红色/绿色MitoTimer蛋白质的比率。用acNP挽救自噬通量将恢复线粒体自噬，并使用FA处理的细胞中的红色/绿色荧光正常化。
体内溶酶体酸化的药理学抑制会导致脂肪肝，并且自噬的抑制会损害葡萄糖刺激的胰岛素分泌。迄今为止，尚不清楚增加酸化作用是否能够逆转脂肪肝和胰岛素抵抗(IR)。不受特定理论的束缚，我们相信溶酶体酸度和自噬通量的恢复将使肝细胞脂质含量正常化，并增强β细胞响应葡萄糖而分泌胰岛素的能力。
自噬在被称为脂噬(lipophagy)的过程中消耗脂滴，并且脂滴在肝细胞内的积累在胰岛素抵抗(IR)的发展中起因果作用。在本发明的一方面，通过增加脂噬，用acNP活化自噬减少了肝细胞的脂质负担。在另一个实施例中，对由于过量的FA暴露而导致具有溶酶体功能障碍的受试者的acNP治疗增加了蛋白激酶B(Akt)的磷酸化。响应于胰岛素受体的刺激，PI3K将蛋白激酶B(Akt)直接磷酸化。Akt的磷酸化发生在Ser473。在胰岛素抵抗(IR)的状态下，由于FA暴露诱导IR，Ser473的磷酸化减弱。在另一个实施例中，acNP在胰岛素抵抗性肝细胞中恢复了对葡萄糖产生的胰岛素抑制作用。
在肥胖的、胰岛素抵抗的人类中，胰岛素减少肝细胞产生葡萄糖的能力降低，并且与肝脂质积累密切相关。为了确定acNP是否能够在胰岛素抵抗性肝细胞中恢复对葡萄糖产生的胰岛素抑制作用，分离出肝细胞，并在存在或不存在acNP的情况下在FA中对肝细胞进行长期培养。
在本发明的一方面，对暴露于过量脂质环境的细胞的acNP处理在长期内恢复了酸化，从而导致细胞中葡萄糖刺激的胰岛素分泌的完全且持续的恢复。在一个实施例中，通过向暴露于过量脂质的哺乳动物施用有效量的acNP，预防了所述哺乳动物中葡萄糖刺激的胰岛素分泌的缺陷。
在本发明的一方面，acNP包括具有不同聚酯组成的聚合物。在一个实施例中，acNP包括聚酯，其中二醇的链长是变化的。具有不同链长的二醇的聚酯选自由以下组成的组：乙二醇、丙二醇、丁二醇、己二醇、聚乙二醇。
在另一个实施例中，聚酯是不同链长的直链或支链烃。在另一个实施例中，acNP包括四氟琥珀酸(TFSA)与琥珀酸(SA)的变化的比率。TFSA与SA的比率选自由以下组成的组：约10:90、约15:85、约20:80、约25:75、约30:70、约35:65、约40:60、约45:55、约50:50、约55:45、约60:40、约65:35、约70:30、约75:25、约80:20、约15:15、约90:10、约95:5和约100:0。
在本发明的一方面，提供了包括acNP的药物调配物及其使用方法。
鉴于本文提供的前述内容和实例，技术人员将认识到，我们已经合成了新颖的可生物降解的酸活化的酸释放型纳米颗粒(acNP)，以策略性地靶向和操纵溶酶体酸度和自噬。这些acNP在pH 6.0(功能障碍性溶酶体中报告的pH)下降解，以释放出进一步降低溶酶体pH的组分酸，从而在LT下增加肝细胞的自噬通量和细胞功能。acNP在被诊断患有NAFLD或其它溶酶体功能障碍疾病的个体中可用作恢复溶酶体功能的治疗剂。
实例
提供以下实例以展示要求保护的发明，但不限制要求保护的发明。
实例1
可生物降解的聚酯在脂毒性下调节细胞中的溶酶体酸化
聚酯文库的合成。
使用缩聚制备聚酯，基于TFSA:SA的比率，反应温度和时间略有变化。使TFSA:SA比率大于50％的聚酯在130℃下反应，而其它聚酯在150℃下反应。使用1H NMR、13C NMR、19FNMR(SI)和凝胶渗透色谱法(GPC)对聚合物组成、分子量和PDI进行表征(图2，图片A-E)。NMR光谱的结果证实了聚酯组成，并且与理论比率一致。同一系列的分子量的顺序相同。
聚酯的热特性
用差示量热扫描(DSC)和热重分析(TGA)表征聚酯的热行为。确定了熔融温度、结晶温度和玻璃化转变温度以及聚酯显示出5％降解的温度(Td，5％)或聚酯显示出最大降解的温度(Td，max)，并且所述结果示于表2中。对于许多被表征的聚酯，未检测到熔融温度或结晶点。大多数聚酯具有低于-20℃的玻璃化转变温度(图3A和3B)。这项研究的结果表明，聚酯大多是无定形的。玻璃化转变温度随着所使用的TFSA:SA的比率的增加而降低。所有合成的聚酯在高达250℃下均没有分解(图3C)。
以下表2示出了合成聚酯的热特性。Tg表示转变温度，Tcc：冷结晶温度，ΔHcc：冷结晶期间的热流变化，Tm：熔融温度，ΔHm：熔融期间的热流变化，Tc：结晶温度，ΔHc结晶期间的热流变化，Td,5％：聚酯显示出5％分解的温度，以及Td,max：聚酯显示出最大分解的温度。
表2
Figure BDA0002589558380000151
单分散纳米大小的acNP的合成。
聚酯的特征在于其形成纳米颗粒的能力。制备纳米颗粒的方法包含但不限于微乳液、超声处理12、溶剂置换和纳米沉淀。纳米沉淀是一种简单、快速的方法，其允许在没有任何高剪切应力的情况下使用非高毒性溶剂。此外，所述方法允许轻松扩展到工业规模以生成acNP。纳米颗粒的形成取决于颗粒成核、分子生长和聚集。简而言之，通过首先将聚合物溶解在可与水混溶的溶剂(即，丙酮/DMF)中并通过25G注射器针头将其逐滴添加到具有不同类型的表面活性剂的快速搅拌水溶液中来形成纳米颗粒。通过随时间进行的透析去除有机溶剂和过量的表面活性剂。为了获得具有不同大小和稳定性的acNP，需要更改若干参数，例如，(1)聚合物的类型和数量、(2)有机溶剂的类型、(3)溶剂与水溶液的比率、(3)表面活性剂的类型、(4)聚合物与表面活性剂的比率、(5)透析时间以及(6)温度(表3)。通过动态光散射(DLS)、扫描电子显微镜(SEM)和ζ电位仪对acNP的大小、形态和稳定性进行了表征。(图4)示出了使用由丁二醇(聚酯)和TFSA:SA比率合成的不同聚合物调配的代表性acNP的SEM图像。
溶剂类型的影响
为了探索用于形成acNP的不同变量，选择了50％PBFSU作为模型聚合物。acNP的制备中使用了不同的溶剂。所使用的溶剂为丙酮、二氯甲烷(DCM)和二甲基甲酰胺(DMF)。由DMF形成的acNP是最球形的，并且具有最低的多分散度(0.125)，这表明稳定性高。acNP的大小也是小的—133.9nm。尽管表3表明由丙酮合成的acNP甚至更小，但是SEM图像(图5-更改为图5)显示出过量的表面活性剂和不均匀的形态，这表明不完全的颗粒形成(SI)。
