JP7272555B2 - Bone quality evaluation marker and its use - Google Patents
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Description
本発明は、骨質評価用マーカーおよびその用途に関する。 TECHNICAL FIELD The present invention relates to a marker for evaluating bone quality and uses thereof.
骨折やそれに伴う寝たきりは、生活の質を損なう大きな社会問題である。骨強度の低下は、骨折の原因のうち重要なものとされている。２０００年に米国国立衛生研究所（ＮＩＨ）で開かれたコンセンサス会議において、骨強度が骨密度および骨質の２つの要因から規定され、骨質の要素として骨リモデリング、骨微細構造が挙げられている。糖尿病患者では骨密度が高いにも関わらず骨折リスクが高く、糖尿病により骨質が低下することが知られており（非特許文献１）、骨強度の７０％は骨密度により規定され、３０％は骨質から特定されるとの報告もある（非特許文献２）。これらのことから、骨質の役割が新たに注目されるようになってきた。 Fractures and accompanying bedriddenness are major social problems that impair the quality of life. Decreased bone strength has been identified as an important cause of fractures. At a consensus meeting held at the National Institutes of Health (NIH) in 2000, bone strength is defined by two factors, bone density and bone quality, and bone remodeling and bone microarchitecture are listed as factors of bone quality. . Diabetic patients have a high risk of fracture despite high bone density, and it is known that diabetes reduces bone quality (Non-Patent Document 1), 70% of bone strength is defined by bone density, and 30% There is also a report that it is identified from bone quality (Non-Patent Document 2). From these facts, new attention has been paid to the role of bone quality.
現在、骨質を把握するツールが開発されつつある。骨の微細構造を把握するツールとしては、Ｘ線ＣＴによる骨構造解析が挙げられる。また、骨リモデリングを把握するツールとしては血液中、尿中の骨代謝マーカーの測定などが挙げられる。 Currently, tools for grasping bone quality are being developed. As a tool for grasping the fine structure of bones, there is bone structure analysis by X-ray CT. Tools for understanding bone remodeling include measurement of bone metabolism markers in blood and urine.
非特許文献３には、歯周病患者の唾液中のＭＩＰ－１α（Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｐｒｏｔｅｉｎ １ ａｌｐｈａ）が骨リモデリングに関わるバイオマーカーの可能性があることが記載されている。非特許文献４には、骨形成と骨吸収の連携には、多細胞からなるユニット内の細胞小器官等様々なシグナルが関わることが記載されている。特許文献１～４には唾液等から採取される種々の特定の物質が、それぞれ、骨吸収、骨量減少、骨密度、破骨細胞の骨吸収活性のマーカーとなり得ることが記載されている。 Non-Patent Document 3 describes that MIP-1α (Macrophage Inflammatory Protein 1 alpha) in the saliva of periodontal disease patients may be a biomarker involved in bone remodeling. Non-Patent Document 4 describes that various signals such as organelles in a multicellular unit are involved in the linkage between bone formation and bone resorption. Patent Documents 1 to 4 describe that various specific substances collected from saliva and the like can serve as markers for bone resorption, bone loss, bone density, and bone resorption activity of osteoclasts, respectively.
しかしながら、Ｘ線ＣＴによる方法では、Ｘ線による被爆の懸念があり、また、血液中および尿中の骨代謝マーカーの測定による方法では、採血、採尿の肉体的・精神的苦痛を伴い、これらの方法を骨質の予防的ツールとして利用するのは改善の余地がある。 However, the method using X-ray CT involves the risk of exposure to radiation from X-rays, and the method using measurement of bone metabolism markers in blood and urine entails physical and mental pain during blood and urine collection. The use of the method as a preventative tool for bone quality leaves room for improvement.
本発明はこのような事情に鑑みてなされたものであり、その目的は、簡易に、かつ、客観的に骨質を評価可能な新規の骨質評価用マーカーを提供することである。 The present invention has been made in view of such circumstances, and an object of the present invention is to provide a novel bone quality evaluation marker capable of easily and objectively evaluating bone quality.
本発明者らは下記の〔１〕～〔１７〕を提供する。
〔１〕以下の（１）～（３０）からなる群より選ばれる少なくとも１つである、骨質評価用マーカー。
（１）Ｃｏａｃｔｏｓｉｎ－ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ
（２）Ｒｈｏ ＧＤＰ－ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ２
（３）Ｇａｌｅｃｔｉｎ－３－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ
（４）Ｇｕａｎｉｎｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ（ｉ）ｓｕｂｕｎｉｔ ａｌｐｈａ－２
（５）Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ－ｃｏｎｊｕｇａｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ Ｅ２ Ｌ３
（６）ＧＴＰ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｎｕｃｌｅａｒ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒａｎ
（７）Ｐｅｐｔｉｄｙｌ－ｇｌｙｃｉｎｅ ａｌｐｈａ－ａｍｉｄａｔｉｎｇ ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ
（８）Ｉｎｔｅｒ－ａｌｐｈａ－ｔｒｙｐｓｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ Ｈ１
（９）Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ－ｃａｐｐｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ
（１０）Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ ｎｕｃｌｅａｒ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｄ０
（１１）Ｐｒｏｔｈｒｏｍｂｉｎ
（１２）ＳＰＡＲＣ－ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ １
（１３）Ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｉｎ
（１４）Ａｃｔｉｎ－ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ３
（１５）Ｍｙｏｓｉｎ－７Ｂ
（１６）Ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎ－ＩＩＩ
（１７）Ｃｈｒｏｍｏｂｏｘ ｐｒｏｔｅｉｎ ｈｏｍｏｌｏｇ ３
（１８）Ｃｏｌｌａｇｅｎ ａｌｐｈａ－２（ＶＩ）ｃｈａｉｎ
（１９）ＣＤ９ ａｎｔｉｇｅｎ
（２０）Ｃｅｒｕｌｏｐｌａｓｍｉｎ
（２１）Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ ｎｕｃｌｅａｒ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｕ
（２２）Ｐｙｒｕｖａｔｅ ｋｉｎａｓｅ ｉｓｏｚｙｍｅｓ Ｍ１／Ｍ２
（２３）Ｍｏｅｓｉｎ
（２４）Ｇｒａｎｕｌｉｎｓ
（２５）Ｌ－ｌａｃｔａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ Ｂ ｃｈａｉｎ
（２６）Ｐｅｒｏｘｉｒｅｄｏｘｉｎ－５，ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ
（２７）Ｆｒｕｃｔｏｓｅ－ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ ａｌｄｏｌａｓｅ Ａ
（２８）Ａｃｔｉｎ－ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ２
（２９）Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ＲｈｏＡ
（３０）Ｔｒａｎｓａｌｄｏｌａｓｅ
〔２〕前記（１）～（４）、（１０）～（１４）、（１８）～（２１）および（２５）～（２７）からなる群より選ばれる少なくとも１つを含み、骨リモデリング評価用である、〔１〕に記載のマーカー。
〔３〕前記（５）～（９）、（１５）～（１７）、（２２）～（２４）および（２８）～（３０）からなる群より選ばれる少なくとも１つを含み、骨微細構造評価用である、〔１〕に記載のマーカー。
〔４〕前記（１）～（４）、（１０）～（１４）、（１８）～（２１）および（２５）～（２７）からなる群より選ばれる少なくとも１つと、前記（５）～（９）、（１５）～（１７）、（２２）～（２４）および（２８）～（３０）からなる群より選ばれる少なくとも１つとを含む、〔１〕に記載のマーカー。
〔５〕〔１〕～〔４〕のいずれか１項に記載のマーカーと特異的に結合する、骨質評価用抗体またはアプタマー。
〔６〕〔１〕～〔４〕のいずれか１項に記載のマーカーと特異的に結合する分子が結合している固相化担体を含む、マイクロアレイ。
〔７〕前記分子が、〔５〕に記載の抗体またはアプタマーである、〔６〕に記載のマイクロアレイ。
〔８〕被検者由来の生体試料における、〔１〕～〔４〕のいずれか１項に記載のマーカーの量を測定することを含む、骨質の評価のための骨質評価用マーカーの検出方法。
〔９〕マーカーは、〔２〕に記載のマーカーを含み、骨質の評価は骨リモデリングの評価を含む、〔８〕に記載の方法。
〔１０〕マーカーは、〔３〕に記載のマーカーを含み、骨質の評価は骨微細構造の評価を含む、〔８〕または〔９〕に記載の方法。
〔１１〕骨質が低下している被検者に候補物質を投与し、少なくとも投与後の被検者由来の生体試料における〔１〕～〔４〕のいずれか１項に記載のマーカーの量を測定することを含む、候補物質の骨質に対する効果を確認するための骨質評価用マーカーの検出方法。
〔１２〕骨質が低下している被検者に医療措置を行い、少なくとも措置終了後の被検者由来の生体試料における〔１〕～〔４〕のいずれか１項に記載のマーカーの量を測定することを含む、医療措置の骨質に対する効果を確認するための骨質評価用マーカーの検出方法。
〔１３〕被検者由来の生体試料における、〔１〕～〔４〕のいずれか１項に記載のマーカーの量を測定することを含む、歯槽骨疾患、骨粗鬆症または糖尿病診断のための骨質評価用マーカーの検出方法。
〔１４〕生体試料が、唾液、歯垢、舌苔、または歯肉滲出液である、〔８〕～〔１３〕のいずれか１項に記載の方法。
〔１５〕測定は、〔５〕に記載の抗体またはアプタマー、あるいは〔６〕または〔７〕に記載のマイクロアレイを用いた測定である、〔８〕～〔１４〕のいずれか１項に記載の方法。
〔１６〕前記測定は、質量分析法、ＥＬＩＳＡ、またはウエスタンブロット法である分析法による測定である、〔８〕～〔１５〕のいずれか１項に記載の方法。
〔１７〕〔５〕に記載の抗体またはアプタマー、あるいは〔６〕または〔７〕に記載のマイクロアレイを含む、骨質評価用キット。
The present inventors provide the following [1] to [17].
