JP2007178356A - Evaluation method of bone quality, evaluation kit for bone quality, screening method of bone quality deterioration preventing or improving agent, and kit for screening bone quality deterioration preventing or improving agent - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、骨密度とは別個に骨強度を測定することのできる、骨質を評価する方法，骨質の評価キット，及びこれを利用した骨質劣化予防又は改善剤のスクリーニング方法，及び骨質劣化予防又は改善剤のスクリーニング用キットに関するものである。 The present invention relates to a method for evaluating bone quality, a bone quality evaluation kit, and a screening method for a bone quality deterioration preventive or ameliorating agent using the same, and a bone quality deterioration prevention or improvement method capable of measuring bone strength separately from bone density. The present invention relates to a screening kit for an improving agent.
骨折・寝たきりは、大きな社会問題である。骨折の原因として、骨の脆弱性、すなわち骨粗鬆症が重要である。骨の強度は、骨の量と質によって規定される。現在、骨粗鬆症の診断、治療の必要性の判断、治療効果の評価は、骨密度の測定，あるいはこれに代用される骨の量の推定に頼っている。 Fractures and bedridden are big social problems. As a cause of fracture, bone vulnerability, that is, osteoporosis is important. Bone strength is defined by the quantity and quality of bone. At present, diagnosis of osteoporosis, judgment of the necessity of treatment, and evaluation of treatment effect depend on measurement of bone density or estimation of the amount of bone substituted for this.
しかしながら、骨密度が骨粗鬆症域にまで低下していなくても骨折を起こす等の現象が明らかにされつつあり、骨密度による評価には限界があることが分かってきた。そこで、骨密度以外の指標を用いて、より正確に骨質を評価する方法の確立が求められており、わが国でも2004年ガイドラインが策定されたところである。 However, even if the bone density is not lowered to the osteoporosis region, phenomena such as fractures are being clarified, and it has been found that there is a limit to the evaluation based on the bone density. Therefore, establishment of a method for more accurately evaluating bone quality using indicators other than bone density is required, and the 2004 guidelines have been formulated in Japan.
一方、エストロゲン欠乏やステロイドの投与による骨細胞の減少が知られており、とくにステロイドによる骨粗鬆症は、1000万人以上と言われる骨粗鬆症患者の２０％を占め、200万人に相当する。少量のステロイドでも、また数ヶ月の短期間の服用で骨折が発生し、服用患者は例外なく必ず骨粗鬆症になることが知られている。 On the other hand, it is known that bone cells are decreased due to estrogen deficiency or steroid administration. In particular, steroid-induced osteoporosis accounts for 20% of osteoporosis patients said to be 10 million or more, corresponding to 2 million. It is known that even with a small amount of steroids, bone fractures occur after taking for a short period of several months, and patients taking it are sure to have osteoporosis without exception.
しかしながら、骨細胞の数そのものが、骨質に影響していることは報告されていなかった。 However, it has not been reported that the number of bone cells itself affects bone quality.
以前に本発明者等は、”誘導的に骨細胞を欠失させることのできるトランスジェニック動物”を開発した（下記特許文献１参照）。このマウスは、ジフテリア毒素の受容体が骨細胞にのみ発現しており、毒素を投与することによって、任意の時期に骨細胞のみを欠失させることができるようにデザインされている。
Previously, the present inventors have developed a “transgenic animal capable of inductively deleting bone cells” (see
今回新たに、このマウスにおいて骨細胞をablateすると、皮質骨内の多孔性が高まり、微少骨破壊（microcrack）が生じて、骨の強度が低下することが明らかになった。
すなわち、骨細胞の存在が、骨質の維持にきわめて重要であり、骨質のより正確な評価指標となり得るとのはじめての証拠を得た。
It has now been clarified that ablation of bone cells in this mouse increases the porosity in the cortical bone, resulting in microcracking and reduced bone strength.
That is, we obtained the first evidence that the presence of bone cells is extremely important for maintaining bone quality and can be a more accurate evaluation index of bone quality.
現在、骨の質を規定する因子は不明であり、またそれを臨床的に評価する方法もない。現時点では、骨の質の評価に関しては、Ｘ線やMRIを用いた画像解析が主で、大部分は摘出骨を用いた侵襲的・破壊的検査が研究目的で行われているのが現状であり、非侵襲的・非破壊的に血液や尿サンプルを用いて骨の質を評価する方法はまったく存在しない（非特許文献１，２参照）。
Currently, the factors that define bone quality are unknown and there is no way to evaluate it clinically. At present, regarding bone quality evaluation, image analysis using X-rays or MRI is mainly used, and invasive / destructive examinations using excised bones are mostly conducted for research purposes. There is no method for evaluating bone quality using blood or urine samples non-invasively and non-destructively (see Non-Patent
ところで、骨細胞産生蛋白質としては、後述する(a)FGF-23，(b)MEPE，(c)DMP1等が知られている。このうち、FGF-23は、腎に作用して、尿細管からのリンの再吸収抑制、ビタミンDの活性化を抑制して骨軟化症を起こす原因遺伝子として知られている。 By the way, as bone cell-producing proteins, (a) FGF-23, (b) MEPE, (c) DMP1, and the like described later are known. Among them, FGF-23 is known as a causative gene that acts on the kidney to suppress reabsorption of phosphorus from tubules and suppress activation of vitamin D to cause osteomalacia.
このFGF23は、くる病や骨軟化症の患者のリン低下によって引き起こされる疾病患者の血清中において、健常人の数百〜数千倍量検出されることから、これら疾病のマーカーとして、用いられている。 This FGF23 is used as a marker for these diseases because it is detected in the serum of patients with diseases caused by low phosphorus in patients with rickets and osteomalacia. Yes.
しかしながら、本願発明者が目的とするような、リンが正常な値であるにも拘わらず骨質に変調を来しているような症状において、FGF-23と骨質の関係を示唆するものは無かった。 However, there was no suggestion of the relationship between FGF-23 and bone quality in the symptom in which the bone quality is modulated despite the normal value of phosphorus, as intended by the present inventor. .
また、(b)MEPE，(c)DMP1等についても、同様に骨質との関係を示唆するものは知られていない。 Similarly, (b) MEPE, (c) DMP1, etc. are not known to suggest a relationship with bone quality.
本発明者等は、上記マウスにジフテリア毒素を投与して骨細胞を破壊すると、骨細胞産生物質である蛋白質のｍRNA量や、蛋白質そのものの量が減少すること、すなわち、骨細胞産生物質量が、骨細胞の数と密接に関連していることをも、初めて見出した。 When the present inventors administer diphtheria toxin to the mouse and destroy bone cells, the amount of mRNA of the protein that is a bone cell-producing substance and the amount of the protein itself are reduced, that is, the amount of the bone cell-producing substance is reduced. It was also found for the first time that it was closely related to the number of bone cells.
発明者は、上記問題に鑑み、鋭意研究の結果、骨細胞が、骨質を規定する要因であり、骨強度と密接に関連すること，及び、骨細胞が産生する蛋白質やその遺伝子等の量が、骨細胞の量，つまりは骨質を正確に反映していることを初めて見出し、本発明に到達したものであって、その目的とするところは、骨質の正確な評価を行うことのできる評価キット，評価方法，更にはこの評価方法を用いて、骨質の劣化予防又は改善剤をスクリーニングする方法，及びそのスクリーニング用キットを提供することにある。 As a result of diligent research, the inventor has found that bone cells are a factor that defines bone quality and is closely related to bone strength, and that the amount of proteins, genes, and the like produced by bone cells is The present invention has been found for the first time to accurately reflect the amount of bone cells, that is, the bone quality, and the object of the present invention is to provide an evaluation kit that can accurately evaluate the bone quality. The present invention provides an evaluation method, a method for screening an agent for preventing or improving bone quality deterioration using the evaluation method, and a kit for screening the same.
上述の目的は、下記の発明によって達成される。 The above object is achieved by the following invention.
（第一の発明）
骨細胞，骨細胞産生物質の少なくともいずれかを指標として、骨質を評価する方法である。
(First invention)
This is a method for evaluating bone quality using at least one of bone cells and bone cell-producing substances as an index.
（第二の発明）
骨細胞産生蛋白質又はその遺伝子の少なくともいずれかを指標として、骨質を評価する方法である。
(Second invention)
This is a method for evaluating bone quality using at least one of a bone cell-producing protein and its gene as an index.