表3
调配变量对acNP形成的影响。
Figure BDA0002589558380000161
Figure BDA0002589558380000171
图例：a-溶剂类型，b-水类型，c-表面活性剂类型，d-浓度，e-温度，f-多分散度，g-超纯水超滤水，h-十二烷基硫酸钠，i-聚乙烯醇，j-聚-L-赖氨酸以及k-普朗尼克F127。
表面活性剂类型的影响
确定所使用的溶剂类型后，考虑了不同表面活性剂对acNP形成的影响。用十二烷基硫酸钠(SDS)制成的纳米颗粒产生最小的直径和PDI，而聚-L-赖氨酸的纳米颗粒则比使用SDS获得的纳米颗粒大一个数量级，并且具有显著的聚集。两种非离子表面活性剂，聚乙烯醇(PVA)和普朗尼克F127，也产生了比SDS大得多的纳米颗粒。
聚合物与表面活性剂的比率的影响
通过改变DMF中的聚合物和纳米纯水中的表面活性剂的最终浓度(mg/mL)来确定聚合物与表面活性剂的比率。进行调配，其中表面活性剂的浓度(1)大于、(2)等于或(3)小于所用聚合物的浓度。发现用于acNP形成的最佳比率为1:4(即，50％PBFSU的1mg/mL最终浓度:SDS的4mg/mL)。随后的调配将溶剂与水的比率保持恒定，聚合物与表面活性剂的比率保持在1:4，改变单个参数以确定这些参数的影响。
溶剂与水的比率的影响
较低的溶剂与水的比率导致形成小得多的纳米颗粒。
透析温度的影响
当聚合物与表面活性剂的比率以及溶剂与水的比率固定时，确定透析温度和时间。在0℃或25℃下测试acNP的形成。这是因为温度操纵会影响表面活性剂的临界胶束浓度(CMC)，其中CMC通常会随着温度的升高而降低，直到温度升高对应于CMC升高的某个点。在0℃下，水中SDS的CMC为2.75mg/mL，而在25℃下，CMC落在2.30-2.50mg/mL的范围内。在0℃和25℃两者下测试acNP调配物，SDS的变化浓度高于和低于CMC。在25℃下，在高于CMC的SDS浓度下形成最佳的纳米颗粒。SEM图像表明，在这种条件下，形成的acNP是球形的并且具有分散的群体(图6)。在0℃下，其大小、多分散度和ζ电位与25℃下获得的大小、多分散度和ζ电位类似。由于DMF的挥发性，未测试高于25℃室温的更高温度。另外，高温下的透析导致CMC降低，从而降低了表面活性剂包裹聚合物的能力，所述能力由于快速的胶束形成而受到阻碍。
透析时间的影响
发现透析时间显著影响纳米颗粒的大小。比较介于24小时与36小时之间的时间点，24小时的透析产生了具有最佳大小和稳定性的纳米颗粒。当透析时间增加到36小时时，acNP的大小没有显著改变(图7)。
聚合物类型的影响
所用聚合物的类型影响形成acNP所需的透析时间。具有较低的TFSA:SA含量或较短的乙二醇长度的acNP需要更短的透析时间—即75％PBFSU和100％PBFSU仅需要6小时的透析(形成的acNP的平均直径为94.6nm，PDI为0.124)，而使用25％的PEFSU，则仅需要8小时的透析。另一方面，25％PBFSU或50％PBFSU需要24小时来形成acNP(平均直径133.9nm，PDI0.125)。使用DLS和SEM成像两者对acNP的形成进行表征(图4)。
通过pH和GPC分析表征acNP的降解速率
使用上述合成的acNP研究了在不同类型的缓冲环境中的pH调节能力和降解速率。将acNP随时间悬浮在DI水或pH 6.0的20mM PBS缓冲液中，并测量pH和分子量的变化。选择pH 6.0的20mM PBS缓冲液是因为其模拟了功能障碍性溶酶体的缓冲能力(19±6mmol/Ph)。在pH 6.0下，与含有丁二醇的聚酯相比，含有乙二醇的聚酯酸化得更快(图13，图片B)。比较相同系列中的acNP，即PBFSU acNP，具有较高TFSA:SA比率的PBFSU acNP显示出更高的酸化速率(图8)。
通过使用凝胶渗透色谱法(GPC)确定37℃下水中聚合物的分子量降低速率，来测量acNP的降解速率。将acNP悬浮在水中，并在37℃下孵育1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、1周、2周。在每个指定的时间点收集等分试样的聚合物溶液，将其干燥并重新溶解在四氢呋喃(THF)溶剂中，然后使用GPC进行分析。图8B表明，acNP以稳定的速率降解，这表明降解发生自端基，而不是中心。在PBFSU系列中，TFSA:SA比率越高，降解速率越慢。
比较使用不同聚酯制备的acNP，具有较短二醇链的聚酯降解更快。基于降解曲线，PBFSU聚酯经历了异相双相降解。在第一阶段(0–24小时)，PBFSU酯键缓慢地全部水解。在第二阶段(24-48小时)，降解产物(即，TFSA或SA)的羧酸端基降低了pH，并催化了纳米颗粒内部的进一步降解。如通过降解速率增加所看到的，这允许更快的水渗透和纳米颗粒的大量损失。
acNP的细胞毒性和acNP的溶酶体pH恢复能力。
在HepG2细胞系中确定了PBFSU acNP的细胞毒性。当将HepG2细胞与使用不同聚合物:TFSA/SA比率制备的acNP(浓度高达1000μg/mL)一起孵育时，未观察到显著的死亡(图9)。确定了PBFSU acNP挽救棕榈酸酯诱导的细胞死亡的能力。(图9B)。发现具有较高的酸释放速率和释放量的acNP能够增加细胞生存力。
此外，测试了acNP在脂毒性条件下调节HepG2细胞中溶酶体pH的能力。将HepG2细胞与(1)与BSA复合的棕榈酸酯(棕榈酸酯:BSA)一起孵育16小时以诱导脂肪毒性，或(2)与具有不同acNP(50％、75％和100％PBFSA acNP)的棕榈酸酯:BSA一起孵育16小时。用LysoSensorTM黄色/蓝色染料和共聚焦成像评估溶酶体的pH。使用MetaMorph分析软件对图像进行定量(图19A &B)。结果表明，丁烯基acNP在孵育16小时内恢复溶酶体pH，这与其快速降解动力学相符。
实例2
可降解的酸性纳米颗粒在脂质毒性下恢复细胞中的溶酶体pH和自噬通量
可生物降解的acNP(PEFSU acNP)的合成、表征及其在溶液中的降解动力学。