[1] A bone quality evaluation marker which is at least one selected from the group consisting of the following (1) to (30).
(1) Coactosin-like protein
(2) Rho GDP-dissociation inhibitor 2
(3) Galectin-3-binding protein
(4) Guanine nucleotide-binding protein G (i) subunit alpha-2
(5) Ubiquitin-conjugating enzyme E2 L3
(6) GTP-binding nuclear protein Ran
(7) Peptidyl-glycine alpha-amidating monooxygenase
(8) Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H1
(9) Macrophage-capping protein
(10) Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein D0
(11) Prothrombin
(12) SPARC-like protein 1
(13) Myeloblastin
(14) Actin-related protein 3
(15) Myosin-7B
(16) Antithrombin-III
(17) Chromobox protein homolog 3
(18) Collagen alpha-2(VI) chain
(19) CD9 antigens
(20) Ceruloplasmin
(21) Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein U
(22) Pyruvate kinase isozymes M1/M2
(23) Moesin
(24) Granulins
(25) L-lactate dehydrogenase B chain
(26) Peroxiredoxin-5, mitochondrial
(27) Fructose-bisphosphate aldolase A
(28) Actin-related protein 2
(29) Transforming protein RhoA
(30) Transaldolase
[2] Bone remodeling, including at least one selected from the group consisting of (1) to (4), (10) to (14), (18) to (21) and (25) to (27) The marker according to [1], which is for evaluation.
[3] Bone microstructure, including at least one selected from the group consisting of (5) to (9), (15) to (17), (22) to (24) and (28) to (30) The marker according to [1], which is for evaluation.
[4] at least one selected from the group consisting of (1) to (4), (10) to (14), (18) to (21) and (25) to (27); and (5) to (9), (15) to (17), (22) to (24) and at least one selected from the group consisting of (28) to (30), the marker of [1].
[5] An antibody or aptamer for evaluating bone quality that specifically binds to the marker of any one of [1] to [4].
[6] A microarray comprising an immobilized carrier bound with a molecule that specifically binds to the marker of any one of [1] to [4].
[7] The microarray of [6], wherein the molecule is the antibody or aptamer of [5].
[8] A method for detecting a marker for evaluating bone quality, comprising measuring the amount of the marker according to any one of [1] to [4] in a biological sample derived from a subject. .
[9] The method of [8], wherein the marker includes the marker of [2], and the evaluation of bone quality includes evaluation of bone remodeling.
[10] The method of [8] or [9], wherein the marker includes the marker of [3], and the evaluation of bone quality includes evaluation of bone microstructure.
[11] A candidate substance is administered to a subject with reduced bone quality, and at least the amount of the marker of any one of [1] to [4] in a biological sample derived from the subject after administration is determined. A method for detecting a bone quality evaluation marker for confirming the effect of a candidate substance on bone quality, including measuring.
[12] medical treatment is performed on a subject with reduced bone quality, and the amount of the marker according to any one of [1] to [4] in a biological sample derived from the subject after the completion of the treatment at least A method of detecting a marker for assessing bone quality to ascertain the effect of a medical procedure on bone quality, including measuring.
[13] Evaluation of bone quality for diagnosing alveolar bone disease, osteoporosis or diabetes, comprising measuring the amount of the marker according to any one of [1] to [4] in a subject-derived biological sample detection method of markers for
[14] The method of any one of [8] to [13], wherein the biological sample is saliva, dental plaque, tongue coating, or gingival exudate.
[15] The measurement is performed using the antibody or aptamer of [5], or the microarray of [6] or [7], [8] to [14]. Method.
[16] The method according to any one of [8] to [15], wherein the measurement is by an analytical method such as mass spectrometry, ELISA, or Western blotting.
[17] A kit for evaluating bone quality, comprising the antibody or aptamer of [5], or the microarray of [6] or [7].
本発明によれば、骨微細構造、骨リモデリング等の骨質をより簡便に、かつ、客観的に判定することができる。本発明を利用して、医者の診断に先だって骨質の評価を行えば、骨質と関連する健康変動のチェッカーとして利用することができ、健康維持に有用である。 According to the present invention, bone quality such as bone microstructure and bone remodeling can be determined more simply and objectively. If the present invention is used to evaluate bone quality prior to diagnosis by a doctor, it can be used as a checker for health fluctuations related to bone quality, which is useful for health maintenance.
〔骨質、骨リモデリング、骨微細構造〕
本発明において骨質とは、骨密度と共に骨強度を規定する因子である。骨質は、骨リモデリング、骨微細構造により制御されることから、骨質の評価は、骨リモデリングの評価または骨微細構造の評価によることが好ましく、両評価によることがより好ましい。本発明において骨リモデリングとは、骨吸収と骨形成のバランスであり、骨吸収速度、骨形成速度、骨石灰化速度等の要因により評価され得る。本発明において骨微細構造とは、骨の海綿質の構造である。海綿質には適切な幅、間隔を有する適切な数の骨梁が形成され、これにより骨の強度が保持されている。
[Bone quality, bone remodeling, bone microstructure]
In the present invention, bone quality is a factor that defines bone strength as well as bone density. Since bone quality is controlled by bone remodeling and bone microstructure, bone quality is preferably evaluated by bone remodeling evaluation or bone microstructure evaluation, and more preferably by both evaluations. In the present invention, bone remodeling is the balance between bone resorption and bone formation, and can be evaluated by factors such as bone resorption rate, bone formation rate, and bone mineralization rate. Bone microstructure in the context of the present invention is the cancellous structure of bone. An appropriate number of trabeculae with appropriate width and intervals are formed in the cancellous bone, thereby maintaining the strength of the bone.
〔骨質評価用マーカー〕
本発明の骨質評価用マーカーは、以下のタンパク質（１）～（３０）からなる群から選択される少なくとも１つである。
（１）Ｃｏａｃｔｏｓｉｎ－ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＣＯＴＬ１）
（２）Ｒｈｏ ＧＤＰ－ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ２（ＡＲＨＧＤＩＢ）
（３）Ｇａｌｅｃｔｉｎ－３－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＬＧＡＬＳ３ＢＰ）
（４）Ｇｕａｎｉｎｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ（ｉ）ｓｕｂｕｎｉｔ ａｌｐｈａ－２（ＧＮＡＩ２）
（５）Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ－ｃｏｎｊｕｇａｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ Ｅ２ Ｌ３（ＵＢＥ２Ｌ３）
（６）ＧＴＰ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｎｕｃｌｅａｒ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒａｎ（ＡＲＡ２４）
（７）Ｐｅｐｔｉｄｙｌ－ｇｌｙｃｉｎｅ ａｌｐｈａ－ａｍｉｄａｔｉｎｇ ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ（ＰＡＭ）
（８）Ｉｎｔｅｒ－ａｌｐｈａ－ｔｒｙｐｓｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ Ｈ１（ＩＴＩＨ１）
（９）Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ－ｃａｐｐｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＣＡＰＧ）
（１０）Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ ｎｕｃｌｅａｒ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｄ０（ＨＮＲＰＤ）
（１１）Ｐｒｏｔｈｒｏｍｂｉｎ（ＴＨＲＢ）
（１２）ＳＰＡＲＣ－ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ １（ＳＰＲＬ１）
（１３）Ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｉｎ（ＰＲＴＮ３）
（１４）Ａｃｔｉｎ－ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ３（ＡＲＰ３）
（１５）Ｍｙｏｓｉｎ－７Ｂ（ＭＹＨ７Ｂ）
（１６）Ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎ－ＩＩＩ（ＡＮＴ３）
（１７）Ｃｈｒｏｍｏｂｏｘ ｐｒｏｔｅｉｎ ｈｏｍｏｌｏｇ ３（ＣＢＸ３）
（１８）Ｃｏｌｌａｇｅｎ ａｌｐｈａ－２（ＶＩ）ｃｈａｉｎ（ＣＯ６Ａ２）
（１９）ＣＤ９ ａｎｔｉｇｅｎ（ＣＤ９）
（２０）Ｃｅｒｕｌｏｐｌａｓｍｉｎ（ＣＥＲＵ）
（２１）Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ ｎｕｃｌｅａｒ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｕ（ＨＮＲＰＵ）
（２２）Ｐｙｒｕｖａｔｅ ｋｉｎａｓｅ ｉｓｏｚｙｍｅｓ Ｍ１／Ｍ２（ＫＰＹＭ）
（２３）Ｍｏｅｓｉｎ（ＭＯＥＳ）
（２４）Ｇｒａｎｕｌｉｎｓ（ＧＲＮ）
（２５）Ｌ－ｌａｃｔａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ Ｂ ｃｈａｉｎ（ＬＤＨＢ）
（２６）Ｐｅｒｏｘｉｒｅｄｏｘｉｎ－５，ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ（ＰＲＤＸ５）
（２７）Ｆｒｕｃｔｏｓｅ－ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ ａｌｄｏｌａｓｅ Ａ（ＡＬＤＯＡ）
（２８）Ａｃｔｉｎ－ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ２（ＡＲＰ２）
（２９）Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ＲｈｏＡ（ＲＨＯＡ）
（３０）Ｔｒａｎｓａｌｄｏｌａｓｅ（ＴＡＬＤＯ）
[Marker for evaluating bone quality]
The bone quality evaluation marker of the present invention is at least one selected from the group consisting of the following proteins (1) to (30).
