JP4214235B2 - Type 2 diabetes diagnosis kit - Google Patents
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Description
本発明は、２型糖尿病の診断方法及び診断用キット、並びに２型糖尿病予防・治療効果を有する物質のスクリーニング方法及びスクリーニング用キットに関する。 The present invention relates to a diagnostic method and a diagnostic kit for type 2 diabetes, and a screening method and a screening kit for a substance having a type 2 diabetes prevention / treatment effect.
糖尿病の患者数は、世界規模で増加の一途をたどっており、２０１０年度には２億人を越えると予想されている。糖尿病はその病因に基づいて大きく１型と２型とに分類されるが、糖尿病の患者のほとんどが２型糖尿病の患者によって占められており、その克服は人類の大きな課題の一つといえる。
１型糖尿病は、膵臓ランゲルハンス島が炎症を起こしてβ細胞によるインスリン分泌能が著しく低下するもので、インスリンを補充しなくては生存できないインスリン依存型の病像を呈する。
２型糖尿病は、それ以外の原因でインスリンの作用不足が現れて高血糖になるもので、肥満、過食、運動不足、ストレス等の環境因子の関与が大きく、中年以降の比較的高齢の肥満者に発症しやすい。２型糖尿病では、一般的にはインスリン非依存型の病像を呈し、食事療法と運動療法が治療の基本となる。食事療法、運動療法の次の段階として薬物療法が行われ、それでも治療が困難な場合にはインスリン療法が行われる。
糖尿病の初発時期には、多飲、多尿、夜尿等の症状が見られるが、これらの初発症状を自覚する患者は少なく、患者の多くは、合併症に伴う症状が現れるまで自覚できないため、糖尿病がいつの間にか発症していて、それを発見した時には合併症が出現しており、治療が極めて困難となる場合が多い。したがって、糖尿病の克服には、早期発見・早期治療が極めて重要であるが、１型糖尿病に比べて２型糖尿病の発症過程は未だ不明な点が多いため、早期発見・早期治療が困難となる場合がある。
そこで、２型糖尿病の発症過程を明らかにするために、様々な遺伝学的アプローチが行われており、最近、糖尿病患者におけるＳＮＰｓ解析やハプロタイプ解析によって遺伝子に先天的な塩基配列の異常が存在することが明らかになりつつある。例えば、塩基配列の異常により、糖尿病罹患率の変動（Ａｌｔｓｈｕｌｅｒ，Ｄ．ら，Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ，２０００．２６（１）ｐ．７６−８０；Ｙｅｎ，Ｃ．Ｊ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ，１９９７．２４１（２）ｐ．２７０−４）、膵臓β細胞の機能低下（Ｍａｅｃｈｌｅｒ，Ｐ．ａｎｄ Ｃ．Ｂ．Ｗｏｌｌｈｅｉｍ，Ｎａｔｕｒｅ，２００１．４１４（６８６５）ｐ．８０７−１２；Ｂｅｌｌ，Ｇ．Ｉ．ａｎｄ Ｋ．Ｓ．Ｐｏｌｏｎｓｋｙ，Ｎａｔｕｒｅ，２００１．４１４（６８６５）ｐ．７８８−９１）、さらには薬剤感受性の変化（Ｕｍｅｋａｗａ，Ｔ．ら，Ｄｉａｂｅｔｅｓ，１９９９．４８（１）ｐ．１１７−２０；Ｈｏｆｆｓｔｅｄｔ，Ｊ．ら，Ｄｉａｂｅｔｅｓ，１９９９．４８（１）ｐ．２０３−５）等をきたすことが報告されている。しかし、２型糖尿病の原因となる遺伝子は完全には同定されておらず、２型糖尿病の発症過程には未だ不明な点が多い。
その他の遺伝学的なアプローチとして、遺伝子の発現解析が行われている。遺伝子の発現解析は、遺伝子の発現状態（表現型）を解析するものであり、遺伝子の先天的な異常（遺伝子型）を解析するＳＮＰｓ解析等と本質的に異なるものであって、遺伝因子及び環境因子を加味した患者の現状を把握できる点で有利である。
しかしながら、これまでの遺伝子の発現解析は、肝臓、骨格筋、脂肪、膵臓等、インスリンの主要標的臓器における糖代謝、脂質代謝等に関連する遺伝子の発現の変化を調べるために行われてきたため、これを臨床応用して２型糖尿病の診断を行うことは困難である。すなわち、インスリンの主要標的臓器を対象とする場合には、検体のサンプリングが困難であるため、遺伝子の発現解析に基づいて２型糖尿病の診断を行うことは困難である。The number of diabetic patients is increasing on a global scale and is expected to exceed 200 million in 2010. Diabetes is roughly classified into type 1 and type 2 on the basis of its etiology, but most patients with diabetes are occupied by patients with type 2 diabetes, and overcoming this is one of the major challenges of humanity.
Type 1 diabetes is caused by inflammation of the pancreatic islets of Langerhans and significantly reduces the ability of β-cells to secrete insulin, and exhibits an insulin-dependent pathology that cannot survive without supplementation with insulin.
Type 2 diabetes is due to other causes of insufficient insulin action and hyperglycemia. Obesity, overeating, lack of exercise, stress and other environmental factors are significant, and obesity is relatively old since middle age. It is easy to develop in the elderly. In type 2 diabetes, an insulin-independent disease state is generally exhibited, and diet therapy and exercise therapy are the basis of treatment. Drug therapy is performed as the next stage of diet therapy and exercise therapy, and insulin therapy is performed when treatment is still difficult.
Symptoms such as polydipsia, polyuria, and nocturnal urine are observed at the initial stage of diabetes, but few patients are aware of these initial symptoms, and many patients cannot be aware until symptoms associated with complications appear Diabetes is onset for some time, and when it is discovered, complications appear and treatment is often very difficult. Therefore, early detection and early treatment are extremely important for overcoming diabetes, but the onset process of type 2 diabetes is still unclear compared to type 1 diabetes, making early detection and early treatment difficult. There is a case.
Therefore, various genetic approaches have been carried out to clarify the onset process of type 2 diabetes. Recently, there is a congenital abnormality of the gene by SNP analysis and haplotype analysis in diabetic patients. It is becoming clear. For example, changes in the prevalence of diabetes due to abnormal base sequences (Altshuler, D. et al., Nat Genet, 200.26 (1) p. 76-80; Yen, CJ et al., Biochem Biophys Res Commun, 1997. 241 (2) p. 270-4), pancreatic β-cell function decline (Maechler, P. and CB Wallheim, Nature, 2001.414 (6865) p. 807-12; Bell, GI, and K. S. Polonsky, Nature, 2001.414 (6865) p. 788-91), as well as changes in drug sensitivity (Umekawa, T. et al., Diabetes, 1999.48 (1) p. 117-20; Hoffstead, J. et al., Diabetes, 1999.48 (1) p. It has been reported that lead to 203-5), and the like. However, the gene causing type 2 diabetes has not been completely identified, and there are still many unclear points in the onset process of type 2 diabetes.
As another genetic approach, gene expression analysis is performed. Gene expression analysis is to analyze the expression state (phenotype) of a gene, and is essentially different from SNP analysis etc. to analyze an inherited abnormality (genotype) of a gene, It is advantageous in that it can grasp the current state of patients taking environmental factors into account.
However, gene expression analysis so far has been performed to examine changes in the expression of genes related to glucose metabolism, lipid metabolism, etc. in the main target organs of insulin, such as liver, skeletal muscle, fat, pancreas, It is difficult to make a diagnosis of type 2 diabetes by applying this clinically. That is, when the main target organ of insulin is targeted, it is difficult to sample type 2, and thus it is difficult to diagnose type 2 diabetes based on gene expression analysis.
そこで、本発明は、第一に、サンプリングが容易な組織における遺伝子の発現解析によって２型糖尿病を診断できる（特に２型糖尿病の発症前において、将来２型糖尿病を発症する可能性があるか否かを診断でき、２型糖尿病の早期発見を可能とする）、２型糖尿病の診断方法及び診断用キットを提供することを目的とする。
また、本発明は、第二に、サンプリングが容易な組織における遺伝子の発現解析によって２型糖尿病予防・治療効果を有する物質をスクリーニングすることができる、２型糖尿病予防・治療効果を有する物質のスクリーニング方法及びスクリーニング用キットを提供することを目的とする。
上記目的を達成するために、本発明は、以下の２型糖尿病の診断方法及び診断用キット、並びに２型糖尿病予防・治療効果を有する物質のスクリーニング方法及びスクリーニング用キットを提供する。
（１）被験者の血液から採取した白血球におけるＣＡＰＮ１０遺伝子又はＩＲＳ−１遺伝子の発現レベルを指標として２型糖尿病の診断を行うことを特徴とする２型糖尿病の診断方法。
（２）前記発現レベルを、ＣＡＰＮ１０又はＩＲＳ−１をコードするｍＲＮＡの存在量に基づいて測定することを特徴とする前記（１）記載の診断方法。
（３）前記発現レベルを、ＣＡＰＮ１０又はＩＲＳ−１の存在量に基づいて測定することを特徴とする前記（１）記載の診断方法。
（４）前記被験者の白血球におけるＣＡＰＮ１０遺伝子又はＩＲＳ−１遺伝子の発現レベルが、健常者の白血球におけるＣＡＰＮ１０遺伝子又はＩＲＳ−１遺伝子の発現レベルよりも減少しているときに、前記被験者が将来２型糖尿病を発症する可能性がある又は前記被験者が現在２型糖尿病を発症している可能性があると診断することを特徴とする前記（１）記載の診断方法。
（５）ＣＡＰＮ１０又はＩＲＳ−１をコードする核酸にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを含むことを特徴とする２型糖尿病診断用キット。
（６）ＣＡＰＮ１０又はＩＲＳ−１に反応し得る抗体又はその断片を含むことを特徴とする２型糖尿病診断用キット。
（７）２型糖尿病モデル動物に候補物質を投与した後、前記動物の血液から採取した白血球におけるＣＡＰＮ１０遺伝子又はＩＲＳ−１遺伝子の発現レベル改善効果を指標として、前記候補物質の２型糖尿病予防・治療効果を判定することを特徴とする２型糖尿病予防・治療効果を有する物質のスクリーニング方法。
（８）ＣＡＰＮ１０又はＩＲＳ−１をコードする核酸にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを含むことを特徴とする２型糖尿病予防・治療効果を有する物質のスクリーニング用キット。
（９）ＣＡＰＮ１０又はＩＲＳ−１に反応し得る抗体又はその断片を含むことを特徴とする２型糖尿病予防・治療効果を有する物質のスクリーニング用キット。Therefore, the present invention can first diagnose type 2 diabetes by gene expression analysis in an easily sampled tissue (in particular, whether or not there is a possibility of developing type 2 diabetes in the future before the onset of type 2 diabetes). An object of the present invention is to provide a method for diagnosing type 2 diabetes and a diagnostic kit.
In addition, the present invention secondly, screening of a substance having type 2 diabetes prevention / treatment effect, which can screen for a substance having type 2 diabetes prevention / treatment effect by gene expression analysis in an easily sampled tissue. It is an object to provide a method and a screening kit.
In order to achieve the above object, the present invention provides the following type 2 diabetes diagnosis method and diagnostic kit, and a screening method and screening kit for a substance having a type 2 diabetes prevention / treatment effect.
(1) A method for diagnosing type 2 diabetes, comprising diagnosing type 2 diabetes using the expression level of the CAPN10 gene or IRS-1 gene in leukocytes collected from the blood of a subject as an index.
(2) The diagnostic method according to (1), wherein the expression level is measured based on the abundance of mRNA encoding CAPN10 or IRS-1.
(3) The diagnostic method according to (1), wherein the expression level is measured based on the abundance of CAPN10 or IRS-1.
(4) When the expression level of the CAPN10 gene or the IRS-1 gene in the white blood cells of the subject is lower than the expression level of the CAPN10 gene or the IRS-1 gene in the white blood cells of the healthy subject, The diagnosis method according to (1) above, wherein diagnosis is made that there is a possibility of developing diabetes or that the subject is currently developing type 2 diabetes.