基于一系列合成的聚(乙烯-琥珀酸-共-四氟琥珀酸酯)聚合物(PESU和25％PEFSU)合成酸活化的酸性纳米颗粒，所述聚合物可以生物降解以释放组分羧酸—四氟琥珀酸(TFSA)和琥珀酸(SA)，所述四氟琥珀酸和琥珀酸显著降低了周围的pH(图11)。
通常，聚酯在pH 7-7.4的水性环境中不易水解。然而，在弱酸性环境(pH 6.0)下，聚酯会经历水解、降解并释放酸。挑战在于水解和NP降解时进一步降低周围的pH。先前合成的由酸(如乙醇酸或乳酸，二者具有相对较高的pKa值(例如，乙醇酸＝3.83，乳酸＝3.86))构成的生物可降解聚酯仅使pH降低一点。本发明中的聚酯掺入了pKa低得多
Figure BDA0002589558380000191
的TFSA。由这些TFSA/SU聚酯制成的acNP通过释放比由DL-丙交酯-乙交酯合成的PLGA纳米颗粒更强的酸，能够显著恢复溶酶体的pH。
acNP酸化能力。
为了显示这些acNP的酸释放特性和pH降低特性，通过改变的TFSA和SA的比率合成了两种不同的聚合物(PESU和25％PEFSU)，所述聚合物具有不同的降解速率和酸释放速率。1H、13C和19F NMR光谱和聚合物表征示出在图11中。
根据动态光散射和扫描电子显微镜研究(图4(上述PBFSU)的图片A和图13(PEFSU)的图片A)，由10％PEFSU、25％PEFSU、PESU和50％PBFSU聚酯形成的acNP的说明性结果显示了相对较小的大小和均匀的分布(直径<100nm，PDI<0.14)。
当在25℃和37℃下将acNP在pH 6.0、7.4和8.0的20mM PBS缓冲液中以及DI水中随时间孵育时，可以容易地确定酸化的速率和程度。选择pH 6.0的20mM PBS缓冲液是因为其模拟了功能障碍性溶酶体的缓冲能力(19±6mM，pH＝6.0)(22)。另外，在pH 7.4的血浆中重复实验，因为这更能代表体内血浆环境。改变血浆pH的acNP无需进一步考虑，因为其不太可能与体内测试兼容。初步数据表明，当暴露于pH 7.4缓冲液时，由25％PEFSU(25:75 TFSA:SA和乙二醇)构成的acNP并未改变pH，而在pH 6.0缓冲液中，pH从6显著降低到3(图14B)。相反，由于丁二醇的疏水性比乙二醇大，因此由聚酯、50％PBFSU(50:50 TFSA:SA和丁二醇)构成的acNP导致酸释放较慢。(图13B)。由于较低的TFSA含量降低了其酸化速率，所以由10％PEFSU(10％TFSA)构成的acNP降解得比25％PEFSU慢。(图13B)。这些结果支持我们的假设。因此，我们认为可以通过改变TFSA:SA的比率和乙二醇的类型来精确控制酸化程度。
含有0％TFSA和100％SA的PESU充当对照，因为预计其具有较慢的降解速率，并且因此pH没有显著变化。另一方面，25％PEFSU(25％TFSA和0％SA)具有增加的TFSA含量，这可以增加其酸度和pH降低特性。使用合成的聚合物通过纳米沉淀技术1形成单分散acNP。通过动态光散射(DLS)、扫描电子显微镜(SEM)和ζ电位仪分别对acNP的大小、形态和稳定性进行表征。(图14，图片A)。形成的acNP的平均直径为100nm，并且ζ电位介于-25mV到-30mV之间，这表明溶液具有良好的稳定性(图14，图片A)。
为了确定acNP的酸化程度，测量了48小时内在PBS pH 6.0缓冲液(溶酶体环境模拟缓冲液)中以及在pH 7.4下的acNP悬浮液中的pH变化。在pH 6.0中，基于25％PEFSU的acNP在前4小时内将PBS pH缓冲液(20mM)显著酸化，并持续酸化至24小时。(图13B和图14B，左图)。相反，基于PESU的acNP并未导致pH改变，这可能是因为聚合物的降解速率慢，因此释放的琥珀酸量低，这对降低pH值没有显著影响(图13B和图14B，左图)。还将pH释放与已经在其它细胞系中用于类似应用的PLGA Np进行了比较，结果显示酸释放速率比25％PEFSUacNP慢得多(图15)。
acNP细胞摄入速率和定位到内体/溶酶体区室。
acNP摄入到细胞和溶酶体中的速率的表征。
为了可视化acNP摄入到细胞和溶酶体中的途径，用罗丹明(Rho-acNP)共价标记acNP。将HepG2和INS1细胞与Rho-acNP一起孵育24小时。共聚焦成像前30分钟，添加标记溶酶体的LysoTracker Green DND-26以在培养基中实现50nmol/mL的最终浓度(25，26)。定量Rho-acNP与Lysotracker绿色染料的共定位，以确定Rho-acNP是否位于溶酶体内。Rho-acNP(25％PEFSU)显示出与Lysotracker绿色染料的共定位，这表明摄入到溶酶体中(参见，例如，图16)。
acNP的细胞毒性和摄入。
在HepG2细胞系中确定了acNP的细胞毒性。为了确定可用于在不诱导显著细胞死亡的情况下治疗HepG2细胞的最佳acNP(PESU和25％PEFSU)浓度，使用10μg/mL到1000μg/mL范围内的各种acNP浓度进行24小时的剂量反应细胞毒性试验。然后将不同浓度处理条件下的活细胞百分比相对于对照(未用棕榈酸脂或acNP处理的细胞)进行归一化。两种类型的acNP在高达1000μg/mL的浓度下并未导致显著的细胞死亡(图17A)。选择最佳剂量为100μg/mL以进行进一步测定，从而避免对细胞产生任何细胞毒性。
定位到溶酶体的acNP。
及时摄入到肝细胞中并特异性定位到溶酶体对于acNP在体外发挥其作用很重要。预期acNP的大小
Figure BDA0002589558380000211
会导致内体-溶酶体系统内的摄入和定位。使用所选的100μg/mL的浓度，将罗丹明标记的acNP(Rho-acNP)与HepG2细胞一起孵育24小时。流式细胞术确定大多数Rho-acNP摄入发生在前8小时内(图17B)。使用LysoSensorTM蓝色染料的共定位共聚焦显微镜证实Rho-acNP被定位到HepG2细胞中的溶酶体中(图17C)。
10％ PEFSU acNP和25％ PEFSU acNP可恢复暴露于脂肪酸的HepGs细胞中的溶酶 体pH和细胞生存力
