JP7284095B2 - 3dマイクロ流体細胞培養デバイスを使用して腫瘍細胞スフェロイドを評価するための方法 - Google Patents
3dマイクロ流体細胞培養デバイスを使用して腫瘍細胞スフェロイドを評価するための方法 Download PDFInfo
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Description
本出願は、2017年3月31日に出願された米国仮特許出願第62/480,192号の利益を請求し、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、米国立衛生研究所(National Institutes of Health)により授与されたK08 CA138918-01A1及びR01CA 190394-01の下で、政府の支援と共に為された。政府は、本発明においてある特定の権利を有する。
酵素処理された腫瘍試料から腫瘍スフェロイドを取得し、腫瘍スフェロイドの第1のアリコートを生体適合性ゲル中に懸濁する工程;腫瘍スフェロイドの第2のアリコートを生体適合性ゲル中に懸濁する工程;
生体適合性ゲル中の腫瘍スフェロイドの第1のアリコートを第1の3次元デバイスに入れる工程、
第1のアリコートと、死細胞に選択的な第1のフルオロフォア色素であって、死細胞に結合した場合に第1の波長で蛍光を放出する、第1のフルオロフォア色素とを接触させる工程、
第1のアリコートと、生細胞に選択的な第2のフルオロフォア色素であって、生細胞に結合した場合に第1の波長とは異なる第2の波長で蛍光を放出する第2のフルオロフォア色素とを接触させる工程、
第1のアリコート中の第1及び第2のフルオロフォア色素のそれぞれによって放出された総蛍光を測定する工程、
第2のアリコートを第2の3次元デバイス中で培養する工程、
第2のアリコートと、第1のフルオロフォア色素とを接触させる工程、
第2のアリコートと、第2のフルオロフォア色素とを接触させる工程(第2のアリコートと、第1のフルオロフォア色素及び第2のフルオロフォア色素との接触が、第1のアリコートと、第1のフルオロフォア色素及び第2のフルオロフォア色素との接触の少なくとも24時間後に実行される)、
第2のアリコート中の第1及び第2のフルオロフォア色素のそれぞれによって放出された総蛍光を測定する工程、
を含み、それぞれのアリコート中の生細胞の死細胞に対する比の増加又は減少を評価することができる。
[(%生細胞)+(%死細胞)=100%]
となるように、総蛍光のパーセンテージとして表すことができる。一部の実施形態では、第1のアリコート中の生細胞及び死細胞の相対レベルを、試験化合物で処理された第2のアリコートについて得られた同様の測定値と比較する。第1のアリコートと比較した試験化合物の存在下での(%死細胞)の増加は、試験化合物が細胞死を誘導するのに有効であることを示す。一部の実施形態では、有効な試験化合物の存在下での死細胞のパーセンテージは、試験化合物の非存在下と比較して、約5%、約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、又はそれより大きく増加する。
ex vivoでのプロファイリングのための材料及び方法
患者試料
Massachusetts General Hospital及びDana-Farber Cancer Instituteで処置された患者のコホート(Table S1-1(表4)及びTable S1-2(表5))を、2015年8月から2016年8月までの間、PDOTSプロファイリング及び培養のために集めた。全ての対象からインフォームドコンセントを取得した。腫瘍試料を収集し、Dana-Farber/Harvard Cancer Center IRBによって認可されたプロトコールに従って分析した。これらの研究は、Declaration of Helsinkiに従って行われ、MGH及びDFCI IRBによって認可された。MGH Melanoma Tissue Bankに由来する脱同定された記録一致した血漿及び組織試料を、示されたように抗PD-1療法を用いる処置前又は処置中の患者から取得した。変異分析を、MGH及びDFCIでの臨床的に検証された次世代配列決定(NGS)プラットフォーム上で実施した。PD-1に対する臨床利益(CB)を、疾患の非存在、腫瘍体積の減少(X線若しくは臨床)、又は安定疾患と定義したが、臨床利益を示さない患者(NCB)は、混合応答を示す患者、進行又は処置、及び一次非応答者を含んでいた。
全ての動物実験は、確立された倫理規則を順守して実施され、Dana-Farber Animal Care and Use Committeeによって認可されたものであった。MC38マウス結腸腺癌細胞は、Dr. Gordon Freeman (DFCI)によって寛大に提供され、NCI (Bethesda、MD)のDr. Jeffrey SchlomからMTAの下で受領した。B16F10メラノーマ細胞、CT26結腸癌細胞、及びEMT6乳腺癌細胞は、ATCCから取得した。細胞を拡張し、マイコプラズマ及びマウス病原体について試験したところ、それらを含んでいなかった。解凍した細胞を、5%CO2で維持した加湿されたインキュベーター中、37℃で10%熱不活化FBSを添加したDMEM(MC38、B16F10)又はRPMI1640(CT26)中で最大3回の継代にわたって培養した。血球計とInvitrogen Countess Cell Counterの両方による実行の前に細胞の計数を実施した。滅菌PBS(Ca+、Mg+を含まない)中に再懸濁した、MC38結腸癌細胞、CT26結腸癌細胞、及びB16F10メラノーマ細胞(100μL中の5x105個の細胞/マウス)を、8週齢のメスのC57BL/6アルビノマウス又はBalb/c (Jackson社)に注入し、埋込みの2~3週後に、又はサイズが2000mm3に達した際(又は1週間で15%を超えるBWの減少若しくは瀕死等の人道的な理由が存在していた場合)に腫瘍を収集し、以下に記載のようにMDOTSを調製した。CT26結腸癌細胞の埋込みを、同一の様式でBALB/cマウスを使用して実施した。in vivo処置研究のために、マウスを無作為化(決定論的方法を使用する)した後、10mg/kgのアイソタイプ対照IgG(クローン2A3、BioXCell社)又はラット抗マウスPD-1(クローンRMP1-14、BioXCell社)を、3日毎に8用量分注射し、示されるように腫瘍体積を測定した。調査者は処置群に対して盲検ではなかった。初期腫瘍体積が約100mm3になった後、週ベースで腫瘍体積(TV)をモニタリングした。指数腫瘍増殖期に週2回、TVを測定し、埋込み後、週ベースで体重をモニタリングした。