(5) A kit for diagnosing type 2 diabetes, comprising an oligonucleotide or polynucleotide capable of hybridizing to a nucleic acid encoding CAPN10 or IRS-1.
(6) A kit for diagnosing type 2 diabetes, comprising an antibody capable of reacting with CAPN10 or IRS-1 or a fragment thereof.
(7) After the candidate substance is administered to a type 2 diabetes model animal, the effect of improving the expression level of the CAPN10 gene or IRS-1 gene in leukocytes collected from the blood of the animal is used as an index to prevent type 2 diabetes. A screening method for a substance having a preventive / therapeutic effect on type 2 diabetes, characterized by determining a therapeutic effect.
(8) A kit for screening for a substance having a preventive / therapeutic effect on type 2 diabetes, comprising an oligonucleotide or polynucleotide capable of hybridizing to a nucleic acid encoding CAPN10 or IRS-1.
(9) A screening kit for a substance having a preventive / therapeutic effect on type 2 diabetes, comprising an antibody capable of reacting with CAPN10 or IRS-1 or a fragment thereof.
図１は、ＯＬＥＴＦラット及びＬＥＴＯラットの体重変化を示す図である。
図２は、ＯＬＥＴＦラット及びＬＥＴＯラットの耐糖能変化を示す図である。
図３は、ＯＬＥＴＦラット及びＬＥＴＯラットの白血球におけるＩＲ（図３Ａ）、ＳＨＩＰ２（図３Ｂ）、ＰＰＡＲγ（図３Ｃ）、ＣＡＰＮ１０（図３Ｄ）及びＩＲＳ−１（図３Ｅ）のｍＲＮＡ発現解析結果を示す図であり、図中、白（□）はＬＥＴＯラットの結果を、黒（■）はＯＬＥＴＦラットの結果を示す。FIG. 1 is a graph showing changes in body weight of OLETF rats and LETO rats.
FIG. 2 is a graph showing changes in glucose tolerance of OLETF rats and LETO rats.
FIG. 3 shows the results of mRNA expression analysis of IR (FIG. 3A), SHIP2 (FIG. 3B), PPARγ (FIG. 3C), CAPN10 (FIG. 3D), and IRS-1 (FIG. 3E) in white blood cells of OLETF and LETO rats. In the figure, white (□) indicates the result of the LETO rat, and black (■) indicates the result of the OLETF rat.
本発明の２型糖尿病の診断方法は、被験者の血液から採取した白血球におけるＣＡＰＮ１０遺伝子又はＩＲＳ−１遺伝子の発現レベルを指標として２型糖尿病の診断を行うことを特徴とする。
被験者の血液から白血球を採取する方法は特に限定されるものではなく、例えば、血液中の赤血球を選択的に溶解させた後、遠心分離することによって白血球を採取できる。白血球には、好中球、好酸球、好塩基球、リンパ球及び単球のいずれもが含まれ、検体として用いる白血球は、これらのうちの１種類であってもよいし、２種類以上の混合物であってもよい。
ＣＡＰＮ１０遺伝子は、ＣＡＰＮ１０（Ｃａｌｐａｉｎ１０，カルパイン１０）をコードする遺伝子である。ＣＡＰＮ１０は、組織非特異的に発現しているシステインプロテアーゼである。ＣＡＰＮ１０は、カルパインが通常有しているカルシウム結合ドメインを有しておらず、代わりにＴドメインを有している（Ｈｏｒｉｋａｗａ，Ｙ．ら，Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ，２０００．２６（２）ｐ．１６３−７５）。ＣＡＰＮ１０の機能としては、例えば、ＩＲＳ−１の分解に関わっている（Ｓｍｉｔｈ，Ｌ．Ｋ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ，１９９３．１９６（２）ｐ．７６７−７２）、Ａキナーゼ系に組み込まれており、脂肪細胞の分化に関わっている（Ｐａｔｅｌ，Ｙ．Ｍ．ａｎｄ Ｍ．Ｄ．Ｌａｎｅ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，１９９９．９６（４）ｐ．１２７９−８４）、プロテインキナーゼＣを加水分解する（Ｓｕｚｕｋｉ，Ｋ．ら，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ，１９８７．２２０（２）ｐ．２７１−７）等が知られている。
ＩＲＳ−１遺伝子は、ＩＲＳ−１（Ｉｎｓｕｌｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ−１，インスリンレセプター基質−１）をコードする遺伝子である。ＩＲＳ−１は、インスリン作用機構に関与するタンパク質である。すなわち、インスリンが細胞表面のインスリンレセプターに結合すると、インスリンレセプターに結合したＩＲＳ−１をはじめとする各種タンパク質が次々と活性化して、その信号が伝達され、その信号によってトランスポーター（ＧＬＵＴ４）が活性化して、ブドウ糖を細胞外から細胞内へと移送する。
ＣＡＰＮ１０遺伝子の塩基配列には、多型、アイソフォーム等によって被験者間で相違が見られる場合があるが、塩基配列が相違する場合であってもＣＡＰＮ１０をコードする限り、ＣＡＰＮ１０遺伝子に含まれる。ＩＲＳ−１遺伝子についても同様である。
「ＣＡＰＮ１０遺伝子の発現レベル」には、ＣＡＰＮ１０遺伝子のｍＲＮＡへの転写レベル及びタンパク質への翻訳レベルが含まれる。同様に、「ＩＲＳ−１遺伝子の発現レベル」には、ＩＲＳ−１遺伝子のｍＲＮＡへの転写レベル及びタンパク質への翻訳レベルが含まれる。したがって、ＣＡＰＮ１０遺伝子又はＩＲＳ−１遺伝子の発現レベルは、検体におけるＣＡＰＮ１０又はＩＲＳ−１をコードするｍＲＮＡの存在量、あるいは、検体におけるＣＡＰＮ１０又はＩＲＳ−１の存在量に基づいて測定することができる。
ＣＡＰＮ１０又はＩＲＳ−１をコードするｍＲＮＡの存在量の測定にあたっては、公知の遺伝子解析技術、例えば、ハイブリダイゼーション技術（例えば、ノーザンハイブリダイゼーション法、ドットブロット法、ＤＮＡマイクロアレイ法等）、遺伝子増幅技術（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ等）等を利用することができる。
ハイブリダイゼーション技術を利用する際には、ＣＡＰＮ１０又はＩＲＳ−１をコードする核酸にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドをプローブとして利用することができ、遺伝子増幅技術を利用する際には、当該オリゴヌクレオチドをプライマーとして利用することができる。
ＣＡＰＮ１０又はＩＲＳ−１をコードする核酸には、ＤＮＡ及びＲＮＡの両者が含まれ、例えば、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ｃＲＮＡ等が含まれる。オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを構成するヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチド、あるいは非天然型ヌクレオチドのいずれであってもよい。オリゴヌクレオチドの塩基長は通常１５〜１００塩基、好ましくは１８〜４０塩基であり、ポリヌクレオチドの塩基長は通常２００〜３０００塩基、好ましくは５００〜１０００塩基である。
ＣＡＰＮ１０又はＩＲＳ−１をコードする核酸にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドの塩基配列は、ＣＡＰＮ１０遺伝子又はＩＲＳ−１遺伝子の塩基配列に基づいて設計することができる。例えば、ＣＡＰＮ１０又はＩＲＳ−１をコードするｃＤＮＡのうち、ｃＤＳを含む領域を選択し、当該領域にハイブリダイズするように、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドの塩基配列を設計する。また、ＣＤＳ領域の５’末端側又は３’末端側の領域にハイブリダイズし得るように、あるいは、ＣＤＳ領域からその５’末端側又は３’末端側の領域にわたる領域にハイブリダイズし得るように設計することもできる。設計したオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドについては、実際にプライマーやプローブとして利用して、目的とする核酸にハイブリダイズするか否かを確認することが好ましい。ヒトのＣＡＰＮ１０をコードするｃＤＮＡの塩基配列を配列番号１に示し、ヒトのＩＲＳ−１をコードするｃＤＮＡの塩基配列を配列番号２に示す。配列番号１記載のｃＤＮＡのうち、２４〜２０２４番目の塩基からなる領域がＣＤＳ領域であり、配列番号２記載のｃＤＮＡのうち、１０２１〜４７４９番目の塩基からなる領域がＣＤＳ領域である。オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドをプライマーとして利用する場合には、５’末端側に制限酵素認識配列、タグ等を付加することができる。また、プローブとして利用する場合には、蛍光色素、ラジオアイソトープ等の標識を付加することができる。
ＣＡＰＮ１０又はＩＲＳ−１をコードするｍＲＮＡの存在量の具体的測定方法について、ＲＴ−ＰＣＲを利用する場合を例にして説明する。被験者の血液から採取した白血球から全ＲＮＡを抽出し、抽出した全ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した後、合成したｃＤＮＡを鋳型とし、ＣＡＰＮ１０又はＩＲＳ−１をコードするｃＤＮＡにハイブリダイズし得るプライマーセットを用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲ増幅断片を定量することによって、ＣＡＰＮ１０又はＩＲＳ−１をコードするｍＲＮＡの存在量を測定することができる。この際、ＰＣＲは、ＰＣＲ増幅断片生成量が初期鋳型ｃＤＮＡ量を反映するような条件（例えば、ＰＣＲ増幅断片が指数関数的に増加するＰＣＲサイクル数）で行う。
ＰＣＲ増幅断片の定量方法は特に限定されるものではなく、ＰＣＲ増幅断片の定量には、例えば、ラジオアイソトープ（ＲＩ）を用いた定量方法、蛍光色素を用いた定量方法等を利用することができる。
ＲＩを用いた定量方法としては、例えば、（ｉ）反応液にＲＩ標識したヌクレオチド（例えば３２Ｐ標識されたｄＣＴＰ等）を基質として加えておき、ＰＣＲ増幅断片に取り込ませてＰＣＲ増幅断片をＲＩ標識し、ＰＣＲ増幅断片を電気泳動等で分離した後、放射活性を測定してＰＣＲ増幅断片を定量する方法、（ｉｉ）ＲＩ標識したプライマーを用いることによりＰＣＲ増幅断片をＲＩ標識し、ＰＣＲ増幅断片を電気泳動等で分離した後、放射活性を測定してＰＣＲ増幅断片を定量する方法、（ｉｉｉ）ＰＣＲ増幅断片を電気泳動した後、メンブランにブロッティングし、ＲＩ標識したプローブをハイブリダイズさせ、放射活性を測定してＰＣＲ増幅断片を定量する方法等が挙げられる。放射活性は、例えば、液体シンチレーションカウンター、Ｘ線フィルム、イメージングプレート等を用いて測定することができる。
蛍光色素を用いた定量方法としては、（ｉ）二本鎖ＤＮＡにインターカレートする蛍光色素（例えば、エチジウムブロマイド（ＥｔＢｒ）、ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎＩ、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ等）を用いてＰＣＲ増幅断片を染色し、励起光の照射によって発せられる蛍光強度を測定してＰＣＲ増幅断片を定量する方法、（ｉｉ）蛍光色素で標識したプライマーを用いることによりＰＣＲ増幅断片を蛍光色素で標識し、ＰＣＲ増幅断片を電気泳動等で分離した後、蛍光強度を測定してＰＣＲ増幅断片を定量する方法等が挙げられる。蛍光強度は、例えば、ＣＣＤカメラ、蛍光スキャナー、分光蛍光光度計等を用いて測定することができる。
ＲＴ−ＰＣＲを利用する場合には、例えばＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）等の市販の装置を利用して、遺伝子増幅過程をリアルタイムでモニターリングすることにより、ＰＣＲ増幅断片のより定量的な解析を行うことができる。
ＣＡＰＮ１０遺伝子又はＩＲＳ−１遺伝子の発現レベルの測定値は、発現レベルが大きく変動しない遺伝子（例えば、β−アクチン遺伝子、ＧＡＰＤＨ遺伝子等のハウスキーピング遺伝子）の発現レベルの測定値に基づいて補正することが好ましい。