通过使用LysoSensorTM黄色/蓝色染料(基于pH改变其发射)通过共聚焦成像监测细胞来定量acNP酸化肝细胞和β细胞中的功能障碍性溶酶体的能力。将细胞与400μM 4:1的与牛血清白蛋(BSA)复合的棕榈酸酯(4:1棕榈酸酯:BSA))一起孵育，并与0.1μg/mL到1000μg/mL范围内不同浓度的不同acNP共同孵育16-18小时(HepG2细胞需要16小时，B细胞需要18小时)。将未添加棕榈酸酯或acNP的细胞以及仅用acNP处理的细胞用作对照。与20小时或24小时相比，针对B细胞选择了棕榈酸酯:BSA处理的18小时时间点，因为此时间点产生细胞中最高的溶酶体pH碱化(10)。处理后，添加1μM的LysoSensorTM黄色/蓝色染料，并在添加染料后5分钟内对细胞进行成像，以使碱化最小化。基于先前确定的标准曲线将比值校准至溶酶体的pH(14)。用棕榈酸酯处理16小时的HepG2细胞的溶酶体pH显著升高(
Figure BDA0002589558380000212
单位)。
结果表明，用4:1棕榈酸脂:BSA处理的HepG2细胞(与由10％PEFSU或25％PEFSU(分别为聚酯1和聚酯4)构成的acNP共同孵育或不共同孵育)展现出溶酶体pH的显著恢复，类似于BSA对照(图18A和B)。
在棕榈酸酯-BSA(4:1比率)和各种浓度(0.1–1000ug/mL)的acNP孵育24-72小时后评估细胞。与未经处理的对照相比，用棕榈酸酯-BSA和来自10％PEFSU或25％PEFSU(分别为聚酯1和聚酯4)的acNP处理的HepG2细胞的初步数据显示出了细胞生存力的显著挽救(图18C)。
acNP可恢复暴露于棕榈酸酯的肝细胞中的溶酶体的pH和大小。
已经显示了acNP功能和溶酶体中的细胞摄入，基本问题是acNP是否可以恢复暴露于LT的细胞中的溶酶体酸度。在有或没有25％PEFSU acNP的情况下，将HepG2细胞暴露于BSA，0.4mM与BSA复合的棕榈酸脂(棕榈酸脂:BSA)(图19A)。孵育后，以75nM的浓度添加LysoSensorTM黄色/蓝色染料(赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific))，通过共聚焦成像评估溶酶体的酸度和大小，并在添加染料后5分钟内用
Figure BDA0002589558380000221
进行图像分析，以防止溶酶体碱化。
为了显示溶酶体的LysoSensorTM染色的特异性，在成像前用100μM巴弗洛霉素处理细胞2小时，由于溶酶体pH的中和，并未示出LysoSensorTM染色。(图19B)。图18C表明，棕榈酸酯暴露显著增加了溶酶体pH(□)，增加幅度为0.6pH单位。与经BSA处理的细胞相比，暴露于棕榈酸酯还增加了溶酶体大小(◇)。与图14B一致，用PESU acNP进行的处理并未诱导pH降低，这表明降解速率和酸释放速率较慢。另一方面，用25％PEFSU acNP进行的处理在HepG2细胞中分别引起0.3和0.5pH单位的降低(图19C)。添加25％PEFSU acNP还引起平均溶酶体大小的显著减少，这可能是由于通过自噬而增加的溶酶体转换。34
用PLGA纳米颗粒(先前已被证明当以1mg/ml39的浓度使用时会酸化溶酶体)进行的处理在棕榈酸酯下以1mg/ml的浓度部分恢复了溶酶体酸度(图20)。相比之下，25％PEFSUacNP以低10倍浓度(100μg/ml)恢复了溶酶体酸度。溶酶体组织蛋白酶的活性是pH依赖性的，研究表明，暴露于脂肪酸会抑制组织蛋白酶的活性。16,34
为了确定acNP是否恢复棕榈酸酯孵育的细胞中的溶酶体酶组织蛋白酶L活性，进行了魔术红组织蛋白酶L荧光底物测定。结果表明，用25％PEFSU acNP恢复溶酶体酸度显著增加了溶酶体组织蛋白酶L的pH依赖性活性。与未经acNP处理的棕榈酸脂孵育的细胞相比，在经acNP处理的棕榈酸脂孵育的细胞中，组织蛋白酶L活性的这种增加与魔术红荧光强度的增加相关(图18)。这进一步证实了溶酶体酸度的降低在脂毒性下在16小时内引起溶酶体的功能性挽救。
由acNP控制的溶酶体酸化可恢复暴露于脂肪酸的HepG2细胞中的自噬通量。
在自噬体形成期间，磷脂酰乙醇胺与细胞质LC3(即，LC3-I)结合形成LC3-II，所述LC3-II被隔离在自噬体膜中。因此，LC3-II积累充当自噬体积累的替代标志物。(参见图1)。为了研究溶酶体酸度的恢复是否缓解了暴露于棕榈酸酯的HepG2细胞中的自噬通量的抑制，测量了微管相关蛋白质1A/1B轻链3(LC3-II)的细胞内积累。为了进一步证实acNP对自噬降解的影响，还测量了p62蛋白质(即在自噬期间被降解并用作自噬通量的标志物的蛋白质)的水平。44为了验证并确定棕榈酸酯引起HepG2细胞中的自噬通量抑制所需的时间，将HepG2细胞与棕榈酸酯一起孵育16小时、20小时或24小时，并使用蛋白质印迹法分析了LC3II和p62的表达水平(针对20小时和24小时的数据未示出)。在16小时处，棕榈酸酯暴露增加了LC3II和p62的水平，这表明自噬通量的抑制和自噬底物的积累。(图21A)。将HepG2细胞与PBSU acNP一起孵育16小时并未导致LC3II和p62的表达水平发生显著变化(数据未示出)。用25％PEFSU acNP进行的处理导致LC3II的水平显著降低，这表明自噬体的清除(图21A-C)。25％PEFSU acNP还显著降低了p62的水平。
图22表明，在长期暴露于棕榈酸酯的HepG2细胞中，10％PEFSU以及25％PEFSU定位并且恢复了组织蛋白酶L活性。为了进一步查明通过增加溶酶体酸度的自噬通量恢复的效果，将细胞用巴弗洛霉素(一种提高了溶酶体pH的V-ATPase抑制剂)处理2小时。处理时LC3II和p62的水平显著增加。这表明由于溶酶体pH降低，acNP增加了自噬。另一方面，用亮抑酶肽(一种溶酶体蛋白酶抑制剂，其与溶酶体融合时可防止自噬体内容物降解)处理的细胞也显示出了增加的LC3II和p62水平。结果表明，通过acNP的自噬恢复取决于溶酶体蛋白酶的活性。溶酶体酶的降解导致酸度增加，这对降低溶酶体pH并因此增加自噬很重要。
由acNP控制的溶酶体酸化可减少脂滴积累。
体内溶酶体酸化的药理学抑制导致脂肪肝和肝细胞内脂滴的积累，这在胰岛素抵抗的发展中起因果作用。