新鮮な腫瘍標本(マウス及びヒト患者)を、氷上、培地(DMEM)中で受け取り、滅菌鉗子及び外科用メスを使用して10cm皿(氷上)中で細断した。細断された腫瘍を、RPMI中で調製したCT26腫瘍を除いて、DMEM(4.5mMグルコース、100mMピルビン酸ナトリウム、1:100ペニシリン-ストレプトマイシン)(Corning CellGro社、Manassas、VA)+10%FBS(Gemini Bio-Products社、West Sacramento、CA)、100U/mLコラゲナーゼIV型(Life Technologies社、Carlsbad、CA)、及び15mM HEPES(Life Technologies社、Carlsbad、CA)中に再懸濁した。試料を沈降させ、10~20mLの培地中に再懸濁した。RBC Lysis Buffer (Boston Bio-Products社、Ashland、MA)を使用して、目に見えて血液性の試料から赤血球を除去した。試料を沈降させた後、新鮮なDMEM + 10%FBS中に再懸濁し、100μmフィルター及び40μmフィルター上で濾してS1(100μmを超える)、S2(40~100μm)、及びS3(40μm未満)スフェロイド画分を生成した後、超低接着組織培養プレート中で維持した。S2画分を、ex vivoでの培養のために使用した。S2画分のアリコートを沈降させ、NaOHを使用してpHを調整した(pH7.0~7.5、PANPEHA Whatman用紙(Sigma-Aldrich社、St.Louis、MO)を使用して確認した)フェノールレッドを含む10xPBSを添加した後、I型ラット尾部コラーゲン(Corning社、Corning、NY)中に、2.5mg/mLの濃度で再懸濁した。次いで、スフェロイド-コラーゲン混合物を、3Dマイクロ流体培養デバイスの中心ゲル領域中に注入した。PDOTS/MDOTSを含有するコラーゲンヒドロゲルを、37℃で30分後、示された治療的モノクローナル抗体を含む、又は含まない培地で水和した。MDOTSを、アイソタイプ対照IgG(10μg/mL、クローン2A3)又は抗PD-1(0.1、1.0、10μg/mL、クローンRMP1-14)で処理した。モノクローナルラット抗マウスCCL2(5μg/mL、クローン123616、R&D Systems社)を、MDOTS中でのCCL2中和のために使用した。PDOTSを、抗PD-1(ペンブロリズマブ、250μg/mL)、抗CTLA-4(イピリムマブ、50μg/mL)、又は組合せ(250μg/mLのペンブロリズマブ+50μg/mLのイピリムマブ)で処理した。10mg/kg(FDA CDER適用)の投与後、各薬物の報告されたピーク血漿濃度と一致するように用量を選択した(臨床的に使用されるストック濃度の1:100希釈液)。選択実験では、PDOTSを、InVivoMAbヒトIgGアイソタイプ対照(BioXCell社)で処理した。免疫細胞を欠くスフェロイド培養のために、MC38又はCT26細胞(1x106個)を、24時間にわたって低接着条件で播種し、濾過した(上記のように)。S2画分を沈降させ、コラーゲン中に再懸濁した後(上記のように)、マイクロ流体培養を行った。
MC38及びB16F10同系マウスモデルに由来する腫瘍を、上記のように調達した。PBS中で1:500に希釈したZombie NIR Fixable Viability Kit (Biolegend社、423105)を使用して、暗室中、室温で20分間、細胞をインキュベートした。フローサイトメトリー染色緩衝液(PBS + 5%FBS)中、1:100希釈率で、4℃で15分間、抗マウスCD16/CD32クローン2.4G2ブロッキングAb(Fisher Scientific社)と共にインキュベートすることにより、FcRを遮断した。フローサイトメトリー染色緩衝液中に希釈された以下のAb(総染色容量100μL):リンパ球染色パネル-CD45 AF488(BioLegend社、103122)、CD25 PE(BioLegend社、101904)、CD19 PE-Dazzle (115554)、CD49b PE-Cy7 (BioLegend社、108922)、CD3 BV421 (BioLegend社、100228)、CD8 BV510 (BioLegend社、100752)、CD4 BV786 (Fisher Scientific社、#BDB563331);骨髄染色パネル-F4/80 AF488 (BioLegend社、#123120)、MHCII PE (BioLegend社、#107608)、CD11c BV421 (BioLegend社、#117330)、Ly6G BV510 (BioLegend社、#127633)、CD11b BV650 (BioLegend社、#101239)、Ly6C BV711 (BioLegend社、#128037)、CD45 BV786 (Fisher Scientific社、#BDB564225)、CD19 APC-Cy7 (BioLegend社、#115530)、及びCD49b APC-Cy7 (BioLegend社、#108920)を使用して、4℃で20分間インキュベートすることにより、細胞表面染色を実施し、これらはZombie NIR生存能力染色によって決定された死細胞と共にダンプチャネルとして使用される骨髄染色パネルと共に含まれていた。細胞表面染色の後、室温で10分間、200μLのIC Fixation Buffer (eBioscience社、#00-8222-49)中でインキュベートすることにより、細胞を固定した。細胞を洗浄し、フローサイトメトリー染色緩衝液中に再懸濁し、次の日、BD LSR Fortessaフローサイトメーター上で読み取った。データを、FlowJoソフトウェアバージョン10.0.8を使用して分析した。
100mgの元の試料質量あたり、250μLのL/D 1X希釈液の比で、FACS緩衝液(PBS + 2%FBS)中、暗室中、室温で8分間、Live/Dead Fixable Yellow Dead Cell Stain Kit (Life Technologies社、Carlsbad、CA)又は暗室中、室温で5分間、Live/Dead Fixable Zombie NIRTM (Biolegend社、San Diego、CA)と共に細胞をインキュベートした。表面マーカー及び細胞内染色を、製造業者のプロトコール(eBioscience社、San Diego、CA)に従って実施した。Human FcR Blocking Reagent (Miltenyi社、San Diego、CA)を使用して、表面抗体染色の前にFcRを遮断した。細胞を1%PBS + 2%FBS中で固定し、洗浄した後、FACSDivaソフトウェア(BD Biosciences社、San Jose、CA)を含むBD LSRFortessa上で分析した。データを、FlowJo (Ashland社、OR)ソフトウェアバージョン10.0.8を使用して分析した。細胞生存能力を、陰性生/死細胞染色によって決定した。抗体は、以下のヒトマーカー: CD3 (HIT3a; UCHT1)、CD8 (RPA-T8)、CD14 (M5E2; MphiP9)、CD45 (HI30)、CD56 (B159)、CCR7 (150503)、EpCAM (EBA-1)、HLA-DR (G46-6)、PD-1 (EH12.1)、及びBD Biosciences社(San Jose、CA)製のIgG1アイソタイプ対照(MOPC-21); CD3 (UCHT1)、CD4 (RPA-T4)、CD14 (M5E2)、CD15 (W6D3)、CD16 (3G8)、CD19 (HIB19)、CD25 (BC96)、CD33 (WM53)、CD38 (HIT2)、CD40L (24-31)、CD45 (HI30)、CD45RA (HI100)、CD45RO (UCHL1)、CD56 (HCD56; 5.1H11)、CD66b (G10F5)、CD69 (FN50)、CD123 (6H6)、CD163 (GHI/61)、CTLA-4 (L3D10)、CX
