JP7250452B2 - 分解活性の評価方法 - Google Patents
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Description
本開示は、分解活性の評価方法に関する。
二酸化炭素排出削減を目的として、ケナフ繊維を自動車等の部品の材料として用いることが行われている。ケナフから繊維を取り出す際に、繊維同士を架橋するペクチンを微生物で分解している。従って、ペクチンの分解に関わる微生物又は酵素を探索することは有用である。
この例は、ケナフに関するものであるが、種々の有機物の分解に関わる微生物又は酵素を探索することは様々な分野において有用である。
ところで、有用な微生物又は酵素を探索するためには、微生物又は酵素の分解活性を比較することが必要となる。
分解活性を比較するために、従来は、例えば、多検体プレート（特許文献１参照）の各ウエルに微生物を入れて分解活性を評価している。例えば、１００～１６００個／枚のウエルに微生物と活性評価溶液を入れて、色素等を用いて分解量を検出していた。
この例は、ケナフに関するものであるが、種々の有機物の分解に関わる微生物又は酵素を探索することは様々な分野において有用である。
ところで、有用な微生物又は酵素を探索するためには、微生物又は酵素の分解活性を比較することが必要となる。
分解活性を比較するために、従来は、例えば、多検体プレート（特許文献１参照）の各ウエルに微生物を入れて分解活性を評価している。例えば、１００～１６００個／枚のウエルに微生物と活性評価溶液を入れて、色素等を用いて分解量を検出していた。
しかし、従来の方法は、検出感度が必ずしも十分でなく、新規な分解活性の評価方法が求められていた。
本発明は、上記実情に鑑みてなされたものであり、良好な検出感度を有する分解活性の評価方法を提供することを目的とする。本発明は、以下の形態として実現することが可能である。
本発明は、上記実情に鑑みてなされたものであり、良好な検出感度を有する分解活性の評価方法を提供することを目的とする。本発明は、以下の形態として実現することが可能である。
〔１〕透明な支持板と、
前記支持板の一面上に形成され、分解評価物を含有する固体培地と、
を備える分解活性評価用の板状体を用いた分解活性の評価方法であって、
前記固体培地の厚みが２００μｍ以上１０ｍｍ以下であり、
微生物又は酵素を配置した基板の上に前記固体培地が被さるように、前記基板に前記板状体を載せて、前記固体培地と、前記微生物又は前記酵素とを接触させる接触工程と、
前記接触工程の後の前記板状体を第１温度にて保温する第１保温工程と、
前記第１保温工程の後の前記板状体を前記第１温度よりも低い第２温度で保温することによって、前記固体培地のうち、未分解の前記分解評価物が存在する部位を白濁化させる第２保温工程と、
前記第２保温工程の後に、前記固体培地の状態を観測して、前記微生物又は前記酵素の分解活性を評価する評価工程と、を備える分解活性の評価方法。
前記支持板の一面上に形成され、分解評価物を含有する固体培地と、
を備える分解活性評価用の板状体を用いた分解活性の評価方法であって、
前記固体培地の厚みが２００μｍ以上１０ｍｍ以下であり、
微生物又は酵素を配置した基板の上に前記固体培地が被さるように、前記基板に前記板状体を載せて、前記固体培地と、前記微生物又は前記酵素とを接触させる接触工程と、
前記接触工程の後の前記板状体を第１温度にて保温する第１保温工程と、
前記第１保温工程の後の前記板状体を前記第１温度よりも低い第２温度で保温することによって、前記固体培地のうち、未分解の前記分解評価物が存在する部位を白濁化させる第２保温工程と、
前記第２保温工程の後に、前記固体培地の状態を観測して、前記微生物又は前記酵素の分解活性を評価する評価工程と、を備える分解活性の評価方法。
〔２〕前記固体培地の状態は、前記板状体の前記支持板の側から、前記支持板を通して観察する、〔１〕に記載の分解活性の評価方法。
〔３〕前記分解評価物が高分子化合物である、〔１〕又は〔２〕に記載の分解活性の評価方法。
〔４〕透明な支持板と、
前記支持板の一面上に形成され、分解評価物を含有する固体培地と、
を備える分解活性評価用の板状体を用いた分解活性の評価方法であって、
前記固体培地の厚みが２００μｍ以上１０ｍｍ以下であり、
微生物を磁性化して磁性化微生物とする磁性化工程と、
基板の上に前記磁性化微生物を含有する液体を保持した状態で、前記基板の裏面側から前記基板の複数箇所に磁力をかけて、前記基板の前記複数箇所に前記磁性化微生物を引きつけて配置する配置工程と、
前記配置工程の後に、前記液体を除去する液体除去工程と、
前記磁性化微生物を配置した前記基板の上に前記固体培地が被さるように、前記基板に前記板状体を載せて、前記固体培地と、前記磁性化微生物とを接触させる接触工程と、
前記接触工程の後の前記板状体を第１温度にて保温する第１保温工程と、
前記第１保温工程の後の前記板状体を前記第１温度よりも低い第２温度で保温することによって、前記固体培地のうち、未分解の前記分解評価物が存在する部位を白濁化させる第２保温工程と、
前記第２保温工程の後に、前記固体培地の状態を観測して、前記磁性化微生物の分解活性を評価する評価工程と、を備える分解活性の評価方法。
前記支持板の一面上に形成され、分解評価物を含有する固体培地と、
を備える分解活性評価用の板状体を用いた分解活性の評価方法であって、
前記固体培地の厚みが２００μｍ以上１０ｍｍ以下であり、
微生物を磁性化して磁性化微生物とする磁性化工程と、
基板の上に前記磁性化微生物を含有する液体を保持した状態で、前記基板の裏面側から前記基板の複数箇所に磁力をかけて、前記基板の前記複数箇所に前記磁性化微生物を引きつけて配置する配置工程と、
前記配置工程の後に、前記液体を除去する液体除去工程と、
前記磁性化微生物を配置した前記基板の上に前記固体培地が被さるように、前記基板に前記板状体を載せて、前記固体培地と、前記磁性化微生物とを接触させる接触工程と、
前記接触工程の後の前記板状体を第１温度にて保温する第１保温工程と、
前記第１保温工程の後の前記板状体を前記第１温度よりも低い第２温度で保温することによって、前記固体培地のうち、未分解の前記分解評価物が存在する部位を白濁化させる第２保温工程と、
前記第２保温工程の後に、前記固体培地の状態を観測して、前記磁性化微生物の分解活性を評価する評価工程と、を備える分解活性の評価方法。
〔５〕前記固体培地の状態は、前記板状体の前記支持板の側から、前記支持板を通して観察する、〔４〕に記載の分解活性の評価方法。
〔６〕前記分解評価物が高分子化合物である、〔４〕又は〔５〕に記載の分解活性の評価方法。
〔１〕の分解活性の評価方法によれば、良好な検出感度で、分解活性を評価できる。
すなわち、本発明では、第２保温工程で、未分解の分解評価物が存在する部位を白濁化させる。他方、この工程を経ても、分解された分解評価物が存在する部位は、透明である。よって、透明な部分の大きさ等により、分解活性が評価できる。そして、本発明では、固体培地の厚みが２００μｍ以上であるから、第１保温工程において、固体培地が乾燥によって不本意に白濁化することを抑制できる。また、本発明では、固体培地の厚みが１０ｍｍ以下であるから、良好な検出感度となる。固体培地の厚みが１０ｍｍよりも大きくなると、分解された分解評価物が存在する透明な部位の検出が難しくなる傾向にある。
また、〔２〕の発明では、固体培地の状態は、板状体の支持板の側から、支持板を通して観察している。この場合には、固体培地の支持板に密接した平面を観察することになるから、固体培地の観察面が平坦化されて、観察しやすい。
また、〔３〕の発明に示される、分解評価物として高分子化合物を用いる場合に、本発明は特に有効である。
また、〔４〕の分解活性の評価方法によれば、基板の複数箇所に磁性化微生物を引きつけて配置し、複数の箇所において一括して、分解活性の評価が行えるから、分解活性の評価が容易である。なお、微生物として複数種の微生物を用いて、基板の複数箇所における微生物の種類が異なるように配置すれば、一度に複数種の微生物の分解活性の評価が行えるから非常に有用である。
〔４〕の分解活性の評価方法によれば、〔１〕の評価方法と同様に、良好な検出感度で、分解活性を評価できる。すなわち、本発明では、第２保温工程で、未分解の分解評価物が存在する部位を白濁化させる。他方、この工程を経ても、分解された分解評価物が存在する部位は、透明である。よって、透明な部分の大きさ等により、分解活性が評価できる。そして、本発明では、固体培地の厚みが２００μｍ以上であるから、第１保温工程において、固体培地が乾燥によって不本意に白濁化することを抑制できる。また、本発明では、固体培地の厚みが１０ｍｍ以下であるから、良好な検出感度となる。固体培地の厚みが１０ｍｍよりも大きくなると、分解された分解評価物が存在する透明な部位の検出が難しくなる傾向にある。
また、〔５〕の発明では、固体培地の状態は、板状体の支持板の側から、支持板を通して観察している。この場合には、固体培地の支持板に密接した平面を観察することになるから、固体培地の観察面が平坦化されて、観察しやすい。
また、〔６〕の発明に示される、分解評価物として高分子化合物を用いる場合に、本発明は特に有効である。
すなわち、本発明では、第２保温工程で、未分解の分解評価物が存在する部位を白濁化させる。他方、この工程を経ても、分解された分解評価物が存在する部位は、透明である。よって、透明な部分の大きさ等により、分解活性が評価できる。そして、本発明では、固体培地の厚みが２００μｍ以上であるから、第１保温工程において、固体培地が乾燥によって不本意に白濁化することを抑制できる。また、本発明では、固体培地の厚みが１０ｍｍ以下であるから、良好な検出感度となる。固体培地の厚みが１０ｍｍよりも大きくなると、分解された分解評価物が存在する透明な部位の検出が難しくなる傾向にある。
また、〔２〕の発明では、固体培地の状態は、板状体の支持板の側から、支持板を通して観察している。この場合には、固体培地の支持板に密接した平面を観察することになるから、固体培地の観察面が平坦化されて、観察しやすい。
また、〔３〕の発明に示される、分解評価物として高分子化合物を用いる場合に、本発明は特に有効である。
また、〔４〕の分解活性の評価方法によれば、基板の複数箇所に磁性化微生物を引きつけて配置し、複数の箇所において一括して、分解活性の評価が行えるから、分解活性の評価が容易である。なお、微生物として複数種の微生物を用いて、基板の複数箇所における微生物の種類が異なるように配置すれば、一度に複数種の微生物の分解活性の評価が行えるから非常に有用である。
〔４〕の分解活性の評価方法によれば、〔１〕の評価方法と同様に、良好な検出感度で、分解活性を評価できる。すなわち、本発明では、第２保温工程で、未分解の分解評価物が存在する部位を白濁化させる。他方、この工程を経ても、分解された分解評価物が存在する部位は、透明である。よって、透明な部分の大きさ等により、分解活性が評価できる。そして、本発明では、固体培地の厚みが２００μｍ以上であるから、第１保温工程において、固体培地が乾燥によって不本意に白濁化することを抑制できる。また、本発明では、固体培地の厚みが１０ｍｍ以下であるから、良好な検出感度となる。固体培地の厚みが１０ｍｍよりも大きくなると、分解された分解評価物が存在する透明な部位の検出が難しくなる傾向にある。