由于自噬消耗脂滴(脂噬)，因此我们假设用acNP活化自噬将通过增加脂噬来减轻肝细胞的脂质负担。为了测量每个细胞的脂滴含量，在有和没有acNP的情况下将HepG2细胞用棕榈酸酯处理，并使用尼罗红(赛默飞世尔科技公司)染色在活细胞中使脂滴可视化。在BSA条件下，HepG2细胞的基础脂滴数为10，而用棕榈酸酯进行的处理将脂滴数显著增加至每个细胞约20-25。HepG2细胞与25％PEFSU的共同处理将脂滴的积累减少到每个细胞15，这表明脂噬的增加和脂质积累的逆转(图23，图片A和B)。
在肥胖的、胰岛素抵抗的人类中，胰岛素减少肝细胞产生葡萄糖的能力降低，并且与肝脂质积累密切相关。47为了评估糖异生能力，在所描述的各种条件下处理肝细胞。接下来，将肝细胞急性暴露于2mM丙酮酸钠和20mM乳酸中，持续16小时。在用10nM胰岛素处理肝细胞后，通过在10小时内监测培养基葡萄糖水平(2NBDG)，测量了胰岛素对糖异生作用的抑制。在用10nM胰岛素处理肝细胞后，通过在3小时内监测培养基葡萄糖水平，测量了胰岛素对糖异生作用的抑制。图23C示出了2-NBDG的摄入，其是一种葡萄糖类似物。胰岛素的添加通过增加葡萄糖(2-NBDG)的摄入而抑制了糖异生作用。棕榈酸酯的添加减少了葡萄糖摄入，而acNP的添加增加了葡萄糖摄入，并因此抑制了糖异生作用。
acNP可降低NAFLD的高脂饮食小鼠模型中的血清甘油三酯水平
已经表明本发明的acNP在体外是有功能的，在NAFLD的小鼠模型中测试了acNP的毒性和功效。将C57BL/6J DIO小鼠(杰克逊实验室(Jackson Laboratory))用高脂饮食(HFD)(D12492：60％大卡能量作为脂肪，研究饮食公司(Research Diets,Inc))喂养16周，作为NAFLD的体内模型。每天或每隔一天(共六天)对HFD小鼠进行单次静脉内注射无菌盐水溶液，所述溶液含有100mg/kg/天的acNP(低剂量)或300mg/kg/天的acNP(高剂量)。在每次处理结束时，处死小鼠，并测试血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT)和胆红素(BIL)的水平以及甘油三酯(TRIG)的水平的变化。血清中的ALT和BIL的血清水平指示肝损害。与HFD对照相比，在第1天(24小时)或第6天添加低剂量或高剂量的acNP并未显著改变血清ALT和BIL水平。然而，在处理的六天后，通过添加低剂量或高剂量的acNP，血清甘油三酯水平显著降低(图24A和B)。
acNP可降低NAFLD的高脂饮食小鼠模型中的脂滴水平
获得了代表性的小鼠肝脏组织切片，并使用H&E三色染色评估了脂滴积累(脂肪变性)的量(图25)。在HFD对照中，肝脏切片显示出增大肝细胞的显著区域和脂滴积累。用低剂量acNP或高剂量的acNP处理6天显示出脂滴积累的显著减少(图25)。
总之，为了调节或控制酸释放的速率和程度，我们通过改变二醇的链长或增加四氟琥珀酸与琥珀酸的比率合成了不同的聚酯。还基于这些新合成的聚合物合成并表征了不同的纳米颗粒。我们已经发现，增加二醇的长度会降低酸释放的速率，而增加四氟琥珀酸比琥珀酸的量则会增加释放的酸的量。简而言之，基于乙二醇的纳米颗粒(PEFSU)显示出最高的酸释放速率和降解速率，而基于丁二醇的纳米颗粒具有最低的酸释放速率和降解速率。用于制备纳米颗粒的参数也与聚合物特性有强关联。评估了基于不同聚酯的纳米颗粒在溶酶体中的细胞毒性和酸恢复程度，以研发针对溶酶体pH功能障碍性疾病的不同治疗方案的体内治疗策略。
材料与方法
acNP聚合物的合成与表征
在圆底烧瓶中以不同的比率加入二酸单体四氟琥珀酸(Matrix科技公司)、琥珀酸(西格玛奥德里奇(Sigma Aldrich))。以过量5mol％或10mol％添加乙二醇(西格玛奥德里奇)以及金属催化剂异丙氧基钛(TIPT)(西格玛奥德里奇)，并在120℃下共沸蒸馏16小时。随后，缓慢施加真空以防止过度发泡、使低聚物的升华最小化，从而去除过量的水，并进一步缩合以形成更高分子量的聚合物链。将温度增加到130-140℃，持续至少12小时。终止反应，并将最终产物在冷乙醚中沉淀，并在高真空下干燥以进一步储存和使用。
聚合物的表征(NMR和GPC)
在Agilent 500MHz VNMRS光谱仪上记录1H、13C、和19F NMR光谱。将CDCl3用作溶剂。确定了不同聚合物的核磁共振(NMR)化学位移：
1H NMR[(500MHz,CDCl3)：PESU 2.66(s,1H),4.29(s,1H)],[25％PEFSU 2.66(s,1H),4.29(s,0.69H),4.37(s,0.25H),4.56(s,0.25H),4.65(s,0.06H)]。13C NMR[(500MHz,CDCl3)：PESU,62.35,76.76],[25％PEFSU 29.66,61.37,62.35,65.37,76.77,107.89,159.06]。19F NMR[(500MHz,CDCl3)：25％PEFSU-119.9,-120.6]。
1H NMR[(500MHz,CDCl3)：PBSU 1.58(s,1H),1.70(s,2H),2.62(s,2H),4.11(s,2H)],[50％PBFSU 1.70(m,2H),1.86(m,2H),2.62(s,2H),4.11(m,2H),4.38(m,2H)],[100％PBFSU 1.86(s,1H),4.39(s,1H)]。13C NMR[(500MHz,CDCl3)：PBSU,25.19,28.99,64.15,77.28],[50％PBFSU 25.17,28.95,64.18,67.52,76.76,107.98,159.29],100％PBFSU 24.48,67.17,76.74,107.97]。19F NMR[(500MHz,CDCl3)：50％PBFSU-124.18,-121.40--119.28],100％PBFSU-120.04。
在配备有沃特世(Waters)410折射率检测器、沃特世515HPLC泵和三个UltraStyragel柱的凝胶渗透色谱(GPC)上在25℃下用THF作为洗脱液以1.0mL/分钟的流速测量平均分子量(Mn)和多分散度(PDI)。将单分散聚苯乙烯标准物用作校准物。
acNP纳米颗粒的合成与表征
