JP2018534244A - 脳間質内のナノ粒子分布を改善するための組成物および方法 - Google Patents

Abstract

ＣＥＤを介して非接着性表面を保有するナノ粒子を高浸透圧の注入溶液で送達することによって、分布の改善を達成することができる。この送達戦略により、脳の細胞外マトリックスによって生じる妨害が最小限となり、血管周囲腔内に限定される治療薬の濃度が低減される。一局面において、脳を含む組織へのナノ粒子の送達のための組成物が提供され、上記組成物は、（ｉ）高浸透圧溶液と、（ｉｉ）以下：第１のポリマー、および上記第１のポリマーに連結してコンジュゲートを形成する、第２の親水性で電荷中性のポリマーを含む、ナノ粒子とを含み、上記第２の親水性かつ電荷中性のポリマーが、上記ナノ粒子の表面をコーティングし、上記高浸透圧溶液の濃度および上記親水性で電荷中性のポリマーコーティングの密度が、組織内での上記ナノ粒子の拡散および分布を強化する。

Description

関連出願への相互参照
この出願は、２０１５年９月１１日に出願された米国仮出願第６２／２１７，１９４号（これは、その全体が参考として本明細書に援用される）の利益を主張する。

連邦政府によって資金提供を受けた研究または開発に関する声明
この発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ ＨｅａｌｔｈによってＪｕｓｔｉｎ Ｈａｎｅｓに付与された助成金番号Ｒ０１ＣＡ１６４７８９および助成金番号Ｐ３０−ＥＹ００１７６５の下、政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。

本発明は、一般的に、治療剤、診断剤、または予防剤の強化送達のための組成物および方法の分野にあり、特に、脳間質におけるこれらの薬剤の広範囲の分布容積を達成するために、血管周囲腔からのそれらの逸脱を促進することによって、これらの薬剤を脳内に送達することにある。

多くの脳疾患は、脳組織全体にわたって高度に散在する病的細胞または異常な細胞外構造の存在によって特徴付けられる。このため、同様に広範な分布を達成することができるナノ粒子（ＮＰ）治療薬の開発が必要となっている（Ａｌｌａｒｄら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、２００９年、３０巻（１２号）、２３０２〜１８頁）。対流強化送達（ＣＥＤ）は、血液脳関門（ＢＢＢ）を避けるのに有効な送達戦略であり、これは、理論的には、圧力により駆動されるバルク流を利用することによって広範なＮＰ分布を達成することができる（Ａｌｌａｒｄら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、２００９年、３０巻（１２号）、２３０２〜１８頁；Ｂｏｂｏら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ、１９９４年、９１巻（６号）、２０７６〜８０頁；ＳａｉｔｏおよびＴｏｍｉｎａｇａ、Ｎｅｕｒｏｌ Ｍｅｄ Ｃｈｉｒ（Ｔｏｋｙｏ）、２０１２年、５２巻（８号）、５３１〜８頁）。しかしながら、近年の技術的画像化の進歩により、ＣＥＤを使用してナノ粒子（ＮＰ）を投与しても、依然として、治療的に好ましい分布が達成できないことが判明している（Ｋｒａｕｚｅら、Ｅｘｐ Ｎｅｕｒｏｌ、２００５年、１９６巻（１号）、１０４〜１１頁）。頭蓋内投与されたＮＰは、脳間質を通って移動し、この脳間質は、細胞間腔（ＩＣＳ）および血管周囲腔（ＰＶＳ）という２つの異なる間隙を含む。ＩＣＳにおけるＮＰの分布は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分によって生じる妨害によって制限される（Ｎａｎｃｅら、Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ、２０１２年、４巻（１４９号）、１４９ｒａ１１９）。さらに、ＮＰが、優先的に、抵抗の低い、流体で満たされたＰＶＳを通って流れ、続いてＰＶＳ内に限定されることにより、標的細胞に到達する能力は低減される（Ｋｒａｕｚｅら、Ｅｘｐ Ｎｅｕｒｏｌ、２００５年、１９６巻（１号）、１０４〜１１頁；Ｓａｌｅｇｉｏら、Ｆｒｏｎｔ Ｎｅｕｒｏａｎａｔ、２０１４年、８巻９頁）。これらが明らかになったことで、一次転帰および二次転帰を満たさなかった終了した以前のＣＥＤに基づく臨床試験について解明され（Ｋｕｎｗａｒら、Ｎｅｕｒｏ Ｏｎｃｏｌ、２０１０年、１２巻（８号）、８７１〜８１頁；Ｌａｎｇら、Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ、２００６年、５９巻（３号）、４５９〜６６頁）、ＣＥＤのために最適化された次世代のＮＰ系の開発に拍車がかかっている（Ｚｈｏｕら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ、２０１３年、１１０巻（２９号）、１１７５１〜６頁；Ｙｉｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ、２０１３年、２０巻（６号）、３３６〜４１頁）。ＣＥＤ後のＮＰ分布が不良であることに寄与する機序の理解を深めることにより、前述の障壁を克服し、脳実質内での治療用ＮＰの分布を最大化する特定の戦略の開発が可能となるであろう。

従来のように設計されたＮＰは、ＣＥＤのバルク流を介して送達した場合であっても、投与地点の近傍でのみ局在化が見出されることが多く、ＩＣＳを通って移動することができない（Ｖｏｇｅｓら、Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ、２００３年、５４巻（４号）、４７９〜８７頁）。ＩＣＳ内では、プロテオグリカンおよびグリコサミノグリカンを含む相互作用構造のナノ多孔質ネットワークからなる脳ＥＣＭ成分は（ＳｙｋｏｖａおよびＮｉｃｈｏｌｓｏｎ、Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｒｅｖ、２００８年、８８巻（４号）、１２７７〜３４０頁）、投与後に従来のＮＰと立体的および接着的に相互作用する障壁として機能する。直径が最大で１１４ｎｍまでのＮＰは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の高密度な層で遮蔽されると、脳ＥＣＭとの相互作用を最小限に抑え、健常な脳ＩＣＳ内に急速に拡散することが、これまでに実証されている（Ｎａｎｃｅら、Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ、２０１２年、４巻（１４９号）、１４９ｒａ１１９）。しかしながら、ＩＣＳ全体にわたって治療用ＮＰを分布させる拡散のみに頼ると、距離が遠くなれば最適に満たない治療濃度しか達成できない（Ａｌｌａｒｄら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、２００９年、３０巻（１２号）、２３０２〜１８頁）。

ＰＶＳは、大脳血管を包囲する脳脊髄液（ＣＳＦ）で満たされた管であり、脳内の恒常性を維持するために、代謝産物のクリアランスを担っている（Ｉｌｉｆｆら、Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ、２０１２年、４巻（１４７号）、１４７ｒａ１１１）。ＰＶＳは、多数の神経疾患において重要な役割を果たすことが示されている。アルツハイマー病では、ＰＶＳグリアリンパ系（ｇｌｙｍｐｈａｔｉｃ ｓｙｓｔｅｍ）の調節不全が、広範囲なアミロイド−βプラークの発生を引き起こす（Ｉｌｉｆｆら、Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ、２０１２年、４巻（１４７号）、１４７ｒａ１１１；Ｐｒｅｓｔｏｎら、Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ Ａｐｐｌ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ、２００３年、２９巻（２号）、１０６〜１７頁）。同様に、ＰＶＳは、最も抵抗の低い経路として、悪性神経膠腫の脳全体への移行を促進することに関係しており（Ｃｕｄｄａｐａｈら、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、２０１４年、１５巻（７号）、４５５〜６５頁；Ｂａｋｅｒら、Ｎｅｏｐｌａｓｉａ、２０１４年、１６巻（７号）、５４３〜６１頁）、それによって、腫瘍再発を引き起こすことが多い。

したがって、ＮＰがＰＶＳを通って優先的に輸送され、続いて、グリア境界膜を通ってＩＣＳ内へと放射方向に逸脱することを利用して、神経疾患の拡大を追跡することができる。脳内に投与すると、ＮＰは、ＩＣＳを通って移動する場合に、ＰＶＳを通る場合よりも高い抵抗に遭遇する（Ｃｕｄｄａｐａｈら、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、２０１４年、１５巻（７号）、４５５〜６５頁）。したがって、注入したＮＰのかなりの量がＰＶＳを通って移動することが視覚的に確認されている（Ｋｒａｕｚｅら、Ｅｘｐ Ｎｅｕｒｏｌ、２００５年、１９６巻（１号）、１０４〜１１頁；Ｂａｒｕａら、Ｆｌｕｉｄｓ Ｂａｒｒｉｅｒｓ ＣＮＳ、２０１２年、９巻（１号）、２頁）。ＰＶＳに局在化されると、ＮＰは、ＰＶＳとＩＣＳとを分離する解剖学的障壁であるグリア境界膜に起因して、そこに隔離されたままとなる（ＥｎｇｅｌｈａｒｄｔおよびＣｏｉｓｎｅ、Ｆｌｕｉｄｓ Ｂａｒｒｉｅｒｓ ＣＮＳ、２０１１年、８巻（１号）、４頁）。さらに重要なことには、ＰＶＳにおけるＮＰの蓄積および捕捉は、鼻腔内、槽内、または髄腔内の経路を使用した投与を含む、すべての利用可能な脳への送達戦略の後に生じる（Ｓａｌｅｇｉｏら、Ｆｒｏｎｔ Ｎｅｕｒｏａｎａｔ、２０１４年、８巻９頁；Ｆｏｌｅｙら、Ａｎｎ Ｂｉｏｍｅｄ Ｅｎｇ、２０１２年、４０巻（２号）、２９２〜３０３頁；ＬｏｃｈｈｅａｄおよびＴｈｏｒｎｅ、Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ、２０１２年、６４巻（７号）、６１４〜２８頁）。ＮＰがＰＶＳに限定されることは、臨床試験における治療効果の低減につながることが示唆されていることを考慮すると（Ｂａｒｕａら、Ｆｌｕｉｄｓ Ｂａｒｒｉｅｒｓ ＣＮＳ、２０１２年、９巻（１号）、２頁；Ｋｒａｕｚｅら、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ Ｐｒｏｔｏｃ、２００５年、１６巻（１〜３号）、２０〜６頁）、ＰＶＳでの隔離を低減させるのに有効な戦略が必須である。

Ｃｕｄｄａｐａｈら、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ（２０１４年）１５巻（７号）、４５５〜６５頁 Ｋｒａｕｚｅら、Ｅｘｐ Ｎｅｕｒｏｌ（２００５年）１９６巻（１号）、１０４〜１１頁 Ｂａｒｕａら、Ｆｌｕｉｄｓ Ｂａｒｒｉｅｒｓ ＣＮＳ（２０１２年）９巻（１号）、２頁

したがって、脳細胞間腔における分布が改善された組成物を提供することが、本発明の目的である。

ＰＶＳからのＮＰの逸脱が強化されることにより脳細胞間腔での分布が改善されたか、脳ＥＣＭ内での拡散が増大したか、またはその両方である、遮蔽されたＮＰを高浸透圧溶液において提供することが、本発明の別の目的である。

脳ＥＣＭによる妨害およびＮＰがＰＶＳに優先的に蓄積することを最小限に抑えるために、脳組織の浸透圧モジュレーションによって、脳細胞間腔での分布が改善された組成物を送達するための方法を提供することが、本発明のさらなる目的である。

ＰＶＳからのＮＰの逸脱が強化されることにより脳細胞間腔での分布が改善されたか、脳ＥＣＭ内での拡散が増大したか、またはその両方である、遮蔽されたＮＰを高浸透圧溶液において送達するための方法を提供することが、本発明の別の目的である。

脳間質におけるナノ粒子の分布の改善のための組成物および方法を開発した。本組成物は、ナノ粒子を、高浸透圧溶液中に含有する。ナノ粒子は、第１のポリマーと、第１のポリマーと連結してコンジュゲートを形成する親水性で電荷中性の第２のポリマーとを含有する。好ましい実施形態では、第１のポリマーは、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコール酸）である。ナノ粒子の表面は、親水性で電荷中性のポリマーまたは他のコーティング剤の高密度なコーティングでコーティングされている。親水性または電荷中性のポリマーとしては、好ましくは、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）、ポロキサマー（ポリエチレンオキシドブロックコポリマー）、ポリソルベート８０、またはこれらの組合せが挙げられる。好ましい実施形態では、高密度なコーティングは、ＰＥＧである。高密度なコーティングは、ナノ粒子と脳細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の成分との接着を減少させることによって、脳間質内でのナノ粒子の分布を強化する。ナノ粒子は、２００ｎｍ未満であることが好ましく、１５０未満であることがより好ましく、１００ｎｍ未満であることが最も好ましい。実施例において、ナノ粒子は、１１４ｎｍ、８０ｎｍもしくは６０ｎｍ未満またはそれに等しい直径を有する。

一部の実施形態では、ＰＥＧは、分岐状である。分岐状にすることにより、ポリマーにコンジュゲートするポリエチレングリコールの密度が高まる。一部の実施形態では、ポリエチレングリコールは、１，０００ダルトンから１０，０００ダルトンの間、例えば、５，０００ダルトンの分子量を有する。

高浸透圧溶液は、食塩溶液およびマンニトール溶液などの溶液から形成される。高浸透圧溶液は、脳のＥＣＭ内の細孔サイズを増大させ、それによって、脳間質内におけるナノ粒子の拡散を促進することによって、脳間質内でのナノ粒子の分布を強化する。好ましい実施形態では、高浸透圧溶液は、食塩水である。より好ましい実施形態では、高浸透圧溶液は、３％食塩水溶液である。実施例は、接着の低減とＥＣＭ内の細孔サイズの増大とを組み合わせることで、投与地点から離れたナノ粒子の分布を改善し、ナノ粒子が脳の血管周囲腔から逸脱することが可能となることを示す。

治療剤、予防剤、または診断剤の脳への送達のための投薬製剤もまた、開示される。本製剤は、ＰＥＧで高密度にコーティングされた治療有効量のナノ粒子と、脳内への送達のための薬学的に許容される賦形剤とを含む。ナノ粒子は、脳内への直接的または間接的な注射用に製剤化することができる。

本組成物を使用する方法には、対流強化送達を介して本組成物を投与することが含まれるが、これに限定されない。

本組成物および方法は、脳のがん、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、卒中、急性および慢性の外傷性症候群および疼痛症候群を含む、脳の様々な障害または疾患の１つまたは複数の症状を治療するための、治療剤、予防剤、および診断剤のうちのいずれか１つの送達を改善するために使用することができる。

