KR102697202B1 - 자가포식의 회복을 위한 산성 나노입자 - Google Patents

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Abstract

다양한 구현예에서, 리소좀 산도와 자가포식을 조작하기 위한 표적화된 전략으로서 사용되는, 신규한 생분해성 산-활성화 산 방출성 나노입자 (acNP)가 제공된다. 특정 구현예에서, 플루오르화 폴리에스테르 기반의 이러한 acNP는 pH 6.0 (기능장애 리소좀에서 보고된 pH)에서 분해되고, 리소좀 pH를 추가로 저하시키는 구성요소인 산을 방출하여, LT 하에서 간세포의 세포 기능과 자가포식 흐름을 증가시킨다. acNP는 간 질환을 회복시키는 치료제로서 작용할 수 있다.

Description

자가포식의 회복을 위한 산성 나노입자
관련 출원의 교차 참조
본 출원은 2019년 1월 21일자 출원된 미국 특허 출원 제16/252,927호와 2018년 1월 19일자 출원된 미국 가출원 제62/619,565호를 우선권 주장하며, 상기 문헌들의 전체 내용은 그 전문이 본원에 참조로서 인용된다.
자가포식(autophagy)은, 세포가 장생(long-lived) 단백질과 세포 소기관을 분해하는, 필수적이고 진화적으로 보존되는 유지 메카니즘이다. 이러한 하우스키핑(housekeeping) 과정은 노화에 따라 축적되는 손상된 물질을 제거하기 위해 자가포식에 의존하는 비(非)증식성 세포에서 특히 중요하다. 리소좀과 자가포식소체(autophagosome)의 융합은 또한 산성 리소좀을 필요로 한다. 따라서, 리소좀 산도는 리소좀 기능과 자가포식 흐름(autophagic flux) 유지에 필수적인 중요한 국소 신호이다. 하지만, 현재 시험관내 및 생체내 모두에서 리소좀 산도를 조작할 수 있는 도구는 존재하지 않는다. 현재의 약리학적 및 분자적 도구는 리소좀 산도를 감소시킬 수 있지만; 리소좀을 증가시키기 위해 이용 가능한 도구는 존재하지 않는 것으로 여겨진다. 비제한적으로, 제2형 당뇨병, 비(非)알코올성 지방간 질환 (NAFLD) 및 신경퇴행을 포함하는 다수의 질환 상태가 손상된 리소좀 산도와 관련이 있다.
비알코올성 지방간 질환 (NAFLD)은 일반 대중의 20 내지 30%에게 영향을 미치고 있는, 오늘날 세계에서 가장 흔한 간 질환 중 하나이다. 다양한 유전적 및 후생적 요인이 NAFLD의 발병에 기여한다. 인슐린 내성은 지방질 조직에서 지방분해의 억제를 손상시킴으로써, 무혈청 지방산 (FFA)의 수준을 증가시킨다. FFA는 통상적으로 간에 의해 흡수되고 중성 트리글리세리드로 에스테르화되지만; 과량의 포화된 FFA는 FFA를 에스테르화시키는 간의 능력을 압도하여 지질독성 (LT)을 유도한다. LT 하의 간세포에서, 손상된 리소좀 산도에 수반되는 자가포식의 붕괴가 보고되었다. 이러한 붕괴는 손상된 세포 소기관과 단백질을 세포에 축적시키고, 세포 기능과 생존능의 저하를 악화시킴으로써, 간세포 사멸을 촉진시키고 진행성 질환으로 이어진다. 치료되지 않은 NAFLD는 간경변으로 진행될 수 있는 비알코올성 지방간염 (NASH)이 되며, 이는 간 기능을 심각하게 손상시킬 수 있다. 적은 비율이 간암종으로 악화되며, 이를 위한 유일한 치료 옵션은 성공 가능성이 낮은 것으로 보고된 간 이식이다.
따라서, 지금까지 NAFLD의 치료를 위해 승인된 특정한 약리학적 제제는 존재하지 않는다. 인슐린 감작제를 처방하는 것에 맞춰진 NAFLD에 대한 현재의 치료 옵션에는, 티아졸리딘디온 (Thiazolidinedione, TZD), 메트포르민(Metformin), 및 GLP-1 수용체 작용제와 같은 주사제가 포함된다. 이러한 것들은 부작용을 유발하며, 장기 치료를 필요로 할 수 있다 (문헌[Liu et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (2016) 113: 2288-2293]). mTOR 경로 저해제 라파마이신(Rapamycin)과 같은 자가포식 경로를 표적으로 하는 또 다른 그룹의 약리학적 제제가 자가포식과 관련된 대사 질환을 치료하는데 사용되어 왔지만, 이러한 작용제는 자가포식 유도와는 별도로 중요한 대사 신호전달 경로에 대한 비(非)특이적 변화를 포함할 수 있다. 이러한 이유로, 이는 장기 사용을 위해 바람직하지 않을 수 있다. 마지막으로, GFT-505 (PPAR 작용제)와 OCALIVA® (Intercept Pharmaceuticals)를 포함하는 전임상 화합물은 여전히 이의 효율성을 완전히 특성화하기 위한 임상 시험 중에 있다.
비알코올성 지방간 질환 (NAFLD)은 오늘날 세계에서 가장 흔한 간 질환이다. 최근, 지질독성 (LT)으로 지칭되는 간 유리 지방산 (FFA) 수준의 증가가, 리소좀 산도를 감소시킴 (즉, 리소좀에서 pH가 증가됨)과 동시에 자가포식 흐름을 저해하여, NAFLD의 발병에 기여하는 것으로 확인되었다. 해결하고자 하는 과제는 리소좀 산도와 자가포식 흐름을 회복시키는 생체에 적합한 방법을 제공하는 것이다. 따라서, 본 발명에서, 본 발명자들은 리소좀 산도와 자가포식을 조작하기 위한 표적화된 전략으로서, 신규한 생분해성 산-활성화 산 방출성 나노입자 (acNP)를 합성하였다. 이러한 acNP는 pH 6.0 (기능장애 리소좀에서 보고된 pH)에서 분해되는 플루오르화 폴리에스테르를 기반으로 한다. 나노입자로부터 산 구성요소의 방출은 리소좀 pH를 추가로 저하시킴으로써, LT 하에서 간세포의 세포 기능과 자가포식 흐름을 증가시킨다. 따라서, 본 발명의 acNP는 NAFLD를 치료하기 위한 치료제로서 유용하다. 나아가, 본 발명의 acNP는 또한 손상된 리소좀 산도와 관련된 질환의 치료 또는 예방에 유용하다. 이러한 질환에는, 비제한적으로, 비만, 대사 증후군, 제2형 당뇨병 (T2D), 비알코올성 지방간 질환 (NAFLD), 간 이식, 신경퇴행 (예를 들어, 노인성 치매, 알츠하이머병, 파킨슨병 등)이 포함된다.
본 발명의 하나의 양태에서, 산 방출성 플루오르화 폴리에스테르 나노입자가 제공된다. 상기 나노입자는 폴리에스테르와 테트라플루오로숙신산 (TFSA)을 포함하며, pH가 약 pH 6.0인 환경에 노출될 때 산을 방출한다. 플루오르화 폴리에스테르가 낮은 독성과 시험관내 및 생체내 생체적합성을 나타내기 때문에, 플루오르화 폴리에스테르 나노입자는 최소 독성으로 세포에 의해 용이하게 흡수될 수 있고, 따라서 이는 의료 적용에 유용하다.
하나의 구현예에서, 상기 나노입자는 숙신산 (SA)을 추가로 포함한다. TFSA 대 SA의 비는 100:0 (TFSA:SA) 내지 10:90 (TFSA:SA) 범위이다. 예를 들어, TFSA 대 SA의 비는 약 10:90, 약 15:85, 약 20:80, 약 25:75, 약 30:70, 약 35:65, 약 40:60, 약 45:55, 약 50:50, 약 55:45, 약 60:40, 약 65:35, 약 70:30, 약 75:25, 약 80:20, 약 15:15, 약 90:10, 약 95:5 및 약 100:0으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 비를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 상기 나노입자는 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 부틸렌 글리콜로 이루어지는 군으로부터 선택되는 디올을 포함하는 폴리에스테르를 포함한다. 예를 들어, 산 방출성 플루오르화 폴리에스테르 나노입자는 폴리에스테르, 에틸렌 글리콜 및 TFSA (PEFSU); 폴리에스테르, 프로필렌 글리콜 및 TFSA (PPFSU); 또는 폴리에스테르, 부틸렌 글리콜 및 TFSA (PBFSU)를 포함할 수 있다.
본 발명의 나노입자는 10% PEFSU, 15% PEFSU, 20% PEFSU, 25% PEFSU, 30% PEFSU, 35% PEFSU, 40% PEFSU, 45% PEFSU, 50% PEFSU, 55% PEFSU, 60% PEFSU, 65% PEFSU, 70% PEFSU, 75% PEFSU, 80% PEFSU, 85% PEFSU, 90% PEFSU, 95% PEFSU, 100% PEFSU, 10% PPFSU, 15% PPFSU, 20% PPFSU, 25% PPFSU, 30% PPFSU, 35% PPFSU, 40% PPFSU, 45% PPFSU, 50% PPFSU, 55% PPFSU, 60% PPFSU, 65% PPFSU, 70% PPFSU, 75% PPFSU, 80% PPFSU, 85% PPFSU, 90% PPFSU, 95% PPFSU, 100% PPFSU, 10% PBFSU, 15% PBFSU, 20% PBFSU, 25% PBFSU, 30% PBFSU, 35% PBFSU, 40% PBFSU, 45% PBFSU, 50% PBFSU, 55% PBFSU, 60% PBFSU, 65% PBFSU, 70% PBFSU, 75% PBFSU, 80% PBFSU, 85% PBFSU, 90% PBFSU, 95% PBFSU 및 100% PBFSU로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것으로 고려된다.
하나의 구현예에서, 상기 나노입자는 10% PEFSU, 15% PEFSU, 20% PEFSU, 25% PEFSU로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
추가의 구현예에서, 상기 나노입자는 25% PPFSU, 50% PPFSU, 75% PPFSU, 100% PPFSU로 이루어지는 군으로부터 선택된다, 12. 또 다른 구현예에서, 상기 나노입자는 30% PBFSU, 50% PBFSU, 75% PBFSU, 100% PBFSU로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
또 다른 구현예에서, 상기 나노입자의 평균 직경은 약 25nm 또는 약 50 nm 내지 약 200 nm 또는 약 150 nm 또는 약 100 nm 범위이다.
또 다른 구현예에서, 상기 나노입자의 바람직한 평균 직경은 약 100 nm 미만이다.
또 다른 구현예에서, 상기 나노입자의 집단의 다분산 지수 (PDI)는 약 0.2 이하 또는 약 0.14 이하이다.
또 다른 구현예에서, 상기 나노입자는, 세포와 접촉될 때, 리소좀에 의해 흡수되는 크기와 제타 전위를 갖는다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 상기 나노입자는, 리소좀 산성화가 손상된 세포에 의해 흡수될 때, 상기 세포의 자가포식 흐름을 회복시키고/시키거나 상기 세포의 리소좀-자가포식소체 융합 능력을 증강시키는데 유용하다.
하나의 구현예에서, 상기 나노입자는 지방산에 노출된 간세포 또는 지방산에 노출된 B 세포에서 리소좀 기능의 단기 및/또는 장기 회복을 유도하는데 효과적이다.
또 다른 구현예에서, 상기 나노입자는 간세포 지질 함량을 정상화시키는데 효과적이다.
추가의 구현예에서, 상기 나노입자는 포도당에 반응하여 인슐린을 분비하는 B 세포의 능력을 증강시키는데 효과적이다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 약학적 제제가 제공된다. 상기 제제는 복수의 상기 기재된 나노입자와 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다. 약학적 제제는 실질적으로 멸균된 단위 투여량 제제를 포함한다.
일 구현예에서, 약학적 제제는 경구 전달, 이소포레틱(isophoretic) 전달, 경피 전달, 비경구 전달, 에어로졸 투여, 흡입을 통한 투여, 정맥내 투여 및 직장 투여로 이루어지는 군으로부터 선택되는 경로를 통한 투여를 위해 설계된다.
본 발명의 또 다른 양태는, 포유류 세포를 복수의 상기 기재된 나노입자와 접촉시킴으로써, 포유류 세포에서 자가포식을 촉진시키는 방법을 제공한다. 상기 방법은 유효량의 상기 나노입자 및/또는 약학적 제제를 포유류에게 투여하는 것을 포함한다.
하나의 구현예에서, 상기 방법은 유효량의 본 발명의 나노입자를 약학적 제제로 포유류에게 투여함으로써, 리소좀 기능의 회복에 유리하게 반응하는 포유류에서 병리를 치료한다.
또 다른 구현예에서, 상기 방법은 손상된 리소좀 산도와 관련된 질환 상태를 갖는 포유류에 치료를 제공한다. 상기 질환 상태는 비만, 대사 증후군, 제2형 당뇨병 (T2D), 비알코올성 지방간 질환 (NAFLD) 및 신경퇴행성 병리로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
추가의 구현예에서, 신경퇴행성 병리를 포함 상기 질환 상태는 노인성 치매, 파킨슨병 및 알츠하이머병으로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
하나의 구현예에서, 상기 방법은 리소좀 산성화를 손상시키는 조건 하에서 자가포식 흐름을 회복시키는데 효과적이다.
또 다른 구현예에서, 상기 방법은 리소좀-자가포식소체 융합 능력을 증강시키는데 효과적이다.
또 다른 구현예에서, 상기 방법은 리소좀 가수분해효소 활성을 증강시키는데 효과적이다.
또 다른 구현예에서, 상기 방법은 리소좀 기능의 단기 또는 장기 회복을 이끌어내는데 효과적이다. 예를 들어, 상기 방법은 지방산에 노출된 간세포에서 리소좀 기능의 단기 또는 장기 회복을 이끌어내고, 간세포에서 지질 함량을 정상화시키는데 효과적이다.
또 다른 추가의 구현예에서, 상기 방법은 지방산에 노출된 B 세포에서 리소좀 기능의 단기 또는 장기 회복을 이끌어내고, 포도당에 반응하여 인슐린을 분비하는 B 세포의 능력을 증강시키는데 효과적이다.
또 다른 구현예에서, 상기 방법은 유효량의 acNP를 투여함으로써 인간인 포유류 또는 비인간 포유류에 치료를 제공한다. acNP는 정맥내 또는 당업계에 공지된 다른 방식으로 투여될 수 있다.