（第三の発明）
血清中の骨細胞産生蛋白質又はその遺伝子を指標とする、第一又は第二の発明の評価方法である。
(Third invention)
It is the evaluation method of the first or second invention using the bone cell-producing protein in serum or its gene as an index.
（第四の発明）
骨細胞産生蛋白質が、FGF-23，MEPE，DMP1のいずれかであることを特徴とする第一乃至第三の発明のいずれかの評価方法である。
(Fourth invention)
The evaluation method according to any one of the first to third inventions, wherein the bone cell-producing protein is any one of FGF-23, MEPE, and DMP1.
（第五の発明）
骨細胞又は骨細胞産生物質に対する抗体，或いは骨細胞産生物質の遺伝子に対する遺伝子プローブを含むことを特徴とする、骨質の評価キットである。
(Fifth invention)
A bone quality evaluation kit comprising an antibody against a bone cell or a bone cell-producing substance, or a gene probe for a gene of the bone cell-producing substance.
（第六の発明）
骨細胞産生物質が、FGF-23，MEPE，DMP1のいずれかであることを特徴とする第五の発明のキットである。
(Sixth invention)
The bone cell-producing substance is any one of FGF-23, MEPE, and DMP1.
（第七の発明）
下記(1)〜(4)のいずれかの非ヒト動物を用い、骨細胞及び／又は骨細胞産生物質を指標とすることを特徴とする、骨質劣化予防又は改善剤のスクリーニング方法である。
(1)グルココルチコイドを投与し、ヒトのステロイド骨粗鬆症のような症状を呈するモデル動物
(2)加齢したモデル動物
(3)卵巣摘除などによってエストロゲン欠乏にしたモデル動物
(4)尾部懸垂や微小重力下においた骨粗鬆症モデル動物
(Seventh invention)
A screening method for an agent for preventing or improving bone quality, characterized by using a non-human animal according to any one of (1) to (4) below and using bone cells and / or bone cell-producing substances as indices.
(1) A model animal that is administered glucocorticoid and exhibits symptoms like human steroid osteoporosis
(2) Aged animal model
(3) Estrogen-deficient model animals such as ovariectomy
(4) Osteoporosis model animal under tail suspension or microgravity
（第八の発明）
骨細胞，骨細胞産生物質の少なくともいずれかを指標とする、骨質劣化予防又は改善剤のスクリーニング方法である。
(Eighth invention)
This is a screening method for an agent for preventing or improving bone quality, using at least one of bone cells and bone cell-producing substances as an index.
（第九の発明）
骨細胞又は骨細胞産生物質に対する抗体，或いは骨細胞産生物質の遺伝子に対するプローブを含むことを特徴とする、骨質劣化予防又は改善剤のスクリーニング用キットである。
(Ninth Invention)
A kit for screening an agent for preventing or improving bone quality deterioration, comprising an antibody against bone cells or a bone cell-producing substance, or a probe for a gene of a bone cell-producing substance.
（第十の発明）
骨細胞産生物質が、FGF-23，MEPE，DMP1のいずれかであることを特徴とする第九の発明のキットである。
(Tenth invention)
The kit according to the ninth aspect, wherein the bone cell-producing substance is any one of FGF-23, MEPE, and DMP1.
本発明の骨質評価方法又は骨質評価キットを用いることによって、骨質の正確な評価が可能となる。特に、血清中の骨細胞産生物質量を指標とする評価方法の場合には、骨組織の摘出が不要な非破壊的な検査であることから、患者負担が少ないという利点を有している。
また、本発明のスクリーニング方法又はスクリーニング用キットを用いて、骨質劣化予防又は改善剤のスクリーニングを行うことができる。
By using the bone quality evaluation method or the bone quality evaluation kit of the present invention, it is possible to accurately evaluate bone quality. In particular, in the case of an evaluation method using the amount of bone cell-producing substance in serum as an index, it is a non-destructive test that does not require extraction of bone tissue, and thus has an advantage that the burden on the patient is small.
Further, the screening method or screening kit of the present invention can be used to screen for an agent for preventing or improving bone quality deterioration.
しかも、本発明の骨質評価は、血清リン濃度が正常範囲内であっても起こっている骨の変化を、その評価対象としている。
このため、骨軟化症やくる病等の低リン血症に起因する特異な骨疾患に罹患していない、極めて健常人に近い人の、骨の劣化のみを、純粋に予測・診断することができる。つまり、低リン血症の特定の患者のみならず、例えば、老人や閉経後の女性等の、骨の劣化すなわち骨粗鬆症が心配され、骨折のリスクが予想される対象者についても、正確に骨の質、ひいては骨折のリスクを予測・診断できることを意味しており、その意義は極めて大きい。
In addition, the bone quality evaluation of the present invention is targeted for evaluation of bone changes that occur even when the serum phosphorus concentration is within the normal range.
For this reason, it is possible to purely predict and diagnose only the bone deterioration of a person who is not suffering from a specific bone disease caused by hypophosphatemia such as osteomalacia or rickets and is very close to a healthy person it can. This means that not only certain patients with hypophosphatemia, but also subjects who are concerned about bone deterioration, i.e. This means that the quality and, in turn, the risk of fracture can be predicted and diagnosed, and its significance is extremely large.
以下、本発明を詳細に説明する。 Hereinafter, the present invention will be described in detail.
〈本発明の骨質の評価方法〉
本発明において用いられる骨細胞（osteocyte）とは、骨芽細胞が終末分化した細胞である。骨細胞は、休止期にあって増殖せず、硬組織に埋没している。そのため、理論上は、細胞突起などの形態学的な特徴に基づいて、骨細胞を単離することができるものの、実際の単離は極めて困難である。また、一般にin vitroでの遺伝子の発現パターンはin vivoとは異なるため、骨細胞の単離が可能であったとしても、in vivoにおける骨細胞の生物学的特性を分析することは困難であった。そのため従来は、特異的な遺伝子産物も知られておらず、in vivoでの機能も解明されていない。本発明者等の作製した、生体内で骨細胞のみを除去できるマウス（上記特許文献１等参照）を用いた本発明によって、骨細胞と骨質の間に、密接な関係があること，及び、従来知られていたある種の蛋白質（FGF-23等）が、骨細胞が特異的に産生していたこと、骨細胞の欠乏によってその血清濃度が低下することが、今回初めて明らかとなった。
<Method for evaluating bone quality of the present invention>
Osteocytes used in the present invention are cells obtained by terminal differentiation of osteoblasts. Bone cells are resting and do not proliferate and are buried in hard tissue. Therefore, theoretically, although bone cells can be isolated based on morphological features such as cell processes, actual isolation is extremely difficult. In general, gene expression patterns in vitro differ from those in vivo, so even if bone cells can be isolated, it is difficult to analyze the biological characteristics of bone cells in vivo. It was. Therefore, conventionally, a specific gene product is not known, and the function in vivo has not been elucidated. According to the present invention using a mouse (see
本発明において用いられる骨細胞産生物質とは、骨細胞産生蛋白質の他、骨細胞が産生又は放出する蛋白質等であるが、骨細胞が特異的に産生するものが好ましい。 The bone cell-producing substance used in the present invention is a protein produced or released by a bone cell in addition to a bone cell-producing protein, but a material specifically produced by a bone cell is preferable.
骨細胞が特異的に産生する骨細胞産生蛋白質としては、後述する(a)FGF-23，(b)MEPE，(c)DMP1，等が挙げられる。 Examples of bone cell-producing proteins that are specifically produced by bone cells include (a) FGF-23, (b) MEPE, and (c) DMP1, which will be described later.
(a)FGF-23(Fibroblast Growth Factor 23)とは、FGFファミリーに属する分子量約30kDa，アミノ酸残基数251の公知の蛋白質である。尚、このFGF-23は、生体内ではN末端側の24残基がシグナルペプチドとして脱落した後、227アミノ酸から成る分泌蛋白質が活性体として存在することが知られており、また、活性は消失しているものの179残基と180残基の間をプロテアーゼによって切断された断片も生体内に存在することが知られている。 (a) FGF-23 (Fibroblast Growth Factor 23) is a known protein belonging to the FGF family and having a molecular weight of about 30 kDa and 251 amino acid residues. In addition, FGF-23 is known to have a secreted protein consisting of 227 amino acids as an active substance after 24 residues on the N-terminal side have dropped out as a signal peptide in vivo, and the activity disappears. However, it is also known that a fragment cleaved between 179 and 180 residues by a protease exists in the living body.