図１Ａおよび１Ｂは、ポリスチレン系ナノ粒子モデルの物理化学的特徴付けのグラフ（図１Ａ）、ならびに様々な濃度で脳内に注入した場合のＰＳ−ＰＥＧおよびＰＳ−ＣＯＯＨ ＮＰの定量的分布容積（Ｖｄ）のグラフ（図１Ｂ）である。統計学的有意性は、^＊ｐ＜０．０５で表す。 図１Ａおよび１Ｂは、ポリスチレン系ナノ粒子モデルの物理化学的特徴付けのグラフ（図１Ａ）、ならびに様々な濃度で脳内に注入した場合のＰＳ−ＰＥＧおよびＰＳ−ＣＯＯＨ ＮＰの定量的分布容積（Ｖｄ）のグラフ（図１Ｂ）である。統計学的有意性は、^＊ｐ＜０．０５で表す。

図１Ｃは、ＰＳ−ＰＥＧおよびＰＳ−ＣＯＯＨのｉｎ ｖｉｖｏ投与後のＣＦ−１マウスおよびスプラーグドーリーラットにおけるナノ粒子の分布容積のグラフである。

図２Ａおよび２Ｂは、ナノ粒子のｅｘ ｖｉｖｏでの拡散性およびｉｎ ｖｉｖｏでの分布を特徴付けるグラフ（図２Ａ）、ならびに様々な塩分濃度の注入溶液においてインキュベートしたげっ歯類の脳切片におけるＰＳ−ＰＥＧの平均二乗変位（＜ＭＳＤ＞）のグラフである（図２Ｂ）。１試料当たりの追跡したＮＰはＮ＞１００であり、げっ歯類試料はＮ＝４である。^＊Ｐ＜０．０５は、統計学的有意性を表す。（Ｂ）画像に基づくＭＡＴＬＡＢ定量化方法を使用して決定したＰＳ−ＰＥＧおよびＰＳ−ＣＯＯＨのＶｄ。^＊ｐ＜０．０５は、統計学的有意性を表す。

図３Ａ〜３Ｄは、ＣＥＤ後のナノ粒子の血管周囲分布を示すグラフである。（図３Ａ−３Ｃ）。ＰＳ−ＰＥＧに対応するＮＰ蛍光の存在は、高浸透圧の３％食塩溶液で送達した場合に、線条体動脈のＰＶＳから最大１００μｍの距離で検出される。ＰＳ−ＣＯＯＨは、注入溶液の容量オスモル濃度に関係なく、ＰＶＳから効果的に逸脱しない。少なくともＮ＝３の線条体血管を、各条件で定量化した。ＩＣＳ内におけるＰＳ−ＰＥＧおよびＰＳ−ＣＯＯＨの蛍光のカバー範囲（ｃｏｖｅｒａｇｅ）パーセントを、画像に基づくＭＡＴＬＡＢ定量化を使用して計算した（図３Ｄ）。３％食塩水で注入した場合に、他のすべての条件と比較して、有意に高いＰＳ−ＰＥＧカバー範囲が検出される。統計学的有意性は、^＊ｐ＜０．０５で表す。 図３Ａ〜３Ｄは、ＣＥＤ後のナノ粒子の血管周囲分布を示すグラフである。（図３Ａ−３Ｃ）。ＰＳ−ＰＥＧに対応するＮＰ蛍光の存在は、高浸透圧の３％食塩溶液で送達した場合に、線条体動脈のＰＶＳから最大１００μｍの距離で検出される。ＰＳ−ＣＯＯＨは、注入溶液の容量オスモル濃度に関係なく、ＰＶＳから効果的に逸脱しない。少なくともＮ＝３の線条体血管を、各条件で定量化した。ＩＣＳ内におけるＰＳ−ＰＥＧおよびＰＳ−ＣＯＯＨの蛍光のカバー範囲（ｃｏｖｅｒａｇｅ）パーセントを、画像に基づくＭＡＴＬＡＢ定量化を使用して計算した（図３Ｄ）。３％食塩水で注入した場合に、他のすべての条件と比較して、有意に高いＰＳ−ＰＥＧカバー範囲が検出される。統計学的有意性は、^＊ｐ＜０．０５で表す。

図４Ａ〜４Ｃは、マウス線条体における、ＣＥＤを介して投与した治療用ＰＬＧＡ系ＮＰのｉｎ ｖｉｖｏ分布を示すグラフである。図４Ａは、マウス線条体におけるＰＬＧＡ−ＰＥＧおよびＰＬＧＡの定量化Ｖｄを示す。差込み図は、ＰＬＧＡの低いＶｄを示す。^＊ｐ＜０．０５は、統計学的有意性を表す。図４Ｂは、３％食塩水で投与した場合における、０．９％食塩水とは対照的な、血管周囲からのＰＬＧＡ−ＰＥＧの逸脱の改善を示すグラフである。図４Ｃは、画像に基づくＭＡＴＬＡＢ定量化を使用して計算した、脳ＩＣＳ内でのＰＬＧＡ−ＰＥＧ蛍光のカバー範囲パーセントのグラフである。３％食塩水で注入した場合には、０．９％食塩水と比較して、有意に高いＰＬＧＡ−ＰＥＧがＩＣＳにおいて見出される。統計学的有意性は、^＊ｐ＜０．０５で表す。 図４Ａ〜４Ｃは、マウス線条体における、ＣＥＤを介して投与した治療用ＰＬＧＡ系ＮＰのｉｎ ｖｉｖｏ分布を示すグラフである。図４Ａは、マウス線条体におけるＰＬＧＡ−ＰＥＧおよびＰＬＧＡの定量化Ｖｄを示す。差込み図は、ＰＬＧＡの低いＶｄを示す。^＊ｐ＜０．０５は、統計学的有意性を表す。図４Ｂは、３％食塩水で投与した場合における、０．９％食塩水とは対照的な、血管周囲からのＰＬＧＡ−ＰＥＧの逸脱の改善を示すグラフである。図４Ｃは、画像に基づくＭＡＴＬＡＢ定量化を使用して計算した、脳ＩＣＳ内でのＰＬＧＡ−ＰＥＧ蛍光のカバー範囲パーセントのグラフである。３％食塩水で注入した場合には、０．９％食塩水と比較して、有意に高いＰＬＧＡ−ＰＥＧがＩＣＳにおいて見出される。統計学的有意性は、^＊ｐ＜０．０５で表す。

Ｉ．定義
「生体適合性」という用語は、本明細書に使用されるとき、それ自体が宿主（例えば、動物またはヒト）に対して毒性ではなく、（ポリマーが分解する場合には）宿主において毒性濃度でモノマーサブユニットもしくはオリゴマーサブユニットまたは他の副生成物を生成する速度で分解することもない、１つまたは複数の材料を指す。

「生体分解性」という用語は、本明細書に使用されるとき、材料が、その構成サブユニットに分解もしくは分かれること、または例えば、生化学プロセスによって、ポリマーがより小さな非ポリマーサブユニットに消化されることを意味する。

「対応する粒子」または「基準粒子」という用語は、本明細書に使用されるとき、比較される別の粒子に実質的に同一であるが、典型的には、脳ＥＣＭにおける細孔を通る輸送の差を促すような表面修飾を欠いている、粒子を指す。対応する粒子は、典型的に、比較される粒子と同様の材料、密度、およびサイズのものである。ある特定の実施形態では、対応する粒子は、ＰＥＧまたは他のコーティング剤の高密度なコーティングを有さない粒子である。ある特定の実施形態では、同等の粒子は、遊離ポリマーおよびＰＥＧにコンジュゲートしたポリマーを含有するブレンド混合物から形成されていない、粒子である。ある特定の実施形態では、対応する粒子は、比較される粒子と同様の材料のものであるが、サイズがより小さいかまたは大きいものである。

「高密度にコーティングされた粒子」という用語は、例えば、基準粒子と比較して、粒子の表面におけるコーティング剤の密度を特異的に強化するように修飾されている、粒子を指す。一部の実施形態では、高密度にコーティングされた粒子は、低密度にコーティングされた粒子またはコーティングされていない粒子と比べて、粒子の物理化学的特性を変化させるのに十分である、ＰＥＧ対ポリマーの比で形成されている。一部の実施形態では、コーティング剤の密度は、粒子の電荷を完全に遮断し、ほぼ中性の電荷およびほぼ中性のゼータ電位値、ならびに生理溶液中でのコロイド安定性をもたらすのに十分なものである。特定の実施形態では、高密度にコーティングされた粒子は、分岐状ＰＥＧまたは分岐状ポリマーを使用して達成され、ここで、分岐状にすることで、分岐状ポリマーまたは分岐状ポリエチレングリコールを含有しない基準粒子と比較して、ポリマーに対するＰＥＧの比が高まる。

「高浸透圧」という用語は、当該技術分野で認識されており、別の溶液と比較して、１リットル当たりのオスモルが高い溶液を指し、最も典型的には、塩０．９％未満の食塩溶液を指す。一実施形態では、別の溶液は、脳細胞の細胞質である。

「等浸透圧」という用語は、当該技術分野で認識されており、別の溶液と比較して、１リットル当たりのオスモルが等しい溶液を指す。一実施形態では、別の溶液は、脳細胞の細胞質である。

「低浸透圧」という用語は、当該技術分野で認識されており、別の溶液と比較して、１リットル当たりのオスモルが低い溶液を指す。一実施形態では、別の溶液は、脳細胞の細胞質である。

「直径」という用語は、当該技術分野で認識されており、本明細書において、物理的直径または流体力学的直径のいずれかを指して使用される。本質的に球形の粒子の直径は、物理的直径または流体力学的直径を指し得る。非球形の粒子の直径は、流体力学的直径を優先的に指し得る。本明細書に使用されるとき、非球形粒子の直径は、粒子の表面上の２つの点の間の最も長い直線距離を指し得る。複数の粒子に言及する場合、粒子の直径は、典型的に、粒子の平均直径を指す。

「持続放出」とは、本明細書に使用されるとき、物質の全量が一度に生物学的に利用可能となるボーラス型の投与とは対照的に、長期間にわたる物質の放出を指す。

「マイクロスフェア」、「マイクロ粒子」、および「マイクロカプセル」という用語は、別途示されない限り、互換可能に使用される。これらは、約１から最大約１０００ミクロンの間のサイズを有する。一般に、「マイクロカプセル」は、シェル材料とは異なる材料のコアを有する。マイクロ粒子は、球形または非球形であってよく、規則的な形状または不規則的な形状を有してもよい。構造体の直径が約１ミクロンに満たない場合、当該技術分野で認識されている「ナノスフェア」、「ナノカプセル」、および「ナノ粒子」という対応する用語を用いることができる。ある特定の実施形態では、ナノスフェア、ナノカプセル、およびナノ粒子は、約２００ｎｍ、１００ｎｍ、または１００ｎｍ未満、例えば、５０ｎｍまたは１０ｎｍの平均直径を有する。

マイクロ粒子またはナノ粒子を含有する組成物は、ある範囲の粒子サイズの粒子を含み得る。ある特定の実施形態では、粒子サイズの分布は、均一、例えば、容積中位径（ｍｅｄｉａｎ ｖｏｌｕｍｅ ｄｉａｍｅｔｅｒ）の約２０％未満の標準偏差以内であり得、他の実施形態では、さらにより均一、例えば、容積中位径の約１０％以内であり得る。

「界面活性剤」という用語は、液体の表面張力を低下させる薬剤を指す。

「組み込まれた」および「被包された」という用語は、所望される適用において、活性剤の放出、例えば、持続放出を可能にする組成物の中および／または上に活性剤を組み込むこと、製剤化すること、またはそれ以外の方法で含むことを指す。これらの用語は、化学的および物理的カップリング、物理的混合、またはコーティング層に薬剤を封入することを含む、治療剤または他の材料をポリマーマトリックスに組み込む任意の様式を企図する。

「治療すること」という用語は、疾患、障害、または状態の１つまたは複数の症状を予防または緩和することを指す。疾患または状態を治療することには、鎮痛剤が疼痛の原因を治療するものではないとしても、そのような薬剤の投与によって被験体の疼痛を治療することなど、根底にある病態生理学に影響を及ぼさないものであっても、特定の疾患または状態の少なくとも１つの症状を軽減することが含まれる。

「薬学的に許容される」という語句は、健全な医学的判断の範囲内で、過剰な毒性、刺激、アレルギー応答、または他の問題もしくは合併症を伴うことなく、妥当な利益／危険性比に合った、ヒトおよび動物の組織と接触して使用するのに好適な組成物、ポリマー、および他の材料、ならびに／または剤形を指す。「薬学的に許容される担体」という語句は、薬学的に許容される材料、組成物、またはビヒクル、例えば、任意の対象組成物を、１つの器官または身体の部分から、別の器官または身体の部分へと運搬または輸送することに関与する、液体もしくは固体の充填剤、希釈剤、溶媒、または被包材料を指す。それぞれの担体は、対象組成物の他の成分と適合性があり患者に対して有害でないという意味で、「許容される」必要がある。

「治療有効量」という語句は、何らかの所望される効果を、任意の医療処置に対して、妥当な利益／危険性比でもたらす治療剤の量を指す。有効量は、治療を受ける疾患もしくは状態、投与される特定の標的化構築物、被験体の大きさ、または疾患もしくは状態の重症度などの要因に応じて多様であり得る。当業者であれば、過度の実験を必要とすることなく、特定の化合物の有効量を経験的に決定することができる。

ＩＩ．組成物
脳組織における急速な拡散および広範囲の分布が可能な、親水性かつ電荷中性のポリマー、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポロキサマーとして知られているＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）などのポリエチレングリコール−ポリオキシエチレンブロックコポリマー（集合的に、「ＰＥＧ化粒子」と称される）の高密度な表面コーティングを有するナノ粒子を含有する高浸透圧溶液の組成物を、開示する。

Ａ．ナノ粒子
ナノ粒子は、ポリマー性粒子、ナノゲル、ハイブリッド脂質−ポリマー粒子、ナノゲル、ナノ脂質ゲル系、およびデンドリマーであり得る。一部の実施形態では、ナノ粒子は、固形であっても中空であってもよく、１つまたは複数の層を含み得る。一部の実施形態では、各層は、他の層に対して、固有の組成および固有の特性を有する。ナノ粒子は、生体分解性であっても生体非分解性であってもよい。好ましい実施形態では、ナノ粒子は、ポリマー性である、すなわち、ポリマー性ナノ粒子である。最も好ましい実施形態では、ポリマー性ナノ粒子は、親水性かつ電荷中性のポリマーの高密度な表面コーティングを含む。