상기 특정 구현예에서, TFSA는, 본 발명의 나노입자를 위하여, 다른 산, 특히 pKa가 약 2 미만, 또는 pKa가 약 1.6 이하인 다른 산으로 대체될 수 있다고 이해될 것이다.
도 1은, 비만, 제2형 당뇨병 및 비알코올성 지방간 질환 (NAFLD)의 치료를 위한 본 발명의 acNP의 사용을 예시한다. 비만, 제2형 당뇨병 및 NAFLD는 자가포식 흐름의 정지와 자가포식소체의 축적을 유도하는 손상된 리소좀 산성화와 관련이 있다. 본원에 기재된 acNP는 리소좀을 표적으로 한다. 손상된 세포에서, 리소좀 pH는 부분적으로 산성화되기 때문에, 자가포식소체와 융합하지 않는다. 자가포식 흐름은 저해되고, 지질을 캡슐화하는 자가포식소체는 세포에 축적되어, 지질의 청소(clearance)를 감소시킨다. 리소좀에의 진입 후, acNP는 산을 방출하여 리소좀의 산도를 회복시킴으로써, 자가포식소체와의 융합, 리소좀 가수분해효소 활성 및 자가포식 흐름을 회복시킬 것이다.
도 2a: PBFSU의 합성에 대한 개략도, 도 2b: PBFSU 중합체의 화학적 및 물리적 특성의 요약. 도 2c 내지 2e: PBFSU 중합체의 NMR 스펙트럼:1H (도 2c), 13C (도 2d) 및 19F (도 2e).
도 3a 및 3b: 시차 주사 열량분석 (DSC)에 의한 PBFSU 폴리에스테르의 열적 거동: 10℃/분의 속도로의 가열 곡선 (도 3a) 및 5℃/분의 속도로의 냉각 곡선 (도 3b). 도 3c: PBFSU 폴리에스테르에 대한 열중량 분석 (TGA) 곡선. 대조군 중합체는 PBSU였다.
도 4는, PBFSU acNP의 SEM 이미지를 보여준다.
도 5는, acNP 형성에 대한 용매의 영향을 보여준다.
도 6은, acNP 형성에 대한 투석 온도의 영향을 보여준다.
도 7은, acNP 형성에 대한 투석 시간의 영향을 보여준다.
도 8a는, 상이한 PBFSU acNP가 20 mM PBS (pH 6)에서 인큐베이션될 때, 시간의 경과에 따른 pH 변화의 영향을 보여준다. 도 8b는, PBFSU acNP가 37oC의 물에서 인큐베이션될 때, PBFSU acNP의 분해와 분자량 변화를 보여준다.
도 9: acNP의 세포독성 검정. PBFSU acNP는 1000 μg/mL에서 조차도 유의한 세포 사멸을 유도하지 않는다.
도 10a는, BSA (대조군), 팔미테이트, 또는 팔미테이트 + PBFSU acNP로 처리된 HepG2 세포의 공초점 이미지를 보여준다. 도 10b는, MetaMorph® 분석 소프트웨어를 사용하여 측정된 리소좀 pH와 크기의 정량화를 보여준다 (도 10b) (n=3, *p< 0.05).
도 11은, acNP, PESU 및 PEFSU의 합성을 예시한다.
도 12a 내지 12c는, NMR 스펙트럼을 사용한 PESU 및 25% PEFSU의 특징분석을 보여준다. 도 12a: 1H NMR, 도 12b: 13C NMR 및 도 12c: 19F NMR 스펙트럼.
도 13a와 13b는, acNP의 크기와 시험관내 기능의 특징분석을 예시한다. 도 13a) 다양한 acNP의 전자 주사 전자 현미경사진 (축척 막대 = 200 nm). 도 13b) pH 6.0 및 pH 7.4 완충액에서 상이한 중합체 조성을 갖는 acNP의 시간의 경과에 따른 pH 변화. 25% PEFSU가 pH 7.4 완충액에 첨가되는 경우, pH 6.0 완충액과 비교하여 pH는 유의하게 변하지 않았으며, pH 6.0에서만 산성화의 활성을 나타냈다는 점에 유의한다.
도 14a 및 14b: 도 14a: acNP의 제타 전위와 직경 (SEM 도면 상에 표지된 제타 전위와 크기)을 결정하기 위해 동적 광 산란을 사용한 acNP, PESU 및 25% PEFSU의 특징분석. 도 14b: 20 mM pH 6.0 (좌측 패널) 및 pH 7.4 (우측 패널) PBS 완충액에서의 48시간의 기간에 걸친 acNP의 pH 변화.
도 15a와 15b는, PESU, 25% PEFSU acNP 및 PLGA NP의 pH 변화를 보여준다. 나노입자를 20mM pH 6.0 완충액 (도 15a)과 20mM pH 7.4 완충액 (도 15b)에서 인큐베이션하였다. 25% PEFSU acNP는 PLGA NP와 비교하여 리소좀 pH의 더 큰 감소 (더 낮은 pH)를 나타낸다.
도 16a와 16b는, 리소좀에서 acNP의 세포 흡수와 국소화를 예시한다. 도 16a는, 로다민-표지된 acNP (적색)으로 처리하고, 리소좀 염료인 LysoTracker™로 염색한 HepG2 세포의 초해상 이미지를 보여준다. 도 16b는, 세포로의 acNP 흡수와 acNP의 표적 경로를 식별하는데 유용한 저해제의 목록이다.
도 17a 내지 17c: 세포 생존율, 및 세포와 리소좀으로의 흡수에 대한 acNP의 영향. 도 17a: PESU 또는 25%PEFSU와 함께 인큐베이션한 세포의 생존율에 대한 다양한 acNP 농도의 영향. 세포를 다양한 acNP 농도로 24시간 동안 인큐베이션하였다. 1000 μg/ml 이하의 acNP 농도는 유의한 세포 사멸을 유도하지 않았다. 이러한 연구를 기반으로, 100 μg/ml의 치료 용량을 추가 연구를 위해 선택하였다. 도 17b: 유세포 분석법에 의한, HepG2 세포에서 로다민-표지된 acNP (Rho-acNP) 흡수의 정량화. Rho-acNP 흡수는 4시간 내에 일어났으며, 24시간의 인큐베이션 후 완전히 흡수되었다. (데이터 = 평균 ± 표준편차, n=3, *=p < 0.05). 도 17c) HepG2 세포에서의 Rho-acNP의 흡수 (우측 패널), LysoSensor™로 염색된 리소좀 구획에서의 공동 국소화 (좌측 패널), 및 청색 채널 (중간 패널)을 나타내는 공초점 현미경 이미지. 막대, 10 μm.
도 18a 내지 18c는, acNP가 리소좀 산도를 개선시키고, 지질독성 하에서 세포 사멸을 구제함을 보여준다. 도 18a) acNP의 존재 유무 하에서 복합체화된 팔미테이트:BSA (4:1 비)로 만성적으로 처리된 INS1 세포의 LysoSensor™ 이미지. 도 18b) 팔미테이트:BSA + acNP에 의해 야기된 pH 변화의 정량화. 도 18c) acNP는 세포 사멸을 방지한다. 팔미테이트:BSA로의 처리는 BSA 대조군과 비교하여 7배 더 많은 세포 사멸을 유도하였다. 25% PEFSU acNP의 첨가는 BSA 대조군과 비교하여 세포 사멸을 유의하게 감소시켰다. (데이터 = 평균 ± 표준편차, n=3, *=P<0.05)
도 19a 내지 19d는, acNP의 존재 또는 부재 하에서 BSA (대조군) 또는 팔미테이트로 처리된 세포에서 리소좀 산도와 카텝신 L의 변화에 대한 acNP의 영향을 보여준다. 도 19a: 25% PEFSU acNP의 부재 (대조군) 또는 존재 하에서 BSA (대조군) 또는 팔미테이트와 함께 인큐베이션한 세포에 대한 실험 프로토콜의 개략도, 리소좀 산도, 자가포식 또는 세포 기능에 대한 검정이 이어짐. 도 19b: BSA (상단 좌측 패널), 팔미테이트 (상단 우측 패널), 팔미테이트 + 25% PEFSU (하단 우측 패널), 및 리소좀 산성화 저해제인 바필로마이신 (Bafilomycin, Baf) (하단 좌측 패널)과 함께 인큐베이션한 HepG2 세포의 공초점 현미경 이미지. 리소좀 산도를 평가하기 위해 세포를 pH-민감성 LysoSensor™ 염료로 염색하였다. 리소좀의 LysoSensor™ 염색의 특이성을 입증하기 위해 100 μM Baf를 사용하였다. 막대, 10 μm. 도 19c: 세포를 BSA (대조군), 팔미테이트 (대조군) 및 팔미테이트 + 25% PEFSU로 처리한 후, 세포 당 평균 리소좀 pH (□) 및 리소좀 영역 (◇). 결과는, 팔미테이트 단독으로 처리된 세포와 비교하여 팔미테이트 + 25% PEFSU로 처리된 세포에서 리소좀 pH의 유의한 회복을 나타냈다 (pH 값 크기 값에 대한 실험 n = 3, 실험 당 20 내지 30개의 세포를 분석함). 도 19d: BSA (대조군), 팔미테이트 (대조군), 및 팔미테이트 + 25% PEFSU로 처리된 HepG2 세포에서 매직 레드(Magic red) 카텝신 L 형광 기질 검정에 의한 리소좀 카텝신 L 활성의 평가. 결과는, 25% PEFSU acNP로 처리한 경우 리소좀 효소 활성의 유의한 회복을 나타냈다 (데이터 = 평균 ± 표준편차, n=3, *=p < 0.05).
도 20은, 팔미테이트 대조군과 비교하여, HepG2 세포에서 25% PEFSU acNP와 PLGA NP의 리소좀 pH 변화를 보여준다. 100 ug/mL의 acNP는 1 mg/mL의PLGA NP 보다 더 큰 리소좀 pH 변화를 생성할 수 있었으며, 이는 훨씬 더 강한 산성화 효과를 나타낸다.
도 21a 내지 21c는, BSA (대조군), 팔미테이트 (대조군) 및 팔미테이트 25% PEFSU로 처리된 HepG2 세포에서 자가포식 흐름에 대한 acNP의 기능적 영향을 예시한다. 도 21a 내지 21c: LC3-II, GAPDH 및 p62의 단백질 수준은 웨스턴 블롯 농도측정 분석으로 결정하였다. 팔미테이트로의 처리는 LC3II와 p62의 축적을 유도한 반면, 25% PEFSU acNP로 처리 시에는 축적된 자가포식소체, LC3-II 및 p62 단백질의 청소를 관찰하였다. (데이터 = 평균 ± 표준편차, n=3, *=p < 0.05).
도 22a와 22b는, acNP에 의해 유도된 카텝신 L 활성과 자가포식 흐름의 기능적 변화를 예시한다. 도 22a: 팔미테이트와 함께 만성적으로 인큐베이션한 HepG2 세포는 acNP에 의해 구제되는 카텝신 L 활성을 감소시킨다. 도 22b: 팔미테이트와 함께 만성적으로 인큐베이션한 HepG2 세포는acNP에 의해 부분적으로 역전된 p62와 LC3II의 축적을 증가시킨다. (데이터 = 평균 ± 표준편차, n=3, *=p<0.05)
도 23a 내지 23c는, BSA, 팔미테이트 및 25%PEFSU acNP로의 처리 후, HepG2 세포에서 지질 액적 축적에 대한 acNP의 영향을 보여준다. 도 23a: 15분 동안 나일 레드(Nile Red) 염료로 염색한 HepG2 세포는 지질 소포에서 축적을 나타냈다. 형광 현미경법은 팔미테이트에 노출된 HepG2 세포에서 25% PEFSU acNP 처리 후 지질 액적 밀도의 유의한 감소를 나타냈다 (n=조건 당 30 내지 50개의 세포). 도 23b: BSA, 팔미테이트 또는 팔미테이트 + 25% PEFSU로 처리된 HepG2 세포에서 지질 액적의 정량화. 도 23c: 100nM 인슐린으로 자극된 HepG2 세포의 포도당신합성(gluconeogenesis).
도 24a와 24b는, 16주간 고지방 식이를 섭취한 마우스에 대하여, 각각, 24시간 및 6일의 acNP 처리 (저용량 및 고용량) 후 알라닌 트랜스아미나아제 (ALT), 빌리루빈 (bilirubin, BIL) 및 트리글리세리드 (TRIG)의 혈청 수준을 보여준다. 6일의 acNP 처리는 혈청에서 트리글리세리드 수준을 유의하게 감소시켰다.
도 25: 24시간 또는 6일 동안 저용량 및 고용량의 acNP로 처리된, 16주간 고지방 식이 마우스 간 절편의 H & E 염색. 지방증, 섬유증 및 염증의 정도를 H & E 염색으로부터 특징분석하였다. HFD 대조군 마우스에서, 간 절편은 주목할 만한 확대된 간세포 영역과 지질 액적 축적을 나타낸 반면, 6일 동안 저용량 또는 고용량 acNP 하의 마우스는 지질 액적 축적의 유의한 감소를 나타낸다.
자가포식은, 세포가 장생 단백질과 세포 소기관을 분해하는, 필수적이고 진화적으로 보존되는 유지 메카니즘이다. 이러한 하우스키핑 과정은 노화에 따라 축적되는 손상된 물질을 제거하기 위해 자가포식에 의존하는 비증식성 세포에서 특히 중요하다. 자가포식의 핵심 단계는 자가포식소체 동원과 세포 내용물의 삼킴, 이어서 산성 리소좀과의 자가포식소체 융합이다. 리소좀 내 가수분해효소는 삼킨 물질을 적절하게 분해시키기에 충분히 낮은pH에 의존한다. 리소좀과 자가포식소체의 융합은 또한 산성 리소좀을 필요로 한다. 따라서, 리소좀 산도는 리소좀 기능과 자가포식 흐름 유지에 필수적인 중요한 국소 신호이다.
본원에 기재된 조성물 및 방법은 시험관내 및 생체내 모두에서 리소좀 산도를 조작하는데 이용한 가능한 도구의 부족에서 기인하였다. 구체적으로, 리소좀 산도를 감소시킬 수 있는, 즉 pH를 증가시키는 약리학적 및 분자적 도구 (예를 들어, 바필로마이신)는 현재 공지되어 있다. 하지만, 리소좀 산도를 증가시키는, 즉 pH를 감소시키는 도구는 존재하지 않는다.
