CN101977692A - 生物材料的高梯度磁性分离 - Google Patents

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Abstract

说明一种用于对磁性的或磁性标记的生物材料进行分离或纯化的高梯度磁性分离装置，所述高梯度磁性分离装置包含磁体(7)、分离柱(1)、可以布置在分离柱的内腔中的铁磁性基质(2)、以及含有用于平衡分离柱(1)和/或用于使生物材料悬浮的缓冲溶液的储存容器(11)，其中，在操作过程中，由磁体(7)产生的磁场在基质(2)中产生了高梯度磁场，缓冲溶液可以从储存容器(11)通流分离柱(1)。在此，缓冲溶液包含基本溶液和能够使基质(2)的非特异性结合位点饱和的大分子。

Description

生物材料的高梯度磁性分离
技术领域
本发明涉及用于分离和纯化生物材料的高梯度磁性分离(HGMS)技术的应用。
背景技术
尤其是在生物医学研究领域中，从非均质颗粒悬液中分离和纯化确定的颗粒，对于各种不同分析方法来说是极其重要的。一般来说，待纯化的、在后文中称为“靶颗粒”的颗粒，与悬液中包含的其余的、在后文中称为“非靶颗粒”的颗粒相比，通常只有极小的差别。靶颗粒和非靶颗粒通常是细胞或细胞片段，但也可以是任何其他生物物质。
一些已有的分离方法利用了靶颗粒的磁性性质，其中，靶颗粒具有天然存在的“固有”磁性性质，或者其中靶颗粒在实际分离步骤之前通过有针对性地结合合成的磁性颗粒而被标记。
固有磁性颗粒是例如血红细胞，前提情况是：血红细胞中所包含的血红蛋白以脱氧合或氧化而非氧合的状态存在。这里，脱氧合意味着没有携带氧，而氧合意味着携带氧。在后一种情况下，血红蛋白分子通过非共价结合、也就是说可逆结合携带氧分子。与之相区别的是血红蛋白的氧化状态，在该氧化状态中，氧原子或其他氧化性原子共价地、也就是不可逆地结合到血红蛋白分子的中心铁原子上。这时，在脱氧合以及氧化形式(但非氧合形式)中，血红蛋白分子中所包含的中心铁原子的轨道携带不成对电子。这些电子的不成对自旋通过施加磁场在铁原子中实现诱导磁极。
但是，所施加的常规类型的磁场，不能对包含这种铁原子的颗粒施加有向的净磁力，这是因为由于原子直径非常小，在极化的铁原子的北极和南极处的吸引磁力和排斥磁力保持平衡。同样地，在移除磁场后，颗粒将失去其极化。这种磁性被称为“顺磁性”。特定形式的顺磁性有时被称为“超顺磁性”。但是，在这两种形式之间不存在完全明确的区分，因此在下文中，术语“顺磁性”或“顺磁性的”将包含术语“超顺磁性”和“超顺磁性的”。
同样地，可用的、用于靶颗粒磁性标记的合成颗粒是顺磁性的，并且与氧化血红蛋白非常相似地，通常含有极少量的氧化的铁或另一种可磁化物质。此外理想的是，所述合成颗粒是如此之小，以至于它们在悬液中形成稳定的胶体，换句话说，它们在长时间段(数月到数年)中不会沉积，因此，所述合成颗粒的直径一般为30-200nm。这种类型的可商购颗粒，单独地或与抗体偶联进行销售，例如由chemicellGmbH(Eresburgstrasse 22-23，D-12103 Berlin，Deutschland)、micromodPartikeltechnologie GmbH(Friedrich-Barnewitz-Str.4，D-18119 Rostock，Deutschland)、oder Miltenyi Biotech GmbH(Friedrich Ebert Straβe 68，D-51429 Bergisch Gladbach，Deutschland)销售。
已可行的、纯化顺磁性颗粒的方法、也就是说从颗粒悬液中分离顺磁性颗粒的方法，是产生极高的磁场梯度。足够高的磁场梯度导致：顺磁性颗粒的北极和南极经受吸引力和排斥力的差异，并因此产生了有向的净磁力。这种技术用高梯度磁性分离(HGMS)这一名称来称呼。
在这里，需要在所谓的“内部”和“外部”高梯度磁性分离器之间作出区分。对HGMS技术的首次介绍涉及的是内部分离器。它们可以在Oberteuffer(IEEE Transactions on Magnetics，Mag-9，No.3，September 1973：303-306)和US 3.676.337中发现。将用作分离室的适合的非磁性容器中的铁磁性材料导入到强的均匀磁场中，该磁场可以由电磁体或马蹄铁形状的永磁体(偶极磁体)产生。在这种情况下，铁磁性材料一般被称为“基质”；它可以是丝状的(线状或纤维状的)，球形的(球状)，或其他不同形状的，例如它可以由冲出的钢片构成。基质的铁磁性材料通过外部施加的场而获得与其磁化率X相应的磁化。于是，从基质材料的表面出发，产生了磁场梯度，该磁场梯度可以达到高于每厘米100特斯拉，其中，梯度的大小与使用的丝状或球形元件的直径成反比。“外部”高梯度磁性分离器，通过磁体在固有分离室外部的技术上更加复杂的特殊布置，而获得类似的高梯度，例如在WO 98/055236、WO 99/019071或US 6.241.894B1中所公开的。作为重要区别的是，取消了基质位于分离室中的必需性。
当今，内部高梯度磁性分离器在生物医学研究中得到最广泛的推广。US 4.664.796和US 5.200.084描述了这种分离器的具体实施方案。
US 5.200.084公开了特别针对于在微量滴定板的凹陷部中对极少量生物材料进行纯化的装置和方法。其中，记述了从外周血单核细胞(PBMCs)中对于以顺磁性第二颗粒标记的CD4细胞纯化直至83％。
据本发明人的知识，目前只有内部高梯度磁性分离器这一种技术实施方案来实现高的纯化率，正如在WO 96/26782和EP 0.942.766 B1中公开的那样。为了避免将非靶颗粒非特异性结合到基质上，这种结合在所提到的出版文献中介绍的分离器中有损于纯化结果，所述分离器的分离室具有以聚合物涂覆的基质。正如在WO 96/26782中详细描述的，聚合物在几个步骤中施加到基质上。根据作者给出的信息，这样制成的分离室的长处在于，聚合物在基质的铁磁性材料上形成了坚固的、封闭的、不透液体和不透离子的、含有不到1％水的涂层；并且以聚合物涂覆的基质填充了所介绍分离室总体积的60-70％。
除了减少非靶颗粒与基质的非特异性结合之外，根据提到的公开内容，所述涂层被认为也避免待分离的生物材料由于与铁磁性基质材料直接接触而受到损伤(物理损伤)，以及排除了铁磁性基质材料与用于使生物材料悬浮的缓冲溶液发生化学反应，这是因为释放的离子也可能导致待分离的生物材料的损伤(化学损伤)。但是，这两种损伤都将被认为是假定的，这是因为就此而言没有科学上可靠的认识可以提供。此外，Paul等在Clinical and Laboratory Haematology，7，1985：43-53中的报道，反过来报道了通过HGMS柱的未处理的不锈钢基质的血细胞和血细胞片段的形态学和生活力没有受损。
对迄今为止所提到的所有专利和出版物在此加以参引。
所介绍的这种分离室，由于其生产过程耗时，首要地对于基质涂层来说是高成本的。这种分离室可以从Miltenyi Biotech GmbH(上述引文中)商购。
特别是当用于从颗粒悬液中纯化合成的顺磁性颗粒标记的颗粒时，这种分离室实现了高度纯化。
研究了将具有涂层基质的所述分离室用于固有(天然)顺磁性颗粒。在此，疟疾感染的血红细胞用作固有顺磁性颗粒。疟疾的病原体，来自原生动物界的疟原虫属(Plasmodium)的寄生虫，选择性攻击血红细胞，并具有将受感染的血红细胞中产生的游离血红素分子的中心铁原子氧化成三价铁的性质。如上所述，它是顺磁性的。因此，疟疾感染的血红细胞，在高梯度磁性分离器的分离室中，应该可以与未感染的和氧合的血红细胞分离开。这首先在1981年由Paul等(Lancet，July11，1981：70-71)指出。所述的具有涂覆基质的可商购分离室，应当实现了当今高于80％的纯化(Uhlemann等，MACS&more 2000；4(2)：7-8；Trang等，Malaria Journal 2004；3：1-7)。