また、〔５〕の発明では、固体培地の状態は、板状体の支持板の側から、支持板を通して観察している。この場合には、固体培地の支持板に密接した平面を観察することになるから、固体培地の観察面が平坦化されて、観察しやすい。
また、〔６〕の発明に示される、分解評価物として高分子化合物を用いる場合に、本発明は特に有効である。
本発明について、本発明による典型的な実施形態の非限定的な例を挙げ、言及された複数の図面を参照しつつ以下の詳細な記述にて更に説明する。
分解活性評価用の板状体の一例を示す説明図（断面図）である。
第１実施形態の分解活性の評価方法の接触工程を示す説明図（断面図）である。
第１実施形態の分解活性の評価方法の接触工程を示す説明図（断面図）である。但し、上の図では、板状体は斜視図で示されている。
第１実施形態の分解活性の評価方法の第１保温工程を示す説明図（断面図）である。
第１実施形態の分解活性の評価方法の第２保温工程を示す説明図（断面図）である。
第２実施形態の分解活性の評価方法の配置工程を示す説明図（断面図）である。
第２実施形態の分解活性の評価方法の配置工程を示す説明図（断面図）である。
第２実施形態の分解活性の評価方法の液体除去工程を示す説明図（断面図）である。
第２実施形態の分解活性の評価方法の接触工程を示す説明図（断面図）である。但し、上の図では、板状体は斜視図で示されている。
第２実施形態の分解活性の評価方法の第１保温工程を示す説明図（断面図）である。
第２実施形態の分解活性の評価方法の第２保温工程を示す説明図（断面図）である。
作製直後の評価用基板（分解活性評価用の板状体）の様子を示す写真である。
４０℃で保温後の評価用基板の様子を示す写真である。
４℃で保温後の評価用基板の様子を示す写真である。
４０℃で保温後に４℃で冷却した後の評価用基板の様子を示す写真である。
各厚みの固体培地における、酵素活性量とハロー面積の相関を示すグラフである。
培養３時間後の評価用基板（分解活性評価用の板状体）の様子を示す図である。上図は、光学顕微鏡による観察像である。下図は、画像処理後の画像である。
培養６時間後の評価用基板（分解活性評価用の板状体）の様子を示す図である。上図は、光学顕微鏡による観察像である。下図は、画像処理後の画像である。
培養９時間後の評価用基板（分解活性評価用の板状体）の様子を示す図である。上図は、光学顕微鏡による観察像である。下図は、画像処理後の画像である。
培養１２時間後の評価用基板（分解活性評価用の板状体）の様子を示す図である。上図は、光学顕微鏡による観察像である。下図は、画像処理後の画像である。
培養１８時間後の評価用基板（分解活性評価用の板状体）の様子を示す図である。上図は、光学顕微鏡による観察像である。下図は、画像処理後の画像である。
従来例の固体培地の一例を示す説明図（断面図）である。
以下、本発明を詳しく説明する。なお、本明細書において、数値範囲について「～」を用いた記載では、特に断りがない限り、下限値及び上限値を含むものとする。例えば、「１０～２０」という記載では、下限値である「１０」、上限値である「２０」のいずれも含むものとする。すなわち、「１０～２０」は、「１０以上２０以下」と同じ意味である。
１．第１実施形態の分解活性の評価方法
第１実施形態の分解活性の評価方法は、分解活性評価用の板状体１を用いた評価方法である。
第１実施形態の分解活性の評価方法は、分解活性評価用の板状体１を用いた評価方法である。
（１）分解活性評価用の板状体１
分解活性評価用の板状体１は、図１に例示されるように、透明な支持板３と、支持板３の一面上に形成され、分解評価物を含有する固体培地５と、を備える。
分解活性評価用の板状体１は、図１に例示されるように、透明な支持板３と、支持板３の一面上に形成され、分解評価物を含有する固体培地５と、を備える。
（１．１）透明な支持板３
透明な支持板３を構成する材料は、特に限定されない。例えば、無機系材料、有機系材料を幅広く用いることができる。
無機系材料としては、例えば、ガラスを用いることができる。ガラスとしては、例えば、硼珪酸ガラス、石英ガラス、９６％石英ガラス、ソーダ石灰ガラス、アルミノ硼珪酸ガラス、アルミノ珪酸ガラス、鉛ガラス等を用いることができる。
後述するように、固体培地５の状態を、板状体１の支持板３の側から、支持板３を通して観察する場合には、透明性が高くて観察しやすいとの観点から、ガラスが好ましく用いられる。
有機系材料としては、例えば、ポリメチルメタクリレート等のアクリル系ポリマー、ポリエチレンテレフタレートやポリエチレンナフタレート等のポリエステル系ポリマー、ジアセチルセルロースやトリアセチルセルロース等のセルロース系ポリマー、ポリスチレンやアクリロニトリル・スチレン共重合体（ＡＳ樹脂）等のスチレン系ポリマー、ポリカーボネート系ポリマーを用いることができる。また、ポリエチレン、ポリプロピレン等のポリオレフィン、エチレン・プロピレン共重合体等のポリオレフィン系ポリマー、塩化ビニル系ポリマー、ナイロンや芳香族ポリアミド等のアミド系ポリマー、イミド系ポリマー、スルホン系ポリマー、ポリエーテルスルホン系ポリマー、ポリエーテルエーテルケトン系ポリマー、ポリフェニレンスルフィド系ポリマー、ビニルアルコール系ポリマー、塩化ビニリデン系ポリマー、ビニルブチラール系ポリマー、アリレート系ポリマー、ポリオキシメチレン系ポリマー、エポキシ系ポリマー、及びこれらのポリマーの任意のブレンド物等も用いることができる。
なお、無機系材料と有機系材料のハイブリッド材料も用いることができる。
透明な支持板３を構成する材料は、特に限定されない。例えば、無機系材料、有機系材料を幅広く用いることができる。
無機系材料としては、例えば、ガラスを用いることができる。ガラスとしては、例えば、硼珪酸ガラス、石英ガラス、９６％石英ガラス、ソーダ石灰ガラス、アルミノ硼珪酸ガラス、アルミノ珪酸ガラス、鉛ガラス等を用いることができる。
後述するように、固体培地５の状態を、板状体１の支持板３の側から、支持板３を通して観察する場合には、透明性が高くて観察しやすいとの観点から、ガラスが好ましく用いられる。
有機系材料としては、例えば、ポリメチルメタクリレート等のアクリル系ポリマー、ポリエチレンテレフタレートやポリエチレンナフタレート等のポリエステル系ポリマー、ジアセチルセルロースやトリアセチルセルロース等のセルロース系ポリマー、ポリスチレンやアクリロニトリル・スチレン共重合体（ＡＳ樹脂）等のスチレン系ポリマー、ポリカーボネート系ポリマーを用いることができる。また、ポリエチレン、ポリプロピレン等のポリオレフィン、エチレン・プロピレン共重合体等のポリオレフィン系ポリマー、塩化ビニル系ポリマー、ナイロンや芳香族ポリアミド等のアミド系ポリマー、イミド系ポリマー、スルホン系ポリマー、ポリエーテルスルホン系ポリマー、ポリエーテルエーテルケトン系ポリマー、ポリフェニレンスルフィド系ポリマー、ビニルアルコール系ポリマー、塩化ビニリデン系ポリマー、ビニルブチラール系ポリマー、アリレート系ポリマー、ポリオキシメチレン系ポリマー、エポキシ系ポリマー、及びこれらのポリマーの任意のブレンド物等も用いることができる。
なお、無機系材料と有機系材料のハイブリッド材料も用いることができる。
支持板３の厚みは、特に限定されない。板状体１の強度を確保しつつ、支持板３の透明性を担保するという観点から、０．０１ｍｍ～３ｍｍが好ましく、０．０５ｍｍ～０．５ｍｍがより好ましく、０．１ｍｍ～０．２ｍｍが更に好ましい。
（１．２）固体培地５
以下の説明において、固体培地５の各成分の濃度が示されているが、いずれの成分についても、固体培地１Ｌに含有されている各成分のグラム（ｇ）数が示されている。
例えば、成分Ａを１ｇ含み、成分Ｂを２ｇ含み、成分Ｃを３ｇ含み、かつ、その他の成分を含んで、成分Ａ、成分Ｂ、成分Ｃ、及びその他の成分（水等）の合計した全体が１Ｌの固体培地５の場合には、「成分Ａの濃度が１ｇ／Ｌ」、「成分Ｂの濃度が２ｇ／Ｌ」、「成分Ｃの濃度が３ｇ／Ｌ」となる。
以下の説明において、固体培地５の各成分の濃度が示されているが、いずれの成分についても、固体培地１Ｌに含有されている各成分のグラム（ｇ）数が示されている。
例えば、成分Ａを１ｇ含み、成分Ｂを２ｇ含み、成分Ｃを３ｇ含み、かつ、その他の成分を含んで、成分Ａ、成分Ｂ、成分Ｃ、及びその他の成分（水等）の合計した全体が１Ｌの固体培地５の場合には、「成分Ａの濃度が１ｇ／Ｌ」、「成分Ｂの濃度が２ｇ／Ｌ」、「成分Ｃの濃度が３ｇ／Ｌ」となる。
分解評価物（基質）は、特に限定されない。分解評価物として、例えば、ペクチン、セルロース、アルギン酸、コラーゲン、ケラチン等の高分子化合物を好適に例示できる。
固体培地５中の分解評価物の濃度は、特に限定されない。分解評価物の濃度は、好ましくは０．０１ｇ／Ｌ～１００ｇ／Ｌ、より好ましくは０．１ｇ／Ｌ～５０ｇ／Ｌ、更に好ましくは１０ｇ／Ｌ～４０ｇ／Ｌである。この範囲内であると、未分解の分解評価物が冷却により白濁化されやすく、容易に評価できる。
固体培地５中の分解評価物の濃度は、特に限定されない。分解評価物の濃度は、好ましくは０．０１ｇ／Ｌ～１００ｇ／Ｌ、より好ましくは０．１ｇ／Ｌ～５０ｇ／Ｌ、更に好ましくは１０ｇ／Ｌ～４０ｇ／Ｌである。この範囲内であると、未分解の分解評価物が冷却により白濁化されやすく、容易に評価できる。
固体培地５は、固形化剤を使用して固化されている。固形化剤は、特に限定されない。固形化剤として、例えば、寒天、ゲランガム、アガロース、ゲルライト、ゼラチン、及びカラギーナンからなる群より選ばれた１種以上を好適に例示できる。固体培地５中の固形化剤の濃度は、特に限定されない。固形化剤の濃度は、固体培地５の厚みを後述する特定範囲内にし易いという観点から、好ましくは０．１ｇ／Ｌ～２００ｇ／Ｌであり、より好ましくは１ｇ／Ｌ～１００ｇ／Ｌであり、更に好ましくは１０ｇ／Ｌ～５０ｇ／Ｌである。なお、ここで、固形化剤の濃度は、固形化剤を２種以上含む場合は、合計の濃度を意味する。
固体培地５は、ｐＨ調整剤を含有していることが好ましい。ｐＨ調整剤は、特に限定されないが、炭酸ナトリウムなどの炭酸塩、水酸化ナトリウム、塩酸を好適に使用できる。炭酸ナトリウムを用いる場合には、この濃度は、好ましくは１ｇ／Ｌ～３０ｇ／Ｌであり、より好ましくは５ｇ／Ｌ～２０ｇ／Ｌであり、更に好ましくは８ｇ／Ｌ～１５ｇ／Ｌである。炭酸ナトリウムの濃度を、この範囲内とすると、第１温度よりも低い第２温度で保温して、未分解の分解評価物を白濁化させることが容易になり、分解活性の評価が容易となる。
固体培地５には、微生物の生育に必要な成分が含まれていてもよい。この成分は特に限定されない。例えば、固体培地５は、硫酸マグネシウム七水和物を含有していることが好ましい。硫酸マグネシウム七水和物の濃度は、好ましくは０．０１ｇ／Ｌ～５ｇ／Ｌであり、より好ましくは０．０５ｇ／Ｌ～１ｇ／Ｌであり、更に好ましくは０．１ｇ／Ｌ～０．５ｇ／Ｌである。
固体培地５は、硫酸マンガン五水和物を含有していることが好ましい。硫酸マンガン五水和物の濃度は、好ましくは０．０１ｇ／Ｌ～１ｇ／Ｌであり、より好ましくは０．０２ｇ／Ｌ～０．０８ｇ／Ｌであり、更に好ましくは０．０３ｇ／Ｌ～０．０７ｇ／Ｌである。