ＣＡＰＮ１０又はＩＲＳ−１の存在量の測定にあたっては、公知のタンパク質解析技術、例えば、ＣＡＰＮ１０又はＩＲＳ−１に反応し得る抗体又はその断片を利用したウェスタンブロッティング法、免疫沈降法、ＥＬＩＳＡ等を利用することができる。
ＣＡＰＮ１０又はＩＲＳ−１に反応し得る抗体には、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体のいずれもが含まれ、「その断片」には、ＣＡＰＮ１０又はＩＲＳ−１に反応し得る限り、いかなる断片も含まれる。抗体の断片としては、例えば、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ）’２断片、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）等が挙げられる。「ＣＡＰＮ１０又はＩＲＳ−１に反応し得る」には、ＣＡＰＮ１０又はＩＲＳ−１のいずれの部分と反応する場合も含まれる。ＣＡＰＮ１０又はＩＲＳ−１に反応し得る抗体又はその断片は、ＣＡＰＮ１０又はＩＲＳ−１には反応するが、白血球に含まれる他のタンパク質には反応しないことが好ましい。
ＣＡＰＮ１０又はＩＲＳ−１に反応し得る抗体は、例えば、次のようにして得ることができる。
免疫用抗原としては、ＣＡＰＮ１０又はＩＲＳ−１の一部又は全部を利用することができる。免疫用抗原としては、例えば、（ｉ）ＣＡＰＮ１０又はＩＲＳ−１を発現している細胞又は組織の破砕物又はその精製物、（ｉｉ）ＤＮＡ組換え技術を用いて、ＣＡＰＮ１０又はＩＲＳ−１をコードするｃＤＮＡ（例えば、ＣＡＰＮ１０については配列番号１、ＩＲＳ−１については配列番号２記載の塩基配列からなるｃＤＮＡ）を大腸菌、昆虫細胞又は動物細胞等の宿主に導入して発現させた組換えタンパク質、（ｉｉｉ）化学合成したペプチド等を利用することができる。
ポリクローナル抗体の作製に当たっては、まず、免疫用抗原を用いてラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ウマ、ウシ等の哺乳動物を免疫する。免疫の際には、抗体産生誘導する為に、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）、フロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）等の免疫助剤を用いてエマルジョン化した後、複数回の免疫することが好ましい。インスリンシグナル伝達制御タンパク質に対する抗体力価を測定し、抗体力価が上昇した後に採血し、抗血清を得る。
モノクローナル抗体の作製に当たっては、ポリクローナル抗体の場合と同様に免疫用抗原を用いて哺乳動物を免疫した後、抗体産生細胞を採取する。抗体産生細胞としては、例えば、脾臓細胞、リンパ節細胞、胸腺細胞、末梢血細胞等が挙げられるが、脾臓細胞が一般的に利用される。次いで、ハイブリドーマを得るために、抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合を行う。細胞融合処理後、選択培地を用いて培養し、目的とするハイブリドーマを選別する。次いで、増殖したハイブリドーマの培養上清中に、目的とする抗体が存在するか否かをスクリーニングする。次いで、限界希釈法、軟寒天法、フィブリンゲル法、蛍光励起セルソーター法等によりハイブリドーマのクローニングを行い、最終的にモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを取得する。取得したハイブリドーマからモノクローナル抗体を採取する方法としては、通常の細胞培養法等を利用できる。また、ハイブリドーマをマウス等の腹腔内に移植した後、腹水を採取し、当該腹水からモノクローナル抗体を取得することもできる。
ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体の精製が必要とされる場合には、硫酸アンモニウムによる塩析、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の方法を適宜選択して又はこれらを組み合わせて利用することができる。
ＣＡＰＮ１０又はＩＲＳ−１に反応し得る抗体又はその断片を用いて、ＣＡＰＮ１０又はＩＲＳ−１の発現量を定量する際には、例えば、放射能免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、化学発光測定法（ＣＬＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）等を利用できる。具体的には、物理吸着や化学結合等により抗体を結合させた固相担体（例えば、イムノプレート、ラテックス粒子等）を用いて、検体中のＣＡＰＮ１０又はＩＲＳ−１を捕捉した後、捕捉されたＣＡＰＮ１０又はＩＲＳ−１を、固相担体に固定化した抗体とはＣＡＰＮ１０又はＩＲＳ−１に対する抗原認識部位が異なる標識化抗体（例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等の酵素、フロレッセンス、ウンベリフェロン等の蛍光物質等で標識した抗体）を用いて定量することができる。
また、ＣＡＰＮ１０又はＩＲＳ−１の存在量の測定は、ＣＡＰＮ１０又はＩＲＳ−１の活性を測定することによって行うこともできる。ＣＡＰＮ１０又はＩＲＳ−１の活性は、例えば、ＣＡＰＮ１０又はＩＲＳ−１に反応し得る抗体又はその断片を利用したウェスタンブロッティング法、ＥＬＩＳＡ法等の公知の方法によって測定することができる。
２型糖尿病は緩徐に進行する病気であるため、高血糖、糖尿等の明らかな２型糖尿病の症状が現れる前（すなわち２型糖尿病の発症前）においても２型糖尿病が緩徐に進行している可能性がある。
本発明の２型糖尿病の診断方法では、２型糖尿病の進行に伴って、白血球におけるＣＡＰＮ１０遺伝子又はＩＲＳ−１遺伝子の発現レベルが正常発現レベルと異なる変化を示すことを利用し、被験者の血液から採取した白血球におけるＣＡＰＮ１０遺伝子又はＩＲＳ−１遺伝子の発現レベルを指標として２型糖尿病の診断を行う。すなわち、白血球におけるＣＡＰＮ１０遺伝子又はＩＲＳ−１遺伝子の発現レベルは、２型糖尿病の進行に伴って正常発現レベルよりも減少するので、被験者の白血球におけるＣＡＰＮ１０遺伝子又はＩＲＳ−１遺伝子の発現レベルが、健常者の白血球におけるＣＡＰＮ１０遺伝子又はＩＲＳ−１遺伝子の発現レベルよりも減少しているときには、被験者が将来２型糖尿病を発症する可能性がある又は被験者が現在２型糖尿病を発症している可能性があると診断することができる。本発明の２型糖尿病の診断方法において、被験者からのサンプリングが必要となる組織は血液であり、血液は他の組織に比べてサンプリングが容易であるので、２型糖尿病の診断を簡易に行うことができる。
被験者と健常者との間で、白血球におけるＣＡＰＮ１０遺伝子又はＩＲＳ−１遺伝子の発現レベルを比較する際には、複数の健常者（健常者群）の発現レベルを測定し、その値の分布から正常範囲を設定して、被験者の発現レベルが正常範囲以上になるか正常範囲以下になるかを判別することが好ましい。
健常者群は、複数の健常者を任意に選別して構成することができるが、被験者と同年齢又は同世代である健常者から構成することが好ましい。年齢差がＣＡＰＮ１０遺伝子又はＩＲＳ−１遺伝子の発現レベルに与える影響をできるだけ排除するためである。
本発明の２型糖尿病診断用キットは、被験者の血液から採取した白血球におけるＣＡＰＮ１０遺伝子又はＩＲＳ−１遺伝子の発現レベルを測定するための試薬として、ＣＡＰＮ１０又はＩＲＳ−１をコードする核酸にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド、あるいは、ＣＡＰＮ１０又はＩＲＳ−１に反応し得る抗体又はその断片を含むことを特徴とする。
本発明の２型糖尿病診断用キットを利用すれば、被験者の血液から採取した白血球におけるＣＡＰＮ１０遺伝子又はＩＲＳ−１遺伝子の発現レベルを測定することにより、２型糖尿病の診断を行うことができる。
本発明の２型糖尿病診断用キットは、上記オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド、あるいは、上記抗体又はその断片を含む限り、いかなる形態であってもよく、任意の試薬、器具等を含むことができる。
本発明の２型糖尿病診断用キットが、上記オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを含む場合には、ＰＣＲに必要な試薬（例えばＨ２Ｏ、バッファー、ＭｇＣｌ２、ｄＮＴＰミックス、Ｔａｑポリメラーゼ等）、ＰＣＲ増幅断片の定量に必要な試薬（例えばＲＩ、蛍光色素等）、ＤＮＡマイクロアレイ、ＤＮＡチップ等の１種類又は２種類以上を含むことができる。また、本発明の２型糖尿病診断用キットが、上記抗体又はその断片を含む場合には、上記抗体又はその断片を固定化するための固相担体（例えば、イムノプレート、ラテックス粒子等）、抗γ−グログリン抗体（二次抗体）、抗体（二次抗体を含む）又はその断片の標識（例えば、酵素、蛍光物質等）、各種試薬（例えば、酵素基質、緩衝液、希釈液等）等の１種類又は２種類以上を含むことができる。
本発明の２型糖尿病予防・治療効果を有する物質のスクリーニング方法は、２型糖尿病モデル動物に候補物質を投与した後、前記動物の血液から採取した白血球におけるＣＡＰＮ１０遺伝子又はＩＲＳ−１遺伝子の発現レベル改善効果を指標として、前記候補物質の２型糖尿病予防・治療効果を判定することを特徴とする。
白血球におけるＣＡＰＮ１０遺伝子又はＩＲＳ−１遺伝子の発現レベルは、２型糖尿病の進行に伴って正常発現レベルよりも減少するので、２型糖尿病モデル動物の白血球におけるＣＡＰＮ１０遺伝子又はＩＲＳ−１遺伝子の発現レベル改善効果を有する物質を選択することによって、２型糖尿病予防・治療効果を有する物質をスクリーニングすることができる。
本発明のスクリーニング方法において、２型糖尿病モデル動物からのサンプリングが必要となる組織は血液であり、血液は他の組織に比べてサンプリングが容易であるので、候補物質が糖尿病予防・治療効果を有するか否かを簡易に判定することができる。
「ＣＡＰＮ１０又はＩＲＳ−１遺伝子の発現レベル改善効果」には、ＣＡＰＮ１０又はＩＲＳ−１遺伝子の発現レベルを正常発現レベルに戻す効果及び正常発現レベルに近づける効果のいずれもが含まれ、ＣＡＰＮ１０又はＩＲＳ−１遺伝子の転写・翻訳、ＣＡＰＮ１０又はＩＲＳ−１の活性発現等のいかなるステップに対して奏される効果も含まれる。
本発明のスクリーニング方法においては、２型糖尿病モデル動物として、白血球におけるＣＡＰＮ１０遺伝子又はＩＲＳ−１遺伝子の発現レベルが正常発現レベルよりも減少している動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ等）を使用する。このような動物は、将来２型糖尿病を発症する可能性があるか又は現在糖尿病を発症している可能性がある動物である。
候補物質を投与するモデル動物としては、ＣＡＰＮ１０遺伝子又はＩＲＳ−１遺伝子の発現レベルを人為的に減少させたトランスジェニック動物を利用することもできる。トランスジェニック動物におけるＣＡＰＮ１０遺伝子又はＩＲＳ−１遺伝子の発現レベルの減少には、ＣＡＰＮ１０遺伝子又はＩＲＳ−１遺伝子の発現レベルが減少している状態、ＣＡＰＮ１０又はＩＲＳ−１の分解が亢進された状態のいずれもが含まれる。
本発明のスクリーニング方法においては、白血球におけるＣＡＰＮ１０遺伝子又はＩＲＳ−１遺伝子の発現レベルの変化が、将来又は現在における２型糖尿病発症の可能性の指標となることを利用し、２型糖尿病モデル動物に候補物質を投与した後、当該動物の血液から採取した白血球におけるＣＡＰＮ１０遺伝子又はＩＲＳ−１遺伝子の発現レベル改善効果を指標として候補物質の糖尿病予防・治療効果の判定を行う。すなわち、候補物質を投与した後の発現レベルが、正常発現レベルに戻ったか否か、又は正常発現レベルに近づいたか否かを指標として、候補物質の２型糖尿病予防・治療効果を判定し、この結果に基づいて糖尿病予防・治療効果を有する物質をスクリーニングする。正常発現レベルは、複数の健常動物の発現レベルを測定し、その値の分布から決定することが好ましい。
本発明の癌予防・治療効果を有する物質のスクリーニング用キットは、検体におけるＣＡＰＮ１０遺伝子又はＩＲＳ−１遺伝子の発現レベルを測定するための試薬として、ＣＡＰＮ１０又はＩＲＳ−１をコードする核酸にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド、あるいは、ＣＡＰＮ１０又はＩＲＳ−１に反応し得る抗体又はその断片を含むことを特徴とする。
本発明のスクリーニング用キットを利用すれば、被験者の血液から採取した白血球におけるＣＡＰＮ１０遺伝子又はＩＲＳ−１遺伝子の発現レベルを測定することにより、癌予防・治療効果を有する物質のスクリーニングを行うことができる。
本発明のスクリーニング用キットは、上記オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド、あるいは、上記抗体又はその断片を含む限り、いかなる形態であってもよく、本発明の２型糖尿病の診断用キットにおいて例示した各種試薬、器具等の他、モデル動物等を含むことができる。The type 2 diabetes diagnosis method of the present invention is characterized in that type 2 diabetes is diagnosed using the expression level of the CAPN10 gene or IRS-1 gene in leukocytes collected from the blood of a subject as an index.