但是，所列举的研究，仅仅涉及了总共四种已知的在人类中发生的病原性疟疾病原体中的一种，即恶性疟原虫(Plasmodiumfalciparum)，热带疟疾的病原因子，以及啮齿动物中的另一种疟疾病原体，柏氏鼠疟原虫(Plasmodium berghei)。关于总共接近120种其他已知疟原虫物种的其它科学研究尚不可用。但是，对于本发明人已知的是，使用可商购的分离室纯化受到间日疟原虫(Plasmodium vivax)(一种也在人类中发生的间日疟的病原体)感染的血红细胞，并不总是能够产生满意的结果。
从上述的解释可以明了的是，进一步改进HGMS技术的纯化效率，对于生物医学研究领域将是极其有用的。这同样在成本效益方面也是适合的，这是因为已知的复杂先进的分离室，在很多领域仅仅出于价格的考虑便是不可用的，特别是在疟疾病原体的研究中不可用，这些疟疾病原体在医学和研究预算较少的国家影响尤其大。
发明内容
因此，本发明的任务是提供如下的HGMS分离柱，这种HGMS分离柱以成本有效的方式获得较好的纯化结果。
该任务通过权利要求1的HGMS分离柱和权利要求10的方法得以解决，其中使用了内部HGMS。本发明的解决方案基于下述原理，即，通过具有权利要求书中陈述的性质的、用于平衡分离柱和用于悬浮待分离的生物材料的缓冲溶液，来解决非靶颗粒与HGMS分离柱的基质的非特异性结合的问题。这样可以省去复杂和推高成本的涂层，这是因为缓冲溶液使得分离柱的非特异性结合位点饱和。在此，这种非特异性结合位点应该被理解为是颗粒不依赖于其磁性性质而结合的位点，因此，在该位点处，颗粒以机械的、电学的、化学的、物理的或其他方式进行结合。因此，将不依赖于磁性梯度地筛选非靶颗粒，这将导致不完全的纯化或分离结果。生物材料优选为具有固有顺磁性、或可以利用顺磁性或超顺磁性颗粒来直接或间接标记的细胞、细胞聚集物或细胞组成部分。
本发明的解决方案的优点是，可以相对简单和成本有效地提供缓冲溶液。可以省去针对分离柱及包含于分离柱中的基质的、耗费时间的、耗费材料和费用的预处理。在此，与常规的带有基质复杂涂层的分离柱相比，这种简化甚至还具有改进纯化结果的优点。
优选情况下，缓冲溶液具有与待分离的生物材料颗粒的密度相匹配的密度，匹配程度如此之高使得作用在颗粒上的重力基本上得到抵偿，因此颗粒几乎漂浮在缓冲溶液中，和/或缓冲溶液具有高的粘度，使得缓冲溶液能够以适合于分离过程的流速分层地通流分离柱。通过这种方式，靶颗粒可以在高梯度磁场的作用范围内不受重力的扰乱性影响而保持如此时长，使得靶颗粒以非常高的程度沉淀出来。由此，获得了特别高程度的分离度和纯化度。
优选地，磁体是永磁体或电磁体，所述磁体以如下方式成型，即，分离柱可以布置在由所述磁体产生的特别均匀的磁场内，并且通过在空间上分隔和/或关断，分离柱可以可选地处于磁场影响之下或不在其影响之下。通过调整形状，可以使磁场接近基质，从而提供足够的外部磁场强度。此外，磁体必须足够强，以便通过将场强度借助基质聚焦，而可以产生强的高梯度磁场。通过在空间上分隔或关断，靶颗粒可以被有针对性地固着和释放，这取决于在相应的工作步骤中，流出分离柱的液体是否应包含靶颗粒。
优选情况下，基质是未涂层的，和/或具有有序的或无序的丝状、球状或其他形状的材料，特别是防锈的、磁性的不锈钢或钢绒。未涂层的基质是特别成本低廉的，并且根据本发明，涂层不是必需的。但是，可选地，仍可以设想设置有涂层，以便进一步改善分离结果和纯化结果，其中，该涂层与常规情况相比可以是不完全高性能的或较不高性能的。基质的相对宽网孔的布置，防止了待分离的生物材料的物理或化学损伤，例如可以在下面描述的实验中有效避免对敏感细胞的损伤。
优选情况下，储存容器与分离柱相连，以便可以使缓冲溶液经过流入量限制装置或不经过它，以可调节的流速导入分离柱中，和/或分离柱具有流出量限制装置，该流入量限制装置能够对从其中的流出量和分离柱内部的流速产生影响。在此，储存容器与分离柱之间的连接能够以装备的方式例如通过管道，但是也可以通过自由滴落的方式来设置。因此，流速可以适应于生物材料，适应于缓冲溶液和适应于具体的工作步骤，其中，可以实现对缓冲溶液流入的完全阻断，以便例如将闲置的相设置在分离柱中以进行平衡，或用于不需要缓冲溶液的工作步骤中。
缓冲溶液包含基本溶液和至少一种大分子。例如，缓冲溶液含有80到99.8重量％的基本溶液和0.2到20重量％的大分子。
在此，缓冲溶液优选含有基本溶液，基本溶液的离子强度依赖于大分子进行调整，以使大分子对生物材料的聚集效应得到抵偿，其中，基本溶液具有等渗浓度的阳离子钠、钾、镁或钙，和阴离子氯、磷酸根、硫酸根或碳酸根，特别是磷酸盐缓冲的食盐溶液或蔗糖溶液或其混合物。基本溶液也应该根据下面描述的机理在其性质例如pH值等方面进行匹配，并且还与生物材料和用于饱和非特异性结合位点的大分子相匹配，以便获得更好的结果。在此，如果等渗(生理)的磷酸盐缓冲的食盐溶液被等渗的磷酸盐缓冲蔗糖溶液完全或部分取代，则可以特别好地防止生物材料的不希望的聚集。也可以设想蔗糖溶液之外的其他糖溶液。
例如，缓冲溶液含有0.2到10重量％明胶、9.5-10重量％蔗糖、80-95重量％蒸馏水和用于缓冲的磷酸钠，和/或3-10重量％牛血清白蛋白、0.85-0.95重量％氯化钠和89-98重量％蒸馏水和用于缓冲的磷酸钠，和/或0.5-20重量％水解胶原蛋白、5-10重量％蔗糖、0.1-0.9重量％氯化钠和用于缓冲的磷酸钠。
大分子可以有利地包含天然或合成的聚电解质或聚两性电解质，它们可以是强或弱的，特别是合成的聚电解质Orotan 1850或有机聚电解质D-葡萄糖醛酸，和/或大分子具有如下等电点，该等电点能够导致在基本溶液的pH值下产生与待分离生物材料颗粒的电荷相应的电荷，和/或大分子具有10,000到100,000kDa、特别是30,000到70,000kDa的分子量。已证明的是：这样的缓冲溶液产生特别好的结果。
此外，大分子可以优选包含球形的蛋白，特别是白蛋白、牛或人血清白蛋白、卵白蛋白、乳白蛋白或植物白蛋白、β-乳球蛋白、κ-酪蛋白、组蛋白、鱼精蛋白、球蛋白、醇溶谷蛋白或谷蛋白，它们的浓度为3到7重量％，特别是4到5重量％。可选地或附加地，大分子还包含更优选为丝状的蛋白，特别是明胶、牛明胶、猪明胶或硬骨鱼明胶，浓度为0.3到1.5重量％，特别是0.4到0.8重量％，具有150布鲁姆(Bloom)或更低、特别是75Bloom或更低的低凝胶强度。此外，酶水解的胶原蛋白(胶原蛋白水解物)可以可选地或附加地使用，优选情况下浓度为0.3到20重量％，特别是1到10重量％。
这些种类的大分子，特别是在指定的浓度下并具有由此产生的粘度时，格外好地适合于使非特异性结合位点饱和，并且在此，具有适合的流速和密度产生如下条件，在该条件下，靶颗粒可以特别好地粘附到基质上。
在本发明的方法中，在说明书中适当位置提到的每种缓冲溶液，特别是在装置的子权利要求中描述的每种缓冲溶液，都可以用作缓冲溶液。
在此，在通流悬液之前，优选通过与干净的缓冲溶液、即不含生物材料的缓冲溶液预先温育，对基质及包围基质的分离柱进行平衡，更确切地说是经过足够长的时间段，以便使基质中的非特异性结合位点饱和，特别是进过3到20分钟或5到10分钟的时间段内，其中，在平衡过程中，保持基质被缓冲溶液持续覆盖。在这里更优选的是，悬液具有生物材料的对于分离过程临界的浓度，这也取决于所使用的缓冲溶液。根据本发明人的认识，所陈述的时间间隔足以事先使非特异性结合位点足够饱和。该准备性的平衡防止了：开始在将悬液导入基质中时，不需要的颗粒与还没有由缓冲溶液进行完全饱和的悬液的非特异性结合位点结合。在整个过程中，基质保持被覆盖，使得非特异性结合位点不被释放，并且流速保持恒定，因为这将有损于分离结果。
为了分离不需要的生物材料，洗脱液、即离开基质的流体，优选在通流后被接住，其中，磁场仍还激活的情况下，将悬液导入基质后，利用附加的纯缓冲溶液通流基质，直到确保悬液已经完全离开基质，并且其中，在通流过程中，基质始终被缓冲溶液完全覆盖。在这种情况下，靶颗粒是应被移除的干扰物，它们附着在基质中，直至生物材料的本来所需要的组分从基质中完全洗出。被接住的洗脱液不再含有通过磁力吸附到基质上的靶颗粒，靶颗粒被分离了，靶颗粒的浓度在洗脱液中显著降低了，或者在理想情况下，洗脱液不再含有该靶颗粒。随后，保留在基质中的靶颗粒可以被分开清除或者用于其他目的，方法是：在自有的工作步骤中将靶颗粒冲洗出来。
