JP2013195077A - Periodontal disease determination marker - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、歯周病判定マーカーに関する。 The present invention relates to a periodontal disease determination marker.
歯周病は歯を支持している歯周組織（歯肉、セメント質、歯根膜、および歯槽骨）が破壊される炎症性疾患である。歯周病が進行するにつれ、歯根膜、歯槽骨などの組織の破壊および吸収に波及する（非特許文献１）。現在、歯周病診断はレントゲン撮影または歯科医の目視などによる臨床指標による歯槽骨吸収量の測定による診断が主である。 Periodontal disease is an inflammatory disease in which the periodontal tissues supporting the teeth (gingiva, cementum, periodontal ligament, and alveolar bone) are destroyed. As periodontal disease progresses, it affects the destruction and absorption of tissues such as periodontal ligament and alveolar bone (Non-patent Document 1). At present, the diagnosis of periodontal disease is mainly performed by measuring alveolar bone resorption by a clinical index such as X-ray imaging or visual inspection by a dentist.
セルグリシン（ｓｅｒｇｌｙｃｉｎ）はタンパク質の一種である。特許文献１には、セルグリシンがＣＤ４４のリガンドであることが記載されている。ＣＤ４４は、がんの転移やリンパ球のホーミングにおいて重要な役割を担う膜貫通タンパク質である。非特許文献２には、セルグリシンが骨髄腫において骨石灰化抑制効果を発揮することが記載されている。 Serglycin is a type of protein. Patent Document 1 describes that serglycine is a ligand of CD44. CD44 is a transmembrane protein that plays an important role in cancer metastasis and lymphocyte homing. Non-Patent Document 2 describes that serglycine exhibits a bone mineralization inhibitory effect in myeloma.
レギュカルシン（ｒｅｇｕｃａｌｃｉｎ）は、タンパク質の一種である。非特許文献３には、レギュカルシンが過剰発現したラットでは骨吸収を引き起こすことが記載されている。 Regucalcin is a type of protein. Non-Patent Document 3 describes that rats that overexpress regucalcin cause bone resorption.
しかしながら、目視評価などは歯科医の経験および技術によるところが大きく、客観性に欠ける場合があった。また、定期的に歯科医でレントゲンなどの歯周病診断を受けることは被爆の懸念に加え、通院に伴う時間的な制約からも容易ではなかった。 However, visual evaluation and the like largely depend on dentist's experience and technology, and there are cases where objectivity is lacking. In addition, it is not easy to receive periodontal diseases such as X-rays at regular dentists due to concerns about exposure and time constraints associated with hospital visits.
本発明は、歯周病の発症および／または進行度、歯槽骨吸収の発症および／または進行度を、通常の健康診断の一環として把握するツールを提供することを目的とする。 An object of this invention is to provide the tool which grasps | ascertains the onset and / or progress degree of a periodontal disease, and the onset and / or progress degree of alveolar bone resorption as part of a normal medical examination.
本発明者らは、健常マウスと歯周病モデルマウスの血清プロテオーム解析から、セルグリシンの血中濃度が歯周病モデルマウスでは低下すること、レギュカルシンの血中濃度が歯周病モデルマウスでは増加することを見出し、セルグリシンおよびレギュカルシンがそれぞれ、歯周病の発症および／または進行度を表す、ならびに、歯槽骨吸収の発症および／または進行度を表す、バイオマーカーとして利用できることを見出し、本発明に到達した。 Based on the serum proteome analysis of healthy mice and periodontal disease model mice, the present inventors found that the serum concentration of serglycine decreased in the periodontal disease model mice and the blood concentration of regucalcin increased in the periodontal disease model mice. And selglycine and regucalcin can be used as biomarkers representing the onset and / or progression of periodontal disease and the onset and / or progression of alveolar bone resorption, respectively. Reached.
本発明は、下記の発明を提供する。
〔１〕セルグリシンまたはレギュカルシンからなる歯周病の発症および／または進行度判定用マーカータンパク質。
〔２〕セルグリシンまたはレギュカルシンからなる歯槽骨吸収の発症および／または進行度判定用マーカータンパク質。
〔３〕セルグリシンおよび／またはレギュカルシンに結合する、歯周病の発症および／または進行度判定用の抗体またはアプタマー。
〔４〕セルグリシンおよび／またはレギュカルシンに結合する、歯槽骨吸収の発症および／または進行度判定用の抗体またはアプタマー。
〔５〕セルグリシンおよび／またはレギュカルシンに結合する抗体またはアプタマーが担体に固相化された、歯周病の発症および／または進行度判定用マイクロアレイ。
〔６〕セルグリシンおよび／またはレギュカルシンに結合する抗体またはアプタマーが担体に固相化された、歯槽骨吸収の発症および／または進行度判定用マイクロアレイ。
〔７〕被験者から採取された血液、唾液および尿からなる群より選ばれる１以上の生体試料中のセルグリシンおよび／またはレギュカルシンの量を測定して、該量から、被験者が歯周病を発症しているか否かおよび／または被験者の歯周病の進行度を判定する、歯周病の発症および／または進行度の判定方法。
〔８〕被験者から採取された血液、唾液および尿からなる群より選ばれる１以上の生体試料中のセルグリシンおよび／またはレギュカルシンの量を測定して、該量が、健常者から採取された血液中の当該量と比べて少量である場合に、被験者が歯周病を発症していると判定する、上記〔７〕に記載の判定方法。
〔９〕２人以上の被験者から採取された血液、唾液および尿からなる群より選ばれる１以上の生体試料中のセルグリシンおよび／またはレギュカルシンの量を測定して、該量が少量である被験者ほど歯周病が進行していると判定する、上記〔７〕に記載の判定方法。
〔１０〕被験者から採取された血液、唾液および尿からなる群より選ばれる１以上の生体試料中のセルグリシンおよび／またはレギュカルシンの量を測定して、該量から、被験者において歯槽骨の吸収が発生しているか否かおよび／または被験者の歯槽骨吸収の進行度を判定する、歯槽骨吸収の発症および／または進行度の判定方法。
〔１１〕被験者から採取された血液、唾液および尿からなる群より選ばれる１以上の生体試料中のセルグリシンおよび／またはレギュカルシンの量を測定して、該量が、健常者から採取された血液中の当該量と比べて少量である場合に、被験者が歯槽骨吸収を発症していると判定する、上記〔１０〕に記載の判定方法。
〔１２〕２名以上の被験者から採取された血液、唾液および尿からなる群より選ばれる１以上の生体試料中のセルグリシンおよび／またはレギュカルシンの量を測定して、該量が少量である被験者ほど歯槽骨吸収が進行していると判定する、上記〔１０〕に記載の判定方法。
〔１３〕生体試料中のセルグリシンおよび／またはレギュカルシンの量の測定を、質量分析法と、請求項３または４に記載の抗体またはアプタマーを用いる免疫測定法と、請求項５または６に記載のマイクロアレイを用いる免疫測定法との中から選ばれる方法により行う、上記〔７〕〜〔１２〕のいずれか一項に記載の判定方法。
〔１４〕上記〔２〕に記載の抗体またはアプタマー、もしくは上記〔４〕に記載のマイクロアレイを含む、歯周病の発症および／または進行度判定用キット。
〔１５〕上記〔３〕に記載の抗体またはアプタマー、もしくは上記〔５〕に記載のマイクロアレイを含む、歯槽骨吸収の発症および／または進行度判定用キット。
The present invention provides the following inventions.