１．コーティング剤
粒子と脳組織との間の相互作用を低減することによって脳内でのＥＣＭを通した粒子の拡散を促進する、１つまたは複数の材料（例えば、表面改質剤）でコーティングされたナノ粒子を、開示する。表面改質剤の例としては、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）、ポロキサマー（ポリエチレンオキシドブロックコポリマー）、ポリソルベート８０、およびこれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、コーティング剤は、ナノ粒子が形成された後に、ナノ粒子に連結される。別の実施形態では、コーティング剤は、ナノ粒子が形成される前に、ナノ粒子のコアを形成するために使用されるポリマーに連結される。

好ましいコーティング剤は、ＰＥＧとしても知られているポリ（エチレングリコール）である。ＰＥＧは、ある特定の構成において、脳ＥＣＭにおける接着を低減するために用いられ得、例えば、表面から延びているＰＥＧ鎖の長さが、制御される（ＥＣＭに相互貫通する長い非分岐鎖が低減または排除されるように）。例えば、線形で高分子量のＰＥＧを、粒子の調製に用いて、線形の鎖の一部分（例えば、低分子量のＰＥＧ分子と同等の長さの部分）のみが粒子の表面から延びるようにしてもよい。あるいは、分岐状で高分子量のＰＥＧを用いてもよい。そのような実施形態では、ＰＥＧ分子の分子量は高くなり得るが、粒子の表面から延びる分子のすべての個々の鎖の線形の長さは、低分子量のＰＥＧ分子の線形鎖に対応するであろう。

ダルトン（Ｄａ）単位での代表的なＰＥＧ分子量としては、３００Ｄａ、６００Ｄａ、１ｋＤａ、２ｋＤａ、３ｋＤａ、４ｋＤａ、５ｋＤａ、６ｋＤａ、８ｋＤａ、１０ｋＤａ、１５ｋＤａ、２０ｋＤａ、３０ｋＤａ、５０ｋＤａ、１００ｋＤａ、２００ｋＤａ、５００ｋＤａ、および１ＭＤａが挙げられる。好ましい実施形態では、ＰＥＧは、約５，０００ダルトンの分子量を有する。任意の所与の分子量のＰＥＧは、長さ、密度、および分岐など、他の特徴が多様であり得る。一実施形態では、コーティング剤は、５ｋＤａの分子量のメトキシ−ＰＥＧ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ｍＰＥＧ−ＮＨＳ、５ｋＤａ）である。特定の実施形態では、コーティング剤は、５ｋＤａの分子量のメトキシ−ＰＥＧ−アミンである。

代替的な実施形態では、コーティングは、ＰＬＵＯＲＯＮＩＣ（登録商標）として市販されているポリエチレングリコール−ポリエチレンオキシドブロックコポリマーなどのポロキサマーである。

一部の実施形態では、コーティングは、ナノ粒子のコアと共有結合または非共有結合で連結して、コンジュゲートを形成する。一部の実施形態では、コーティングとナノ粒子のコアとの間の共有結合による連結は、直接的である。他の実施形態では、コーティングは、リンカー部分を通じて間接的にナノ粒子のコアに連結される。一部の実施形態では、非共有結合による連結は、親和性相互作用、金属配位、物理的吸着、ホスト−ゲスト相互作用、疎水性相互作用、π−スタッキング、水素結合、ファンデルワールス相互作用、またはこれらの組合せによって媒介される。好ましい実施形態では、コーティング剤は、ナノ粒子のコアに共有結合で連結される。

好ましい実施形態では、ナノ粒子は、脳実質を通じた急速な拡散を最適化する密度で、ＰＥＧまたは他のコーティング剤でコーティングされる。コーティングの密度は、粒子の材料および組成を含む、様々な要因に基づいて多様であり得る。

ＰＥＧまたは他のコーティング剤の量は、コアポリマーに対するＰＥＧまたは他のコーティング剤のモル比として表される。コアポリマーに対するＰＥＧまたはコーティング剤のモル比は、ナノ粒子が、ポリエチレングリコールまたは他のコーティング剤の高密度なコーティングを有さない対応する粒子と比較して、脳実質を通じた急速な拡散を呈するように、選択される。

一実施形態では、ＰＥＧまたは他のコーティング剤の密度は、１ｎｍ^２当たり少なくとも、０．００１、０．００２、０．００５、０．０１、０．０２、０．０５、０．１、０．２、０．５、１、２、５、１０、２０、５０、または１００ユニットである。

別の実施形態では、ＰＥＧまたは他のコーティング剤の量は、粒子の質量に対する百分率として表される。特定の実施形態では、ＰＥＧまたは他のコーティング剤の質量は、粒子の質量の少なくとも１／１０，０００、１／７５００、１／５０００、１／４０００、１／３４００、１／２５００、１／２０００、１／１５００、１／１０００、１／５００、１／２５０、１／２００、１／１５０、１／１００、１／７５、１／５０、１／２５、１／２０、１／５、１／２、または９／１０である。さらなる実施形態では、ＰＥＧまたは他のコーティング剤の重量パーセントは、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、またはそれよりも高い。

さらに別の実施形態では、ＰＥＧまたは他のコーティング剤の量は、ＰＥＧまたは他のコーティング剤とコアポリマーとのコンジュゲートの質量に対する百分率として表される。一部の実施形態では、コンジュゲート中のＰＥＧまたは他のコーティング剤の重量パーセントは、約１０重量％〜約９０重量％である。

２．コアポリマー
任意の数の生体適合性ポリマーを、ナノ粒子を調製するために使用することができる。ポリマーは、線形ポリマーであってもよく、ポリマーがＰＥＧなどのコーティング剤とのコンジュゲートする能力を強化するために、分岐状ポリマーであってもよい。一部の実施形態では、生体適合性ポリマーは、生体分解性である。一部の実施形態では、生体適合性で生体分解性のポリマーは、両親媒性である。別の実施形態では、生体適合性で生体分解性のポリマーは、疎水性である。ブロックコポリマー、ランダムコポリマー、または両方を含む、２つまたはそれよりも多いポリマーのコポリマーもまた、ポリマー性粒子の作製に利用することができる。

好ましい生体分解性ポリマーの例としては、ヒドロキシ酸、乳酸、およびグリコール酸のポリマーを含む、ならびにこれらのヒドロキシ酸とＰＥＧとのコポリマーを含む、ポリ（ヒドロキシ酸）；ポリ無水物；ポリ（オルト）エステル；ポリウレタン；ポリ（酪酸）；ポリ（吉草酸）；ポリ（ラクチド−ｃｏ−カプロラクトン）；ポリ（アミン−ｃｏ−エステル）；これらのブレンドおよびコポリマーが挙げられる。好ましい実施形態では、粒子は、１つまたは複数のポリエステルから構成される。

一部の実施形態では、１つまたは複数のポリエステルは、疎水性である。

例えば、粒子は、以下のポリエステルのうちの１つまたは複数を含有し得る：本明細書において「ＰＧＡ」と称されるグリコール酸ユニット、ならびに本明細書において集合的に「ＰＬＡ」と称される、ポリ−Ｌ−乳酸、ポリ−Ｄ−乳酸、ポリ−Ｄ，Ｌ−乳酸、ポリ−Ｌ−ラクチド、ポリ−Ｄ−ラクチド、およびポリ−Ｄ，Ｌ−ラクチドなどの乳酸ユニット、ならびに本明細書において集合的に「ＰＣＬ」と称される、ポリ（ε−カプロラクトン）などのカプロラクトンユニットを含む、ホモポリマー；本明細書において集合的に「ＰＬＧＡ」と称され、乳酸：グリコール酸の比によって特徴付けられる、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）およびポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）の様々な形態などの乳酸ユニットおよびグリコール酸ユニットを含む、コポリマー；ならびにポリアクリレートおよびそれらの誘導体。

追加の疎水性ポリマーとしては、ポリヒドロキシアルカノエート、ポリ（ホスファゼン）、ポリカーボネート、ポリアミド、ポリエステルアミド、ポリ（アルキレンアルキレート）、疎水性ポリエーテル、ポリエーテルエステル、ポリアセタール、ポリシアノアクリレート、ポリアクリレート、ポリメチルメタクリレート、ポリシロキサン、ポリケタール、ポリヒドロキシバレレート、ポリアルキレンオキサレート、ポリアルキレンスクシネート、およびこれらのコポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。

一部の実施形態では、ポリマーは、親水性ポリマーおよび上述の疎水性ポリマーを含有する両親媒性である。

好適な親水性ポリマーとしては、親水性ポリペプチド、例えば、ポリ−Ｌ−グルタミン酸、ガンマ−ポリグルタミン酸、ポリ−Ｌ−アスパラギン酸、ポリ−Ｌ−セリン、またはポリ−Ｌ−リシン、ポリ（アルキレングリコール）、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ（プロピレングリコール）、およびエチレングリコールおよびプロピレングリコールのコポリマー、ポリ（オキシエチル化ポリオール）、ポリ（オレフィンアルコール）、ポリビニルピロリドン）、ポリ（ヒドロキシアルキルメタクリルアミド）、ポリ（ヒドロキシアルキルメタクリレート）、ポリ（サッカライド）、ポリ（ビニルアルコール）、ならびにこれらのコポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、親水性ポリマーは、ＰＥＧである。

例示的な両親媒性ポリマーとしては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と前述のポリエステルとのコポリマー、例えば、ＰＬＧＡ−ＰＥＧまたはＰＬＡ−ＰＥＧコポリマーの様々な形態が挙げられる。ある特定の実施形態では、ＰＥＧ領域が、ポリマーと共有結合で結合して、「ＰＥＧ化ポリマー」が得られ、任意選択では、切断可能なリンカーによってカップリングされる。アルギネートポリマーもまた使用することができる。

好ましい実施形態では、コアポリマーは、ＰＬＧＡである。ＰＬＧＡは、安全な、ＦＤＡに認可されているポリマーである。

生体非分解性ナノ粒子を形成するために使用することができるポリマーの例としては、ポリスチレン、エチレン酢酸ビニル、ポリ（メタ）アクリル酸、ポリアミド、これらのコポリマーおよび混合物が挙げられる。

ポリマー化学において、置換基、例えば、モノマーサブユニット上の水素原子を、共有結合で結合するそのポリマーの別の鎖で、またはグラフトコポリマーの場合には、別の種類の鎖で、置き換えることによって、分岐化が生じる。分岐化は、炭素−炭素結合または様々な他の種類の共有結合の形成により生じ得る。エステル結合およびアミド結合による分岐化は、典型的に、縮合反応によるものであり、形成される結合ごとに１つの水（またはＨＣｌ）分子が生じる。

分岐指数（ｂｒａｎｃｈｉｎｇ ｉｎｄｅｘ）は、長鎖分岐が溶液中の高分子のサイズに及ぼす影響を評価する。これは、ｇ＝＜ｓｂ２＞／＜ｓｌ２＞として定義され、式中、ｓｂは、所与の溶媒中の分岐高分子の回転半径の二乗平均であり、ｓｌは、同じ温度、同じ溶媒中で、それ以外は同一な直鎖高分子の回転半径の二乗平均である。１よりも大きな値は、分岐化による回転半径の増大を示す。

好ましい実施形態では、ＰＥＧまたはその誘導体と、上述のポリマーのいずれかとのコポリマーを使用して、ポリマー性粒子が作製され得る。ある特定の実施形態では、ＰＥＧまたは誘導体は、コポリマーの内部位置に位置し得る。代替として、ＰＥＧまたは誘導体は、コポリマーの末端または末端付近の位置に位置し得る。ある特定の実施形態では、ナノ粒子は、ＰＥＧの領域が相分離するか、そうでなければ粒子の表面に位置するのを可能にする条件下で形成される。表面に局在化されたＰＥＧ領域は、単独で、表面改質剤の機能を果たし得るか、または表面改質剤を含んでもよい。

３．ナノ粒子の特性
実施例に示されるように、ＰＥＧまたは他のコーティング剤で高密度にコーティングされた本開示のナノ粒子は、コーティングされていない粒子、例えば、コーティングされていないカルボキシル化ポリスチレン粒子などの基準ナノ粒子よりも、高い拡散速度で、脳ＥＣＭの細孔を通過する。

ｉ．粒子の分布容積
投与後に、ＰＥＧまたは他のコーティング剤で高密度にコーティングされた本開示のナノ粒子は、基準粒子よりも１．３倍、２倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、５０倍、６０倍、８０倍、１００倍、１２５倍、１５０倍、２００倍、２５０倍、５００倍、６００倍、７５０倍、１０００倍、１５００倍、２０００倍、２５００倍、３０００倍、４０００倍、５０００倍、１００００倍、またはそれよりも高い分布容積（Ｖｄ）で、脳のＩＣＳ内に分布する。一部の実施形態では、分布容積は、投与後に、注射部位からある特定の距離で、脳組織の切片において蛍光標識したナノ粒子の蛍光を決定することによって測定される。脳切片の共焦点レーザー走査顕微鏡画像を、最大蛍光強度閾値１０％で特注のＭＡＴＬＡＢスクリプトにかけることによって、脳切片の画像をナノ粒子の蛍光分布に関して定量化する。脳室または白質路（ｗｈｉｔｅ ｍａｔｔｅｒ ｔｒａｃｔ）におけるＮＰの蛍光分布は避け、定量化には含めない。各切片から計算された分布面積に、脳切片の厚さを乗じ、すべての画像にわたって合計して、総分布容積を得る。

特定の実施形態では、コーティングされた粒子のＶｄは、基準粒子のものよりも約６〜７倍高い。他の実施形態では、コーティングされた粒子のＶｄは、基準粒子のものよりも１０．７倍、６．８倍、５．８倍、３．６倍、および１．３倍高い。

ｉｉ．粒子の拡散性
ＰＥＧまたは他のコーティング剤で高密度にコーティングされた本開示のナノ粒子は、基準分子よりも少なくとも５倍、１０倍、２０倍、３０倍、５０倍、６０倍、８０倍、１００倍、１２５倍、１５０倍、２００倍、２５０倍、５００倍、６００倍、７５０倍、１０００倍、１５００倍、２０００倍、２５００倍、３０００倍、４０００倍、５０００倍、１００００倍、またはそれよりも高い拡散速度で、脳ＥＣＭの細孔を通過する。

粒子の輸送速度は、当該技術分野における様々な技法を使用して測定することができる。一実施形態では、拡散速度は、幾何集団平均二乗変位（ｇｅｏｍｅｔｒｉｃ ｅｎｓｅｍｂｌｅ ｍｅａｎ ｓｑｕａｒｅｄ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）（ＭＳＤ）によって測定される。特定の実施形態では、粒子は、基準粒子よりも少なくとも５倍、１０倍、２０倍、３０倍、５０倍、６０倍、８０倍、１００倍、１２５倍、１５０倍、２００倍、２５０倍、５００倍、６００倍、７５０倍、１０００倍、１５００倍、２０００倍、２５００倍、３０００倍、４０００倍、５０００倍、１００００倍、またはそれよりも高いＭＳＤで、脳ＥＣＭの細孔を通って拡散し得る。