CR5 (J252D4)、EpCAM (9C4)、Ki-67 (Ki-67)、PD-1 (EH12.2H7)、PD-L1 (29E.2A3)、PD-L2 (24F.10C12)、TIM-3 (F38-2E2)、BioLegend社(San Diego、CA)製のIgG2aアイソタイプ対照(MOPC-173)、IgG2bアイソタイプ対照(MPC-11)、及びIgG1アイソタイプ対照(MOPC-21); Cell Signaling Technologies社(Danvers、MA)製のパン-サイトケラチン(C11)及びPD-L1 (E1L3N); Affymetrix社/eBioscience社(San Diego、CA)製のCD45 (2D1)、FOXP3 (236A/E7)、及びIL-10 (236A/E7)に特異的であった。免疫細胞(CD45+)、腫瘍細胞(CD45-CD31-CD90-)、がん関連線維芽細胞(CD45-CD31-CD90+)、及び内皮細胞(CD45-CD31+CD144+)の4つの方法でのフロー選別を、単一ステイン対照を使用するゲートセット及び以下の抗体: CD31-APC (Biolegend社、303115)、CD45-BV711 (Biolegend社、304050)、CD90-PE/Cy7 (Biolegend社、328123)、及びCD144-PE (Biolegend社、348505)を使用する手動補正を用いてBD Aria II SORP上で行った。細胞を、冷PBS中で選別し、氷上で保存した後、確立された技術を使用してmRNAを抽出した。
マイクロ流体デバイスの設計及び製造を、より大きい容量の培地を収容するためにデバイスの寸法を改変して、当業界で公知の方法に従って実施した(例えば、その内容の全体が参照により本明細書に組み込まれるAref, A. R.ら、Integr. Biol. (Camb.) (2013))。また、選択研究のために、DAX-1 3D細胞培養チップ(AIM Biotech社、Singapore)を使用して、MDOTSも評価した。
マイクロ流体デバイスに、Nexcelom ViaStain(商標)AO/PI Staining Solution (Nexcelom社、CS2-0106)をロードすることにより、二重標識化を実施した。色素と共にインキュベートした後(暗室中、室温で20分間)、Zスタック(Prior社)及びCoolSNAP CCDカメラ(Roper Scientific社)を装備したNikon Eclipse 80i蛍光顕微鏡上で画像を捕捉した。画像の捕捉及び分析を、NIS-Elements ARソフトウェアパッケージを使用して実施した。AutoQuant Moduleを使用して、画像解析を行った。複数の捕捉物を縫い合わせることにより、全デバイス画像を達成した。生細胞及び死細胞の定量化を、それぞれの色素の総細胞面積を測定することによって実施した。3つの異なる研究室が、PD-1遮断後のMC38 MDOTSの免疫媒介性細胞死を検証した。CD8+T細胞の細胞傷害性を阻害するために、CT26 MDOTSを、10μg/mLの抗CD8α Ab(クローン53-6.72、BioXCell社)で処理した。上記のようなCT26同種移植片を使用して、腫瘍間及び腫瘍内不均一性実験を実施した。より小さい同種移植片から調製されたMDOTSと共に、より大きい腫瘍の別々の小片を使用してMDOTSを調製した。MDOTSを、上記のようにプロセシングし、処理し、プロファイリングした。CD8+T細胞に関する免疫蛍光を、以下に記載のように実施した。
免疫蛍光研究のために、PDOTS及びMDOTSをPBSで洗浄し、室温で30分間、FcRブロッキング試薬(PDOTS-Miltenyi社、Cambridge、MA、MDOTS-BioLegend社、San Diego、CA)で遮断した。PDOTSのための直接コンジュゲート化抗体は、CD326 EpCAM-PE (クローン9C4)、CD45-AlexaFluor-488 (HI30)、CD8a-AlexaFluor488 (RPA-T8)であり; MDOTSについては、CD45-AlexaFluor488又は647 (30-F11)、CD8a-PE (53-6.7) (BioLegend社、San Diego、CA)であった。抗体を、PBS中のHoechst 33342 (Thermo Fisher Scientific社、Waltham、MA)の10μg/mL溶液中で1:50に希釈し、暗室中、室温で1時間のインキュベーションのためにマイクロ流体デバイス中にロードした。スフェロイドを、0.1%Tween20を含むPBSで2回洗浄した後、PBSで洗浄した。生存能力評価のために、マイクロ流体デバイスに、PBS中のカルセインAM(Thermo Fisher Scientific社、Waltham、MA)の1:1000溶液をロードした。Zスタック(Prior社)及びCoolSNAP CCDカメラ(Roper Scientific社)を装備したNikon Eclipse 80i蛍光顕微鏡上で画像を捕捉した。画像の捕捉及び分析を、NIS-Elements ARソフトウェアパッケージを使用して実施した。明視野低速度撮影画像を、加湿され、温度制御されたチャンバー中、10x NA 0.3対物及び冷却したCCDカメラ(Orca R2、Hamamatsu社)を用いて捕捉した。発光は、CoolLED pe-100白色LEDによるものであった。経時的ないくつかの視野の低速度撮影イメージングを、LED及びカメラと共にPrior電動ステージのNISElementsソフトウェアによって制御した。
Bio-plex 200システム(カタログ番号171000201)上で、2つの多重アッセイ、Bio-Plex Pro(商標)Human Cytokine 40-plex Assay (カタログ番号171AK99MR2)及びBio-Plex Pro(商標)Mouse Cytokine Panel 1,23-plex (カタログ番号M60009RDPD)を、ビーズに基づく免疫アッセイ手法を使用して実施した。それぞれのタンパク質のMDOT/PDOT条件化培地濃度レベル[pg/mL]は、5パラメータ曲線適合モデルに由来するものであった。MDOT/PDOT対照と比較した倍数変化を算出し、log2FCとしてプロットした。定量の下限及び上限(LLOQ/ULOQ)を、検出より上又は下のサイトカインに関する標準曲線から帰属させた。PDOTSに由来する条件化培地をきちんとアッセイし、血漿を1:4に希釈した。