可选地，为了纯化所需生物材料，在将悬液导入基质后，在外部磁场仍然激活的情况下，用附加的纯缓冲溶液以如下时长通流基质，直到悬液完全离开基质，并且接着，在通过空间分隔或通过关断使外部磁场停用的情况下，用附加的纯缓冲溶液冲洗基质，并在此接住由此产生的洗脱液，其中，在整个过程中基质保持被缓冲溶液覆盖。在这种情况下，在激活的磁场阶段中离开基质的流体不含主要需要的生物材料，该流体可以被丢弃或用于别处。只有接着在没有磁场的情况下进行洗出过程，基质才使靶颗粒重新游离，该靶颗粒在随后冲洗基质的过程中以非常显著提高的纯化程度包含在接住的洗脱液中。在该冲洗过程中，缓冲溶液可以与具有激活的磁场情况下实际的HGMS阶段中的缓冲溶液相同，但是也可以是不同的缓冲溶液。在这种情况下，靶颗粒包含在洗脱液的另一种缓冲溶液中，或在两种缓冲溶液的混合物中。
优选情况下，将接住的洗脱液进行离心，并且优选使用离心出来的不含洗脱液液体相的生物材料将该过程重复一次或几次。于是，用于分离步骤时，生物材料保持不含待分离的干扰性靶颗粒，在正相反的情况下，在纯化过程中，靶颗粒保持为纯净形式，不含悬液的缓冲溶液。只要通常在一次通过后已经获得的高分离度或纯化度还不足够的话，就可以将重新实施该过程。这在当分离过程中基质过载的时候尤其适用，否则的话与第一次通过相比，预计只有明显变低的改进。
本发明的方法还能以类似特征进行改进并在此显示出类似的优点，比如所述类似特征示例性地而并非穷举式地在接着独立权利要求的子权利要求中给出。
附图说明
下面，将针对其他的特征和优点，结合实施例并参考附图对本发明进行描述。在附图的图示中：
图1示出本发明的HGMS装置和分离柱的实施方式的结构的示意性前视图；
图2A/B示出本发明的纯化的第一示例的流式细胞分析，其中，使用了含有0.75％明胶的等渗的磷酸盐缓冲的蔗糖溶液作为缓冲溶液(图2A：在通过HGMS柱之前的恶性疟原虫(P.falciparum)培养物；图2B：通过、清洗并将分离柱移离磁场后的洗脱液)；
图3A/B示出描述了根据图2的第二示例，使用了含有牛血清白蛋白(BSA)的磷酸盐缓冲的食盐溶液(PBS)作为缓冲溶液；
图4A/B示出作为点图的第三示例的流式细胞分析(图4A：纯化前外周血单核细胞(PBMCs)悬液中CD8阳性白细胞的比例；图4B：在PBMCs通过、清洗并将分离柱移离磁场后，来自分离柱的洗脱液)；与第一示例中相同，使用了含有0.75％明胶的等渗的磷酸盐缓冲的蔗糖溶液作为缓冲溶液；以及
图5A/B示出描述了根据图4的第四示例，但是与第二示例中相同，使用了含有牛血清白蛋白(BSA)的磷酸盐缓冲的食盐溶液(PBS)作为缓冲溶液。
具体实施方式
图1显示了本发明的纯化装置的实施方式的示意性前视图。纯化装置包括分离柱1、可以从中向分离柱1供应缓冲溶液的液体储存容器11、用于产生强磁场的永磁体或电磁体7、以及特制的缓冲溶液，该缓冲溶液将在下面进一步详细解释。
分离柱1具有壳体和布置于该壳体中的基质2。壳体由非磁性材料构成，并且具有至少一个液体入口6和至少一个液体出口3。液体出口3设有用于影响分离柱1中缓冲溶液流速的装置4，装置4具有多路分接头4和通流限制装置5。可选地，可以使用其他已知的、用以调节分离柱中的流速的装置。
基质2以如下方式构成，即，在分离柱1的内部，由在外部布置的磁体产生了高磁性梯度，正如HGM分离所需的。为此，基质2含有铁磁性材料，例如不锈钢、磁性不锈钢等，它们以有序的或无序的方式，呈丝状、球状或其他形状造型。对于基质2的实施方案的示例，在下面结合实验性纯化进一步列出。
分离柱1与包含于分离柱1中的基质2位于强的、优选均匀的磁场中，该磁场可以由永磁体或电磁体7产生。磁场可以通过例如将分离柱从永磁体的磁场中移走，或通过关断电磁体7，来打开或关断。
液体储存容器11具有液体入口区域12、储液器区域以及液体出口10，缓冲溶液可以从该出口被带入到分离柱1的液体入口6中。液体储存容器11的液体出口10设有用于影响包含在液体储存容器11中液体的流出速度的装置，该装置具有单路分接头8和流动限制装置9。如同分离柱1的液体出口3那样，在这里也可以考虑其他已知的用于调节来自液体储存容器11的出口流速的装置。此外，根据需要，也可以使用和/或互换单路分接头或多路分接头。
上面提到的和本发明所使用的缓冲溶液用于平衡分离柱1和使待分离的生物材料悬浮。该缓冲溶液可以包含纯水和一种或几种不同种类的大分子，这些大分子在足够浓度下具有能够使分离柱1中和其中包含的基质2的非特异性结合位点饱和的性质。此外，优选情况下，缓冲溶液的密度与待分离的颗粒密度足够相似，能够大大地或甚至可能完全减去重力对颗粒的影响，因此使所述颗粒保持悬浮。通过这种方式，在分离柱中缓慢流动的过程中，避免了待分离颗粒的沉积。此外，缓冲溶液具有如下粘度，该粘度在分离柱1中产生了适合于分离过程的、带有层流性质的流速。最后，缓冲溶液中可以包含不同的离子，例如而又不限于阳离子例如钠、钾、镁和钙，或阴离子例如氯化物、磷酸盐、硫酸盐和碳酸盐。在此，提到的列举并不意味着排除其他的阳离子或阴离子。
在缓冲溶液中使用的大分子应该足够地大，以便能够使非特异性结合位点有效饱和，但是不应该大得使这些大分子在使用的浓度下严重地增加缓冲溶液的粘度。因此，大分子优选具有10,000到100,000kDa的分子量，更优选具有30,000到70,000kDa的分子量。有利情况下，加入的大分子带有与待分离的颗粒的电荷相应的电荷，因为这优选涉及待分离的颗粒及大分子与基质2的材料的非特异性结合的竞争性抑制。例如，如果待分离的颗粒是其细胞壁主要带负电荷的细胞，那么优选选择带有负电荷的大分子。
已知的这种带正电或负电荷的大分子被称为聚电解质类。此外，聚电解质的一个亚组被称为聚两性电解质。这称为带有正电和负电官能团的聚电解质。在已知其等电点和分子周围的缓冲溶液pH值的情况下，可以容易地推导出聚两性电解质的净电荷：如果缓冲溶液的pH低于聚两性电解质的等电点，则缓冲溶液的净电荷将在正电区域中。当缓冲溶液的pH值高于等电点时，情况正好相反，所以净电荷位于负电区域中。如果缓冲溶液的pH值位于聚两性电解质的等电点处或与聚两性电解质的等电点非常接近，则缓冲溶液是中性的，因此它不带净电荷。
已被证明在本发明的范围内能够特别有利地用于分离细胞物质的聚电解质，是例如来自蛋白(蛋白质)组的大分子。蛋白组被分成两个亚组，球蛋白(球形)和丝状蛋白(纤维状)。但是，两种提到的亚组之间的概念划分，严格来说应该被视为普及性的，因为球状和丝状蛋白之间的中间形式也存在。因此，在下文中，术语“球状”和“丝状”将包含两个亚组和过渡形式的蛋白。
现在，溶解在液体中的球状和丝状蛋白具有与固态表面可逆和不可逆结合的性质，这种现象大多数情况下吸附或粘附。在与不锈钢表面结合的情况下，科学出版物指出，在溶解在液体中的蛋白与不锈钢表面接触后，产生了蛋白分子在不锈钢表面上的单层(单层分子层)(Nakanishi等，Journal of Bioscience and Bioengineering，91，2001：233-244；Fukuzaki等，Journal of Fermentation and Bioengineering，80，1995：6-11)。该单层的厚度在相应蛋白分子的流体动力学直径(斯托克斯半径(斯托克斯-Radius))的范围内，即在几纳米的范围内变动，但到目前为止还没有发现单层的严格的面对称。但是，可以假定单层的形状不是完全规则地构成。Pradier等指出，在沉积的蛋白分子之间甚至可能存在缝隙，即不锈钢表面可能不能完全被蛋白分子覆盖(Surface and Interface Analysis，34，2002：50-54)。进一步的研究没有弄清这种单层的形成对不锈钢表面的腐蚀有正面还是负面的影响(Omanovic und Roscoe，Langmuir，15，1999：8315-8321；Hansen等，Corrosion Science，37，1995：1423-1441)。总之，必须由如下所述触发，即，水分子和溶解的离子绝不会被单层完全排除。然而，在本发明的情况下，发现：这种单层的形成能够极其有效地阻止非靶颗粒与HGMS-分离器的基质的非特异性结合；此外，没有观察到待分离的生物材料的物理或化学损伤。