(1) Coactosin-like protein (COTL1)
(2) Rho GDP-dissociation inhibitor 2 (ARHGDIB)
(3) Galectin-3-binding protein (LGALS3BP)
(4) Guanine nucleotide-binding protein G (i) subunit alpha-2 (GNAI2)
(5) Ubiquitin-conjugating enzyme E2 L3 (UBE2L3)
(6) GTP-binding nuclear protein Ran (ARA24)
(7) Peptidyl-glycine alpha-amidating monooxygenase (PAM)
(8) Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H1 (ITIH1)
(9) Macrophage-capping protein (CAPG)
(10) Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein D0 (HNRPD)
(11) Prothrombin (THRB)
(12) SPARC-like protein 1 (SPRL1)
(13) Myeloblastin (PRTN3)
(14) Actin-related protein 3 (ARP3)
(15) Myosin-7B (MYH7B)
(16) Antithrombin-III (ANT3)
(17) Chromobox protein homolog 3 (CBX3)
(18) Collagen alpha-2 (VI) chain (CO6A2)
(19) CD9 antigen (CD9)
(20) Ceruloplasmin (CERU)
(21) Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein U (HNRPU)
(22) Pyruvate kinase isozymes M1/M2 (KPYM)
(23) Moesin (MOES)
(24) Granulins (GRN)
(25) L-lactate dehydrogenase B chain (LDHB)
(26) Peroxiredoxin-5, mitochondrial (PRDX5)
(27) Fructose-bisphosphate aldolase A (ALDOA)
(28) Actin-related protein 2 (ARP2)
(29) Transforming protein RhoA (RHOA)
(30) Transaldolase (TALDO)
骨質が正常な被検者由来の生体試料中の（１）～（３０）の量は、骨質が低下している被検者由来の生体試料中の当該タンパク質の量と異なる傾向にある。そのため、上記（１）～（３０）は、骨質評価マーカーとして有用である。 The amounts of (1) to (30) in biological samples derived from subjects with normal bone quality tend to be different from the amounts of the proteins in biological samples derived from subjects with reduced bone quality. Therefore, the above (1) to (30) are useful as bone quality evaluation markers.
（１）、（２）、（４）、（５）、（６）、（９）、（１０）、（１３）、（１４）、（１５）、（１７）、（１９）、（２１）、（２２）、（２３）、（２５）、（２６）、（２７）、（２８）、（２９）、および（３０）は、骨質が低下している被検者において健常者と比較して増加する傾向にある。
（３）、（７）、（８）、（１１）、（１２）、（１６）、（１８）、（２０）、および（２４）は、骨質が低下している被検者において健常者と比較して低下する傾向にある。
(1), (2), (4), (5), (6), (9), (10), (13), (14), (15), (17), (19), (21) ), (22), (23), (25), (26), (27), (28), (29), and (30) in subjects with reduced bone quality compared to healthy subjects. and tend to increase.
(3), (7), (8), (11), (12), (16), (18), (20), and (24) healthy subjects in subjects with reduced bone quality tend to decrease compared to
本発明の骨質評価用マーカーは上記の（１）～（３０）からなる群から選択される１つでもよいし、２つ以上の組み合わせでもよく、２つ以上の組み合わせが好ましい。骨質評価用マーカーは、上記（１）～（４）、（１０）～（１４）、（１８）～（２１）および（２５）～（２７）からなる群より選ばれる少なくとも１つ、並びに、（５）～（９）、（１５）～（１７）、（２２）～（２４）および（２８）～（３０）からなる群より選ばれる少なくとも１つを含むことが好ましい。これにより、以下説明するように骨リモデリング評価および骨微細構造評価の両方を行うことができる。 The bone quality evaluation marker of the present invention may be one selected from the group consisting of (1) to (30) above, or may be a combination of two or more, preferably a combination of two or more. The bone quality evaluation marker is at least one selected from the group consisting of (1) to (4), (10) to (14), (18) to (21) and (25) to (27), and It preferably contains at least one selected from the group consisting of (5) to (9), (15) to (17), (22) to (24) and (28) to (30). This allows both bone remodeling and bone microstructural assessments to be performed as described below.
骨質評価用マーカーが上記（１）～（４）、（１０）～（１４）、（１８）～（２１）および（２５）～（２７）からなる群より選ばれる少なくとも１つを含むことにより、被検者の骨リモデリングを評価できる。被検者由来の生体試料中の（１）、（１０）～（１１）および（２５）～（２７）の量は骨吸収速度の、（２）、（１２）および（１８）の量は被検者の骨形成速度の、（３）～（４）、（１３）～（１４）、および（１９）～（２１）の量は骨石灰化速度の、それぞれ指標となり得る。（１）～（４）、（１０）～（１４）、（１８）～（２１）および（２５）～（２７）からなる群より選ばれる少なくとも１つは、（１）～（４）、（１０）～（１４）、（１８）～（２１）および（２５）～（２７）からなる群より選ばれる２以上の組み合わせが好ましく、（１）、（１０）、（１１）および（２５）～（２７）からなる群より選ばれる少なくとも１つと、（２）、（１２）および（１８）からなる群より選ばれる少なくとも１つと、（３）、（４）、（１３）、（１４）および（１９）～（２１）からなる群より選ばれる少なくとも１つの組み合わせがより好ましい。これにより、被検者の骨吸収速度、骨形成速度、および骨石灰化速度から選ばれる少なくとも２つを評価でき、骨リモデリングをより具体的に評価することができる。 The bone quality evaluation marker contains at least one selected from the group consisting of (1) to (4), (10) to (14), (18) to (21) and (25) to (27) , can assess bone remodeling in a subject. The amounts of (1), (10) to (11) and (25) to (27) in the subject-derived biological sample are the bone resorption rate, and the amounts of (2), (12) and (18) are The amounts (3)-(4), (13)-(14), and (19)-(21) of the bone formation rate in a subject can be indicators of the bone mineralization rate, respectively. at least one selected from the group consisting of (1) to (4), (10) to (14), (18) to (21) and (25) to (27), (1) to (4), A combination of two or more selected from the group consisting of (10) to (14), (18) to (21) and (25) to (27) is preferred, and (1), (10), (11) and (25) ) to (27), at least one selected from the group consisting of (2), (12) and (18), and (3), (4), (13), (14) ) and at least one combination selected from the group consisting of (19) to (21) is more preferred. Thereby, at least two selected from the bone resorption rate, bone formation rate, and bone mineralization rate of the subject can be evaluated, and bone remodeling can be evaluated more specifically.
骨質評価用マーカーが（５）～（９）、（１５）～（１７）、（２２）～（２４）および（２８）～（３０）からなる群より選ばれる少なくとも１つを含むことにより、被検者の骨微細構造を評価できる。被検者由来の生体試料中の、（５）、（６）、（１５）、（２２）、（２３）および（２８）～（３０）の量は骨梁間隔の、（７）、（８）、（１６）および（１７）の量は骨梁幅の、（９）および（２４）の量は骨梁数の、それぞれ指標となり得る。（５）～（９）、（１５）～（１７）、（２２）～（２４）および（２８）～（３０）からなる群より選ばれる少なくとも１つは、（５）～（９）、（１５）～（１７）、（２２）～（２４）および（２８）～（３０）からなる群より選ばれる２以上の組み合わせがより好ましく、（５）、（６）、（１５）、（２２）、（２３）および（２８）～（３０）からなる群より選ばれる少なくとも１つと、（７）、（８）、（１６）および（１７）からなる群より選ばれる少なくとも１つと、（９）および（２４）からなる群より選ばれる少なくとも１つの組み合わせがさらに好ましい。これにより、被検者の骨梁間隔、骨梁幅および骨梁数から選ばれる少なくとも２つを評価でき、骨微細構造をより具体的に評価することができる。 By including at least one selected from the group consisting of bone quality evaluation markers (5) to (9), (15) to (17), (22) to (24) and (28) to (30), A subject's bone microstructure can be evaluated. The amount of (5), (6), (15), (22), (23) and (28)-(30) in the subject-derived biological sample is the trabecular interval, (7), ( The amounts of 8), (16) and (17) can be indicators of trabecular width, and the amounts of (9) and (24) can be indicators of trabecular number. at least one selected from the group consisting of (5) to (9), (15) to (17), (22) to (24) and (28) to (30), (5) to (9), A combination of two or more selected from the group consisting of (15) to (17), (22) to (24) and (28) to (30) is more preferred, and (5), (6), (15), ( 22), (23) and (28) to (30), at least one selected from the group consisting of (7), (8), (16) and (17), and ( At least one combination selected from the group consisting of 9) and (24) is more preferred. As a result, at least two selected from the trabecular spacing, trabecular width and number of trabeculae of the subject can be evaluated, and the bone microstructure can be evaluated more specifically.
本発明において評価とは、健常者と比較した際の低下（劣化）の有無の評価（判定）、正常または異常の評価（判定）、将来的な低下（劣化）リスクの評価（判定）が挙げられる。本発明における評価は、通常、いわゆる医師による医療行為における診断に対し予備的に示される指標である。骨質は、歯槽骨の骨質、骨粗鬆症、糖尿病等の各疾患と相関していることから、本発明の骨質評価用マーカーは、これらの評価のために利用することができる。 Evaluation in the present invention includes evaluation (determination) of the presence or absence of deterioration (deterioration) when compared with healthy subjects, evaluation (determination) of normal or abnormal, and evaluation (determination) of future deterioration (deterioration) risk. be done. The evaluation in the present invention is usually a preliminary indicator for diagnosis in medical practice by a so-called doctor. Since bone quality correlates with diseases such as alveolar bone quality, osteoporosis, and diabetes, the bone quality evaluation marker of the present invention can be used for these evaluations.