抗PD-1による療法前及び療法中のメラノーマのヘマトキシリン&エオシン(H&E)で染色した52の切片を、これらの腫瘍の末梢での三次リンパ様構造(TLS)の存在について2人の皮膚科医によって独立に評価した。これらのものは、図10Aに示されるように、時には、胚中心形成及び関連する高内皮細静脈と共に、顕著なリンパ球浸潤を特徴とする。
新鮮に単離された患者腫瘍試料(DF/HCCプロトコール11-181に同意した患者由来)を、液体窒素中で簡易凍結し、Qiagen RNeasy Miniキットを使用してRNAを収集した。RNAライブラリーを、標準的なIllumina社のプロトコールを使用して、試料あたり250ngのRNAから調製した。RNA配列決定を、Broad Institute (Illumina社、HiSeq2000)及びWistar Institute (Illumina社、NextSeq 500)で実施した。RNA試料をリボゼロ処理した後、Epicentre社のScriptSeq Complete Goldキットを使用してライブラリープレップにかけた。品質チェックを、High Sensitivity DNAキットを使用してBioanalyzer上で行い、定量化を、KAPA Quantificationキットを使用して実行した。生のRNA-seqデータ(BAMファイル)のリード数を、ペアエンドのみし、キメラではなかったパラメータを用いるfeatureCountsによってまとめ、良好にマッピングされた(20以上のマッピング品質)リードを計数する。次いで、正規化を適用して、edgeR、かくして、RPKM(100万のマッピングされたリードあたり転写物1キロベースあたりのリード)により、配列決定深度及び遺伝子長に由来する偏りを除去した。
定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(qRT-PCR)によるCCL19及びCXCL13の発現レベルの分析を、転移性メラノーマを有する患者から得られた組織試料を使用して実施した。試料を、処理前及び処理中に利用可能な組織と共に抗PD-1療法で処置した患者から選択した。全ての患者が、DF/HCCプロトコール11-181(Melanoma Tissue and Blood Collection)に対する同意文書を提供した。組織試料を液体窒素中で簡易凍結し、プロセシングしてRNAを得て、抽出後に-80℃で保存した。正常リンパ節組織を、CCL19及びCXCL13の発現に関する陽性対照として使用した。プライマーを、CXCL13(Fwd: 5'-GAGGCAGATGGAACTTGAGC-3'(配列番号1)、Rev: 5'-CTGGGGATCTTCGAATGCTA-3'(配列番号2))及びCCL19 (Fwd: 5'-CCAACTCTGAGTGGCACCAA-3' (配列番号3)、Rev: 5'-TGAACACTACAGCAGGCACC-3'(配列番号4))のために設計し、総RNAを、QIAGEN TissueRuptorを用いて粉砕した後、QIAGEN RNeasy Mini Kitにより抽出した。抽出プロセスを、QIAGEN QIAcubeによって自動化した。RNAを、1.5mLのRNAse非含有EPチューブ中で保存した後、QIAGEN Qubitを使用して定量した。Applied Biosystems 2720 Thermo Cycler上でInvitrogen Superscript VILOキットを使用して、cDNAをRNAから逆転写した後、後に使用するまで-40℃の冷凍庫中、1.5mLチューブ中で保存した。qPCRのために、ウェルあたり20μLの総容量でBio-Rad社のSsoAdvanced Universal SYBR Green Supermixを使用するRoche社のLightCycler 96上で3回、試料を泳動した。β-チューブリン(Fwd: 5'-CGCAGAAGAGGAGGAGGATT-3'(配列番号5)、Rev: 5'-GAGGAAAGGGGCAGTTGAGT-3'(配列番号6))を使用して、標的遺伝子の発現を正規化した。4回の泳動を実施した。RT-PCRを3回実施し、値を平均した。PD-1遮断の効果を、処理前試料と比較した処理中試料に由来するCCL19又はCXCL13発現(β-チューブリンに対して正規化される)のlog2倍数変化として記載した。選別された細胞集団中でのCCL19/CXCL13発現の分析のために(図10H)、以下のプライマー: CXCL13 (Fwd: 5'-CTCTGCTTCTCATGCTGCTG-3'(配列番号7)、Rev: 5-TGAGGGTCCACACACACAAT-3'(配列番号8))及びCCL19 (Fwd: 5'-ATCCCTGGGTACATCGTGAG-3'(配列番号9)、Rev: 5'- GCTTCATCTTGGCTGAGGTC-3'(配列番号10))を使用して、また、遺伝子発現を正規化するためには、36B4 (Fwd: 5'-CAGATTGGCTACCCAACTGTT-3'(配列番号11)、Rev: 5'-GGAAGGTGTAATCCGTCTCCAC-3'(配列番号12))を使用して、当業界で公知の方法(例えば、その内容の全体が参照により本明細書に組み込まれる、Zhu, Z.ら、Cancer Discov. (2014))に従ってqRT-PCRを実施した。
4μmのホルマリン固定パラフィン包埋切片上で、免疫組織化学染色を実施した。全ての手順を、自動化Ventana Discovery Ultra染色システム上で行った。切片を、EZ prep溶液を使用して最初に脱パラフィン化し、Cell Conditioning溶液1を使用して抗原回収を達成した。切片を、Discovery Inhibitor(全てVentana社製)で遮断した。切片を、集団マーカーについては16分間並びにCXCL13及びCCL19については12時間、一次抗体と共にインキュベートした後、洗浄し、西洋わさびペルオキシダーゼ(HRP)(Ventana社、カタログ番号760-4310及び760-4311)とコンジュゲートさせたOmniMap抗マウス又は抗ウサギ抗体と共に更に16分間インキュベートした。次いで、Discovery Purple又はOmniMAP DAB色原体キット(カタログ番号760-229又は760-159)を適用して、呈色反応を生成させた。次いで、スライドを、ヘマトキシリンII、次いで、ブルーイング試薬(Ventana社、カタログ番号790-2208及びカタログ番号760-2037)で対抗染色した。染色のために使用した一次抗体は、抗CCL19抗体(RD Systems社、カタログ番号MAB361-100; 1:200)及び抗CXCL13抗体(Abcam社、カタログ番号ab112521; 1:150)、CD31 (Cell Marque社、カタログ番号131M-94; 1:500); αSMA (Abcam社、カタログ番号ab5694; 1:400)であった。