비제한적으로, 대사 증후군, 제2형 당뇨병, 비알코올성 지방간 질환 (NAFLD), 신경퇴행 및 비만인의 심근증을 포함하는 다수의 질환 상태가 손상된 리소좀 산도와 관련이 있다. 질환 진행을 직접 결정하는 능력은 리소좀 pH를 적절하게 조작할 수 없기 때문에 심각하게 방해받아 왔다. 예를 들어, 연구에 따르면, 상승된 포도당과 포화 지방산에 만성적으로 노출된 췌장 β-세포는 리소좀의 결함이 있는 산성화로 인해 자가포식 흐름이 감소되었다. β-세포 기능장애에서 감소된 리소좀 산성화의 역할을 결정하기 위해, 본 발명자들은 자외선 광에 의한 급성 활성화 시 결함이 있는 리소좀을 산성화시키는 신규한 나노입자 (NP)를 합성하고 특징분석하였다. 이러한 나노입자의 광-활성화는 리소좀 산도의 2시간 회복을 제공하였다. 후속 연구는, 실제로 당지질독성에 노출된 췌장 β-세포에서 리소좀 산도의 회복이 자가포식 흐름과 포도당-자극 인슐린 분비를 정상화시킨다는 것을 입증하였다.
하지만, 외부 촉발제 (즉, 자외선 광)가 필요하며 리소좀 산도의 회복이 단생 (2시간)이라는 점으로 인해, 광-활성화 가능한 나노입자 (paNP)의 사용은 단기 실험에 제한되며, 기능장애 리소좀을 갖는 인간 또는 비인간 동물에서 리소좀 산도의 장기 및 생체내 회복의 이점을 평가할 수 없다. 따라서, 본 발명자들은 내부 리소좀 촉발제에 의해 활성화되는 차세대 나노입자를 개발하고 특징분석하였다. 이러한 차세대 나노입자 (산-활성화 산 방출성 나노입자 또는 acNP)는 여전히 약산성 환경 (약 pH 6)을 유지하는 손상된 리소좀에 의해서도 활성화될 수 있다.
이러한 산-활성화 산 방출성 나노입자 (acNP)는 비알코올성 지방간 질환 및 β-세포 기능장애의 세포 모델에서 자가포식 흐름과 세포 기능을 회복시키는데 사용될 수 있다. 도 1은, 고지질 환경에 노출된 세포에서 자가포식 흐름을 회복시키는 acNP의 능력을 상세히 설명하는 모델을 제공한다.
특정 이론에 구애됨 없이, 이러한 나노입자는 정맥내 투여 또는 당업계에 공지된 다른 투여 방식을 통해 생체 내에서 이용될 수 있다. 이러한 나노입자는, 리소좀 산도가 손상된 질환을 치료하기 위해 리소좀 산성화를 회복시키는데 사용하는 것을 포함하여, 이러한 질환을 연구하는데 유의한 발전이 될 가능성이 있다. 또한, 약물 개발자들은 관심 질환에 대한 리소좀 산성화 경로에서 약물 표적을 입증하는데 acNP를 사용할 수 있다.
리소좀 산성화의 장기 회복이 이전에는 가능하지 않았기 때문에, 본원에 기재된 acNP가 최초이다:
1) 기계론적 연구를 용이하게 하기 위해 연장된 연속 기간 동안 리소좀 산성화를 회복시키는 도구;
2) 연구자가 손상된 리소좀 산성화를 표적으로 하는 것에 대한 이점을 조사할 수 있도록 함으로써, 약물 개발자들이 리소좀 산성화를 치료 표적으로서 입증할 수 있도록 하는 도구;
3) 표적 세포 소기관으로의 진입을 감지할 수 있고, 세포 소기관 내에서 자가 활성화되는 NP;
4) 다른 세포 소기관의 pH에 영향을 미치지 않으면서 리소좀이 산성화될 수 있게 하는 표적화된 중재;
5) 생체내 NP 사용의 선례를 고려한, 생체내 이용에 적합한 리소좀 산성화 중재.
비알코올성 지방간 질환 (NAFLD)이 오늘날 세계에서 가장 흔한 간 질환이라는 점에 유의해야 한다. 최근, 지질독성 (LT)으로 지칭되는 간 유리 지방산 (FFA) 수준의 증가가, 리소좀 산도를 감소시킴과 동시에 자가포식 흐름을 저해하며, 이는 NAFLD의 발병에 기여하는 것으로 확인되었다. 본 발명의 하나의 양태에서, 리소좀 산도와 자가포식을 전략적으로 표적화하고 조작하기 위해 신규한 생분해성 산-활성화 산 방출성 나노입자 (acNP)가 합성된다. 본 발명의 하나의 양태에서, acNP는 pH 6.0 (기능장애 리소좀에서 보고된 pH임)에서 분해되어, 리소좀 pH를 추가로 저하시키는 구성요소인 산, 즉 TFSA (테트라플루오로숙신산)와 SA (숙신산)를 방출함으로써, LT 하에서 간세포의 세포 기능과 자가포식 흐름을 증가시킬 수 있는 플루오르화 폴리에스테르를 기반으로 한다. 본원에 기재된 acNP는 NAFLD와 다른 기능장애 리소좀 질환을 회복시키는 잠재적인 치료제로서 작용할 수 있다.
본 발명의 acNP는 심근증, 노인성 치매, 알츠하이머병, 파킨슨병 및 리소좀 저장 장애의 치료뿐 아니라, 리소좀 기능의 회복에 유리하게 반응하는 포유류의 병리 치료를 포함하여, 다수의 맥락에서 자가포식을 촉진시키는데 사용될 수 있다. 본 발명의 하나의 양태에서, acNP는 손상된 리소좀 산도와 관련된 질환의 치료 또는 예방에 사용될 수 있다. 이러한 질환에는, 비제한적으로, 비만, 고지질혈증, 고혈압, 대사 증후군, 제2형 당뇨병 (T2D), 간 질환 (예컨대, 비알코올성 지방간 질환 (NAFLD), 비알코올성 지방간염 (NASH), 간경변 또는 간암), 신경퇴행 (예를 들어, 노인성 치매, 알츠하이머병, 파킨슨병 등)이 포함된다. 또 다른 구현예에서, acNP는 이식을 필요로 하는 대상에게 이식될 간에 투여될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 이식용 간은 본 발명의 acNP를 간에 관류시킴으로써 탈지질화된다.
특정 이론에 구애됨 없이, 본원에 기재되고 실시예에 예시된 나노입자 (acNP)는, 과량의 지질이 자가포식을 저해하는 세포 시스템에서 리소좀 pH, 자가포식 흐름 및 세포 기능의 국소화된 회복을 가능한다고 여겨진다. 이러한 관찰은 생체내 모델로 확장되었다. 이러한 신규한 acNP는 자가포식 흐름과 세포 기능을 회복시키기 위해, 내부 리소좀 촉발제를 통해 손상된 리소좀 구획으로 산을 전달한다. 본 발명의 acNP는 리소좀 pH를 리소좀이 정상적으로 기능하는데 필요한 산성 조건으로 조정할 수 있는 최초로 이용 가능한 약리학적 또는 분자적 도구인 것으로 여겨진다.
감소된 리소좀 산도 (pH > 6)는 높은 수준의 지방산 (FA)에 노출된 간세포와 β-세포에서 자가포식 흐름을 저해한다. 하나의 양태에서, 플루오르화 폴리에스테르로부터 제조된 acNP는 pH 6의 기능장애 리소좀에서 흡수되어 구성적으로 활성화된다. 리소좀 산성화를 저해하는 조건 하에서 적절한 산성화 속도, 리소좀 표적화 및 리소좀 산도의 회복을 갖는 제제를 결정하기 위해, 상이한 중합체 조성물을 제제화하고 사용하였다.
특정 구현예에서, acNP는 약산성 환경에 노출 시 산과 알코올 구성성분으로 분해되는 폴리에스테르로부터 제조된다. 산이 기능장애 리소좀으로만 방출되고, 추가의 산성화가 일어난다는 것을 보장하기 위해, 특정 구현예에서, 테트라플루오로숙신산 (TFSA)을 함유하는 플루오르화 폴리에스테르가 사용된다. 플루오르화 폴리에스테르는 의료 적용에 광범위하게 사용되며, 플루오르화 폴리에스테르는 낮은 독성과, 높은 시험관내 및 생체내 생체적합성을 나타낸다. 일반적으로, 폴리에스테르는 pH 7 내지 7.4의 수성 환경에서 용이하게 가수분해되지 않는다. 하지만, 약산성 환경 (pH 6.0)의 존재 하에서, 이는 가수분해되고, 분해되어 산을 방출한다. 따라서, 과제는 가수분해와 NP 분해 시 주변 pH를 추가로 저하시키는 것이었다. 비교적 높은 pKa 값 (예를 들어, 글리콜산 = 3.83, 숙신산 = 5.6 및 4.2)을 갖는 글리콜산 또는 숙신산 (SA)과 같은 산으로 구성된 이전에 합성된 생분해성 폴리에스테르는, pH를 약간만 저하시키기 때문에, 리소좀에서 pH를 회복시키기에 불충분하다. 하지만, 본원에 예시된 폴리에스테르 나노입자에서, 본 발명자들은 약 1.6의 더 낮은 pKa를 갖는 TFSA를 사용하였다. 따라서, acNP는 더 강한 산의 방출을 통해 리소좀 pH의 보다 유의한 회복을 가능하게 한다.
본 발명자들은, 폴리에스테르의 acNP 조성물이 하기와 같은 특성을 보유할 것이라는 가설을 세웠다: 1) SA에 대한 TFSA의 양이 클수록 완충액과 리소좀 구획에서 산성 반응이 커질 것임; 및 2) 소수성이 클수록 (폴리에스테르 내 디올에 존재하는 메틸렌 탄소의 수를 증가시킴으로써, 예를 들어 에틸렌 → 프로필렌 → 부틸렌 글리콜) 더 느리게 분해되어 장기간에 걸쳐 산을 전달할 것임. 따라서, 하나의 구현예에서, TFSA 대 SA 함량은 acNP의 합성에서 가변적이다. 또 다른 구현예에서, 글리콜 사슬의 길이는 가변적이다. 글리콜 사슬이 짧을수록 산성화는 커지며, 글리콜 사슬이 길수록 acNP의 분해는 느려져, 장기간에 걸쳐 산을 전달할 수 있다. 산성화의 정도를 조절하기 위해, 본 발명자들은 상이한 비의 TFSA:SA와, 리소좀 루멘을 정상 수준 (약 pH 4.5)으로 추가로 산성화시키기 위해 약 pH 6에서 활성화되는 상이한 유형의 디올 - 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 또는 부틸렌 글리콜을 기반으로 하는, 일련의 폴리에스테르와 상응하는 acNP를 합성하였다. 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 및 부틸렌 글리콜 디올은 예시적이며 비제한적인 것으로 이해되어야 한다. 다른 선형의 탄화수소 기반 디올, 예를 들어 헥산디올, 폴리에틸렌 글리콜이, 또한 acNP를 생성하는데 사용될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 분지형 디올이 본 발명의 acNP를 생성하는데 사용된다. 분지형 디올의 예에는, 비제한적으로, 글리세롤과 폴리(에틸렌 글리콜) 별모양 중합체가 포함된다. 본원에 제공된 교시를 사용하여, 당업자는 다른 적합한 디올을 알아낼 수 있다.
추가의 구현예에서, acNP는 디올의 사슬 길이와 테트라플루오로숙신산 대 숙신산의 비가 가변적인 폴리에스테르를 포함한다. acNP에서 중합체 조성 및/또는 테트라플루오로숙신산 대 숙신산의 비를 변화시킴으로써, 산성화의 속도와 정도를 조정할 수 있다. TFSA 함량이 높을수록 리소좀 산성화의 속도가 증가된다.
나아가, acNP에서 중합체 조성 및/또는 테트라플루오로숙신산 대 숙신산의 비를 변화시킴으로써, acNP는 단기 또는 장기간의 치료를 필요로 하는 인간 또는 비인간 포유류에게 투여될 수 있다. 또한, 중합체 조성 및/또는 테트라플루오로숙신산 대 숙신산의 비를 변화시키는 것은, acNP가 저장되는 온도를 제어할 필요가 있는지 여부에 관계없이, 안정성, 및 따라서 저장성을 제공한다.
하나의 예시적인 비제한적인 구현예에서, 상기 중합체는 하기 반응식 I에 따른 중축합 방법을 통해 합성되었다:
다양한 구현예에서, 단량체 비와 글리콜 유형을 다르게 하여, 생성되는 중합체를 변화시킨다. 최종 조성과 분자량은, 예를 들어 1H, 13C NMR 및 겔 투과 크로마토그래피 기법을 통해 특징분석되고 확인된다. 결과는 실시예 1 및 2에 제시되어 있다. 본 발명자들은 TFSA:SA 비와, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 또는 부틸렌 글리콜인지 여부가 모두 달라지는 중합체의 라이브러리를 합성하였다 (표 1 참조). 특히 폴리에스테르 1 (10% PEFSU), 4 (25% PEFSU), 5 (PESU) 및 12 (50% PBFSU)의, 특성화 화학 조성, 분자량 (수 평균 분자량 (Mn), 중량 평균 분자량 (Mw)) 및 다분산도 (D)가 표 1에 제시되어 있다 (또한, 실시예 1 및 2에서의 이들 중합체의 특징분석 참조).
특정한 예시적인 비제한적인 구현예에서, 50 내지 100 nm NP가 세포내이입 경로를 통해 리소좀에 용이하게 흡수되기 때문에, 이러한 직경이 선택된다 (20, 21). 폴리에스테르 1 (10% PEFSU), 4 (25% PEFSU), 5 (PESU) 및 12 (50% PBFSU)로부터 형성된 acNP의 예시적인 결과는, 동적 광 산란과 전자 주사 현미경 연구에 따라 비교적 작은 크기와 균일한 분포 (직경 <100 nm, PDI <0.14)를 나타낸다.
특정 구현예에서, acNP는 pH 5 내지 pH 6.0일때, 생체 내에서 혈장 pH를 변경시킨다. acNP는 pH를 6에서 3으로 유의하게 감소시킬 수 있다.
엔도좀/리소좀 구획으로의 acNP 세포 흡수 및 국소화 속도.
세포 및 리소좀으로의 acNP의 흡수 속도의 특징분석.