他の実施形態では、ＰＥＧまたは他のコーティング剤で高密度にコーティングされた本開示のナノ粒子は、粒子が水を通って拡散する拡散速度に近い速度で、脳ＥＣＭの細孔を通って拡散する。一部の実施形態では、拡散速度は、同一の条件下におけるこの粒子の水中での拡散速度の少なくとも１／１０００倍、１／８００倍、１／７００倍、１／６００倍、１／５００倍、１／４００倍、１／２５０倍、１／２００倍、１／１５０倍、１／１００倍、１／７５倍、１／５０倍、１／２５倍、１／１０倍、１／７倍、１／５倍、１／２倍、または１倍である。例えば、１秒の時間スケールにおいて、未修飾粒子または基準粒子の拡散速度は、脳組織において、同じ粒子が水中に拡散するよりも遅くなり得る。

ＰＥＧまたは他の材料のコーティング密度は、脳ＩＣＳ内でのナノ粒子の拡散に影響を及ぼし得る。一部の実施形態では、高密度にＰＥＧ化された粒子の１秒間でのＭＳＤは、基準粒子のものよりも少なくとも１．５倍高い。特定の実施形態では、高密度にＰＥＧ化された粒子は、ＩＣＳにおいて少なくとも０．５ｍｍ、１．０ｍｍ、および１．５ｍｍの距離まで拡散するが、一方で、基準粒子はＩＣＳでは観察されない。

粒子輸送速度における不均一性もまた、特定の期間、例えば、１秒間にわたる個々の粒子の拡散性の分布を試験することによって、評価することができる。一実施形態では、所与の平均粒子サイズのコーティング粒子のうち、少なくとも１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、またはそれよりも高くが、拡散性として分類される。この値は、ポリマーの選択によって影響を受ける。例えば、ＰＬＧＡナノ粒子は、典型的に、約５０％の粒子拡散性を有するが、一方で、ポリスチレンナノ粒子では８０％またはそれよりも高くが拡散性となるであろう。これは、ｌｏｇ（ＭＳＤ）＞−１を示すものという拡散性ナノ粒子の定義に合致する。

ｉｉｉ．界面動電位
ＰＥＧまたはコーティング剤の存在は、粒子のゼータ電位に影響を及ぼし得る。一実施形態では、粒子のゼータ電位は、−１００ｍＶ〜１０ｍＶ、−５０ｍＶ〜１０ｍＶ、−２５ｍＶ〜１０ｍＶ、−２０ｍＶ〜５ｍＶ、−１０ｍＶ〜１０ｍＶ、−１０ｍＶ〜５ｍＶ、−５ｍＶ〜５ｍＶ、または−２ｍＶ〜２ｍＶである。好ましい実施形態では、表面電荷は、ほぼ中性である。

ｉｖ．粒子サイズ
一部の実施形態では、ＰＥＧまたは他のコーティング剤で高密度にコーティングされた本開示のナノ粒子は、脳のＥＣＭにおける細孔に等しいかまたはそれよりも小さい平均直径を有する。特定の実施形態では、粒子は、最大１１４ｎｍ、１００ｎｍ未満、約３０〜約８０ｎｍの平均直径を有する。一部の実施形態では、遮蔽されたナノ粒子は、約７１．１±１ｎｍ〜約７５±３ｎｍの平均直径を有する。他の実施形態では、遮蔽されたナノ粒子は、約５８±０．２ｎｍ〜約６２±０．５ｎｍの平均直径を有する。粒子サイズは、当該技術分野で公知の任意の技法を使用して、例えば、動的光散乱を使用して、測定することができる。

別の実施形態では、粒子は、粒子の大半が血管周囲腔内に局在化することのないような平均直径を有する。

ある特定の実施形態では、ナノ粒子は、少なくとも１０分間、２０分間、３０分間、１時間、２時間、４時間（ｈｏｕｒ ｈｏｕｒｓ）、６時間、１０時間、１日間、３日間、７日間、１０日間、２週間、１ヶ月、またはそれよりも長い期間にわたって、有効量の治療剤、診断剤、または予防剤を放出する。

ｖ．毒性
開示されるＰＥＧまたは他のコーティング剤で高密度にコーティングされた遮蔽型ナノ粒子のｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでの毒性は、細胞生存度アッセイなど、当該技術分野で公知の任意の技法を使用して、またはナノ粒子が投与された被験体の挙動を観察することにより、評価することができる。好ましくは、ＰＥＧまたは他のコーティング剤で高密度にコーティングされたナノ粒子は、コーティングされていない同じ粒子よりも毒性が低い。しかしながら、ポリスチレンおよびＰＧＬＡ系のナノ粒子の大部分など、一部の粒子は、ＰＥＧ化されない場合がある。ナノ粒子の毒性は、細胞型または組織型に依存し得、ナノ粒子の濃度、注入溶液の容量オスモル濃度、またはその両方に依存し得る。一部の実施形態では、投与部位の近傍または投与部位に対して遠位において、著しい細胞毒性または炎症が観察されない場合、毒性は低いと考えられる。毒性は、細胞生存度、炎症、および動物の場合には、正常な体重増加、および警告挙動（ａｌｅｒｔ ｂｅｈａｖｉｏｒ）を測定することによって、当業者により測定される。典型的な神経毒性の徴候としては、猫背の姿勢、歩行異常、嗜眠、運動失調、および／またはけいれんなど、挙動の変化が挙げられる。動物の挙動を緊密にモニタリングした際、これらの症状は全く観察されなかった。

４．治療剤、予防剤、または診断剤
一部の実施形態では、粒子は、その中に１つまたは複数の治療剤が被包されている、その中に１つまたは複数の治療剤が分散されている、および／またはその表面に１つまたは複数の治療剤が共有結合もしくは非共有結合で結合している。治療剤は、小分子、タンパク質、ポリサッカライドもしくはサッカライド、核酸分子、および／または脂質であり得る。

組換えタンパク質、単離タンパク質、もしくは合成タンパク質、糖タンパク質、またはリポタンパク質を含む、任意のタンパク質を製剤化することができる。これらは、抗体（抗体断片および組換え抗体を含む）、酵素、増殖因子もしくは成長ホルモン、免疫調節剤、抗感染症薬、抗増殖薬、または他の治療用タンパク質、予防用タンパク質、もしくは診断用タンパク質であってもよい。ある特定の実施形態では、タンパク質は、約１５０ｋＤａを上回る、１６０ｋＤａを上回る、１７０ｋＤａを上回る、１８０ｋＤａを上回る、１９０ｋＤａを上回る、またはさらには２００ｋＤａを上回る、分子量を有する。ある特定の実施形態では、タンパク質は、ＰＥＧ化タンパク質であり得る。

小分子治療剤の例示的なクラスとしては、鎮痛剤、抗炎症薬、解熱薬、抗うつ薬、鎮痙薬、抗精神病剤（ａｎｔｉｏｐｓｙｃｈｏｔｉｃ ａｇｅｎｔ）、神経保護剤、抗増殖薬、例えば、抗がん剤、抗感染剤、例えば、抗細菌剤および抗真菌剤、抗ヒスタミン薬、抗偏頭痛薬、抗ムスカリン薬、抗不安薬、鎮静薬、催眠薬、抗精神病薬（ａｎｔｉｐｓｙｃｈｏｔｉｃｓ）、気管支拡張薬、抗喘息薬、心臓血管薬、コルチコステロイド、ドーパミン作動薬、電解質、胃腸薬、筋弛緩薬、栄養剤、ビタミン類、副交感神経作動薬、刺激薬、食欲抑制薬、および抗ナルコレプシー薬（ａｎｔｉ−ｎａｒｃｏｌｅｐｔｉｃｓ）が挙げられるが、これらに限定されない。

一部の実施形態では、薬剤は、１つまたは複数の核酸である。核酸は、内因性核酸配列の改変、修正、または置換えを行うことができる。核酸を使用して、がんを治療し、肺疾患および肺機能に影響を及ぼす代謝疾患における遺伝子欠陥の修正を行って、例えば、パーキンソン病およびＡＬＳを治療することができ、ここで、遺伝子は、鼻への送達により脳に到達する。

遺伝子療法は、疾患の発症に関与する欠陥遺伝子を修正するための技法である。正常な遺伝子を、ゲノム内の非特異的位置に挿入して、非機能性遺伝子と置き換えることができる。このアプローチが、最も一般的である。異常な遺伝子は、相同組換えを通じて正常な遺伝子と取り替えることができる。異常な遺伝子は、遺伝子をその正常な機能へと戻す、選択的復帰突然変異を通じて修復してもよい。特定の遺伝子の制御（遺伝子をオンまたはオフにする程度）を、変化させてもよい。

核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、化学的に修飾された核酸、またはこれらの組合せであり得る。例えば、核酸の半減期の安定性および酵素切断に対する抵抗性を増大させるための方法が、当該技術分野で公知であり、これには、ポリヌクレオチドの核酸塩基、糖、または連結に対する１つまたは複数の修飾または置換が含まれる。核酸は、所望される使用に適合するように調整された特性を含むように特別に合成することができる。一般的な修飾としては、ロックド核酸（ＬＮＡ）、アンロックド核酸（ＵＮＡ）、モルホリノ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ホスホロチオエート連結、ホスホノアセテート連結、プロピン類似体、２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、５−Ｍｅ−ｄＣ、２’−５’連結型ホスホジエステル連結、キメラ連結（ホスホロチオエートおよびホスホジエステル連結の混合、ならびに修飾）、脂質およびペプチドとのコンジュゲーション、ならびにこれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。

例示的な診断用材料としては、常磁性分子、蛍光化合物、磁性分子、および放射性核種が挙げられる。好適な診断剤としては、Ｘ線画像化剤および造影剤が挙げられるが、これらに限定されない。放射性核種もまた、画像化剤として使用することができる。他の好適な造影剤の例としては、ガスまたはガス放出化合物が挙げられ、これらは、放射線不透過性である。リポソームは、投与される粒子の位置を決定するのに有用な薬剤をさらに含み得る。この目的に有用な薬剤としては、蛍光タグ、放射性核種、および造影剤が挙げられる。

好ましい実施形態では、抗感染症薬としては、トブラマイシン、コリスチン、またはアズトレオナムなどの抗生物質が挙げられ、抗炎症剤としては、エリスロマイシン、アジスロマイシン、およびクラリスロマイシンが挙げられる。ナノ粒子はまた、化学療法剤および抗増殖剤の送達に使用することもできる。

１つまたは複数の治療剤、予防剤、および／または診断剤が被包されるこれらの実施形態について、薬物充填パーセントは、約１重量％〜約８０重量％、約１重量％〜約５０重量％、約１重量％〜約４０重量％、約１重量％〜約２０重量％、または約１重量％〜約１０重量％である。

５．標的化部分
一部の実施形態では、ナノ粒子は、標的化部分を必要とせず、標的化部分の不在下においても、それらの意図される細胞または組織に有効に到達する。他の実施形態では、ナノ粒子は、ナノ粒子の表面にコンジュゲートした標的化部分を含有し、これが、細胞の成分に結合する。一部の実施形態では、標的化部分は、ナノ粒子に共有結合で連結している。他の実施形態では、標的化部分は、ナノ粒子に非共有結合で連結している。標的化部分は、器官、組織、細胞、または細胞外マトリックスと関連する１つまたは複数の標的に結合する、ペプチド、ポリペプチド、糖タンパク質、核酸、小分子、炭水化物、脂質などであり得る。一部の実施形態では、標的化部分は、所望される細胞型または組織へのナノ担体の標的化を増大または強化する。

Ｂ．高浸透圧溶液
ナノ粒子は、高浸透圧溶液を用いて投与される。好ましい実施形態では、高浸透圧溶液は、食塩水またはマンニトール溶液である。高浸透圧溶液の濃度は、０．１％〜１０％の範囲にわたる。一部の実施形態では、高浸透圧溶液の濃度は、０．９％、３％、および９％である。好ましい実施形態では、高浸透圧溶液は、食塩水である。より好ましい実施形態では、高浸透圧の食塩溶液の濃度は、３％である。

Ｃ．脳への送達のための薬学的賦形剤
粒子は、生理学的または薬学的に許容される担体、賦形剤、または安定剤と組み合わせて投与され得る。医薬組成物は、活性化合物を薬学的に使用することができる調製物へと加工することを促進する賦形剤および補助剤を含む、１つまたは複数の生理学的に許容される担体を使用して、従来の様式で製剤化され得る。

ナノ粒子は、最初は薬学的賦形剤の添加によって保護され得るが、その後、ＣＥＤ投与の直前にＮａＣｌを添加することによって、溶液の容量オスモル濃度を増大させることができる。好ましい実施形態では、薬学的賦形剤は、任意の有害作用を回避するために、可能な限り短い時間で、高浸透圧の食塩水に曝露される。

適切な製剤化は、選択された投与の経路に依存する。好ましい実施形態では、粒子は、脳への非経口送達のために製剤化される。典型的には、粒子は、治療される組織または細胞内への注射のために滅菌食塩水または緩衝化溶液において製剤化されるであろう。粒子は、凍結乾燥して、使用直前に再湿潤化（ｒｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ）するための単回使用バイアルで保管することができる。再湿潤化および投与のための他の手段は、当業者には公知である。

任意選択の薬学的に許容される賦形剤としては、滑沢剤、崩壊剤、着色剤、安定剤、および界面活性剤が挙げられるが、これらに限定されない。安定剤は、例として、酸化反応を含む、分解反応を阻害または遅延するために使用される。

ナノ粒子またはナノコンジュゲートは、投与の容易さおよび投薬量の均一性のため、投薬単位形態で製剤化することができる。「投薬単位形態」という表現は、本明細書に使用されるとき、治療を受ける患者に適切なコンジュゲートの物理的に分かれた単位を指す。しかしながら、組成物の合計一日使用量は、健全な医学的判断の範囲内で、担当医によって決定されるであろうことが理解されるであろう。いずれのナノ粒子またはナノコンジュゲートについても、治療有効用量は、まず、細胞培養アッセイにおいて、または通常はマウス、ウサギ、イヌ、もしくはブタである動物モデルにおいてのいずれかで、推定され得る。動物モデルは、望ましい濃度範囲および投与の経路を達成するためにも使用される。次いで、このような情報を使用して、ヒトにおける投与に有用な用量および経路を決定することができる。コンジュゲートの治療効果および毒性は、細胞培養物または実験動物における標準的な薬学的手順によって、例えば、ＥＤ５０（集団の５０％に治療的に有効な用量である）およびＬＤ５０（集団の５０％に致死的な用量である）によって、決定することができる。毒性作用と治療効果との用量比が、治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０の比で表すことができる。大きな治療指数を示す医薬組成物が、好ましい。細胞培養アッセイおよび動物での研究により得られたデータを、ヒトでの使用のための投薬量範囲を処方するのに使用することができる。