The method for collecting white blood cells from the blood of the subject is not particularly limited. For example, the white blood cells can be collected by selectively lysing red blood cells in blood and then centrifuging them. Leukocytes include all of neutrophils, eosinophils, basophils, lymphocytes and monocytes, and the leukocytes used as a specimen may be one of these, or two or more It may be a mixture of
The CAPN10 gene is a gene encoding CAPN10 (Calpain 10, Calpain 10). CAPN10 is a cysteine protease expressed in a tissue non-specific manner. CAPN10 does not have the calcium binding domain that calpain normally has, but instead has a T domain (Horikawa, Y. et al., Nat Genet, 200.26 (2) p.163-75). ). The functions of CAPN10 are, for example, related to the degradation of IRS-1 (Smith, LK, et al., Biochem Biophys Res Commun, 1993.196 (2) p. 767-72) and incorporated into the A kinase system. And is involved in the differentiation of adipocytes (Patel, YM and MD Lane, Proc Natl Acad Sci USA, 1999.96 (4) p. 1279-84), hydrolyzing protein kinase C (Suzuki, K. et al., FEBS Lett, 1987.220 (2) p.271-7) and the like are known.
The IRS-1 gene is a gene encoding IRS-1 (Insulin receptor substrate-1, Insulin receptor substrate-1). IRS-1 is a protein involved in the mechanism of insulin action. That is, when insulin binds to the insulin receptor on the cell surface, various proteins including IRS-1 bound to the insulin receptor are activated one after another, and the signal is transmitted, and the transporter (GLUT4) is activated by the signal. And transports glucose from outside the cell to inside the cell.
The base sequence of the CAPN10 gene may differ between subjects depending on the polymorphism, isoform, etc., but even if the base sequence is different, it is included in the CAPN10 gene as long as it encodes CAPN10. The same applies to the IRS-1 gene.
The “CAPN10 gene expression level” includes the transcription level of the CAPN10 gene into mRNA and the translation level into protein. Similarly, “expression level of IRS-1 gene” includes the level of transcription of IRS-1 gene into mRNA and the level of translation into protein. Therefore, the expression level of the CAPN10 gene or the IRS-1 gene can be measured based on the abundance of mRNA encoding the CAPN10 or IRS-1 in the specimen, or the abundance of CAPN10 or IRS-1 in the specimen.
In measuring the abundance of mRNA encoding CAPN10 or IRS-1, a known gene analysis technique, for example, a hybridization technique (for example, Northern hybridization method, dot blot method, DNA microarray method, etc.), gene amplification technique ( For example, RT-PCR etc. can be used.
When using a hybridization technique, an oligonucleotide or polynucleotide that can hybridize to a nucleic acid encoding CAPN10 or IRS-1 can be used as a probe. When using a gene amplification technique, the oligonucleotide Nucleotides can be used as primers.
Nucleic acids encoding CAPN10 or IRS-1 include both DNA and RNA, including, for example, mRNA, cDNA, cRNA and the like. The nucleotides constituting the oligonucleotide or polynucleotide may be deoxyribonucleotides and ribonucleotides, or non-natural nucleotides. The base length of the oligonucleotide is usually 15 to 100 bases, preferably 18 to 40 bases, and the base length of the polynucleotide is usually 200 to 3000 bases, preferably 500 to 1000 bases.
The base sequence of an oligonucleotide or polynucleotide that can hybridize to a nucleic acid encoding CAPN10 or IRS-1 can be designed based on the base sequence of the CAPN10 gene or IRS-1 gene. For example, a region containing cDS is selected from cDNA encoding CAPN10 or IRS-1, and the nucleotide sequence of the oligonucleotide or polynucleotide is designed so as to hybridize to the region. In addition, it can hybridize to the 5 'end side or 3' end side region of the CDS region, or can hybridize to the region extending from the CDS region to the 5 'end side or 3' end side region. It can also be designed. The designed oligonucleotide or polynucleotide is preferably used as a primer or probe to confirm whether it hybridizes to the target nucleic acid. The base sequence of cDNA encoding human CAPN10 is shown in SEQ ID NO: 1, and the base sequence of cDNA encoding human IRS-1 is shown in SEQ ID NO: 2. Of the cDNA described in SEQ ID NO: 1, the region composed of the 24th to 2024th bases is the CDS region, and in the cDNA described in SEQ ID NO: 2, the region composed of the 1021st to 4749th bases is the CDS region. When an oligonucleotide or polynucleotide is used as a primer, a restriction enzyme recognition sequence, a tag or the like can be added to the 5 ′ end side. Moreover, when using as a probe, labels, such as a fluorescent dye and a radioisotope, can be added.
A specific method for measuring the abundance of mRNA encoding CAPN10 or IRS-1 will be described by taking RT-PCR as an example. Extract total RNA from leukocytes collected from the blood of the subject, synthesize cDNA from the extracted total RNA, and then use a primer set that can hybridize to cDNA encoding CAPN10 or IRS-1 using the synthesized cDNA as a template The amount of mRNA encoding CAPN10 or IRS-1 can be measured by performing PCR and quantifying the PCR amplified fragment. At this time, PCR is performed under conditions such that the amount of PCR amplified fragments generated reflects the amount of initial template cDNA (for example, the number of PCR cycles in which PCR amplified fragments increase exponentially).
The method for quantifying the PCR amplified fragment is not particularly limited. For quantification of the PCR amplified fragment, for example, a quantification method using a radioisotope (RI), a quantification method using a fluorescent dye, or the like can be used. .
The quantification method using RI, for example, the PCR amplified fragment the previously added as a substrate, incorporated into PCR amplified fragment (i) reaction solution RI-labeled nucleotides (such as 32 P-labeled dCTP such) RI After labeling and separating the PCR amplified fragment by electrophoresis or the like, the method of quantifying the PCR amplified fragment by measuring radioactivity, (ii) RI-labeling the PCR amplified fragment by using an RI-labeled primer, and PCR amplification After separating the fragments by electrophoresis or the like, a method of quantifying the PCR amplified fragments by measuring radioactivity, (iii) after electrophoresis of the PCR amplified fragments, blotting on a membrane, hybridizing with an RI-labeled probe, Examples thereof include a method for quantifying a PCR amplified fragment by measuring radioactivity. Radioactivity can be measured using, for example, a liquid scintillation counter, an X-ray film, an imaging plate, or the like.
As a quantification method using a fluorescent dye, (i) a fluorescent dye that intercalates with double-stranded DNA (for example, ethidium bromide (EtBr), SYBR GreenI, PicoGreen, etc.) is used to stain and amplify a PCR amplified fragment. A method for quantifying PCR amplified fragments by measuring fluorescence intensity emitted by light irradiation, (ii) PCR amplified fragments are labeled with fluorescent dyes by using primers labeled with fluorescent dyes, PCR amplified fragments are electrophoresed, etc. And a method of quantifying the PCR amplified fragment by measuring the fluorescence intensity. The fluorescence intensity can be measured using, for example, a CCD camera, a fluorescence scanner, a spectrofluorometer, or the like.
When RT-PCR is used, for example, by using a commercially available device such as ABI PRISM 7700 (Applied Biosystems), the gene amplification process is monitored in real time, thereby enabling more quantitative analysis of PCR amplified fragments. It can be performed.
The measured value of the expression level of the CAPN10 gene or the IRS-1 gene should be corrected based on the measured value of the expression level of a gene whose expression level does not vary greatly (for example, a housekeeping gene such as β-actin gene, GAPDH gene). Is preferred.
In measuring the abundance of CAPN10 or IRS-1, a known protein analysis technique, for example, Western blotting using an antibody or fragment thereof that can react with CAPN10 or IRS-1, an immunoprecipitation method, ELISA or the like is used. be able to.
The antibody capable of reacting with CAPN10 or IRS-1 includes both monoclonal antibodies and polyclonal antibodies, and the “fragment” includes any fragment as long as it can react with CAPN10 or IRS-1. Examples of antibody fragments include Fab fragments, F (ab) ′ 2 fragments, single-chain antibodies (scFv), and the like. “Can react with CAPN10 or IRS-1” includes a case where it reacts with any part of CAPN10 or IRS-1. An antibody or fragment thereof that can react with CAPN10 or IRS-1 preferably reacts with CAPN10 or IRS-1, but does not react with other proteins contained in leukocytes.
An antibody capable of reacting with CAPN10 or IRS-1 can be obtained, for example, as follows.
As an antigen for immunization, part or all of CAPN10 or IRS-1 can be used. Examples of the antigen for immunization include (i) a disrupted cell or tissue expressing CAPN10 or IRS-1, or a purified product thereof, and (ii) encoding CAPN10 or IRS-1 using DNA recombination technology. A recombinant protein obtained by introducing a cDNA to be expressed into a host such as Escherichia coli, insect cells or animal cells (for example, a cDNA comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 for CAPN10 and SEQ ID NO: 2 for IRS-1), (Iii) A chemically synthesized peptide or the like can be used.
In producing a polyclonal antibody, first, mammals such as rats, mice, guinea pigs, rabbits, sheep, horses, cows and the like are immunized using the antigen for immunization. In immunization, in order to induce antibody production, it is preferable to immunize a plurality of times after emulsification using an adjuvant such as Freund's complete adjuvant (FCA) or Freund's incomplete adjuvant (FIA). The antibody titer against the insulin signaling control protein is measured, and blood is collected after the antibody titer is increased to obtain antiserum.
In producing a monoclonal antibody, a mammal is immunized with an antigen for immunization as in the case of a polyclonal antibody, and then antibody-producing cells are collected. Examples of antibody-producing cells include spleen cells, lymph node cells, thymocytes, and peripheral blood cells, and spleen cells are generally used. Next, in order to obtain a hybridoma, cell fusion between antibody-producing cells and myeloma cells is performed. After cell fusion treatment, the cells are cultured using a selective medium, and the target hybridoma is selected. Subsequently, it is screened whether the target antibody exists in the culture supernatant of the grown hybridoma. Subsequently, the hybridoma is cloned by a limiting dilution method, a soft agar method, a fibrin gel method, a fluorescence excitation cell sorter method or the like, and finally a hybridoma that produces a monoclonal antibody is obtained. As a method for collecting a monoclonal antibody from the obtained hybridoma, a normal cell culture method or the like can be used. Further, after transplanting the hybridoma into the abdominal cavity of a mouse or the like, ascites can be collected and a monoclonal antibody can be obtained from the ascites.
When purification of a polyclonal antibody or a monoclonal antibody is required, a method such as salting out with ammonium sulfate, gel chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography, etc. may be appropriately selected or used in combination. it can.