固体培地５は、塩化カルシウム二水和物を含有していることが好ましい。塩化カルシウム二水和物の濃度は、好ましくは０．０１ｇ／Ｌ～１ｇ／Ｌであり、より好ましくは０．０２ｇ／Ｌ～０．０８ｇ／Ｌであり、更に好ましくは０．０３ｇ／Ｌ～０．０７ｇ／Ｌである。
固体培地５は、ペプトン（ｐｏｌｙ ｐｅｐｔｏｎ）を含有していることが好ましい。ペプトンの濃度は、好ましくは０．５ｇ／Ｌ～２０ｇ／Ｌであり、より好ましくは１ｇ／Ｌ～１０ｇ／Ｌであり、更に好ましくは２ｇ／Ｌ～８ｇ／Ｌである。
固体培地５は、リン酸水素二カリウムを含有していることが好ましい。リン酸水素二カリウムの濃度は、好ましくは０．２ｇ／Ｌ～２ｇ／Ｌであり、より好ましくは０．５ｇ／Ｌ～１．５ｇ／Ｌであり、更に好ましくは０．８ｇ／Ｌ～１．２ｇ／Ｌである。
固体培地５のｐＨは、特に限定されない。固体培地５のｐＨは、好ましくは９～１１であり、より好ましくは９．８～１０．７である。この範囲内であると、未分解の分解評価物が冷却により白濁化されやすく、容易に評価できる。低すぎるｐＨでは、白濁化しにくい傾向にあり、他方、高すぎるｐＨでは、室温（２０℃）でも白濁化する可能性がある。
固体培地５のｐＨは、固体培地５に含まれる各種化合物の配合割合によって調整できる。
なお、本明細書において、固体培地５のｐＨは、固形化剤を除く全成分を添加した培地のｐＨを意味する。
固体培地５のｐＨは、固体培地５に含まれる各種化合物の配合割合によって調整できる。
なお、本明細書において、固体培地５のｐＨは、固形化剤を除く全成分を添加した培地のｐＨを意味する。
固体培地５の厚みは、２００μｍ以上１０ｍｍ以下であり、好ましくは２００μｍ以上７ｍｍ以下であり、より好ましくは２００μｍ以上５ｍｍ以下である。
固体培地５の厚みをこの範囲内とすると、固体培地５の乾燥による白濁化を防止できる。なお、固体培地５が薄すぎると、固体培地５の取扱いが難しくなる。例えば、２枚の支持板（カバーグラス等）にスペーサーを挟んで隙間を作り、その隙間に培地を流し込み固化した場合には、使用に際して片方の支持板を外す必要があるが、この際に、固体培地５が薄すぎると、固体培地５が著しく崩れやすくなる。
また、固体培地５の厚みをこの範囲内とすると、次の作用効果が得られる。
第２保温工程を経ても透明な部位は、微生物又は酵素を配置した場所を中心として、放射状に広がっていく。この場合に、固体培地５が厚すぎると、透明な部位は、固体培地５の水平方向（平面方向）のみならず、厚み方向にも広がってしまう。すると、厚み方向に広がった分だけ、水平方向への広がりは小さくなる。
ところで、分解活性の評価は、分解された分解評価物が存在する透明な部分の状態で評価する。この評価においては、透明な部分の水平方向の広がり（大きさ）での評価の方が、厚み方向の広がりでの評価よりも容易である。なぜならば、透明な部分の水平方向の広がりは、固体培地５の上面又は下面を観察すれば、容易に把握できるが、厚み方向での広がりは、固体培地５の側面から観察せざるを得なくなり、容易には把握できないからである。
固体培地５が厚すぎると、上述のように、厚み方向に広がった分だけ、水平方向の広がりが現れにくくなり、その結果、分解活性の評価感度が低下する。
これに対して、本発明では、固体培地５の厚みの上限が規定されている。よって、透明な部分は、厚み方向にはそれ程広がらず、主に固体培地５の水平方向に広がるから、分解活性の評価感度が向上する。
また、本発明では、厚い固体培地５を用いるよりも、透明な部分の水平方向の広がり方が早いから、分解活性を迅速に評価できる。
固体培地５の厚みをこの範囲内とすると、固体培地５の乾燥による白濁化を防止できる。なお、固体培地５が薄すぎると、固体培地５の取扱いが難しくなる。例えば、２枚の支持板（カバーグラス等）にスペーサーを挟んで隙間を作り、その隙間に培地を流し込み固化した場合には、使用に際して片方の支持板を外す必要があるが、この際に、固体培地５が薄すぎると、固体培地５が著しく崩れやすくなる。
また、固体培地５の厚みをこの範囲内とすると、次の作用効果が得られる。
第２保温工程を経ても透明な部位は、微生物又は酵素を配置した場所を中心として、放射状に広がっていく。この場合に、固体培地５が厚すぎると、透明な部位は、固体培地５の水平方向（平面方向）のみならず、厚み方向にも広がってしまう。すると、厚み方向に広がった分だけ、水平方向への広がりは小さくなる。
ところで、分解活性の評価は、分解された分解評価物が存在する透明な部分の状態で評価する。この評価においては、透明な部分の水平方向の広がり（大きさ）での評価の方が、厚み方向の広がりでの評価よりも容易である。なぜならば、透明な部分の水平方向の広がりは、固体培地５の上面又は下面を観察すれば、容易に把握できるが、厚み方向での広がりは、固体培地５の側面から観察せざるを得なくなり、容易には把握できないからである。
固体培地５が厚すぎると、上述のように、厚み方向に広がった分だけ、水平方向の広がりが現れにくくなり、その結果、分解活性の評価感度が低下する。
これに対して、本発明では、固体培地５の厚みの上限が規定されている。よって、透明な部分は、厚み方向にはそれ程広がらず、主に固体培地５の水平方向に広がるから、分解活性の評価感度が向上する。
また、本発明では、厚い固体培地５を用いるよりも、透明な部分の水平方向の広がり方が早いから、分解活性を迅速に評価できる。
（２）分解活性の評価方法
分解活性の評価方法は、接触工程、第１保温工程、第２保温工程、評価工程を備えている。
以下、各工程ついて詳細に説明する。
分解活性の評価方法は、接触工程、第１保温工程、第２保温工程、評価工程を備えている。
以下、各工程ついて詳細に説明する。
（２．１）接触工程
接触工程は、微生物又は酵素を配置した基板９の上に固体培地５が被さるように、板状体１を載せて、固体培地５と、微生物又は酵素とを接触させる工程である。
接触工程は、微生物又は酵素を配置した基板９の上に固体培地５が被さるように、板状体１を載せて、固体培地５と、微生物又は酵素とを接触させる工程である。
（２．１．１）微生物又は酵素
微生物又は酵素（以下「微生物等７」ともいう）は、分解活性の評価対象であり、幅広い微生物又は酵素に適用することができる。
微生物又は酵素（以下「微生物等７」ともいう）は、分解活性の評価対象であり、幅広い微生物又は酵素に適用することができる。
（２．１．２）接触工程の詳細
図２に例示するように、微生物等７を上面に配置した基板９を用意する。図２では、基板９としてシャーレの底壁を用いているが、基板９は特に限定されず、適宜変更できる。
次に、図３に示すように、基板９の上から、固体培地５を被せるようにして板状体１を配して、固体培地５と、微生物等７とを接触させる。このようにすると、固体培地５の上面は、支持板３によって覆われた状態となるから、固体培地５の乾燥が抑制される。厚みが薄い固体培地５の場合には、支持板３による乾燥抑制効果が高い。これを図２２を参照して、説明する。図２２の上図は、固体培地５がシャーレ本体部３１の底部に形成されている従来例を示している。図２２の下図は、この固体培地５の乾燥を防ぐために、シャーレ本体部３１に蓋３３を被せた状態を示している。しかし、図２２の下図の場合でも、固体培地５の片面（上面）は気体３５に触れた状態であるから、乾燥しやすいのである。これに対して、図３の下図の場合、固体培地５は、基板９と支持板３との間に挟まれた状態となり、気体との接触が抑えられて、乾燥しにくいのである。なお、固体培地５の側部からの乾燥を防ぐために、固体培地５の側部にワセリン等の乾燥防止剤を塗布してもよい。
図２に例示するように、微生物等７を上面に配置した基板９を用意する。図２では、基板９としてシャーレの底壁を用いているが、基板９は特に限定されず、適宜変更できる。
次に、図３に示すように、基板９の上から、固体培地５を被せるようにして板状体１を配して、固体培地５と、微生物等７とを接触させる。このようにすると、固体培地５の上面は、支持板３によって覆われた状態となるから、固体培地５の乾燥が抑制される。厚みが薄い固体培地５の場合には、支持板３による乾燥抑制効果が高い。これを図２２を参照して、説明する。図２２の上図は、固体培地５がシャーレ本体部３１の底部に形成されている従来例を示している。図２２の下図は、この固体培地５の乾燥を防ぐために、シャーレ本体部３１に蓋３３を被せた状態を示している。しかし、図２２の下図の場合でも、固体培地５の片面（上面）は気体３５に触れた状態であるから、乾燥しやすいのである。これに対して、図３の下図の場合、固体培地５は、基板９と支持板３との間に挟まれた状態となり、気体との接触が抑えられて、乾燥しにくいのである。なお、固体培地５の側部からの乾燥を防ぐために、固体培地５の側部にワセリン等の乾燥防止剤を塗布してもよい。
（２．２）第１保温工程
第１保温工程は、接触工程の後の板状体１を第１温度にて保温する工程である。この工程後でも、固体培地５の全体は透明であり、前工程（接触工程）後の固体培地５と同様である。つまり、図４の固体培地５の状態は、外見上、図３（下図）の固体培地５と同じである。
第１温度は、特に限定されないが、好ましくは２０℃～４５℃であり、より好ましくは３５～４０℃である。第１温度が、この範囲内であると、分解評価物の分解を促進でき、分解活性の評価が容易になる。
第１保温工程の時間は、特に限定されず、微生物等７の種類に応じて適宜変更できる。第１保温工程の時間は、好ましくは０．５時間～２４時間であり、より好ましくは１時間～１８時間である。
第１保温工程は、接触工程の後の板状体１を第１温度にて保温する工程である。この工程後でも、固体培地５の全体は透明であり、前工程（接触工程）後の固体培地５と同様である。つまり、図４の固体培地５の状態は、外見上、図３（下図）の固体培地５と同じである。
第１温度は、特に限定されないが、好ましくは２０℃～４５℃であり、より好ましくは３５～４０℃である。第１温度が、この範囲内であると、分解評価物の分解を促進でき、分解活性の評価が容易になる。
第１保温工程の時間は、特に限定されず、微生物等７の種類に応じて適宜変更できる。第１保温工程の時間は、好ましくは０．５時間～２４時間であり、より好ましくは１時間～１８時間である。
（２．３）第２保温工程
第２保温工程は、第１保温工程の後の板状体１を第１温度よりも低い第２温度で保温することによって、固体培地５のうち、未分解の分解評価物が存在する部位５Ａを白濁化させる工程である。図５に、第２保温工程後の固体培地５の様子を示す。図５では、白濁化した部分を点描で表現している。
なお、第２保温工程後においても、固体培地５のうち、分解評価物が分解された部位５Ｂは白濁化せずに、透明である。第２保温工程後は、分解評価物が未分解の部位５Ａは白濁状態となり、基質が分解された部位５Ｂは透明状態となる。
第２温度は、第１温度よりも低ければ、特に限定されないが、好ましくは０℃～１５℃であり、より好ましくは３℃～７℃である。第２温度が、この範囲であると、未分解の分解評価物が白濁化されやすく、評価が容易になる。
第２保温工程は、第１保温工程の後の板状体１を第１温度よりも低い第２温度で保温することによって、固体培地５のうち、未分解の分解評価物が存在する部位５Ａを白濁化させる工程である。図５に、第２保温工程後の固体培地５の様子を示す。図５では、白濁化した部分を点描で表現している。
なお、第２保温工程後においても、固体培地５のうち、分解評価物が分解された部位５Ｂは白濁化せずに、透明である。第２保温工程後は、分解評価物が未分解の部位５Ａは白濁状態となり、基質が分解された部位５Ｂは透明状態となる。