[1] A marker protein for determining the onset and / or progression of periodontal disease comprising serglycine or regucalcin.
[2] A marker protein for determining the onset and / or progression of alveolar bone resorption comprising serglycine or regucalcin.
[3] An antibody or aptamer for determination of the onset and / or progression of periodontal disease that binds to serglycine and / or regucalcin.
[4] An antibody or aptamer for determining the onset and / or progress of alveolar bone resorption that binds to serglycin and / or regucalcin.
[5] A microarray for determining the onset and / or progression of periodontal disease, wherein an antibody or aptamer that binds serglycin and / or regucalcin is immobilized on a carrier.
[6] A microarray for determining the onset and / or progression of alveolar bone resorption, wherein an antibody or aptamer that binds serglycin and / or regucalcin is immobilized on a carrier.
[7] The amount of serglycine and / or regucalcin in one or more biological samples selected from the group consisting of blood, saliva and urine collected from the subject is measured, and the subject develops periodontal disease from the amount A method for determining the onset and / or progression of periodontal disease, which determines whether or not and / or the progression of periodontal disease of a subject.
[8] The amount of serglycine and / or regucalcin in one or more biological samples selected from the group consisting of blood, saliva and urine collected from a subject is measured, and the amount is blood collected from a healthy subject The determination method according to the above [7], wherein the subject is determined to have developed periodontal disease when the amount is small compared with the amount in question.
[9] A subject whose amount is small by measuring the amount of serglycine and / or regucalcin in one or more biological samples selected from the group consisting of blood, saliva and urine collected from two or more subjects The determination method according to [7] above, wherein it is determined that periodontal disease is progressing.
[10] The amount of serglycine and / or regucalcin in one or more biological samples selected from the group consisting of blood, saliva and urine collected from the subject is measured, and from this amount, alveolar bone is absorbed in the subject. A method for determining the onset and / or progress of alveolar bone resorption, wherein the occurrence and / or progress of alveolar bone resorption of a subject is determined.
[11] The amount of serglycine and / or regucalcin in one or more biological samples selected from the group consisting of blood, saliva and urine collected from a subject is measured, and the amount of blood collected from healthy subjects The determination method according to the above [10], wherein the subject is determined to have developed alveolar bone resorption when the amount is small compared to the amount in question.
[12] A subject whose amount is small by measuring the amount of serglycin and / or regucalcin in one or more biological samples selected from the group consisting of blood, saliva and urine collected from two or more subjects The determination method according to [10], wherein it is determined that alveolar bone resorption is progressing as much as possible.
[13] The measurement of serglycin and / or regucalcin in a biological sample is performed by mass spectrometry, immunoassay using the antibody or aptamer according to claim 3 or 4, and claim 5 or 6. The determination method according to any one of [7] to [12], which is performed by a method selected from immunoassays using a microarray.
[14] A kit for determining the onset and / or progression of periodontal disease, comprising the antibody or aptamer according to [2] above, or the microarray according to [4] above.
[15] A kit for determining the onset and / or progression of alveolar bone resorption, comprising the antibody or aptamer according to [3] above, or the microarray according to [5] above.
本発明により、従来のようにレントゲンを用いずに採取された生体試料により科学的および客観的に歯周病の発症、歯周病の進行度、歯槽骨吸収の発症、および歯槽骨吸収の進行度の、各判定が可能である。 According to the present invention, the onset of periodontal disease, the degree of progression of periodontal disease, the onset of alveolar bone resorption, and the progression of alveolar bone resorption, scientifically and objectively by biological samples collected without using X-rays as in the past Each determination is possible.
本発明は、歯周病の発症および／または進行度の判定、および、歯槽骨吸収の発症および／または進行度の判定に関する。 The present invention relates to determination of the onset and / or progression of periodontal disease and determination of the onset and / or progression of alveolar bone resorption.