下面将进一步阐明了一些被证明在本发明的情况下特别有价值的蛋白，但不将本发明限制于这些特别适合的蛋白。
就此而言，应该特别优选地提到白蛋白，例如牛或人血清白蛋白作为球状蛋白亚组的代表。在白蛋白的组中，其他任何物种的血清白蛋白，以及还有其他白蛋白，例如但不排除卵白蛋白、乳白蛋白或植物白蛋白，也可以使用，但不是优选的。
对于在磷酸盐缓冲的等渗(生理)食盐溶液中的牛或人血清白蛋白来说，在本发明的范围内，从3％到7％、更优选从4％到5％的浓度，被发现对于细胞物质的分离过程是最佳的。明显较低的浓度(0.1％-1％)，例如在细胞研究中通常添加到生理缓冲液中的，在本发明的情况下不能产生所需的结果。一方面，这可以解释为：这种相对低的白蛋白浓度不能有效地使在本发明中使用的具有未涂覆基质2的分离柱1的非特异性结合位点饱和。另一方面，这些低的白蛋白浓度不能赋予缓冲溶液所必需的密度，该密度能够使待分离的颗粒保持悬浮，并且即便在流速缓慢的情况下，也防止重力诱导的沉积。
在丝状蛋白亚组中，在本发明的情况下是要特别优选的是明胶。由于明胶大约pH4.5到pH5.6的有利的等电点以及因此明胶在中性pH下的负电荷，已发现在用于在生理pH范围内分离细胞物质的明胶中，B类明胶(牛明胶)是特别优选的。对于细胞物质的分离过程来说特别有利的浓度范围，对于牛明胶来说，发现是从0.3％到1.5％，更优选从0.4％到0.8％。其他的明胶例如A类明胶(猪明胶)或硬骨鱼明胶(鱼明胶)，或任何其他的明胶，以及作为明胶的另一个亚组的酶水解的胶原蛋白(胶原蛋白水解物)，同样也可以使用，但是不是优选的，因为这些明胶至少对于在生理pH范围内的分离来说，具有不太有利的等电点。一般来说，在提到的不同的B类明胶和其他所述组的明胶中，优选的是具有低的凝胶强度(Bloom强度)的明胶，优选低于150Bloom，更优选低于75Bloom。
可用于本发明的情况中的蛋白类的其他大分子，除了其他蛋白之外，不排除其他的球形蛋白，例如β-乳球蛋白或κ-酪蛋白，或其他来自组蛋白或鱼精蛋白、球蛋白、醇溶谷蛋白和谷蛋白亚组的球形蛋白，以及还有丝状蛋白。
在本发明的其他实施方案中，可以设想使用来自有机的或合成的聚电解质组的大分子，例如合成的聚电解质Orotan 1850TM(Rohm andHaas，Philadelphia，PA，USA)或有机聚电解质D-葡萄糖醛酸。
某些提到的可以添加到缓冲溶液中以减少待分离的生物材料与基质材料的非特异性结合的大分子，与特定的缓冲溶液相组合，导致了待分离生物材料在悬液中的聚集。悬液中血红细胞的聚集倾向性与添加的大分子的分子量和浓度、以及缓冲溶液的离子强度正相关。离子强度被理解为缓冲溶液中溶解的离子的总电荷浓度。低离子强度可以反作用于由添加的大分子引起的聚集，甚至能够完全阻止这种聚集。考虑可以由分子量及对固有粘度的测量而推导出的流体动力学直径(斯托克斯半径)，与单独考虑具体大分子的分子量相比，能够更精确地预测它对血红细胞悬液的聚集促进作用(与Jan和Chien(Journal ofGeneral Physiology，61，1973：638-654，655-668)以及Armstrong等(Biophysical Journal，87，2004：4259-4270)的工作相比)。在下文中，大分子的“分子量”这一术语将总是代表可以从其推导出的该大分子的流体动力学直径(斯托克斯半径)。
在本发明的情况下，已证明如下所述是有利的，即：利用这些知识，并调整缓冲溶液的离子强度以有效防止待分离生物材料的聚集。例如，本发明人发现了血细胞特别是在悬浮于含有明胶的磷酸盐缓冲生理食盐溶液中以后的聚集。为了防止在使用明胶分离血细胞时的这种聚集，已证明用磷酸盐缓冲的生理蔗糖溶液部分或完全取代生理磷酸盐缓冲的食盐溶液，是特别有利的。
从缓冲溶液的颗粒聚集和具体性质(特别是大分子的浓度和分子量，以及缓冲溶液的离子强度)之间所介绍的相互关系，可以对哪种大分子和缓冲溶液的组合特别适合于待分离的特定生物材料的分离作出预测，并可以选择其物理化学性质与特定颗粒所需的分离条件相匹配的、含有大分子的缓冲溶液。在此，在本发明的范围内，缓冲溶液的物理化学性质这一术语包含液体的粘度、密度、离子强度、渗透压和pH值，还有溶解于液体中的大分子的种类、分子量、电荷和浓度，以及大分子和周围大分子的液体二者的其他可产生影响的物理化学参数。
下面，将更详细地分步解释本发明的纯化方法。
在第一步中，将分离柱1用缓冲溶液平衡，以使非特异性结合位点饱和。在此，通过将分离柱1与上述的适合于被研究的具体颗粒悬液的分离过程的缓冲溶液(在下文中称为缓冲溶液A)预先温育一段适配于缓冲溶液中使用的大分子的足够长的时间段而进行平衡。一般来说，这段时间为3到20分钟，更通常为5到10分钟，但是，在很少的情况下，也需要或短或长的时间段。
在平衡后，将待分离的生物材料悬浮在缓冲溶液A中，进样到分离柱1的入口区域6中，其中，分离柱1位于马蹄铁形磁体或电磁体7的均匀磁场中。同时，在多路分接头4的帮助下打开分离柱1的液体出口3。在此，必须注意保持基质2总是被缓冲溶液覆盖。生物材料通流分离柱1，固有磁性的或事先用合成的顺磁性颗粒标记的靶颗粒粘附到基质2上。但是，所有非磁性颗粒，不受阻碍地通过分离柱1，在液体出口3处出去。
在充分添加待分离生物材料后，进行分离柱1的清洗。这一过程用于洗去残留在分离柱1中的非磁性非靶颗粒。在单路分接头8的帮助下，打开含有缓冲溶液A的液体储存容器11的液体出口10，以便这时使纯的缓冲溶液A作为清洗溶液通流分离柱1。在此，必须再次注意的是：保持基质2总是被缓冲溶液覆盖。待用于清洗的缓冲溶液A的量根据分离柱1的尺寸进行适配。足够用于清洗体积为3ml的分离柱1所需的缓冲溶液A的量为大约30-60ml，对于其他尺寸的分离柱来说，必须进行相应的调整。
在完成分离柱1的清洗后，关闭分离柱1和液体储存容器11的液体出口3。将分离柱1移离马蹄铁形磁体7的磁场，或在使用电磁体7的情况下关断磁场。在没有磁场的情况下，这是靶颗粒从基质2上释放下来，并且可以通过使用缓冲溶液A顺行或逆行清洗分离柱1来洗出，或者因为这时执行了分离，所以可以用任何其他缓冲溶液来洗出。
该方法适合于纯化靶颗粒，这是因为靶颗粒包含在通过柱的洗出而获得的洗脱液中，以及适合于从待分离的生物材料中移除靶颗粒。在第二种情况下，从分离柱1中出来的清洗溶液是需要的，该清洗溶液含有减掉了靶颗粒的生物材料。然后，在将悬浮在缓冲溶液A中的生物材料导入分离柱1的过程中以及随后用纯的缓冲溶液A清洗分离柱1的过程中接住清洗溶液。在此，重点注意的是：基质2不要以太高量的靶颗粒过载，这是因为在耗尽了基质2的容量后，未结合的靶颗粒可以与剩余的待分离生物材料一起从分离柱1的液体出口3出来。
如果需要获得更高纯化的话，可以用所获得的纯化靶颗粒重复该方法。这同样适用于力求从待分离的生物材料中更纯地移除靶颗粒的情况下，在通流分离柱1后接住的清洗溶液。但是，在大多数情况下，因为本发明的高纯化程度，这不再是必需的。
下面的试验示例应当对本发明进行进一步说明，但是并不因此而限制试验示例的适用性。
示例1
使用等渗的含有明胶的磷酸盐缓冲蔗糖溶液对被来自恶性疟原虫 (P.falciparum)培养物的疟疾病原体(疟原虫)感染的血红细胞进行 纯化。
材料：
缓冲溶液A1：含有0.75％明胶的等渗磷酸盐缓冲的蔗糖溶液
不锈钢绒1g
单路分接头
三路分接头
20G注射针头
3ml一次性注射器
10ml一次性注射器
50ml一次性注射器
1个钕马蹄铁形磁体
a)纯化试剂盒的制备
分离柱的制造