When quantifying the expression level of CAPN10 or IRS-1 using an antibody or fragment thereof that can react with CAPN10 or IRS-1, for example, radioimmunoassay (RIA), enzyme immunoassay (EIA) Chemiluminescence assay (CLIA), fluorescence immunoassay (FIA) and the like can be used. Specifically, after capturing CAPN10 or IRS-1 in a specimen using a solid phase carrier (for example, immunoplate, latex particle, etc.) to which an antibody is bound by physical adsorption or chemical bonding, it was captured. A labeled antibody (for example, an enzyme such as peroxidase or alkaline phosphatase, florescence, umbelliferone, etc.) having a different antigen recognition site for CAPN10 or IRS-1 from an antibody in which CAPN10 or IRS-1 is immobilized on a solid support. Quantification using an antibody labeled with a fluorescent substance or the like).
The abundance of CAPN10 or IRS-1 can also be measured by measuring the activity of CAPN10 or IRS-1. The activity of CAPN10 or IRS-1 can be measured, for example, by a known method such as Western blotting or ELISA using an antibody or fragment thereof that can react with CAPN10 or IRS-1.
Since type 2 diabetes is a slowly progressing disease, type 2 diabetes is progressing slowly even before obvious symptoms of type 2 diabetes such as hyperglycemia and diabetes appear (that is, before the onset of type 2 diabetes) there is a possibility.
The method for diagnosing type 2 diabetes of the present invention utilizes the fact that the expression level of the CAPN10 gene or the IRS-1 gene in leukocytes shows a change different from the normal expression level as the type 2 diabetes progresses. Diagnosis of type 2 diabetes is performed using the expression level of the CAPN10 gene or the IRS-1 gene in the collected leukocytes as an index. That is, since the expression level of the CAPN10 gene or IRS-1 gene in leukocytes decreases from the normal expression level as type 2 diabetes progresses, the expression level of the CAPN10 gene or IRS-1 gene in leukocytes of the subject is healthy. When the expression level of the CAPN10 gene or the IRS-1 gene in the white blood cells of a person is decreased, the subject may develop type 2 diabetes in the future or the subject may currently develop type 2 diabetes. Can be diagnosed. In the method for diagnosing type 2 diabetes according to the present invention, the tissue that needs to be sampled from the subject is blood, and since blood is easier to sample than other tissues, the diagnosis of type 2 diabetes can be easily performed. Can do.
When comparing the expression level of the CAPN10 gene or IRS-1 gene in leukocytes between the test subject and the healthy person, the expression level of a plurality of healthy persons (healthy person group) is measured, and the distribution of the values is normal. It is preferable to set a range to determine whether the expression level of the subject is above the normal range or below the normal range.
The group of healthy persons can be configured by arbitrarily selecting a plurality of healthy persons, but is preferably composed of healthy persons having the same age or the same generation as the subject. This is to eliminate as much as possible the influence of the age difference on the expression level of the CAPN10 gene or the IRS-1 gene.
The kit for diagnosing type 2 diabetes of the present invention hybridizes to a nucleic acid encoding CAPN10 or IRS-1 as a reagent for measuring the expression level of the CAPN10 gene or IRS-1 gene in leukocytes collected from the blood of a subject. Characterized in that it comprises an oligonucleotide or polynucleotide obtained or an antibody or fragment thereof capable of reacting with CAPN10 or IRS-1.
If the kit for diagnosing type 2 diabetes of the present invention is used, type 2 diabetes can be diagnosed by measuring the expression level of the CAPN10 gene or IRS-1 gene in leukocytes collected from the blood of the subject.
The kit for diagnosing type 2 diabetes of the present invention may be in any form as long as it contains the above-mentioned oligonucleotide or polynucleotide, or the above-mentioned antibody or fragment thereof, and can contain any reagent, instrument, and the like.
When the kit for diagnosing type 2 diabetes of the present invention contains the above oligonucleotide or polynucleotide, reagents necessary for PCR (for example, H 2 O, buffer, MgCl 2 , dNTP mix, Taq polymerase, etc.), PCR amplified fragment One kind or two or more kinds of reagents (for example, RI, fluorescent dye, etc.), DNA microarray, DNA chip and the like necessary for quantification of the above can be contained. In addition, when the kit for diagnosing type 2 diabetes of the present invention contains the above antibody or a fragment thereof, a solid phase carrier (for example, an immunoplate, latex particles, etc.) for immobilizing the above antibody or a fragment thereof, γ-gglutin antibody (secondary antibody), label of antibody (including secondary antibody) or fragment thereof (for example, enzyme, fluorescent substance), various reagents (for example, enzyme substrate, buffer, diluent, etc.), etc. One type or two or more types can be included.
The method for screening a substance having a preventive / therapeutic effect on type 2 diabetes according to the present invention is a method for expressing a CAPN10 gene or an IRS-1 gene in leukocytes collected from blood of the animal after administering a candidate substance to a type 2 diabetes model animal. Using the improvement effect as an index, the effect of preventing or treating type 2 diabetes of the candidate substance is determined.
Since the expression level of the CAPN10 gene or IRS-1 gene in leukocytes decreases from the normal expression level as type 2 diabetes progresses, the expression level of the CAPN10 gene or IRS-1 gene in leukocytes of type 2 diabetes model animals is improved. By selecting a substance having an effect, a substance having a type 2 diabetes prevention / treatment effect can be screened.
In the screening method of the present invention, the tissue that needs to be sampled from a type 2 diabetes model animal is blood, and blood is easier to sample than other tissues, so that the candidate substance has a diabetes prevention / treatment effect. It can be easily determined whether or not.
The “CAPN10 or IRS-1 gene expression level improving effect” includes both the effect of returning the expression level of the CAPN10 or IRS-1 gene to the normal expression level and the effect of bringing the expression level close to the normal expression level. The effects exerted on any step such as transcription / translation of one gene and expression of the activity of CAPN10 or IRS-1 are also included.
In the screening method of the present invention, as a type 2 diabetes model animal, an animal in which the expression level of the CAPN10 gene or the IRS-1 gene in leukocytes is reduced from the normal expression level (eg, rat, mouse, guinea pig, rabbit, etc.). Is used. Such an animal is an animal that may develop type 2 diabetes in the future or may currently develop diabetes.
As a model animal to which the candidate substance is administered, a transgenic animal in which the expression level of the CAPN10 gene or the IRS-1 gene is artificially reduced can also be used. The decrease in the expression level of the CAPN10 gene or the IRS-1 gene in the transgenic animal includes either a state where the expression level of the CAPN10 gene or the IRS-1 gene is decreased or a state where degradation of the CAPN10 or IRS-1 is enhanced. Is also included.
In the screening method of the present invention, a change in the expression level of the CAPN10 gene or the IRS-1 gene in leukocytes is used as an indicator of the possibility of the onset of type 2 diabetes in the future or present. After the candidate substance is administered, the diabetes prevention / treatment effect of the candidate substance is determined using as an index the effect of improving the expression level of the CAPN10 gene or the IRS-1 gene in leukocytes collected from the blood of the animal. That is, whether the expression level after administration of the candidate substance has returned to the normal expression level or whether the expression level has approached the normal expression level is used as an index to determine the type 2 diabetes prevention / treatment effect of the candidate substance, Based on the results, a substance having a diabetes prevention / treatment effect is screened. The normal expression level is preferably determined from the distribution of values obtained by measuring the expression levels of a plurality of healthy animals.