本発明において歯周病の発症とは、被験者が歯周病を発症しているかどうかの判定（評価、判別、鑑別）を行うこと、または被験者が歯周病患者か健常者かの区別（分類）を行うことを意味する。歯周病の進行度の判定とは、歯周病が進行しているかどうかの判定（評価、判別、鑑別）を行うこと、または被験者が歯周病患者か健常者かの区別（分類）を行うことを意味する。 In the present invention, the onset of periodontal disease refers to the determination (evaluation, discrimination, differentiation) of whether or not the subject has developed periodontal disease, or whether the subject is a periodontal disease patient or a healthy person (classification) ). Determining the degree of progression of periodontal disease means determining whether periodontal disease is progressing (evaluation, discrimination, differentiation), or distinguishing (classifying) whether the subject is a periodontal disease patient or a healthy person Means to do.
本発明において歯槽骨吸収の発症とは、被験者が歯槽骨吸収を発症しているかどうかの判定（評価、判別、鑑別）を行うことを意味する。歯槽骨吸収の進行度の判定とは、歯周病が進行しているかどうかの判定（評価、判別、鑑別）を行うこと、または被験者が歯周病患者か健常者かの区別（分類）を行うことを意味する。 In the present invention, the onset of alveolar bone resorption means performing determination (evaluation, discrimination, discrimination) on whether or not the subject has developed alveolar bone resorption. Determining the progress of alveolar bone resorption means determining whether periodontal disease is progressing (evaluation, discrimination, differentiation), or distinguishing (classifying) whether the subject is a periodontal disease patient or a healthy person Means to do.
本発明において判定の精度は、複数人の被験者のうち、通常は統計学的に有意な割合の被験者において、歯周病の発症および／または進行度の判定、および、歯槽骨吸収の発症および／または進行度を正しく判定できる程度であり、例えば１５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上の被験者において歯周病を発症していることを正しく判定できる程度である。本発明の判定方法は、医師による診断前の予備的な判定方法として有用である。 In the present invention, the accuracy of the determination is usually determined in a statistically significant proportion of subjects among the plurality of subjects, the determination of the onset and / or progression of periodontal disease, and the onset of alveolar bone resorption and / or Or the degree of progression can be judged correctly, for example, correctly judging that periodontal disease has developed in 150% or more, 60% or more, 70% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more It is possible. The determination method of the present invention is useful as a preliminary determination method before diagnosis by a doctor.
本発明における被験者は、通常は動物であり、好ましくは、ヒト、実験動物（マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギなど）であり、より好ましくはヒトである。 The subject in the present invention is usually an animal, preferably a human or a laboratory animal (mouse, rat, guinea pig, hamster, rabbit, etc.), more preferably a human.
本発明の判定方法においては、被験者から採取された生体試料として、血液、唾液および尿からなる群から選ばれる１以上を用いる。生体試料は、好ましくは血液である。血液は、全血であってもよいし、血液成分（血清、血漿など）であってもよい。 In the determination method of the present invention, one or more selected from the group consisting of blood, saliva and urine is used as the biological sample collected from the subject. The biological sample is preferably blood. The blood may be whole blood or a blood component (serum, plasma, etc.).
本発明においては、歯周病の発症および／または進行度の判定、および、歯槽骨吸収の発症および／または進行度の判定にあたり、被験者から採取された生体試料中のセルグリシンおよび／またはレギュカルシンの量または有無を測定する。したがって、セルグリシンおよびレギュカルシンは、それぞれ、歯周病の発症および／または進行度の判定用マーカー、歯槽骨吸収の発症および／または進行度の判定用マーカーとしても有用である。 In the present invention, in the determination of the onset and / or progression of periodontal disease and the determination of the onset and / or progression of alveolar bone resorption, serglycin and / or regucalcin in a biological sample collected from a subject is used. Measure quantity or presence. Therefore, serglycine and regucalcin are also useful as markers for determining the onset and / or progression of periodontal disease and markers for determining the onset and / or progression of periodontal bone resorption, respectively.
セルグリシン（ｓｅｒｇｌｙｃｉｎ）はタンパク質の一種である。コア部分のタンパク質の分子量は１７．６ｋＤａであるが、糖などの修飾を受けた場合には分子量が最大約６００ｋＤａ程度に検出されることもある。本発明においてセルグリシンは糖などの修飾を受けていないタンパク質であってもよいし、糖などの修飾を受けているタンパク質（ゆるプロテオグリカンなど）であってもよい。 Serglycin is a type of protein. The molecular weight of the protein in the core portion is 17.6 kDa, but when the sugar is modified, the molecular weight may be detected up to about 600 kDa. In the present invention, serglycine may be a protein that is not modified with sugar or the like, or may be a protein that is modified with sugar (such as loose proteoglycan).
レギュカルシン（ｒｅｇｕｃａｌｃｉｎ）は、肝臓などの臓器で発現されることが知られているタンパク質の一種である。レギュカルシンのコア部分の分子量は約３５ｋＤａであり、レギュカルシン全体の分子量は、糖などの修飾に応じて変動する。本発明においてレギュカルシンは、糖などの修飾を受けていないタンパク質であってもよいし、糖などの修飾を受けているタンパク質（プロテオグリカンなど）であってもよい。 Regucalcin is a type of protein known to be expressed in organs such as the liver. The molecular weight of the core part of regucalcin is about 35 kDa, and the molecular weight of the whole regucalcin varies depending on modifications such as sugar. In the present invention, the regucalcin may be a protein that is not modified with a sugar or the like, or may be a protein that is modified with a sugar (such as a proteoglycan).