FGF-23は、心臓および肝臓で産生され、hypマウス（XLH（X-linked hypophosphatemic rickets）症候群モデルマウス）などのリン代謝異常を示す変異マウスの解析から、リン代謝を調節する新規のホルモン様分子であることがわかっている。この蛋白質は、骨組織においても発現が確認されているが、従来、産生細胞は特定されていなかった。本発明者等の作製した、生体内で骨細胞のみを除去できるマウス（上記特許文献１等参照）を用いた本発明によって、骨細胞がFGF-23の主要な産生細胞であり、かつ骨細胞の存在が血清中のFGF-23濃度に大きく寄与することが今回はじめて証明された。つまりFGF-23も、骨細胞の数と同様、骨質の評価に使用できると考えられる。
FGF-23 is a novel hormone-like molecule that regulates phosphorus metabolism by analyzing mutant mice that show abnormalities in phosphorus metabolism such as hyp mice (model mice with XL-linked hypophosphatemic rickets), which are produced in the heart and liver. I know that. Although the expression of this protein has been confirmed in bone tissue, the production cell has not been identified conventionally. According to the present invention using a mouse prepared by the present inventors and capable of removing only bone cells in vivo (see
本発明の骨質評価においてFGF-23を指標とする際には、上述のN末端が脱落した活性型が望ましい。本発明の評価では、骨細胞の存在が推定できれば、良いが、活性を有するFGF-23であることが好ましい。尚、mRNAを指標として検出する際には、成熟前のmRNA，及びスプライシングを受けた後の成熟mRNAのいずれも指標として用いることができる。 In the bone quality evaluation of the present invention, when FGF-23 is used as an index, the above-mentioned active form in which the N-terminal is removed is desirable. In the evaluation of the present invention, it is sufficient if the presence of bone cells can be estimated, but FGF-23 having activity is preferable. When mRNA is detected as an index, both mRNA before maturation and mature mRNA after splicing can be used as an index.
(b)MEPE(Matrix extracellular phosphoglycoprotein）とは、公知の細胞外基質リン酸化糖タンパク質で、OF45とも呼ばれる。XLHと同じく、低リン血症と骨軟化症をきたす腫瘍性骨軟化症（TIO: tumor-induced osteomalacia）患者の腫瘍から同定されたものであり、SIBLING（インテグリン結合性の糖タンパク質）と呼ばれるファミリーの一員である。ヒトMEPEは、525アミノ酸、マウスは433アミノ酸から成る（The Journal of Clinical Investigation，September 2003，Volume 112，Number 5等参照）。
(b) MEPE (Matrix extracellular phosphoglycoprotein) is a known extracellular matrix phosphorylated glycoprotein, also called OF45. Similar to XLH, it was identified from a tumor of a tumor-induced osteomalacia (TIO) patient who causes hypophosphatemia and osteomalacia, and is called SIBLING (integrin-binding glycoprotein) Be part of. Human MEPE consists of 525 amino acids, and mice consists of 433 amino acids (see The Journal of Clinical Investigation, September 2003, Volume 112,
MEPEは、石灰化に関わることを示唆する実験結果が得られているが、その機能は明らかになっていない。また、MEPEは、骨（主に骨芽細胞）で産生されるという報告はあるが、骨細胞が産生するか、また、主な産生細胞が何であるか等については不明であった（Genomics 74:342-351, 2001）。
我々の骨細胞のないマウスでは、骨におけるMEPE mRNAの発現が低下し、骨細胞とMEPE産生には相関関係があること示していることから、MEPEは、主に骨細胞が産生しており、本発明の骨質評価に使用し得ることが分かった。
Experimental results suggesting that MEPE is involved in calcification have been obtained, but its function is not clear. In addition, although it has been reported that MEPE is produced in bone (mainly osteoblasts), it is unclear as to whether the bone cells are produced and what the main production cells are (Genomics 74 : 342-351, 2001).
In mice without our bone cells, MEPE mRNA is mainly produced by bone cells, as the expression of MEPE mRNA in bone is reduced, indicating that there is a correlation between bone cells and MEPE production. It turned out that it can be used for the bone quality evaluation of this invention.
(c)DMP1(dentin matrix protein 1)とは、もともと歯の象牙質のcDNA ライブラリーから同定された、分泌性の酸性リン酸化蛋白質である。その遺伝子はヒト染色体では4q21に位置し、その近傍に位置するオステオポンチンや、(b)のMEPEや、骨シアロタンパク質などの遺伝子とともに、遺伝子ファミリーを形成している。近年では、DMP1 の骨組織における発現がクローズアップされ、DMP1 のin situ hybridizationと免疫組織染色から、DMP1は骨芽細胞では産生されず、骨細胞で特異的に産生されることが明らかとなった（J Bone Miner Res 16:2017-26, 2001）。従って、DMP1は骨細胞の特異的マーカーと考えることができる。つまり、本発明において、骨細胞と同様、骨質の評価に使用できると考えられる。 (c) DMP1 (dentin matrix protein 1) is a secreted acidic phosphorylated protein originally identified from the dentin cDNA library. The gene is located at 4q21 in the human chromosome and forms a gene family together with genes such as osteopontin, MEPE in (b), and bone sialoprotein. In recent years, the expression of DMP1 in bone tissue has been highlighted, and in situ hybridization and immunohistochemical staining of DMP1 revealed that DMP1 is not produced in osteoblasts but specifically in bone cells. (J Bone Miner Res 16: 2017-26, 2001). Therefore, DMP1 can be considered as a specific marker for bone cells. That is, in the present invention, it is considered that it can be used for evaluation of bone quality like bone cells.
本発明の評価方法において評価する骨質とは、骨強度（曲げや圧迫、ねじれなどに対する強度等）を決定する要因で、微少亀裂（Microcrack）や骨梁構造の変化、骨の材質等を意味する。 Bone quality to be evaluated in the evaluation method of the present invention is a factor that determines bone strength (strength against bending, compression, torsion, etc.) and means microcrack, changes in trabecular structure, bone material, and the like. .
つまり、骨細胞や骨細胞産生物質を指標とし、例えばその量や発現部位を測定又は観察等することによって、骨の強度が予測・推定できるのである。 That is, the bone strength can be predicted and estimated by measuring or observing the amount and expression site of the bone cell or the bone cell-producing substance as an index.
本発明の骨質評価方法において、骨細胞や骨細胞産生物質の量を測定する為の方法としては、骨組織を取り出して用いる破壊的な方法と、骨組織から放出される物質を非破壊的に測定する方法が挙げられるが、非破壊的な方法が好ましい。非破壊的な方法は、患者負担が少ないからである。また、局所の骨の情報だけが得られる破壊検査と違って、血液や尿の生化学検査に代表される非破壊的な方法では、全身の骨の状態が反映されるので、全身性の骨代謝疾患である骨粗鬆症における骨質評価、骨強度の評価という見地からは望ましいからである。 In the bone quality evaluation method of the present invention, as a method for measuring the amount of bone cells and bone cell-producing substances, a destructive method in which bone tissue is extracted and used, and a substance released from bone tissue is nondestructively used. Although the method to measure is mentioned, A nondestructive method is preferable. This is because the non-destructive method has a low patient burden. Unlike destructive testing, which only provides information on local bone, non-destructive methods such as blood and urine biochemical tests reflect the state of the bones throughout the body. This is because it is desirable from the viewpoint of bone quality evaluation and bone strength evaluation in osteoporosis, which is a metabolic disease.
これらの破壊的・非破壊的な方法のいずれにおいても、骨細胞や骨細胞産生物質の検出は、生体抽出材料を用い、顕微鏡による観察方法の他、遺伝子発現やタンパク質の公知の解析方法等を、必要に応じて併用することによって実施する。 In any of these destructive and non-destructive methods, the detection of bone cells and bone cell-producing substances is performed using bio-extracted materials, in addition to microscopic observation methods, gene expression, known analysis methods for proteins, etc. It is carried out by using together as necessary.