The screening kit for a substance having a cancer prevention / treatment effect of the present invention hybridizes to a nucleic acid encoding CAPN10 or IRS-1 as a reagent for measuring the expression level of the CAPN10 gene or IRS-1 gene in a specimen. Characterized in that it comprises an oligonucleotide or polynucleotide obtained or an antibody or fragment thereof capable of reacting with CAPN10 or IRS-1.
If the screening kit of the present invention is used, a substance having cancer prevention / treatment effects can be screened by measuring the expression level of the CAPN10 gene or the IRS-1 gene in leukocytes collected from the blood of the subject. .
The screening kit of the present invention may be in any form as long as it contains the above-mentioned oligonucleotide or polynucleotide, or the above-mentioned antibody or fragment thereof, and various reagents exemplified in the diagnostic kit for type 2 diabetes of the present invention, In addition to instruments, model animals and the like can be included.
以下に実施例を示し、本発明について具体的に説明する。
１．ＯＬＥＴＦラットにおける糖尿病発症過程
１．１ 実験材料及び実験方法
１．１．１ 使用動物
実験動物として、大塚製薬（株）徳島研究所で系統維持されている、雄性のＯＬＥＴＦ（Ｏｔｓｕｋａ−Ｌｏｎｇ−Ｅｖａｎｓ−Ｔｏｋｕｓｈｉｍａ−Ｆａｔｔｙ）ラット及びＬＥＴＯ（Ｌｏｎｇ−Ｅｖａｎｓ−Ｔｏｋｕｓｈｉｍａ−Ｏｔｓｕｋａ）ラットを使用した。ＯＬＥＴＦラットは、２型糖尿病（インスリン非依存型糖尿病）に類似した症状を示す自然発症糖尿病モデル動物であり（Ｋａｗａｎｏ，Ｋ．ら，Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｒｅｓ Ｃｌｉｎ Ｐｒａｃｔ，１９９４．２４ Ｓｕｐｐｌ ｐ．Ｓ３１７−２０）、ＬＥＴＯラットは、糖尿病を全く発症しないコントロール動物である。このように、確実に糖尿病を発症するモデル動物と、全く糖尿病を発症しないモデル動物とを使用することにより、糖尿病の発症前及び発症後における遺伝子の発現状態を解析できるというメリットがある。ＯＬＥＴＦラット及びＬＥＴＯラットは、４週齢で大塚製薬（株）徳島研究所より供与された。
ラットは、人工照明による明暗環境下（明期７：００〜２１：００、暗期２１：００〜７：００）、一定温度（２２℃±０．５℃）、相対湿度（５８％）の動物実験室内で飼育し、固形飼料及び水を自由に摂取させた。
１．１．２ 実験手順
ＯＬＥＴＦラット及びＬＥＴＯラット（ｎ＝５〜６）において、生後５週齢より実験終了時（２４週齢）まで体重を測定した。また、サンプリングの前週に糖負荷試験を行った。
１．１．３ 糖負荷試験（Ｇｌｕｃｏｓｅ Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ Ｔｅｓｔ，ＧＴＴ）
糖負荷試験（以下「ＧＴＴ」という。）は、Ｈｏｔｔａらの方法（Ｈｏｔｔａ，Ｋ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ，１９９６．１２８９（１）ｐ．１４５−９）を使用した。
すなわち、ＯＬＥＴＦラット及びＬＥＴＯラットの糖耐能の変化をみるために、５週齢及び２３週齢の時点で、ラットを２１：００より１２時間絶食し、１ｇ／ｋｇ ＢＷのグルコース溶液を、２７Ｇシリンジを使用して腹腔内投与した。１時間後、尾静脈より採取し、血糖値を測定した。
１．１．４ 血糖値測定法
血糖値は、グルコースＢテストワコーを使用して、グルコースオキシダーゼ法により測定した（Ｔｒｉｎｄｅｒ，Ｐ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐａｔｈｏｌ，１９６９．２２（２）ｐ．１５８−６１）。
すなわち、尾静脈よりサンプリングした血液を、氷上に１５〜２０分間静置した後、４℃の条件下、１００００ｒｐｍで２分間遠心分離した。遠心上清２０μＬを生理食塩水で３倍に希釈した後、２０μＬをグルコースＢテストワコーの発色試験液１ｍＬと混合した。３７℃で１時間インキュベートした後、５０５ｎｍの吸光度を測定した。
１．１．５ 使用試薬
グルコースＢテストワコーは和光純薬（株）より購入し、グルコースその他の試薬は市販特級品を使用した。
１．１．６ 統計学的処理及び検定法
測定値は全て平均値±標準偏差で示してある。群間の比較は、Ｓｔｕｄｅｎｔ ｔ−ｔｅｓｔによる両側検定を行い、有意差を検定した。ｐ＜０．０５の値を統計学的に有意であるとみなし、ｐ＜０．０５を★で、ｐ＜０．０１を★★で示した。
１．２ 実験結果
１．２．１ ＯＬＥＴＦラット及びＬＥＴＯラットの体重変化
５週齢から２４週齢までのＯＬＥＴＦラット及びＬＥＴＯラットの体重変化を図１に示す。なお、図１中、−●−はＯＬＥＴＦラットの体重変化を示し、−〇−はＬＥＴＯラットの体重変化を示す。
図１に示すように、ＯＬＥＴＦラット及びＬＥＴＯラットの間に、５週齢の段階では有意な体重差は観察されなかったが、６週齢目から顕著な体重差が表れ始め、ＯＬＥＴＦラットの方が有意に重かった。週齢が進むに従って体重差は顕著になっていった。
１．２．２ ＯＬＥＴＦラット及びＬＥＴＯラットの耐糖能変化
ＧＴＴの結果を図２に示す。なお、図２中、■はＯＬＥＴＦラットの結果を示し、□はＬＥＴＯラットの結果を示す。
図２に示すように、ＯＬＥＴＦラット及びＬＥＴＯラットの間に、５週齢では有意な耐糖能の差は観察されず、両群の血糖値はいずれも２００ｍｇ／ｄＬを下回り、両群ともに耐糖能障害は観察されなかった。また、２３週齢になると、実験に使用した６匹のＯＬＥＴＦラットのうち、４匹の血糖値が２００ｍｇ／ｄＬを越え、ＬＥＴＯラットに比べて有意に耐糖能が悪化していた。
１．３ 考察
体重変化に関しては、６週齢より有意差が検出された。ＯＬＥＴＦラットに関する論文（Ｉｓｈｉｄａ，Ｋ．ら，Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，１９９６．４５（１０）ｐ．１２８８−９５）においても、顕著な体重差が観察されることが報告されているので、本実験において、ＯＬＥＴＦラット及びＬＥＴＯラットがともに順調に発育したものと考えられる。
ＧＴＴの結果より、５週齢の耐糖能は、ＯＬＥＴＦラット及びＬＥＴＯラットの間でそれほど変わらないが、２３週齢においては、ＯＬＥＴＦラットの耐糖能が顕著に悪化していた。１ｇ／ｋｇ ＢＷグルコースを腹腔内投与した場合、１時間後の血糖値が２００ｍｇ／ｄＬを越えていれば、糖尿病の症状であると考えられるので、本実験では、２３週齢において６匹のＯＬＥＴＦラットのうち４匹が糖尿病の症状を示したこととなる。
体重変化及びＧＴＴの結果より、ＯＬＥＴＦラットが週齢を経るに従い、顕著にＬＥＴＯラットと異なる発育を示し、糖尿病の症状を示すことが確かめられた。
２．ＯＬＥＴＦラットにおける糖尿病関連遺伝子の発現解析
２．１ 実験材料及び実験方法
２．１．１ 使用動物
前章で耐糖能を測定したＯＬＥＴＦラット及びＬＥＴＯラットを次の週（６週齢及び２４週齢）に使用した。特に、２４週齢のＯＬＥＴＦラットは、１ｇ／ｋｇＢＷグルコース投与後、１時間後の血糖値が２００ｍｇ／ｄＬ以上であった個体を使用した。
２．１．２ 実験手順
ＯＬＥＴＦラット及びＬＥＴＯラットを６週齢（非糖尿病状態）、２４週齢（糖尿病状態）で２１：００より１２時間絶食させた後、全血液をサンプリングし、脱血後、肝臓及び筋肉をサンプリングした。血液（白血球）、肝臓及び筋肉よりＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲ法により、インスリンレセプター（Ｉｎｓｕｌｉｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ、以下「ＩＲ」という）、ＳＨ２含有イノシトール−５−ホスファターゼ（ＳＨ２−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｉｎｏｓｉｔｏｌ−５−ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ、以下「ＳＨＩＰ２」という）、ペルオキシソーム増殖剤応答性受容体（Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ γ、以下「ＰＰＡＲγ」という）、カルパイン１０（Ｃａｌｐａｉｎ１０、以下「ＣＡＰＮ１０」という）、インスリンレセプター基質−１（Ｉｎｓｕｌｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ−１、以下「ＩＲＳ−１」という）の白血球、肝臓及び筋肉における、ＯＬＥＴＦラットとＬＥＴＯラットとの発現量の相対的な違いについて解析した。
２．１．３ 血液、肝臓及び筋肉のサンプリング
ＯＬＥＴＦラット及びＬＥＴＯラットを６週齢（非糖尿病状態）、２４週齢（糖尿病状態）に２１：００より１２時間絶食させた。体重測定後、ラットをエーテルガスにより麻酔して開腹し、腹部大静脈よりヘパリンナトリウム（１０００Ｕ／ｍＬ）を、２７Ｇシリンジを使用して注入した。この時、ラット全血量を体重の１３分の１と仮定し、添付文章に基づき、必要なヘパリンナトリウムの量を概算し、概算値の２倍量のヘパリンナトリウムを注入した。
注入後、予め０．５％ＥＤＴＡ／生理食塩水溶液を０．５ｍＬ分取しておいたファルコンチューブを大動脈の下にあてがい、大動脈を切断して採血した。得られた血液サンプルは、すぐに白血球からのＲＮＡ抽出操作を行った。同時に門脈より生理食塩水を灌流させ、肝臓及び筋肉を脱血した後に摘出した。肝臓及び筋肉は摘出後、速やかに液体窒素に浸し、−８０℃で保存した。
２．１．４ 白血球からのＲＮＡ抽出
２．１．３で得た血液サンプルからのＲＮＡ抽出は、ＱＩＡＧＥＮ社のＱＩＡａｍｐ ＲＮＡ Ｂｌｏｏｄ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔｓを使用してスピンカラム法により行った。同キットに添付されているプロトコールに沿ってＲＮＡを抽出した後、ＤＥＰＣ水に溶解させ、核酸濃度及び純度を測定し、−８０℃でストックした。
なお、６週齢の時点で、ＲＮＡ水溶液中にＤＮＡがキャリーオーバーしていることが分かったので、２４週齢時のＲＮＡ抽出は、ＱＩＡＧＥＮ ＲＮａｓｅ−Ｆｒｅｅ Ｄｎａｓｅ Ｄｉｇｅｓｔ Ｓｅｔを併用して行った。
２．１．５ 肝臓及び筋肉からのＲＮＡ抽出
２．１．３で得た肝臓及び筋肉ストックに液体窒素をかけながら、ハンマーで砕いた。液体窒素をかけた乳鉢に移し、液体窒素をかけながらすりつぶした。粉末状にした肝臓及び筋肉サンプルより、インビトロジェンのＴＲＩＺＯＬ Ｒｅａｇｅｎｔを使用して、同試薬に添付されているプロトコールに従い、ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡはＤＥＰＣ水に溶解させ、核酸濃度及び純度を測定し、−８０℃ストックした。
２．１．６ 一本鎖ｃＤＮＡの合成
ｔｏｔａｌ ＲＮＡ １μｇにｏｌｉｇｏ（ｄＴ）１２−１８ ｐｒｉｍｅｒ（５００μｇ／ｍＬ）を０．２μｇ加え、０．１％ＤＥＰＣ水で１１．５μＬとし、７０℃で１０分間、熱変性後、氷中に静置した。その後、Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｂｕｆｆｅｒ［５０ｍＭ ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３），７５ｍＭ ＫＣｌ，３ｍＭ ＭｇＣｌ２］、１０ｍＭ ＤＴＴ、ｄＮＴＰｓ（各０．５ｍＭ）、ＲＮａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（２０Ｕ）、及びＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ ＩＩ ＲＮａｓｅ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（１００Ｕ）を加え、全量を２０μＬとし、４２℃で６０分間反応させた。その後、９４℃で５分間、インキュベートして反応を停止させ、ｃＤＮＡ試料とした。なお、ｃＤＮＡ試料は−２０℃で保存した。
２．１．７ プライマーの設定
Ｇｅｎｅ Ｂａｎｋより、ＩＲ［Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ，Ｂ．Ｊ．ａｎｄ Ａ．Ｌ．Ｄｕｄｌｅｙ，Ｍｏｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ，１９９０．４（２）ｐ．２３５−４４］、ＳＨＩＰ２［Ｋｕｄｏ，Ｍ．ら，Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ Ｍｏｌ Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ，２０００．７５（１）ｐ．１７２−７］、ＰＰＡＲγ［Ｇｕａｒｄｉｏｌａ−Ｄｉａｚ，Ｈ．Ｍ．ら，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，１９９９．２７４（３３）ｐ．２３３６８−７７］、ＣＡＰＮ１０［Ｍａ，Ｈ．ら，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２００１．２７６（３０）ｐ．２８５２５−３１］、ＩＲＳ−１［Ｎａｔｕｒｅ １９９１ Ｊｕｌ ４；３５２（６３３０）ｐ．７３−７］、Ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ ３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＧＡＰＤＨ）［Ｔｓｏ，Ｊ．Ｙ．ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，１９８５．１３（７）ｐ．２４８５−５０２］のラットのｃＤＮＡ配列を抽出し、次のプライマーを設計した。
・プライマーセット１（ＩＲ用）
［ＰＣＲ産物の長さ：４０５ｂｐ，アニーリング温度：５６．４℃］
Ｕｐｐｅｒ，２０ｍｅｒ，５’ｐｏｓｉｔｉｏｎ：３６０１
［ＰＣＲ産物の長さ：３１８ｂｐ，アニーリング温度：５６．５℃］
Ｕｐｐｅｒ，２０ｍｅｒ，５’ｐｏｓｉｔｉｏｎ：２７８７
［ＰＣＲ産物の長さ：４８４ｂｐ，アニーリング温度：５５．０℃］
Ｕｐｐｅｒ，２０ｍｅｒ，５’ｐｏｓｉｔｉｏｎ：７５６
［ＰＣＲ産物の長さ：１３６ｂｐ，アニーリング温度：６０℃］
Ｕｐｐｅｒ，２０ｍｅｒ，５’ｐｏｓｉｔｉｏｎ：２８２
［ＰＣＲ産物の長さ：２９３ｂｐ，アニーリング温度：６０℃］
Ｕｐｐｅｒ，２０ｍｅｒ，５’ｐｏｓｉｔｉｏｎ：１４２６
［ＰＣＲ産物の長さ：２９６ｂｐ，アニーリング温度：５８．９℃］
Ｕｐｐｅｒ，２０ｍｅｒ，５’ｐｏｓｉｔｉｏｎ：６２８
ＧＡＰＤＨを内部標準としてＲｅａｌ−ｔｉｍｅ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ法を行うことにより、各遺伝子のｍＲＮＡ量を定量した。ｃＤＮＡ試料４μＬ、付属の酵素バッファー２５μＬ、センス及びアンチセンスプライマー各１μＬ（各６μＭ）及び滅菌精製水１６μＬからＰＣＲ反応液を調製し、最終容量を５０μＬとした。ＰＣＲはＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００を用いて次のサイクルで行った。９５℃で１５秒間の熱変性、６７℃で５秒間のアニーリング及び７２℃で１０秒間の増幅を５０サイクル行い、全てのサンプルは２回測定した。データは標準曲線法を用いて算出し、ＧＡＰＤＨとの相対量として表した。
２．１．９ 統計学的処理及び検定法
測定値は全て平均値±標準偏差で示してある。群間の比較は、Ｓｔｕｄｅｎｔｔ−ｔｅｓｔによる両側検定を行い、有意差を検定した。ｐ＜０．０５の値を統計学的に有意であるとみなし、ｐ＜０．０５を★で、ｐ＜０．０１を★★で示した。
２．２ 実験結果
２．２．１ ＯＬＥＴＦラット及びＬＥＴＯラットのｍＲＮＡ発現相対量
（ｉ）ＩＲのｍＲＮＡ発現相対量
６週齢及び２４週齢のＯＬＥＴＦラット及びＬＥＴＯラットの白血球、肝臓及び筋肉におけるＩＲのｍＲＮＡ発現相対量（％）を表１に示す。また、白血球におけるＩＲのｍＲＮＡ発現相対量（％）を図３Ａに示す。なお、図３Ａ中、■はＯＬＥＴＦラットの結果を示し、□はＬＥＴＯラットの結果を示す。
したがって、将来２型糖尿病を発症する動物であっても、２型糖尿病の発症前における白血球、肝臓及び筋肉のＩＲのｍＲＮＡ発現量は健常動物と有意差はないと考えられる。また、２型糖尿病を発症している動物において、白血球及び筋肉のＩＲのｍＲＮＡ発現量は健常動物と有意差はないと考えられるが、肝臓のＩＲのｍＲＮＡ発現量は健常動物よりも有意に減少していると考えられる。
（ｉｉ）ＳＨＩＰ２のｍＲＮＡ発現相対量
６週齢及び２４週齢のＯＬＥＴＦラット及びＬＥＴＯラットの白血球及び肝臓におけるＳＨＩＰ２のｍＲＮＡ発現相対量（％）を表２に示す。なお、筋肉におけるＳＨＩＰ２のｍＲＮＡ発現量は僅かであるため解析不能であった。また、白血球におけるＳＨＩＰ２のｍＲＮＡ発現相対量（％）を図３Ｂに示す。なお、図３Ｂ中、■はＯＬＥＴＦラットの結果を示し、□はＬＥＴＯラットの結果を示す。
したがって、将来２型糖尿病を発症する可能性がある動物であっても、２型糖尿病の発症前における白血球及び肝臓のＳＨＩＰ２のｍＲＮＡ発現量は健常動物と有意差はないと考えられる。また、２型糖尿病を発症しいている動物における白血球及び肝臓のＳＨＩＰ２のｍＲＮＡ発現量は健常動物と有意差はないと考えられる。