示差的CCL19及びCXCL13遺伝子発現分析のためのデータを、公開された報告(例えば、それぞれの内容の全体が参照により本明細書に組み込まれる、Hugo, W.ら、Cell (2016)、Chen, P. L.ら、Cancer Discov. (2016)、Van Allen, E. M.ら、Science (2015)、Cancer Genome Atlas、N. Cell (2015))から取得した。Hugoら、及びVan Allenらのデータについて、トランスクリプトーム配列決定データを、TopHatを使用して整列させ、100万あたりの転写物(TPM)として提示される、正規化された遺伝子発現を、DESeq2(例えば、それぞれの内容の全体が参照により本明細書に組み込まれる、Kim, D.ら、Genome Biol. (2013)、及びLove, M.I.ら、Genome Biol. (2014)を参照されたい)を使用して定量した(Table S3(表10))。PD-1応答者(n=4)及び非応答者(n=8)に関するNanoString供給源データ(Chenら)を比較し(PD-1中/PD-1前)、log-2倍数変化として表した。TCGA分析のために、TCGA SKCM試料の生のRNA-Seqデータ(BAMファイル)を、Genomic Data Commonsからダウンロードし、リードカウントをまとめ(featureCounts)、edgeRを使用して正規化して、RPKMを生成した。CCL19及びCXCL13試料を、RPKM値のk平均クラスタリングによって2群:高群及び低群に分け、それぞれの群の中央値を使用して、高い又は低いと標識した。これらの2群(高;n=206及び低;n=257)上で、Kaplan-Meier法に従って生存曲線を構築し、ログランク(Mantel-Cox)検定(α=0.05)を使用して群間で生存を比較した。高発現及び低発現を定義するための中央カットオフを使用して、4つの方法のグループ分けを実施した。単一試料のGSEA(ssGSEA)を、当業界で公知の方法(例えば、内容全体が参照により本明細書に組み込まれるBindea, G.ら、Immunity (2013))に従って免疫細胞シグネチャーを使用して実施した。
工程1:0℃のN,N-ジメチルホルムアミド(150mL)中の2,4-ジクロロ-1,3,5-トリアジン(9.5g、63mmol)の溶液(アルゴンバルーンでフラッシュ)に、N,N-ジメチルホルムアミド(100mL)中の4-(4-オキセタン-3-イル)ピペラジン-1-イル)アニリン(14.1g、60.2mmol)の溶液を、カニューレを介して5分かけて添加し、氷浴中で1時間撹拌した。40%メタノール/CH2Cl2の溶液(200mL)を反応混合物に添加し、室温で撹拌した。1時間後、形成された固体を濾過し、ジエチルエーテルで2回洗浄した。固体を収集して、第1の生成物ロットを提供した。濾液に、ジエチルエーテル(200mL)を添加し、室温で一晩撹拌した。固体を濾過によって分離して、第2の生成物ロットを提供した。両ロットを合わせて、合計収量20g(91%)の4-クロロ-N-(4-(4-(オキセタン-3-イル)ピペラジン-1-イル)フェニル)-1,3,5-トリアジン-2-アミンを提供し、これを精製することなく使用した。LCMS-ESI+ (m/z): C16H19ClN6Oに関する計算値: 346.1; 実測値: 347.1 (M+H)。
TBK1、IKKε(IKBKE)、及びオフターゲットキナーゼの生化学的単一点阻害及びIC50濃度を、SelectScreen Kinase Profiling Services (Madison、WI、USA)を使用してThermoFisher Scientific社で決定した(Table S4A(表11)及びTable S4B-1~7(表12~表18))。細胞効力を決定するために、ヒト結腸直腸がん細胞株HCT116(ATCC、Manassas、VA)を、完全RPMI培地;10%FBS、1Xペニシリン-ストレプトマイシン溶液及び1X MEM(非必須アミノ酸)を添加したRPMI 1640中、T175フラスコ中で維持した。HCT116細胞を、完全RPMI培地を含有するT175フラスコ中で90~95%の集密度まで増殖させ、70μgのISG54-ルシフェラーゼリポータープラスミド(Elim Biopharmaceuticals Inc.社、Hayward、CA)と共にLipofectamine 2000(Invitrogen社、Carlsbad、CA)を使用してバルクでトランスフェクトした。リポータープラスミドは、ヒトインターフェロン刺激遺伝子54(ISG54)のプロモーターの転写調節下にルシフェラーゼ遺伝子発現カセットを含有する。細胞のトランスフェクションを6時間にわたって起こさせた後、0.25%トリプシンEDTA(Corning Inc.社、Corning、NY)を用いる処理により、細胞を収集した。トリプシン処理された細胞を、384ウェルのポリ-d-リシン処理された黒色透明底の組織培養アッセイプレート(Greiner Bio-One GmbH社、Kremsmunster、Austria)に、80μLの完全RPMI培地中、20,000個の細胞/ウェルの密度で添加し、一晩インキュベートした。トランスフェクションの16~18時間後、アッセイプレートをPBS(Corning Inc.社、Corning、NY)で洗浄した後、1Xペニシリン-ストレプトマイシン溶液、1X MEM及び350nLのDMOSO又は化合物1の滴定物を含有する80μL/ウェルの無血清RPMI 1640培地を添加した。化合物1の滴定物を、2つの重複する連続希釈系列中、1.5倍の希釈段階によって生成して、40点の化合物用量範囲を生成した。37℃で1時間インキュベートした後、Optimem培地(Life Technologies社、Rockville、MD)中、15μg/mLの最終濃度のポリ(I:C) (InvivoGen社、San Diego、CA)で細胞を刺激した。アッセイプレートを、37℃で5時間インキュベートした後、1:1の容量/ウェルでOne-Glo蛍ルシフェラーゼ試薬(Promega社、Madison、WI)を添加し、EnVision Multilabel Plate Reader (PerkinElmer社、Santa Clara、CA)中で発光を測定した。EC50値を、用量応答曲線の適合から4パラメータ式まで算出した。全てのEC50値は、4つの決定値の最小の幾何平均値を表す。