破壊的な方法としては、たとえば、取り出した骨組織をパラフィン等で包埋し、ヘマトキシリン・エオシン(H＆E)染色（Hematoxylin and eosin stain）等した後、顕微鏡で観察することにより、骨細胞の有無が判定できる。骨細胞は、lacuna（ラクナ）と呼ばれる空洞中に存在するため、空になった空洞や異常な形態の骨細胞の数を計測することによっても、骨細胞の減少，ひいては骨質の劣化を推定することが可能である。 Destructive methods include, for example, embedding the extracted bone tissue with paraffin, etc., hematoxylin and eosin stain (Hematoxylin and eosin stain), etc. Can be judged. Since bone cells exist in a cavity called lacuna, the number of vacant cavities and abnormally shaped bone cells can be counted to estimate the decrease in bone cells and the deterioration of bone quality. It is possible.
また、取り出した骨組織から、常法に従い蛋白質や遺伝子（骨細胞産生蛋白質遺伝子のmRNA）を検出することによっても、骨細胞の有無，ひいては骨質の劣化を推定することが可能である。 Further, by detecting a protein or gene (mRNA of a bone cell-producing protein gene) from the extracted bone tissue according to a conventional method, it is possible to estimate the presence or absence of bone cells, and hence the deterioration of bone quality.
非破壊的な方法では、被験者から非破壊的に抽出した後述の検体を用い、蛋白質や遺伝子の測定に用いる。 In the non-destructive method, a sample to be described later extracted non-destructively from a subject is used to measure proteins and genes.
非破壊的に測定可能な検体としては、尿や血漿、血清、全血、脳脊髄液、精液等の体液等が挙げられるが、被験者からの抽出が容易である点や、局所の骨の情報だけが得られる破壊検査と違って、全身の骨の状態が反映され、全身性の骨代謝疾患である骨粗鬆症における骨質評価、骨強度の評価が可能であると言う点から、血清が好ましい。 Samples that can be measured nondestructively include body fluids such as urine, plasma, serum, whole blood, cerebrospinal fluid, semen, etc., but are easy to extract from the subject, and information on local bones Unlike the destructive examination that can only be obtained, serum is preferred because it reflects the state of bones throughout the body and enables evaluation of bone quality and bone strength in osteoporosis, a systemic bone metabolic disease.
蛋白質の測定方法としては、（１）ウェスタンブロット分析や（２）ELISA法等の酵素免疫測定法，（３）放射免疫測定法のほか、（４）蛋白質に結合している糖鎖を検出する方法等、蛋白質の検出・定量に用いられている一般的な方法を用いることができるが、測定精度の点では、ELISA法が好ましい。 Protein measurement methods include (1) Western blot analysis and (2) enzyme immunoassay methods such as ELISA, (3) radioimmunoassay, and (4) detecting sugar chains bound to proteins. Although general methods used for protein detection and quantification such as the method can be used, the ELISA method is preferable in terms of measurement accuracy.
ELISA法とはenzyme-linked immunosorbent assayの頭文字をとったもので、EIA法 ( Enzyme Immune Assay：酵素抗体法，酵素免疫測定法)とも言われるものである。 The ELISA method is an acronym for enzyme-linked immunosorbent assay, and is also called EIA method (Enzyme Immune Assay).
測定は、常法に従い、目的とする蛋白質（骨細胞の細胞膜上の受容体蛋白質や、FGF-23，MEPE，DMP-1等の骨細胞が産生・分泌する蛋白質）等に対する抗体や、当該目的蛋白質の遺伝子に対する、遺伝子プローブを用いて行うことができる。 The measurement is carried out according to conventional methods, such as antibodies against the target protein (receptor protein on the cell membrane of bone cells, and proteins produced and secreted by bone cells such as FGF-23, MEPE, DMP-1), etc. It can be performed using a gene probe for a protein gene.
骨細胞の細胞膜上の受容体蛋白質や、FGF-23，MEPE，DMP-1等の骨細胞が産生・分泌する蛋白質に特異的な抗体は、常法に従い、マウスやウサギ等にこれらの蛋白質を免疫する方法等により調製することができる。 Antibodies specific for receptor proteins on the cell membrane of bone cells and proteins produced and secreted by bone cells such as FGF-23, MEPE, and DMP-1 should be applied to mice and rabbits according to conventional methods. It can be prepared by a immunization method or the like.
抗体としては、ポリクローナル抗体，モノクローナル抗体が挙げられる。 Examples of antibodies include polyclonal antibodies and monoclonal antibodies.
また、抗体は、哺乳動物由来の抗体、キメラ抗体または擬人化抗体，ヒト化抗体のいずれであっても良い。ヒトのタンパク質に対する抗体であれば何でもよく、検出用抗体自体はヒト化である必要はない。 The antibody may be any of a mammal-derived antibody, a chimeric antibody, an anthropomorphic antibody, or a humanized antibody. Any antibody against a human protein may be used, and the detection antibody itself does not have to be humanized.
FGF-23抗体は、例えばJ Clin Endocrinol Metab 87:4957-4960, 2002に記載の方法等に従って作製することができる他、市販されているものもある（R and D社製 FGF-23モノクローナル抗体：MAB2604, MAB2629，及びサンタクルーズ社製FGF23抗体等）。市販品としては、R and D社製 FGF-23モノクローナル抗体が好ましい。
尚、血清中のFGF-23は、市販のELISAキット（FGF-23 ELISA Kit：カイノス社製）等によって測定することができる。
The FGF-23 antibody can be prepared, for example, according to the method described in J Clin Endocrinol Metab 87: 4957-4960, 2002, and others are commercially available (FGF-23 monoclonal antibody manufactured by R and D: MAB2604, MAB2629, and Santa Cruz FGF23 antibody, etc.). A commercially available product is preferably an FGF-23 monoclonal antibody manufactured by R and D.
In addition, FGF-23 in serum can be measured by a commercially available ELISA kit (FGF-23 ELISA Kit: manufactured by Kainos).
DMP1の抗体は、例えば、TaKaRa Code M176（抗DMP1ペプチド抗体，タカラバイオ社製）等として、入手することができる。 An antibody of DMP1 can be obtained, for example, as TaKaRa Code M176 (anti-DMP1 peptide antibody, manufactured by Takara Bio Inc.).
mRNAを測定する際には、ノザンブロット分析や後述する核酸増幅法が挙げられるが、同時に定量できることから核酸増幅法が好ましい。 When measuring mRNA, Northern blot analysis and a nucleic acid amplification method to be described later can be mentioned, but a nucleic acid amplification method is preferable because it can be quantified at the same time.
ただし、mRNAは酵素分解を受けやすく不安定であることから、逆転写酵素を用いてmRNAをcDNAに変換した後にPCR分析を行うRT-PCR法を用いると、壊れやすいRNAに変わって安定したcDNAで測定できるので好ましい。 However, since mRNA is susceptible to enzymatic degradation and is unstable, RT-PCR, which uses reverse transcriptase to convert mRNA to cDNA and then performs PCR analysis, converts it into fragile RNA and stable cDNA. It is preferable because it can be measured by
尚、mRNAの発現量は標識した遺伝子プローブを用いることによって定量することができる。 The mRNA expression level can be quantified by using a labeled gene probe.
遺伝子プローブとは、日本語で検索子とも言い、相補的な塩基同士の結合により目的遺伝子と共に二本鎖構造を形成するポリヌクレオチドであって、目的遺伝子を探り出す為に用いる核酸断片である。 A gene probe is also referred to as a searcher in Japanese, and is a polynucleotide that forms a double-stranded structure with a target gene by the binding of complementary bases, and is a nucleic acid fragment that is used to search for the target gene.
尚、本発明において遺伝子プローブに用いられるポリヌクレオチドは、アデニン（A），グアニン（G）等のプリン塩基や、チミン（T），ウラシル（U），シトシン（C）等のピリミジン塩基やそれらの修飾塩基を構成要素として含むものであり、一本鎖又は二本鎖のDNA，一本鎖又は二本鎖のRNA，一本鎖DNAと一本鎖RNAからなるハイブリッド体，RNAとDNAが結合して一本鎖となったキメラ体をも含むものである。通常、プライマーやプローブとしては、核酸分子の安定性の点等から、DNAが適しているが、等温遺伝子増幅法（ICAN法）にはキメラプライマー，リアルタイムPCR法のうち一種のサイクリングプローブ法には、キメラプローブが用いられる。 The polynucleotide used for the gene probe in the present invention includes purine bases such as adenine (A) and guanine (G), pyrimidine bases such as thymine (T), uracil (U) and cytosine (C), and their bases. Containing a modified base as a component, single-stranded or double-stranded DNA, single-stranded or double-stranded RNA, a hybrid composed of single-stranded DNA and single-stranded RNA, and RNA and DNA bind Thus, a single-stranded chimera is also included. In general, DNA is suitable as a primer or probe in terms of the stability of nucleic acid molecules, but the isothermal gene amplification method (ICAN method) is a chimeric primer, and the real-time PCR method is a kind of cycling probe method. Chimeric probes are used.