ＩＩ．製造方法
Ａ．ナノ粒子
ポリマーは、典型的に、商業的に入手されるか、当該技術分野で公知の任意の手段によって合成することができる。ＰＥＧまたは他のコーティング剤は、コーティングが粒子に共有結合で結合するか非共有結合で結合するかに応じて、当該技術分野で公知の様々な技法を使用して、コアポリマーにコンジュゲートすることができる。一部の実施形態では、ＰＥＧまたは他のコーティング剤は、粒子の官能基を、ＰＥＧまたは他のコーティング剤の反応性官能基と反応させて、コポリマーを作製することによって、コアポリマーに共有結合で結合させることができる。例えば、アミノ化されたＰＥＧを、粒子の反応性官能基、例えば、カルボン酸基と反応させて、アミド結合を介して薬剤を共有結合で結合させることができる。

一実施形態では、メトキシ−ＰＥＧ（５ｋＤａ）−アミンを、カルボキシル化ポリマーナノ粒子の表面上のカルボキシル官能基とコンジュゲートさせる。他の実施形態では、ナノ粒子は、ＰＥＧがコポリマーの２５重量％を構成する、ＰＬＧＡ−ＰＥＧコポリマーから形成される。

一部の実施形態では、ナノ粒子は、ＰＥＧ化ポリマーおよび非ＰＥＧ化ポリマーの混合物から形成される。ＰＥＧ化ポリマー：非ＰＥＧ化ポリマーのモル比は、表面に提示されるＰＥＧの密度を変化させるために、多様であり得る。

ナノ粒子は、当該技術分野で公知のポリマー性ナノ粒子の形成に好適な任意の方法を使用して、１つまたは複数の生体適合性ポリマー、生体分解性ポリマー、またはその両方、１つまたは複数のＰＥＧまたは他のコーティング剤から形成することができる。ナノ粒子形成に用いられる方法は、ナノ粒子中に存在するポリマーの特徴、ならびに所望される粒子サイズおよびサイズ分布を含む、様々な要因に依存するであろう。

単分散粒子集団が所望される状況では、粒子は、単分散ナノ粒子集団が得られる方法を使用して形成され得る。あるいは、多分散ナノ粒子分布をもたらす方法を使用することができ、粒子は、所望される平均粒子サイズおよび粒子サイズ分布を有する粒子集団が得られるように、粒子の形成後に、ふるいなどの当該技術分野で公知の方法を使用して分離することができる。

ナノ粒子を調製するための一般的な技法としては、溶媒蒸発、溶媒除去、噴霧乾燥、相反転、低温注型、およびナノ沈殿が挙げられるが、これらに限定されない。粒子形成の好適な方法を、以下に簡単に説明する。ｐＨ調整剤、崩壊剤、保存剤、および抗酸化剤を含む、薬学的に許容される賦形剤を、任意選択で、粒子形成中に粒子に組み込むことができる。上述のように、１つまたは複数の追加の活性剤もまた、粒子形成中にナノ粒子遺伝子担体に組み込むことができる。

１．溶媒蒸発
この方法では、ポリマーを、塩化メチレンなどの揮発性有機溶媒中に溶解させる。核酸を溶液に添加し、混合物を、ポリ（ビニルアルコール）などの表面活性物質を含有する水溶液中に懸濁させる。結果として得られたエマルジョンを、有機溶媒の大部分が蒸発するまで撹拌すると、固体のナノ粒子が残る。結果として得られたナノ粒子を、水で洗浄し、凍結乾燥装置において一晩乾燥させる。様々なサイズおよび形態を有するナノ粒子を、この方法により得ることができる。この方法は、ポリエステルおよびポリスチレンなどの比較的安定したポリマーに有用である。

しかしながら、ポリ無水物などの不安定なポリマーは、水の存在により、製造プロセス中に分解する可能性がある。これらのポリマーについては、完全に無水の有機溶媒中で行われる以下の２つの方法が、より有用である。

２．溶媒除去
この技法は、主として、ポリ無水物のために設計されている。この方法では、薬物を、塩化メチレンなどの揮発性有機溶媒中の、選択されたポリマーの溶液に、分散または溶解させる。この混合物を、有機油（シリコン油など）中で撹拌することによって懸濁して、エマルジョンを形成する。溶媒蒸発とは違って、この方法は、高い融点および異なる分子量を有するポリマーから、ナノ粒子を作製するために使用することができる。この技法を用いて得られる球体の外的形態は、使用されるポリマーの種類に大きく依存する。

３．噴霧乾燥
この方法では、ポリマーを、有機溶媒中に溶解させる。既知量の活性薬物を、ポリマー溶液中に懸濁させるか（不溶性薬物）、または共溶解させる（可溶性薬物）。次いで、溶液または分散液を、スプレー乾燥させる。

４．相反転
マイクロスフェアは、相反転法を使用して、ポリマーから形成することができ、その場合、ポリマーを、「良」溶媒中に溶解させ、薬物など、組み込もうとする物質の微細粒子を、ポリマー溶液中に混合または溶解させ、この混合物を、ポリマーの強力な非溶媒中に注ぎ入れると、好ましい条件下において、自発的に、ポリマー性マイクロスフェアが生成され、ここで、ポリマーは、粒子でコーティングされているか、または粒子がポリマー中に分散しているかのいずれかである。この方法は、例えば、約１００ナノメートル〜約１０ミクロンを含む、広範なサイズのナノ粒子を生成するために使用することができる。使用することができる例示的なポリマーとしては、ポリビニルフェノールおよびポリ乳酸が挙げられる。組み込むことができる物質としては、例えば、蛍光色素などの画像化剤、またはタンパク質もしくは核酸などの生物学的に活性な分子が挙げられる。このプロセスでは、ポリマーを、有機溶媒中に溶解し、次いで、非溶媒と接触させ、それにより、溶解したポリマーの相反転が生じて、任意選択で抗原または他の物質を組み込んだ、サイズ分布の狭い小さな球形粒子が形成される。

ナノ粒子を調製するために使用することができる、当該技術分野で公知の他の方法としては、高分子電解質縮合（Ｓｕｋら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、２７巻、５１４３〜５１５０頁（２００６年）を参照されたい）、単一および二重エマルジョン（プローブ超音波処理）、ナノ粒子成形、ならびに静電自己アセンブリ法（例えば、ポリエチレンイミン−ＤＮＡまたはリポソーム）が挙げられるが、これらに限定されない。

ＩＩＩ．使用方法
ＰＥＧなどの表面コーティング剤の密度および組成が、脳実質全体にわたって拡散する粒子の能力を決定し得ることは、確立されている。ナノ粒子（直径約５０〜７５ｎｍの粒子）の拡散限界を、実施例に記載されるように、切除したげっ歯類の脳切片において、ｅｘ ｖｉｖｏで調査した。多重粒子追跡法（ＭＰＴ）および最適化されたＰＥＧ化プロトコルを使用して、ＰＥＧコーティングおよび注入溶液の濃度の違いにより、遮蔽粒子の接着性相互作用を防止し、それらの拡散性を増大させ、ＰＥＧまたは他のコーティング剤を有さない基準粒子と比較して、ｉｎ ｖｉｖｏでより広範囲に浸透し、分布することが可能であることが示された。

したがって、本明細書に記載される粒子組成物は、１つまたは複数の治療剤、予防剤、および／または診断剤を脳に直接投与して、脳の１つまたは複数の疾患または障害を治療するために、使用することができる。

Ａ．治療的使用
１つまたは複数の治療剤、診断剤、または予防剤を担持するナノ粒子を利用して、これらの薬剤を、化学療法薬を送達するための方法などにおいて、治療目的、診断目的、または予防目的で、送達することができる。

１．治療される障害または疾患
本開示の組成物および方法によって治療することができる例示的な脳の疾患および障害としては、新生物（がん、腫瘍、増殖）、感染症（ＨＩＶ／ＡＩＤＳ、結核）、炎症（多発性硬化症、横断脊髄炎、および他の自己免疫プロセス、脳浮腫または組織浮腫、および他の反応性プロセス）、後天性状態または変性状態（アルツハイマー病、パーキンソン病、卒中、筋萎縮性側索硬化症、急性および慢性の外傷性症候群および疼痛症候群）、先天性または遺伝性異常（神経線維腫症、ムコ多糖症、結節硬化症、フォン・ヒッペル・リンドウ）、エピジェネティック状態、ならびに脳の外傷または傷害が挙げられる。

Ｂ．投与および投薬の方法
本開示のナノ粒子は、様々な投与経路で投与することができる。ある特定の実施形態では、粒子は、脳に直接投与される。他の実施形態では、粒子は、全身投与される。

脳ＥＣＭの組成は、その成分の物理化学的特性およびそれらの間の間隙（「細孔」）を含め、脳内での物質の浸透を決定する重要な要因である。

遮蔽されておらず、疎水性領域が露出している負電荷の粒子は、粒子サイズに関係なく、拡散が著しく妨害される。粒子表面とＥＣＭ成分との間の疎水性相互作用が、著しい接着の原因であり得る。静電力および疎水性力を含む潜在的な相互作用からの適切な表面遮蔽が、脳内での急速な拡散にとって極めて重要である。

本開示のナノ粒子の脳への強化送達の機序を、開示する。局所送達の強化は、対流、電磁力（ｅｌｅｃｔｒｉｃｏｍａｇｎｅｔｉｃ）、または他の力を介して達成することができる。全身送達の強化は、薬理学的物質（例えば、サイトカイン）、機械的な障壁の破壊（例えば、超音波）、または浸透圧の変化（例えば、マンニトール）などであるがこれらに限定されない、透過処理剤（ｐｅｒｍｅａｂｌｉｉｚａｔｉｏｎ ａｇｅｎｔ）の同時投与または逐次投与を介して達成することができる。他の送達方法としては、脳脊髄液腔を介した髄腔内投与または脳室内送達、嗅球を介した鼻腔内投与または送達、および経口、静脈内、または動脈内投与を介した全身送達が挙げられる。

１．対流強化送達
一部の実施形態では、ＰＥＧ化ＮＰは、対流強化送達（ＣＥＤ）後のＮＰの脳のＩＣＳ内での分布を強化するために、高浸透圧溶液中で提供される。ＣＥＤは、脳に実質内導入され、陽圧および一定流量の注入液を提供するポンプに取り付けられた針を通じて、薬物が送達される方法である。例えば、治療剤または診断剤を表面上に含有するか、またはナノ粒子内に被包されているか、またはその両方である、高密度にＰＥＧ化されたナノ粒子は、例えば、脳腫瘍塊内に直接、または腫瘍もしくは切除腔の周囲に、定位留置された１個〜数個のカテーテルを通じて、高浸透圧溶液で送達することができる。

一部の実施形態では、高浸透圧溶液およびＰＥＧ化により、様々なサイズのＮＰの局所領域濃度の分布が有意に強化される。ある特定の実施形態では、高密度にＰＥＧ化された粒子を高浸透圧溶液において送達するのにＣＥＤを使用することにより、脳全体にわたる粒子の分布が、予測されるものよりもある程度良好に強化される。一部の実施形態では、ＮＰ分布は、線条体全体にわたって達成される。ＣＥＤ単独では、粒子、例えば、基準粒子が、接着性相互作用、立体的障害、ならびに優先的な輸送および隔離のいずれかに起因して、注入部位または脳ＰＶＳに局在化したままとなるとすれば、有意な利益が得られる可能性は低い。したがって、ＣＥＤ後の粒子浸透の強化を達成するためには、脳実質内での妨害されない拡散を可能にする粒子の物理化学的特性が、依然として重要である。

２．投与レジメン
一般に、投与のタイミングおよび頻度は、所与の治療または診断スケジュールの有効性と、所与の送達系の副作用とのバランスをとるように調節されるであろう。例示的な投薬頻度としては、連続注入、単回投与、および複数回投与、例えば、１時間ごと、１日ごと、１週間ごと、１ヶ月ごと、または１年ごとの投薬が挙げられる。

全身送達、髄腔内送達、または脳実質自体への局所送達に関係なく、脳および他の組織における生物活性剤または画像化剤の浸透は、有効な治療法および診断法にとって重要な問題となっている。ウイルス送達、ナノ粒子送達、および対流強化送達を使用した多数の研究が、脳内での物質の移動が制限されることに起因して、失敗に終わっている。したがって、重要な制限パラメーターを定義し、脳浸透を強化する戦略を設計することにより、これらの治療の有効性が向上する可能性が高いであろう。高密度にＰＥＧ化されたナノ粒子は、粒子拡散の増大、安定性の向上、および持続放出動態の延長を含む、多数のさらなる利点を提供する。これらの要因は、多数の治療薬の有効性と相関することが知られており、ナノサイズ担体を、脳内への診断薬および治療薬の送達に利用することに関して、重大な影響を有する可能性が高いであろう。