セルグリシンの量または有無、およびレギュカルシンの量または有無は、セルグリシンおよび／またはレギュカルシンに結合する抗体またはアプタマーを用いることにより測定してもよい。すなわち、被験者から採取された生体試料を上記抗体またはアプタマーに作用させた際に、抗体またはアプタマーに結合したセルグリシンの結合量を測定することにより、生体試料中のセルグリシンおよびレギュカルシンの量を知ることができ、歯周病の発症および／または進行度の判定、および、歯槽骨吸収の発症および／または進行度の判定が可能である。 The amount or presence of serglycine and the amount or presence of regucalcin may be measured by using an antibody or aptamer that binds to serglycine and / or regucalcin. That is, when a biological sample collected from a subject is allowed to act on the above antibody or aptamer, the amount of serglycine and regucalcin in the biological sample is known by measuring the amount of serglycin bound to the antibody or aptamer. It is possible to determine the onset and / or progression of periodontal disease and to determine the onset and / or progression of alveolar bone resorption.
セルグリシンおよび／またはレギュカルシンに結合する抗体またはアプタマーは、常法により作製することができる。 An antibody or aptamer that binds to serglycin and / or regucalcin can be prepared by a conventional method.
セルグリシンおよび／またはレギュカルシンに結合する抗体またはアプタマーを用いてセルグリシンの量または有無および／またはレギュカルシンの量または有無を測定する際の例を以下に示す。まず抗体またはアプタマーをマイクロタイタープレート等の担体に、物理的吸着、官能基を利用した共有結合等、公知の方法により吸着させた後、生体試料を必要に応じて希釈後に添加してインキュベーションする。次に蛍光発光物質、化学発光物質または酵素を結合させた２次抗体を加えインキュベーションする。検出はそれぞれの基質を加えた後、蛍光もしくは化学発光物質または酵素反応による可視光を計測することによって評価判定を行う。セルグリシンの量を測定する場合には、抗体またはアプタマーはセルグリシンに結合する抗体またはアプタマーであればよい。レギュカルシンの量を測定する場合には、抗体またはアプタマーはレギュカルシンに結合する抗体またはアプタマーであればよい。セルグリシンの量およびレギュカルシンの量を測定する場合には、抗体またはアプタマーはセルグリシンとレギュカルシンの両者に結合する抗体またはアプタマーであればよい。 Examples of measuring the amount or presence of serglycin and / or the amount or presence of regucalcin using an antibody or aptamer that binds to serglycin and / or regucalcin are shown below. First, an antibody or aptamer is adsorbed on a carrier such as a microtiter plate by a known method such as physical adsorption or covalent bonding using a functional group, and then a biological sample is added after dilution as necessary and incubated. Next, a secondary antibody conjugated with a fluorescent substance, a chemiluminescent substance or an enzyme is added and incubated. For detection, evaluation is performed by adding each substrate and then measuring visible light by fluorescent or chemiluminescent substances or enzymatic reactions. When measuring the amount of serglycine, the antibody or aptamer may be an antibody or aptamer that binds to serglycin. When measuring the amount of regucalcin, the antibody or aptamer may be an antibody or aptamer that binds to regucalcin. When measuring the amount of serglycine and the amount of regucalcin, the antibody or aptamer may be an antibody or aptamer that binds to both serglycine and regucalcin.
セルグリシンおよび／またはレギュカルシンに結合する抗体またはアプタマーは、マイクロアレイに固相化して用いてもよい。マイクロアレイを用いることにより、セルグリシンおよび／またはレギュカルシンの量または有無を測定することができ、歯周病の発症および／または進行度の判定、および、歯槽骨吸収の発症および／または進行度の判定が可能である。 Antibodies or aptamers that bind to serglycin and / or regucalcin may be used after immobilizing them on a microarray. By using the microarray, the amount or presence of serglycin and / or regucalcin can be measured, the onset and / or progression of periodontal disease, and the onset and / or progression of alveolar bone resorption Is possible.
マイクロアレイとは、担体（基材）上に測定しようとする物質に結合し得る物質を整列し固定化させたデバイスを総称していう。マイクロアレイの担体の材料としては、ガラスなどの無機材料、ニトロセルロースなどの有機材料のいずれであってもよい。マイクロアレイの担体の形状としては、膜、ビーズ、プレートのいずれであってもよい。 A microarray is a generic term for devices in which substances that can bind to a substance to be measured are aligned and fixed on a carrier (base material). The material of the microarray carrier may be an inorganic material such as glass or an organic material such as nitrocellulose. The shape of the microarray carrier may be a membrane, a bead, or a plate.
セルグリシンおよび／またはレギュカルシンに結合する抗体またはアプタマーが固相化されているマイクロアレイは、上記抗体またはアプタマーを担体に固定化して製造することができる。固定化の際には、マイクロアレイヤー、スポッター等の機器を用いることができる。 A microarray on which an antibody or aptamer that binds to serglycin and / or regucalcin is immobilized can be produced by immobilizing the antibody or aptamer on a carrier. For immobilization, devices such as a microarrayer and a spotter can be used.
セルグリシンおよび／またはレギュカルシンに結合する抗体またはアプタマーが固相化されているマイクロアレイを用いるセルグリシンの量の測定例を以下に示す。まず、マイクロアレイ上に、固相化された抗体またはアプタマーに、生体試料を添加し、生体試料中のマーカーペプチドを結合させ、次に蛍光発光物質、化学発光物質、または酵素を結合させた２次抗体を加えインキュベーションする。検出はそれぞれの基質を加えた後、蛍光もしくは化学発光物質または酵素反応による可視光を計測すればよい。 An example of measuring the amount of serglycin using a microarray on which antibodies or aptamers that bind to serglycin and / or regucalcin are immobilized is shown below. First, a biological sample is added to an immobilized antibody or aptamer on a microarray, a marker peptide in the biological sample is bound, and then a fluorescent substance, a chemiluminescent substance, or an enzyme is bound. Add antibody and incubate. Detection may be performed by adding each substrate and then measuring the fluorescent or chemiluminescent substance or visible light from the enzyme reaction.