第２温度は、第１温度よりも低ければ、特に限定されないが、好ましくは０℃～１５℃であり、より好ましくは３℃～７℃である。第２温度が、この範囲であると、未分解の分解評価物が白濁化されやすく、評価が容易になる。
（２．４）評価工程
評価工程は、第２保温工程の後に、固体培地５の状態を観測して、微生物等７の分解活性を評価する工程である。
上述のように、第２保温工程後は、分解評価物が未分解の部位５Ａは白濁状態となり、分解評価物が分解された部位５Ｂは透明状態となる。すなわち、第２保温工程後では、分解評価物の分解部位と、分解評価物の未分解部位と、を視覚的に判別可能である。
観測の方法は、特に限定されない。例えば、固体培地５の微生物等７の周辺に形成された透明部分の大きさを測定することが好ましい。この方法を採用すると、透明部分の大きさの大小により、分解活性の程度を把握することが可能となる。すなわち、透明部分が大きいほど、分解された分解評価物が多いことになるから、分解活性が高いことが判明する。なお、透明部分の大きさの評価方法は、特に限定されない。すなわち、透明部分の径、幅、長さによって大きさを評価してもよいし、透明部分の面積によって大きさを評価してもよい。
固体培地５の状態は、板状体１の支持板３の側から、支持板３を通して観察することが好ましい。すなわち、図５の場合には、矢印の方向から観察することが好ましい。この場合には、固体培地５の支持板３に密接した平面を観察することになるから、固体培地５の観察面が平坦化されて、観察しやすい。
なお、基板９側から観察しようとすると、下方から見上げるように観察することになるから、観察しにくい。基板９側から観察する場合には、基板９が透明でなければならず、基板９に透明性が高い材質を用いる必要があり、基板９の材質の制限が生じる。
評価工程は、第２保温工程の後に、固体培地５の状態を観測して、微生物等７の分解活性を評価する工程である。
上述のように、第２保温工程後は、分解評価物が未分解の部位５Ａは白濁状態となり、分解評価物が分解された部位５Ｂは透明状態となる。すなわち、第２保温工程後では、分解評価物の分解部位と、分解評価物の未分解部位と、を視覚的に判別可能である。
観測の方法は、特に限定されない。例えば、固体培地５の微生物等７の周辺に形成された透明部分の大きさを測定することが好ましい。この方法を採用すると、透明部分の大きさの大小により、分解活性の程度を把握することが可能となる。すなわち、透明部分が大きいほど、分解された分解評価物が多いことになるから、分解活性が高いことが判明する。なお、透明部分の大きさの評価方法は、特に限定されない。すなわち、透明部分の径、幅、長さによって大きさを評価してもよいし、透明部分の面積によって大きさを評価してもよい。
固体培地５の状態は、板状体１の支持板３の側から、支持板３を通して観察することが好ましい。すなわち、図５の場合には、矢印の方向から観察することが好ましい。この場合には、固体培地５の支持板３に密接した平面を観察することになるから、固体培地５の観察面が平坦化されて、観察しやすい。
なお、基板９側から観察しようとすると、下方から見上げるように観察することになるから、観察しにくい。基板９側から観察する場合には、基板９が透明でなければならず、基板９に透明性が高い材質を用いる必要があり、基板９の材質の制限が生じる。
（３）本実施形態の効果
本実施形態の分解活性の評価方法によれば、良好な検出感度で、微生物等７の分解活性を評価できる。
本実施形態の分解活性の評価方法によれば、良好な検出感度で、微生物等７の分解活性を評価できる。
２．第２実施形態の分解活性の評価方法
第２実施形態の分解活性の評価方法は、分解活性評価用の板状体１を用いた評価方法である。
第２実施形態の分解活性の評価方法は、分解活性評価用の板状体１を用いた評価方法である。
（１）分解活性評価用の板状体
分解活性評価用の板状体１については、第１実施形態の「（１）分解活性評価用の板状体１」、「（１．１）透明な支持板３」、「（１．２）固体培地５」の記載をそのまま適用する。
分解活性評価用の板状体１については、第１実施形態の「（１）分解活性評価用の板状体１」、「（１．１）透明な支持板３」、「（１．２）固体培地５」の記載をそのまま適用する。
（２）分解活性の評価方法
分解活性の評価方法は、磁性化工程、配置工程、液体除去工程、接触工程、第１保温工程、第２保温工程、評価工程を備えている。
以下、各工程ついて詳細に説明する。
分解活性の評価方法は、磁性化工程、配置工程、液体除去工程、接触工程、第１保温工程、第２保温工程、評価工程を備えている。
以下、各工程ついて詳細に説明する。
（２．１）磁性化工程
磁性化工程は、微生物を磁性化して磁性化微生物１３とする工程である。
磁性化工程は、微生物を磁性化して磁性化微生物１３とする工程である。
（２．１．１）微生物
微生物は、分解活性の評価対象であり、幅広い微生物に適用することができる。
微生物は、分解活性の評価対象であり、幅広い微生物に適用することができる。
（２．１．２）磁性化
微生物を磁性化する方法は、特に限定されない。
例えば、次のようにして、微生物を磁性化できる。微生物に化学修飾を施して、微生物の表面に反応基を形成する。他方、この反応基と反応する反応部位を有する磁性体を用意する。そして、微生物の反応基と、磁性体の反応部位とを反応させて、両者を結合することで、微生物を磁性化できる。
例えば、微生物の表面をビオチン化し、ストレプトアビジン修飾されている磁性ビーズ（磁性体）と反応させて、微生物を磁性化できる。この方法は、ビオチン－ストレプトアビジン結合を利用した磁気ラベル化である。
また、微生物に磁性粒子を導入又は付着して微生物を磁性化できる。この場合に、磁性粒子は、微生物に保持されることで細胞に磁性を付加するものであれば特に限定されない。例えば、磁性材料の粒子（磁性粒子）を用いることができる。具体的には、フェライト、マグネタイトなどの酸化鉄の粒子、酸化クロムの粒子、コバルトの粒子などを用いることができる。磁性粒子は、１種あるいは２種以上を組み合わせて用いることができる。磁性粒子は、微生物と親和性のある表面を有していることが好ましく、例えば、リポソームなどの脂質膜を表面に備える磁性粒子を用いることができる。また、表面に正電荷を備えることも好ましい。例えば、磁性粒子をリポソームに封入した磁性粒子封入リポソーム（ＭＬ： ＭａｇｎｅｔｏｌｉｐｏｓｏｍｅあるいはＭａｇｎｅｔｉｔｅ ｌｉｐｏｓｏｍｅ）、磁性粒子を正電荷リポソームに封入した磁性粒子封入正電荷リポソーム（ＭＣＬ： Ｍａｇｎｅｔｉｔｅ ｃａｔｉｏｎｉｃ ｌｉｐｏｓｏｍｅ）を用いることができる。磁性粒子が微生物と親和性のある表面を有することで、磁性粒子が微生物へ付着すること、又は磁性粒子が微生物に取り込まれることを可能としている。なお、磁性粒子が微生物へ付着すること、又は磁性粒子が微生物に取り込まれることによって、微生物を確実に磁性化できる。微生物の磁性化を、磁性粒子封入リポソーム（ＭＬ）、磁性粒子封入正電荷リポソーム（ＭＣＬ）で行う場合には、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）、ＴＢＳ、ＬＢ、Ｍ９、ＢＧ１１、Ｒ２Ａ等を使用すると、スムーズに微生物の磁性化が行われる。なお、磁性粒子封入リポソーム（ＭＬ）、磁性粒子封入正電荷リポソーム（ＭＣＬ）は、レクチンや抗体等のタンパク質、糖鎖、ペプチド、その他の分子によって修飾されていてもよい。修飾することによって、微生物との親和性が高まる場合がある。
微生物を磁性化する方法は、特に限定されない。
例えば、次のようにして、微生物を磁性化できる。微生物に化学修飾を施して、微生物の表面に反応基を形成する。他方、この反応基と反応する反応部位を有する磁性体を用意する。そして、微生物の反応基と、磁性体の反応部位とを反応させて、両者を結合することで、微生物を磁性化できる。
例えば、微生物の表面をビオチン化し、ストレプトアビジン修飾されている磁性ビーズ（磁性体）と反応させて、微生物を磁性化できる。この方法は、ビオチン－ストレプトアビジン結合を利用した磁気ラベル化である。
また、微生物に磁性粒子を導入又は付着して微生物を磁性化できる。この場合に、磁性粒子は、微生物に保持されることで細胞に磁性を付加するものであれば特に限定されない。例えば、磁性材料の粒子（磁性粒子）を用いることができる。具体的には、フェライト、マグネタイトなどの酸化鉄の粒子、酸化クロムの粒子、コバルトの粒子などを用いることができる。磁性粒子は、１種あるいは２種以上を組み合わせて用いることができる。磁性粒子は、微生物と親和性のある表面を有していることが好ましく、例えば、リポソームなどの脂質膜を表面に備える磁性粒子を用いることができる。また、表面に正電荷を備えることも好ましい。例えば、磁性粒子をリポソームに封入した磁性粒子封入リポソーム（ＭＬ： ＭａｇｎｅｔｏｌｉｐｏｓｏｍｅあるいはＭａｇｎｅｔｉｔｅ ｌｉｐｏｓｏｍｅ）、磁性粒子を正電荷リポソームに封入した磁性粒子封入正電荷リポソーム（ＭＣＬ： Ｍａｇｎｅｔｉｔｅ ｃａｔｉｏｎｉｃ ｌｉｐｏｓｏｍｅ）を用いることができる。磁性粒子が微生物と親和性のある表面を有することで、磁性粒子が微生物へ付着すること、又は磁性粒子が微生物に取り込まれることを可能としている。なお、磁性粒子が微生物へ付着すること、又は磁性粒子が微生物に取り込まれることによって、微生物を確実に磁性化できる。微生物の磁性化を、磁性粒子封入リポソーム（ＭＬ）、磁性粒子封入正電荷リポソーム（ＭＣＬ）で行う場合には、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）、ＴＢＳ、ＬＢ、Ｍ９、ＢＧ１１、Ｒ２Ａ等を使用すると、スムーズに微生物の磁性化が行われる。なお、磁性粒子封入リポソーム（ＭＬ）、磁性粒子封入正電荷リポソーム（ＭＣＬ）は、レクチンや抗体等のタンパク質、糖鎖、ペプチド、その他の分子によって修飾されていてもよい。修飾することによって、微生物との親和性が高まる場合がある。
（２．２）配置工程
配置工程は、基板９の上に磁性化微生物１３を含有する液体１５を保持した状態で、基板９の裏面側から基板９の複数箇所に磁力をかけて、基板９の複数箇所に磁性化微生物１３を引きつけて配置する工程である。
配置工程の一例を図６～７の模式図を用いて説明する。まず、図６に示すように、磁性化微生物１３を含有する液体１５を基板９の上に保持する。そして、図７に示すように、基板９の複数箇所に磁力をかけて、基板９の複数箇所に磁性化微生物１３を引きつけて配置する。
配置工程は、基板９の上に磁性化微生物１３を含有する液体１５を保持した状態で、基板９の裏面側から基板９の複数箇所に磁力をかけて、基板９の複数箇所に磁性化微生物１３を引きつけて配置する工程である。
配置工程の一例を図６～７の模式図を用いて説明する。まず、図６に示すように、磁性化微生物１３を含有する液体１５を基板９の上に保持する。そして、図７に示すように、基板９の複数箇所に磁力をかけて、基板９の複数箇所に磁性化微生物１３を引きつけて配置する。
