JP7233101B2 - 微小血管造影用の造影剤 - Google Patents
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Description
- 上述のヨード化エステル化油と前述のケトン又は好ましくは2-ブタノンとを含む第1の容器と、
- 上述のポリウレタンを含む第2の容器と、
- 上述の硬化剤を含む第3の容器と
を含む、微小血管造影用キット・オブ・パーツに関する。
- 第1の容器及び第2の容器の中身を受けるための、好ましくは容量12mlの第1のシリンジと、
- 第3の容器の中身を受けるための、好ましくは容量1mlの第2のシリンジと、
- 第1のシリンジの中身と第2のシリンジの中身とを混合するための混合容器と、
- 第1のシリンジ及び第2のシリンジを制御するためのディスペンサーであって、第1のシリンジ及び第2のシリンジそれぞれの第1の端部を受けるためのデバイスを備えたディスペンサーと、
- 好ましくは、第1のシリンジ及び第2のシリンジそれぞれの第2の端部を受け、かつ混合室の第1の端部を受けるためのアダプター要素と
を含む。
a)第1の容器中に、ヨード化エステル化油、好ましくはヨード化エステル化亜麻仁油と、ケトン、好ましくは2-ブタノンとの第1の混合物を準備するステップと、
b)第2の容器中に、ポリウレタンを準備するステップと、
c)第3の容器中に、硬化剤を準備するステップと、
d)第1の容器の中身を第2の容器の中身とブレンドし混合して、第2の混合物を形成するステップと、
e)マウス又はラットの血管系に注入する直前に、第3の容器の中身をステップd)の第2の混合物と混合要素中でブレンドするステップであって、好ましくはポリウレタンと硬化剤との混合比100:16を用いるステップと
を含む方法に関する。
- 上述の造影剤を、好ましくは上述の方法にしたがい準備するステップと、
- 被験動物の身体にカニューレを挿入し、好ましくは透明溶液で、特にPBS(リン酸緩衝食塩水溶液)で洗浄又は瀉血するステップであって、好ましくはマウスの場合には20~100mlの洗浄量、あるいはラットの場合には20~200mlの洗浄量を用いるステップと、
- 造影剤を、好ましくは一定の流量で、好ましくは可能な限り一定の圧力で注入するステップであって、流量は、好ましくは最大3ml/分、特に好ましくは最大1.5ml/分であるステップと
を含む方法に関する。
容器を3つ準備する。容器1は、ヨード化エステル化油、好ましくはヨード化エステル化亜麻仁油と、2-ブタノン(C4H8O)と、色素(VasQtec社製BlueDye)との第1の混合物を含む。この第1の混合物は、本願の文脈では、色素の有無にかかわらず「造影溶液」と称される。容器2は、ポリウレタン(PU)を含む。容器3は、硬化剤を含む。
12ml使い捨てシリンジ(例えばルアーロックc1086付きMonojectシリンジ、Qosina社)を容器1のルアーコネクター(20mmバイアルキャップ用ポリカーボネート製拭き取り可能無針バルブ雌ルアー、Value Plastic社)に回し嵌め;容器1に空気5mlを注入し(垂直方向圧力)、容器1を回転させ、造影剤を全てシリンジ内へ吸引する。
容器2の中の第2の混合物を、Vortexデバイスで混合する。実験で用いた造影剤とPUとの第2の混合物(硬化剤なし)の粘度は、この時点で20℃で約100mPas.sである。
ルアーキャップを取り外し;容器2に空気10mlを注入し;容器2を回転させ、第2の混合物を12ml使い捨てシリンジ内へ吸引する。
1ml使い捨てシリンジ(ルアースリップc3302付き1mlシリンジ、Qosina社)を容器3(又は容器3に取り付けられたルアーコネクター)に回し嵌め;容器3に空気0.5mlを注入し;硬化剤を全て(1ml)吸引する。
シリンジの中身の脱気、すなわち微小気泡を除去するため、少なくとも15分間、シリンジを直立状態にする。
最初に動物に深麻酔をするか又は安楽死させてから、カニューレを挿入する。動物の身体の洗浄は、2×5~50mlの透明溶液、好ましくは等張溶液、例えばPBS(リン酸緩衝食塩水)溶液などで行う。好ましくは、動物を二分して洗浄する(その後も、各半身にそれぞれ造影剤を充填する)。