（ｉｉｉ）ＰＰＡＲγのｍＲＮＡ発現相対量
６週齢及び２４週齢のＯＬＥＴＦラット及びＬＥＴＯラットの白血球、肝臓及び筋肉におけるＰＰＡＲγのｍＲＮＡ発現相対量（％）を表３に示す。また、白血球におけるＰＰＡＲγのｍＲＮＡ発現相対量（％）を図３Ｃに示す。なお、図３Ｃ中、■はＯＬＥＴＦラットの結果を示し、□はＬＥＴＯラットの結果を示す。
したがって、将来２型糖尿病を発症する動物であっても、２型糖尿病の発症前における白血球、肝臓及び筋肉のＰＰＡＲγのｍＲＮＡ発現量は健常動物と有意差はないと考えられる。また、２型糖尿病を発症している動物において、白血球及び肝臓のＰＰＡＲγのｍＲＮＡ発現量は健常動物と有意差はないと考えられるが、筋肉のＰＰＡＲγのｍＲＮＡ発現量は健常動物よりも有意に減少していると考えられる。
（ｉｖ）ＣＡＰＮ１０のｍＲＮＡ発現相対量
６週齢及び２４週齢のＯＬＥＴＦラット及びＬＥＴＯラットの白血球、肝臓及び筋肉におけるＣＡＰＮ１０のｍＲＮＡ発現相対量（％）を表４に示す。また、白血球におけるＣＡＰＮ１０のｍＲＮＡ発現相対量（％）を図３Ｄに示す。なお、図３Ｄ中、■はＯＬＥＴＦラットの結果を示し、□はＬＥＴＯラットの結果を示す。
したがって、将来２型糖尿病を発症する動物において、２型糖尿病の発症前における肝臓及び筋肉のＣＡＰＮ１０のｍＲＮＡ発現量は健常動物と有意差はないと考えられるが、２型糖尿病の発症前における白血球のＣＡＰＮ１０のｍＲＮＡ発現量は健常動物よりも有意に減少していると考えられる。また、２型糖尿病を発症している動物において、白血球、肝臓及び筋肉のＣＡＰＮ１０のｍＲＮＡ発現量は健常動物よりも有意に減少していると考えられる。
（ｖ）ＩＲＳ−１のｍＲＮＡ発現相対量
６週齢及び２４週齢のＯＬＥＴＦラット及びＬＥＴＯラットの白血球、肝臓及び筋肉におけるＩＲＳ−１のｍＲＮＡ発現相対量（％）を表５に示す。また、白血球におけるＣＡＰＮ１０のｍＲＮＡ発現相対量（％）を図３Ｅに示す。なお、図３Ｅ中、■はＯＬＥＴＦラットの結果を示し、□はＬＥＴＯラットの結果を示す。
したがって、将来２型糖尿病を発症する動物において、２型糖尿病の発症前における肝臓及び筋肉のＩＲＳ−１のｍＲＮＡ発現量は健常動物と有意差はないと考えられるが、２型糖尿病の発症前における白血球のＩＲＳ−１のｍＲＮＡ発現量は健常動物よりも有意に減少していると考えられる。また、２型糖尿病を発症している動物において、肝臓及び筋肉のＩＲＳ−１のｍＲＮＡ発現量は健常動物と有意差がないと考えられるが、白血球のＩＲＳ−１のｍＲＮＡ発現量は健常動物よりも有意に減少していると考えられる。
２．２．２ 遺伝子発現変化のまとめ
将来２型糖尿病を発症する動物（ＯＬＥＴＦラット）において、糖尿病の発症前（６週齢）及び発症後（２４週齢）のいずれの時点においても、白血球のＣＡＰＮ１０及びＩＲＳ−１のｍＲＮＡ発現量が健常動物（ＬＥＴＯラット）よりも減少していたことから、糖尿病の進行に伴って、白血球のＣＡＰＮ１０遺伝子及びＩＲＳ−１遺伝子の発現レベルが正常発現レベルよりも減少することが判明した。
したがって、白血球におけるＣＡＰＮ１０遺伝子及びＩＲＳ−１遺伝子の発現レベルを指標とすることにより、糖尿病の診断を行うことができると考えられる。すなわち、白血球におけるＣＡＰＮ１０遺伝子及びＩＲＳ−１遺伝子の発現レベルが正常発現レベルよりも減少しているときには、将来糖尿病を発症する可能性があるか、あるいは、現在糖尿病を発症している可能性があると診断できると考えられる。Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to examples.
1. Diabetes Onset Process in OLETF Rats 1.1 Experimental Materials and Methods 1.1.1 Animals Used Male OLETF (Otsuka-Long-Evans-) maintained as a test animal at the Tokushima Research Institute, Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. Tokushima-Fatty) rats and LETO (Long-Evans-Tokushima-Otsuka) rats were used. The OLETF rat is a spontaneous diabetes model animal showing symptoms similar to type 2 diabetes (non-insulin-dependent diabetes) (Kawano, K. et al., Diabetes Res Clin Pract, 1994.24 Suppl p. S317-20), LETO rats are control animals that do not develop diabetes at all. Thus, by using a model animal that surely develops diabetes and a model animal that does not develop diabetes at all, there is an advantage that the expression state of the gene before and after the onset of diabetes can be analyzed. OLETF rats and LETO rats were provided by Totsushima Research Institute, Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. at 4 weeks of age.
Rats are light and dark under artificial lighting (light period 7:00 to 21:00, dark period 21: 00 to 7:00), at a constant temperature (22 ° C. ± 0.5 ° C.) and relative humidity (58%). They were raised in an animal laboratory and allowed to freely feed solid feed and water.
1.1.2 Experimental Procedure In OLETF rats and LETO rats (n = 5 to 6), body weight was measured from the age of 5 weeks to the end of the experiment (24 weeks of age). In addition, a glucose tolerance test was performed the week before sampling.
1.1.3 Glucose Tolerance Test (GTT)
For the glucose tolerance test (hereinafter referred to as “GTT”), the method of Hotta et al. (Hota, K. et al., Biochem Biophys Acta, 1996. 1289 (1) p. 145-9) was used.
That is, in order to see the change in glucose tolerance of OLETF rats and LETO rats, the rats were fasted for 12 hours from 21:00 at 5 weeks of age and 23 weeks of age, and a glucose solution of 1 g / kg BW was added to 27 G It was administered intraperitoneally using a syringe. One hour later, it was collected from the tail vein and the blood glucose level was measured.
1.1.4 Blood glucose level measurement method Blood glucose level was measured by glucose oxidase method using Glucose B Test Wako (Trinder, P., J Clin Pathol, 1969.22 (2) p.158-61). .
That is, blood sampled from the tail vein was allowed to stand on ice for 15 to 20 minutes, and then centrifuged at 10000 rpm for 2 minutes at 4 ° C. After 20 μL of the centrifugal supernatant was diluted 3 times with physiological saline, 20 μL was mixed with 1 mL of a color development test solution of glucose B test Wako. After 1 hour incubation at 37 ° C., the absorbance at 505 nm was measured.
1.1.5 Used reagents Glucose B Test Wako was purchased from Wako Pure Chemical Industries, Ltd., and commercially available special grades were used for glucose and other reagents.
1.1.6 Statistical processing and test method All measured values are shown as mean ± standard deviation. For comparison between groups, a two-sided test by Student t-test was performed, and a significant difference was tested. A value of p <0.05 was considered statistically significant, p <0.05 was indicated by ★, and p <0.01 was indicated by ★★.
1.2 Experimental Results 1.2.1 Weight Changes of OLETF Rats and LETO Rats Weight changes of OLETF rats and LETO rats from 5 to 24 weeks of age are shown in FIG. In FIG. 1,-●-indicates a change in body weight of the OLETF rat, and-◯-indicates a change in body weight of the LETO rat.
As shown in FIG. 1, no significant difference in body weight was observed between the OLETF and LETO rats at the age of 5 weeks, but a significant difference in body weight began to appear at the age of 6 weeks. Was significantly heavy. The difference in body weight became more prominent as the age of the week progressed.
1.2.2 Change in glucose tolerance of OLETF and LETO rats The results of GTT are shown in FIG. In FIG. 2, ▪ indicates the result of the OLETF rat, and □ indicates the result of the LETO rat.
As shown in FIG. 2, no significant difference in glucose tolerance was observed between OLETF rats and LETO rats at the age of 5 weeks, and both groups had glucose levels below 200 mg / dL, and both groups had glucose tolerance. No impairment was observed. Further, at the age of 23 weeks, among 6 OLETF rats used in the experiment, the blood glucose level of 4 animals exceeded 200 mg / dL, and glucose tolerance was significantly deteriorated as compared with LETO rats.
1.3 Discussion Regarding the change in body weight, a significant difference was detected from the age of 6 weeks. In a paper on OLETF rats (Ishida, K., et al., Metabolism, 1996.45 (10) p. 1288-95), it is reported that a significant difference in body weight is observed. And LETO rats are considered to have developed smoothly.
From the results of GTT, the glucose tolerance at 5 weeks of age did not change much between OLETF rats and LETO rats, but at 23 weeks of age, the glucose tolerance of OLETF rats was significantly deteriorated. When 1 g / kg BW glucose is administered intraperitoneally, if the blood glucose level after 1 hour exceeds 200 mg / dL, it is considered to be a symptom of diabetes. Therefore, in this experiment, 6 OLETF were obtained at 23 weeks of age. Four of the rats showed symptoms of diabetes.
From the results of changes in body weight and GTT, it was confirmed that the OLETF rats showed markedly different development from the LETO rats as they passed through the age of the week, and showed symptoms of diabetes.
2. Expression analysis of diabetes-related genes in OLETF rats 2.1 Experimental materials and methods 2.1.1 Animals used The OLETF rats and LETO rats whose glucose tolerance was measured in the previous chapter were placed in the next week (6 weeks old and 24 weeks old). used. In particular, 24-week-old OLETF rats used individuals whose blood glucose level was 200 mg / dL or more 1 hour after administration of 1 g / kg BW glucose.
2.1.2 Experimental procedure OLETF rats and LETO rats were fasted at 2 weeks from 21:00 at 6 weeks of age (non-diabetic state) and 24 weeks of age (diabetic state), then whole blood was sampled and after blood removal The liver and muscle were sampled. Blood (white blood cells), RNA was extracted from liver and muscle meat, by RT-PCR method, insulin receptor (Insulin Receptor, hereinafter referred to as "IR"), SH2-containing inositol-5-phosphatase (SH2-containing inositol-5- phosphatase , Hereinafter referred to as “SHIP2”), peroxisome proliferator-activated receptor γ (hereinafter referred to as “PPARγ”), calpain 10 (Calpain 10, hereinafter referred to as “CAPN10”), insulin receptor substrate-1 (Insulin receptor) OLETF Lat in leukocytes, liver and muscle of substrate 1 (hereinafter referred to as “IRS-1”). It was analyzed for the relative differences expression of the LETO rats and.