将用作分离柱1的3ml一次性注射器，以作为基质2的1克不锈钢绒填充到3ml一次性注射器总体积的三分之二。在此，需要注意大量的不锈钢绒纤维位于注射器体的纵向方向上。将三路分接头4和作为流动限制装置5的20G注射针头连至注射器体的液体出口3。一次性注射器的没有用不锈钢绒填充的上部三分之一用作分离柱1的入口区域6。
分离柱的平衡
将这样制造的分离柱在垂直位置上通过三路分接头4用缓冲溶液逆向填充。通过用手指轻拍尽可能完全地排出空气泡，但其中，已发现：剩余的较小的空气泡对分离过程没有负面影响。这时，分离柱1定位于马蹄铁形磁体7的两极之间，从而整个基质2暴露于均匀磁场，并平衡10分钟。
液体储存容器的组装和定位
将设有作为流动限制装置9的18G针头的单路分接头8，安设在用作液体储存容器11的50ml一次性注射器的液体出口10处。然后将用作液体储存容器11的50ml一次性注射器放置在分离柱1上方，使得从针头流出的液体滴入分离柱1的入口区域6中。
b)分离过程的准备和执行
用于纯化疟疾病原体感染的血红细胞的恶性疟原虫(P.falciparum)培养物的制备
将50μl含有13.51％寄生虫血症的恶性疟原虫(P.falciparum)的血红细胞培养物，重新悬浮在450μl RPMI培养基中，在室内空气作用下氧合10分钟。然后将培养物离心，并重新悬浮在5ml缓冲溶液A1中。
分离过程的执行
在分离柱1的10分钟平衡完成后，打开它的液体出口3，同时将重新悬浮的细胞缓慢导入到分离柱1的入口区域中，使得基质2保持被液体始终覆盖。在重悬浮的培养物的完成添加后，打开含有45ml缓冲溶液A1的液体储存容器11的液体出口10。在此，应该避免由操作分离柱1的液体出口3而引起的分离柱1中流速的变化，并注意保持分离柱1的基质2始终被缓冲溶液A1覆盖。在从液体储存容器11完成添加缓冲溶液A1后，通过关闭液体出口3终止分离柱1中的液流，将分离柱1移离磁场。将填充有缓冲溶液A1的10ml一次性注射器与三路分接头4相接，并逆向冲洗分离柱1。在此，将洗脱液接住在适合的容器中，将悬液在1500g的情况下离心5分钟。丢弃上清液，将沉淀重新悬浮在300μl磷酸盐缓冲的食盐溶液中。
c)分析和结果
然后按照别处的描述(Bhakdi等，Cytometry A 2007：(71A)662-667)用吖啶橙染色细胞并进行流式细胞分析。图2利用流式细胞分析的柱状图显示了纯化的结果。A)在通过高梯度磁性分离柱之前的恶性疟原虫(P.falciparum)培养物。M1：正常血红细胞，M2：被恶性疟原虫(P.falciparum)感染的血红细胞(13.51％)。B)在培养物通过、用45ml缓冲溶液A1清洗和从磁场移离分离柱1之后，来自分离柱1的洗脱液。M1：正常血红细胞，M2：被恶性疟原虫(P.falciparum)感染的血红细胞，被纯化到99.54％。相应地，用Giemsa染色的血涂片显示出只有疟疾病原体感染的血红细胞。来自纯化的血红细胞的疟疾病原体可以被毫无问题地培养几天。
示例2
使用含有牛血清白蛋白(BSA)的磷酸盐缓冲的食盐溶液(PBS) 纯化被来自恶性疟原虫(P.falciparum)培养物的疟疾病原体(疟原虫) 感染的血红细胞
材料：
如示例1中所列，但是缓冲溶液A1被缓冲溶液A2(含有5％BSA的PBS)代替。
a)纯化试剂盒的制备
按照示例1中的描述。
b)分离过程的准备和执行
用于纯化疟疾病原体感染的血红细胞的恶性疟原虫(P.falciparum)培养物的制备
如示例1中所述。在本实验中恶性疟原虫(P.falciparum)培养物的寄生虫血症是14.47％。缓冲溶液A1用缓冲溶液A2代替。
分离过程的执行
如示例1中所述，有下列不同之处：
缓冲溶液A1用缓冲溶液A2代替。然后洗脱液的离心在800g的情况下进行5分钟。
c)分析和结果
分析类似于示例1进行。图3利用流式细胞分析的柱状图显示了纯化的结果。A)在通过高梯度磁性分离柱之前的恶性疟原虫(P.falciparum)培养物。M1：正常血红细胞，M2：被恶性疟原虫(P.falciparum)感染的血红细胞(14.47％)。B)在培养物通过、用45ml缓冲溶液A2清洗和从磁场移离分离柱1之后，来自分离柱1的洗脱液。M1：正常血红细胞，M2：被恶性疟原虫(P.falciparum)感染的血红细胞，被纯化到97.03％。相应地，用Giemsa染色的血涂片显示出几乎只有疟疾病原体感染的血红细胞。来自纯化的血红细胞中的疟疾病原体可以毫无问题地被进一步培养几天。
示例3
从白细胞(外周血单核细胞(PBMCs))悬液中纯化带有表面抗 原CD8的白细胞(CD8阳性细胞)。
材料：
如示例1中所列。
a)纯化试剂盒的制备
按照示例1中的描述。
b)分离过程的准备和执行
用抗体偶联的合成的顺磁性颗粒(微珠)标记CD8阳性细胞
将1.5x107个人类外周单核细胞(PBMCs)与单克隆的大鼠抗人类CD8IgG抗体，在PBS/BSA 1％中，在冰上温育30分钟。将细胞用同样的缓冲溶液清洗两次，然后与抗大鼠IgG偶联的微珠(MiltenyiBiotech GmbH，loc.cit.)在冰上继续温育10分钟。将细胞在同样的缓冲溶液中再清洗两次，然后与荧光素标记的抗体(PE-抗CD8抗体和FITC-抗CD3抗体，SimultestTM，BD Biosciences，2350 Qume Drive，SanJose，CA USA 95131)在冰上继续温育30分钟。然后再次用PBS/BSA1％将细胞清洗两次。然后将细胞再次离心出来，重新悬浮在1.5ml缓冲溶液A1中。
分离过程的执行
如示例1中所述。
c)分析和结果
图4显示了从PBMCs悬液中纯化CD8阳性细胞的结果。A)样品的细胞群体。上面的两个象限显示了CD8阳性细胞(23.21％)。B)在PBMCs通过、用45ml缓冲溶液A1清洗和从磁场移离分离柱1之后，来自分离柱1的洗脱液。上面的两个象限显示了CD8阳性细胞，纯化到99.17％。
示例4
从PBMCs悬液移除(贫化)CD8阳性细胞
材料
如示例2中所列，但是使用了25G注射针头代替20G注射针头作为流动限制装置。
A)纯化试剂盒的制备
如示例1中所述。
B)分离过程的准备和执行
用抗体偶联的合成的顺磁性颗粒(微珠)标记CD8阳性细胞
如示例3中所述。
分离过程的执行
如示例2中所述，但是使用了15ml缓冲溶液A2。对于本试验来说，需要的是通过分离柱1的液体。它被接住在适合的容器中，以800g的情况下将细胞离心5分钟，重新悬浮在300μl PBS中。
c)分析和结果
图5显示了从PBMCs悬液中移除CD8阳性细胞的结果。A)样品的细胞群体。上面的两个象限显示了CD8阳性细胞(35.41％)。B)在PBMCs通过、用15ml缓冲溶液A2清洗和从磁场移离分离柱1之后，来自分离柱的洗脱液。上面的两个象限显示了CD8阳性细胞，被贫化到0.57％。
所有上面提到的出版物通过引用整体收入在本专利文件中。
总的来说，本发明是基于如下设想，即，使用带有可消耗材料的技术装置进行生物材料的高梯度磁性分离，技术装置也被称为“试剂盒”，包括或包含：
1.1.分离柱，含有由铁磁性材料构成的基质，适合用于在外部强的均匀磁场中产生高梯度磁场，
1.2.液体储存容器，缓冲溶液A可以由液体储存容器被引入分离柱的入口区域中，
1.3.永磁体或电磁体，用于产生强的、均匀的磁场，
1.4.缓冲溶液A，用于平衡分离柱和使待分离的生物材料悬浮，
其中，缓冲溶液A具有下列三种有利性质中的至少一种：
1.5.缓冲溶液A为平衡分离柱和使待分离的生物材料悬浮而包含大分子，大分子具有能够使分离柱中的非特异性结合位点饱和的性质，和/或
1.6.缓冲溶液A具有如下密度，该密度与待分离的颗粒的密度足够相似，以尽可能地减少重力对颗粒的影响，并因此保持这些颗粒悬浮在缓冲溶液A中，和/或
1.7.所述缓冲溶液A具有如下粘度，该粘度有助于在分离柱中适合于分离过程的具有层流性质的流速。

Claims (14)