本発明は、以下の非限定的な実施例を参照することにより、さらに理解されるであろう。

（実施例１：粒子を非接着性コーティングでコーティングすることの効果）
材料および方法
ｉ．ナノ粒子の調製および特徴付け
４０ｎｍの暗赤色蛍光カルボキシル化ポリスチレンマイクロスフェア（ＰＳ−ＣＯＯＨ）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）を、これまでに公開されているプロトコル（Ｎａｎｃｅ， Ｅ．Ａ．ら、Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ、２０１２年、４巻（１４９号）、１４９ｒａ１１９）に従って、５ｋＤａのメトキシ−ＰＥＧ−アミン（Ｃｒｅａｔｉｖｅ ＰＥＧｗｏｒｋｓ、Ｗｉｎｓｔｏｎ Ｓａｌｅｍ、ＮＣ）の高密度な層を表面にコンジュゲートすることによって修飾して、高密度にＰＥＧ化されたポリスチレンナノ粒子（ＰＳ−ＰＥＧ）を得た。ＰＬＧＡ（７５：２５）（分子量１５ｋＤａ、Ｊｉｎａｎ Ｄａｉｇａｎｇ Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｃｏ．Ｌｔｄ．、Ｊｉｎａｎ、Ｃｈｉｎａ）およびＰＬＧＡ−ＰＥＧ（７５：２５）（２５重量％ＰＥＧ、Ｊｉｎａｎ Ｄａｉｇａｎｇ Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｃｏ．Ｌｔｄ．、Ｊｉｎａｎ、Ｃｈｉｎａ）のナノ粒子を、これまでに公開されているプロトコル（Ｎａｎｃｅ， Ｅ．ら、ＡＣＳ Ｎａｎｏ、２０１４年、８巻（１０号）、１０６５５〜１０６６４頁）に従って、単一エマルジョンプロセスを使用して製剤化した。簡単に述べると、ＰＬＧＡ−ＰＥＧおよびＰＬＧＡポリマーを、Ｎａｎｃｅ， Ｅ．ら、ＡＣＳ Ｎａｎｏ、２０１４年、８巻（１０号）、１０６５５〜１０６６４頁に記載されるように、それぞれ、ＡｌｅｘＦｌｕｏｒ ６４７およびＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ５５５カダベリン色素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）で、蛍光標識した。ポリマーを、ジクロロメタン中に溶解し、プローブ超音波処理装置を使用して、０．５重量％のコール酸（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）中に乳化させた。ナノ粒子を、１μｍのフィルタ（Ｗｈａｔｍａｎ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）を通して濾過した。ＰＬＧＡ−ＰＥＧを収集し、遠心分離フィルターユニット（ＭＷＣＯ：１００ｋＤａ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を３６００ｇの速度で１２分間使用して、洗浄した。ＰＬＧＡナノ粒子を、２２１７０ｇで３０分間の高速遠心分離によって収集し、洗浄し、使用のために再懸濁させた。小アリコートを凍結乾燥させ、秤量して、収集したナノ粒子の濃度を決定した。ナノ粒子のサイズおよび表面化学を、標準的な１０ｍＭ ＮａＣｌ溶液において、動的光散乱およびレーザードップラー流速測定技法（ｌａｓｅｒ ｄｏｐｐｌｅｒ ａｎｅｍｏｍｅｔｒｙ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）により、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ ＮａｎｏＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｓｏｕｔｈｂｏｒｏｕｇｈ、ＭＡ）を使用して特徴付けた。ナノ粒子の安定性を試験するために、粒子を、以下の注入溶液：水、食塩水（０．９％、３％）、およびマンニトール（１０％、２５％）中に２００倍で希釈し、室温で１５分間インキュベートさせた。次いで、ナノ粒子を、動的光散乱を使用してサイズ決定し、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ ＮａｎｏＺＳを使用して流体力学的直径を決定した。頭蓋内対流強化送達（ＣＥＤ）のためのナノ粒子を調製する場合は、ストックＰＳ−ＰＥＧおよびＰＳ−ＣＯＯＨを、それぞれ、水、０．９％食塩水、３％食塩水、１０％マンニトール、および２５％マンニトール中に２５倍希釈し、１：１の比で混合し、最終濃度１ｍｇ／ｍＬにした。通常の食塩水において、２５ｍｇ／ｍＬおよび０．１ｍｇ／ｍＬの最終濃度を含め、追加のナノ粒子濃度についても調査した。ＰＬＧＡおよびＰＬＧＡ−ＰＥＧについては、ナノ粒子を一晩凍結乾燥させ、投与のために０．９％食塩水中に１ｍｇ／ｍＬの濃度で再懸濁させた。

ｉｉ．対流強化送達
体重が２０〜３０ｇの雌性ＣＦ−１マウスまたは体重が３００〜４００ｇの雄性スプラーグドーリーラットに、ケタミン（７５ｍｇ／ｋｇ）とキシラジン（７．５ｍｇ／ｋｇ）の混合物で麻酔をかけた。マウスについては、頭部に２ｃｍの矢状切開を行い、穿頭孔を、ブレグマの横２ｍｍに開けた。すべてのナノ粒子溶液または注入溶液を、３３ゲージのシリンジを用いて、５０μＬのＨａｍｉｌｔｏｎ Ｎｅｕｒｏｓｙｒｉｎｇｅに充填し、１ｍｍステップに設定した（Ｈａｍｉｌｔｏｎ、Ｒｅｎｏ、ＮＶ）。シリンジを、小動物定位フレーム（Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ、Ｗｏｏｄ Ｄａｌｅ、Ｉｌ）に固定したＣｈｅｍｙｘ Ｎａｎｏｊｅｔ Ｉｎｊｅｃｔｏｒ Ｍｏｄｕｌｅ（Ｃｈｅｍｙｘ、Ｓｔａｆｆｏｒｄ、ＴＸ）に垂直に取り付けた。充填済みシリンジを、マウスの硬膜の下２．５ｍｍの深さまで下げ、合計２μＬの溶液を、０．２μＬ／分の速度で１０分間にわたって投与した。ラットについては、穿頭孔を、ブレグマの横３ｍｍに開け、合計溶液２０μＬの溶液を、０．３３μＬ／分の速度で、３．５ｍｍの深さに投与した。いずれのげっ歯類においても、カニューレは、注入の完了後５分間の間静置した後、１ｍｍ／分の速度で引き抜いた。次いで、動物を、縫合し（Ｃｏｖｉｄｉｅｎ、Ｍｕｎｄｅｌｅｉｎ、Ｉｌ）、加温パッドに乗せた。

ｉｉｉ．異なるナノ粒子濃度：分布容積の定量化
様々なＰＳ−ＰＥＧおよびＰＳ−ＣＯＯＨ濃度での分布容積を調査する際、対側脳半球において決定したバックグラウンドを上回る蛍光の脳切片画像を取得した。脳切片画像を、Ｍｅｔａｍｏｒｐｈ（Ｍｅｔａｍｏｒｐｈ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を使用して重ねた後、ＳｔａｃｋＲｅｇプラグイン（ＩｍａｇｅＪ、ＮＩＨ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）を使用して整列させた。ナノ粒子の分布容積の３Ｄレンダリングを、Ｉｍａｒｉｓ（Ｂｉｔｐｌａｎｅ、Ｓｏｕｔｈ Ｗｉｎｄｓｏｒ、ＣＴ）ソフトウェアを使用して、最大蛍光強度の１０％という閾値を用いて生成した。最も低い注入濃度でのナノ粒子のＶｄを完全に捕捉することを確実にするために、この定量化方法をとった。

ｉｖ．血管の染色および画像化
マウスに、暗赤色蛍光ＰＳ−ＰＥＧナノ粒子および赤色蛍光ＰＳ−ＣＯＯＨナノ粒子を共注射した。組織を採取し、後固定し、注射の前頭面から指定間隔で１０μｍの厚さで凍結切片にした（０ｍｍ、０．５ｍｍ、１．０ｍｍ、および１．５ｍｍ）。組織を、スライドガラスに載置し、３７℃で１０分間、ペプシン溶液（Ｄａｋｏ、Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ、ＣＡ）中に浸漬した。スライドをＰＢＳで３回洗浄し、室温で１時間、ＰＢＳ中の５％正常ヤギ血清（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）および１％ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から構成されるブロッキング緩衝液でブロッキングした。組織切片を、４℃で１６時間、１：２５０でブロッキング緩衝液中に希釈した一次ウサギ抗マウスＩＶ型コラーゲン抗体（Ａｂｃａｍ ａｂ６５８６、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）とともにインキュベートした。組織をＰＢＳで３回洗浄し、室温で１時間、ブロッキング緩衝液中に１：５００で希釈したＡＦ４８８で標識したヤギ抗ウサギ二次抗体（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）とともにインキュベートした。組織をＰＢＳで３回洗浄した後、室温で１５分間、ＰＢＳ中１：１０００希釈のＤＡＰＩ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）とともにインキュベートした。スライドをＰＢＳで３回洗浄し、乾燥させた後、Ｄａｋｏ蛍光封入剤（Ｄａｋｏ、Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ、ＣＡ）で封入した。

Ｚｅｉｓｓ共焦点７１０レーザー走査顕微鏡を使用して、高解像度画像（倍率４０倍）を、主ＮＰバルクから指定の間隔で間を空けて取得し、ＤＡＰＩ、ＩＶ型コラーゲン、ＰＳ−ＰＥＧ、およびＰＳ−ＣＯＯＨに関して画像化した。画像は、Ｎ＝３頭のマウス標本由来であり、１頭の動物につき少なくともＮ＝３枚の画像を得た。ＰＶＳおよびＩＣＳにおける蛍光ＰＳ−ＰＥＧおよびＰＳ−ＣＯＯＨの存在を、すべての画像において定量的に決定した。細胞外腔（ＥＣＳ）およびＩＣＳにおけるＮＰの存在を、以下の群に分類した：１）画像の１００％で一定である、２）全画像の９０％で一定である、３）全画像の８０％で一定である、および４）全画像の２０％未満で一定である。

ｖ．ナノ粒子の外側線条体動脈分布
げっ歯類の線条体における外側線条体動脈を、ＤＡＰＩ染色（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）後の伸長した内皮細胞および扁平な内皮細胞を特定することによって、画像化した切片において視覚的に特定した。これらの内皮細胞を、血管基底膜（ＩＶ型コラーゲン）と共染色することによって、線条体動脈の内層を確認した。Ｚｅｉｓｓ共焦点７１０レーザー走査顕微鏡（倍率４０倍）を使用した高解像度画像を、線条体動脈においてＰＳ−ＰＥＧおよびＰＳ−ＣＯＯＨに関して取得した。ナノ粒子がＰＶＳから逸脱した程度を決定するために、画像を、特注のＭＡＴＬＡＢスクリプトによって処理した。線条体動脈を画定する線を、ＤＡＰＩで染色した内皮細胞に沿って並行に描いた。蛍光ナノ粒子の強度を、１０μｍ間隔で、線条体動脈から１００μｍまで離れて、平均した。少なくともＮ＝３の線条体動脈の血管を、各条件で定量化した。各高解像度画像（倍率４０倍）について実質内のＩＣＳにおけるＮＰのカバー範囲パーセントを、画像の閾値を最大強度の１０％にした特注のＭＡＴＬＡＢ定量化スクリプトを使用して計算した。線条体動脈を裏打ちする扁平なＤＡＰＩで染色した内皮細胞を使用して、ＰＶＳおよびＩＣＳを描出し、ＩＣＳ全体にわたって検出可能な蛍光のみを定量化した。少なくともＮ＝３の線条体動脈画像を、各条件で定量化した。

結果
ナノ粒子の表面電荷を遮蔽することにより、ナノ粒子の分布が強化される
蛍光標識した４０ｎｍのカルボキシル化ポリスチレン（ＰＳ−ＣＯＯＨ）ＮＰプローブを、本発明者らがこれまでに公開したプロトコル（Ｎａｎｃｅ， Ｅ．Ａ．、Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ、２０１２年、４巻（１４９号）、１４９ｒａ１１９）に従って、相当に高密度な表面ＰＥＧコーティングで修飾した。これらの高密度にＰＥＧ化されたＮＰ（ＰＳ−ＰＥＧ）は、およそ６０ｎｍであり、表面電荷（ζ−電位によって示される）がほぼ中性であったが、一方で修飾されていないＰＳ−ＣＯＯＨは、著しくアニオン性の表面電荷を保有していた（図１Ａ）。

ＣＥＤを使用して１００ｎｍ未満の遮蔽されていないＮＰを投与していたこれまでの研究では、有意なＮＰ分布は達成されていないが、これは、ＮＰと脳ＥＣＭとの間の接着性相互作用に起因する可能性が高い（Ｓａｉｔｏら、Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｍｅｔｈｏｄｓ、２００６年、１５４巻（１〜２号）、２２５〜３２頁）。相当に高密度なＰＥＧコーティングを有する１１４ｎｍほどの大きさのＮＰは、健常なげっ歯類および腫瘍げっ歯類の脳組織に急速に拡散することができ、それによって、治療転帰の改善をもたらすことができる（Ｎａｎｃｅら、Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ、２０１２年、４巻（１４９号）、１４９ｒａ１１９；Ｎａｎｃｅら、ＡＣＳ Ｎａｎｏ、２０１４年、８巻（１０号）、１０６５５〜１０６６４頁）。この研究は、ＣＥＤによってもたらされる圧力駆動型の流動により、ＣＦ−１マウスおよびスプラーグドーリーラットの両方において、脳間質全体にわたって非接着性ＮＰの分布がさらに改善されることを示す（図１Ｃ）。１ｍｇ／ｍＬのＮＰ濃度での注入後、非接着性ＮＰの分布容積（Ｖｄ）は、どちらの種においても、修飾されていないＰＳ−ＣＯＯＨのものよりも一貫して高かった（約６〜７倍）。ＣＥＤによって提供される連続的な圧力により駆動される流動でさえも、従来のＮＰ（すなわち、ＰＳ−ＣＯＯＨ）と脳ＥＣＭとの間に生じる接着性相互作用を十分に克服することができないという結論に至った。したがって、ＣＥＤ後に投与地点から離れたＮＰの有意な分布を達成するためには、十分にコーティングされた非接着性ナノ粒子表面が必須である。

ＮＰ分布の制限に対処しようという試みで、いくつかのグループは、ＥＣＭ全体にわたり利用可能な結合ドメインを飽和する小型の従来のＮＰを高濃度で投与し、それによって、残りのＮＰが注入地点から遠くに分布するのを可能にしている（ＭａｃＫａｙら、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ、２００５年、１０３５巻（２号）、１３９〜５３頁；Ｚｈｏｕら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．、２０１３年、１１０巻（２９号）、１１７５１〜５６頁；Ｋｒｏｌｌら、Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ、１９９６年、３８巻（４号）、７４６〜５２頁；考察７５２〜４頁）。したがって、ＮＰのＶｄと、注入されるＮＰの濃度との間の相関性を決定した。ＰＳ−ＰＥＧおよびＰＳ−ＣＯＯＨを、０．１ｍｇ／ｍＬ、１ｍｇ／ｍＬ、および２５ｍｇ／ｍＬで共注入した場合、ＰＳ−ＰＥＧのＶｄは、ＰＳ−ＣＯＯＨのものよりも、それぞれ、１０．７倍、３．６倍、および１．３倍高かった（図１Ｂ）。重要なことに、ＰＳ−ＣＯＯＨのＶｄは、注入されるＮＰの濃度と高度に相関していたが、一方でＰＳ−ＰＥＧでは、濃度に関係なく、高いＶｄが達成された（図１Ｂ）。

このデータにより、非接着性のＮＰが、低い濃度で投与した場合であっても、脳ＥＣＭを克服し、脳間質内での有意な分布を達成することができることが確立される。従来のＮＰは、極めて高いＮＰ濃度で投与した場合にのみ、ＣＥＤ後に脳ＥＣＭを克服し（図１Ｂ）、これは、高度に免疫原性および／または毒性の薬物ペイロードでは転換して適用することができない場合がある。