セルグリシンおよび／またはレギュカルシンに結合する抗体またはアプタマー、あるいは、該抗体またはアプタマーが固相化されているマイクロアレイは、歯周病の発症および／または進行度の判定用キットとして利用することができる。また、セルグリシンおよび／またはレギュカルシンに結合する抗体またはアプタマー、あるいは、該抗体またはアプタマーが固相化されているマイクロアレイは、歯槽骨吸収の発症および／または進行度の判定用キットとして利用することができる。ク判定用キットは、上記抗体またはアプタマー、もしくは、上記マイクロアレイを含む。 An antibody or aptamer that binds to serglycin and / or regucalcin, or a microarray on which the antibody or aptamer is immobilized can be used as a kit for determining the onset and / or progression of periodontal disease. In addition, an antibody or aptamer that binds to serglycin and / or regucalcin, or a microarray on which the antibody or aptamer is immobilized can be used as a kit for determining the onset and / or progression of alveolar bone resorption. it can. The kit for determination of judgment includes the antibody or aptamer, or the microarray.
本発明において、セルグリシンおよび／またはレギュカルシンの測定は、例えば、質量分析法によることができる。質量分析法による測定の際には各種の質量分析装置を利用することができる。質量分析装置としては、例えば、ＧＣ−ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ、ＦＡＢ−ＭＳ、ＥＩ−ＭＳ、ＣＩ−ＭＳ、ＦＤ−ＭＳ、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ、ＥＳＩ−ＭＳ、ＨＰＬＣ−ＭＳ、ＦＴ−ＩＣＲ−ＭＳ、ＣＥ−ＭＳ、ＩＣＰ−ＭＳ、Ｐｙ−ＭＳ、ＴＯＦ−ＭＳなどが挙げられ、これらのいずれも利用可能である。 In the present invention, serglycine and / or regucalcin can be measured, for example, by mass spectrometry. Various types of mass spectrometers can be used for measurement by mass spectrometry. Examples of the mass spectrometer include GC-MS, LC-MS, FAB-MS, EI-MS, CI-MS, FD-MS, MALDI-MS, ESI-MS, HPLC-MS, FT-ICR-MS, CE-MS, ICP-MS, Py-MS, TOF-MS and the like can be mentioned, and any of these can be used.
また、各成分は、セルグリシンおよび／またはレギュカルシンに結合する物質（例えば、上記の抗体およびアプタマーのほか、受容体、酵素、ペプチドなど）、または上記のマイクロアレイを利用して、ＲＩＡ（ラジオイムノアッセイ）、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着法）、ＥＣＬＩＡ（電気化学発光免疫測定法）、ウェスタンブロッティング法などの免疫化学的手法により測定することもできる。 In addition, each component is a substance that binds to serglycin and / or regucalcin (for example, the above-mentioned antibodies and aptamers, as well as receptors, enzymes, peptides, etc.), or RIA (radioimmunoassay) using the above microarray , ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), ECLIA (electrochemiluminescence immunoassay), Western blotting and other immunochemical techniques.
生体試料中の成分の測定値からの、歯周病の発症の判定、および、歯槽骨吸収の発症の判定に当たっては、参照値との比較を行ってもよい。参照値としては、例えば、健常者（本発明の判定方法以外の手段で健常者であることが予め確認されていることが好ましい）から採取された生体試料中の成分の測定値、歯周病患者および／または歯槽骨吸収患者（本発明の判定方法以外の手段で歯周病患者または歯槽骨吸収患者であることが予め確認されていることが好ましい）から採取された生体試料中の成分の測定値が挙げられるが、このうち、前者が好ましい。 In determining the onset of periodontal disease and the determination of the onset of alveolar bone resorption from the measured values of the components in the biological sample, comparison with a reference value may be performed. Examples of the reference value include measured values of components in a biological sample collected from a healthy person (preferably confirmed to be healthy by means other than the determination method of the present invention in advance), periodontal disease, and the like. Of a component in a biological sample collected from a patient and / or an alveolar bone resorption patient (preferably confirmed to be a periodontal disease patient or alveolar bone resorption patient in advance by means other than the determination method of the present invention) Among the measured values, the former is preferable.
セルグリシンの量は、歯周病を発症している場合には発症していない場合と比較して低下する。したがって、健常者の値を参照値として歯周病の発症を判定する場合、被験者から採取された生体試料中の当該量が、健常者から採取された生体試料中の当該量と比べて低い場合に歯周病を発症していると判定される。参照値が歯周病患者の値である場合、被験者から採取された生体試料中の当該量が、歯周病患者から採取された生体試料中の当該量と比べて同一または低い場合に歯周病を発症していると判定される。 The amount of serglycine decreases when periodontal disease has developed compared to when it does not. Therefore, when determining the onset of periodontal disease using the value of a healthy person as a reference value, the amount in the biological sample collected from the subject is lower than the amount in the biological sample collected from the healthy person It is determined that periodontal disease has developed. When the reference value is a value of a periodontal disease patient, the periodontal period when the amount in the biological sample collected from the subject is the same or lower than the amount in the biological sample collected from the periodontal disease patient. It is determined that the disease has developed.