〔抗体、アプタマー、マイクロアレイ〕
本発明の抗体およびアプタマーは、上記骨質評価用マーカーの各ペプチドに特異的に結合する抗体およびアプタマーである。これを用いることにより、上記マーカーによる骨質評価を簡便かつ容易に行うことができる。抗体またはアプタマーは、常法により作製することができる。
[Antibodies, aptamers, microarrays]
The antibody and aptamer of the present invention are antibodies and aptamers that specifically bind to each peptide of the markers for evaluating bone quality. By using this, it is possible to simply and easily evaluate bone quality using the above markers. Antibodies or aptamers can be produced by conventional methods.
本発明のマイクロアレイ（タンパク質アレイまたは核酸アレイ）は、上記骨質評価用マーカーと特異的に結合する分子が担体上に固相化されているマイクロアレイである。これを用いることにより、上記マーカーによる骨質評価を簡便かつ容易に行うことができる。 The microarray (protein array or nucleic acid array) of the present invention is a microarray in which molecules that specifically bind to the markers for evaluating bone quality are immobilized on a carrier. By using this, it is possible to simply and easily evaluate bone quality using the above markers.
骨質評価用マーカーと特異的に結合する分子としては、骨質評価用マーカーのタンパク質の少なくとも一部と特異的に結合する分子（例えば、前述の抗体、アプタマー）、上記タンパク質をコードする核酸の少なくとも一部と特異的に結合する分子（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ等、該核酸とハイブリダイズし得るプローブ）が挙げられる。担体は、上記骨質評価用マーカーであるタンパク質を固定化可能であればよく、特に限定されないが、材料としては例えば、ガラス、シリコンなどの無機材料、ニトロセルロースなどの有機材料が挙げられる。担体の形状としては、例えば、膜、ビーズ、チップ、ロッド、プレートが挙げられる。 The molecule that specifically binds to the marker for evaluating bone quality includes a molecule that specifically binds to at least part of the protein of the marker for evaluating bone quality (e.g., the aforementioned antibody and aptamer), and at least one nucleic acid that encodes the protein. Molecules that specifically bind to moieties (eg, DNA, RNA, PNA, etc., probes that can hybridize with the nucleic acid) are included. The carrier is not particularly limited as long as it can immobilize the protein, which is the marker for evaluating bone quality, and examples of the material include inorganic materials such as glass and silicon, and organic materials such as nitrocellulose. The shape of the carrier includes, for example, membranes, beads, chips, rods, and plates.
マイクロアレイの製造方法は特に限定されず、上記マーカー、抗体またはアプタマーを担体に物理的吸着、官能基を利用した共有結合等の任意の手法により固定化して製造すればよい。固定化の際には、マイクロアレイヤー、スポッター等の機器を用いることができる。 The method for producing the microarray is not particularly limited, and the above markers, antibodies or aptamers may be immobilized on a carrier by any method such as physical adsorption or covalent bonding using functional groups. Equipment such as a microarrayer and a spotter can be used for immobilization.
〔骨質評価用マーカーの検出方法〕
本発明の骨質評価用マーカーの検出方法は、被検者由来の生体試料中の骨質評価用マーカーの量を測定することを含む方法である。本発明の方法は、被検者の骨質の評価、候補物質の骨質に対する効果の確認、医療措置の骨質に対する効果の確認のために行うことができる。
[Method for detecting markers for evaluating bone quality]
The method for detecting a marker for evaluating bone quality of the present invention is a method comprising measuring the amount of a marker for evaluating bone quality in a subject-derived biological sample. The methods of the present invention can be used to assess the bone quality of a subject, confirm the effects of candidate substances on bone quality, and confirm the effects of medical treatments on bone quality.
－被検者の骨質の評価－
被検者の骨質の評価のために骨質評価用マーカーを検出する場合、本発明の方法は、被検者の生体試料中の骨質評価用マーカーの量を測定することを含む。
-Evaluation of the bone quality of the subject-
When detecting a bone quality marker for assessing bone quality of a subject, the method of the present invention includes measuring the amount of the bone quality marker in the subject's biological sample.
生体試料としては、被検者から採取可能な生体試料であれば特に限定されないが、例えば、唾液、歯垢、舌苔、歯肉滲出液、血液（全血、血漿、血清等）、尿、汗、涙等の体液、細胞、組織が挙げられる。このうち、非侵襲的かつ常時採取可能な生体試料が好ましく、唾液、歯垢、舌苔、または歯肉滲出液がより好ましい。これにより、被検者の負担を軽減できる。 The biological sample is not particularly limited as long as it is a biological sample that can be collected from a subject. Examples include body fluids such as tears, cells, and tissues. Among these, non-invasive and constantly sampleable biological samples are preferred, and saliva, dental plaque, tongue coating, or gingival exudate are more preferred. Thereby, the burden on the subject can be reduced.
被検者は、通常は哺乳類である。哺乳類としては、例えば、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ブタ等が挙げられ、好ましくはヒトである。被検者の性別、年齢、健康状態は特に限定されない。 A subject is typically a mammal. Mammals include, for example, humans, mice, rats, hamsters, guinea pigs, rabbits, dogs, cats, cows, horses, goats, sheep, and pigs, preferably humans. The subject's sex, age, and health condition are not particularly limited.
骨質評価用マーカーの量は、通常は生体試料中のマーカーの含有量であるが、含有量に限定されずタンパク質の発現量、タンパク質をコードする遺伝子の発現量でもよい。骨質評価用マーカーが前記（１）～（３０）からなる群より選ばれる２以上の組み合わせである場合、それぞれの含有量であることが好ましい。骨質評価用マーカーの量の測定は、上記の抗体、アプタマー、マイクロアレイを利用することが好ましく、測定方法としては例えば、質量分析法、ＲＩＡ（ラジオイムノアッセイ）、免疫測定法（例えば、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着法）、ＥＣＬＩＡ（電気化学発光免疫測定法）、蛍光標識抗体法、放射線標識抗体法）、イムノブロット法（例えば、ウエスタンブロット法）、表面プラズモン共鳴法等が挙げられる。 The amount of the marker for bone quality evaluation is usually the content of the marker in the biological sample, but is not limited to the content, and may be the expression level of the protein or the expression level of the gene encoding the protein. When the bone quality evaluation markers are a combination of two or more selected from the group consisting of (1) to (30), the respective contents are preferred. Measurement of the amount of bone quality evaluation markers is preferably carried out using the above antibodies, aptamers, and microarrays, and examples of measurement methods include mass spectrometry, RIA (radioimmunoassay), and immunoassay (e.g., ELISA (enzyme-linked immunoabsorption method), ECLIA (electrochemiluminescence immunoassay), fluorescence-labeled antibody method, radiolabeled antibody method), immunoblot method (eg, Western blot method), surface plasmon resonance method, and the like.
質量分析法においては、各種の質量分析装置を利用することができる。例えば、ＬＣ－ＭＳ、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ、ＧＣ－ＭＳ、ＦＡＢ－ＭＳ、ＥＩ－ＭＳ、ＣＩ－ＭＳ、ＦＤ－ＭＳ、ＭＡＬＤＩ－ＭＳ、ＥＳＩ－ＭＳ、ＨＰＬＣ－ＭＳ、ＦＴ－ＩＣＲ－ＭＳ、ＣＥ－ＭＳ、ＩＣＰ－ＭＳ、Ｐｙ－ＭＳ、ＴＯＦ－ＭＳ等がある。これらのいずれも利用可能である。 Various mass spectrometers can be used in mass spectrometry. For example, LC-MS, LC-MS/MS, GC-MS, FAB-MS, EI-MS, CI-MS, FD-MS, MALDI-MS, ESI-MS, HPLC-MS, FT-ICR-MS, There are CE-MS, ICP-MS, Py-MS, TOF-MS and the like. Any of these are available.
上述の本発明の抗体、アプタマー、マイクロアレイを用いる免疫測定法による測定の一例を以下に示す。生体試料を必要に応じて希釈した後、抗体、アプタマーまたはマイクロアレイを添加してインキュベーションする。次に、蛍光発光物質、化学発光物質または酵素を結合させた２次抗体等の標識物質を加えインキュベーションする。検出はそれぞれの基質を加えた後、標識物質の量を直接または間接的に計測し、マーカーの量を得る。 An example of measurement by immunoassay using the antibody, aptamer, and microarray of the present invention is shown below. After diluting the biological sample as necessary, antibodies, aptamers or microarrays are added and incubated. Next, a labeling substance such as a secondary antibody conjugated with a fluorescent substance, a chemiluminescent substance, or an enzyme is added and incubated. For detection, after adding each substrate, the amount of labeled substance is directly or indirectly measured to obtain the amount of marker.
生体試料中の成分の同定は、次のように行うことができる。例えば、ＬＣ－ＭＳ法で成分の同定を行う場合、「標準となる化合物」のデータと比較して行うことができる。
また、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ法で成分の同定を行う場合、「標準となる化合物」および「一般公開データベース（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ）」等の既知のデータと比較して行うことができる。成分に既知のデータが存在しない場合、ＭＳ／ＭＳ分析を行うことで未知の成分を同定することができる。
Identification of components in a biological sample can be performed as follows. For example, when identifying a component by the LC-MS method, it can be performed by comparing with data of a "standard compound".
In addition, when identifying a component by the LC-MS/MS method, it can be performed by comparing with known data such as "standard compound" and "public database (UniProtKB)". If no known data exist for a component, MS/MS analysis can be performed to identify the unknown component.