また、本発明において用いられる遺伝子プローブは、常法に従い、DNA合成装置等を用いて人工的に合成する，天然に存在するポリヌクレオチドを抽出する，天然からの抽出ポリヌクレオチドの塩基の一部を欠失，置換，付加する，目的とする配列と相補的な配列を用い、逆転写酵素やDNAポリメラーゼ，RNAポリメラーゼ等によって目的の配列のものを合成させることによって製造することができる。 In addition, the gene probe used in the present invention is artificially synthesized using a DNA synthesizer or the like according to a conventional method, extracts a naturally occurring polynucleotide, or a part of the base of an extracted polynucleotide from nature. Using a sequence complementary to the target sequence to be deleted, substituted or added, the target sequence can be synthesized by reverse transcriptase, DNA polymerase, RNA polymerase or the like.
遺伝子プローブは、目的とする遺伝子と相補的な配列を有し、同じ長さを有するものが好ましいが、必ずしも完全に相補的である必要はなく、プローブの機能を奏する限り、その一部の配列が欠失・置換・付加・削除されたものであっても良い。 The gene probe has a sequence complementary to the target gene and preferably has the same length, but it does not necessarily have to be completely complementary, and as long as the function of the probe is achieved, a partial sequence thereof May be deleted, substituted, added, or deleted.
抗体や遺伝子プローブ等には、必要に応じて蛍光物質等の標識を結合させることが好ましい。 It is preferable to bind a label such as a fluorescent substance to an antibody, a gene probe, or the like, if necessary.
標識としては、蛋白質や遺伝子の検出に一般に用いられているものであれば良いが、抗体に結合させる蛍光蛋白質としては、例えばGFP（Green Fluorescence Protein：オワンクラゲ由来の緑色蛍光タンパク），YFP（Yellow Fluorescence Protein：黄色）、CFP（Cyan Fluorescence Protein：シアン）の他、珊瑚由来の赤色蛍光タンパク等が挙げられ、遺伝子プローブに結合させる標識としては、FAM（６−カルボキシフルオレセイン）のようなフルオレセイン系蛍光色素等の、蛍光色素，ビオチンやジゴキシゲニン（DIG），HRP（西洋わさびパーオキシダーゼ）、あるいはAP（アルカリフォスファターゼ）等が挙げられる。これらの標識を抗体や遺伝子プローブに結合させるには常法を用いることができる。 The label is not particularly limited as long as it is generally used for detection of proteins and genes. Examples of fluorescent proteins to be bound to antibodies include GFP (Green Fluorescence Protein: Green Fluorescent Protein derived from Aequorea jellyfish) and YFP (Yellow Fluorescence). Protein: yellow), CFP (Cyan Fluorescence Protein: cyan), and red fluorescent protein derived from sputum and the like. Examples of labels to be bound to gene probes include fluorescein fluorescent dyes such as FAM (6-carboxyfluorescein) And fluorescent dyes such as biotin, digoxigenin (DIG), HRP (horseradish peroxidase), AP (alkaline phosphatase), and the like. Conventional methods can be used to bind these labels to antibodies and gene probes.
尚、測定対象が遺伝子の場合には、予め検体中の遺伝子を、核酸増幅法等により増幅させて測定する方法がある。 When the measurement target is a gene, there is a method in which a gene in a specimen is amplified in advance by a nucleic acid amplification method or the like.
遺伝子検出に先だって行われる核酸増幅法としては、例えば、PCR法（ポリ核酸増幅法メラーゼ連鎖反応法，Polymerase Chain Reaction，EP200362等参照）やNASBA法（EP329822等参照），TAS法（WO88/10315等参照）のほか、等温遺伝子増幅法（ICAN法：Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids，タカラバイオ社）等が挙げられる。 Examples of nucleic acid amplification methods performed prior to gene detection include, for example, PCR method (see polynucleic acid amplification method, merase chain reaction method, Polymerase Chain Reaction, EP200362, etc.), NASBA method (see EP329822, etc.), TAS method (WO88 / 10315, etc.) In addition to isothermal gene amplification (ICAN method: Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids, Takara Bio Inc.).
これらのうち、主にPCR法が用いられているが、PCR法にも、色々な種類が開発されている。（１）遺伝子の量的な変化を追跡可能なリアルタイム−PCR法，（２）遺伝子を、一旦PCRで増幅した後に、更に別のプライマー対によってPCRを行う、nested-PCR法，（３）nested-PCR法とリアルタイムPCR法を組み合わせたnested-リアルタイムPCR法（二度目のPCRをリアルタイムPCR法で行う方法），及び、これらに、PCR法の実施前にRNAを逆転写する逆転写工程（Reverse Transcription : RT）を組み合わせた方法等が開発されている。
nested-PCR法は、２段階のPCRに基づく増幅により、より特異的に標的遺伝子内の特異配列DNAのみを増幅する事が可能である点で好ましい。
Of these, the PCR method is mainly used, but various kinds of PCR methods have been developed. (1) Real-time PCR method capable of tracking quantitative changes in genes, (2) Nested-PCR method in which a gene is once amplified by PCR and then PCR is performed using another primer pair, (3) nested -Nested-real-time PCR method combining PCR method and real-time PCR method (method of performing the second PCR by real-time PCR method), and reverse transcription step (Reverse transcription for reverse transcription of RNA before PCR method) Transcription: RT) and other methods have been developed.
The nested-PCR method is preferable in that only specific sequence DNA in the target gene can be amplified more specifically by amplification based on two-step PCR.
本発明の骨質評価方法においては、骨細胞量や骨細胞産生物質量が正常時よりも少ないと、微少亀裂が起こる（又は起こっている）可能性が高く、骨強度等に劣り、骨粗鬆症である（又はなっている）、骨折のリスクが高いとの判定することができる。 In the bone quality evaluation method of the present invention, if the amount of bone cells or the amount of bone cell-producing substance is less than normal, there is a high possibility that a microcrack will occur (or has occurred), the bone strength is poor, and osteoporosis is present It can be determined that the risk of fracture is high.
尚、健常人の骨の骨細胞量や血清中の骨細胞産生物質の量は、被験者の性別，年齢等によって異なり一概には限定できないが、例えば、FGF-23の場合、大凡8.2〜54.3 ng/Lの範囲であると考えられる。また、ヒト腸骨の生検では、（閉経後の健常な婦人では）、骨細胞の密度が、mean +/- SDで、188 +/- 22 (/mm2)、骨細胞がいない空のlacunaの密度が18 +/- 7 (/mm2)、合計したlacunaの密度が206 +/- 22(/mm2)という報告がある（J Bone Miner Res 18:1657-63, 2003）。 The amount of bone cells in normal human bones and the amount of bone cell-producing substances in serum vary depending on the sex, age, etc. of the subject and cannot be limited. For example, in the case of FGF-23, the amount is generally 8.2 to 54.3 ng. It is considered to be in the range of / L. Also, in human iliac biopsy (in healthy postmenopausal women), the density of bone cells is mean +/- SD, 188 +/- 22 (/ mm 2 ), empty bone cells There is a report that the density of lacuna is 18 +/− 7 (/ mm 2 ) and the total density of lacuna is 206 +/− 22 (/ mm 2 ) (J Bone Miner Res 18: 1657-63, 2003).
尚、低リン血症に起因する、くる病や骨軟化症の患者の血清中FGF-23は、健常人よりも多いので、本発明の骨質評価とは、明らかに区別される。 In addition, since FGF-23 in serum of patients with rickets and osteomalacia caused by hypophosphatemia is higher than that in healthy persons, it is clearly distinguished from the bone quality evaluation of the present invention.
本発明の骨質評価方法によって得られた結果は、骨のサイズや，骨内部の微細構造，代謝回転速度，石灰化の程度等と併せて、総合的な骨質の判断のために用いることができる。 The results obtained by the bone quality evaluation method of the present invention can be used for comprehensive bone quality judgment together with the bone size, the fine structure inside the bone, the turnover rate, the degree of calcification, etc. .