본 발명은 폴리에스테르와 acNP의 라이브러리를 제공한다. 특정 구현예에서, 중합체 합성 수율은 60% 초과이며, 분산도 (Mw/Mn)는 1.4 미만이고, MW은 예상 MW의 10% 이내이다. 일부 구현예에서, acNP의 직경은 약 75 mm이고, PDI는 0.1 미만이다. 추가의 구현예에서, acNP의 직경은 약 100 내지 120 nm이고, PDI는 0.1 내지 0.2이다. 또 다른 구현예에서, acNP의 직경은 약 50 내지 100 nm이다. 본 발명의 acNP는 미니에멀젼 기법 또는 LV-1 미세유동화기(Microfluidizer) (Microfluidics Corp)를 사용하여 생성될 수 있다. 중합체 조성과 리소좀 산성화를 최적화하기 위해, acNP 조성-산성화, 즉 TFSA 함량과 글리콜 사슬 길이 사이의 관계가 결정된다. 본 발명의 acNP는 세포에 세포독성이 아니며, 미세포음작용(micropinocytosis), 세포내이입 (클라트린 또는 카베올린 매개), 포식작용 또는 미세포음작용을 통해 세포에 의해 흡수될 수 있다. 세포에의 진입 후, acNP는 리소좀에 국소화되며, 여기서 acNP는 4시간 내에 약 4 내지 약 4.5의 이의 정상 pH로 리소좀을 산성화시킨다.
NP의 합성에서의 잠재적 한계는, 응집으로 인한 장기 저장 (30일 초과)에서의 acNP의 불안정성이다. 하나의 구현예에서, 상기 NP는 합성 후 동결건조된다. 또 다른 구현예에서, 1종 이상의 동결보호제 (예를 들어, 트레할로오스, 만노오스 또는 수크로오스)가 첨가된다. 동결보호제는 NP 현탁액을 안정화시키고, 추가 사용을 위한 재현탁의 용이성을 증가시키는 역할을 한다. 본 발명의 acNP는 리소좀 산성화를 손상시키는 조건 하에서 자가포식 흐름의 장기 회복을 가능하게 한다.
본 발명의 하나의 양태에서, acNP는 리소좀 산성화가 손상된 병든 세포에서 자가포식 흐름과 리소좀 기능의 단기 및 장기 회복을 제공한다. 하나의 구현예에서, acNP는 과량의 FA에 노출된 간세포와 β-세포에서 자가포식 흐름과 리소좀 기능의 단기 및 장기 회복을 제공한다. 하나의 구현예에서, acNP는 FA에 만성적으로 노출된 세포에서 리소좀-자가포식소체 융합 능력, 리소좀 가수분해효소 활성 및 자가포식 흐름을 증강시킨다. acNP는 최적의 리소좀 pH의 연속적인 장기 회복을 가능하게 한다. 검증 실험은, β-세포 기능장애의 시험관내 질환 모델에서 acNP가 리소좀 기능과 자가포식 흐름의 단기 및 장기 회복을 제공할 수 있음 (acNP는 4시간의 인큐베이션 후 B 세포에서 리소좀 pH를 감소시킬 수 있음)을 보여주었다.
FA에의 만성 노출에 의해 야기된 자가포식 흐름의 저해는 감소된 리소좀 산도의 결과이며, 이는 자가포식소체와의 리소좀 융합과 자가포식소체 내용물의 분해를 손상시킨다. 하나의 구현예에서, acNP는 FA에 만성적으로 노출된 세포에서 리소좀-자가포식소체 융합 능력, 리소좀 가수분해효소 활성 및 자가포식 흐름을 증강시킨다.
또 다른 구현예에서, acNP는 리소좀에서 가수분해효소 활성을 회복시킨다. 세포 내 리소좀 효소 활성은 카텝신 (즉, 카텝신 A, B, C, D, E, K, L, O, S, V), 글루코세레브로시다아제 (glucocerebrosidase, GBA) 또는 LAMP (즉, LAMP 1, LAMP 2, LAMP 5)를 포함한다.
또 다른 구현예에서, acNP는 리소좀 기능장애를 갖는 세포에서 자가포식 흐름을 회복시킨다. 리소좀 기능장애를 갖는 세포는 지질 또는 지방산에 만성적으로 노출된 세포를 포함할 수 있다. 자가포식소체 형성 동안, 포스파티딜에탄올아민은 시토졸 LC3 (LC3-I)에 접합되어, 자가포식소체 막에 격리되어 있는 LC3-II를 형성한다. LC3은 자가포식소체 내용물에 대한 마커로서 작용한다. 따라서, 기능성 세포에서, 리소좀의 산성화는 자가포식소체와의 융합을 유도하며, 이는 자가포식소체와 이의 내용물 (LC3-II 포함)의 분해를 가능하게 한다. 손상된 리소좀 산성화는 자가포식소체의 분해를 감소시킨다. 따라서, 융합은 LC3-II의 축적으로 이어진다. 자가포식 흐름에 대한 영향을 추론하기 위해, 2가지 시험이 적용되었다. 첫 번째는, 자가포식소체에서 분해되는 p62의 측정이다. 두 번째는, 자가포식소체의 분해를 완전히 차단함으로써 자가포식소체 형성에 대한 임의의 영향을 추정할 수 있었다 (LC3-II의 측정). 기능장애 자가포식소체의 축적을 방지하는 acNP의 능력을 시험하기 위해, 세포를 지질독성에 16시간 노출시키는 동안 acNPS로 처리하였다. 만성적 FA 노출은 세포에서 LC3-II와 p62 수준을 증가시켰고, acNP로의 처리는 이러한 2가지 단백질의 수준을 정상화시켰다.
또 다른 구현예에서, acNP는 리소좀 기능장애를 갖는 세포에서 단백질과 미토콘드리아 전환(turnover)을 정상화시킨다. 단백질 전환과 미토콘드리아 전환을 측정함으로써 자가포식의 특정 결과에 대한 acNP의 영향을 정량화할 수 있다 - 자가포식의 2가지 핵심 생리학적 역할은 단백질과 미토콘드리아의 전환임. 미토콘드리아 전환은 세포에서 미토파지(mitophagy)의 속도를 모니터링하는 프로브인 Fis1-GFP-mCherry (Anne Burnet 박사에 의해 기탁된 Addgene 플라스미드)를 사용하여 결정되었다. Fis1-GFP-mCherry는, 형광이 켄칭될 때, 미토콘드리아가 산성 자가포식소체에 진입하는 것을 보고한다.
미토콘드리아 단백질 전환은 프로브인 MitoTimer (Roberta Gottlieb 박사에 의해 기탁된 Addgene 플라스미드)를 사용하여 측정되며, 이는 바필로마이신에 의한 리소좀 양성자 펌프의 저해에 의해 강하게 영향을 받는다 (32). Mitotimer는 단백질의 수명에 따라 방출 스펙트럼을 변화시킨다 (녹색에서 적색으로). 구성적 발현 동안 더 높은 적색/녹색 형광 비율은 미토콘드리아 내 오래된 단백질의 축적을 나타내며, 이는 자가포식을 통해 미토콘드리아가 효과적으로 제거되지 못하는 것으로 해석된다.
자가포식에 대한 acNP의 영향을 결정하기 위해, INS1 세포와 HepG2 세포를 과량의 지질로 처리한 후, 프로테아제 저해제, 예를 들어 펩스타틴 + E64D의 존재 또는 부재 하에서 acNP와 함께 인큐베이션할 수 있다. 프로테아제 저해제는 자가포식소체 내용물의 분해를 방지한다. 본 발명자들은, 만성적 FA 노출에 의해 야기된 감소된 리소좀 산성화가 β-세포와 간세포에서 적색/녹색 MitoTimer 단백질의 비율을 증가시킬 것으로 여긴다. acNP를 이용한 자가포식 흐름의 구제는 미토파지를 회복시키고, FA로 처리된 세포에서 적색/녹색 형광을 정상화시킬 것이다.
생체내 리소좀 산성화의 약리학적 저해는 지방간을 초래하며, 자가포식의 저해는 포도당-자극 인슐린 분비를 손상시킨다. 현재까지, 산성화의 증가가 지방간과 인슐린 내성 (IR)을 역전시킬 수 있는지 여부는 알려지지 않았다. 특정 이론에 구애됨 없이, 본 발명자들은 리소좀 산도와 자가포식 흐름의 회복이 간세포 지질 함량을 정상화시키고, 포도당에 반응하여 인슐린을 분비하는 β-세포의 능력을 증강시킬 것으로 여긴다.
자가포식은 지질포식(lipophagy)으로 지칭되는 과정에서 지질 액적을 소비하고, 간세포 내 지질 액적의 축적은 인슐린 내성 (IR)의 발달에 원인이 되는 역할을 한다. 본 발명의 하나의 양태에서, acNP에 의한 자가포식의 활성화는 지질포식을 증가시킴으로써 간세포에 대한 지질 부담을 감소시켰다. 또 다른 구현예에서, 과량의 FA 노출의 결과로서 리소좀 기능장애를 갖는 대상의 acNP 처리는, 단백질 키나아제 B (Akt)의 인산화를 증가시켰다. 단백질 키나아제 B (Akt)는 인슐린 수용체의 자극에 대한 반응으로 PI3K에 의해 직접 인산화된다. Akt의 인산화는 Ser473에서 일어난다. 인슐린 내성 (IR)의 상태에서, Ser473의 인산화는IR을 유도하는 FA 노출의 결과로서 감소된다. 또 다른 구현예에서, acNP는 인슐린 내성 간세포에서 포도당 생산에 대한 인슐린 저해 효과를 회복시켰다.
간세포에 의한 포도당 생산을 감소시키는 인슐린의 능력은 비만인 인슐린 내성 인간에서 감소되며, 이는 간 지질 축적과 강한 상관관계가 있다. acNP가 인슐린 내성 간세포에서 포도당 생산에 대한 인슐린 저해 효과를 회복시킬 수 있는지를 결정하기 위해, 간세포를 acNP의 존재 또는 부재 하의 FA에서 단리하고 만성적으로 배양하였다.
본 발명의 하나의 양태에서, 과량의 지질 환경에 노출된 세포의 acNP 처리는 장기간에 걸쳐 산성화를 회복시킴으로써, 세포에서 포도당-자극 인슐린 분비의 완전하고 지속적인 회복을 유도하였다. 하나의 구현예에서, 포도당-자극 인슐린 분비에서의 결함은 유효량의 acNP를 포유류에게 투여함으로써 과량의 지질에 노출된 포유류에서 예방되었다.
본 발명의 하나의 양태에서, acNP는 상이한 폴리에스테르 조성의 중합체를 포함한다. 하나의 구현예에서, acNP는 디올의 사슬 길이가 가변적인 폴리에스테르를 포함한다. 상이한 사슬 길이의 디올을 갖는 폴리에스테르는 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 부틸렌 글리콜, 헥산디올, 폴리에틸렌 글리콜로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
또 다른 구현예에서, 폴리에스테르는 상이한 사슬 길이의 선형 또는 분지형 탄화수소이다. 또 다른 구현예에서, acNP는 테트라플루오로숙신산 (TFSA) 대 숙신산 (SA)을 상이한 비율로 포함한다. TFSA 대 SA의 비는 약 10:90, 약 15:85, 약 20:80, 약 25:75, 약 30:70, 약 35:65, 약 40:60, 약 45:55, 약 50:50, 약 55:45, 약 60:40, 약 65:35, 약 70:30, 약 75:25, 약 80:20, 약 15:15, 약 90:10, 약 95:5 및 약 100:0으로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
본 발명의 하나의 양태에서, acNP를 포함하는 약학적 제제와 이의 사용 방법이 제공된다.
상기 및 본원에 제공된 실시예의 관점에서, 당업자는, 본 발명자들이 리소좀 산도와 자가포식을 전략적으로 표적화하고 조작하기 위해 신규한 생분해성 산-활성화 산 방출성 나노입자 (acNP)를 합성하였다는 인지할 것이다. 이러한 acNP는 pH 6.0 (기능장애 리소좀에서 보고된 pH)에서 분해되어, 리소좀 pH를 추가로 저하시키는 구성요소인 산을 방출함으로써, LT 하에서 간세포의 세포 기능과 자가포식 흐름을 증가시킨다. acNP는 NAFLD 또는 다른 리소좀 기능장애 질환으로 진단받은 개체에서 리소좀 기능을 회복시키는 치료제로서 유용하다.
실시예
하기 실시예는 예시하기 위한 것으로, 청구된 발명을 제한하고자 하는 것이 아니다.
실시예 1
생분해성 폴리에스테르는 지질독성 하의 세포에서 리소좀 산성화를 조절함
폴리에스테르 라이브러리의 합성.
폴리에스테르의 제조에 중축합을 사용하였으며, 이때 TFSA:SA의 비에 따라 반응 온도와 시간에 있어서 약간의 변화가 있었다. TFSA:SA 비가 50% 초과인 폴리에스테르는 다른 폴리에스테르가 150℃였던 것에 비해 130℃에서 반응시켰다. 중합체 조성, 분자량 및 PDI를 1H NMR, 13C NMR, 19F NMR (SI) 및 겔 투과 크로마토그래피 (GPC)를 사용하여 특징분석하였다 (도 2a 내지 도 2e). NMR 스펙트럼으로부터의 결과는 폴리에스테르 조성을 확인시켜주었으며, 이는 이론적 비율과 일치하였다. 분자량은 동일한 계열에 대하여 동일한 순서로 되어있다.
폴리에스테르의 열적 특성
폴리에스테르의 열적 거동을 시차 주사 열량분석 (DSC)과 열중량 분석 (TGA)을 이용하여 특징분석하였다. 용융 온도, 결정화 온도, 유리 전이 온도, 및 폴리에스테르가 5% 분해 (Td, 5%) 또는 최대 분해 (Td, max)를 나타내는 온도를 결정하였고, 결과는 표 2에 제시되어 있다. 특징분석된 다수의 폴리에스테르의 경우, 용융 온도 또는 결정화 온도는 검출되지 않았다. 대부분은 -20℃ 미만의 낮은 유리 전이 온도를 가졌다 (도 3a 및 3b). 이러한 연구의 결과는, 폴리에스테르가 대부분 비정질임을 나타낸다. 유리 전이 온도는, 사용된 TFSA:SA의 비가 증가함에 따라 감소되었다. 합성된 모든 폴리에스테르는 250℃ 이하에서 분해를 나타내지 않았다 (도 3c).
하기 표 2는 합성된 폴리에스테르의 열적 특성을 보여준다. Tg는 전이 온도, Tcc는 냉각 결정화 온도, Δ Hcc는 냉각 결정화 동안 열 흐름 변화, Tm은 용융 온도, Δ Hm은 용융 동안 열 흐름 변화, Tc는 결정화 온도, Δ Hc는 결정화 동안 열 흐름 변화, Td,5%는 폴리에스테르가 5% 분해를 나타낸 온도, Td,max는 폴리에스테르가 최대 분해를 나타낸 온도를 나타낸다.