2.1.3 Sampling of blood, liver and muscle OLETF rats and LETO rats were fasted for 12 hours from 21:00 to 6 weeks of age (non-diabetic state) and 24 weeks of age (diabetic state). After the body weight measurement, the rat was anesthetized with ether gas and opened, and heparin sodium (1000 U / mL) was injected from the abdominal vena cava using a 27G syringe. At this time, the amount of rat whole blood was assumed to be 1/13 of the body weight, the amount of sodium heparin required was estimated based on the accompanying text, and heparin sodium twice the estimated value was injected.
After the injection, 0.5 mL of a 0.5% EDTA / physiological saline solution in advance was placed under the aorta, and the aorta was cut to collect blood. The obtained blood sample was immediately subjected to RNA extraction from white blood cells. At the same time, physiological saline was perfused from the portal vein, and the liver and muscles were removed from the blood and extracted. Livers and muscles were immediately immersed in liquid nitrogen after storage and stored at -80 ° C.
2.1.4 RNA extraction from leukocytes RNA extraction from the blood sample obtained in 2.1.3 was performed by the spin column method using QIAAMP RNA Blood Mini Kits manufactured by QIAGEN. RNA was extracted according to the protocol attached to the kit, dissolved in DEPC water, the nucleic acid concentration and purity were measured, and stocked at -80 ° C.
Since it was found that DNA carried over in the RNA aqueous solution at the age of 6 weeks, RNA extraction at the age of 24 weeks was performed using QIAGEN RNase-Free DNA Digest Set together.
2.1.5 RNA extraction from liver and muscle The liver and muscle stock obtained in 2.1.3 was crushed with a hammer while applying liquid nitrogen. It was transferred to a mortar with liquid nitrogen and ground with liquid nitrogen. RNA was extracted from powdered liver and muscle samples using Invitrogen's TRIZOL Reagent according to the protocol attached to the reagent. RNA was dissolved in DEPC water, nucleic acid concentration and purity were measured, and stocked at −80 ° C.
2.1.6 Synthesis of single-stranded cDNA 0.2 μg of oligo (dT) 12-18 primer (500 μg / mL) is added to 1 μg of total RNA, and 11.5 μL of 0.1% DEPC water is added. After heat denaturation for 1 minute, it was left to stand in ice. Then, First-Strand Buffer [50 mM tris-HCl (pH 8.3), 75 mM KCl, 3 mM MgCl 2 ], 10 mM DTT, dNTPs (0.5 mM each), RNase inhibitor (20 U), and SUPERSCRIPT II RNase ReverseTrump ) Was added to make a total volume of 20 μL and reacted at 42 ° C. for 60 minutes. Thereafter, the reaction was stopped by incubation at 94 ° C. for 5 minutes to obtain a cDNA sample. The cDNA sample was stored at -20 ° C.
2.1.7 Primer setting From Gene Bank, IR [Goldstein, B .; J. et al. and A. L. Dudley, Mol Endocrinol, 1990.4 (2) p. 235-44], SHIP2 [Kudo, M .; Brain Res Mol Brain Res, 2000.75 (1) p. 172-7], PPARγ [Guardola-Diaz, H .; M.M. Et al., J Biol Chem, 1999.274 (33) p. 23368-77], CAPN10 [Ma, H. et al. Et al., J Biol Chem, 2001.276 (30) p. 28525-31], IRS-1 [Nature 1991 Jul 4; 352 (6330) p. 73-7], Glyceraldehydrate 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) [Tso, J. et al. Y. Et al., Nucleic Acids Res, 1985.13 (7) p. 2485-502] rat cDNA sequence was extracted, and the following primers were designed.
・ Primer set 1 (for IR)
[PCR product length: 405 bp, annealing temperature: 56.4 ° C.]
Upper, 20mer, 5'position: 3601
[Length of PCR product: 318 bp, annealing temperature: 56.5 ° C.]
Upper, 20mer, 5'position: 2787
[Length of PCR product: 484 bp, annealing temperature: 55.0 ° C.]
Upper, 20mer, 5'position: 756
[PCR product length: 136 bp, annealing temperature: 60 ° C.]
Upper, 20mer, 5'position: 282
[Length of PCR product: 293 bp, annealing temperature: 60 ° C.]
Upper, 20mer, 5'position: 1426
[PCR product length: 296 bp, annealing temperature: 58.9 ° C.]
Upper, 20mer, 5'position: 628
The amount of mRNA of each gene was quantified by performing Real-time SYBR Green PCR using GAPDH as an internal standard. A PCR reaction solution was prepared from 4 μL of cDNA sample, 25 μL of the attached enzyme buffer, 1 μL each of sense and antisense primers (6 μM each) and 16 μL of sterilized purified water, and the final volume was 50 μL. PCR was performed in the next cycle using ABI PRISM 7700. 50 cycles of heat denaturation at 95 ° C. for 15 seconds, annealing at 67 ° C. for 5 seconds, and amplification at 72 ° C. for 10 seconds were performed, and all samples were measured twice. Data was calculated using the standard curve method and expressed as a relative amount to GAPDH.
2.1.9 Statistical processing and test method All measured values are shown as mean ± standard deviation. For comparison between groups, a two-sided test by Student-test was performed, and a significant difference was tested. A value of p <0.05 was considered statistically significant, p <0.05 was indicated by ★, and p <0.01 was indicated by ★★.
2.2 Experimental results 2.2.1 Relative mRNA expression in OLETF and LETO rats (i) Relative mRNA expression in IR IR in leukocytes, liver and muscle of 6-week-old and 24-week-old OLETF and LETO rats Table 1 shows the relative amount (%) of mRNA expression. FIG. 3A shows the relative amount (%) of IR mRNA expression in leukocytes. In FIG. 3A, ▪ indicates the result of the OLETF rat, and □ indicates the result of the LETO rat.
Therefore, even in animals that will develop type 2 diabetes in the future, it is considered that there is no significant difference in the amount of IR mRNA expression of leukocytes, liver and muscle before the onset of type 2 diabetes from healthy animals. In animals with type 2 diabetes, white blood cell and muscle IR mRNA expression levels are not significantly different from those in healthy animals, but liver IR mRNA expression levels are significantly lower than in healthy animals. it seems to do.
(Ii) SHIP2 mRNA expression relative amount The SHIP2 mRNA expression relative amount (%) in leukocytes and livers of 6-week-old and 24-week-old OLETF rats and LETO rats is shown in Table 2. It should be noted that the expression level of SHIP2 mRNA in muscle was so small that it could not be analyzed. Moreover, the relative expression level (%) of SHIP2 mRNA in leukocytes is shown in FIG. 3B. In FIG. 3B, ▪ indicates the result of the OLETF rat, and □ indicates the result of the LETO rat.
Therefore, even in animals that may develop type 2 diabetes in the future, the expression levels of leukocyte and liver SHIP2 mRNA before the onset of type 2 diabetes are not significantly different from those of healthy animals. Moreover, it is considered that the expression level of SHIP2 mRNA in leukocytes and liver in animals that have developed type 2 diabetes is not significantly different from that in healthy animals.
(Iii) PPARγ mRNA expression relative amount PPARγ mRNA expression relative amount (%) in leukocytes, liver and muscle of 6-week-old and 24-week-old OLETF rats and LETO rats is shown in Table 3. Moreover, the relative expression level (%) of PPARγ mRNA in leukocytes is shown in FIG. 3C. In FIG. 3C, ▪ indicates the result of the OLETF rat, and □ indicates the result of the LETO rat.
Therefore, even in animals that will develop type 2 diabetes in the future, the expression level of PPARγ mRNA in leukocytes, liver and muscle before the onset of type 2 diabetes is considered to be not significantly different from that of healthy animals. In animals with type 2 diabetes, leukocyte and liver PPARγ mRNA expression levels are not significantly different from those in healthy animals, but muscle PPARγ mRNA expression levels are significantly lower than in healthy animals. it seems to do.
(Iv) Relative expression level of CAPN10 mRNA The relative expression level (%) of CAPN10 mRNA in leukocytes, liver and muscle of 6-week-old and 24-week-old OLETF rats and LETO rats is shown in Table 4. In addition, the relative amount (%) of CAPN10 mRNA expression in leukocytes is shown in FIG. 3D. In FIG. 3D, ▪ represents the result of the OLETF rat, and □ represents the result of the LETO rat.
Therefore, in animals that will develop type 2 diabetes in the future, it is considered that the mRNA expression levels of CAPN10 in liver and muscle before the onset of type 2 diabetes are not significantly different from those in healthy animals. It is thought that the mRNA expression level of CAPN10 is significantly decreased as compared with healthy animals. Moreover, it is considered that the amount of CAPN10 mRNA expression in leukocytes, liver and muscle is significantly decreased in animals that have developed type 2 diabetes than in healthy animals.
(V) IRS-1 mRNA expression relative amount Table 5 shows the relative amount (%) of IRS-1 mRNA expression in leukocytes, liver and muscle of 6-week-old and 24-week-old OLETF rats and LETO rats. Further, the relative amount (%) of CAPN10 mRNA expression in leukocytes is shown in FIG. 3E. In FIG. 3E, ▪ represents the result of the OLETF rat, and □ represents the result of the LETO rat.
Therefore, in animals that will develop type 2 diabetes in the future, IRS-1 mRNA expression levels in liver and muscle before the onset of type 2 diabetes are considered to be not significantly different from those in healthy animals, but before the onset of type 2 diabetes. It is considered that the amount of IRS-1 mRNA expression in leukocytes is significantly reduced as compared with that in healthy animals. Moreover, in animals that develop type 2 diabetes, it is considered that the IRS-1 mRNA expression level in liver and muscle is not significantly different from that in healthy animals, but the IRS-1 mRNA expression level in leukocytes is higher than that in healthy animals. Is also considered to be significantly reduced.
2.2.2 Summary of changes in gene expression In animals that will develop type 2 diabetes in the future (OLETF rats), leukocyte counts at any time before the onset of diabetes (6 weeks old) and after the onset (24 weeks of age) Since the mRNA expression levels of CAPN10 and IRS-1 were lower than those of healthy animals (LETO rats), the expression levels of the CAPN10 gene and IRS-1 gene in leukocytes were higher than the normal expression level as diabetes progressed It turned out to decrease.
Therefore, it is considered that diabetes can be diagnosed by using the expression levels of the CAPN10 gene and the IRS-1 gene in leukocytes as an index. That is, when the expression levels of the CAPN10 gene and the IRS-1 gene in leukocytes are lower than the normal expression level, there is a possibility of developing diabetes in the future, or there is a possibility of developing diabetes at present. Can be diagnosed.
本発明によれば、第一に、サンプリングな容易な組織における遺伝子の発現解析によって２型糖尿病を診断できる（特に２型糖尿病の発症前において、将来２型糖尿病を発症する可能性があるか否かを診断でき、２型糖尿病の早期発見を可能とする）、２型糖尿病の診断方法及び診断用キットが提供される。また、本発明によれば、第二に、サンプリングが容易な組織における遺伝子の発現解析によって２型糖尿病予防・治療効果を有する物質をスクリーニングすることができる、２型糖尿病予防・治療効果を有する物質のスクリーニング方法及びスクリーニング用キットが提供される。 According to the present invention, first, type 2 diabetes can be diagnosed by gene expression analysis in an easily sampled tissue (particularly whether or not there is a possibility of developing type 2 diabetes in the future before the onset of type 2 diabetes). A method for diagnosing type 2 diabetes and a diagnostic kit are provided. In addition, according to the present invention, secondly, a substance having a type 2 diabetes prevention / treatment effect capable of screening a substance having a type 2 diabetes prevention / treatment effect by gene expression analysis in an easily sampled tissue Screening methods and screening kits are provided.
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