磁力をかける際に用いる磁石１７の種類は特に限定されない。例えば、永久磁石又は電磁石を用いることができる。電磁石を使用すれば、通電状態をコントロールすることによって磁力を制御可能である。永久磁石は、特に限定されない。永久磁石としては、例えば、鋳造磁石（アルニコ磁石、鉄・クロム・コバルト磁石を含む）、塑性加工磁石（Ｆｅ－Ｍｎ系、Ｆｅ－Ｃｒ－Ｃｏ系を含む）、フェライト磁石（Ｂａ系、Ｓｒ系を含む）、希土類磁石（Ｓｍ－Ｃｏ系、Ｎｄ－Ｆｅ－Ｂ系を含む）、ボンド磁石（Ｓｍ－Ｃｏ系、Ｎｄ－Ｆｅ－Ｂ系、Ｓｍ－Ｆｅ－Ｎ系を含む）が好適に例示される。
磁力を作用させる時間は、使用する磁石の種類、磁性粒子の種類などに応じて適宜選定することができる。例えば５秒～７２時間である。
磁石１７から放出される磁力を直接利用してもよいし、間接的に利用してもよい。間接的に利用する場合には、磁石１７から放出される磁力を他の部材に伝搬させ、他の部材から放出される磁力を利用してもよい。例えば、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｆｅ－Ｃ、Ｆｅ－Ｎｉ、Ｆｅ－Ｃｏ、Ｆｅ－Ｎｉ－Ｃｏ－Ａｌ、Ｆｅ－Ｎｉ－Ｃｒ、ＳｍＣｏ５、Ｎｄ２Ｆｅ１４Ｂ、Ｆｅ３Ｏ４、γ－Ｆｅ２Ｏ３、ＢａＦｅ１２Ｏ１９等のように磁力を伝搬する特性の部材を磁石１７に接触又は近接させれば、この部材の表面（端面など）から磁力を放出させることが可能である。この構成に用いられる部材の形状、構造は特に限定されない。この部材の具体例として、図７に示す剣山状磁石デバイス１９（「剣山状デバイス」ともいう）が挙げられる。剣山状デバイスは例えば鉄製であり、その上面側には所定の間隔で規則的に多数のピン（支柱）が形成されている。ピンの配列は、ランダムであってもよいが、ここでは、アレイ状、すなわち、格子（複数の縦の線と横の線が交差した状態）の交差部分に規則的に並べた配列を例示している。ピンの高さ及び間隔は微生物の種類などに応じて適宜選定することができる。
（２．３）液体除去工程
液体除去工程は、配置工程の後に、液体１５を除去する工程である。
液体除去工程の一例を、図８の模式図を用いて説明する。図７の状態から、液体１５を除去して図８に示す状態とする。この工程によって、磁性化微生物１３が基板９上で、露出した状態になる。
なお、液体除去工程の際にも、磁力により、基板９に磁性化微生物１３を引きつけておくことが好ましい。液体除去の際において、溶液１５の揺れ等による磁性化微生物１３の不本意な移動を抑制するためである。
液体除去工程は、配置工程の後に、液体１５を除去する工程である。
液体除去工程の一例を、図８の模式図を用いて説明する。図７の状態から、液体１５を除去して図８に示す状態とする。この工程によって、磁性化微生物１３が基板９上で、露出した状態になる。
なお、液体除去工程の際にも、磁力により、基板９に磁性化微生物１３を引きつけておくことが好ましい。液体除去の際において、溶液１５の揺れ等による磁性化微生物１３の不本意な移動を抑制するためである。
（２．４）接触工程
接触工程は、図９に例示されるように、磁性化微生物１３を配置した基板９の上に固体培地５が被さるように、基板９に板状体１を載せて、固体培地５と、磁性化微生物１３とを接触させる工程である。なお、基板９としてシャーレの底壁を用いているが、基板９は特に限定されず、適宜変更できる。
この工程を経ると、固体培地５の上面は、支持板３によって覆われた状態となるから、固体培地５の乾燥が抑制される。
接触工程は、図９に例示されるように、磁性化微生物１３を配置した基板９の上に固体培地５が被さるように、基板９に板状体１を載せて、固体培地５と、磁性化微生物１３とを接触させる工程である。なお、基板９としてシャーレの底壁を用いているが、基板９は特に限定されず、適宜変更できる。
この工程を経ると、固体培地５の上面は、支持板３によって覆われた状態となるから、固体培地５の乾燥が抑制される。
（２．５）第１保温工程
第１保温工程は、接触工程の後の板状体１を第１温度にて保温する工程である。この工程後でも、固体培地５の全体は透明であり、前工程（接触工程）後の固体培地５と同様である。つまり、図１０の固体培地５の状態は、外見上、図９（下図）の固体培地５と同じである。
第１温度は、特に限定されないが、好ましくは２０℃～４５℃であり、より好ましくは３５～４０℃である。第１温度が、この範囲内であると、分解評価物の分解を促進でき、分解活性の評価が容易になる。
第１保温工程の時間は、特に限定されず、微生物の種類に応じて適宜変更できる。第１保温工程の時間は、好ましくは０．５時間～２４時間であり、より好ましくは１時間～１８時間である。
第１保温工程は、接触工程の後の板状体１を第１温度にて保温する工程である。この工程後でも、固体培地５の全体は透明であり、前工程（接触工程）後の固体培地５と同様である。つまり、図１０の固体培地５の状態は、外見上、図９（下図）の固体培地５と同じである。
第１温度は、特に限定されないが、好ましくは２０℃～４５℃であり、より好ましくは３５～４０℃である。第１温度が、この範囲内であると、分解評価物の分解を促進でき、分解活性の評価が容易になる。
第１保温工程の時間は、特に限定されず、微生物の種類に応じて適宜変更できる。第１保温工程の時間は、好ましくは０．５時間～２４時間であり、より好ましくは１時間～１８時間である。
（２．６）第２保温工程
第２保温工程は、第１保温工程の後の板状体１を第１温度よりも低い第２温度で保温することによって、固体培地５のうち、未分解の分解評価物が存在する部位５Ａを白濁化させる工程である。図１１に、第２保温工程後の固体培地５の様子を示す。図１１では、白濁化した部分を点描で表現している。
なお、第２保温工程後においても、固体培地５のうち、分解評価物が分解された部位５Ｂは白濁化せずに、透明である。よって、第２保温工程後は、分解評価物が未分解の部位５Ａは白濁状態となり、基質が分解された部位５Ｂは透明状態となる。
第２温度は、第１温度よりも低ければ、特に限定されないが、好ましくは０℃～１５℃であり、より好ましくは３℃～７℃である。第２温度が、この範囲であると、未分解の分解評価物が白濁化されやすく、評価が容易になる。
第２保温工程は、第１保温工程の後の板状体１を第１温度よりも低い第２温度で保温することによって、固体培地５のうち、未分解の分解評価物が存在する部位５Ａを白濁化させる工程である。図１１に、第２保温工程後の固体培地５の様子を示す。図１１では、白濁化した部分を点描で表現している。
なお、第２保温工程後においても、固体培地５のうち、分解評価物が分解された部位５Ｂは白濁化せずに、透明である。よって、第２保温工程後は、分解評価物が未分解の部位５Ａは白濁状態となり、基質が分解された部位５Ｂは透明状態となる。
第２温度は、第１温度よりも低ければ、特に限定されないが、好ましくは０℃～１５℃であり、より好ましくは３℃～７℃である。第２温度が、この範囲であると、未分解の分解評価物が白濁化されやすく、評価が容易になる。
（２．７）評価工程
評価工程は、第２保温工程の後に、固体培地５の状態を観測して、磁性化微生物１３の分解活性を評価する工程である。
上述のように、第２保温工程後は、分解評価物が未分解の部位５Ａは白濁状態となり、分解評価物が分解された部位５Ｂは透明状態となる。すなわち、第２保温工程後では、分解評価物の分解部位と、分解評価物の未分解部位と、を視覚的に判別可能である。
観測の方法は、特に限定されない。例えば、固体培地５の磁性化微生物１３の周辺に形成された透明部分の大きさを測定することが好ましい。この方法であると、透明部分の大きさの大小により、分解活性の程度を把握することが可能となる。すなわち、透明部分が大きいほど、分解された分解評価物が多いことになるから、分解活性が高いことが判明する。なお、透明部分の大きさの評価方法は、特に限定されない。すなわち、透明部分の径、幅、長さによって大きさを評価してもよいし、透明部分の面積によって大きさを評価してもよい。
固体培地５の状態は、板状体１の支持板３の側から、支持板３を通して観察することが好ましい。すなわち、図１１の場合には、矢印の方向から観察することが好ましい。この場合には、固体培地５の支持板３に密接した平面を観察することになるから、固体培地５の観察面が平坦化されて、観察しやすい。
なお、基板９側から観察しようとすると、下方から見上げるように観察することになるから、観察しにくい。基板９側から観察する場合には、基板９が透明でなければならず、基板９に透明性が高い材質を用いる必要があり、基板９の材質の制限が生じる。
評価工程は、第２保温工程の後に、固体培地５の状態を観測して、磁性化微生物１３の分解活性を評価する工程である。
上述のように、第２保温工程後は、分解評価物が未分解の部位５Ａは白濁状態となり、分解評価物が分解された部位５Ｂは透明状態となる。すなわち、第２保温工程後では、分解評価物の分解部位と、分解評価物の未分解部位と、を視覚的に判別可能である。
観測の方法は、特に限定されない。例えば、固体培地５の磁性化微生物１３の周辺に形成された透明部分の大きさを測定することが好ましい。この方法であると、透明部分の大きさの大小により、分解活性の程度を把握することが可能となる。すなわち、透明部分が大きいほど、分解された分解評価物が多いことになるから、分解活性が高いことが判明する。なお、透明部分の大きさの評価方法は、特に限定されない。すなわち、透明部分の径、幅、長さによって大きさを評価してもよいし、透明部分の面積によって大きさを評価してもよい。
固体培地５の状態は、板状体１の支持板３の側から、支持板３を通して観察することが好ましい。すなわち、図１１の場合には、矢印の方向から観察することが好ましい。この場合には、固体培地５の支持板３に密接した平面を観察することになるから、固体培地５の観察面が平坦化されて、観察しやすい。
なお、基板９側から観察しようとすると、下方から見上げるように観察することになるから、観察しにくい。基板９側から観察する場合には、基板９が透明でなければならず、基板９に透明性が高い材質を用いる必要があり、基板９の材質の制限が生じる。
（３）本実施形態の効果
本実施形態の分解活性の評価方法によれば、基板９の複数箇所に磁性化微生物１３を引きつけて配置し、複数の箇所において一括して、分解活性の評価が行えるから、分解活性の評価が容易である。なお、微生物として複数種の微生物を用いて、基板９の複数箇所における微生物の種類が異なるように配置すれば、一度に複数種の微生物の分解活性の評価が行えるから非常に有用である。
また、本実施形態の分解活性の評価方法によれば、良好な検出感度で、微生物の分解活性を評価できる。
本実施形態の分解活性の評価方法によれば、基板９の複数箇所に磁性化微生物１３を引きつけて配置し、複数の箇所において一括して、分解活性の評価が行えるから、分解活性の評価が容易である。なお、微生物として複数種の微生物を用いて、基板９の複数箇所における微生物の種類が異なるように配置すれば、一度に複数種の微生物の分解活性の評価が行えるから非常に有用である。
また、本実施形態の分解活性の評価方法によれば、良好な検出感度で、微生物の分解活性を評価できる。
以下、実施例により更に具体的に説明する。
＜実験Ａ＞
実験Ａでは、厚み２００μｍ以上１０ｍｍ以下の固体培地５を備えた分解活性評価用の板状体１が、微生物等７の分解活性の評価に有用であることを確認した。
実験Ａでは、厚み２００μｍ以上１０ｍｍ以下の固体培地５を備えた分解活性評価用の板状体１が、微生物等７の分解活性の評価に有用であることを確認した。
１．評価用基板の作製、及び冷却による白濁化の確認