단분산 나노크기 acNP의 합성.
폴리에스테르를 나노입자를 형성하는 이의 능력에 대하여 특징분석하였다. 나노입자의 제조 방법에는, 비제한적으로, 미니에멀젼, 초음파처리12, 용매 치환 및 나노침전이 포함된다. 나노침전은 임의의 높은 전단 응력없이 고도로 독성이 아닌 용매의 사용을 가능하게 하는 간단하고 신속한 방법이다. 나아가, 상기 방법은 acNP를 생성하기 위한 산업적 규모로 용이하게 규모 확장될 수 있다. 나노입자 형성은 입자 핵화, 분자 성장 및 응집에 의존한다. 간략하게, 먼저 수혼화성 용매 (즉, 아세톤/DMF) 중에 중합체를 용해시켜 나노입자를 형성하고, 이를 상이한 유형의 계면활성제를 포함하는 빠르게 교반 중인 수용액에 25G 시린지 바늘을 통해 적가하였다. 유기 용매와 과량의 계면활성제를 시간에 걸쳐 투석으로 제거하였다. 상이한 크기와 안정성을 갖는 acNP를 수득하기 위해, 몇몇 파라미터를 변화시켰다: 예를 들어, (1) 중합체의 유형과 양, (2) 유기 용매의 유형, (3) 용매 대 수용액 비, (3) 계면활성제의 유형, (4) 중합체 대 계면활성제 비, (5) 투석 시간 및 (6) 온도 (표 3). acNP의 크기, 형태 및 안정성을 동적 광 산란 (DLS), 주사 전자 현미경 (SEM) 및 제타 전위계로 특징분석하였다. (도 4)는, 부틸렌 글리콜 (폴리에스테르)과 TFSA:SA 비로 합성된 상이한 중합체를 사용하여 제제화된 대표적인 acNP의 SEM 이미지를 보여준다.
용매 유형의 영향
acNP를 형성하는데 사용된 상이한 변수를 분석하기 위해, 50% PBFSU를 모델 중합체로서 선택하였다. acNP의 제조에 상이한 용매를 사용하였다. 그 중에서, 사용된 용매는 아세톤, 디클로로메탄 (DCM) 및 디메틸포름아미드 (DMF)였다. DMF로부터 형성된 acNP는 가장 구형이었고, 가장 낮은 다분산도 (0.125)를 가졌는데, 이는 높은 안정성을 나타낸다. acNP 크기 또한 133.9 nm로 작았다. 표 3은 아세톤으로부터 합성된 acNP가 훨씬 작았음을 나타내지만, SEM 이미지 (도 5)는 과량의 계면활성제와 불균일한 형태를 나타냈으며, 이는 불완전한 입자 형성 (SI)을 나타낸다.
계면활성제 유형의 영향
사용된 용매의 유형을 결정한 후, acNP 형성에 대한 상이한 계면활성제의 영향을 고려하였다. 소듐 도데실 술페이트 (SDS)를 이용하여 제조된 나노입자는 최소 직경과 PDI를 생성한 반면, 폴리-L-리신의 경우에는 SDS를 사용하여 수득된 것보다 한자릿 수 더 큰 크기를 가졌고, 유의한 응집을 나타냈다. 2가지 비이온성 계면활성제인, 폴리비닐 알코올 (PVA)과 pluronic F127 또한 SDS보다 유의하게 큰 나노입자를 생성하였다.
중합체 대 계면활성제 비의 영향
DMF 중의 중합체의 최종 농도 (mg/mL)와 나노퓨어 워터(Nanopure water) 중의 계면활성제를 변화시켜, 중합체 대 계면활성제 비를 결정하였다. 계면활성제의 농도가 사용된 중합체의 농도보다 (1) 높거나, (2) 동일하거나, 또는 (3) 낮은 제제화되었다. acNP 형성을 위한 최적의 비는, 1:4 (즉, 50% PBFSU의 최종 농도 1 mg/mL:SDS 4 mg/mL)인 것으로 확인되었다. 후속 제제는 용매 대 수용액의 비를 일정하게, 중합체 대 계면활성제 비를 1:4로 유지하고, 다양한 단일 파라미터를 사용하여 이들 파라미터의 영향을 결정하였다.
용매 대 수용액 비의 영향
용매 대 수용액의 비가 낮을수록 훨씬 더 작은 나노입자가 수득되었다.
투석 온도의 영향
중합체 대 계면활성제 비와 용매 대 수용액 비가 고정되었을 때, 투석 온도와 시간을 결정하였다. acNP 형성을 0℃ 또는 25℃에서 시험하였다. 이는, 온도 조작이 계면활성제의 임계 미셀 농도 (CMC)에 영향을 미치기 때문이며, CMC는 통상적으로, 온도 증가가 CMC의 증가에 해당하는 특정 지점까지, 온도 증가에 따라 감소한다. 0℃에서, 물 중 SDS의 CMC는 2.75 mg/mL였으며, 25℃에서 CMC는 2.30 내지 2.50 mg/mL 범위 내로 떨어졌다. acNP 제제를 CMC 보다 높거나 낮은 다양한 농도의 SDS를 이용하여 0℃와 25℃ 모두에서 시험하였다. 25℃에서 CMC보다 높은 SDS의 농도에서 최적의 나노입자가 형성되었다. SEM 이미지는, 이러한 조건 하에서, 형성된 acNP가 구형이었으며, 분산 집단을 가졌음을 보여준다 (도 6). 0℃에서, 크기, 다분산도 및 제타 전위는 25℃에서 수득된 것과 유사하였다. 25℃의 실온보다 높은 고온에서는 DMF의 휘발성으로 인해 시험하지 않았다. 또한, 고온에서의 투석은 CMC를 감소시킴으로써 중합체를 캡슐화하는 계면활성제의 능력을 감소시켰으며, 이는 신속한 미셀 형성으로 인해 방해를 받았다.
투석 시간의 영향
투석 시간은 나노입자 크기에 유의하게 영향을 미치는 것으로 확인되었다. 24 내지 36시간 사이의 시점을 비교한 결과, 24시간 투석 시간에서 최적의 크기와 안정성을 갖는 나노입자를 얻었다. 투석 시간이 36시간까지 증가될 때, acNP의 크기는 유의하게 변하지 않았다 (도 7).
중합체 유형의 영향
사용된 중합체의 유형은 acNP를 형성하는데 필요한 투석 시간에 영향을 미친다. 더 낮은 TFSA:SA 함량 또는 더 짧은 글리콜 길이를 갖는 acNP는 더 짧은 투석 시간이 필요했다 - 즉, 75% PBFSU와 100% PBFSU는 단지 6시간의 투석이 필요했으며 (형성된 acNP의 평균 직경은 94.6 nm이고, PDI는 0.124임), 25% PEFSU는 단지 8시간의 투석이 필요했다. 한편, 25% PBFSU 또는 50% PBFSU는 acNP의 형성에 24시간이 필요했다 (평균 직경 133.9 nm, PDI 0.125). DLS와 SEM 이미징 두 가지를 사용하여 acNP 형성을 특징분석하였다 (도 4).
pH와 GPC 분석을 통한 acNP의 분해 속도의 특징분석
상기 기재된 합성된 acNP를 사용하여, 상이한 유형의 완충 환경에서 pH 조절 능력과 분해 속도를 연구하였다. acNP를 탈이온수 또는 pH 6.0의 20mM PBS 완충액 중에 시간에 걸쳐 현탁시키고, pH와 분자량의 변화를 모두 측정하였다. 기능장애 리소좀의 완충 능력을 19±6 mmol/Ph로 시뮬레이션하였기 때문에, 20 mM PBS 완충액 (pH 6.0)을 선택하였다. pH 6.0에서, 에틸렌 글리콜 함유 폴리에스테르는 부틸렌 글리콜 함유 폴리에스테르보다 더 빠르게 산성화되었다 (도 13b). 동일한 계열의 acNP, 즉, PBFSU acNP를 비교하면, 더 높은 TFSA:SA 비를 갖는 PBFSU acNP가 더 빠른 산성화 속도를 나타냈다 (도 8).
겔 투과 크로마토그래피 (GPC)를 사용하여 37℃의 물에서 중합체의 분자량의 감소 속도를 측정함으로써, acNP의 분해 속도를 측정하였다. acNP를 물에 현탁시키고, 37℃에서 1시간, 2시간, 4시간, 6시간, 12시간, 24시간, 48시간, 72시간, 1주, 2주 동안 인큐베이션하였다. 각각의 특정 시점에서, 중합체 용액의 분취액을 수집하고, 건조시키고, GPC를 사용한 분석 전에 테트라히드로푸란 (THF) 용매에 재용해시켰다. 도 8b는, acNP가 일정한 속도로 분해되었음을 보여주며, 이는 분해가 중심에서부터가 아닌, 말단기로부터 일어났음을 나타낸다. PBFSU 계열 내에서, TFSA:SA 비가 높을수록, 분해 속도는 더 느리다.
상이한 폴리에스테르를 사용하여 제조된 acNP를 비교할 때, 더 짧은 글리콜 사슬을 갖는 폴리에스테르가 더 빠른 분해를 거쳤다. 분해 곡선을 기준으로, PBFSU 폴리에스테르는 이종 2상 분해를 거쳤다. 제1 단계 (0 내지 24시간)에서, PBFSU 에스테르 결합은 전체적으로 서서히 가수분해되었다. 제2 단계 (24 내지 48시간)에서, 분해 생성물 (즉, TFSA 또는 SA)의 카르복실산 말단기는 pH를 저하시켰고, 나노입자 내부의 추가 분해를 촉진시켰다. 이는, 증가된 분해 속도로 알 수 있는 바와 같이, 나노입자의 더 빠른 수 침투와 질량 손실을 가능하게 하였다.
acNP의 세포독성과 acNP를 이용한 리소좀 pH 회복 능력.
PBFSU acNP의 세포독성은 HepG2 세포주에서 결정하였다. HepG2 세포를1000 μg/mL이하의 농도에서 상이한 중합체:TFSA/SA 비를 사용하여 제조된 acNP와 함께 인큐베이션할 때, 유의한 사멸은 관찰되지 않았다 (도 9). 팔미테이트 유도 세포 사멸을 구제하는 PBFSU acNP의 능력을 결정하였다 (도 9b). 더 높은 산 방출 속도와 방출량을 갖는 acNP가 세포 생존율을 증가시킬 수 있었다는 것을 발견하였다.
나아가, acNP를 지질독성 조건 하의 HepG2 세포에서 리소좀 pH를 조절하는 이의 능력에 대하여 시험하였다. HepG2 세포를 (1) 지질독성을 유도하기 위해 BSA와 복합체화된 팔미테이트 (팔미테이트:BSA)와 16시간 동안, 또는 (2) 상이한 acNP (50%, 75% 및 100% PBFSA acNP)와 함께 팔미테이트:BSA와 16시간 동안 인큐베이션하였다. 리소좀 pH를 LysoSensor™ 황색/청색 염료와 공초점 이미징을 이용하여 평가하였다. MetaMorph 분석 소프트웨어를 사용하여 이미지를 정량화하였다 (도 19a 및 19b). 결과는, 부틸렌 기반 acNP가 더 빠른 분해 동력학에 따라 16시간의 인큐베이션 내에 리소좀 pH를 회복시켰음을 보여주었다.
실시예 2
분해성 산성 나노입자는 지질독성 하의 세포에서 리소좀 pH와 자가포식 흐름을 회복시킴
생분해성 acNP (PEFSU acNP)의 합성과 특징분석, 및 용액에서의 이의 분해 동력학.
주변 pH를 유의하게 저하시키는 구성성분 카르복실산인 테트라플루오로숙신산 (TFSA)과 숙신산 (SA)을 방출하기 위해 생분해될 수 있는 일련의 합성된 폴리(에틸렌 숙신-코-테트라플루오로숙시네이트) 중합체 (PESU 및 25% PEFSU)를 기반으로, 산-활성화 산성 나노입자를 합성하였다 (도 11).
일반적으로, 폴리에스테르는 pH 7 내지 7.4의 수성 환경에서 용이하게 가수분해되지 않는다. 하지만, 약산성 환경 (pH 6.0)의 존재 하에서, 이는 가수분해를 거쳐, 분해되어, 산을 방출한다. 과제는, 가수분해와 NP 분해 시 주변 pH를 추가로 저하시키는 것에 있다. 비교적 높은 pKa 값 (예를 들어, 글리콜산 = 3.83, 락트산 = 3.86)을 갖는 글리콜산 또는 락트산과 같은 산으로 구성된 이전에 합성된 생분해성 폴리에스테르는, pH를 약간만 저하시킨다. 본 발명의 폴리에스테르는 훨씬 더 낮은 약 1.6의 pKa를 갖는 TFSA를 포함한다. 이러한 TFSA/SU 폴리에스테르로 제조된 acNP는 DL-락티드-co-글리콜리드로부터 합성된 PLGA 나노입자보다 더 강한 산을 방출함으로써 리소좀 pH의 유의한 회복을 가능하게 한다.
acNP 산성화 능력
이러한 acNP의 산 방출 및 pH 저하 특성을 입증하기 위해, TFSA와 SA의 비를 변화시킴으로써, 상이한 분해 및 산 방출 속도를 갖는 2가지 상이한 중합체 (PESU 및 25% PEFSU)를 합성하였다. 1H, 13C 및 19F NMR 스펙트럼 및 중합체 특징분석은 도 11에 제시되어 있다.
폴리에스테르 10% PEFSU, 25% PEFSU, PESU 및 50% PBFSU로부터 형성된 acNP의 예시적인 결과는, 동적 광 산란과 주사 전자 현미경 연구에 따라 비교적 작은 크기와 균일한 분포 (직경 <100 nm, PDI <0.14)를 나타낸다 (도 4a (상기 PBFSU) 및 도 13a (PEFSU)).