新鮮に単離されたヒトCD4+及びCD8+T細胞を、AllCells社(Alameda、CA、USA)から入手した。細胞をスピンダウンし、5ng/mLのIL-17を添加した無血清Xvivo15培地(Lonza Walkersville, Inc.社、Chicago、IL、USA)中に再懸濁し、37℃で一晩インキュベートした。細胞を、2μg/mLの抗CD28抗体(eBioscience社、Dallas、TX、USA)と共に抗CD3抗体被覆プレート(5μg/mLのOKT3、eBioscience社、Dallas、TX、USA、一晩)上に塗布した。IL-2については24時間及びIFNγについては96時間にわたる化合物1の用量滴定を用いて、反復プレート中で細胞を処理した。上清中のIL-2及びIFNγを、単一又は多重免疫アッセイ(Mesoscale Discovery社、Rockville、MD、USA)を使用して測定した。抗CD3抗体被覆プレート上に塗布されたJurkat T細胞白血病細胞(ATCCから取得したクローンE61)を、化合物1の用量滴定を用いて24時間処理した。上清中のIL-2を、上記のように測定した。
組合せ試験を、vivoPharm社(Hummelstown、PA、USA)によって実施した。これらの試験の実施において使用された全手順を、US_SOPvP_EF0314「General Procedures for Efficacy Studies」を特に参照して、vivoPharm社のStandard Operating Proceduresに従って実行した。CT26結腸癌細胞(100μL中の1x106個の細胞/マウス、継代2~3)を、無血清DMEM中に再懸濁し、11~12週齢のメスのBalb/cマウス(Charles River Laboratories社)の右上脇腹に埋め込んだ。CT26に関する腫瘍サイズに基づくマッチドペア分布法を使用して、マウスを10匹の4分に無作為化した。処置を、125.85mm3の投与開始時の平均腫瘍体積を接種した12日後に開始した。ビヒクル又は化合物1(40mg/kg)を、26日間にわたって経口強制摂取により毎日投与し、アイソタイプ対照又は文献報告(例えば、内容全体が参照により本明細書に組み込まれるDeng, R.ら、MAbs (2016))からクローニングされ、マウスIgG1フレームワーク(10mg/kg)中に入れたリバースキメラ抗PD-L1抗体を、合計6用量にわたって5日毎に投与した。調査者は、処置群に対して盲検ではなかった。αPD-L1と化合物1との組合せ療法に対する例外応答を示すCT26腫瘍を担持するマウスに、CT26細胞(1x106個、左下脇腹)及びEMT6細胞(0.5x106個、左上脇腹)を再度埋め込んで、免疫記憶の発達を評価した。MB49及びMC38のin vivoでの組合せ試験を、B6マウスにおいて同一の条件下で実施した。B16F10尾静脈注射試験を、当業界で公知の方法(例えば、内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Zhang, J.ら、Cell Rep. (2016))に従って実施した。尾静脈注射(100μL中の1x105個の細胞)後、マウスを、13日間にわたって毎日、ビヒクル又は40mg/kgの化合物1で、0、5、及び10日目に±抗PD-L1(10mg/kg)又はアイソタイプ対照で処置した。マウスを13日目に犠牲にし、肺転移を定量した(小≦1mm、中>1mmかつ≦3mm、大>3mm)。大きい肺転移は検出されなかった。
全てのグラフは、別途指摘しない限り、平均±s.d.を意味する。グラフを生成し、GraphPad/Prism (v7.0)及びR統計パッケージを使用して統計学的分析を実施した。MDOTSのための21種の細胞表面マーカーを使用するPearsonの相関マトリックスを、腫瘍及び異なるサイズのスフェロイドにわたってRを用いて算出した。教師なし階層的クラスター分析を、GenePatternを使用して実施した。
器官型腫瘍スフェロイドを使用するPD-1遮断のex vivoでのプロファイリング
循環腫瘍細胞(CTC)、オルガノイド培養、及び患者由来異種移植片(PDX)等の現行の患者由来がんモデルは、高精度がん療法を指導することができるが、生成するのに数週間から数カ月かかり、天然の腫瘍免疫微小環境を欠く。患者における抗腫瘍免疫応答を研究するための現在の手法もまた、全血若しくは血漿中における測定が遠隔で行われ、又は生検の評価が静的であることによって制限される。これらの課題を克服し、ex vivoでの免疫チェックポイント遮断(ICB)をモデル化するために、3Dマイクロ流体デバイスを、マウス及び患者由来器官型腫瘍スフェロイド(MDOTS/PDOTS)の短期培養に適用した。新鮮な腫瘍標本の限定的なコラゲナーゼ消化の後、自己免疫細胞を有する多細胞器官型スフェロイドを単離した。MDOTS/PDOTSを、フローサイトメトリー(図5)によって分析したか、又はコラーゲン中、抗PD-1又は抗CTLA-4抗体への曝露のためにデバイスの中心チャネルにロードした(図1A)。
ex vivoでの処置後のMDOTS/PDOTSのトランスクリプトーム分析
上清を収集した後に、デバイス内のMDOTSのサブセットからRNAを収集し、RNA配列決定のためのcDNAライブラリーを生成して、薬物処置あたりの単一の試料上での処置レジメンと関連する全体的なトランスクリプトーム変化を評価する。これらの型のデータを、様々な臨床標本から生成することができる。溶出容量がRNA-Seqライブラリー調製のための試料入力に従うのを容易にする、ビーズ洗浄に基づく分離技術である、RNA Advance組織RNA単離法(Beckman Coulter社)を使用する。自動化ライブラリー調製を、わずか10ngの良品質RNAを使用して実施することができる。ゲノムのコード領域を富化する、Illumina社製のRNA Access法を使用する。ライブラリーを、NextSeq500プラットフォーム上で、75bpの単一末端として配列決定して、試料あたり約2000万のリードを生成する。適切なアダプターを用いて、24の試料をそれぞれのNextSeq500泳動上で多重化する。MDOTSに由来する、濃度[ng/μl]、収量[ng]及びRNAの品質(バイオアナライザーによる高いRIN数)は、その後の配列決定のための良品質ライブラリーを確保するために十分過ぎるほどである(図15)。
いくつかの発明の実施形態を本明細書に記載及び例示してきたが、当業者であれば、本明細書に記載の機能を実施するため、並びに/又は本明細書に記載の結果及び/若しくはその1つ若しくは複数の利点を得るために様々な他の手段及び/又は構造を容易に想定することができ、そのような変更及び/又は改変はそれぞれ、本明細書に記載の発明の実施形態の範囲内にあると見なされる。より一般的には、当業者であれば、本明細書に記載の全てのパラメータ、寸法、材料、及び構成が例示を意味すること、並びに実際のパラメータ、寸法、材料、及び/又は構成が、発明の教示が使用される特定の用途又は複数の用途に依存することを容易に理解できる。当業者であれば、日常的なものを超えない実験を使用して、本明細書に記載の特定の発明の実施形態に対する多くの均等物を認識する、又は確認することができる。したがって、前記実施形態は、ほんの一例によって提供されるものであること、並びに添付の特許請求の範囲及びその均等物の範囲内で、具体的に記載され、特許請求されるもの以外の発明の実施形態を実施することができることが理解されるべきである。本開示の発明の実施形態は、本明細書に記載のそれぞれ個々の特徴、システム、品目、材料、キット、及び/又は方法に関するものである。更に、そのような特徴、システム、品物、材料、キット、及び/又は方法が相互に矛盾しない場合、2つ以上のそのような特徴、システム、品物、材料、キット、及び/又は方法の任意の組合せが、本開示の発明の範囲内に含まれる。