〈本発明の骨質評価キット〉
本発明の骨質評価キットには、上述の抗体や遺伝子プローブが含まれるが、更に、予め核酸増幅を行うための材料として、耐熱性ポリメラーゼ活性を有する酵素や、緩衝液等、PCRキットの基本物質や、RT-PCR等に用いられる逆転写酵素を含ませることもできる。
<Bone quality evaluation kit of the present invention>
The bone quality evaluation kit of the present invention includes the above-described antibodies and gene probes, and further, as a material for performing nucleic acid amplification in advance, an enzyme having a heat-resistant polymerase activity, a buffer solution, and the like basic substances of the PCR kit Alternatively, reverse transcriptase used for RT-PCR and the like can also be included.
〈本発明の骨質劣化予防又は改善剤のスクリーニング方法〉
上記の骨質評価方法は、この他、骨質の劣化予防又は改善剤のスクリーニング方法にも用いることができる。
<Screening method for bone quality deterioration preventing or improving agent of the present invention>
In addition to this, the bone quality evaluation method can also be used as a screening method for an agent for preventing or improving bone quality.
このスクリーニングは、骨細胞培養物や後述のモデル動物へ、骨質劣化予防又は改善剤の候補物質を投与する前後で、上記の本発明の骨質評価を２度実施することで行うことができる。 This screening can be performed by performing the above-described bone quality evaluation of the present invention twice before and after administering a candidate substance for the prevention or improvement agent of bone quality to a bone cell culture or a model animal described later.
本発明で言うスクリーニングには、骨質劣化予防又は改善剤の複数候補の中から、目的の予防又は治療剤等を選択するための、いわゆる一次スクリーニングの他、被験物の予防又は治療効果を確認するための、二次スクリーニング（再評価又は確認試験）も、含まれる。 In the screening referred to in the present invention, in addition to so-called primary screening for selecting a desired preventive or therapeutic agent from among a plurality of candidates for the prevention or improvement of bone quality, the effect of prevention or treatment of a test substance is confirmed. Secondary screening (reassessment or confirmation tests) for this is also included.
〈本発明で骨質劣化予防又は改善剤のスクリーニングに用いる非ヒト動物（モデル動物）〉 <Non-human animal (model animal) used for screening for bone quality deterioration preventing or improving agent in the present invention>
本発明において骨質劣化予防又は改善剤のスクリーニングに用いられる非ヒト動物としては、下記の(1)〜(4)のモデル動物が挙げられる。
(1)グルココルチコイドを投与した、ヒトのステロイド骨粗鬆症のような症状を呈するモデル動物（Endocrinology 145:1835-41, 2004, J Clin Invest 102:274-82, 1998）
(2)加齢したモデル動物（J Bone Miner Res 17:1044-50, 2002）
(3)卵巣摘除などによってエストロゲン欠乏にしたモデル動物（Endocrinology 124:7-16, 1989）
(4)尾部懸垂や微小重力下においた骨粗鬆症モデル動物（J Bone Miner Res 17:1015-25, 2002）
以下、これらを総称してモデル動物と記載することがある。
Examples of the non-human animal used for screening for an agent for preventing or improving bone quality in the present invention include the following model animals (1) to (4).
(1) A model animal that is treated with glucocorticoid and exhibits symptoms like human steroid osteoporosis (Endocrinology 145: 1835-41, 2004, J Clin Invest 102: 274-82, 1998)
(2) Aged model animals (J Bone Miner Res 17: 1044-50, 2002)
(3) Estrogen-deficient animal model by ovariectomy (Endocrinology 124: 7-16, 1989)
(4) Osteoporosis model animal under tail suspension or microgravity (J Bone Miner Res 17: 1015-25, 2002)
Hereinafter, these may be collectively referred to as model animals.
モデル動物に用いられる非ヒト動物としては、ヒト以外の動物を用いることができるが、哺乳類が好ましい。哺乳類としては、マウス，ラット，ハムスター，モルモット，ネズミ，ウサギ等の齧歯類や、犬，猿等が挙げられるが、実験動物として取り扱い方法が確立されており、継代期間も短い等の点で、齧歯類が好ましく、特に、マウスが好ましい。 As the non-human animal used as the model animal, animals other than humans can be used, but mammals are preferred. Mammals include rodents such as mice, rats, hamsters, guinea pigs, mice, rabbits, dogs, monkeys, etc., but their handling methods have been established as experimental animals and their passage times are short. Rodents are preferable, and mice are particularly preferable.
これらのモデル動物は、骨細胞が正常時よりも減少している，あるいは骨細胞の発現を自在にコントロールすることができるため、骨質劣化予防又は改善剤のスクリーニングに使用することが可能である。 Since these model animals have fewer bone cells than normal or can control the expression of bone cells freely, they can be used for the screening of agents for preventing or improving bone quality deterioration.
スクリーニングの対象である候補物質について、骨質劣化の予防効果を確認する際には、骨細胞を欠失させる前のモデル動物にあらかじめ候補物質を投与し、その後に骨細胞を欠失するような上記(1)〜(4)の操作を行い、骨細胞欠失が改善されたか否かを判断する。
このスクリーニングによって、骨細胞欠失後の、異常な破骨細胞の増殖や、骨芽細胞の減少を予防する物質を選択することが可能となる。
When confirming the preventive effect of bone quality deterioration on the candidate substance to be screened, the candidate substance is administered in advance to the model animal before the bone cells are deleted, and then the bone cells are deleted. The operations (1) to (4) are performed to determine whether or not the bone cell deletion has been improved.
This screening makes it possible to select a substance that prevents abnormal osteoclast proliferation and osteoblast loss after bone cell deletion.
スクリーニングの対象である候補物質について、骨質改善効果を確認する際には、上記のモデル動物に骨細胞を欠失するような上記(1)〜(4)の操作を行い、骨細胞の欠失を誘導した後の骨質と、その後、候補物質を投与した後の骨質を評価する。 When confirming the effect of bone quality improvement on the candidate substance to be screened, perform the above steps (1) to (4) to delete the bone cells in the above model animal, and delete the bone cells. The bone quality after the induction of the candidate substance and the bone quality after administration of the candidate substance are evaluated.
尚、骨細胞を不活性化したモデル動物では、血清中のリンの量が正常であったことから、骨細胞量又は血清ＦＧＦ２３量等の骨細胞産生物質が、リン低下に起因する特殊な疾病とは無関係に、骨質の評価指標となることが分かった。 In a model animal in which bone cells are inactivated, since the amount of phosphorus in serum was normal, bone cell-producing substances such as bone cell amount or serum FGF23 amount are a special disease caused by low phosphorus. It became clear that it became an evaluation index of bone quality regardless of the above.
〈本発明の骨質劣化予防又は改善剤のスクリーニング用キット〉
前述の骨質評価キットは、骨質劣化予防又は改善剤のスクリーニング用キットとして用いることも可能である。すなわち、被験物の投与前後において、骨質評価キットを使用することで、骨質劣化予防又は改善剤のスクリーニング用キットとなる。
<Screening kit for preventing or improving bone deterioration of the present invention>
The aforementioned bone quality evaluation kit can also be used as a screening kit for a bone quality deterioration prevention or improvement agent. That is, by using a bone quality evaluation kit before and after administration of a test object, it becomes a screening kit for a bone quality deterioration prevention or improvement agent.
〈骨への荷重を評価する方法〉
脱荷重状態におく前後の前記モデル動物の骨質を、前記の骨質評価方法と同様にして評価したところ、骨細胞量等に有意な差があることを見いだした。つまり、骨細胞又は骨細胞産生物質量の少なくともいずれかを指標とすることによって骨への荷重を評価することができる。
<Method of evaluating the load on the bone>
When the bone quality of the model animal before and after placing in the unloaded state was evaluated in the same manner as the bone quality evaluation method, it was found that there was a significant difference in the amount of bone cells. That is, the load on the bone can be evaluated by using at least one of the bone cell and the bone cell-producing substance amount as an index.
以下に実施例を挙げて、本発明をさらに具体的に説明するが、これらの実施例により本発明は限定されるものではない。 The present invention will be described more specifically with reference to the following examples. However, the present invention is not limited to these examples.
実施例に変えて、以下に試験例を挙げて、骨細胞と骨質に関連性があることについて説明する。 A test example will be given below in place of the example to explain the relationship between bone cells and bone quality.