（実施例２：異なる濃度の注入組成物の効果）
材料および方法
ｉ．脳細孔サイズのｅｘ ｖｉｖｏでの特徴付け
雌性ＣＦ−１マウスから脳を採取し、Ｎａｎｃｅら、Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ、２０１２年、４巻（１４９号）、１４９ｒａ１１９のプロトコルをわずかに修正したものに従って、１．５ｍｍの厚さの脳切片内に注入したナノ粒子に、多重粒子追跡を行った。簡単に述べると、採取したげっ歯類の脳を、低温人工脊髄液ですすぎ、Ｚｉｖｉｃマウス脳成形型（Ｚｉｖｉｃ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）を使用して、１．５ｍｍ間隔で切断した。個々の脳切片を、注入溶液（水、０．９％食塩水、３％食塩水、１０％マンニトール、または２５％マンニトール）中に５分間浸漬した。脳切片を取り出し、特注のウェルに載置し、０．５μＬの蛍光標識したＰＳ−ＰＥＧナノ粒子を、皮質内に注射した。カバーガラスを、標本の上に接着して、組織におけるバルク流を防止した。粒子の軌跡を、１００倍の油浸対物レンズ（開口数１．３）を搭載した落射蛍光倒立顕微鏡（Ａｘｉｏ Ｏｂｓｅｒｖｅｒ Ｄ１、Ｚｅｉｓｓ；Ｔｈｏｒｎｗｏｏｄ、ＮＹ）に取り付けられたＥＭＣＣＤカメラ（Ｅｖｏｌｖｅ ５１２；Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ、Ｔｕｓｃｏｎ、ＡＺ）を使用して、６６ミリ秒の露出で、２０秒の動画として記録した。ナノ粒子の平均二乗変位（ＭＳＤ）を、特注のＭＡＴＬＡＢナノ粒子追跡コードおよび粒子ＭＳＤのヒストグラムに基づいて、計算した。

ｉｉ．ナノ粒子の分布容積の定量化
動物を、ＣＥＤ後１時間で殺処理し、脳を、ホルマリン中に２４時間固定した後、１０％、２０％、および３０％のスクロース勾配に曝露した。脳を載置し、５０μｍの厚さで凍結切片にした（Ｌｅｉｃａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｂｕｆｆａｌｏ Ｇｒｏｖｅ、Ｉｌ）。注射部位から±１．５ｍｍの距離を、注意深く取得した。切片を、Ｄａｋｏ蛍光封入剤（Ｄａｋｏ、Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ、ＣＡ）で固定し、Ｚｅｉｓｓ共焦点７１０レーザー走査顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ、Ｊｅｎａ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、ＧＦＰおよびＣｙ５のチャネルにおいて倍率５倍で画像化した。バックグラウンド蛍光の存在は、注射していない対側脳半球の線条体と比較することによって決定した。共焦点レーザー走査顕微鏡画像を、最大強度の１０％の画像閾値で特注のＭＡＴＬＡＢスクリプトにかけることによって、脳切片の画像を、ＰＳ−ＰＥＧまたはＰＳ−ＣＯＯＨナノ粒子の蛍光分布に関して定量化した。脳室または白質路におけるＮＰの蛍光分布は避け、定量化には含めなかった。各切片から計算された分布面積に、切片の厚さ５０μｍを乗じ、すべての画像にわたって合計して、総分布容積を得た。切片を凍結切断手順中に紛失した場合、分布面積は、前の切片と後の切片の平均として得た。脳標本から１つを上回る切片が紛失されることはほとんどなかった。さらに、ＰＳ−ＣＯＯＨナノ粒子とＰＳ−ＰＥＧナノ粒子との間で観察されたＶｄの差異は、ＧＦＰおよびＣｙ５チャネルの使用に起因するものではなかったことを確実にするために、蛍光マーカーを変えて、蛍光ＰＳ−ＰＥＧナノ粒子（黄緑色、ＧＦＰ）が、ＰＳ−ＣＯＯＨナノ粒子（暗赤色、Ｃｙ５）と比較して有意に強化された分布を呈したことを確認した。

ｉｉｉ．異なる注入溶液の毒性
様々な注入溶液（ＮＰなし）の頭蓋内投与の後に、ＣＦ−１マウスを、有害な毒性の徴候に関してモニタリングした。マウスを、投与の１時間後または７２時間後のいずれかに、殺処理した。脳を採取し、ホルマリン中に２４時間固定した後、Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ＨｉｓｔｏｌｏｇｙによってＨ＆Ｅ染色分析を行った。注射地点は、針によって生じた組織腔によって特定し、それに直接隣接する領域を画像化し、正式な資格を持った神経病理学者によって毒性または出血のエビデンスについて評価した。

２標本のスチューデントｔ検定を使用して、２つの群間での統計学的試験を行った。統計学的比較が、２つを上回る群を伴う場合、検定は、ＳＰＳＳ １８．０ソフトウェア（ＩＢＭ Ｉｎｃ．）を用いて行い、一方向ＡＮＯＶＡを使用した後、テューキー正当有意差（Ｔｕｋｅｙ ｈｏｎｅｓｔｌｙ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ）を使用した。ｔ検定、ＡＮＯＶＡ、およびテューキー検定の差は、ｐ＜０．０５で統計学的に有意であるとみなした。

結果
ｉ．脳の細胞外腔を拡大することにより、ナノ粒子の分布が強化される
脳ＥＣＭとの接着性相互作用から遮蔽されている非接着性ＮＰについては、ＥＣＭの成分により生じる立体障害が、効率的なＮＰの分布に対する主な制限を構成している（Ｎａｎｃｅら、Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ、２０１２年、４巻（１４９号）、１４９ｒａ１１９；ＳｙｋｏｖａおよびＮｉｃｈｏｌｓｏｎ、Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｒｅｖ、２００８年、８８巻（４号）、１２７７〜３４０頁）。この障壁を克服するために、これまでの研究では、脳ＥＣＭの細孔サイズを拡大し、治療薬の分布を強化するように、脳組織をモジュレートしていた（Ｎｅｅｖｅｓら、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ、２００７年、１１８０巻、１２１〜３２頁；ＣｈｅｎおよびＮｉｃｈｏｌｓｏｎ、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ、２０００年、９７巻（１５号）、８３０６〜１１頁；Ｍａｓｔａｋｏｖら、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ、２００１年、３巻（２号）、２２５〜３２頁；Ｍａｍｏｔら、Ｊ Ｎｅｕｒｏｏｎｃｏｌ、２００４年、６８巻（１号）、１〜９頁）。Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎおよび同僚らは、脳組織を中等度に浸透圧が高い溶液（５００ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ）に曝露することが、ＩＣＳの容積を増大させ、ＮＰ拡散に対する組織の累積抵抗を最小限に抑えることを示した（Ｋｕｍｅ−Ｋｉｃｋら、Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ、２００２年、５４２巻（２部）、５１５〜２７頁）。本明細書では、様々な容量オスモル濃度の注入溶液中で、十分に遮蔽されたＮＰを投与することによって、脳ＥＣＭの細孔サイズを変化させた。高浸透圧の食塩水およびマンニトール溶液は、いずれも、高い頭蓋内圧力を低減するために臨床環境で投与されているため、それらを使用した（Ｋａｍｅｌら、Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ、２０１１年、３９巻（３号）、５５４〜９頁）。さらに、マンニトールは、前臨床研究において、治療薬のＣＥＤのための高浸透圧注入溶液として、広く調査されている（Ｎｅｅｖｅｓら、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ、２００７年、１１８０巻、１２１〜３２頁；Ｍａｍｏｔら、Ｊ Ｎｅｕｒｏｏｎｃｏｌ、２００４年、６８巻（１号）、１〜９頁；Ｃａｒｔｙら、Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｍｅｔｈｏｄｓ、２０１０年、１９４巻（１号）、１４４〜５３頁）。すべての注入溶液は、正式に資格を持った神経病理学者によるＨ＆Ｅで染色したマウスの脳の組織分析後に、安全であるとみられた。

脳微小環境を異なる容量オスモル濃度の溶液に曝露した後のＥＣＭ細孔サイズの変化を決定するために、脳の細孔サイズを、確立されているｅｘ ｖｉｖｏ技法を使用してプローブした（Ｎａｎｃｅら、Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ、２０１２年、４巻（１４９号）、１４９ｒａ１１９；Ｎａｎｃｅら、Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ、２０１４年、１８９巻、１２３〜３２頁）。ＰＳ−ＰＥＧの物理化学的特徴は、注入溶液では影響を受けなかったため（表１）、これによって、ＥＣＭ細孔サイズに対する容量オスモル濃度の影響の確認が、正確に評価された。

脳切片を、低浸透圧の水、等浸透圧の０．９％食塩水、または高浸透圧の３％食塩水中でインキュベートし、多重粒子追跡（ＭＰＴ）を使用して、非接着性ＰＳ−ＰＥＧプローブの拡散を定量化した（Ｎａｎｃｅら、Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ、２０１２年、４巻（１４９号）、１４９ｒａ１１９）。１秒間の時間スケールで、高浸透圧の３％食塩水で処理した脳切片では、通常の食塩水中でインキュベートした脳切片と比較して、１．５倍高いＮＰ平均二乗変位（ＭＳＤ）が得られた（図２Ａ）。これは、高浸透圧の食塩水によって生じる浸透圧勾配を介してＩＣＳに引き込まれる水が、ＥＣＭのメッシュ間隙を拡大し（ＣｈｅｎおよびＮｉｃｈｏｌｓｏｎ、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ、２０００年、９７巻（１５号）、８３０６〜１１頁；Ｋｕｍｅ−Ｋｉｃｋら、Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ、２００２年、５４２巻（２部）、５１５〜２７頁）、それによって、脳のＩＣＳ内を移動するＰＳ−ＰＥＧに課される立体障害が低減されたことを示す。対照的に、低浸透圧の水溶液での脳切片処理では、２分の１のＭＳＤ値が得られた（図２Ａ）。この低減されたＰＳ−ＰＥＧ拡散性は、水の取込みによって生じる細胞構造のうっ滞の結果生じる立体障害の増大、およびそれに続くＩＣＳの低減に起因する（ＣｈｅｎおよびＮｉｃｈｏｌｓｏｎ、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ、２０００年、９７巻（１５号）、８３０６〜１１頁）。

ｅｘ ｖｉｖｏで観察されたＩＣＳの浸透圧モジュレーションが、ｉｎ ｖｉｖｏに転換できることを検証するために、ＣＥＤを使用して、ＮＰを、様々な容量オスモル濃度の食塩水注入溶液中で投与し、ＮＰのＶｄに対するそれらの影響を決定した。結果は、非接着性ＰＳ−ＰＥＧのＶｄが、注入溶液の容量オスモル濃度と正相関にあったことを示した。しかしながら、高い容量オスモル濃度の溶液が、ＰＳ−ＣＯＯＨのＶｄに有意な影響を及ぼしたわけではなかった（図２Ｂ）。これは、立体障害が最小限に抑えられた場合であっても、接着性相互作用は、従来のＮＰに対する支配的な制限のままであったことを示す。実際に、等浸透圧溶液および高浸透圧溶液で注入した場合に、ＰＳ−ＰＥＧのＶｄは、ＰＳ−ＣＯＯＨのものよりも、それぞれ、５．８倍および６．８倍高かった。対照的に、ＰＳ−ＰＥＧおよびＰＳ−ＣＯＯＨのＶｄは、低浸透圧の水を注入溶液として使用した場合には有意な差はなく、ＥＣＭの細孔サイズの低減により生じる立体障害の上昇が、ＮＰ分布に対する支配的な制限として機能することを示唆した。これらの観察結果は、ＣＥＤ後の脳間質におけるＮＰ分布を最大化するためには、接着性相互作用および立体障害を同時に最小限に抑えることが重要であることを強調する。

高浸透圧の注入溶液での非接着性ＮＰのＣＥＤは、ＮＰの物理化学的特徴が維持される場合にのみ、有効である。マンニトール注入溶液の容量オスモル濃度を増加させること（１０％から２５％へ）により、ＰＳ−ＰＥＧのｅｘ ｖｉｖｏでの脳組織における拡散性およびｉｎ ｖｉｖｏでの分布が有意に低減された。容量オスモル濃度は、溶質の種類とは無関係な束一的性質であるため、反対の結果は、マンニトールに基づく浸透圧駆動型の水の流動の任意の固有の作用に起因するものである可能性は低い。むしろ、これらの結果は、２５％マンニトール注入溶液中のＰＳ−ＰＥＧのサイズの著しい増加に帰するものであり得、これは、ＥＣＭ細孔拡大の効果を打ち消すものである（表２）。

脳内のウイルヒョウ・ロビン腔としても知られるＰＶＳは、くも膜下腔から脳内への急速なＣＳＦ流のための導管として機能し（Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ、Ｆｌｕｉｄｓ Ｂａｒｒｉｅｒｓ ＣＮＳ、２０１１年、８巻（１号）、７頁）、代謝小分子および老廃物のクリアランスを担う（Ｉｌｉｆｆら、Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ、２０１２年、４巻（１４７号）、１４７ｒａ１１１）。多数の研究により、注射部位から遠くの距離への治療薬の分布は、主として、ＰＶＳを通って生じることが示されている（Ｋｒａｕｚｅら、Ｅｘｐ Ｎｅｕｒｏｌ、２００５年、１９６巻（１号）、１０４〜１１頁；Ｂａｒｕａら、Ｆｌｕｉｄｓ Ｂａｒｒｉｅｒｓ ＣＮＳ、２０１２年、９巻（１号）、２頁）。しかしながら、頭蓋内投与されたＮＰがＰＶＳ内に優先的に輸送され、続いてそこに隔離されることにより（Ｃａｒａｒｅら、Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ Ａｐｐｌ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ、２００８年、３４巻（２号）、１３１〜４４頁）、標的細胞の治療に利用可能なＮＰの用量は有意に低減される。ＰＶＳ内に過剰な治療薬が蓄積することはまた、隣接するマクロファージに対する毒性副作用（ＭａｃＫａｙら、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ、２００５年、１０３５巻（２号）、１３９〜５３頁）、望ましくない免疫応答（Ｂａｒｕａら、Ｆｌｕｉｄｓ Ｂａｒｒｉｅｒｓ ＣＮＳ、２０１２年、９巻（１号）、２頁）、および治療効果の全体的な低減（Ｋｒａｕｚｅら、Ｅｘｐ Ｎｅｕｒｏｌ、２００５年、１９６巻（１号）、１０４〜１１頁；Ｂａｒｕａら、Ｆｌｕｉｄｓ Ｂａｒｒｉｅｒｓ ＣＮＳ、２０１２年、９巻（１号）、２頁）にもつながっている。