9a.)(手動)ディスペンサーに取り付ける場合:それぞれが第1の端部を有する12mlシリンジ及び1mlシリンジを、互いに接続された2シリンジ・ディスペンサー(2つの使い捨てシリンジ11:1(M-System、Medmix Systems AG))に挿入し;アダプター(Adapter L-System、Medmix Systems AG)を2つのシリンジそれぞれの第2の端部に取り付け;アダプターを混合容器(ミキサー、ML 3.2-16-LLM、DN3.2×16、Med.LuerLock、Medmix Systems AG)に取り付ける;又は
9b.)注入ポンプに取り付ける場合:両シリンジを注入ポンプに取り付け;ポンプを正しい位置に手動で調節し;2つのシリンジそれぞれの第2の端部でアダプターを回し外し;アダプターを混合容器に取り付け;ポンプ(シリンジポンプLEGATO 100、220V/50Hz、CE、kdScientific社)のセットアップ、パラメーターの選択を行う(モード:注入のみ;シリンジ:Sherwood 12ml;流量:最大1.5ml/分;最大体積:約3ml/マウス、約9~10ml/ラット)。
10a.)慎重に均一に、できるだけ同じフローで、又は
10b.)ポンプを起動、最大流量1.5ml/分。
カニューレ(例えばAichele Medica AG製BD Neoflon 0.6×19mm、26G、洗浄に使用したカニューレでもよい)を手動ディスペンサー(オプションa)又はポンプ(オプションb)に取り付ける。
下半身に属する全ての臓器に、下半身の完全充填により、上述したように造影剤を充填することができる。上半身全体に充填することで、脳に造影剤を充填することができる。
注入後、造影剤は、大動脈から動脈を通って動物の身体の毛細血管網及び静脈系へと移動していき、そこで重合により硬化する。造影剤は、少なくとも20~30分で硬化する。次に、硬化した造影剤を含む動物の身体の一部を化学的に、好ましくは2%パラホルムアルデヒド溶液で固定し、それから0~8℃で数カ月間は保存することができる。
動物の身体の撮像法、又はマイクロCTデバイスを用いたスキャンは、硬化した状態で実行される。スキャン中は、画像の乱れにつながるため、体が動いたり動かされたりしてはならない。微細な動きも防ぐために、スキャン中は動物の身体を機械的に固定すべきである。
CTスキャン後、動物の身体を、再び0~8℃で2%パラホルムアルデヒド溶液中に保存することができる。
続いて、動物の身体の一部又は臓器の組織学的検査を行うことができる。そのために、従来のパラフィン包埋、従来の組織学的薄片法、色素及び免疫組織化学を用いることができる。
マイクロCT映像は、スキャン後に例えばNReconソフトウェア(NReconServer64bit、Bruker社、MicroCT、ベルギー国Kontich)を用いて逆戻しに再構成された映像の場合もあるし、CTVoxソフトウェア(Bruker社、MicroCT、ベルギー国Kontich)を用いて「ボリュームレンダリング」され、三次元的に視覚化される場合もある。組織及び血管を、CTAnソフトウェア(Bruker社、MicroCT、ベルギー国Kontich)を用いてセグメント化し分析することができ、あるいは他の一般公開されているソフトウェア、例えばMatlab(The MathWorks, Inc.、米国マサチューセッツ州ナティック)又はImageJ(Rasband, W.S., ImageJ、アメリカ国立衛生研究所、米国メリーランド州ベセスダ、http://imagej.nih.gov/ij/、1997-2016)を用いて判定することもできる。
造影剤の最適な組成を求めて、ヨード化エステル化亜麻仁油の2-ブタノン及びPUに対する異なる比率を試験した。ここで、PUと硬化剤との重量%での好ましい一定の比率として、100:16を用いた。さらに、いずれの場合も、粉末形態の青色色素を0.2g(又はひとつまみ)用いた。混合試験を、以下のように実施した。