試験例１［骨細胞欠失と骨質との関係］ Test Example 1 [Relationship between bone cell deletion and bone quality]
（Tgマウスの作製）
特許文献１に記載した方法に従い、ジフテリア毒素（DT）の投与によって、誘導的に骨細胞を欠失させることのできるモデルマウス（Tgマウス）を作製した。
骨細胞で特異的に発現するDMP-1遺伝子のプロモーターの下流の適当な位置に、外部化合物の受容体をコードする遺伝子を結合させた遺伝子構造物又はそれを含むベクターを、宿主マウスに投与した。
(Production of Tg mice)
According to the method described in
A gene structure in which a gene encoding a receptor for an external compound was bound to an appropriate position downstream of a promoter of a DMP-1 gene that is specifically expressed in bone cells or a vector containing the gene structure was administered to a host mouse. .
具体的には、マウスDMP１遺伝子の9.6kbの５’末端領域，エクソン１，イントロン１，及びエクソン２の一部を、ポリＡシグナル遺伝子と共に、ヒトHB-EGF（ジフテリア受容体）のcDNAに融合した、トランスジェニックカセットを構築した。
親マウスは、C57BL/6マウスの受精卵に、上記カセットをマイクロインジェクションすることによって作成し、その子孫を、骨細胞の欠失を誘導可能なマウスとして下記実験に供した。
尚、導入遺伝子量は、サザンブロッティング分析及び尾から抽出したゲノムDNAのPCR分析によって確認した。
骨細胞欠失誘導は、マウス体重１kg当たり２−５０μgのDTを、PBSに溶解したものを、腹腔内注射することによって行った。
Specifically, the 9.6
A parent mouse was prepared by microinjecting the above cassette into a fertilized egg of a C57BL / 6 mouse, and its offspring was subjected to the following experiment as a mouse capable of inducing bone cell deletion.
The amount of transgene was confirmed by Southern blotting analysis and PCR analysis of genomic DNA extracted from the tail.
Bone cell deletion was induced by intraperitoneal injection of 2-50 μg DT dissolved in PBS per kg body weight of the mouse.
（骨芽細胞表面の状態，石灰化速度，骨形成速度）
野生型（WT）マウスとTgマウスの腹腔内へ、体重１kg当たり50μgのDTを投与した。
DT投与後８日の脛骨の海綿部分の骨の組織形態学的な分析は、骨芽細胞面に変化無く、顕著に抑制された石灰化速度（MAR：mineral apposition rate）を示し（図１）、そのことは、骨芽細胞の分化・増加が変化せずに残っているにも係わらず、個々の骨芽細胞の石灰化機能が、骨細胞の除去から８日で、阻害されていることを示唆していた。尚、図中の＊＊は、Ｐ＜0.01（n＝5 each group）を表す。
海綿骨上の破骨細胞の数は、このとき変わっていなかった（データ示さず。）。
骨細胞除去後すぐの骨分析結果から、骨細胞は、石灰化と、とくに骨外膜からの骨吸収の異常な加速から守る点で重要な役割を担っていることが示唆された。
(Osteoblast surface condition, calcification rate, bone formation rate)
50 μg DT / kg body weight was administered intraperitoneally to wild type (WT) mice and Tg mice.
Histomorphological analysis of the bone of the cancellous portion of the
The number of osteoclasts on the cancellous bone was not changed at this time (data not shown).
The results of bone analysis immediately after bone cell removal suggested that bone cells play an important role in protecting against calcification and, in particular, the abnormal acceleration of bone resorption from the outer bone membrane.
試験例２［骨の構造と骨強度の評価］
骨のリモデリングに及ぼす、長期間の骨細胞欠失の影響を調べるため、試験例１で作製したTgマウスに、DTを20μg／kgの濃度で一回投与後、20〜40日観察した。
Test Example 2 [Evaluation of bone structure and bone strength]
In order to examine the effect of long-term bone cell deletion on bone remodeling, DT was administered once to a Tg mouse prepared in Test Example 1 at a concentration of 20 μg / kg and observed for 20 to 40 days.
（骨強度）
DT投与40日後のTgマウスの骨についての骨強度を測定した。
骨強度の評価方法としては、J Bone Miner Res 14:2159-66, 1999等に記載の４点曲げ試験方法等によって実施した。具体的には、骨を横にして、下から２点（端を）で支え、上から２点から（中央側から）力を加えて、骨折するまで、変位した長さと加えた外力を定量測定した。この結果、比較的長期間の骨細胞欠乏により、骨形成阻害と骨吸収を通じて、骨量が顕著に減少し、微細構造も悪化し、骨強度も弱められていることが分かった（図２）。尚、図中の＊は、Ｐ＜0.05（n＝3 each group）を表す。
(Bone strength)
The bone strength of the bones of
As a bone strength evaluation method, a four-point bending test method described in J Bone Miner Res 14: 2159-66, 1999 and the like was performed. Specifically, laying the bone sideways, supporting it from two points (edges) from the bottom, applying force from two points (from the center side) from the top, quantifying the displaced length and the applied external force until fractured It was measured. As a result, it was found that bone mass deficiency caused by bone formation deficiency and bone resorption significantly reduced bone mass, deteriorated fine structure, and weakened bone strength due to bone cell deficiency for a relatively long period of time (Fig. 2). . In the figure, * represents P <0.05 (n = 3 each group).
試験例３［骨細胞欠失マウス血清中の骨細胞産生物質量］
（FGF-23量）
DT投与40日後の、野生型マウス及びTgマウスの、血清中のカルシウム量（Ca），リン酸（Pi），副甲状腺ホルモン(parathyroid hormone, PTH），及びFGF-23量を測定した結果を示す（図３）。血清中のカルシウム量，リン酸，副甲状腺ホルモンについては、骨細胞の有無による影響は無かったが、FGF-23については、Tgマウスの血清中の量が有意に減少した。尚、図中の＊は、Ｐ＜0.05（n＝5 each group）を表す。
Test Example 3 [Amount of bone cell-producing substance in serum of bone cell-deficient mice]
(FGF-23 amount)
Results of measurement of serum calcium (Ca), phosphate (Pi), parathyroid hormone (PTH), and FGF-23 levels in wild-type and
試験例４［骨細胞欠失マウス血清中のFGF-23量］
上記試験例３の結果は、毒素を投与して40日がたっており、骨やミネラル代謝の変化を介した２次的な影響を見ている可能性もある。そこで、毒素の投与で骨細胞の死を誘導してから、48時間という短期で同じ実験を行った。その結果、図４に示すように、血清FGF-23濃度の低下が見られた。つまり、血清中のFGF-23量の低下は、骨・ミネラル代謝の変化を介した２次的な結果ではなく、骨細胞がなくなったことによる直接の結果と考えられる。尚、図中の＊＊は、Ｐ＜0.01（n＝3 each group）を表す。
Test Example 4 [Amount of FGF-23 in the serum of mice lacking bone cells]
The result of Test Example 3 is 40 days after the administration of the toxin, and there is a possibility that a secondary effect through changes in bone and mineral metabolism is observed. Therefore, the same experiment was conducted in a short period of 48 hours after the death of bone cells was induced by administration of toxin. As a result, as shown in FIG. 4, a decrease in serum FGF-23 concentration was observed. That is, the decrease in the amount of FGF-23 in the serum is not a secondary result through changes in bone / mineral metabolism, but a direct result due to the disappearance of bone cells. In the figure, ** represents P <0.01 (n = 3 each group).