ＰＶＳとは対照的に、ＩＣＳを通って分布するＮＰの割合は、ＮＰ拡散に対する脳ＥＣＭの抵抗を低減するように脳組織をモジュレートすることによって増大するであろうという仮説を立てた。したがって、水、０．９％食塩水、および３％食塩水で注入した場合のＰＶＳ内でのＮＰの輸送の範囲を調査するための研究を行った。水で投与したＰＳ−ＰＥＧ ＮＰは、大部分がＰＶＳに限定された（表３）。

しかしながら、通常の食塩水で投与した場合、ＰＳ−ＰＥＧ ＮＰは、ＩＣＳにおいては注射面から最大１．０ｍｍの距離で見出され（表３）、１．５ｍｍで局在化していたのはＰＶＳ内のみであった（表３）。さらに、高浸透圧の３％食塩水で注入したＰＳ−ＰＥＧ ＮＰは、ＩＣＳおよびＰＶＳの両方において最大１．５ｍｍの距離で見出され（表３）、ＩＣＳにおけるＮＰの分布が、ＥＣＭの抵抗を低減することによって強化され得ることを示した。高浸透圧の注入溶液によって達成されたＰＶＳにおけるＮＰ蓄積の低減およびＩＣＳ全体でのＮＰ分布の改善は、これらの製剤を使用して、ＣＥＤの重大な制限を克服することができることを示す。

注入溶液に関係なく、ＰＳ−ＣＯＯＨ ＮＰは、血管にのみ関連していたことがわかった（表３）。食塩水濃度を増大させることにより、ＰＳ−ＣＯＯＨＮＰがＰＶＳを通って輸送される全体的な距離が低減された。水および０．９％食塩水で注入した場合、ＰＳ−ＣＯＯＨ ＮＰは、ＰＶＳにおいて投与面から最大１．５ｍｍの距離で見出され、一方で３％食塩水で注入したＰＳ−ＣＯＯＨ ＮＰは、ＰＶＳにおいて０．５ｍｍまでしか離れずに位置した。距離の低減は、高浸透圧の食塩水中でのＰＳ−ＣＯＯＨ ＮＰの不安定性に帰し得るが（表１）、これは、それらの１μｍを上回るサイズへの急速な凝集により、幅が１μｍ未満である小動脈のＰＶＳを通って輸送するときに遭遇する妨害が増加するためである（Ｐａｔｅｋ， Ｐ．、Ａｎａｔ． Ｒｅｃ．、１９４４年、８８巻（１号）、１〜２４頁）。

ｉｉ．高浸透圧の注入溶液により、血管周囲腔からのナノ粒子の逸脱が可能となる
ＰＶＳの物理的抵抗がＩＣＳのものと比較して固有に低いことに起因して（Ｆｏｌｅｙら、Ａｎｎ Ｂｉｏｍｅｄ Ｅｎｇ、２０１２年、４０巻（２号）、２９２〜３０３頁）、ＰＶＳにおけるＮＰの輸送は、投与パラメーターまたはＮＰの特徴に関係なく、避けることができない。さらに、ＮＰは、ＰＶＳ中に隔離されたままとなり、グリア境界膜を通過することができない（Ｚｈａｎｇら、Ｊ Ａｎａｔ、１９９０年、１７０巻、１１１〜２３頁）。このグリア境界膜は、ＰＶＳとＩＣＳを厳密に区別する、星状細胞の終末（ａｓｔｒｏｃｙｔｉｃ ｅｎｄｆｅｅｔ）によって形成される障壁であり、約２０ｎｍの細胞間開口部しかない（Ｉｌｉｆｆら、Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ、２０１２年、４巻（１４７号）、１４７ｒａ１１１；ＥｎｇｅｌｈａｒｄｔおよびＣｏｉｓｎｅ、Ｆｌｕｉｄｓ Ｂａｒｒｉｅｒｓ ＣＮＳ、２０１１年、８巻（１号）、４頁；Ｐａｐａｄｏｐｏｕｌｏｓら、ＦＡＳＥＢ Ｊ、２００４年、１８巻（１１号）、１２９１〜３頁）。高浸透圧の注入溶液を使用してグリア境界膜をモジュレートすることによって、ＮＰが、ＰＶＳから逸脱し、ＩＣＳ内に分布するように駆動され得るという仮説を立てた。ＮＰを有意に隔離することがこれまでに示されている、大きな血管構造である外側線条体動脈（Ｋｒａｕｚｅら、Ｅｘｐ Ｎｅｕｒｏｌ、２００５年、１９６巻（１号）、１０４〜１１頁）を調査して、ＮＰがこの主幹動脈から逸脱する程度を決定した。水において投与した場合は、ＰＳ−ＰＥＧ ＮＰおよびＰＳ−ＣＯＯＨ ＮＰのいずれも、ＰＶＳに限定され、血管から２０μｍの距離で蛍光が検出されたのは、ＰＳ−ＰＥＧ ＮＰまたはＰＳ−ＣＯＯＨ ＮＰの１０％未満であった（図３Ａ）。同様に、０．９％食塩水で投与した場合、２０μｍの距離で蛍光が観察されたのはＰＳ−ＰＥＧ ＮＰおよびＰＳ−ＣＯＯＨ ＮＰともにほんの２０％であり（図３Ｂ）、非接着性コーティングを有してさえも、ＮＰは、グリア境界膜をＩＣＳへと横切ることができないことを示した。しかしながら、粒子を高浸透圧の３％食塩水で注入した場合、ＰＳ−ＣＯＯＨ ＮＰは、同様にＰＶＳに隔離されたが、ＰＳ−ＰＥＧ ＮＰは、著しく改善されたＰＶＳからの逸脱を示し（図３Ｃ）、高浸透圧溶液と非接着性ＮＰとの組合せが、ＰＶＳ逸脱に必要であることを示した。実際に、ＰＳ−ＰＥＧ ＮＰの６５％が、２０μｍの距離で蛍光が観察され、蛍光の２０％は、１００μｍですら検出可能であった。これらの同じ高解像度の外側線条体動脈画像において、ＰＶＳの外側にある蛍光ＮＰおよび脳ＩＣＳ内にある蛍光ＮＰのカバー範囲パーセントを決定した。３％食塩水で投与したＰＳ−ＰＥＧの蛍光は、画像内のＩＣＳの３０％にわたって検出され、０．９％食塩水で投与したＰＳ−ＰＥＧ（カバー範囲８％）および水で投与したＰＳ−ＰＥＧ（カバー範囲３％）と比較して、有意に高いカバー範囲であった（Ｐ＜０．０５）（図３Ｄ）。

高浸透圧溶液での注入後に非接着性ＮＰがＰＶＳからＩＣＳ内へと移動するのは、本発明者らの前述の脳ＥＣＭ細孔のモジュレーションと類似して、２０ｎｍの星状細胞の細胞間の割れ目の破壊および拡大に帰する可能性が高いと言える。したがって、より大きなＮＰが、次いでＩＣＳ内へと逸脱するが、これは、ＮＰの表面が非接着性となっている場合に限る。注入溶液に関係なく、従来のＮＰは、それらの接着性質によりＰＶＳ内に限定されるため、脳ＩＣＳに再度入ることはできない。現在のところ、小分子（すなわち、水、ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ色素、小デキストラン）および２０ｎｍのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）のみが、ＰＶＳからＩＣＳ内へと分配されることが示されている（Ｓａｌｅｇｉｏら、Ｆｒｏｎｔ Ｎｅｕｒｏａｎａｔ、２０１４年、８巻、９頁；Ｉｌｉｆｆら、Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ、２０１２年、４巻（１４７号）、１４７ｒａ１１１）。直径６０ｎｍほどの大きなＮＰ治療薬の、ＰＶＳからグリア境界膜を通ってＩＣＳ内への送達が、ここで実証された。

ｉｉｉ．他の薬物ナノ担体系への適用が成功した送達戦略
ＮＰプローブモデルに基づく研究を、様々な薬物を送達するための一般的に用いられるＦＤＡに認可されたポリマーである、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）に由来する治療用ＮＰに転換することができる（Ｂａｌａら、Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｔｈｅｒ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔ、２００４年、２１巻（５号）、３８７〜４２２頁）。等浸透圧および高浸透圧の食塩溶液中のＰＬＧＡ系ＮＰのサイズを、特徴付けた。コーティングされていないＰＬＧＡ ＮＰは、製剤化の時点で８０ｎｍであったが、非常に不安定であり、３％食塩水中で急速に凝集した（表４）。

製剤化後に直径が７１ｎｍであった非接着性ＰＬＧＡ−ＰＥＧ ＮＰは、より高い食塩水濃度において安定なままであった。ｉｎ ｖｉｖｏでのＣＥＤ投与後に、蛍光に基づくＮＰ分布の定量化により、ＰＬＧＡ−ＰＥＧ ＮＰの分布に、０．９％食塩水および３％食塩水の両方におけるそのＰＬＧＡ対応物と比較して統計学的に有意な改善が得られた。加えて、ＰＬＧＡ−ＰＥＧのＶｄは、３％食塩水で投与した場合に、０．９％食塩水で投与したＰＬＧＡ−ＰＥＧのＶｄよりも２．７倍高かった（図４Ａ）。ＰＬＧＡ−ＰＥＧの脳間質全体にわたる広範囲な分布は、外側線条体動脈に沿って血管周囲への分布をもたらしたが、一方で、未修飾のＰＬＧＡ ＮＰは、投与地点に局在化したままだった。プローブ粒子での観察と十分に一致して（図３Ｃ）、ＰＬＧＡ−ＰＥＧ ＮＰが、高浸透圧の３％食塩水で投与した場合に、ＰＶＳを逸脱することができることが見出された（図４Ｂ）。血管から２０μｍの距離で、ＰＬＧＡ−ＰＥＧの蛍光の５２％および１２％が、それぞれ、３％食塩水および０．９％食塩水で投与した場合に検出された。さらに、３％食塩水での投与後の脳ＩＣＳ内におけるＰＬＧＡ−ＰＥＧのカバー範囲パーセントは、０．９％食塩水で投与したＰＬＧＡ−ＰＥＧよりも有意に高かった（図４Ｃ、Ｐ＜０．０５）。最後に、投与の１時間後または７２時間後に殺処理した動物は、いずれの時点においても、埋め込んだカテーテルの近傍において、有意な細胞毒性も炎症も示しておらず、急性毒性も慢性毒性も限られていたことを示した。動物は、投与後最大７２時間まで、正常な挙動を示していた。これらの結果は、ＣＥＤ後のＮＰの分布ならびにそれらの薬物ペイロードの最大化には、非接着性表面コーティングと高浸透圧の注入溶液との組合せ使用が必要であることという、プローブＮＰで得られた所見を確認する。したがって、適切な高浸透圧の注入溶液を使用して、治療用の非接着性生体分解性ＮＰを投与することにより、治療薬の分布が強化され、さらには、治療効果を向上するはずである。

結論として、脳内でのＮＰ分布を最大化することに焦点を当て、ＣＥＤを使用して高浸透圧の注入溶液で非接着性ＮＰを投与することによって、脳ＥＣＭ成分による妨害、およびＮＰがＰＶＳへ優先的に輸送され隔離されることの両方を克服し、神経疾患の治療のための前臨床および臨床の両方の環境において、現在ＣＥＤと関連している主な弱点を克服することができる、送達戦略が開発された。

Claims (17)

1. 脳を含む組織へのナノ粒子の送達のための組成物であって、前記組成物は、
   （ｉ）高浸透圧溶液と、
   （ｉｉ）以下：
   第１のポリマー、および
   前記第１のポリマーに連結してコンジュゲートを形成する、第２の親水性で電荷中性のポリマー
   を含む、ナノ粒子と
   を含み、
   前記第２の親水性かつ電荷中性のポリマーが、前記ナノ粒子の表面をコーティングし、
   前記高浸透圧溶液の濃度および前記親水性で電荷中性のポリマーコーティングの密度が、組織内での前記ナノ粒子の拡散および分布を強化する、組成物。
2. 脳実質内への送達のための、請求項１に記載の組成物。
3. 前記ナノ粒子が、１１４ｎｍ未満もしくはそれに等しい、８０ｎｍ未満もしくはそれに等しいまたは６０ｎｍ未満もしくはそれに等しい直径を有する、請求項１に記載の組成物。
4. 前記第２の親水性ポリマーが、ポリエチレングリコール、ポリソルベート８０、ポリエチレングリコール−ポリオキシエチレン、およびこれらの組合せからなる群より選択される、請求項１に記載の組成物。
5. 前記ポリエチレングリコールが、１，０００ダルトンから１０，０００ダルトンの間の分子量を有する、請求項４に記載の組成物。
6. 前記ポリエチレングリコールが、５，０００ダルトンの分子量を有する、請求項５に記載の組成物。
7. 前記第１のポリマーが、ポリ（ヒドロキシ酸）、ポリ無水物、ポリ（オルト）エステル、ポリウレタン、ポリエステル、ポリ（アミン−ｃｏ−エステル）、ポリヒドロキシアルカノエート、これらのブレンドおよびコポリマーからなる群より選択される、請求項６に記載の組成物。
8. 前記ポリ（ヒドロキシル酸（ｈｙｄｒｏｘｙｌ ａｃｉｄ））が、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコール酸）である、請求項７に記載の組成物。
9. 前記高浸透圧溶液が、１％から１０％の間の範囲の濃度の食塩水である、請求項８に記載の組成物。
10. 前記食塩溶液の濃度が、３％である、請求項９に記載の組成物。
11. ナノ粒子全体に対する前記第２の親水性ポリマーの重量パーセントが、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、またはそれよりも高い、請求項１に記載の組成物。
12. 前記コンジュゲートの重量に対する前記第２の親水性ポリマーの重量パーセントが、２５％である、請求項１に記載の組成物。
13. 治療剤、予防剤、および診断剤のいずれかの脳への送達のための投薬製剤であって、
    前記脳への投与のための有効量の請求項１〜１２のいずれかに記載の組成物、および
    前記脳内への送達のための薬学的に許容される賦形剤
    からなる、投薬製剤。
14. 前記組成物が、対流強化送達を使用した、前記脳への直接投与のために製剤化される、請求項１３に記載の製剤。
15. 脳の疾患または障害の１つまたは複数の症状を治療するための方法であって、前記脳に、治療有効量の請求項１〜１２のいずれかに記載の組成物を含む製剤を投与することを含む、方法。
16. 前記製剤が、対流強化送達を使用して、前記脳に投与される、請求項１５に記載の方法。
17. 粒子が、血液脳関門を通る前記粒子の通過を促進する１つまたは複数の技法と組み合わせて投与される、請求項１６に記載の方法。