산성화의 속도와 정도는, acNP를 6.0, 7.4 및 8.0의 20mM PBS 완충액과 탈이온수 중에서, 25℃와 37℃모두에서 시간에 걸쳐 인큐베이션할 때, 용이하게 결정될 수 있다. 20 mM PBS 완충액 (pH 6.0)은 기능장애 리소좀의 완충 능력 (19±6 mM, pH=6.0)을 시뮬레이션하기 때문에 선택되었다 (22). 또한, 보다 대표적인 생체내 혈장 환경인 pH 7.4의 혈장에서 실험을 반복하였다. 혈장 pH를 변경하는 acNP는, 이것이 생체내 시험과 상용 가능하지 않을 수 있기 때문에 추가로 고려될 필요가 없다. 예비 데이터는, pH 7.4 완충액에 노출되었을 때, 25% PEFSU (25:75 TFSA:SA와 에틸렌 글리콜)로 구성된 acNP는 pH를 변화시키지 않았지만, pH 6.0 완충액에서, pH는 6에서 3으로 유의하게 감소되었음을 보여준다 (도 14b). 대조적으로, 50% PBFSU (50:50 TFSA:SA와 부틸렌 글리콜)의 폴리에스테르로 구성된 acNP는, 에틸렌 글리콜에 비해 부틸렌 글리콜의 소수성이 더 크기 때문에 산을 더 서서히 방출시켰다 (도 13b). 10% PEFSU (10% TFSA)로 구성된 acNP는 더 낮은 TFSA 함량으로 인해 산성화 속도가 감소되어 25% PEFSU보다 더 서서히 분해되었다 (도 13b). 이러한 결과는 본 발명자들의 가설을 뒷받침한다. 따라서, 본 발명자들은, TFSA:SA 비와 글리콜의 유형을 변화시킴으로써 산성화의 정도를 미세하게 제어할 수 있다고 여긴다.
0% TFSA와 100% SA를 함유하는 PESU는, 분해 속도가 느려 pH에 유의한 변화가 없을 것으로 예상되었기 때문에, 대조군으로서의 역할을 하였다. 한편, 25% PEFSU (25% TFSA와 0% SA)는 TFSA 함량을 증가시켰으며, 이는 이의 산도와 pH 저하 특성을 증가시킬 수 있다. 나노침전 기법을 통해 합성된 중합체를 사용하여 단분산 acNP를 형성하였다.1 acNP의 크기, 형태 및 안정성을 동적 광 산란 (DLS), 주사 전자 현미경 (SEM) 및 제타 전위계로 특징분석하였다 (도 14a). 형성된 acNP는 100nm의 평균 직경과 -25 내지 -30mV의 제타 전위를 가졌으며, 이는 용액에서 양호한 안정성을 나타낸다 (도 14a).
acNP의 산성화 정도를 결정하기 위해, PBS pH 6.0 완충액 (리소좀 환경 모방 완충액)과 pH 7.4에서 48시간에 걸쳐 pH 변화를 측정하였다. pH 6.0에서, 25% PEFSU 기반 acNP는 처음 4시간 내에 PBS pH 완충액 (20 mM)을 유의하게 산성화시켰으며, 산성화는 24시간까지 계속되었다 (도 13b 및 도14b (좌측 패널)). 대조적으로, PESU 기반 acNP는 아마도 중합체의 분해 속도가 느리고, 방출된 숙신산의 양이 적기 때문에, pH 변화를 나타내지 않았으며, 이는 pH를 저하시키는데 유의한 영향을 미치지 않았다 (도 13b 및 도14b (좌측 패널)). pH 방출을 또한 다른 세포주에서 유사한 적용에 사용되었던 PLGA NP와 비교하였으며, 이는 25% PEFSU acNP보다 훨씬 더 느린 산 방출 속도를 나타냈다 (도 15).
엔도좀/리소좀 구획으로의 acNP 세포 흡수 및 국소화 속도.
세포 및 리소좀으로의 acNP의 흡수 속도의 특징분석.
세포와 리소좀으로의 acNP 흡수 경로를 가시화하기 위해, acNP를 로다민으로 공유결합적으로 표지하였다 (Rho-acNP). HepG2와 INS1 세포를 Rho-acNP와 함께 24시간 동안 인큐베이션하였다. 공초점 이미지화 30분 전에, 리소좀을 표지화하는 LysoTracker Green DND-26을 첨가하여, 배양 배지 중에서 50 nmol/mL의 최종 농도를 달성하였다 (25, 26). Rho-acNP가 리소좀 내부에 국소화되었는지 여부를 결정하기 위해, Rho-acNP와 Lysotracker 녹색 염료의 공동 국소화를 정량화하였다. Rho-acNP (25% PEFSU)는 Lysotracker 녹색 염료와 공동 국소화된 것으로 나타냈으며, 이는 리소좀으로의 흡수를 나타낸다 (예를 들어, 도 16 참조).
acNP의 세포독성과 흡수.
acNP의 세포독성은 HepG2 세포주에서 결정하였다. 유의한 세포 사멸을 유도하지 않으면서 HepG2 세포를 처리하는데 유용한 최적의 acNP (PESU 및 25% PEFSU) 농도를 결정하기 위해, 10 μg/mL 내지 1000 μg/mL 범위의 다양한 농도의 acNP를 사용하여 24시간 동안 용량 반응 세포 세포독성 검정을 수행하였다. 상이한 농도 처리 조건 하에서 생존 세포의 백분율을 팔미테이트 또는 acNP로 처리되지 않은 세포인 대조군에 대하여 정규화하였다. 2가지 유형의 acNP는 1000 μg/mL 이하의 농도에서 유의한 세포 사멸을 유도하지 않았다 (도 17a). 임의의 세포독성을 회피하기 위한 추가 검정을 위해 선택된 최적 용량은 100 μg/mL였다.
리소좀에 국소화된 acNP.
acNP의 간세포로의 적시 흡수와 리소좀에 대한 특이적 국소화는, 이의 효과를 시험관 내에서 발휘하기 위해 중요하다. (약 100 nm)의 acNP의 크기가 엔도좀-리소좀 시스템 내에서 흡수와 국소화로 이어질 것으로 예상되었다. 100 μg/mL의 선택된 농도를 사용하여, 로다민 표지된 acNP (Rho-acNP)를 HepG2 세포와 함께 24시간 동안 인큐베이션하였다. 유세포 분석법으로, 대부분의 Rho-acNP 흡수가 처음 8시간 내에 일어났다고 결정하였다 (도 17b). LysoSensor™ 청색 염료를 이용한 공동 국소화 공초점 현미경법은, Rho-acNP가 HepG2 세포에서 리소좀에 국소화되었다는 것을 확인시켜 주었다 (도 17c).
10% PEFSU acNP와및 25% PEFSU acNP는 지방산에 노출된 HepGs 세포에서 리소좀 pH와 세포 생존율을 회복시킴
pH에 따라 방출이 달라지는 LysoSensor™ 황색/청색 염료를 사용하여 공초점 이미지화를 통해 세포를 모니터링함으로써, 간세포와 β-세포에서 기능장애 리소좀을 산성화시키는 acNP의 능력을 정량화하였다. 세포를 소 혈청 알부민 (BSA)과 복합체화된 4:1 팔미테이트 (4:1 팔미테이트:BSA) 400 μM와 함께 인큐베이션하고, 0.1 내지 1000 μg/mL 범위의 상이한 농도를 갖는 상이한 acNP와 함께 16 내지 18시간 동안 (HepG2 세포의 경우 16시간이고, B 세포의 경우 18시간임) 동시 인큐베이션하였다. acNP로만 처리된 세포와 함께, 팔미테이트 또는 acNP가 첨가되지 않은 세포를 대조군으로 사용하였다. B 세포의 경우, 팔미테이트:BSA 처리에 대하여 20 또는 24시간과 비교하여 18시간 시점을 선택하였으며, 이러한 시점은 세포에서 가장 높은 리소좀 pH 알칼리화를 유도하였다 (10). 처리 후, 1 μM의 LysoSensor™ 황색/청색 염료를 첨가하고, 알칼리화를 최소화하기 위해 세포를 염료 첨가 5분 내에 이미지화하였다. 비율 값을 이전에 결정된 표준 곡선을 기반으로 리소좀 pH에 대하여 보정하였다(14). 16시간 동안 팔미테이트로 처리된 HepG2 세포는 리소좀 pH의 유의한 상승 (약 0.6 pH 단위)을 거쳤다.
결과는, 10% PEFSU 또는 25% PEFSU (각각, 폴리에스테르 1과 4)로 구성된 acNP의 존재 유무 하에서 동시 인큐베이션한 4:1 팔미테이트:BSA로 처리된 HepG2 세포가, BSA 대조군과 유사한 리소좀 pH의 유의한 회복을 나타냄을 보여준다 (도 18a 및 18b).
팔미테이트-BSA (4:1 비)와 다양한 농도 (0.1 내지 1000 ug/mL)의 acNP와 함께 24 내지 72시간 동안 인큐베이션 후, 세포를 평가하였다. 팔미테이트-BSA와, 10% PEFSU 또는 25% PEFSU (각각, 폴리에스테르 1과 4)의 acNP로 처리된 HepG2 세포의 예비 데이터는, 미처리 대조군과 비교하여 세포 생존율의 유의한 구제를 나타냈다 (도 18c).
acNP는 팔미테이트에 노출된 간세포에서 리소좀 pH와 크기를 회복시킴.
acNP 기능과 리소좀으로의 세포 흡수를 입증하는데 있어서, 필수적인 질문은 acNP가 LT에 노출된 세포에서 리소좀 산도를 회복시킬 수 있는지 여부이다. HepG2 세포를 25% PEFSU acNP의 존재 유무 하에서 BSA 또는 BSA와 복합체화된 0.4 mM 팔미테이트(Palm:BSA)에 노출시켰다 (도 19a). 인큐베이션 후, LysoSensor™ 황색/청색 염료 (ThermoFisher Scientific)를 75nM 농도로 첨가하고, 리소좀 산도와 크기를 공초점 이미지화로 평가하고, 리소좀 알칼리화를 방지하기 위해 염료 첨가 5분 내에 MetaMorph®를 이용하여 이미지 분석을 수행하였다.
리소좀의 LysoSensor™ 염색의 특이성을 입증하기 위해, 세포를 이미지화 전 2시간 동안 100 μM 바필로마이신으로 처리하였고, 이는 리소좀 pH의 중화로 인해 LysoSensor™ 염색을 나타내지 않았다 (도 19b). 도 18c는, 팔미테이트 노출이 리소좀 pH (□)를 0.6 pH 단위 정도로 유의하게 감소시켰음을 보여준다. 팔미테이트에의 노출은 또한 BSA 처리된 세포와 비교하여 리소좀 크기 (◇)를 증가시켰다. PESU acNP로의 처리는 도 14b에서와 일치하게 pH의 감소를 유도하지 않았으며, 이는 분해와 산 방출의 속도가 느리다는 것을 나타낸다. 한편, 25% PEFSU acNP로의 처리는, 각각, HepG2 세포에서 0.3 및 0.5 pH 단위의 감소를 유도하였다 (도 19c). 25% PEFSU acNP의 첨가는 또한, 아마도 자가포식을 통한 리소좀의 증가된 전환으로 인해, 평균 리소좀 크기의 유의한 감소를 야기하였다.34
1 mg/ml의 농도로 사용될 때 리소좀을 산성화시키는 것으로 이전에 확인되었던 PLGA 나노입자로의 처리는, 1 mg/ml 농도의 팔미테이트 하에서39 리소좀 산도를 부분적으로 회복시켰다 (도 20). 이에 비해, 25% PEFSU acNP는 10배 더 낮은 100 μg/ml의 농도에서 리소좀 산도를 회복시켰다. 리소좀 카텝신의 활성은 pH 의존적이며, 연구에 따르면, 지방산에의 노출은 카텝신 활성을 저해시켰다.16,34
acNP가 팔미테이트 인큐베이션된 세포에서 리소좀 효소 카텝신 L 활성을 회복시키는지를 결정하기 위해, 매직 레드 카텝신 L 형광 기질 검정을 수행하였다. 결과는, 25% PEFSU acNP를 이용한 리소좀 산도의 회복이 리소좀 카텝신 L의 pH 의존적 활성을 유의하게 증가시켰음을 보여주었다. 카텝신 L 활성의 이러한 증가는 acNP 미처리된 팔미테이트-인큐베이션된 세포와 비교하여, acNP 처리된 팔미테이트-인큐베이션된 세포에서 매직 레드 형광 강도의 증가와 상관관계가 있었다 (도 18) 이는, 리소좀 산도의 감소가 16시간 이내에 지질독성 하에서 리소좀의 기능을 구제한다는 것을 추가로 확인시켜준다.
acNP에 의해 제어된 리소좀 산성화는 지방산에 노출된 HepG2 세포에서 자가포식 흐름을 회복시킴.
자가포식소체 형성 동안, 포스파티딜에탄올아민은 시토졸 LC3 (즉, LC3-I)에 접합되어, 자가포식소체 막에 격리되어 있는 LC3-II를 형성한다. 따라서, LC3-II 축적은 자가포식소체 축적에 대한 대용 마커로서 작용한다 (도 1 참조). 리소좀 산도의 회복이 팔미테이트에 노출된 HepG2 세포에서 자가포식 흐름의 저해를 완화시켰는지를 조사하기 위해, 미세소관 관련 단백질 1A/1B 경쇄 3 (LC3-II)의 세포내 축적을 측정하였다. 자가포식 분해에 대한 acNP의 영향을 추가로 확인하기 위해, 자가포식 동안 분해되고, 자가포식 흐름에 대한 마커로서 사용되는 단백질인 p62 단백질의 수준을 또한 측정하였다.44 팔미테이트가 HepG2 세포에서 자가포식 흐름의 저해를 야기하는데 필요한 시간의 양을 확인하고 결정하기 위해, HepG2 세포를 팔미테이트와 함께 16시간, 20시간 또는 24시간 동안 인큐베이션하고, LC3II와 p62의 발현 수준을 웨스턴 블롯을 사용하여 분석하였다 (20시간과 24시간에 대한 데이터는 제시되지 않음). 16시간에서, 팔미테이트 노출은 LC3II와 p62 수준을 증가시켰으며, 이는 자가포식 흐름의 저해와 자가포식 기질의 축적을 나타낸다 (도 21a). HepG2 세포와 PBSU acNP의 16시간 동안의 인큐베이션은, LC3II와 p62 발현 수준의 유의한 변화를 초래하지 않았다 (데이터는 제시되지 않음). 25% PEFSU acNP로의 처리는 LC3II 수준을 유의하게 감소시켰으며, 이는 자가포식소체의 청소를 나타낸다 (도 21a 내지 21c). 25% PEFSU acNP는 또한 p62 수준을 유의하게 저하시켰다.