（１）評価用基板（本発明の「分解活性評価用の板状体１」に相当）
評価用基板は、スピンコーターによって厚さを制御したＰＤＭＳをスペーサーとし、カバーガラス２枚で挟むことによって隙間を作り、そこへペクチン含有寒天培地（Ｉｋｕｒａ Ｙ．，Ａｇｒｉ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４３，１３５９（１９７９）参照）（３０ｇ／Ｌ Ｃｉｔｒｕｓ Ｐｅｃｔｉｎ，５ｇ／Ｌ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｏｎｅ，１ｇ／Ｌ Ｋ２ＨＰＯ４，０．２ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ，０．０５ｇ／Ｌ ＭｎＳＯ４・５Ｈ２Ｏ，０．０５ｇ／Ｌ ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ，１２．５ｇ／Ｌ Ｎａ２ＣＯ３，３０ｇ／Ｌ Ａｇａｒ）を流し込み固化して作製した。このようにして、厚さ２００μｍの固体培地の両面にカバーガラスを備えた評価用基板を作製した。次に、評価用基板の片面のカバーガラスと、側面のスペーサー（ＰＤＭＳ）を剥がして、固体培地を露出した状態（図１に示される板状体１と同じ状態）にした。
（１）評価用基板（本発明の「分解活性評価用の板状体１」に相当）
評価用基板は、スピンコーターによって厚さを制御したＰＤＭＳをスペーサーとし、カバーガラス２枚で挟むことによって隙間を作り、そこへペクチン含有寒天培地（Ｉｋｕｒａ Ｙ．，Ａｇｒｉ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４３，１３５９（１９７９）参照）（３０ｇ／Ｌ Ｃｉｔｒｕｓ Ｐｅｃｔｉｎ，５ｇ／Ｌ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｏｎｅ，１ｇ／Ｌ Ｋ２ＨＰＯ４，０．２ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ，０．０５ｇ／Ｌ ＭｎＳＯ４・５Ｈ２Ｏ，０．０５ｇ／Ｌ ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ，１２．５ｇ／Ｌ Ｎａ２ＣＯ３，３０ｇ／Ｌ Ａｇａｒ）を流し込み固化して作製した。このようにして、厚さ２００μｍの固体培地の両面にカバーガラスを備えた評価用基板を作製した。次に、評価用基板の片面のカバーガラスと、側面のスペーサー（ＰＤＭＳ）を剥がして、固体培地を露出した状態（図１に示される板状体１と同じ状態）にした。
（２）評価用基板の冷却による白濁化の確認
図１２に、作製直後の評価用基板を示す。作製直後、固体培地は透明であった。なお、図１２の中央の略正方形の部分が、評価用基板である（図１３～１５も同様である）。図１２では、固体培地が透明であることから、固体培地の部分では背景が透けて見えている。
この評価用基板を４０℃で一晩静置した（本発明の「第１保温工程」に相当）。４０℃で保温後の様子を図１３に示す。保温後も固体培地は、透明であった。
その後、評価用基板を冷蔵庫で４℃にて冷却した（本発明の「第２保温工程」に相当）。４℃で保温後の様子を図１４に示す。冷却後、固体培地は、白濁化した。
図１２に、作製直後の評価用基板を示す。作製直後、固体培地は透明であった。なお、図１２の中央の略正方形の部分が、評価用基板である（図１３～１５も同様である）。図１２では、固体培地が透明であることから、固体培地の部分では背景が透けて見えている。
この評価用基板を４０℃で一晩静置した（本発明の「第１保温工程」に相当）。４０℃で保温後の様子を図１３に示す。保温後も固体培地は、透明であった。
その後、評価用基板を冷蔵庫で４℃にて冷却した（本発明の「第２保温工程」に相当）。４℃で保温後の様子を図１４に示す。冷却後、固体培地は、白濁化した。
２．酵素の基質分解活性の評価
次に、ペクチン分解酵素（ＰＥＣＴＩＮ ＬＹＡＳＥ ｆｒｏｍ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐ．， Ｍｅｇａｚｙｍｅ）を所定濃度にて、上述の評価用基板の固体培地の中央付近に滴下した。この評価用基板を４０℃で一晩静置した（第１保温工程）。保温後も固体培地は、透明であった。その後、評価用基板を冷蔵庫で４℃にて冷却した（第２保温工程）。４℃で保温後の様子を図１５に示す。冷却後、固体培地のうち、ペクチン分解酵素を滴下した部分の周辺が透明になり、その他の部分は白濁化した。図１５では、略正方形の輪郭のカバーガラスの中央に、略長方形の固定培地が見えている。固定培地の中央の略円形の部分は、透明であることが観察された。
以上の結果から、厚み２００μｍ以上１０ｍｍ以下の固体培地を備えた評価用基板（分解活性評価用の板状体１）を用いて、冷却後の固体培地の状態を観察すれば、微生物等７の分解活性を評価できることが確認された。すなわち、微生物等７に分解活性があれば、冷却後には、微生物等７の周りに透明な部分ができ、これにより分解活性を把握できる。
次に、ペクチン分解酵素（ＰＥＣＴＩＮ ＬＹＡＳＥ ｆｒｏｍ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐ．， Ｍｅｇａｚｙｍｅ）を所定濃度にて、上述の評価用基板の固体培地の中央付近に滴下した。この評価用基板を４０℃で一晩静置した（第１保温工程）。保温後も固体培地は、透明であった。その後、評価用基板を冷蔵庫で４℃にて冷却した（第２保温工程）。４℃で保温後の様子を図１５に示す。冷却後、固体培地のうち、ペクチン分解酵素を滴下した部分の周辺が透明になり、その他の部分は白濁化した。図１５では、略正方形の輪郭のカバーガラスの中央に、略長方形の固定培地が見えている。固定培地の中央の略円形の部分は、透明であることが観察された。
以上の結果から、厚み２００μｍ以上１０ｍｍ以下の固体培地を備えた評価用基板（分解活性評価用の板状体１）を用いて、冷却後の固体培地の状態を観察すれば、微生物等７の分解活性を評価できることが確認された。すなわち、微生物等７に分解活性があれば、冷却後には、微生物等７の周りに透明な部分ができ、これにより分解活性を把握できる。
＜実験Ｂ＞
実験Ｂでは、分解活性の評価に適切な固体培地の厚みを検討した。
実験Ｂでは、分解活性の評価に適切な固体培地の厚みを検討した。
１．実験方法
（１）固体培地の作製
直径９ｃｍのシャーレ内にペクチン含有寒天培地（Ｉｋｕｒａ Ｙ．，Ａｇｒｉ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４３，１３５９（１９７９）参照）（３０ｇ／Ｌ Ｃｉｔｒｕｓ Ｐｅｃｔｉｎ，５ｇ／Ｌ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｏｎｅ，１ｇ／Ｌ Ｋ２ＨＰＯ４，０．２ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ，０．０５ｇ／Ｌ ＭｎＳＯ４・５Ｈ２Ｏ，０．０５ｇ／Ｌ ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ，１２．５ｇ／Ｌ Ｎａ２ＣＯ３，３０ｇ／Ｌ Ａｇａｒ）を流し込み固化させた。シャーレ内に流し込む寒天培地の量を調整して、２００μｍ、１０ｍｍ、２０ｍｍの厚みの固体培地（寒天平板培地）とした。各固体培地の２０℃での様子を目視にて観察したところ、いずれも全面にわたって透明であることが確認された。次に、各固体培地を冷蔵庫に入れ、４℃に冷やした。冷却後の固体培地の様子を目視にて観察した。いずれの固体培地も、全面にわたって白濁した。
（１）固体培地の作製
直径９ｃｍのシャーレ内にペクチン含有寒天培地（Ｉｋｕｒａ Ｙ．，Ａｇｒｉ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４３，１３５９（１９７９）参照）（３０ｇ／Ｌ Ｃｉｔｒｕｓ Ｐｅｃｔｉｎ，５ｇ／Ｌ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｏｎｅ，１ｇ／Ｌ Ｋ２ＨＰＯ４，０．２ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ，０．０５ｇ／Ｌ ＭｎＳＯ４・５Ｈ２Ｏ，０．０５ｇ／Ｌ ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ，１２．５ｇ／Ｌ Ｎａ２ＣＯ３，３０ｇ／Ｌ Ａｇａｒ）を流し込み固化させた。シャーレ内に流し込む寒天培地の量を調整して、２００μｍ、１０ｍｍ、２０ｍｍの厚みの固体培地（寒天平板培地）とした。各固体培地の２０℃での様子を目視にて観察したところ、いずれも全面にわたって透明であることが確認された。次に、各固体培地を冷蔵庫に入れ、４℃に冷やした。冷却後の固体培地の様子を目視にて観察した。いずれの固体培地も、全面にわたって白濁した。
（２）酵素の基質分解活性の評価
ペクチン分解酵素（ＰＥＣＴＩＮ ＬＹＡＳＥ ｆｒｏｍ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐ．， Ｍｅｇａｚｙｍｅ）を種々の濃度（０．６Ｕ、０．０６Ｕ、０．００６Ｕ、０．０００６Ｕ）に調整した。それぞれの濃度のペクチン分解酵素を各固体培地に接種し、各固体培地を４０℃で一晩静置した。その後、各固体培地を冷蔵庫で４℃にて冷却した。各固体培地において、ペクチン分解酵素を接種した周りのハロー（透明な部分）の大きさ（直径）を測定し、ハローの面積（ｍｍ２）を計算した。
ペクチン分解酵素（ＰＥＣＴＩＮ ＬＹＡＳＥ ｆｒｏｍ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐ．， Ｍｅｇａｚｙｍｅ）を種々の濃度（０．６Ｕ、０．０６Ｕ、０．００６Ｕ、０．０００６Ｕ）に調整した。それぞれの濃度のペクチン分解酵素を各固体培地に接種し、各固体培地を４０℃で一晩静置した。その後、各固体培地を冷蔵庫で４℃にて冷却した。各固体培地において、ペクチン分解酵素を接種した周りのハロー（透明な部分）の大きさ（直径）を測定し、ハローの面積（ｍｍ２）を計算した。
２．評価結果
結果を図１６に示す。図１６は、各厚みの固体培地における、酵素活性量とハロー面積との相関を示すグラフである。
いずれの厚みの固体培地においても、酵素活性量とハロー面積に相関関係が見られた。すなわち、酵素活性量が大きいほど、分解活性が高く、ハロー面積が大きくなる傾向にあることが確認された。
また、各グラフのｘ軸との交点であるｘ切片は、各厚みの固体培地の検出限界を示している。ｘ切片は、２００μｍの厚みの固体培地及び１０ｍｍの厚みの固体培地では、０．０１Ｕ以下であり、低い酵素活性量でも検出できることが分かる。これに対して、２０ｍｍの厚みの固体培地では、ｘ切片は、０．０１Ｕより大きく、低い酵素活性量では検出できないことが分かる。
これらの結果から、固体培地の厚みが２００μｍ以上１０ｍｍ以下の場合には、ハロー面積により、簡便に分解活性を評価可能であり、しかも良好な検出感度で、分解活性を評価できることが確認された。
結果を図１６に示す。図１６は、各厚みの固体培地における、酵素活性量とハロー面積との相関を示すグラフである。