レギュカルシンの量は歯周病を発症している場合には発症していない場合と比較して上昇する。したがって、健常者の値を参照値として歯周病の発症を判定する場合、被験者から採取された生体試料中の当該量が、健常者から採取された生体試料中の当該量と比べて高い場合に歯周病を発症していると判定される。参照値が歯周病患者の値である場合、被験者から採取された生体試料中の当該量が、歯周病患者から採取された生体試料中の当該量と比べて同一または高い場合に歯周病を発症していると判定される。 The amount of regucalcin increases when periodontal disease develops compared to when it does not. Therefore, when determining the onset of periodontal disease using the value of a healthy person as a reference value, the amount in the biological sample collected from the subject is higher than the amount in the biological sample collected from the healthy person It is determined that periodontal disease has developed. When the reference value is a value of a periodontal disease patient, the periodontal period when the amount in the biological sample collected from the subject is the same or higher than the amount in the biological sample collected from the periodontal disease patient. It is determined that the disease has developed.
セルグリシンの量は、歯槽骨吸収を発症している場合には発症していない場合と比較して低下する。歯槽骨吸収に関しては、参照値が健常者の値である場合を例に取ると、被験者から採取された血液中の当該量が、健常者から採取された血液中の当該量と比べて低い場合に歯槽骨吸収を発症していると判定される。参照値が歯槽骨吸収患者の値である場合を例に取ると、被験者から採取された血液中の当該量が、歯槽骨吸収患者から採取された血液中の当該量と比べて同一または低い場合に歯槽骨吸収を発症していると判定される。 The amount of serglycine decreases when alveolar bone resorption occurs compared to when it does not. Regarding alveolar bone resorption, when the reference value is the value of a healthy subject, for example, the amount of blood collected from the subject is lower than the amount of blood collected from the healthy subject Is determined to have developed alveolar bone resorption. For example, when the reference value is the value of an alveolar bone resorption patient, the amount in the blood collected from the subject is the same or lower than the amount in the blood collected from the alveolar bone resorption patient Is determined to have developed alveolar bone resorption.
レギュカルシンの量は、歯槽骨吸収を発症している場合には発症していない場合と比較して上昇する。歯槽骨吸収に関しては、参照値が健常者の値である場合を例に取ると、被験者から採取された血液中の当該量が、健常者から採取された血液中の当該量と比べて高い場合に歯槽骨吸収を発症していると判定される。参照値が歯槽骨吸収患者の値である場合を例に取ると、被験者から採取された血液中の当該量が、歯槽骨吸収患者から採取された血液中の当該量と比べて同一または高い場合に歯槽骨吸収を発症していると判定される。 The amount of regucalcin increases when alveolar bone resorption occurs compared to when it does not. Regarding alveolar bone resorption, if the reference value is the value of a healthy person, for example, the amount of blood collected from the subject is higher than the amount of blood collected from the healthy person Is determined to have developed alveolar bone resorption. For example, if the reference value is the value of an alveolar bone resorption patient, the amount in the blood collected from the subject is the same or higher than the amount in the blood collected from the alveolar bone resorption patient Is determined to have developed alveolar bone resorption.
生体試料中の各成分の測定値からの、歯周病の進行度の判定、および、歯槽骨吸収の進行度の判定に当たっては、参照値との比較を行ってもよい。参照値としては、例えば、歯周病の進行度合いまたは歯槽骨吸収の進行度合いが予め判明している者（該進行度合いが本発明の判定方法以外の手段で予め確認されていることが好ましい）から採取された血液中の成分の測定値が挙げられる。 In determining the progress of periodontal disease and the progress of alveolar bone resorption from the measured values of each component in the biological sample, comparison with a reference value may be performed. As the reference value, for example, a person whose progress degree of periodontal disease or alveolar bone resorption is known in advance (the progress degree is preferably confirmed in advance by means other than the determination method of the present invention). Measurement values of components in blood collected from
セルグリシンの量は、歯周病の進行度に反比例する。したがって、被験者から採取された血液中の当該量が、歯周病の進行度が予め判明している者から採取された血液中の当該量と比べて低い場合にはその者よりも歯周病を発症していると判定される。被験者から採取された血液中の当該量が、歯周病の進行度が予め判明している者から採取された血液中の当該量と比べて高い場合にはその者よりも歯周病が進行していないと判定される。 The amount of serglycine is inversely proportional to the progression of periodontal disease. Therefore, if the amount in the blood collected from the subject is lower than the amount in the blood collected from a person whose progression of periodontal disease is known in advance, the periodontal disease is higher than that person. Is determined to have developed. If the amount in the blood collected from the subject is higher than the amount in the blood collected from a person whose progression of periodontal disease is known in advance, the periodontal disease progresses more than that person It is determined that it is not.
レギュカルシンの量は、歯周病の進行度に比例する。したがって、被験者から採取された血液中の当該量が、歯周病の進行度が予め判明している者から採取された血液中の当該量と比べて高い場合にはその者よりも歯周病を発症していると判定される。被験者から採取された血液中の当該量が、歯周病の進行度が予め判明している者から採取された血液中の当該量と比べて低い場合にはその者よりも歯周病が進行していないと判定される。 The amount of regucalcin is proportional to the progression of periodontal disease. Therefore, if the amount in the blood collected from the subject is higher than the amount in the blood collected from a person whose progression of periodontal disease is known in advance, the periodontal disease is higher than that person. Is determined to have developed. If the amount in the blood collected from the subject is lower than the amount in the blood collected from a person whose progression of periodontal disease is known in advance, periodontal disease progresses more than that person It is determined that it is not.