도 22는, 만성적으로 팔미테이트에 노출된 HepG2 세포에서 10% PEFSU 뿐 아니라 25% PEFSU가 카텝신 L 활성을 국소화하고 회복시켰음을 보여준다. 리소좀 산도의 증가를 통한 자가포식 흐름 회복의 효과를 추가로 정확하게 나타내기 위해, 세포를 리소좀 pH를 상승시킨 V-ATPase 저해제인 바필로마이신으로 2시간 동안 처리하였다. LC3II와 p62 수준은 처리 시 유의하게 증가하였다. 이는, 리소좀 pH의 감소로 인해 acNP가 자가포식을 증가시켰음을 나타낸다. 한편, 리소좀과의 융합 시 자가포식소체 내용물의 분해를 방지하는 리소좀 프로테아제 저해제인 류펩틴(leupeptin)으로 처리된 세포는, 또한 LC3II와 p62 수준의 증가된 수준을 나타냈다. 결과는, acNP에 의한 자가포식의 회복이 리소좀 프로테아제의 활성에 의존함을 보여주었다. 리소좀 효소의 분해는 산도를 증가시켰으며, 이는 리소좀 pH을 저하시켜 자가포식을 증가시키는데 중요하다.
acNP에 의해 제어된 리소좀 산성화는 지질 액적 축적을 감소시킴.
생체내 리소좀 산성화의 약리학적 저해는 지방간과 간세포 내 지질 액적의 축적을 초래하고, 이는 인슐린 내성의 발달에 원인이 되는 역할을 한다.
자가포식이 지질 액적을 소비하기 (지질포식) 때문에, 본 발명자들은, acNP에 의한 자가포식의 활성화가 지질포식을 증가시킴으로써 간세포에 대한 지질 부담을 감소시킬 것이라는 가설을 세웠다. 세포 당 지질 액적 함량을 측정하기 위해, HepG2 세포를 acNP의 존재 유무 하에서 팔미테이트로 처리하고, 나일 레드 (ThermoFisher Scientific) 염색을 사용하여 지질 액적을 살아있는 세포에서 가시화하였다. BSA 조건 하의 HepG2 세포는 10개의 기저 지질 액적 수를 가졌지만, 팔미테이트로의 처리는 지질 액적의 수를 세포 당 약 20 내지 25개로 유의하게 증가시켰다. 25% PEFSU로의 HepG2 세포의 동시 처리는 지질 액적의 축적을 세포 당 15개로 감소시켰으며, 이는 지질포식의 증가와 지질 축적의 역전을 나타낸다 (도 23a 및 23b).
간세포에 의한 포도당 생산을 감소시키는 인슐린의 능력은 비만인 인슐린 내성 인간에서 감소되며, 이는 간 지질 축적과 강한 상관관계가 있다.47 포도당신합성 능력을 평가하기 위해, 간세포를 기재된 바와 같은 다양한 조건 하에서 처리하였다. 다음으로, 이를 2 mM 소듐 피루베이트와 20 mM 락테이트에 16시간 동안 급성 노출시켰다. 10 nM 인슐린으로의 간세포의 처리 후 10시간에 걸쳐 배지 포도당 수준 (2NBDG)을 모니터링함으로써, 포도당신합성의 인슐린 저해를 측정하였다. 포도당신합성의 인슐린 저해는 10 nM 인슐린으로의 간세포의 처리 후 3시간에 걸쳐 배지 포도당 수준을 모니터링함으로써 측정된다. 도 23c는, 포도당 유사체인 2-NBDG 흡수를 나타낸다. 인슐린의 첨가는 포도당 (2-NBDG) 흡수의 증가를 통해 포도당신합성을 저해하였다. 팔미테이트 첨가는 포도당 흡수를 감소시켰고, acNP의 첨가는 포도당 흡수를 증가시켜 포도당신합성을 저해하였다.
acNP는 NAFLD의 고지방 식이 마우스 모델에서 혈청 트리글리세리드 수준을 감소시킴
본 발명의 acNP가 시험관 내에서 기능성라는 것을 나타내기 위해, aNAFLD의 마우스 모델에서 acNP의 독성과 효능을 시험하였다. C57BL/6J DIO 마우스 (Jackson Laboratory)는 NAFLD의 생체내 모델로서 16주 동안 고지방 식이 (HFD) (D12492: 지방으로 60% kcal 에너지, Research Diets, Inc)를 공급받았다. HFD 마우스에게 100mg/kg/일의 acNP (저용량) 또는 300mg/kg/일의 acNP (고용량)를 함유한 멸균 식염수 용액의 단일 정맥내 주사를 6일 동안 하루 또는 2일에 한번 투여하였다. 각각의 처리 종료 시, 마우스를 희생시키고, 알라닌 아미노 트랜스퍼라아제 (ALT)와 빌리루빈 (BIL) 수준뿐 아니라 트리글리세리드 (TRIG) 수준의 변화에 대하여 혈청을 시험하였다. 혈청 중 ALT와 BIL 혈청 수준은 간 손상을 나타낸다. 1일차 (24시간) 또는 6일차에서 저용량 또는 고용량 acNP의 첨가는, HFD 대조군과 비교하여 혈청 ALT와 BIL 수준을 유의하게 변화시키지 않았다. 하지만, 혈청 트리글리세리드 수준은 6일의 처리 후 저용량 또는 고용량의 acNP의 첨가에 의해 유의하게 감소하였다 (도 24a 및 24b).
acNP는 NAFLD의 고지방 식이 마우스 모델에서 지질 액적 수준을 감소시킴
대표적인 마우스 간 조직 절편을 입수하고, H & E 3색 염색을 사용하여 지질 액적 축적 (지방증)의 양을 평가하였다 (도 25). HFD 대조군에서, 간 절편은 주목할 만한 확대된 간세포 영역과 지질 액적 축적을 나타냈다. 저용량 acNP 또는 고용량 acNP로의 6일 동안의 처리는 지질 액적 축적이 유의하게 감소됨을 보여준다 (도 25).
요약하면, 산 방출의 속도와 정도를 조절하거나 제어하기 위해, 본 발명자들은 디올의 사슬 길이를 변화시키거나, 테트라플루오로숙신산 대 숙신산의 비를 증가시킴으로써, 상이한 폴리에스테르를 합성하였다. 또한, 이러한 새롭게 합성된 중합체를 기반으로 상이한 나노입자를 합성하고 특징분석하였다. 본 발명자들은, 디올 길이를 증가시키는 것은 산 방출 속도를 감소시키며, 숙신산에 대한 테트라플루오로숙신산의 양을 증가시키는 것은 방출되는 산의 양을 증가시킨다는 것을 발견하였다. 간략하게, 에틸렌 글리콜 기반 나노입자 (PEFSU)는 가장 높은 산 방출 및 분해 속도를 나타낸 반면, 부틸렌 글리콜 기반 나노입자는 가장 느린 속도를 나타냈다. 나노입자의 제조를 위한 파라미터가 또한 중합체 특성과 강한 상관관계가 있다. 리소좀 pH 기능장애 질환에 대한 상이한 치료법을 위한 생체내 치료 전략을 개발하기 위해, 상이한 폴리에스테르 기반의 나노입자를 리소좀에서 세포독성과 산 회복 정도에 대하여 평가하였다.
물질 및 방법
acNP 중합체 합성 및 특징분석
이산(diacid) 단량체인 테트라플루오로숙신산 (Matrix Scientific), 숙신산 (Sigma Aldrich)을 둥근 바닥 플라스크에 상이한 비율로 첨가하였다. 에틸렌 글리콜 (Sigma Aldrich)을 금속 촉매인 티타늄 이소프로폭시드 (TIPT) (Sigma Aldrich)와 함께 5 또는 10 mol% 과량으로 첨가하고, 120℃에서 16시간 동안 공비 증류하였다. 이어서, 과량의 거품형성을 방지하고, 올리고머 승화를 최소화하기 위해 서서히 진공을 적용하고, 과량의 물을 제거하고, 추가로 축합시켜, 고분자량 중합체 사슬을 형성하였다. 온도를 12시간 이상 동안 130 내지 140℃까지 증가시켰다. 반응을 중단시키고, 최종 생성물을 냉각된 디에틸 에테르에 침전시키고, 추가 저장 및 사용을 위해 고진공 하에서 건조시켰다.
중합체 특징분석 (NMR 및 GPC)
1H, 13C 및 19F NMR 스펙트럼은 Agilent 500 MHz VNMRS 분광계에서 기록하였다. CDCl3을 용매로서 사용하였다. 상이한 중합체에 대한 핵 자기 공명 (NMR) 화학적 이동을 결정하였다:
1H NMR [(500 MHz, CDCl3): PESU 2.66 (s, 1H), 4.29 (s, 1H)], [25% PEFSU 2.66 (s, 1H), 4.29 (s, 0.69H), 4.37 (s, 0.25H), 4.56 (s, 0.25H), 4.65 (s, 0.06H)]. 13C NMR [(500 MHz, CDCl3): PESU, 62.35, 76.76], [25% PEFSU 29.66, 61.37, 62.35, 65.37, 76.77, 107.89, 159.06]. 19F NMR [(500 MHz, CDCl3): 25 % PEFSU -119.9, -120.6].
1H NMR [(500 MHz, CDCl3): PBSU 1.58 (s, 1H), 1.70 (s, 2H), 2.62 (s, 2H), 4.11 (s, 2H)], [50% PBFSU 1.70 (m, 2H), 1.86 (m, 2H), 2.62 (s, 2H), 4.11 (m, 2H), 4.38 (m, 2H)], [100% PBFSU 1.86 (s, 1H), 4.39 (s, 1H)].13C NMR [(500 MHz, CDCl3): PBSU, 25.19, 28.99, 64.15, 77.28], [50% PBFSU 25.17, 28.95, 64.18, 67.52, 76.76, 107.98, 159.29], 100% PBFSU 24.48, 67.17, 76.74, 107.97]. 19F NMR [(500 MHz, CDCl3): 50 % PBFSU -124.18, -121.40- -119.28], 100% PBFSU -120.04.
25℃에서, Waters 410 굴절률 검출기, Waters 515 HPLC 펌프 및 3개의 UltraStyragel 컬럼이 장착된 겔 투과 크로마토그래피 (GPC)에서 1.0 mL/분의 유량으로 용리액으로서 THF를 이용하여, 평균 분자량 (Mn)과 다분산도 (PDI)를 측정하였다. 단분산 폴리스티렌 표준물질을 보정물질로서 사용하였다.
acNP 나노입자 합성 및 특징분석
나노침전을 사용하여 acNP 중합체로부터 acNP를 형성하였다. 간략하게, PESU 또는 25% PEFSU 또는 PBFSU 중합체 5 내지 8mg를 디메틸포름아미드 (DMF) (Sigma Aldrich) 0.5 내지 0.6mL에 용해시키고, 0.2 μm 시린지 필터 (Millipore)를 통해 여과하여 큰 응집물 또는 먼지를 제거하였다. 계면활성제인 소듐 도데실 술페이트 (SDS) (Sigma Aldrich) (30 내지 32mg)를 나노퓨어 워터 (Millipore, 엔도톡신 미함유) 2 내지 4mL에 용해시키고, 1k 내지 1.7k 또는 1k 내지 1.3k rpm의 고속으로 교반하였다. 이어서, DMF 중의 중합체 용액을 고속으로 교반 중인 수용액에 적가하였다. 적가 직후, 에멀젼을 SnakeSkin 투석 튜브 (MWCO 10KDa)에 넣고, 6 내지 24시간 동안 나노퓨어 워터에 대하여 투석하였다. 동적 광 산란 (DLS) 측정의 경우, 200uL의 용액을 2.8mL의 탈이온수에 희석하고, Brookehaven 동적 광 산란 기기로부터 크기와 제타 전위를 얻었다. 모든 측정은 3중으로 수행하였다 (n = 3).
주사 전자 현미경
acNP를 탈이온수 중에 100배 희석하였다. 분취액을 실리콘 웨이퍼 상에 플레이팅하고, 밤새 공기 건조시켰다. 상기 웨이퍼를 구리 테이프를 이용하여 알루미늄 조각에 고정시키고, 5 nm Au/Pd로 스퍼터 코팅하였다. 이러한 샘플을 가속 전압이 2 kV이고, 작동 거리가 5.5 cm 또는 6.0 cm인 Supra 55VP 전계 방사 주사 전자 현미경 (ZEISS)을 사용하여 이미지화하였다. 겔 투과 크로마토그래피
30℃에서, Agilent-DRI 굴절률 검출기와 3개의 컬럼: 1개의 PL gel 10 μm 가드 컬럼과 2개의 PL gel Mixed-D 10 μm 컬럼 (MWPS가 500 내지 106 g/mol 범위인 선형 컬럼)이 장착된 SEC (Agilent 1200 SEC)를 이용하여, 분자량 분포 (MWD)를 측정하였다. 테트라히드로푸란을 용매로서 사용하였다. 샘플 용액의 농도는 약 1 mg/mL였고, 용리액의 유량은 1 mL/분이었다. 폴리스티렌 표준물질을 보정물질로서 사용하였다.
시차 주사 열량분석 및 열중량 분석 (DSC & TGA)
표준 가열-냉각-가열 방식으로 Q200 열 분석기 (TA Instruments)에서 DSC로 열 전이를 기록하였다. 가열 속도는 10℃/분이었고, 냉각 속도는 5℃/분이었다. TGA (Q500, TA Instruments)로 열 분해 거동을 기록하였다. 샘플을 N2 분위기 하에서 20℃/분의 속도로 실온에서 600℃까지 가열하였다.
분해 검정
부틸렌 계열의 폴리에스테르에 대하여 분해 검정을 수행하였다. 먼저, 부틸렌 계열의 acNP를 제조하고, 물 또는 혈청 중에 현탁시키고, 37℃에서 시간에 결쳐 인큐베이션하였다. 특정 시점에서, acNP를 함유한 용액을 원심분리하고, 펠릿을 N2 분위기 하에서 밤새 건조시키고, GPC를 사용한 분석을 위해 THF 용매에 재용해시켰다.
세포 배양 및 세포독성
HepG2 세포를 10% FBS, 1mM 글루타민, 50유닛(unit)/ml 페니실린 및 50g/ml 스트렙토마이신이 보충된 DMEM 배지에서 배양하였다. 일부 연구에서는, 1차 배양 간세포를 ATCC에서 입수하고, 10% FBS, 1mM 글루타민, 50유닛/ml 페니실린 및 50g/ml 스트렙토마이신이 보충된 DMEM 배지에서 유지시켰다. MTS 세포 증식 검정 (Abcam)을 사용하여 acNP의 세포독성을 평가하였다. HepG2 또는 1차 배양 간세포를 96-웰 플레이트에 웰 당 15000개의 세포로 1일 동안 배양한 후, 배지를 미처리 또는 0, 50, 250, 500 또는 1000 μg/mL의 acNP를 함유한 배지로 교환하였다. 이어서, 세포를 24시간 동안의 처리와 함께 인큐베이션한 후, 배경 흡광도를 보정한 후 세포 생존율을 미처리 (대조군)에 대하여 정량화하였다. 처리 농도 당 3개의 웰을 사용하였고, 검정은 3회 반복하였다.