1.用于对磁性的或磁性标记的生物材料进行分离或纯化的高梯度磁性分离装置，所述高梯度磁性分离装置包含磁体(7)、分离柱(1)、能布置在所述分离柱的内部空间中的铁磁性基质(2)、以及含有缓冲溶液的储存容器(11)，所述缓冲溶液用于平衡所述分离柱(1)和/或用于使所述生物材料悬浮，其中，在操作过程中，由所述磁体(7)产生的磁场能够在所述基质(2)中产生高梯度磁场，所述缓冲溶液能够从所述储存容器(11)通流所述分离柱(1)，
其特征在于，所述缓冲溶液包含基本溶液以及能够使所述基质(2)的非特异性结合位点饱和的大分子。
2.根据权利要求1所述的装置，其中，所述缓冲溶液具有如下的密度，所述密度以如下程度尽可能相应于所述生物材料的待分离颗粒的密度，即，使得作用于颗粒的重力基本上得到抵偿，因此所述颗粒几乎悬浮在所述缓冲溶液中，和/或所述缓冲溶液具有高粘度，所述高粘度实现了以适合于所述分离过程的流速呈层状地通流所述分离柱(1)。
3.根据权利要求1或2所述的装置，其中，所述磁体(7)是永磁体或电磁体，所述永磁体或电磁体以如下方式成型，即，所述分离柱(1)能够安置在由所述永磁体或电磁体产生的特别均匀的磁场中，其中，能够通过空间上分隔和/或通过关断，选择性地将所述分离柱(1)保持在磁场的影响下或不在磁场的影响下。
4.根据前述权利要求之一所述的装置，其中，所述基质(2)是未涂层的，和/或具有有序或无序的丝状、球状或不同形状的材料，特别是不锈的、磁性的不锈钢或钢绒。
5.根据前述权利要求之一所述的装置，其中，所述储存容器(11)与所述分离柱(1)相连，使得缓冲溶液能够经由流动限制装置(8，9)以能调节的流速导入到所述分离柱(1)中，或不经由所述流动限制装置(8、9)导入到所述分离柱(1)中，和/或其中，所述分离柱(1)具有流动限制装置(4，5)，所述流动限制装置(4、5)能够影响从所述分离柱的流出以及影响所述分离柱(1)内部的流速。
6.根据前述权利要求之一所述的装置，其中，所述基本溶液的离子强度根据所述大分子进行如下调整，即，使得所述大分子对所述生物材料的聚集效应得到抵偿，其中，所述基本溶液具有由钠、钾、镁或钙阳离子以及氯化物、磷酸盐、硫酸盐或碳酸盐阴离子构成的等渗浓度，特别是磷酸盐缓冲的食盐溶液或蔗糖溶液或其混合物。
7.根据前述权利要求之一所述的装置，其中，所述大分子包括天然的或合成的聚电解质或聚两性电解质，特别是合成的聚电解质或有机聚电解质D-葡萄糖醛酸，和/或其中，所述大分子的等电点能够在所述基本溶液的pH值下产生与所述生物材料的待分离颗粒的电荷相应的电荷，和/或其中，所述大分子具有大约10,000kDa到大约100,000kDa、特别是大约30,000kDa到大约70,000kDa的分子量。
8.根据前述权利要求之一所述的装置，其中，所述大分子包括球形蛋白，特别是白蛋白、牛或人血清白蛋白、卵白蛋白、乳白蛋白或植物白蛋白、β-乳球蛋白、κ-酪蛋白、组蛋白、鱼精蛋白、球蛋白、醇溶谷蛋白或谷蛋白，所述球形蛋白的浓度为占所述缓冲溶液的大约3％到大约7％，特别是大约4％到大约5％。
9.根据前述权利要求之一所述的装置，其中，所述大分子包括丝状蛋白，特别是浓度为大约0.3重量％到大约20重量％、特别为大约1重量％到大约10重量％的水解胶原蛋白，或明胶、牛明胶、猪明胶或硬骨鱼明胶，浓度为大约0.3％到大约1.5％，特别是大约0.4％到大约0.8％，具有大约150Bloom或更低、特别是大约75Bloom或更低的低凝胶强度。
10.用于借助高梯度磁性分离来对固有磁性的或预备性磁性标记的生物材料进行分离或纯化的方法，其中，含有所述生物材料的悬液通流布置在外部磁场中的铁磁性基质(2)，从而所述材料粘附到所述基质(2)上，其特征在于，所述基质(2)是未被涂覆的，并且所述生物材料悬浮在如下的缓冲溶液中，所述缓冲溶液含有基本溶液和在通流所述基质过程中使所述基质(2)的非特异性结合位点饱和的大分子。
11.根据权利要求10所述的方法，其中，将所述基质(2)和包围所述基质(2)的分离柱(1)，在所述悬液通流之前，通过利用纯的缓冲溶液、即不含生物材料的缓冲溶液预先温育，而进行平衡，更确切地说是经过足够长的时间段使所述基质(2)中的非特异性结合位点饱和，特别是经过大约3分钟到大约20分钟或大约5分钟到大约10分钟的时间段，并且其中，所述基质(2)在所述平衡过程中始终保持被缓冲溶液覆盖。
12.根据权利要求10或11所述的方法，其中，为了分离不需要的生物材料，洗脱液、即离开所述基质(2)的流体在通流后优选被接住，其中，在将所述悬液导入所述基质(2)后，在磁场仍然激活的情况下，利用附加的纯的缓冲溶液一直通流所述基质(2)，直到确保所述悬液已经完全离开所述基质(2)，并且其中，在通流过程中，所述基质(2)始终保持被缓冲溶液覆盖。
13.根据权利要求10或11所述的方法，其中，为了纯化所需生物材料，在将所述悬液导入所述基质(2)后，在磁场仍然激活的情况下，利用附加的纯的缓冲溶液一直通流所述基质(2)，直到确保所述悬液已完全离开所述基质(2)，并且接着，在通过空间分隔或关断使外部磁场停用的情况下，利用附加的纯的缓冲溶液冲洗所述基质(2)，并且在此，接住所述洗脱液，其中，在整个过程中，所述基质(2)始终保持被缓冲溶液覆盖。
14.根据权利要求10至13之一所述的方法，其中，将接住的所述洗脱液进行离心，并且利用离心过的不含洗脱液液体相的生物材料将所述方法重复一次或几次。
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Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103501912A (zh) * 2011-04-27 2014-01-08 贝克顿·迪金森公司 用于分离样品中磁性标记部分的设备和方法
CN103718018A (zh) * 2011-08-15 2014-04-09 西门子公司 借助磁性通流测量进行的分析物的动态状态确定
CN103765214A (zh) * 2012-08-31 2014-04-30 株式会社东芝 检测体检查装置
CN105170316A (zh) * 2015-10-09 2015-12-23 北京科技大学 一种利用磁化力实现均相混合液体的分子/离子级分离装置及方法
CN108287236A (zh) * 2017-11-24 2018-07-17 中国农业大学 一种基于高梯度磁分离和量子点的荧光生物传感器及其应用
CN109752224A (zh) * 2017-11-06 2019-05-14 广州禾信仪器股份有限公司 浓缩装置及气动聚焦系统

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102008045759A1 (de) * 2008-09-04 2010-03-25 Forschungszentrum Jülich GmbH Verfahren und Vorrichtung zur Sortierung von Partikeln nach deren Magnetisierbarkeit
CN105339090B (zh) * 2013-06-28 2017-03-08 独立行政法人产业技术综合研究所 磁选机用介质以及磁选机
CN108296013B (zh) * 2018-03-02 2023-11-14 浙江大学 一种超顺磁纳米微粒的分离装置及其应用
EP3693739A1 (de) 2019-02-06 2020-08-12 Stefan Schreier Verfahren und vorrichtung zur isolierung von gewünschten zellen aus einer probe nicht-magnetischer biologischer materialien
DE102022200663A1 (de) 2022-01-21 2023-07-27 Robert Bosch Gesellschaft mit beschränkter Haftung Mikrofluidische Vorrichtung und Verfahren zu ihrem Betrieb