Claims (37)
- 3次元マイクロ流体デバイス中の患者由来の原発腫瘍細胞スフェロイド中の生細胞の死細胞に対する比を評価するための方法であって、
酵素処理された腫瘍試料から患者由来の原発腫瘍細胞スフェロイドを取得する工程であって、該原発腫瘍細胞スフェロイドが約10μm~約500μmの直径を有する、工程、
患者由来の原発腫瘍細胞スフェロイドの第1のアリコートを生体適合性ゲル中に懸濁する工程;
患者由来の原発腫瘍細胞スフェロイドの第2のアリコートを生体適合性ゲル中に懸濁する工程;
前記生体適合性ゲル中の患者由来の原発腫瘍細胞スフェロイドの第1のアリコートを第1の3次元マイクロ流体デバイスに入れる工程、
第1のアリコートと、死細胞に選択的な第1のフルオロフォア色素であって、死細胞に結合した場合に第1の波長で蛍光を放出する、第1のフルオロフォア色素とを接触させる工程、
第1のアリコートと、生細胞に選択的な第2のフルオロフォア色素であって、生細胞に結合した場合に第1の波長とは異なる第2の波長で蛍光を放出する第2のフルオロフォア色素とを接触させる工程、
第1の3次元マイクロ流体デバイス内で、第1のアリコート中の患者由来の原発腫瘍細胞スフェロイドにおける第1及び第2のフルオロフォア色素のそれぞれによって放出された総蛍光を測定する工程、
前記生体適合性ゲル中の患者由来の原発腫瘍細胞スフェロイドの第2のアリコートを第2の3次元マイクロ流体デバイス中に入れる工程、
第2のアリコートと、第1のフルオロフォア色素とを接触させる工程、
第2のアリコートと、第2のフルオロフォア色素とを接触させる工程であって、第2のアリコートと、第1のフルオロフォア色素及び第2のフルオロフォア色素との接触が、第1のアリコートと、第1のフルオロフォア色素及び第2のフルオロフォア色素との接触の少なくとも24時間後に実行される、工程、
第2の3次元マイクロ流体デバイス中の第2のアリコート中の患者由来の原発腫瘍細胞スフェロイドにおける第1及び第2のフルオロフォア色素のそれぞれによって放出された総蛍光を測定する工程、
を含み、それぞれのアリコート中の生細胞の死細胞に対する比の増加又は減少に基づいて患者由来の原発腫瘍細胞スフェロイドが評価される、方法。 - 第1及び第2のフルオロフォア色素のそれぞれによって放出される総蛍光が、それぞれの3次元マイクロ流体デバイスの直上又は直下から、カメラを使用して測定され、及び、それぞれの3次元マイクロ流体デバイスが、移動可能なステージ上に置かれ、それぞれのアリコート中の総蛍光をカメラに捕捉することが可能になる、請求項1に記載の方法。
- 第2のアリコートを、第2の三次元マイクロ流体デバイス中の生体適合性ゲル中に入れた後に少なくとも第1の試験化合物と接触させ、第2のアリコートと第1の試験化合物との前記接触が少なくとも24時間にわたって行われる、請求項1又は2に記載の方法。
- 第2のアリコートを、第2の三次元マイクロ流体デバイス中の生体適合性ゲル中に入れた後に少なくとも第1の試験化合物と接触させ、第2のアリコートと第1の試験化合物との前記接触が少なくとも2日間にわたって行われる、請求項1又は2に記載の方法。
- 第2のアリコートを、第2の三次元マイクロ流体デバイス中の生体適合性ゲル中に入れた後に少なくとも第1の試験化合物と接触させ、第2のアリコートと第1の試験化合物との前記接触が少なくとも3日間にわたって行われる、請求項1又は2に記載の方法。
- 第2のアリコートを、第2の三次元マイクロ流体デバイス中の生体適合性ゲル中に入れた後に少なくとも第1の試験化合物と接触させ、第2のアリコートと第1の試験化合物との前記接触が少なくとも4日間にわたって行われる、請求項1又は2に記載の方法。
- 第2のアリコートを、第2の三次元マイクロ流体デバイス中の生体適合性ゲル中に入れた後に少なくとも第1の試験化合物と接触させ、第2のアリコートと第1の試験化合物との前記接触が少なくとも5日間にわたって行われる、請求項1又は2に記載の方法。
- 第2のアリコートを、第2の三次元マイクロ流体デバイス中の生体適合性ゲル中に入れた後に少なくとも第1の試験化合物と接触させ、第2のアリコートと第1の試験化合物との前記接触が少なくとも6日間にわたって行われる、請求項1又は2に記載の方法。
- 第2のアリコートを、第2の三次元マイクロ流体デバイス中の生体適合性ゲル中に入れた後少なくとも第1の試験化合物及び第2の試験化合物と接触させ、第2のアリコートと第1の試験化合物及び第2の試験化合物との前記接触が少なくとも24時間にわたって行われる、請求項1又は2に記載の方法。
- 第2のアリコートを、第2の三次元マイクロ流体デバイス中の生体適合性ゲル中に入れた後少なくとも第1の試験化合物及び第2の試験化合物と接触させ、第2のアリコートと第1の試験化合物及び第2の試験化合物との前記接触が少なくとも2日間にわたって行われる、請求項1又は2に記載の方法。
- 第2のアリコートを、第2の三次元マイクロ流体デバイス中の生体適合性ゲル中に入れた後少なくとも第1の試験化合物及び第2の試験化合物と接触させ、第2のアリコートと第1の試験化合物及び第2の試験化合物との前記接触が少なくとも3日間にわたって行われる、請求項1又は2に記載の方法。
- 第2のアリコートを、第2の三次元マイクロ流体デバイス中の生体適合性ゲル中に入れた後少なくとも第1の試験化合物及び第2の試験化合物と接触させ、第2のアリコートと第1の試験化合物及び第2の試験化合物との前記接触が少なくとも4日間にわたって行われる、請求項1又は2に記載の方法。
- 第2のアリコートを、第2の三次元マイクロ流体デバイス中の生体適合性ゲル中に入れた後少なくとも第1の試験化合物及び第2の試験化合物と接触させ、第2のアリコートと第1の試験化合物及び第2の試験化合物との前記接触が少なくとも5日間にわたって行われる、請求項1又は2に記載の方法。
- 第2のアリコートを、第2の三次元マイクロ流体デバイス中の生体適合性ゲル中に入れた後少なくとも第1の試験化合物及び第2の試験化合物と接触させ、第2のアリコートと第1の試験化合物及び第2の試験化合物との前記接触が少なくとも6日間にわたって行われる、請求項1又は2に記載の方法。
- 試験化合物のうち少なくとも1つが免疫チェックポイント阻害剤である、請求項9から14のいずれか一項に記載の方法。
- 第1及び第2のアリコートがそれぞれ、約15~30個のスフェロイドを含有する、請求項1から15のいずれか一項に記載の方法。