使用纳米沉淀由acNP聚合物形成acNP。简而言之，将5-8mg的PESU或25％PEFSU或PBFSU聚合物溶解在0.5–0.6mL的二甲基甲酰胺(DMF)(西格玛奥德里奇)中，并通过0.2μm注射器过滤器(密理博(Millipore))进行过滤，以去除大的聚集物或灰尘。将十二烷基硫酸钠(SDS)(西格玛奥德里奇)的表面活性剂(30-32mg)溶解在2-4mL的纳米孔水(密理博，无内毒素)中，并以1k-1.7k或1k-1.3k rpm的高速进行搅拌。然后将聚合物于DMF中的溶液逐滴加入到快速搅拌的水溶液中。之后，立即将乳液放入SnakeSkin透析管(MWCO 10KDa)中，并用纳米孔水透析6-24小时。为了进行动态光散射(DLS)测量，将200uL溶液稀释在2.8mL的DI水中，并从Brookehaven动态光散射仪器获得大小和ζ电位。所有测量均重复三次(n＝3)。
扫描电子显微镜
将acNP在DI水中稀释100倍。将等分试样电镀在硅晶片上，并将其风干过夜。用铜胶带将晶片固定到铝棒上，并用5nm Au/Pd溅射镀膜。使用Supra 55VP场发射扫描电子显微镜(ZEISS)对这些样品进行成像，加速电压为2kV并且工作距离为5.5cm或6.0cm。凝胶渗透色谱法
在30℃下使用配备有Agilent-DRI折射率检测器和三个柱的SEC(Agilent 1200SEC)测量分子量分布(MWD)，所述三个柱为：一个PL凝胶10μm保护柱和两个PL凝胶混合-D10μm柱(MWPS的线性柱，范围为500到106g/mol)。将四氢呋喃用作溶剂。样品溶液的浓度为约1mg/mL，并且洗脱液的流速为1mL/分钟。将聚苯乙烯标准物用于校准。
差示扫描量热法和热重分析(DSC和TGA)
通过标准的加热-冷却-加热模式，用DSC在Q200热分析仪(美国热分析仪器公司(TA Instruments))上记录热转变。加热速率为10℃/分钟并且冷却速率为5℃/分钟。用TGA(Q500，美国热分析仪器公司)记录热分解行为。在N2气氛下以20℃/分钟将样品从室温加热至600℃。
降解测定
对丁烯基系列聚酯进行了降解测定。首先，制备来自丁烯系列的acNP，并将其悬浮在水或血清中，并在37℃下随时间孵育。在特定时间点，将含有acNP的溶液离心，将沉淀物在N2气氛中干燥过夜，并重新溶解于THF溶剂中，以使用GPC进行分析。
细胞培养和细胞毒性
在补充有10％FBS、1mM谷氨酰胺、50单位/ml青霉素和50g/ml链霉素的DMEM培养基中培养HepG2细胞。在一些研究中，从ATCC获得原代肝细胞，并将其保存在补充有10％FBS、1mM谷氨酰胺、50单位/ml青霉素和50g/ml链霉素的DMEM培养基中。使用MTS细胞增殖测定法(艾博抗公司(Abcam))评估acNP的细胞毒性。将HepG2或原代肝细胞在96孔板中以15000个细胞/孔培养1天，然后将培养基替换为不含有任何处理或含有0、50、250、500或1000μg/mLacNP的培养基。然后将细胞与处理一起孵育24小时，之后在校正背景吸光度之后相对于无处理(对照)对细胞生存力进行定量。每种处理浓度使用三个孔，并将测定重复三次。
棕榈酸酯:BSA的制备
将棕榈酸酯溶解在DMSO(密理博)中。将此溶液在45℃下溶解在含有6.7％的无脂肪酸BSA(EMD，密理博)的MEM培养基中，以制备4mM(10×)储备液。对于对照BSA条件，使用含有5％BSA和1％DMSO的MEM培养基的10×储备液。对于处理条件，将10×储备液以10mM添加到MEM培养基中，所述MEM培养基含有1％FBS、50U/ml青霉素和50g/ml链霉素和葡萄糖。然后将处理介质的pH调节至7.4，然后进行无菌过滤，然后在有和没有acNP的情况下用棕榈酸酯处理HepG2细胞，持续16小时。
流式细胞术
使用620FACScan对若丹明标记的经acNP处理的细胞进行FACS分析。使用FACScalibur(贝克曼库尔特(Beckman Coulter))进行FACS数据分析。用胰蛋白酶消化细胞，将细胞通过离心用PBS洗涤两次，然后进行流式细胞术。通过在前向散点图和侧向散点图上进行门控，排除了细胞碎片。
LysoSensorTM染色和图像分析
对于共定位成像，首先将细胞与Rho-acNP一起孵育24小时，然后根据制造商的方案添加LysoSensorTM蓝色DND-22染料，持续2小时。然后将细胞替换为新鲜培养基，并用共聚焦显微镜成像，以确定若丹明和Lysosensor蓝色信号重叠的量。对于溶酶体pH的确定，将细胞用1μM LysoSensorTM黄色/蓝色染色5分钟，然后使用360nm激发进行共聚焦成像，并在黄色波长范围(510-641nm)和蓝色波长范围(404-456nm)处收集图像。使用的
Figure BDA0002589558380000271
软件计算黄色和蓝色之间的比率。简而言之，通过中值滤波器去除背景噪声，然后通过阈值识别单个溶酶体。获得了鉴定出的溶酶体的平均黄色和蓝色荧光强度，并计算了黄色/蓝色比值。通过在2-(N-吗啉代)乙磺酸缓冲液(具有变化的pH)中对LysoSensorTM荧光进行成像并建立LysoSensorTM荧光比率与pH的标准曲线，实现了对pH变化的定量。在示出ΔpH值的情况下，没有获得单独的标准曲线，但是通过使用先前的标准曲线方程式将LysoSensorTM比率的变化转换成了ΔpH，从而允许计算相对pH变化，但是无法计算绝对pH值。对于所示出的代表性图像，通过将黄色和蓝色LysoSensorTM图像分开，生成了比率图像，并在所有图像上相同地调整对比度以改善可视化。使用伪彩色增加LysoSensorTM比率变化的分辨率。
魔术红组织蛋白酶L活性测定
将细胞用10μg/ml魔术红色组织蛋白酶L(MR-组织蛋白酶L；免疫化学技术公司(Immunochemistry Technologies))染色1小时。将细胞用PBS洗涤三次，并使用Celigo成像细胞细胞仪(布鲁克斯生命科学系统(Brooks Life Science Systems))进行成像。针对每个孔对红色(531/40激发；629/53发射)荧光通道进行成像。优化通过Celigo成像细胞细胞仪获得的图像的分析参数，以基于荧光识别单个细胞。通过每个细胞值的平均积分强度确定每个细胞值的平均荧光强度，以排除经识别的细胞区域中包含的背景像素的误差。每个孔分析至少1,000个细胞，每个实验重复三个到四个孔。