いずれの厚みの固体培地においても、酵素活性量とハロー面積に相関関係が見られた。すなわち、酵素活性量が大きいほど、分解活性が高く、ハロー面積が大きくなる傾向にあることが確認された。
また、各グラフのｘ軸との交点であるｘ切片は、各厚みの固体培地の検出限界を示している。ｘ切片は、２００μｍの厚みの固体培地及び１０ｍｍの厚みの固体培地では、０．０１Ｕ以下であり、低い酵素活性量でも検出できることが分かる。これに対して、２０ｍｍの厚みの固体培地では、ｘ切片は、０．０１Ｕより大きく、低い酵素活性量では検出できないことが分かる。
これらの結果から、固体培地の厚みが２００μｍ以上１０ｍｍ以下の場合には、ハロー面積により、簡便に分解活性を評価可能であり、しかも良好な検出感度で、分解活性を評価できることが確認された。
＜実験Ｃ＞
実験Ｃでは、第２実施形態の評価方法により、実際に分解活性が評価できることを確認した。
実験Ｃでは、第２実施形態の評価方法により、実際に分解活性が評価できることを確認した。
１．実験方法
（１）微生物種
ペクチン分解微生物として、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ （Ｂ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）Ｃ－１２５株（Ｋｏｋｉ Ｈ．，Ａｇｒ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，３６，２８５（１９７２）、Ｉｋｕｒａ Ｙ．，Ａｇｒｉ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４３，８５（１９７９）参照）を使用した。Ｂ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓは植物繊維のレッティングに利用されているアルカリペクチナーゼを生産する微生物として最も良く研究されている。Ｃ－１２５株は理化学研究所バイオリソースセンターより分譲を受けた。前培養は、１８１ ＨＯＲＩＫＯＳＨＩ－Ｉ ＭＥＤＩＵＭ （Ｇｌｕｃｏｓｅ １０．０ｇ／Ｌ，Ｐｏｌｙｐｅｐｔｏｎ ５．０ｇ／Ｌ，Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ ５．０ｇ／Ｌ，Ｋ２ＨＰＯ４ １．０ｇ／Ｌ，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．２ｇ／Ｌ，Ｎａ２ＣＯ３ １０ｇ／Ｌ）を用いて、３７℃で１２時間、振とう培養した。
（１）微生物種
ペクチン分解微生物として、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ （Ｂ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）Ｃ－１２５株（Ｋｏｋｉ Ｈ．，Ａｇｒ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，３６，２８５（１９７２）、Ｉｋｕｒａ Ｙ．，Ａｇｒｉ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４３，８５（１９７９）参照）を使用した。Ｂ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓは植物繊維のレッティングに利用されているアルカリペクチナーゼを生産する微生物として最も良く研究されている。Ｃ－１２５株は理化学研究所バイオリソースセンターより分譲を受けた。前培養は、１８１ ＨＯＲＩＫＯＳＨＩ－Ｉ ＭＥＤＩＵＭ （Ｇｌｕｃｏｓｅ １０．０ｇ／Ｌ，Ｐｏｌｙｐｅｐｔｏｎ ５．０ｇ／Ｌ，Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ ５．０ｇ／Ｌ，Ｋ２ＨＰＯ４ １．０ｇ／Ｌ，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．２ｇ／Ｌ，Ｎａ２ＣＯ３ １０ｇ／Ｌ）を用いて、３７℃で１２時間、振とう培養した。
（２）微生物のビオチン化
前培養したＢ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓを、４５００ｒｐｍ、５分間、遠心分離した後、４℃で冷却したＰＢＳ（ｐＨ８）で３回洗浄することで培地中のアミノ基をもつ物質を除いた。次に微生物懸濁液をＯＤ６００＝０．３５に希釈した。水溶性のビオチン化試薬であるＥＺ－ＬｉｎｋＴＭ Ｓｕｌｆｏ－ＮＨＳ－ＬＣ－Ｂｉｏｔｉｎ（２１３３５，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）１ｍｇをマイクロチューブに取り、希釈した微生物懸濁液を１ｍＬ添加し、ローテーター（３０ｒｐｍ）で回転撹拌させながら室温で３０分間インキュベートすることでＢ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ表面をビオチン化した。未反応ビオチン化試薬を取り除くため、菌体を１２０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、ＰＢＳ＋１００ｍＭグリシンによる洗浄を３回行い、ＰＢＳ ４００μＬで再懸濁することで、ビオチン化微生物懸濁液を得た。
前培養したＢ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓを、４５００ｒｐｍ、５分間、遠心分離した後、４℃で冷却したＰＢＳ（ｐＨ８）で３回洗浄することで培地中のアミノ基をもつ物質を除いた。次に微生物懸濁液をＯＤ６００＝０．３５に希釈した。水溶性のビオチン化試薬であるＥＺ－ＬｉｎｋＴＭ Ｓｕｌｆｏ－ＮＨＳ－ＬＣ－Ｂｉｏｔｉｎ（２１３３５，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）１ｍｇをマイクロチューブに取り、希釈した微生物懸濁液を１ｍＬ添加し、ローテーター（３０ｒｐｍ）で回転撹拌させながら室温で３０分間インキュベートすることでＢ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ表面をビオチン化した。未反応ビオチン化試薬を取り除くため、菌体を１２０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、ＰＢＳ＋１００ｍＭグリシンによる洗浄を３回行い、ＰＢＳ ４００μＬで再懸濁することで、ビオチン化微生物懸濁液を得た。
（３）磁性ビーズによるＢ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓの磁気ラベル化（本発明の「磁性化工程」に相当）
磁性ビーズはストレプトアビジン修飾されている粒子径１４０ｎｍのＦＧｂｅａｄｓ ＨＭ（ＴＡＢ８８４８ Ｎ３１７０，多摩川精機株式会社）を用いた。ＦＧｂｅａｄｓ １０μＬ（０．２ｍｇ）をネオジウム磁石で磁気分離し、ＰＢＳで３回洗浄した。次に上述のビオチン化微生物懸濁液を２００μＬ添加し、シェーキングミキサー（ＴＷＩＮ３－２８，ＩＷＡＫＩ）で振とうしながら室温で３０分間インキュベートした。その後、磁気分離し、ＰＢＳで３回洗浄して、磁気ラベル化菌体を得た。磁気ラベル化の確認は、ラベル化前の微生物懸濁液の濁度をコントロールとし、ラベル化後の濁度は磁気分離した微生物懸濁液の上清を測定し比較した。
磁性ビーズはストレプトアビジン修飾されている粒子径１４０ｎｍのＦＧｂｅａｄｓ ＨＭ（ＴＡＢ８８４８ Ｎ３１７０，多摩川精機株式会社）を用いた。ＦＧｂｅａｄｓ １０μＬ（０．２ｍｇ）をネオジウム磁石で磁気分離し、ＰＢＳで３回洗浄した。次に上述のビオチン化微生物懸濁液を２００μＬ添加し、シェーキングミキサー（ＴＷＩＮ３－２８，ＩＷＡＫＩ）で振とうしながら室温で３０分間インキュベートした。その後、磁気分離し、ＰＢＳで３回洗浄して、磁気ラベル化菌体を得た。磁気ラベル化の確認は、ラベル化前の微生物懸濁液の濁度をコントロールとし、ラベル化後の濁度は磁気分離した微生物懸濁液の上清を測定し比較した。
（４）剣山状デバイス・磁石
剣山状デバイスは、土台部分の大きさが縦２ｃｍ×横２ｃｍ×高さ０．４ｃｍ、土台表面に縦１００μｍ×横１００μｍ×高さ３００μｍの四角柱型のポールが並んでいるものを使用した。ポールの中心間距離は２５０μｍと１０００μｍの２種類を用いた。この剣山状デバイスの下にネオジウム円柱磁石（二六製作所）をつけて磁化することで、ポール部分に磁力を集中させることができるデバイスとした。ネオジウム円柱磁石は、外径５０ｍｍ、高さ１０ｍｍ、表面磁束密度０．３８Ｔを用いた。
剣山状デバイスは、土台部分の大きさが縦２ｃｍ×横２ｃｍ×高さ０．４ｃｍ、土台表面に縦１００μｍ×横１００μｍ×高さ３００μｍの四角柱型のポールが並んでいるものを使用した。ポールの中心間距離は２５０μｍと１０００μｍの２種類を用いた。この剣山状デバイスの下にネオジウム円柱磁石（二六製作所）をつけて磁化することで、ポール部分に磁力を集中させることができるデバイスとした。ネオジウム円柱磁石は、外径５０ｍｍ、高さ１０ｍｍ、表面磁束密度０．３８Ｔを用いた。
（５）評価用基板（本発明の「分解活性評価用の板状体１」に相当）
評価用基板は、スピンコーターによって厚さを制御したＰＤＭＳをスペーサーとし、カバーガラス２枚で挟むことによって隙間を作り、そこへペクチン含有寒天培地（Ｉｋｕｒａ Ｙ．，Ａｇｒｉ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４３，１３５９（１９７９）参照）（３０ｇ／Ｌ Ｃｉｔｒｕｓ Ｐｅｃｔｉｎ，５ｇ／Ｌ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｏｎｅ，１ｇ／Ｌ Ｋ２ＨＰＯ４，０．２ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ，０．０５ｇ／Ｌ ＭｎＳＯ４・５Ｈ２Ｏ，０．０５ｇ／Ｌ ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ，１２．５ｇ／Ｌ Ｎａ２ＣＯ３，３０ｇ／Ｌ Ａｇａｒ）を流し込み固化して作製した。このようにして、厚さ２００μｍの固体培地の両面にカバーガラスを備えた評価用基板を作製した。次に、評価用基板の片面のカバーガラスと、側面のスペーサー（ＰＤＭＳ）を剥がして、固体培地を露出した状態（図１に示される板状体１と同じ状態）にした。
評価用基板は、スピンコーターによって厚さを制御したＰＤＭＳをスペーサーとし、カバーガラス２枚で挟むことによって隙間を作り、そこへペクチン含有寒天培地（Ｉｋｕｒａ Ｙ．，Ａｇｒｉ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４３，１３５９（１９７９）参照）（３０ｇ／Ｌ Ｃｉｔｒｕｓ Ｐｅｃｔｉｎ，５ｇ／Ｌ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｏｎｅ，１ｇ／Ｌ Ｋ２ＨＰＯ４，０．２ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ，０．０５ｇ／Ｌ ＭｎＳＯ４・５Ｈ２Ｏ，０．０５ｇ／Ｌ ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ，１２．５ｇ／Ｌ Ｎａ２ＣＯ３，３０ｇ／Ｌ Ａｇａｒ）を流し込み固化して作製した。このようにして、厚さ２００μｍの固体培地の両面にカバーガラスを備えた評価用基板を作製した。次に、評価用基板の片面のカバーガラスと、側面のスペーサー（ＰＤＭＳ）を剥がして、固体培地を露出した状態（図１に示される板状体１と同じ状態）にした。