WO2024006510A1 (en) * 2022-06-30 2024-01-04 Illumina, Inc. In-tip magnetic-based magnetic bead processing

Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3826365A (en) * 1970-09-28 1974-07-30 Engelhard Min & Chem Beneficiating clay by selective flocculation and magnetic separation of impurities
US3983033A (en) * 1973-03-26 1976-09-28 Massachusetts Institute Of Technology Process for removing dissolved phosphorus from water magnetically
US4664796A (en) * 1985-09-16 1987-05-12 Coulter Electronics, Inc. Flux diverting flow chamber for high gradient magnetic separation of particles from a liquid medium
US5200084A (en) * 1990-09-26 1993-04-06 Immunicon Corporation Apparatus and methods for magnetic separation
US5466574A (en) * 1991-03-25 1995-11-14 Immunivest Corporation Apparatus and methods for magnetic separation featuring external magnetic means
US5512332A (en) * 1985-10-04 1996-04-30 Immunivest Corporation Process of making resuspendable coated magnetic particles
US5536644A (en) * 1985-12-20 1996-07-16 Behringwerke Ag Particle separation method
DE19516323A1 (de) * 1995-04-27 1996-11-07 Dirk Dipl Chem Guenther Verfahren zur Herstellung von magnetisierbaren Dispersionen und deren Verwendung
US6013188A (en) * 1996-06-07 2000-01-11 Immunivest Corporation Methods for biological substance analysis employing internal magnetic gradients separation and an externally-applied transport force
CN1275445A (zh) * 1999-05-31 2000-12-06 中国科学院化工冶金研究所 从流体中分离磁性颗粒的连续式高梯度磁分离方法及装置
WO2006119308A2 (en) * 2005-05-02 2006-11-09 Bioscale, Inc. Method and apparatus for detecting analytes using an acoustic device
CN1899698A (zh) * 2006-06-30 2007-01-24 上海师范大学 磁性分离柱及其在生物样品分离中的应用

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3676337A (en) 1970-07-09 1972-07-11 Massachusetts Inst Technology Process for magnetic separation
IT1176740B (it) * 1984-09-20 1987-08-18 Riserie Virginio Curti Spa Processo di trattamento del riso per migliorarne le caratteristiche qualitative alla cottura
US4666595A (en) * 1985-09-16 1987-05-19 Coulter Electronics, Inc. Apparatus for acoustically removing particles from a magnetic separation matrix
IL87344A (en) * 1988-08-04 1992-03-29 Univ Bar Ilan Process for the production of gelatin from fish skins
AU4746590A (en) 1988-12-28 1990-08-01 Stefan Miltenyi Methods and materials for high gradient magnetic separation of biological materials
US5186827A (en) * 1991-03-25 1993-02-16 Immunicon Corporation Apparatus for magnetic separation featuring external magnetic means
US5391272A (en) * 1992-03-06 1995-02-21 Andcare, Inc. Electrochemical immunoassay methods
US5705059A (en) 1995-02-27 1998-01-06 Miltenyi; Stefan Magnetic separation apparatus
JP2000504213A (ja) * 1996-01-17 2000-04-11 フリンダーズ・テクノロジーズ・プロプライエタリー・リミテッド 細胞内成分を用いる無傷細胞の固相強化
US6451207B1 (en) 1997-06-04 2002-09-17 Dexter Magnetic Technologies, Inc. Magnetic cell separation device
US6241894B1 (en) 1997-10-10 2001-06-05 Systemix High gradient magnetic device and method for cell separation or purification
ES2279600T3 (es) * 1998-03-12 2007-08-16 Miltenyi Biotec Gmbh Sistema de microcolumna para separacion magnetica.
US20030099954A1 (en) * 2001-11-26 2003-05-29 Stefan Miltenyi Apparatus and method for modification of magnetically immobilized biomolecules
US6984497B2 (en) * 2002-04-05 2006-01-10 Bio-Rad Laboratories, Inc. Reducing non-specific binding in immunoassays performed on polymeric solid phases