蛋白质印迹
如Trudeau等人所述制备样品。2将样品装载在4-12％的聚丙烯酰胺凝胶(英杰公司(Invitrogen))上，并使用湿(罐)转移机将样品转移到聚偏二氟乙烯膜(英杰公司)上。根据制造商的说明，使用了LC3抗体(细胞信号转导公司(Cell Signaling))、GAPDH抗体(细胞信号转导公司)和p62(细胞信号转导公司)抗体。
肝细胞中的葡萄糖产生
如Herzig等人所述进行葡萄糖产生测定。3简而言之，将细胞培养，并在不同的处理条件下孵育。然后将细胞培养基切换为补充有20mM乳酸钠和2mM丙酮酸钠的无葡萄糖和无酚DMEM(pH 7.4)，持续16小时。在处理结束前3小时添加10nM胰岛素，并且在处理结束前10分钟添加2-NBDG。使用葡萄糖摄入测定试剂盒(开曼化学公司(Cayman Chemicals))测量葡萄糖含量。
统计
使用预定的统计方法确定研究结果的重要性。将细胞毒性、溶酶体的pH和大小、自噬通量、蛋白质表达水平、脂质计数/细胞等表示为平均值±S.D。使用Origin Lab Pro 8.5软件进行统计分析；两侧P值<0.05被认为是统计学上显著的。
应当理解，本文描述的实例和实施例仅用于说明目的，并且鉴于所述实例和实施例的各种修改或改变对于本领域技术人员而言将是显而易见的，并且将被包含在本申请的精神和范围内以及所附权利要求的范围内。因此，本发明的范围不仅应当参考以上描述来确定，而且还应当参考所附权利要求以及此类权利要求所授权的等同物的全部范围来确定。本文引用的所有出版物、专利和专利申请均出于所有目的通过引用整体并入本文。

Claims (49)

1.一种酸释放型氟化聚酯纳米颗粒，所述纳米颗粒包括：
聚酯和四氟琥珀酸(TFSA)，其中当暴露于pH约为pH 6.0的环境中时，所述纳米颗粒释放酸。
2.根据权利要求1所述的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒在约pH 7.0的pH下基本上不释放酸。
3.根据权利要求1到2中任一项所述的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒进一步包括琥珀酸(SA)。
4.根据权利要求3所述的纳米颗粒，其中TFSA与SA的比率在100:0(TFSA:SA)到10:90(TFSA:SA)的范围内。
5.根据权利要求1到4中任一项所述的纳米颗粒，其中TFSA与SA的所述比率包括选自由以下组成的组的比率：约10:90、约15:85、约20:80、约25:75、约30:70、约35:65、约40:60、约45:55、约50:50、约55:45、约60:40、约65:35、约70:30、约75:25、约80:20、约15:15、约90:10、约95:5和约100:0。
6.根据权利要求1到5中任一项所述的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒包括聚酯，所述聚酯包括选自由以下组成的组的二醇：乙二醇、丙二醇、丁二醇。
7.根据权利要求6所述的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒包括包含乙二醇的聚酯。
8.根据权利要求6所述的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒包括包含丙二醇的聚酯。
9.根据权利要求6所述的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒包括包含丁二醇的聚酯。
10.根据权利要求1到9中任一项所述的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒包括选自由以下组成的组的材料：10％PEFSU；15％PEFSU、20％PEFSU、25％PEFSU、30％PEFSU、35％PEFSU、40％PEFSU、45％PEFSU；50％PEFSU；55％PEFSU、60％PEFSU、65％PEFSU、70％PEFSU、75％PEFSU、80％PEFSU、85％PEFSU、90％PEFSU、95％PEFSU、100％PEFSU、10％PPFSU；15％PPFSU、20％PPFSU、25％PPFSU、30％PPFSU、35％PPFSU、40％PPFSU、45％PPFSU；50％PPFSU；55％PPFSU、60％PPFSU、65％PPFSU、70％PPFSU、75％PPFSU、80％PPFSU、85％PPFSU、90％PPFSU、95％PPFSU、100％PPFSU、10％PBFSU；15％PBFSU、20％PBFSU、25％PBFSU、30％PBFSU、35％PBFSU、40％PBFSU、45％PBFSU；50％PBFSU；55％PBFSU、60％PBFSU、65％PBFSU、70％PBFSU、75％PBFSU、80％PBFSU、85％PBFSU、90％PBFSU、95％PBFSU和100％PBFSU。
11.根据权利要求10所述的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒包括选自由以下组成的组的材料：10％PEFSU、15％PEFSU、20％PEFSU、25％PEFSU。
12.根据权利要求10所述的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒包括选自由以下组成的组的材料：25％PPFSU、50％PPFSU、75％PPFSU、100％PPFSU。
13.根据权利要求10所述的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒包括选自由以下组成的组的材料：30％PBFSU、50％PBFSU、75％PBFSU、100％PBFSU。
14.根据权利要求1到13中任一项所述的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒的平均直径在约25nm或约50nm到高达约200nm或高达约150nm的范围内。