混合試験後、造影剤混合物をさらに最適化した。造影剤を被験体又は被験臓器に注入するための上述の本方法では、硬化剤又は第3の容器の中身は、残りの造影剤構成要素の注入中又は注入直前になってはじめて混合される。そのためにはダブルシリンジが用いられる。その場合、硬化剤と残りの(第2の)混合物との特定の体積比は1:11と予め決まる。そうなると常に硬化剤が余ることになり、したがって、総量に占める硬化剤の量は限定すべきではない、ということになる。混合試験ではダブルシリンジを使用しなかったため、硬化剤は所定量の0.8mlを用いた。
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Claims (29)
- 死後微小血管造影用の、マイクロCTデバイスを用いたマウスもしくはラットもしくは他の実験動物、又は動物及びヒトの個々の臓器の血管系のデジタル撮像用の、
- ポリウレタンと
- 硬化剤と
を含む造影剤であって、
さらに、
- ヨード化エステル化亜麻仁油と
- 2-ブタノンと
を含むことを特徴とする、造影剤。 - 前記ヨード化エステル化亜麻仁油が、エチル-9,12,15-トリヨードオクタデカトリエノアートであることを特徴とする、請求項1に記載の造影剤。
- 前記造影剤が色素を含むことを特徴とする、請求項1又は2に記載の造影剤。
- 前記ポリウレタンが、ポリイソシアナート-プレポリマーであることを特徴とする、請求項1~3のいずれかに記載の造影剤。
- 前記硬化剤が、変性芳香族ジアミンであることを特徴とする、請求項1~4のいずれかに記載の造影剤。
- - 前記ヨード化エステル化亜麻仁油が、20~60%の割合で前記造影剤に含まれ、
- 前記2-ブタノンが、7~30%の割合で前記造影剤に含まれることを特徴とする、請求項1~5のいずれかに記載の造影剤。 - 前記ヨード化エステル化亜麻仁油と前記2-ブタノンとを含む造影溶液において、前記2-ブタノンの体積に対する前記ヨード化エステル化亜麻仁油の体積の比率が、0.75~4であることを特徴とする、請求項1~6のいずれかに記載の造影剤。
- 前記ポリウレタンは、25~60%の割合で前記造影剤に含まれ、
- 前記硬化剤は、4~10%の割合で前記造影剤に含まれることを特徴とする、請求項1~7のいずれかに記載の造影剤。 - - ヨード化エステル化亜麻仁油を含み、かつ2-ブタノンを含む第1の容器と、
- ポリウレタンを含む第2の容器と、
- 硬化剤を含む第3の容器と
を含む、死後微小血管造影用のキット・オブ・パーツ。 - 前記第1の容器がさらに、色素を含む、請求項9に記載のキット・オブ・パーツ。
- - 前記第1の容器が、2~4mlの前記ヨード化エステル化亜麻仁油と、2~3mlの前記2-ブタノンとの第1の混合物を含み、
- 前記第2の容器が、4~7mlの前記ポリウレタンを含み、
- 前記第3の容器が、0.5~1.5mlの前記硬化剤を含む、
請求項9又は10に記載のキット・オブ・パーツ。 - さらに、
- 前記第1の容器及び前記第2の容器の中身を受けるための第1のシリンジと、
- 前記第3の容器の中身を受けるための第2のシリンジと、
- 前記第1のシリンジの中身と前記第2のシリンジの中身とを混合するための混合容器と
を含む、請求項9~11のいずれかに記載のキット・オブ・パーツ。 - マイクロCTデバイスを用いてマウス又はラットの血管系をデジタル撮像するための、請求項1~8のいずれかに記載の死後微小血管造影用の造影剤の製造方法であって、
f.)第1の容器中に、ヨード化エステル化亜麻仁油と2-ブタノンとの第1の混合物を準備するステップと、
g.)第2の容器中に、ポリウレタンを準備するステップと、
h.)第3の容器中に、硬化剤を準備するステップと、
i.)前記第1の容器の中身を前記第2の容器の中身とブレンドし混合して、第2の混合物を形成するステップと、
j.)被験血管系に注入する直前に、前記第3の容器の中身をステップi.)の前記第2の混合物と混合要素中でブレンドするステップと
を含む、方法。 - マイクロCTデバイスを用いて死後の動物又は死後のヒトの身体若しくは臓器の血管系をデジタル撮像するための死後微小血管造影法であって、