セルグリシンの量は、歯槽骨吸収の進行度に反比例する。したがって、被験者から採取された血液中の当該量が、歯槽骨吸収の進行度が予め判明している者から採取された血液中の当該量と比べて低い場合にはその者よりも歯槽骨吸収がより進行していると判定される。被験者から採取された血液中の当該量が、歯周病の進行度が予め判明している者から採取された血液中の当該量と比べて高い場合にはその者よりも歯周病が進行していないと判定される。 The amount of serglycine is inversely proportional to the progress of alveolar bone resorption. Therefore, if the amount in the blood collected from the subject is lower than the amount in the blood collected from a person whose progress of alveolar bone resorption is known in advance, the alveolar bone resorption is higher than that person. Is determined to be more advanced. If the amount in the blood collected from the subject is higher than the amount in the blood collected from a person whose progression of periodontal disease is known in advance, the periodontal disease progresses more than that person It is determined that it is not.
レギュカルシンの量は、歯槽骨吸収の進行度に比例する。したがって、被験者から採取された血液中の当該量が、歯槽骨吸収の進行度が予め判明している者から採取された血液中の当該量と比べて高い場合にはその者よりも歯槽骨吸収がより進行していると判定される。被験者から採取された血液中の当該量が、歯周病の進行度が予め判明している者から採取された血液中の当該量と比べて低い場合にはその者よりも歯周病が進行していないと判定される。 The amount of regucalcin is proportional to the progress of alveolar bone resorption. Therefore, if the amount in the blood collected from the subject is higher than the amount in the blood collected from a person whose alveolar bone resorption progress is known in advance, the alveolar bone resorption is higher than that person. Is determined to be more advanced. If the amount in the blood collected from the subject is lower than the amount in the blood collected from a person whose progression of periodontal disease is known in advance, periodontal disease progresses more than that person It is determined that it is not.
上記の参照値を利用する判定方法のほか、２名以上の被験者から採取された血液中のセルグリシンの量を比較して、歯周病発症および／または進行度の判定、あるいは、歯槽骨吸収発症および／または進行度の判定を行ってもよい。例えば、ある被験者Ａから採取された血液中のセルグリシンの量が、他の被験者Ｂから採取された血液中の当該量よりも少ない場合には、被験者Ａの歯周病および／または歯槽骨吸収が被験者Ｂのそれよりも進んでいると判定される。 In addition to the above-described determination method using the reference value, the amount of serglycine in blood collected from two or more subjects is compared to determine the onset and / or progression of periodontal disease, or alveolar bone resorption Onset and / or progress may be determined. For example, when the amount of serglycine in blood collected from a subject A is smaller than that in blood collected from another subject B, periodontal disease and / or alveolar bone resorption of subject A Is determined to be ahead of that of subject B.
また、例えば、ある被験者Ｃから採取された血液中のレギュカルシンの量が、他の被験者Ｄから採取された血液中の当該量よりも多い場合には、被験者Ｃの歯周病および／または歯槽骨吸収が被験者Ｄのそれよりも進んでいると判定される。 Further, for example, when the amount of regucalcin in blood collected from a subject C is greater than the amount in blood collected from another subject D, periodontal disease and / or alveolar bone of the subject C It is determined that the absorption is ahead of that of subject D.
本発明は、歯周病の発症および／または進行度の判定、および、歯槽骨吸収の発症および／または進行度の判定を、生体試料から簡便に判定できるので、医師の診断前の予備的な検査として有用である。 In the present invention, the determination of the onset and / or progress of periodontal disease and the determination of the onset and / or progress of alveolar bone resorption can be easily determined from a biological sample. Useful as a test.
歯周病患者および／または歯槽骨吸収患者である被験者に治療を行い、治療が効果を奏した場合、生体試料中のセルグリシンの量は増加し、生体試料中のレギュカルシンの量は減少する。よって、治療と共に生体試料血液中の各成分のいずれか或いは両方の量を測定することにより、治療効果の評価判定を行うこともできる。従って、本発明の判定方法は、歯周病および／または歯槽骨吸収の薬剤の投与効果などの治療効果を判定する方法としても有用である。 When a subject who is a periodontal disease patient and / or an alveolar bone resorption patient is treated and the treatment is effective, the amount of serglycine in the biological sample increases and the amount of regucalcin in the biological sample decreases. Therefore, the therapeutic effect can be evaluated and determined by measuring the amount of either or both of the components in the blood of the biological sample together with the treatment. Therefore, the determination method of the present invention is also useful as a method for determining a therapeutic effect such as a periodontal disease and / or an alveolar bone resorption drug administration effect.
実施例１ 歯周病モデルマウスの作製および歯槽骨吸収の評価
Ｃ５７ＢＬ／６ＪＪｃｌマウス（オス、８週齢、日本クレアから購入）を予備飼育した後、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ菌由来ＬＰＳを歯肉に２日間隔で５回注射した歯周病モデルマウスと、ＬＰＳの代わりに水を注射した健常マウスを作製し、２週間飼育した。飼育後、頭部のＣＴ写真を撮影し、骨吸収量をＣＥＪと第一臼歯歯槽骨上端との距離からボクセル値で算出した（参考文献：歯周病モデルマウスの作製、歯周病学会誌 ３６（３）ｐ．５１９〜５３０）。
Example 1 Production of Periodontal Disease Model Mice and Evaluation of Alveolar Bone Resorption C57BL / 6JJcl mice (male, 8 weeks old, purchased from CLEA Japan) were preliminarily raised, and then Porphyromonas gingivalis bacteria LPS was applied to the gingiva at 2-day intervals. Periodontal disease model mice injected 5 times and healthy mice injected with water instead of LPS were prepared and reared for 2 weeks. After breeding, a CT photograph of the head was taken, and bone resorption was calculated as a voxel value from the distance between CEJ and the upper edge of the first molar alveolar bone (Reference: Production of periodontal disease model mice, Journal of Periodontology) 36 (3) p.519-530).
なお、ボクセル値は歯槽骨の吸収量に比例している。 The voxel value is proportional to the amount of alveolar bone absorbed.