評価においては、各成分の含有量を変数とする多変量解析を行ってもよい。多変量解析としては例えば、ロジスティック回帰分析、重回帰分析、主成分分析、独立成分分析、因子分析、判別分析、数量化理論、クラスター分析、コンジョイント分析および多次元尺度構成法（ＭＤＳ）がある。 In the evaluation, multivariate analysis may be performed using the content of each component as a variable. Multivariate analysis includes, for example, logistic regression analysis, multiple regression analysis, principal component analysis, independent component analysis, factor analysis, discriminant analysis, quantification theory, cluster analysis, conjoint analysis and multidimensional scaling (MDS). .
本発明の方法においては、通常、被検者由来の生体試料におけるマーカーの量の測定値から骨質の評価を行う。骨質の評価は、基準値との比較により行えばよい。基準値としては例えば、骨質が正常であることが予め確認済みの健常者の生体試料におけるマーカーの量の測定値が挙げられる（基準値における生体成分は、通常、被検者由来の生体成分と同じ成分である）。その場合、被検者由来の生体試料における（３）、（７）、（８）、（１１）、（１２）、（１６）、（１８）、（２０）、および（２４）からなる群より選ばれる少なくとも１つの量が基準値より低い場合には、骨質が低下（劣化）していると評価され、基準値と同等以上である場合には、骨質が正常であると評価される。被検者由来の生体試料における（１）、（２）、（４）、（５）、（６）、（９）、（１０）、（１３）、（１４）、（１５）、（１７）、（１９）、（２１）、（２２）、（２３）、（２５）、（２６）、（２７）、（２８）、（２９）、および（３０）からなる群より選ばれる少なくとも１つの量が基準値より高い場合には、骨質が異常であると評価され、基準値と同等以下である場合には、骨質が正常であると評価される。 In the method of the present invention, bone quality is generally evaluated from the measured marker amount in a subject-derived biological sample. Bone quality may be evaluated by comparison with reference values. Examples of the reference value include the measured value of the amount of the marker in a biological sample of a healthy subject whose bone quality has been confirmed in advance (the biological component in the reference value is usually a biological component derived from the subject). same ingredients). In that case, the group consisting of (3), (7), (8), (11), (12), (16), (18), (20), and (24) in the subject-derived biological sample When at least one selected amount is lower than the reference value, it is evaluated that the bone quality is decreased (deteriorated), and when it is equal to or higher than the reference value, the bone quality is evaluated as normal. (1), (2), (4), (5), (6), (9), (10), (13), (14), (15), (17) in a biological sample derived from a subject ), (19), (21), (22), (23), (25), (26), (27), (28), (29), and at least one selected from the group consisting of (30) If the two amounts are higher than the reference value, the bone quality is evaluated as abnormal, and if it is equal to or lower than the reference value, the bone quality is evaluated as normal.
マーカーとして、（１）～（４）、（１０）～（１４）、（１８）～（２１）および（２５）～（２７）からなる群より選ばれる少なくとも１つのマーカーを用いることにより、骨リモデリング評価を行うことができる。被検者由来の生体試料中のマーカーの量の測定値から骨リモデリングの評価を行う場合にも、通常は、基準値との比較が行われる。基準値としては例えば、骨リモデリングが正常であることが予め確認済みの健常者の測定値が挙げられる。その場合、被検者由来の生体試料における（３）、（１１）、（１２）、（１８）、および（２０）からなる群より選ばれる少なくとも１つの量が基準値より低い場合には、骨リモデリングが低下（劣化）していると評価され、基準値と同等以上である場合には、骨リモデリングが正常になされていると評価される。被検者由来の生体試料における（１）、（２）、（４）、（１０）、（１３）、（１４）、（１９）、（２１）、（２５）、（２６）、および（２７）からなる群より選ばれる少なくとも１つの量が基準値より高い場合には、骨リモデリングが異常であると評価され、基準値と同等以下である場合には、骨リモデリングが正常になされていると評価される。 Bone by using at least one marker selected from the group consisting of (1) to (4), (10) to (14), (18) to (21) and (25) to (27) as a marker Remodeling assessment can be performed. When evaluating bone remodeling from the measured value of the marker amount in a subject-derived biological sample, comparison with a reference value is also usually performed. Reference values include, for example, measured values of healthy subjects whose bone remodeling has been confirmed in advance to be normal. In that case, if the amount of at least one selected from the group consisting of (3), (11), (12), (18), and (20) in the biological sample derived from the subject is lower than the reference value, Bone remodeling is evaluated as declining (deteriorating), and when it is equal to or higher than the reference value, bone remodeling is evaluated as normal. (1), (2), (4), (10), (13), (14), (19), (21), (25), (26), and ( 27) If at least one amount selected from the group consisting of is higher than the reference value, bone remodeling is evaluated as abnormal, and if it is equal to or lower than the reference value, bone remodeling is normal. It is evaluated that
マーカーとして、（５）～（９）、（１５）～（１７）、（２２）～（２４）および（２８）～（３０）からなる群より選ばれる少なくとも１つのマーカーを用いることにより、骨微細構造の評価を行うことができる。被検者由来の生体試料中のマーカーの量の測定値から骨微細構造の評価を行う場合にも、通常は、基準値との比較が行われる。基準値としては例えば、骨微細構造が正常であることが予め確認済みの健常者の測定値が挙げられる。その場合、被検者由来の生体試料における（７）、（８）、（１６）、および（２４）からなる群より選ばれる少なくとも１つの量が基準値より低い場合には、骨微細構造が劣化していると評価され、基準値と同等以上である場合には、骨微細構造が正常であると評価される。被検者由来の生体試料における（５）、（６）、（９）、（１５）、（１７）、（２２）、（２３）、（２８）、（２９）、および（３０）からなる群より選ばれる少なくとも１つの量が基準値より高い場合には、骨微細構造が劣化していると評価され、基準値と同等以下である場合には、骨微細構造が正常であると評価される。 Bone by using at least one marker selected from the group consisting of (5) to (9), (15) to (17), (22) to (24) and (28) to (30) as a marker Microstructural evaluation can be performed. Also when evaluating the bone microstructure from the measured value of the marker amount in the subject-derived biological sample, comparison with a reference value is usually performed. Examples of reference values include measured values of healthy subjects whose bone microstructure has been confirmed in advance to be normal. In that case, if the amount of at least one selected from the group consisting of (7), (8), (16), and (24) in the subject-derived biological sample is lower than the reference value, the bone microstructure is If it is evaluated as degraded and equal to or greater than the reference value, the bone microstructure is evaluated as normal. consisting of (5), (6), (9), (15), (17), (22), (23), (28), (29), and (30) in a subject-derived biological sample If at least one amount selected from the group is higher than the reference value, it is evaluated that the bone microstructure is degraded, and if it is equal to or lower than the reference value, the bone microstructure is evaluated as normal. be.
骨質は、歯槽骨の骨質、骨粗鬆症、糖尿病等の疾患と相関していることから、本発明の方法は、歯槽骨疾患、骨粗鬆症または糖尿病診断（通常は、いわゆる医療行為における医師等の診断の予備的指標の提供）のために行ってもよい。これらの場合、骨質が低下していると評価される場合は、歯槽骨疾患、骨粗鬆症または糖尿病に罹患している可能性が高いと診断され、骨質が正常であると評価される場合は、歯槽骨疾患、骨粗鬆症または糖尿病に罹患している可能性は低いと診断され得る。 Since bone quality is correlated with diseases such as alveolar bone quality, osteoporosis, and diabetes, the method of the present invention is useful for diagnosis of alveolar bone disease, osteoporosis, or diabetes (usually, preliminary diagnosis by doctors in medical practice). (Provision of strategic indicators). In these cases, if assessed as having poor bone quality, they are likely to have alveolar bone disease, osteoporosis, or diabetes; It can be diagnosed as unlikely to suffer from bone disease, osteoporosis or diabetes.
－候補物質の骨質に対する効果の確認－
候補物質の骨質に対する効果の確認のために骨質評価用マーカーを検出する場合、本発明の方法は、骨質が低下している被検者に候補物質を投与し、少なくとも投与後の被検者由来の生体試料における上記マーカーの量を測定することを含む。
- Confirmation of the effect of the candidate substance on bone quality -
When detecting a bone quality evaluation marker for confirming the effect of a candidate substance on bone quality, the method of the present invention comprises administering a candidate substance to a subject with reduced bone quality, and measuring at least measuring the amount of said marker in said biological sample.
候補物質は特に限定されず、骨質に対する効果の確認が求められる物質であればよい。動植物、微生物等生物由来の成分（抽出物、精製物）でもよく、人工的に製造された成分でもよく、また、化合物でもよいし組成物でもよい。 Candidate substances are not particularly limited as long as they are required to be confirmed for their effects on bone quality. It may be a component (extract, purified product) derived from organisms such as animals, plants, or microorganisms, or an artificially produced component, a compound, or a composition.
生体試料の具体例および好ましい例は上記の骨質の評価のための本発明の方法の場合と同様である。被検者は、骨質が低下している被検者であり、骨質が低下していることが予め他の方法により（例えば、医師の診断により）確認されている被検者が好ましい。被検者は、ヒトに限定されず、ヒト以外の哺乳類（例えばマウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ等の実験動物）でもよい。 Specific examples and preferred examples of the biological sample are the same as in the method of the present invention for evaluating bone quality described above. The subject is a subject with reduced bone quality, and is preferably a subject whose bone quality has been previously confirmed by another method (for example, by diagnosis by a doctor). Subjects are not limited to humans, and may be mammals other than humans (for example, laboratory animals such as mice, rats, hamsters, guinea pigs, and rabbits).