팔미테이트:BSA 제제
팔미테이트를 DMSO (Millipore)에 용해시켰다. 이러한 용액을 45℃에서 6.7% 지방산 미함유 BSA (EMD Millipore)를 함유한 MEM 배지에 용해시켜, 4 mM (10x) 스톡을 제조하였다. 대조군 BSA 조건의 경우, 5% BSA와 1% DMSO를 함유한 MEM 배지의 10x 스톡을 사용하였다. 처리 조건의 경우, 10x 스톡을 1% FBS, 50 U/ml 페니실린 및 50 g/ml 스트렙토마이신과, 10 mM의 포도당을 함유한 MEM 배지에 첨가하였다. 이어서, 처리 배지의 pH를 7.4로 조정한 후, 멸균 여과하고, HepG2 세포를 acNP의 존재 유무 하에서 팔미테이트로 16시간 동안 처리하였다.
유세포 분석법
620 FACScan을 사용하여, 로다민-표지된 acNP 처리된 세포의 FACS 분석을 수행하였다. FACS 데이터 분석은 FACScalibur (Beckman Coulter)를 사용하여 수행하였다. 세포를 트립신처리하고, 원심분리에 의해 PBS로 2회 세정하고, 유세포 분석법에 적용하였다. 전방 및 측방 산점도에서 게이팅하여 세포 잔해를 제외시켰다.
LysoSensor™ 염색 및 이미지 분석
공동 국소화 이미지화의 경우, 세포를 먼저 Rho-acNP와 함께 24시간 동안 인큐베이션하고, DND-22 염료인 LysoSensor™ 청색을 제조업자의 프로토콜에 따라 2시간 동안 첨가하였다. 이어서, 세포를 새로운 배지로 교체하고, 공초점 현미경을 사용하여 이미지화하여, 로다민과 Lysosensor 청색 신호 중첩의 양을 결정하였다. 리소좀 pH 결정의 경우, 세포를 1 μM LysoSensor™ 황색/청색으로 5분 동안 염색한 후, 360 nm 여기를 사용하여 공초점 이미지화를 수행하고, 황색 파장 범위 (510 내지 641 nm)와 청색 파장 범위 (404 내지 456 nm)에서 이미지를 수집하였다. 황색과 청색 사이의 비는 MetaMorph® 소프트웨어를 사용하여 계산하였다. 간략하게, 중간값 필터를 사용하여 배경 노이즈를 제거한 후, 역치화하여 개별 리소좀을 식별하였다. 식별된 리소좀에 대하여 평균 황색 및 청색 형광 강도를 수득하고, 황색/청색 비율 값을 계산하였다. 다양한 pH의 2-(N-모르폴리노)에탄술폰산 완충액에서 LysoSensor™ 형광을 이미지하고, pH에 대한 LysoSensor™ 형광 비율의 표준 곡선을 확립함으로써, pH 변화의 정량화를 달성하였다. ΔpH 값이 제시되는 경우, 별도의 표준 곡선은 얻지 못했지만, 이전 표준 곡선 방정식을 사용하여 LysoSensor™ 비의 변화를 ΔpH로 전환시켜, 절대 pH 값이 아닌 상대적 pH 변화를 계산할 수 있었다. 도시된 대표적인 이미지의 경우, 황색과 청색 LysoSensor™ 이미지를 분할함으로써 비율 이미지를 생성하였고, 가시화를 개선하기 위해 모든 이미지에 대하여 콘트라스트(contrast)를 동일하게 조정하였다. LysoSensor™ 비율 변화의 해상도를 증가시키기 위해 의사채색(Pseudocoloring)을 적용하였다.
매직 레드 카텝신 L 활성 검정
세포를 10 μg/ml 매직 레드 카텝신 L (MR-카텝신 L; Immunochemistry Technologies)로 1시간 동안 염색하였다. 세포를 PBS로 3회 세정하고, Celigo 이미지화 세포 계수기(Imaging Cell Cytometer) (Brooks Life Science Systems)를 사용하여 이미지화하였다. 각각의 웰에 대하여 적색 (531/40 여기; 629/53 방출) 형광 채널을 이미지화하였다. 형광을 기반으로 개별 세포를 식별하기 위해, Celigo 이미지화 세포 계측기에 의해 획득된 이미지에 대한 분석 파라미터를 최적화하였다. 식별된 세포 영역에 포함된 배경 픽셀로부터 오차를 배제하기 위해, 세포 당 평균 형광 강도 값을 세포 당 평균 통합 강도 값에 따라 결정하였다. 웰 당 적어도 1,000개의 세포를 실험 당 3 내지 4회 반복하여 분석하였다.
웨스턴 블롯
Trudeau 등에 의해 기재된 바2와 같이 샘플을 제조하였다. 샘플을 4 내지 12% 폴리아크릴아미드 겔 (Invitrogen) 상에 로딩하고, 습식 (탱크) 이송 기계를 사용하여 폴리비닐리덴 디플루오라이드 막 (Invitrogen) 상에 옮겼다. LC3 (세포 신호전달), GAPDH (세포 신호전달) 및 p62 (세포 신호전달) 항체를 제조업자의 지침에 따라 사용하였다.
간세포에서의 포도당 생산
Herzig등에 의해 기재된 바3와 같이 포도당 생산 검정을 수행하였다. 간략하게, 세포를 배양하고, 상이한 처리 조건 하에서 인큐베이션하였다. 이어서, 세포 배지를 20 mM 소듐 락테이트와 2 mM 소듐 피루베이트가 보충된 포도당 및 페놀 미함유 DMEM (pH 7.4)로 16시간 동안 교환하였다. 처리 종료 3시간 전에 10nM 인슐린을 첨가하고, 처리 종료 10분 전에 2-NBDG를 첨가하였다. 포도당 흡수 검정 키트 (Cayman Chemicals)를 사용하여 포도당 함량을 측정하였다.
통계
연구 결과의 유의성을 결정하기 위해 사전결정된 통계 방법을 사용하였다. 세포독성, 리소좀 pH와 크기, 자가포식 흐름, 단백질 발현 수준, 세포 당 지질수 등을 평균 ± 표준편차로 표시하였다. Origin Lab Pro 8.5 소프트웨어를 사용하여 통계 분석을 수행하였고; 양방향 P 값이 0.05 미만인 경우 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.
본원의 실시예 및 구현예는 단지 예시의 목적이며, 이에 대한 다양한 변경 또는 변화는 당업자에게 명백할 것이고, 이는 본 출원 및 첨부된 청구범위의 범위의 사상 및 범주 내에 포함된다는 것을 이해해야 한다. 따라서, 본 발명의 범위는 상기 설명을 참조로 결정되어야 할 뿐 아니라, 첨부된 청구범위를 참조로, 이러한 청구범위가 부여되는 등가물의 전체 범위와 함께 결정되어야 한다. 본원에 인용된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 모든 목적을 위하여 그 전문이 본원에 참조로서 인용된다.

Claims (49)

  1. 폴리에스테르 및 테트라플루오로숙신산(TFSA)을 포함하고,
    pH가 pH 6.0인 환경에 노출될 때 산을 방출하는,
    산 방출성 플루오르화 폴리에스테르 나노입자.
  2. 제1항에 있어서, pH 7.0의 pH에서 산을 방출하지 않는, 나노입자.
  3. 제1항에 있어서, 숙신산(SA)을 추가로 포함하고,
    선택적으로, TFSA 대 SA의 몰비가 100:0 (TFSA:SA) 내지 10:90 (TFSA:SA) 범위인, 나노입자.
  4. 제3항에 있어서, 상기 TFSA 대 SA의 몰비는 10:90, 15:85, 20:80, 25:75, 30:70, 35:65, 40:60, 45:55, 50:50, 55:45, 60:40, 65:35, 70:30, 75:25, 80:20, 85:15, 90:10, 95:5, 또는 100:0의 비를 포함하는, 나노입자.
  5. 제1항에 있어서, 상기 폴리에스테르는 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 및 부틸렌 글리콜에서 선택되는 디올을 포함하는, 나노입자.
  6. 제1항에 있어서, 상기 나노입자는 몰%로서
    폴리(에틸렌 숙신-코-테트라플루오로숙시네이트)(PEFSU; poly(ethylene tetrafluorosuccinate-co-succinate) 내 10% TFSA, PEFSU 내 15% TFSA, PEFSU 내 20% TFSA, PEFSU 내 25% TFSA, PEFSU 내 30% TFSA, PEFSU 내 35% TFSA, PEFSU 내 40% TFSA, PEFSU 내 45% TFSA, PEFSU 내 50% TFSA, PEFSU 내 55% TFSA, PEFSU 내 60% TFSA, PEFSU 내 65% TFSA, PEFSU 내 70% TFSA, PEFSU 내 75% TFSA, PEFSU 내 80% TFSA, PEFSU 내 85% TFSA, PEFSU 내 90% TFSA, PEFSU 내 95% TFSA, PEFSU 내 100% TFSA; 또는
    폴리(프로필렌 숙신-코-테트라플루오로숙시네이트)(PPFSU; poly(propylene tetrafluorosuccinate-co-succinate) 내 10% TFSA; PPFSU 내 15% TFSA, PPFSU 내 20% TFSA, PPFSU 내 25% TFSA, PPFSU 내 30% TFSA, PPFSU 내 35% TFSA, PPFSU 내 40% TFSA, PPFSU 내 45% TFSA; PPFSU의 50% TFSA; PPFSU 내 55% TFSA, PPFSU 내 60% TFSA, PPFSU 내 65% TFSA, PPFSU 내 70% TFSA, PPFSU 내 75% TFSA, PPFSU 내 80% TFSA, PPFSU 내 85% TFSA, PPFSU 내 90% TFSA, PPFSU 내 95% TFSA, PPFSU 내 100% TFSA; 또는
    폴리(부틸렌 숙신-코-테트라플루오로숙시네이트)(PBFSU; poly(butylene tetrafluorosuccinate-co-succinate) 내 10% TFSA; PBFSU 내 15% TFSA, PBFSU 내 20% TFSA, PBFSU 내 25% TFSA, PBFSU 내 30% TFSA, PBFSU 내 35% TFSA, PBFSU 내 40% TFSA, PBFSU 내 45% TFSA; PBFSU의 50% TFSA; PBFSU 내 55% TFSA, PBFSU 내 60% TFSA, PBFSU 내 65% TFSA, PBFSU 내 70% TFSA, PBFSU 내 75% TFSA, PBFSU 내 80% TFSA, PBFSU 내 85% TFSA, PBFSU 내 90% TFSA, PBFSU 내 95% TFSA 또는 PBFSU 내 100% TFSA
    를 포함하는, 나노입자.
  7. 제1항에 있어서, 상기 나노입자는 평균 직경이 25nm 또는 50 nm 내지 200 nm 또는 150 nm 범위이거나, 평균 직경이 100 nm 미만인, 나노입자.
  8. 제1항에 있어서, 상기 나노입자 집단의 PDI(다분산 지수; polydispersity index)가 0.2 이하 또는 0.14 이하인, 나노입자.
  9. 제1항에 있어서, 상기 나노입자는 세포와 접촉될 때, 세포내이입 경로를 통해 리소좀에 흡수되는 크기와 제타 전위를 갖는, 나노입자.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 나노입자 또는 복수의 상기 나노입자는, 세포에 의해 흡수될 때, 리소좀 산성화를 손상시키는 조건 하에 있는 세포에서 자가포식 흐름(autophagic flux)을 회복시키는데 효과적이거나, 세포에서 리소좀-자가포식소체(autophagosome) 융합 능력을 증강시키는데 효과적이고, 또는
    상기 나노입자 또는 복수의 상기 나노입자는 지방산에 노출된 간세포 또는 지방산에 노출된 B 세포에서 리소좀 기능의 단기 및/또는 장기 회복을 유도하는데 효과적이거나, 상기 나노입자 또는 복수의 상기 나노입자의 집단이 간세포 지질 함량을 정상화시키는데 효과적이거나, 상기 나노입자 또는 복수의 상기 나노입자의 집단이 포도당에 반응하여 인슐린을 분비하는 B 세포의 능력을 증강시키는데 효과적인,
    나노입자.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 복수의 나노입자, 및
    약학적으로 허용 가능한 담체
    를 포함하고,
    선택적으로, 단위 투여량 제제인, 약학적 제제.
  12. 제11항에 있어서, 상기 약학적 제제가 경구 전달, 이소포렉틱(isophorectic) 전달, 경피 전달, 비경구 전달, 에어로졸 투여, 흡입을 통한 투여, 정맥내 투여, 또는 직장 투여용으로 제제화된 것인, 약학적 제제.
  13. 포유동물의 세포에서 자가포식을 촉진하는데 사용하거나, 리소좀 기능의 회복에 유리하게 반응하는 포유류에서 병리 치료에 사용하거나, 손상된 리소좀 산도와 관련된 질환 상태를 갖는 포유류의 치료에 사용되어,
    비만, 대사 증후군, 제2형 당뇨병(T2D), 비(非)알코올성 지방간 질환(NAFLD) 및 신경퇴행에서 선택되는 질환을 치료 또는 예방하기 위한, 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 나노입자로서,
    선택적으로, 상기 신경퇴행의 병리가 노인성 치매, 파킨슨병, 또는 알츠하이머병인,
    나노입자.
  14. 포유동물의 세포에서 자가포식을 촉진하는데 사용하거나, 리소좀 기능의 회복에 유리하게 반응하는 포유류에서 병리 치료에 사용하거나, 손상된 리소좀 산도와 관련된 질환 상태를 갖는 포유류의 치료에 사용되어,
    비만, 대사 증후군, 제2형 당뇨병(T2D), 비(非)알코올성 지방간 질환(NAFLD) 및 신경퇴행에서 선택되는 질환을 치료 또는 예방하기 위한, 제11항에 따른 약학적 제제로서,
    선택적으로, 상기 신경퇴행의 병리가 노인성 치매, 파킨슨병, 또는 알츠하이머병인,
    약학적 제제.
  15. 간 이식을 필요로 하는 포유동물에 이식될 간을 관류하는데 사용하기 위한, 제11항에 따른 약학적 제제.
  16. 제14항에 있어서, 상기 포유류가 인간인, 약학적 제제
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