k.)請求項1~8のいずれかに記載の造影剤を準備するステップと、
l.)被験動物の身体にカニューレを挿入し、洗浄するステップと、
m.)前記造影剤を、前記身体又は前記臓器に注入するステップと
を含む、死後微小血管造影法。 - 前記造影剤の注入後、前記動物の身体内で前記造影剤が硬化するのを待ち、次いで前記動物の身体をマイクロCTデバイスを用いてスキャンすることを特徴とする、請求項14に記載の死後微小血管造影法。
- ステップm)での注入が、ディスペンサーを用いて行われるか、又はステップm)での注入が、注入ポンプを用いて行われることを特徴とする、請求項14又は15に記載の死後微小血管造影法。
- 前記造影剤が、ヒトもしくは動物の身体、又はヒトもしくは動物の臓器に注入されることを特徴とする、請求項1~8のいずれかに記載の造影剤又は請求項9~12のいずれかに記載のキット・オブ・パーツの、死後微小血管造影における使用。
- 前記造影剤が青色色素であることを特徴とする、請求項3に記載の造影剤。
- 前記ポリウレタンが、脂肪族イソシアナートであることを特徴とする、請求項4に記載の造影剤。
- 前記硬化剤が、ジエチルメチルベンゼンジアミンであることを特徴とする、請求項5に記載の造影剤。
- 前記硬化剤が、ジエチルメチルベンゼンジアミンの2種の異性体の混合物であることを特徴とする、請求項5に記載の造影剤。
- 前記ポリウレタンと前記硬化剤との体積比は、100:10~100:25の範囲にあることを特徴とする、請求項1~21のいずれかに記載の造影剤。
- 前記ヨード化エステル化亜麻仁油は、エチル-9,12,15-トリヨードオクタデカトリエノアートであり、
前記ポリウレタンは、4,4’-メチレン-ジ(シクロヘキシル-イソシアナート)であり、
前記硬化剤は、2,6-ジアミノ-3,5-ジエチルトルエンであることを特徴とする、請求項9に記載の死後微小血管造影用のキット・オブ・パーツ。 - - 前記第1の容器が、2.5~2.8mlの前記ヨード化エステル化亜麻仁油と、2.2~2.9mlの前記2-ブタノンとの第1の混合物を含み、
- 前記第2の容器が、4.5~5mlの前記ポリウレタンを含み、
- 前記第3の容器が、0.8~1.2mlの前記硬化剤を含む、
請求項11に記載のキット・オブ・パーツ。 - さらに、
- 前記第1のシリンジ及び前記第2のシリンジを制御するためのディスペンサーであって、前記第1のシリンジ及び前記第2のシリンジそれぞれの第1の端部を受けるためのデバイスを備えたディスペンサーを含む、請求項12に記載のキット・オブ・パーツ。 - さらに、
- 前記第1のシリンジ及び前記第2のシリンジそれぞれの第2の端部を受け、かつ前記混合容器の第1の端部を受けるためのアダプター要素を含む、請求項12に記載のキット・オブ・パーツ。 - 前記ステップj.)において、前記ポリウレタンと前記硬化剤との混合体積比100:16~100:19を用いる、請求項13に記載の死後微小血管造影用の造影剤の製造方法。
- 請求項14に記載の、マイクロCTデバイスを用いて死後の動物又は死後のヒトの身体若しくは臓器の血管系をデジタル撮像するための死後微小血管造影法であって、
k.)請求項1~8のいずれかに記載の造影剤を、請求項13に記載の方法にしたがい準備するステップと、
l.)被験動物の身体にカニューレを挿入し、洗浄するステップであって、透明溶液で、マウスの場合には20~100mlの洗浄量を、あるいはラットの場合には20~200mlの洗浄量を用いるステップと、
m.)前記造影剤を、一定の流量で前記身体又は前記臓器に注入するステップと
を含む、方法。 - 請求項14に記載の、マイクロCTデバイスを用いて死後の動物又は死後のヒトの身体若しくは臓器の血管系をデジタル撮像するための死後微小血管造影法であって、
前記ステップm.)において、前記造影剤を、最大1.5ml/分の流量で、前記身体又は前記臓器に注入する、方法。
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