骨質評価用マーカーの量の定義およびその測定の、具体例および好ましい例は、上記の骨質の評価のための本発明の方法の場合と同様である。 Specific examples and preferred examples of the definition of the amount of the bone quality evaluation marker and its measurement are the same as in the method of the present invention for evaluating bone quality described above.
本発明の方法においては、通常、被検者に候補物質を投与し、少なくとも投与後の生体試料におけるマーカーの量の測定値から、候補物質の骨質に対する効果を確認する。確認は、少なくとも投与後の生体試料について行えばよく、投与期間終了後、投与期間の途中の各生体試料について行うことができ、投与期間投与終了までの間に２回以上行ってもよい。候補物質の骨質に対する効果の確認は、基準値との比較により行えばよい。基準値としては例えば、投与前の当該被検者由来の生体試料におけるマーカーの量の測定値、骨質が正常または異常であることが明らかな他の個体由来の生体試料におけるマーカーの量が挙げられる（基準値における生体試料は、通常、被検者由来の生体試料と同じである）。基準値が投与前の当該被検者由来の生体試料におけるマーカーの量である場合、投与後の被検者由来の生体試料における（３）、（７）、（８）、（１１）、（１２）、（１６）、（１８）、（２０）、および（２４）から選ばれる少なくとも１つの量が基準値より低いまたは同等である場合には、候補物質の骨質改善効果は低い可能性があることが確認され、基準値よりも高い場合には、候補物質の骨質改善効果が高い可能性があることが確認される。被検者由来の生体試料における（１）、（２）、（４）、（５）、（６）、（９）、（１０）、（１３）、（１４）、（１５）、（１７）、（１９）、（２１）、（２２）、（２３）、（２５）、（２６）、（２７）、（２８）、（２９）、および（３０）からなる群より選ばれる少なくとも１つの量が基準値より高いまたは同等である場合には、候補物質の骨質改善効果は低い可能性があることが確認され、基準値より低下した場合には、候補物質の骨質改善効果が高い可能性があることが確認される。 In the method of the present invention, a candidate substance is usually administered to a subject, and the effect of the candidate substance on bone quality is confirmed at least from the measurement value of the amount of the marker in the biological sample after administration. Confirmation may be performed at least on the biological sample after administration, and may be performed on each biological sample after the administration period and during the administration period, and may be performed twice or more during the administration period until the end of administration. The effect of the candidate substance on bone quality can be confirmed by comparison with reference values. Reference values include, for example, the measured value of the amount of the marker in the subject-derived biological sample before administration, and the amount of the marker in the biological sample derived from another individual whose bone quality is clearly normal or abnormal. (The biological sample at baseline is usually the same as the biological sample from the subject). When the reference value is the amount of the marker in the subject-derived biological sample before administration, (3), (7), (8), (11), (11), ( If the amount of at least one selected from 12), (16), (18), (20), and (24) is lower than or equal to the reference value, the candidate substance may have a low bone quality-improving effect. If it is higher than the reference value, it is confirmed that the candidate substance may have a high bone quality improving effect. (1), (2), (4), (5), (6), (9), (10), (13), (14), (15), (17) in a biological sample derived from a subject ), (19), (21), (22), (23), (25), (26), (27), (28), (29), and at least one selected from the group consisting of (30) If these two amounts are higher than or equal to the standard value, it is confirmed that the candidate substance may have a low bone quality improving effect, and if it is lower than the standard value, it is possible that the candidate substance has a high bone quality improving effect. It is confirmed that there is
マーカーとして（１）～（４）、（１０）～（１４）、（１８）～（２１）および（２５）～（２７）からなる群より選ばれる少なくとも１つのマーカーを用いることにより、候補物質の骨リモデリングに対する効果の評価を行うことができる。マーカーとして（５）～（９）、（１５）～（１７）、（２２）～（２４）および（２８）～（３０）からなる群より選ばれる少なくとも１つのマーカーを用いることにより、候補物質の骨微細構造に対する効果の評価を行うことができる。また、骨質は、歯槽骨の骨質、骨粗鬆症、糖尿病等の疾患と相関していることから、本発明の方法は、歯槽骨疾患、骨粗鬆症または糖尿病治療、予防、症状の改善または改善効果に対する候補物質の効果の評価のために行ってもよい。 candidate substance by using at least one marker selected from the group consisting of (1) to (4), (10) to (14), (18) to (21) and (25) to (27) as a marker can be evaluated for its effect on bone remodeling. candidate substance by using at least one marker selected from the group consisting of (5) to (9), (15) to (17), (22) to (24) and (28) to (30) as a marker can be evaluated for its effect on bone microstructure. In addition, since bone quality correlates with diseases such as alveolar bone quality, osteoporosis, diabetes, etc., the method of the present invention is a candidate substance for alveolar bone disease, osteoporosis, or diabetes treatment, prevention, symptom improvement, or ameliorative effect may be performed for evaluation of the effect of
－医療措置の骨質に対する効果の確認－
医療措置の骨質に対する効果の確認のために骨質評価用マーカーを検出する場合、本発明の方法は、骨質が低下している被検者に医療措置を実施し、少なくとも実施後の被検者由来の生体試料における上記マーカーの量を測定することを含む。
- Confirmation of the effect of medical measures on bone quality -
When detecting a bone quality evaluation marker for confirming the effect of medical treatment on bone quality, the method of the present invention includes performing medical treatment on a subject with reduced bone quality, and obtaining at least measuring the amount of said marker in said biological sample.
医療措置は特に限定されず、骨質に対する効果の確認が求められる措置であればよい。例えば、投薬、候補物質の投与、外科的措置が挙げられる。生体試料、被検者の具体例および好ましい例、骨質評価用マーカーの量の定義およびその測定の具体例および好ましい例は、上記の候補物質の骨質に対する効果の確認のための本発明の方法の場合と同様である。 The medical treatment is not particularly limited, and any treatment that requires confirmation of its effect on bone quality may be used. Examples include medication, administration of candidate substances, and surgical procedures. Biological samples, specific and preferred examples of subjects, definition of the amount of bone quality evaluation markers and specific and preferred examples of their measurement are the methods of the present invention for confirming the effect of the above candidate substances on bone quality. It is the same as the case.
本発明の方法においては、通常、被検者に医療措置を実施し、少なくとも実施後の生体試料におけるマーカーの量の測定値から、医療措置の骨質に対する効果を確認する。確認は、少なくとも医療措置実施後の生体試料について行えばよく、実施期間終了後、実施期間の途中の各生体試料について行うことができ、実施期間終了までの間に２回以上行ってもよい。医療措置の骨質に対する効果の確認は、基準値との比較により行えばよい。基準値としては例えば、実施前の当該被検者由来の生体試料におけるマーカーの量の測定値、骨質が正常または異常であることが明らかな他の個体由来の生体試料におけるマーカーの量が挙げられる（基準値における生体試料は、通常、被検者由来の生体試料と同じである）。基準値が実施前の当該被検者由来の生体試料におけるマーカーの量である場合、実施後の被検者由来の生体試料における（３）、（７）、（８）、（１１）、（１２）、（１６）、（１８）、（２０）、および（２４）からなる群より選ばれる少なくとも１つの量が基準値より低いまたは同等である場合には、医療措置の骨質改善効果は低い可能性があることが確認され、基準値よりも高い場合には、医療措置の骨質改善効果が高い可能性があることが確認される。被検者由来の生体試料における（１）、（２）、（４）、（５）、（６）、（９）、（１０）、（１３）、（１４）、（１５）、（１７）、（１９）、（２１）、（２２）、（２３）、（２５）、（２６）、（２７）、（２８）、（２９）、および（３０）からなる群より選ばれる少なくとも１つの量が基準値より高いまたは同等である場合には、医療措置の骨質改善効果は低い可能性があることが確認され、基準値より低下した場合には、医療措置の骨質改善効果が高い可能性があることが確認される。 In the method of the present invention, medical treatment is usually performed on a subject, and the effect of the medical treatment on bone quality is confirmed at least from the measurement of the marker amount in the biological sample after the treatment. Confirmation may be performed at least on the biological sample after the medical treatment has been performed, and may be performed on each biological sample after the implementation period and during the implementation period, and may be performed twice or more before the implementation period ends. Confirmation of the effect of medical treatment on bone quality may be performed by comparison with reference values. Reference values include, for example, the amount of markers measured in a biological sample derived from the subject before the test, and the amount of markers in a biological sample derived from another individual whose bone quality is clearly normal or abnormal. (The biological sample at baseline is usually the same as the biological sample from the subject). When the reference value is the amount of the marker in the subject-derived biological sample before implementation, (3), (7), (8), (11), (11), ( If at least one amount selected from the group consisting of 12), (16), (18), (20), and (24) is lower than or equal to the reference value, the bone quality improvement effect of the medical treatment is low. It is confirmed that there is a possibility, and if it is higher than the reference value, it is confirmed that there is a high possibility that the bone quality improvement effect of the medical treatment is high. (1), (2), (4), (5), (6), (9), (10), (13), (14), (15), (17) in a biological sample derived from a subject ), (19), (21), (22), (23), (25), (26), (27), (28), (29), and at least one selected from the group consisting of (30) If the two levels are higher than or equal to the reference value, it is confirmed that the bone quality improvement effect of the medical treatment may be low, and if it is lower than the reference value, the bone quality improvement effect of the medical treatment may be high. It is confirmed that there is
マーカーとして（１）～（４）、（１０）～（１４）、（１８）～（２１）および（２５）～（２７）からなる群より選ばれる少なくとも１つのマーカーを用いることにより、医療措置の骨リモデリングに対する効果の評価を行うことができる。マーカーとして（５）～（９）、（１５）～（１７）、（２２）～（２４）および（２８）～（３０）からなる群より選ばれる少なくとも１つのマーカーを用いることにより、医療措置の骨微細構造に対する効果の評価を行うことができる。また、骨質は、歯槽骨の骨質、骨粗鬆症、糖尿病等の疾患と相関していることから、本発明の方法は、歯槽骨疾患、骨粗鬆症または糖尿病治療、予防、症状の改善または改善効果に対する医療措置の効果の評価のために行ってもよい。 Medical treatment by using at least one marker selected from the group consisting of (1) to (4), (10) to (14), (18) to (21) and (25) to (27) as a marker can be evaluated for its effect on bone remodeling. Medical treatment by using at least one marker selected from the group consisting of (5) to (9), (15) to (17), (22) to (24) and (28) to (30) as a marker can be evaluated for its effect on bone microstructure. In addition, since bone quality correlates with diseases such as alveolar bone quality, osteoporosis, diabetes, etc., the method of the present invention can be used as a medical treatment for alveolar bone disease, osteoporosis, or diabetes treatment, prevention, improvement of symptoms, or improvement effect. may be performed for evaluation of the effect of
〔本発明の骨質評価用キット〕
本発明の骨質評価用キットは、上記抗体、アプタマーまたはマイクロアレイを含む。
[Kit for evaluating bone quality of the present invention]
The bone quality evaluation kit of the present invention contains the antibody, aptamer or microarray described above.