表１から明らかな通り、歯周病モデルマウスでは歯周病特徴的である歯槽骨吸収が認められた。 As is clear from Table 1, periodontal disease model mice showed alveolar bone resorption characteristic of periodontal disease.
実施例２ 血液中セルグリシン量の定量
歯肉にＬＰＳを注射した歯周病モデルマウスと健常マウスから血液を採取、血清中の主要タンパクをアフィニティーカラムで除去した後、１マイクログラムのタンパクをＬＣ−ＭＳ／ＭＳに供し、プロテオーム解析を実施した。解析ソフトＰｒｏｇｅｎｅｓｉｓを用いて定量データを取得し、タンパクデータベースＩＰＩにデータを照会し、各定量値を示すタンパクを同定した。得られた網羅的タンパク定量データからセルグリシンの定量値（ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ ａｂｕｎｄａｎｃｅ）を２群間で比較した。
Example 2 Quantification of Serglycin Level in Blood Blood was collected from periodontal disease model mice and healthy mice in which LPS was injected into the gingiva, and after removing major proteins in serum with an affinity column, 1 microgram of protein was converted to LC- Proteomic analysis was performed using MS / MS. Quantitative data was acquired using the analysis software Progenesis, the data was inquired to the protein database IPI, and proteins showing each quantitative value were identified. From the obtained comprehensive protein quantitative data, the quantitative value of serglycine was compared between the two groups.
表２に示すように、歯周病モデルマウスの血清ではセルグリシン量が健常マウスと比較して約５５％に低下していた。 As shown in Table 2, in the serum of periodontal disease model mice, the amount of serglycine was reduced to about 55% as compared with healthy mice.
実施例３ 血液中レギュカルシン量の定量
歯肉にＬＰＳを注射した歯周病モデルマウスと健常マウスから血液を採取、血清中の主要タンパクをアフィニティーカラムで除去した後、１マイクログラムのタンパクをＬＣ−ＭＳ／ＭＳに供し、プロテオーム解析を実施した。解析ソフトＰｒｏｇｅｎｅｓｉｓを用いて定量データを取得し、タンパクデータベースＩＰＩにデータを照会し、各定量値を示すタンパクを同定した。得られた網羅的タンパク定量データからレギュカルシンの定量値（ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ ａｂｕｎｄａｎｃｅ）を２群間で比較した。
Example 3 Quantitative determination of regucalcin in blood Blood was collected from periodontal disease model mice and healthy mice injected with LPS into the gingiva, and major proteins in the serum were removed with an affinity column, and then 1 microgram of protein was converted into LC-MS. / MS for proteome analysis. Quantitative data was acquired using the analysis software Progenesis, the data was inquired to the protein database IPI, and proteins showing each quantitative value were identified. From the obtained comprehensive protein quantification data, the quantified value of regucalcin (normalized abundance) was compared between the two groups.
表３に示すように、歯周病モデルマウスの血清では、レギュカルシン量が健常マウスと比較して約３倍に増加していた。 As shown in Table 3, in the serum of periodontal disease model mice, the amount of regucalcin was increased about 3 times compared with that of healthy mice.
以上の実施例１〜３の結果から明らかな通り、ＬＰＳ投与による歯周病の発症によって、（１）歯周病の代表的な症状である歯槽骨吸収が認められ、かつ、（２）歯周病も出るマウスの血液中のセルグリシン量は健常マウスのそれと比較して低下し、（３）血液中のレギュカルシン量は健常マウスのそれと比較して増加していた。 As is clear from the results of Examples 1 to 3 above, (1) Alveolar bone resorption, which is a typical symptom of periodontal disease, is observed due to the onset of periodontal disease by LPS administration, and The amount of serglycine in the blood of mice with perinatal disease decreased compared to that of healthy mice, and (3) the amount of regucalcin in blood increased compared to that of healthy mice.
これらの結果は、生体試料中のセルグリシンおよび／またはレギュカルシンの量により、歯周病の発症および／または進行度の判定、並びに、歯槽骨吸収の発症および／または進行度の判定が可能であることを示している。 These results indicate that the amount of serglycine and / or regucalcin in a biological sample can be used to determine the onset and / or progression of periodontal disease and the onset and / or progression of alveolar bone resorption. It is shown that.
なお、歯周病菌Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓのＬＰＳによる、サイトカイン産生、Ｔ細胞の分化などの免疫反応は、マウスおよびヒトで共通であると報告されている（Ａｓｉａｎ Ｐａｃｉｆｉｃ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｌｌｅｒｇｙ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２００６、（２４）ｐ．２２３〜２２８）。また、歯周病における歯槽骨吸収が、免疫反応により引き起こされることは、ヒト（医学のあゆみｖｏｌ．２３２，Ｎｏ．３，２０１０）と、今回実施例で用いたマウス歯周病モデルにおいて共通である（歯周病学会誌 ３６（３）ｐ．５１９〜５３０）ことが報告されている。したがって、上記実施例においてマウス歯周病モデルで得られた歯槽骨吸収に関する知見は、ヒトの場合でも同様であると推測される。 It has been reported that immune responses such as cytokine production and T cell differentiation by LPS of periodontal disease bacteria Porphyromonas gingivalis are common in mice and humans (Asian Pacific Journal of Allergy and Immunity 2006, (24) p). .223-228). In addition, the fact that alveolar bone resorption in periodontal disease is caused by an immune reaction is common to humans (Ayumi of Medicine vol. 232, No. 3, 2010) and the mouse periodontal disease model used in this example. It is reported that there is (Journal of Periodontology 36 (3) p.519-530). Therefore, it is estimated that the knowledge regarding alveolar bone resorption obtained in the mouse periodontal disease model in the above example is the same even in the case of humans.
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