CA2431683C (en) 2003-06-20 2006-04-18 Irwin Elias Komery Migraine headache eye-rinse remedy solution
RU2349299C2 (ru) 2003-08-26 2009-03-20 Унилевер Н.В. Композиция для ухода за волосами
EP1692515A1 (de) 2003-12-01 2006-08-23 Dade Behring Marburg GmbH Konjugate und deren verwendung in nachweisverfahren
CA2857741C (en) 2003-12-05 2017-06-13 Automed Technologies, Inc. Pharmacy dispensing system and method
DE102004003812A1 (de) 2004-01-25 2005-08-11 Aventis Pharma Deutschland Gmbh Arylsubstituierte Heterozyklen, Verfahren ihrer Herstellung und ihre Verwendung als Arzneimittel
DE102004005172A1 (de) 2004-02-02 2005-08-18 Aventis Pharma Deutschland Gmbh Indazolderivate als Inhibitoren der Hormon Sensitiven Lipase
CA2558018C (en) 2004-03-04 2013-03-26 Mcneilus Truck And Manufacturing, Inc. Mixing drum

Patent Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3826365A (en) * 1970-09-28 1974-07-30 Engelhard Min & Chem Beneficiating clay by selective flocculation and magnetic separation of impurities
US3983033A (en) * 1973-03-26 1976-09-28 Massachusetts Institute Of Technology Process for removing dissolved phosphorus from water magnetically
US4664796A (en) * 1985-09-16 1987-05-12 Coulter Electronics, Inc. Flux diverting flow chamber for high gradient magnetic separation of particles from a liquid medium
US5512332A (en) * 1985-10-04 1996-04-30 Immunivest Corporation Process of making resuspendable coated magnetic particles
US5536644A (en) * 1985-12-20 1996-07-16 Behringwerke Ag Particle separation method
US5200084A (en) * 1990-09-26 1993-04-06 Immunicon Corporation Apparatus and methods for magnetic separation
US5466574A (en) * 1991-03-25 1995-11-14 Immunivest Corporation Apparatus and methods for magnetic separation featuring external magnetic means
DE19516323A1 (de) * 1995-04-27 1996-11-07 Dirk Dipl Chem Guenther Verfahren zur Herstellung von magnetisierbaren Dispersionen und deren Verwendung
US6013188A (en) * 1996-06-07 2000-01-11 Immunivest Corporation Methods for biological substance analysis employing internal magnetic gradients separation and an externally-applied transport force
CN1275445A (zh) * 1999-05-31 2000-12-06 中国科学院化工冶金研究所 从流体中分离磁性颗粒的连续式高梯度磁分离方法及装置
WO2006119308A2 (en) * 2005-05-02 2006-11-09 Bioscale, Inc. Method and apparatus for detecting analytes using an acoustic device
CN1899698A (zh) * 2006-06-30 2007-01-24 上海师范大学 磁性分离柱及其在生物样品分离中的应用

Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103501912A (zh) * 2011-04-27 2014-01-08 贝克顿·迪金森公司 用于分离样品中磁性标记部分的设备和方法
CN103718018A (zh) * 2011-08-15 2014-04-09 西门子公司 借助磁性通流测量进行的分析物的动态状态确定
CN103718018B (zh) * 2011-08-15 2015-11-25 西门子公司 借助磁性通流测量进行的分析物的动态状态确定
CN103765214A (zh) * 2012-08-31 2014-04-30 株式会社东芝 检测体检查装置
CN103765214B (zh) * 2012-08-31 2015-10-21 株式会社东芝 检测体检查装置
US9470700B2 (en) 2012-08-31 2016-10-18 Toshiba Medical Systems Corporation Automatic analyzer
CN105170316A (zh) * 2015-10-09 2015-12-23 北京科技大学 一种利用磁化力实现均相混合液体的分子/离子级分离装置及方法
CN109752224A (zh) * 2017-11-06 2019-05-14 广州禾信仪器股份有限公司 浓缩装置及气动聚焦系统
CN109752224B (zh) * 2017-11-06 2023-11-28 广州禾信仪器股份有限公司 浓缩装置及气动聚焦系统
CN108287236A (zh) * 2017-11-24 2018-07-17 中国农业大学 一种基于高梯度磁分离和量子点的荧光生物传感器及其应用

Also Published As

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CA2698699C (en) 2012-07-24
CN101977692B (zh) 2014-07-23

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