15.根据权利要求1到14中任一项所述的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒的平均直径小于约100nm。
16.根据权利要求1到15中任一项所述的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒的群体具有约0.2或以下，或约0.14或以下的PDI。
17.根据权利要求1到16中任一项所述的纳米颗粒，其中当所述纳米颗粒与细胞接触时，所述纳米颗粒所具有的大小和ζ电位导致通过内吞途径摄入到溶酶体中。
18.根据权利要求1到17中任一项所述的纳米颗粒，其中当所述纳米颗粒或多个所述纳米颗粒被细胞摄入时，所述纳米颗粒或多个所述纳米颗粒可在损害溶酶体酸化的条件下有效地恢复所述细胞中的自噬通量。
19.根据权利要求1到18中任一项所述的纳米颗粒，其中当所述纳米颗粒或多个所述纳米颗粒被细胞摄入时，所述纳米颗粒或多个所述纳米颗粒可有效地增强所述细胞中的溶酶体-自噬体融合能力。
20.根据权利要求1到19中任一项所述的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒或多个所述纳米颗粒可有效地诱导暴露于脂肪酸的肝细胞或暴露于脂肪酸的B细胞中的溶酶体功能的短期和/或长期恢复。
21.根据权利要求20所述的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒或所述一个或多个纳米颗粒的群体可有效地使肝细胞脂质含量正常化。
22.根据权利要求20所述的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒或所述一个或多个纳米颗粒的群体可有效地增强B细胞响应于葡萄糖而分泌胰岛素的能力。
23.一种药物调配物，所述调配物包括：
多个根据权利要求1到22中任一项所述的纳米颗粒；以及
药学上可接受的载剂。
24.根据权利要求23所述的药物调配物，其中所述药物调配物包括单位剂量调配物。
25.根据权利要求23到24中任一项所述的药物调配物，其中所述调配物基本上是无菌的。
26.根据权利要求23到25中任一项所述的药物调配物，其中所述药物调配物被调配成用于通过选自由以下组成的组的途径进行施用：口服递送、等容递送、透皮递送、亲本递送、气雾剂施用、通过吸入施用、静脉内施用和直肠施用。
27.一种促进哺乳动物细胞中的自噬的方法，所述方法包括使所述细胞与多个根据权利要求1到22中任一项所述的纳米颗粒接触。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述方法包括向所述哺乳动物施用有效量的根据权利要求1到22中任一项所述的纳米颗粒和/或根据权利要求23到26中任一项所述的药物调配物。
29.一种治疗对溶酶体功能的恢复反应良好的哺乳动物中的病状的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用有效量的根据权利要求1到22中任一项所述的纳米颗粒和/或根据权利要求23到26中任一项所述的药物调配物。
30.根据权利要求27到29中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物是患有与受损的溶酶体酸度相关联的疾病状态的哺乳动物。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述疾病状态包括选自由以下组成的组的疾病：肥胖症、代谢综合症、2型糖尿病(T2D)、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)和神经变性。
32.根据权利要求30所述的方法，其中所述疾病状态包括肥胖症。
33.根据权利要求30所述的方法，其中所述疾病状态包括代谢综合症。
34.根据权利要求30所述的方法，其中所述疾病状态包括2型糖尿病。
35.根据权利要求30所述的方法，其中所述疾病状态包括NAFLD。
36.根据权利要求30所述的方法，其中所述疾病状态包括神经退行性病变。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述疾病状态包括选自由以下组成的组的神经退行性病变：与年龄有关的痴呆、帕金森氏病和阿尔茨海默氏病。
38.根据权利要求27到37中任一项所述的方法，其中所述方法可以在损害溶酶体酸化的条件下有效地恢复自噬通量。
39.根据权利要求27到38中任一项所述的方法，其中所述方法可有效地增强溶酶体-自噬体融合能力。
40.根据权利要求27到39中任一项所述的方法，其中所述方法可有效地增强溶酶体水解酶活性。
41.根据权利要求27到40中任一项所述的方法，其中所述方法可有效地产生溶酶体功能的短期或长期恢复。
42.根据权利要求27到41中任一项所述的方法，其中所述方法可有效地产生暴露于脂肪酸的肝细胞中的溶酶体功能的短期或长期恢复。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述方法可有效地使所述肝细胞中的脂质含量正常化。
44.根据权利要求27到43中任一项所述的方法，其中所述方法可有效地产生暴露于脂肪酸的B细胞中的溶酶体功能的短期或长期恢复。
45.根据权利要求44所述的方法，其中所述方法可有效地增强B细胞响应于葡萄糖而分泌胰岛素的能力。
46.根据权利要求27到45中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物是人类。
47.根据权利要求27到45中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物是非人类哺乳动物。
48.一种用于治疗需要肝移植的哺乳动物的方法，所述方法包括向所述待移植的肝脏灌注有效量的根据权利要求1到22中任一项所述的纳米颗粒。
49.一种用于治疗需要肝移植的哺乳动物的方法，所述方法包括使所述待移植的肝脏脱脂有效量的根据权利要求1到22中任一项所述的纳米颗粒。
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