- 第1のアリコートと、第1及び第2のフルオロフォア色素とを接触させる前の6時間未満にわたって、第1のアリコートを、第1の3次元マイクロ流体デバイス中に入れておく、請求項1から16のいずれか一項に記載の方法。
- 第1のアリコートと、第1及び第2のフルオロフォア色素とを接触させる前の3時間未満にわたって、第1のアリコートを、第1の3次元マイクロ流体デバイス中に入れておく、請求項1から16のいずれか一項に記載の方法。
- 第1のアリコートと、第1及び第2のフルオロフォア色素とを接触させる前の2時間未満にわたって、第1のアリコートを、第1の3次元マイクロ流体デバイス中に入れておく、請求項1から16のいずれか一項に記載の方法。
- 第1のアリコートと、第1及び第2のフルオロフォア色素とを接触させる前の1時間未満にわたって、第1のアリコートを、第1の3次元マイクロ流体デバイス中に入れておく、請求項1から16のいずれか一項に記載の方法。
- 第1の3次元マイクロ流体デバイス中の第1のアリコートを、第1のアリコートと、第1及び第2のフルオロフォア色素とを接触させる前に培養しない、請求項17から20のいずれか一項に記載の方法。
- 患者由来の原発腫瘍細胞スフェロイドが、コラゲナーゼ処理された腫瘍試料から得られる、請求項1から21のいずれか一項に記載の方法。
- 第1のフルオロフォア色素が、ヨウ化プロピジウム、DRAQ7、7-AAD、eBioscience Fixable Viability Dye eFluor(登録商標) 455UV、eBioscience Fixable Viability Dye eFluor(登録商標) 450、eBioscience Fixable Viability Dye eFluor(登録商標) 506、eBioscience Fixable Viability Dye eFluor(登録商標) 520、eBioscience Fixable Viability Dye eFluor(登録商標) 660、eBioscience Fixable Viability Dye eFluor(登録商標) 780、BioLegend Zombie Aqua(商標)、BioLegend Zombie NIR(商標)、BioLegend Zombie Red(商標)、BioLegend Zombie Violet(商標)、BioLegend Zombie UV(商標)、若しくはBioLegend Zombie Yellow(商標)であり、及び/又は第2のフルオロフォア色素が、アクリジンオレンジ、核グリーンLCS1 (ab138904)、DRAQ5 (ab108410)、CyTRAK Orange、NUCLEAR-ID Red DNAステイン(ENZ-52406)、SiR700-DNA、カルセインAM、カルセインバイオレットAM、カルセインブルーAM、Vybrant(登録商標) DyeCycle(商標) Violet、Vybrant(登録商標) DyeCycle(商標) Green、Vybrant(登録商標) DyeCycle(商標) Orange、若しくはVybrant(登録商標) DyeCycle(商標) Rubyである、請求項1から22のいずれか一項に記載の方法。
- 患者由来の原発腫瘍細胞スフェロイドが、
血清を添加した培地中で原発腫瘍試料を細断する工程;
細断された原発腫瘍試料を酵素で処理する工程;及び
酵素処理された試料から腫瘍細胞スフェロイドを収集する工程
によって取得される、請求項1から23のいずれか一項に記載の方法。 - 細断された原発腫瘍試料が、細断された原発腫瘍試料の部分的消化を得るのに十分な量で、又は時間にわたって酵素で処理される、請求項24に記載の方法。
- 生体適合性ゲルがコラーゲン、BD Matrigel(商標)Matrix Basement Membrane、又はフィブリンヒドロゲルである、請求項1から25のいずれか一項に記載の方法。
- 腫瘍試料が、膀胱MBT-2、乳腺4T1、EMT6、結腸、Colon26、CT-26、MC38、線維肉腫WEHI-164、腎臓Renca、白血病C1498、L1210、肝臓H22、KLN205、LL/2、LewisLung、リンパ腫A20 S、E.G7-OVA、EL4、肥満細胞腫P815、メラノーマB16-BL6、B16-F10、S91、骨髄腫MPC-11、神経芽腫Neuro-2a、卵巣: ID8、膵臓Pan02、形質細胞腫J558、又は前立腺RM-1マウスモデルのマウス組織に由来する、請求項1から26のいずれか一項に記載の方法。
- 腫瘍試料が患者由来異種移植片(PDX)である、請求項1から26のいずれか一項に記載の方法。
- 第1の3次元マイクロ流体デバイス及び/又は第2の3次元マイクロ流体デバイスが、1つ又は複数のゲルケージ領域が隣接した1つ又は複数の流体チャネルを含み、1つ又は複数のゲルケージ領域が、腫瘍細胞スフェロイドが懸濁された生体適合性ゲルを含み、デバイスがin vivoでの腫瘍微小環境を再現する、請求項1から28のいずれか一項に記載の方法。
- 第1の3次元マイクロ流体デバイス及び/又は第2の3次元マイクロ流体デバイスが、光学的に透過性の材料を含む基材を含み、
i)1つ又は複数の流体チャネル;
ii)1つ又は複数の流体チャネル入口;
iii)1つ又は複数の流体チャネル出口;
iv)1つ又は複数のゲルケージ領域;及び
v)複数のポスト
を更に含み;
1つ又は複数のゲルケージ領域のそれぞれの全部又は一部に、1つ又は複数の流体チャネルの全部又は一部が隣接することによって、1つ又は複数のゲルケージ領域-流体チャネル境界面領域を作出し;1つ又は複数のゲルケージ領域のそれぞれが、ゲルケージ領域を形成する少なくとも1行のポストを含み;1つ又は複数のゲルケージ領域のそれぞれが、500μm未満の高さを有する、請求項1から29のいずれか一項に記載の方法。 - 第1の試験化合物が、低分子、核酸分子、RNAi化合物、アプタマー、タンパク質若しくはペプチド、抗体若しくは抗原結合性抗体断片、リガンド若しくは受容体結合タンパク質、遺伝子療法ベクター、又はその組合せである、請求項3から30のいずれか一項に記載の方法。
- 第1の試験化合物が、化学療法化合物、免疫調節化合物、又は放射線である、請求項3から30のいずれか一項に記載の方法。
- 第1の試験化合物が、アルキル化化合物、代謝拮抗物質、アントラサイクリン、プロテアソーム阻害剤、又はmTOR阻害剤である、請求項32に記載の方法。
- 第1の試験化合物が、免疫調節剤である、請求項3から30のいずれか一項に記載の方法。
- 前記患者由来の原発腫瘍細胞スフェロイドが約40μm~約100μmの直径を有する、請求項1から34のいずれか一項に記載の方法。
- 前記患者由来の原発腫瘍細胞スフェロイドが約200μmの直径を有する、請求項1から34のいずれか一項に記載の方法。
- 前記患者由来の原発腫瘍細胞スフェロイドが約300μmの直径を有する、請求項1から34のいずれか一項に記載の方法。
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