（６）Ｂ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓのアレイ化及び培養（図７～１１参照）
剣山状デバイスのポール上に菌を１～５ｃｅｌｌでアレイ化するため、磁気ラベル化した微生物懸濁液をＰＢＳで希釈した。アレイ化の様子を蛍光観察するため、蛍光染色を行った。ＰＢＳで３０００ｃｅｌｌｓ／ｍＬに希釈した微生物懸濁液２ｍＬにＢａｃｓｔａｉｎ ＣＦＤＡ 溶液（ＢＳ０３，株式会社同仁化学研究所）１μＬを加え、遮光しながら３７℃で、５分間インキュベートした。ＰＢＳで３回洗浄し、ＰＢＳ２ｍＬで懸濁することで蛍光染色した微生物懸濁液を得た。
次に、剣山状デバイスをネオジウム磁石の上に配置したｌｕｍｏｘ ｄｉｓｈ ３５（９４－６０７７－３３１，ＳＡＲＳＴＥＤＴ）に蛍光染色した微生物懸濁液を２ｍＬ流し入れた。そのまま５分静置することにより、同一平面状に細胞アレイパターンニングを行った（本発明の「配置工程」に相当、図７参照）。その後、アレイ化状態を崩さないよう静かにＰＢＳを除き（本発明の「液体除去工程」、図８参照に相当）、上述の評価用基板を被せた後（本発明の「接触工程」に相当、図９参照）、培養中の乾燥を防ぐためカバーガラス周囲をワセリンで塞いだ。
剣山状デバイスからｌｕｍｏｘ ｄｉｓｈを外し、３７℃で３～１８時間培養した（本発明の「第１保温工程」に相当、図１０参照）。
剣山状デバイスのポール上に菌を１～５ｃｅｌｌでアレイ化するため、磁気ラベル化した微生物懸濁液をＰＢＳで希釈した。アレイ化の様子を蛍光観察するため、蛍光染色を行った。ＰＢＳで３０００ｃｅｌｌｓ／ｍＬに希釈した微生物懸濁液２ｍＬにＢａｃｓｔａｉｎ ＣＦＤＡ 溶液（ＢＳ０３，株式会社同仁化学研究所）１μＬを加え、遮光しながら３７℃で、５分間インキュベートした。ＰＢＳで３回洗浄し、ＰＢＳ２ｍＬで懸濁することで蛍光染色した微生物懸濁液を得た。
次に、剣山状デバイスをネオジウム磁石の上に配置したｌｕｍｏｘ ｄｉｓｈ ３５（９４－６０７７－３３１，ＳＡＲＳＴＥＤＴ）に蛍光染色した微生物懸濁液を２ｍＬ流し入れた。そのまま５分静置することにより、同一平面状に細胞アレイパターンニングを行った（本発明の「配置工程」に相当、図７参照）。その後、アレイ化状態を崩さないよう静かにＰＢＳを除き（本発明の「液体除去工程」、図８参照に相当）、上述の評価用基板を被せた後（本発明の「接触工程」に相当、図９参照）、培養中の乾燥を防ぐためカバーガラス周囲をワセリンで塞いだ。
剣山状デバイスからｌｕｍｏｘ ｄｉｓｈを外し、３７℃で３～１８時間培養した（本発明の「第１保温工程」に相当、図１０参照）。
（７）評価用基板の冷却（本発明の「第２保温工程」に相当、図１１参照）
評価用基板を冷蔵庫で４℃に冷却した。
評価用基板を冷蔵庫で４℃に冷却した。
（８）評価
冷却後の固体培地を撮影し、画像処理を行うことで、ハロー（透明部分）を確認した。ハローの確認は、培養時間が３時間、６時間、９時間、１２時間、１８時間の固体培地について行った。
冷却後の固体培地を撮影し、画像処理を行うことで、ハロー（透明部分）を確認した。ハローの確認は、培養時間が３時間、６時間、９時間、１２時間、１８時間の固体培地について行った。
２．実験結果
実験結果を図１７～２１に示す。図１７～２１における上図は、光学顕微鏡による観察像である。図１７～２１における下図は、光学顕微鏡による観察像を画像処理した画像である。下図において、色の薄い部分がハローに相当する部分である。但し、図１７，１８の下図の四隅に見える色の薄い部分は、微生物を示している。
図１７～２１より、培養９時間後からハローが形成され始め、培養１２時間後にはハローの面積が大きくなっていることが確認できた。
この結果から、第２実施形態の評価方法により、良好な検出感度にて、短時間で分解活性を評価できることが確認された。
実験結果を図１７～２１に示す。図１７～２１における上図は、光学顕微鏡による観察像である。図１７～２１における下図は、光学顕微鏡による観察像を画像処理した画像である。下図において、色の薄い部分がハローに相当する部分である。但し、図１７，１８の下図の四隅に見える色の薄い部分は、微生物を示している。
図１７～２１より、培養９時間後からハローが形成され始め、培養１２時間後にはハローの面積が大きくなっていることが確認できた。
この結果から、第２実施形態の評価方法により、良好な検出感度にて、短時間で分解活性を評価できることが確認された。
前述の例は単に説明を目的とするものでしかなく、本発明を限定するものと解釈されるものではない。本発明を典型的な実施形態の例を挙げて説明したが、本発明の記述および図示において使用された文言は、限定的な文言ではなく説明的および例示的なものであると理解される。ここで詳述したように、その形態において本発明の範囲または本質から逸脱することなく、添付の特許請求の範囲内で変更が可能である。ここでは、本発明の詳述に特定の構造、材料および実施例を参照したが、本発明をここにおける開示事項に限定することを意図するものではなく、むしろ、本発明は添付の特許請求の範囲内における、機能的に同等の構造、方法、使用の全てに及ぶものとする。
上記実験Ｃでは、第２実施形態に準じた実験を行ったが、この実験Ｃから磁性化工程、配置工程、及び液体除去工程を省略しても、良好な検出感度で、微生物等の分解活性を評価できる。
本発明の分解活性の評価方法を用いれば、ペクチン等の分解に関わる有用な微生物等を簡便に探索可能となる。
また、本発明の分解活性の評価方法において基質をペクチンとすれば、ペクチンを分解する菌の検出が可能となる。よって、果物や野菜を腐敗させる原因菌が検出できる。このように、本発明の分解活性の評価方法は、農業関連産業においても幅広く利用することができる。
本発明の分解活性の評価方法は、冷却のみで分解活性を可視化できるので、特別な薬品を用いる必要がなく、様々な場所で利用できる。例えば、農産物保存倉庫や市場等の現場でも利用可能である。
また、本発明の分解活性の評価方法において基質をペクチンとすれば、ペクチンを分解する菌の検出が可能となる。よって、果物や野菜を腐敗させる原因菌が検出できる。このように、本発明の分解活性の評価方法は、農業関連産業においても幅広く利用することができる。
本発明の分解活性の評価方法は、冷却のみで分解活性を可視化できるので、特別な薬品を用いる必要がなく、様々な場所で利用できる。例えば、農産物保存倉庫や市場等の現場でも利用可能である。
１ …板状体
３ …支持板
５ …固体培地
５Ａ…未分解の分解評価物が存在する部位
５Ｂ…分解評価物が分解された部位
７ …微生物等
９ …基板
１３…磁性化微生物
１５…液体
１７…磁石
１９…剣山状磁石デバイス
３１…シャーレ本体部
３３…蓋
３５…気体
３ …支持板
５ …固体培地
５Ａ…未分解の分解評価物が存在する部位
５Ｂ…分解評価物が分解された部位
７ …微生物等
９ …基板
１３…磁性化微生物
１５…液体
１７…磁石
１９…剣山状磁石デバイス
３１…シャーレ本体部
３３…蓋
３５…気体
Claims (4)
- 透明な支持板と、
前記支持板の一面上に形成され、分解評価物を含有する固体培地と、
を備える分解活性評価用の板状体を用いた分解活性の評価方法であって、
前記固体培地の厚みが２００μｍ以上１０ｍｍ以下であり、
微生物又は酵素を配置した基板の上に前記固体培地が被さるように、前記基板に前記板状体を載せて、前記固体培地と、前記微生物又は前記酵素とを接触させる接触工程と、
前記接触工程の後の前記板状体を第１温度にて保温する第１保温工程と、
前記第１保温工程の後の前記板状体を前記第１温度よりも低い第２温度で保温することによって、前記固体培地のうち、未分解の前記分解評価物が存在する部位を白濁化させる第２保温工程と、
前記第２保温工程の後に、前記固体培地の状態を観測して、前記微生物又は前記酵素の分解活性を評価する評価工程と、を備え、
前記分解評価物は、ペクチンである、分解活性の評価方法。 - 前記固体培地の状態は、前記板状体の前記支持板の側から、前記支持板を通して観察する、請求項１に記載の分解活性の評価方法。
- 透明な支持板と、
前記支持板の一面上に形成され、分解評価物を含有する固体培地と、
を備える分解活性評価用の板状体を用いた分解活性の評価方法であって、
前記固体培地の厚みが２００μｍ以上１０ｍｍ以下であり、
微生物を磁性化して磁性化微生物とする磁性化工程と、
基板の上に前記磁性化微生物を含有する液体を保持した状態で、前記基板の裏面側から前記基板の複数箇所に磁力をかけて、前記基板の前記複数箇所に前記磁性化微生物を引きつけて配置する配置工程と、
前記配置工程の後に、前記液体を除去する液体除去工程と、
前記磁性化微生物を配置した前記基板の上に前記固体培地が被さるように、前記基板に前記板状体を載せて、前記固体培地と、前記磁性化微生物とを接触させる接触工程と、
前記接触工程の後の前記板状体を第１温度にて保温する第１保温工程と、
前記第１保温工程の後の前記板状体を前記第１温度よりも低い第２温度で保温することによって、前記固体培地のうち、未分解の前記分解評価物が存在する部位を白濁化させる第２保温工程と、
前記第２保温工程の後に、前記固体培地の状態を観測して、前記磁性化微生物の分解活性を評価する評価工程と、を備え、
前記分解評価物は、ペクチンである、分解活性の評価方法。 - 前記固体培地の状態は、前記板状体の前記支持板の側から、前記支持板を通して観察する、請求項３に記載の分解活性の評価方法。
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|---|---|---|---|---|
| JP2001258577A (ja) | 2000-01-14 | 2001-09-25 | Kao Corp | ポリガラクツロナーゼ |
| JP2013532980A (ja) | 2010-06-30 | 2013-08-22 | スリーエム イノベイティブ プロパティズ カンパニー | 吸水性フィルターアセンブリを有するフィルタープレート物品 |
| WO2017131062A1 (ja) | 2016-01-29 | 2017-08-03 | 大日本印刷株式会社 | 黄色ブドウ球菌を検出するための培地及び該培地を有する黄色ブドウ球菌検出シート、並びにそれらを用いる黄色ブドウ球菌の検出方法 |
-
2018
- 2018-07-19 JP JP2018135468A patent/JP7250452B2/ja active Active
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| 日本農芸化学会大会講演要旨集 2018年度大会，2018年03月05日，2A01p20 |
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