試験例５［骨細胞欠失マウスの骨中の、骨細胞産生物質ｍRNA量］ Test Example 5 [Bone cell-producing substance mRNA level in bones of bone cell-deficient mice]
（FGF-23のmRNA）
DT投与後８日目のTgマウスの骨から、常法に従いRNAを抽出し、RT-PCRによりFGF-23のmRNAを検出した。コントロールとしてGAPDH（glyceraldehyde-3-phosphate. dehydrogenase）のmRNAを同時に検出した。これらの結果を、図５に示す。図５から分かる通り、DTを投与して骨細胞がなくなった骨においては、FGF-23 mRNAが著しく減少していた。従って、FGF-23が主に骨細胞で産生され、骨細胞の減少が、FGF-23の血清濃度の低下をもたらしたものと考えられる。
(FGF-23 mRNA)
RNA was extracted from bones of
（MEPEのmRNA量）
DT投与後48時間後のTgマウスの骨から、常法に従いRNAを抽出し、RT-PCRによりMEPEのmRNAを検出した。コントロールであるGAPDHのmRNA発現量に対する、MEPEのmRNA量の比を図６に示す。図中、黒のボックスが、DT投与48時間後のmRNAを表す。白のボックスが、PBS投与48時間後のmRNAを表す。
(MEPE mRNA level)
RNA was extracted from bones of
（DMP1のmRNA量）
DT投与後48時間後のTgマウスの骨から、常法に従いRNAを抽出し、RT-PCRによりDMP1のmRNAを検出した。コントロールであるGAPDHのmRNA発現量に対する、MEPEのmRNA量の比を図７に示す。図中、黒のボックスが、DT投与48時間後のmRNAを表す。白のボックスは、PBS投与48時間後のmRNAを表す。尚、図中の＊＊は、Ｐ＜0.01（n＝3 each group）を表す。
(DMP1 mRNA level)
RNA was extracted from bones of
本発明の骨質評価方法又は骨質評価キットを用いることによって、骨質の正確な評価が可能となる。特に、血清中の骨細胞産生物質量を指標とする評価方法の場合には、骨組織の摘出が不要な非破壊的な検査であることから、患者負担が少ないという利点を有している。
また、本発明のスクリーニング方法又はスクリーニング用キットを用いて、骨質劣化予防又は改善剤のスクリーニングを行うことができる。更には、本発明によって、骨への荷重を評価することができる。
By using the bone quality evaluation method or the bone quality evaluation kit of the present invention, it is possible to accurately evaluate bone quality. In particular, in the case of an evaluation method using the amount of bone cell-producing substance in serum as an index, it is a non-destructive test that does not require extraction of bone tissue, and thus has an advantage that the burden on the patient is small.
Further, the screening method or screening kit of the present invention can be used to screen for an agent for preventing or improving bone quality deterioration. Furthermore, the load on the bone can be evaluated by the present invention.
PBS：リン酸緩衝液
DT：ジフテリア毒素
WT：野生型マウス
Tg：ジフテリア毒素受容体を骨細胞のみに導入した、トランスジェニックマウス
Ob.S／BS（％）：（Osteoblast Surface／Bone Surface）骨表面積に対する骨芽細胞面の割合
MAR：石灰化速度（mineral apposition rate）
BFR：骨形成速度（Bone Formation Rate）
Max load: 骨折するまでに加えた外力
FGF-23：繊維芽細胞増殖因子(Fibroblast Growth Factor 23)
PTH：副甲状腺ホルモン(parathyroid hormone)
Pi：無機リン酸
Ca：カルシウム
GAPDH：glyceraldehyde-3-phosphate. Dehydrogenase
PBS: phosphate buffer
DT: Diphtheria toxin
WT: Wild type mouse
Tg: Transgenic mouse with diphtheria toxin receptor introduced only into bone cells
Ob.S / BS (%): (Osteoblast Surface / Bone Surface) Ratio of osteoblast surface to bone surface area
MAR: Mineral apposition rate
BFR: Bone Formation Rate
Max load: external force applied before fracture
FGF-23:
PTH: parathyroid hormone
Pi: Inorganic phosphoric acid
Ca: Calcium
GAPDH: glyceraldehyde-3-phosphate. Dehydrogenase
Claims (10)
(1)グルココルチコイドを投与した、ヒトのステロイド骨粗鬆症のような症状を呈するモデル動物
(2)加齢したモデル動物
(3)卵巣摘除などによってエストロゲン欠乏にしたモデル動物
(4)尾部懸垂や微小重力下においた骨粗鬆症モデル動物 A screening method for an agent for preventing or improving bone quality, which comprises using a non-human animal according to any one of (1) to (4) below and using bone cells and / or bone cell-producing substances as indices.
(1) A model animal that is administered glucocorticoid and exhibits symptoms like human steroid osteoporosis
(2) Aged animal model
(3) Estrogen-deficient model animals such as ovariectomy
(4) Osteoporosis model animal under tail suspension or microgravity
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|---|---|
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Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2011519043A (en) * | 2008-04-29 | 2011-06-30 | ノバルティス アーゲー | Method for monitoring modulation of kinase activity of fibroblast growth factor receptor and use of the method |
| WO2012029837A1 (en) * | 2010-08-31 | 2012-03-08 | 協和メデックス株式会社 | Method for assaying fibroblast growth factor-23 and assay reagent |
| WO2014189196A1 (en) * | 2013-05-21 | 2014-11-27 | 연세대학교 원주산학협력단 | Device for stimulating cells using three-dimensional rotating machine and ultrasonic waves and method for stimulating cells using same |
| JP2018189644A (en) * | 2017-04-27 | 2018-11-29 | ライオン株式会社 | Bone quality evaluation marker and application thereof |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2003116560A (en) * | 2001-10-11 | 2003-04-22 | Teijin Ltd | New polypeptide and polynucleotide encoding the same |
| JP2004201691A (en) * | 2002-12-23 | 2004-07-22 | Chugai Pharmaceut Co Ltd | Type ii na/pi cotransporter expression regulator |
| WO2004066723A1 (en) * | 2003-01-28 | 2004-08-12 | Daniolabs Limited | A model of bone disease amenable to high-throughput screening |
| JP2004292321A (en) * | 2003-03-25 | 2004-10-21 | Dako Cytomation Kk | Peptide derived from dpm1 |
-
2005
- 2005-12-28 JP JP2005379337A patent/JP2007178356A/en active Pending
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2003116560A (en) * | 2001-10-11 | 2003-04-22 | Teijin Ltd | New polypeptide and polynucleotide encoding the same |
| JP2004201691A (en) * | 2002-12-23 | 2004-07-22 | Chugai Pharmaceut Co Ltd | Type ii na/pi cotransporter expression regulator |
| WO2004066723A1 (en) * | 2003-01-28 | 2004-08-12 | Daniolabs Limited | A model of bone disease amenable to high-throughput screening |
| JP2004292321A (en) * | 2003-03-25 | 2004-10-21 | Dako Cytomation Kk | Peptide derived from dpm1 |
Cited By (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2011519043A (en) * | 2008-04-29 | 2011-06-30 | ノバルティス アーゲー | Method for monitoring modulation of kinase activity of fibroblast growth factor receptor and use of the method |
| KR101882533B1 (en) | 2010-08-31 | 2018-07-26 | 교와 메덱스 가부시키가이샤 | Method for measuring fibroblast growth factor-23 and reagent therefor |
| CN103180733A (en) * | 2010-08-31 | 2013-06-26 | 协和梅迪克斯株式会社 | Method for assaying fibroblast growth factor-23 and assay reagent |
| JPWO2012029837A1 (en) * | 2010-08-31 | 2013-10-31 | 協和メデックス株式会社 | Method and reagent for measuring fibroblast growth factor-23 |
| KR20130137618A (en) * | 2010-08-31 | 2013-12-17 | 교와 메덱스 가부시키가이샤 | Method for assaying fibroblast growth factor-23 and assay reagent |
| CN103180733B (en) * | 2010-08-31 | 2015-11-25 | 协和梅迪克斯株式会社 | The assay method of FGF-23 and mensuration reagent |
| JP5865838B2 (en) * | 2010-08-31 | 2016-02-17 | 協和メデックス株式会社 | Method and reagent for measuring fibroblast growth factor-23 |
| WO2012029837A1 (en) * | 2010-08-31 | 2012-03-08 | 協和メデックス株式会社 | Method for assaying fibroblast growth factor-23 and assay reagent |
| US10422796B2 (en) | 2010-08-31 | 2019-09-24 | Kyowa Medex Co., Ltd. | Method for measuring fibroblast growth factor-23 and reagent therefor |
| WO2014189196A1 (en) * | 2013-05-21 | 2014-11-27 | 연세대학교 원주산학협력단 | Device for stimulating cells using three-dimensional rotating machine and ultrasonic waves and method for stimulating cells using same |
| KR101470159B1 (en) * | 2013-05-21 | 2014-12-12 | 연세대학교 원주산학협력단 | A stimulation equipment and a stimulation method of cell using 3-dimension clinostat and ultrasound |
| US10059917B2 (en) | 2013-05-21 | 2018-08-28 | Yonsei University Wonju Industry-Academic Cooperation Foundation | Apparatus and method of stimulating cells using 3D clinostat and ultrasonic wave |
| JP2018189644A (en) * | 2017-04-27 | 2018-11-29 | ライオン株式会社 | Bone quality evaluation marker and application thereof |
| JP7092546B2 (en) | 2017-04-27 | 2022-06-28 | ライオン株式会社 | Markers for bone quality evaluation and their uses |
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