キットは、骨質評価用マーカーの量の測定の際に用いる試薬を更に含んでいてもよい。
試薬は、測定方法によって適宜選択することが出来、例えば、マーカーに結合した核酸や抗体を定量するための標識物質（例えば、抗体、核酸プローブ、その他の親和性リガンド）が挙げられる。
The kit may further contain reagents used in measuring the amount of the marker for evaluating bone quality.
Reagents can be appropriately selected depending on the measurement method, and examples thereof include labeling substances (eg, antibodies, nucleic acid probes, and other affinity ligands) for quantifying nucleic acids and antibodies bound to markers.
キットは、被検者から生体試料をサンプリングする際に用いる用具、例えばガムを更に含んでいてもよい。ガムは、刺激唾液採取用に通常用いられているガム（パラフィンガム等）であればよい。 The kit may further comprise a device, such as gum, for use in sampling the biological sample from the subject. The gum may be any gum commonly used for collecting stimulated saliva (such as paraffin gum).
実施例１．骨質に関与するタンパク質の同定
１－１）２型糖尿病モデルマウスの飼育
８週齢の雄性２型糖尿病モデルマウスＫＫ／ＴａＪｃｌ（日本クレア）９匹を搬入し、蒸留水、市販のペレットエサ（ＣＥ－２、日本クレア）を自由摂取させて１２週間飼育し、２０週齢時に麻酔下で腹部大静脈からの採血により安楽死した。糖尿病の発症を確認するため、採血した血液サンプルにおけるＨｂＡ１ｃ値（ＮＧＳＰ，％）を測定した。
Example 1. Identification of proteins involved in bone quality 1-1) Breeding of type 2 diabetes model mice Nine 8-week-old male type 2 diabetes model mice KK/TaJcl (CLEA Japan) were brought in, distilled water, commercial pellet feed (CE -2, CLEA Japan) was fed ad libitum for 12 weeks, and at the age of 20 weeks, it was euthanized by collecting blood from the abdominal vena cava under anesthesia. To confirm the onset of diabetes, the HbA1c value (NGSP, %) was measured in the collected blood samples.
１－２－１）マウス歯槽骨の骨リモデリング解析
１－１）で飼育したマウスについて１９週齢時にテトラサイクリン、その５日後にカルセインを皮下投与した。カルセイン投与の３日後に歯槽骨検体を採取、蛍光試薬投与時に形成中の骨に取り込まれたテトラサイクリン、カルセインを蛍光顕微鏡で検出、蛍光強度から骨形成速度（ｍｍ3／ｍｍ2／ｙｅａｒ）、骨吸収速度（ｍｍ2／ｍｍ2／ｙｅａｒ）、骨石灰化速度（μｍ／ｄａｙ）を算出した。
1-2-1) Bone Remodeling Analysis of Mouse Alveolar Bone The mice bred in 1-1) were subcutaneously administered tetracycline at the age of 19 weeks, and calcein five days later. Three days after the administration of calcein, alveolar bone specimens were collected, tetracycline and calcein incorporated into the forming bone at the time of administration of the fluorescent reagent were detected with a fluorescence microscope, and the bone formation rate (mm 3 /mm 2 /year) and bone density were calculated from the fluorescence intensity. Absorption rate (mm 2 /mm 2 /year) and bone mineralization rate (μm/day) were calculated.
１－２－２）歯槽骨の微細構造解析
１－１）で採取した歯槽骨をＸ線ＣＴにより撮影し、ＴＲＩ／３Ｄ－ＢＯＮ（ラトックシステムエンジニアリング社）を用いて、下顎歯槽骨の骨構造パラメータ解析を実施し、骨梁幅Ｔｂ．Ｔｈ（μｍ）、骨梁間隔Ｔｂ．ｓｐ（μｍ）、骨梁数Ｔｂ．Ｎ（１／ｍｍ）を計測した。
1-2-2) Microstructural analysis of alveolar bone The alveolar bone collected in 1-1) was photographed by X-ray CT, and the bone structure of the mandibular alveolar bone was analyzed using TRI/3D-BON (Ratoc System Engineering Co., Ltd.). A parametric analysis was performed to determine the trabecular width Tb. Th (μm), trabecular spacing Tb. sp (μm), trabecular bone number Tb. N (1/mm) was measured.
１－２－３）骨リモデリング、骨微細構造と相関するタンパク質の探索
１－２－２）の解析で用いた歯槽骨から抽出したタンパク質１μｇをＬＣ－ＭＳ／ＭＳ（Ｕｌｔｉｍａｔｅ３０００ ＲＳＬＣ Ｎａｎｏ ｓｙｓｔｅｍ：ダイオネクス社、ＬＴＱ Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｖｅｌｏｓ：Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）に供し、プロテオーム解析を実施した。解析ソフトＰｒｏｇｅｎｅｓｉｓ（Ｎｏｎｌｉｎｅａｒ Ｄｉｎａｍｉｃｓ社）を用いて、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳにより検出したＭＳピークのＩｏｎ Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ、すなわち定量値を取得した。
1-2-3) Bone remodeling, search for proteins correlated with bone microstructure 1 μg of protein extracted from alveolar bone used in analysis 1-2-2) was subjected to LC-MS/MS (Ultimate3000 RSLC Nano system: Dionex company, LTQ Orbitrap Velos: Thermo Fisher Scientific), and proteome analysis was performed. Analysis software Progenesis (Nonlinear Dynamics) was used to obtain the Ion Intensity of MS peaks detected by LC-MS/MS, that is, quantitative values.
さらに、ＭＡＳＣＯＴソフトウェアを用いてタンパク質データベースＵｎｉｐｒｏｔにデータを照会し、定量したＭＳピークに由来するタンパク質を同定、各タンパク質の定量値を算出した。 Furthermore, MASCOT software was used to refer data to the protein database Uniprot, proteins derived from the quantified MS peaks were identified, and the quantified value of each protein was calculated.
骨中に同定できたタンパク質の中で、その定量値が、骨形成速度（ｍｍ3／ｍｍ2／ｙｅａｒ）、骨吸収速度（ｍｍ2／ｍｍ2／ｙｅａｒ）、骨石灰化速度（μｍ／ｄａｙ）、骨梁幅Ｔｂ．Ｔｈ（μｍ）、骨梁間隔Ｔｂ．ｓｐ（μｍ）、骨梁数Ｔｂ．Ｎ（１／ｍｍ）と相関するタンパク質をそれぞれ探索した。 Among the proteins identified in the bone, the quantitative values are bone formation rate (mm 3 /mm 2 /year), bone resorption rate (mm 2 /mm 2 /year), bone mineralization rate (μm/day ), trabecular width Tb. Th (μm), trabecular spacing Tb. sp (μm), trabecular bone number Tb. Each protein that correlates with N (1/mm) was searched.
結果１－１
表１に示す通り、９個体のうち日本糖尿病学会が糖尿病の診断指標のひとつとして定める基準６．５％を上回る個体すなわち糖尿病発症は４個体、未発症は５個体であった。
Result 1-1
As shown in Table 1, among the 9 individuals, 4 individuals developed diabetes and 5 individuals did not develop diabetes, exceeding the standard of 6.5% defined by the Japan Diabetes Society as one of the diagnostic indices for diabetes.
結果１－２
歯槽骨から抽出したタンパク質のプロテオーム解析から８９３個のタンパク質を同定し、それらのタンパク質定量値と、骨リモデリング指標定量値（骨形成速度、骨吸収速度、骨石灰化速度）および微細構造指標定量値（骨梁幅、骨梁間隔、骨梁数）をピアソンの相関分析法により解析した。相関解析のｐ値がｐ＜０．０５である場合に有意に相関すると判断した。
Result 1-2
893 proteins were identified by proteome analysis of proteins extracted from alveolar bone, and their protein quantification values, bone remodeling index quantification values (bone formation rate, bone resorption rate, bone mineralization rate) and fine structure index quantification. Values (trabecular width, trabecular spacing, trabecular number) were analyzed by Pearson's correlation analysis method. Significant correlation was determined when the p-value for correlation analysis was p<0.05.
その結果、表２に示すとおり、骨リモデリング指標である、骨形成速度、骨吸収速度、骨石灰化速度と相関するタンパク質として、ＣＯＴＬ１、ＡＲＨＧＤＩＢ、ＬＧＡＬＳ３ＢＰ、ＧＮＡＩ２、ＨＮＲＰＤ、ＴＨＲＢ、ＳＰＲＬ１、ＰＲＴＮ３、ＡＲＰ３、ＣＯ６Ａ２、ＣＤ９、ＣＥＲＵ、ＨＮＲＰＵ、ＬＤＨＢ、ＰＲＤＸ５、ＡＬＤＯＡを、骨微細構造に関する指標である、骨梁幅、骨梁間隔、骨梁数と相関するタンパク質としてＵＢＥ２Ｌ３、ＡＲＡ２４、ＰＡＭ、ＩＴＩＨ１、ＣＡＰＧ、ＭＹＨ７Ｂ、ＡＮＴ３、ＣＢＸ３、ＫＰＹＭ、ＭＯＥＳ、ＧＲＮ、ＡＲＰ２、ＲＨＯＡ、ＴＡＬＤＯを見出した。 As a result, as shown in Table 2, COTL1, ARHGDIB, LGALS3BP, GNAI2, HNRPD, THRB, SPRL1, PRTN3, ARP3, CO6A2, CD9, CERU, HNRPU, LDHB, PRDX5, and ALDOA, and UBE2L3, ARA24, PAM, ITIH1, and CAPG as proteins that correlate with trabecular width, trabecular spacing, and trabecular number, which are indices of bone microstructure. , MYH7B, ANT3, CBX3, KPYM, MOES, GRN, ARP2, RHOA, TALDO.
実施例２．糖尿病患者唾液における骨質関連タンパク質解析
骨関連の疾患を有さない６名の健常者と糖尿病患者７名から安静時唾液を５００μｌ採取し、唾液中の主要タンパクをアフィニティーカラムで除去した後、１μｇのＬＣ－ＭＳ／ＭＳ（Ｕｌｔｉｍａｔｅ３０００ ＲＳＬＣ Ｎａｎｏ ｓｙｓｔｅｍ：ダイオネクス社、ＬＴＱ Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｖｅｌｏｓ：Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）に供し、プロテオーム解析を実施した。解析ソフトＰｒｏｇｅｎｅｓｉｓ（Ｎｏｎｌｉｎｅａｒ Ｄｉｎａｍｉｃｓ社）を用いて、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳにより検出したＭＳピークのＩｏｎ Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ、すなわち定量値を取得した。
Example 2. Analysis of bone-related proteins in saliva of diabetic patients 500 μl of resting saliva was collected from 6 healthy subjects without bone-related diseases and 7 diabetic patients, and after removing major proteins in saliva with an affinity column, 1 μg Proteome analysis was performed by LC-MS/MS (Ultimate3000 RSLC Nano system: Dionex, LTQ Orbitrap Velos: Thermo Fisher Scientific). Analysis software Progenesis (Nonlinear Dynamics) was used to obtain the Ion Intensity of MS peaks detected by LC-MS/MS, that is, quantitative values.
さらに、ＭＡＳＣＯＴソフトウェアを用いてタンパク質データベースＵｎｉｐｒｏｔにデータを照会し、定量したＭＳピークに由来するタンパク質を同定、各タンパク質の定量値を算出した。 Furthermore, MASCOT software was used to refer data to the protein database Uniprot, proteins derived from the quantified MS peaks were identified, and the quantified value of each protein was calculated.
得られた定量値について健常者、糖尿病患者で２群間比較（Ｓｔｕｄｅｎｔ ｔ－ｔｅｓｔ）を行った。 The obtained quantitative values were compared between two groups (Student t-test) in healthy subjects and diabetic patients.
結果２．
表３～７から、健常者と糖尿病患者の各唾液中における結果１－２にて見いだされたタンパク質（表２）発現量の２群間比較の結果、ｐ値が０．１未満（ｐ＜０．１）であり、統計学的有意に変動していることが見出された。
Result 2.
From Tables 3 to 7, as a result of comparing the expression levels of the proteins found in Results 1-2 (Table 2) in each saliva of healthy subjects and diabetic patients between the two groups, the p value is less than 0.1 (p < 0.1), which was found to vary with statistical significance.
実施例１および２の結果は、本発明のバイオマーカーである各タンパク質（表２）の唾液中の量が骨質と密接に関連すること、および、実際に骨質が低下している糖尿病患者の唾液で変動することを示している。 The results of Examples 1 and 2 show that the amount of each protein (Table 2), which is a biomarker of the present invention, in saliva is closely related to bone quality, and that the saliva of diabetic patients whose bone quality is actually degraded It shows that it fluctuates with
歯槽骨の骨密度は腰椎や大腿骨の骨密度測定の代替として活用可能であることが知られており（非特許文献４）、歯槽骨は骨折を伴い易い腰椎、大腿骨の状態も反映することも判断できる。したがって、実施例１および２の結果は、被検体の口腔内から採取した検体中に、本発明のバイオマーカーの量を検出することにより全身の骨の骨質の良し悪しを判定できることを示している。 It is known that the bone density of alveolar bone can be used as an alternative to measuring the bone density of the lumbar spine and femur (Non-Patent Document 4), and the alveolar bone reflects the condition of the lumbar spine and femur, which are prone to fracture. can also be determined. Therefore, the results of Examples 1 and 2 show that it is possible to determine whether the bone quality of the whole body is good or bad by detecting the amount of the biomarker of the present invention in the specimen collected from the oral cavity of the subject. .
Claims (16)
（１２）ＳＰＡＲＣ－ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ １ A marker for evaluating bone remodeling , which is the following (12) .
( 12) SPARC-like protein 1
（２）Ｒｈｏ ＧＤＰ－ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ２
（３）Ｇａｌｅｃｔｉｎ－３－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ
（４）Ｇｕａｎｉｎｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ（ｉ）ｓｕｂｕｎｉｔ ａｌｐｈａ－２
（１０）Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ ｎｕｃｌｅａｒ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｄ０
（１１）Ｐｒｏｔｈｒｏｍｂｉｎ
（１３）Ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｉｎ
（１４）Ａｃｔｉｎ－ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ３
（１８）Ｃｏｌｌａｇｅｎ ａｌｐｈａ－２（ＶＩ）ｃｈａｉｎ
（１９）ＣＤ９ ａｎｔｉｇｅｎ
（２０）Ｃｅｒｕｌｏｐｌａｓｍｉｎ
（２１）Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ ｎｕｃｌｅａｒ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｕ
（２５）Ｌ－ｌａｃｔａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ Ｂ ｃｈａｉｎ
（２６）Ｐｅｒｏｘｉｒｅｄｏｘｉｎ－５，ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ
（２７）Ｆｒｕｃｔｏｓｅ－ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ ａｌｄｏｌａｓｅ Ａ The bone remodeling evaluation marker according to claim 1 and the following (2) to (4), (10) , (11), (13), (14), (18) to (21) and (25) ) to (27), and at least one marker for bone remodeling evaluation .
(2) Rho GDP-dissociation inhibitor 2
(3) Galectin-3-binding protein
(4) Guanine nucleotide-binding protein G (i) subunit alpha-2
(10) Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein D0
(11) Prothrombin
(13) Myeloblastin
(14) Actin-related protein 3
(18) Collagen alpha-2(VI) chain
(19) CD9 antigens
(20) Ceruloplasmin
(21) Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein U
(25) L-lactate dehydrogenase B chain
(26) Peroxiredoxin-5, mitochondrial
(27) Fructose-bisphosphate aldolase A
（５）Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ－ｃｏｎｊｕｇａｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ Ｅ２ Ｌ３
（６）ＧＴＰ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｎｕｃｌｅａｒ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒａｎ
（７）Ｐｅｐｔｉｄｙｌ－ｇｌｙｃｉｎｅ ａｌｐｈａ－ａｍｉｄａｔｉｎｇ ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ
（８）Ｉｎｔｅｒ－ａｌｐｈａ－ｔｒｙｐｓｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ Ｈ１
（９）Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ－ｃａｐｐｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ
（１５）Ｍｙｏｓｉｎ－７Ｂ
（１６）Ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎ－ＩＩＩ
（１７）Ｃｈｒｏｍｏｂｏｘ ｐｒｏｔｅｉｎ ｈｏｍｏｌｏｇ ３
（２２）Ｐｙｒｕｖａｔｅ ｋｉｎａｓｅ ｉｓｏｚｙｍｅｓ Ｍ１／Ｍ２
（２３）Ｍｏｅｓｉｎ
（２４）Ｇｒａｎｕｌｉｎｓ
（２８）Ａｃｔｉｎ－ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ２
（２９）Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ＲｈｏＡ
（３０）Ｔｒａｎｓａｌｄｏｌａｓｅ The marker for evaluating bone remodeling according to claim 1 or the marker set for evaluating bone remodeling according to claim 2, and the following (5) to (9), (15) to (17), (22) to ( 24) and a marker for bone microstructure evaluation including at least one selected from the group consisting of (28) to (30).
(5) Ubiquitin-conjugating enzyme E2 L3
(6) GTP-binding nuclear protein Ran
(7) Peptidyl-glycine alpha-amidating monooxygenase
(8) Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H1
(9) Macrophage-capping protein
(15) Myosin-7B
(16) Antithrombin-III
(17) Chromobox protein homolog 3
(22) Pyruvate kinase isozymes M1/M2
(23) Moesin
(24) Granulins
(28) Actin-related protein 2
(29) Transforming protein RhoA
(30) Transaldolase
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