JP7215008B2

JP7215008B2 - 粒子検出方法

Info

Publication number: JP7215008B2
Application number: JP2018141532A
Authority: JP
Inventors: 和樹飯嶋; 晃治片山
Original assignee: Tosoh Corp
Current assignee: Tosoh Corp
Priority date: 2018-07-27
Filing date: 2018-07-27
Publication date: 2023-01-31
Anticipated expiration: 2038-07-27
Also published as: JP2020016615A

Description

本発明は、粒子検出方法に関する。

粒子を個々に１つずつ測定することで、マイノリティーな粒子群を正確に検出可能な技術として、電気的検出を用いるコールター法（電気的検知帯法；以下ＥＳＺ）（例えば、非特許文献１参照）が知られている。この手法は、各検出手段から得られる情報（シグナル）が、各粒子に対して１対１で対応しているため粒子個々の評価をすることが可能であり、数的に含まれる割合の少ない粒子でも正確に測定できる。

ＥＳＺで測定できる粒子の種類は、ポリマー等の有機粒子から無機粒子、細胞、小胞、リポソーム、生体分子等多岐にわたるが、電気的に粒子の測定を行う原理上、粒子を懸濁する溶液には一定値以上の電気伝導度が必要であり、一般には電解質等の塩が一定量添加される。しかしながら、例えば無機粒子であるシリカ粒子では、懸濁溶液中に一定量以上の塩が存在した場合、存在する塩の影響でシリカ粒子同士の凝集がみられる場合がある。一般に、塩の存在しない純水に懸濁されている場合は、各シリカ粒子表面の電気二重層間の静電反発力がシリカ粒子間の分子間力よりも大きいため、粒子凝集が抑制されている。しかし、塩が添加された溶液の場合、プロトン、アニオンの濃度が増大したことによりシリカ粒子表面の電気二重層の厚みが薄くなり、シリカ粒子間の静電反発力が分子間力よりも小さくなることで粒子凝集が生じてしまう（例えば、非特許文献２参照）。

したがって、ＥＳＺによる種々の粒子の測定を行う上で、粒子間の凝集が抑制された理想的な条件で測定を行うためには、粒子を懸濁する溶液の電気伝導度を逐次調整する必要があり、一般に塩濃度を下げていく必要がある。但し、塩濃度を下げた場合、塩濃度に付随して電気伝導度も低下するため、粒子の検出感度も低下してしまう。すなわち、粒子の凝集抑制と、ＥＳＺの粒子検出感度の担保は相反するものであるため、両立することが難しい。

Ｒ．Ｗ．ＤｅＢｌｏｉｓ．ｅｔａｌ、ＴｈｅＲｅｖｉｅｗｏｆＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｖｏｌｕｍｅ４１、Ｎｕｍｂｅｒ７、ｐｐ９０９－９１６（１９７０）臼井進之助、佐々木弘、資源・素材学会誌、１０７、Ｎｏ．９、ｐｐ５８５－５９１（１９９１）

本発明の課題は、ＥＳＺによる粒子検出において、測定する粒子をより理想的な条件で測定するために粒子懸濁液の塩濃度を下げた、溶液の電気伝導度が低い場合においても、高感度に粒子検出できる粒子検出方法を提供することにある。

本発明者らは上記課題を鑑み、アパーチャを有した電気検出器からなる粒子検出部に電極を配置し、前記電極を備える空間を、粒子を懸濁している流体よりも高い電気伝導度を持つ流体で満たしておくことで、粒子が懸濁されている流体の電気伝導度が低い場合でも高感度に粒子検出が可能となることを見出した。

すなわち、本発明は、
ＥＳＺにより流体中に存在する粒子を検出する方法であって、
前記流体の電気伝導度に対して、電極を備える空間を満たす流体の電気伝導度が高いことを特徴とする。

本発明により、ＥＳＺによる粒子検出において、粒子懸濁液の塩濃度を下げ、溶液の電気伝導度が低い場合においても、高感度に粒子検出できる粒子検出方法を提供することができる。これにより、塩の添加による粒子凝集を抑制しながら高感度に粒子検出が可能となる。

図１は、本発明を実施するためのマイクロチップ１０を示す。図２は、本発明の概要を示した図であり、粒子５０をアパーチャ５３ａまたは５３ｂへ流入させ、２つの流体排出口に配置した電極５４ａ、５４ｂによりＥＳＺの原理に基づいた粒子検出を行う態様を示す図である。図３（ａ）（ｂ）（ｃ）（ｄ）は、本発明を実施するための別の態様のマイクロチップ１０を示す。実施例１における粒子検出部１０３の電流値変化の測定の様子の一部を示したものである。実施例１の測定結果をヒストグラムにまとめたものである。比較例１における粒子検出部１０３の電流値変化の測定の様子の一部を示したものである。

以下、本発明を実施するための形態について、図面を用いて詳細に説明する。但し、本発明は異なる形態による実施が可能であり、以下に示す実施形態、実施例の例示にのみ限定されるものでは無い。

本発明による粒子検出方法を実施するための装置構成の一実施例を示す模式図である図１、２、３をもとに本発明の実施形態についての詳細を説明する。

図１、２に示す通り、粒子を含むサンプルは、流体導入口であるインレット１４から導入され、送液部によって流路下流へと送液され、導入流路１０１、排出流路１０２ａまたは１０２ｂ、それぞれ対応する粒子検出部１０３ａまたは１０３ｂを通過して、流体排出口であるアウトレット１０４ａまたは１０４ｂへ流出する。導入流路１０１を流れる粒子は、粒子回収流路１０２ａまたは１０２ｂへと流れる。排出流路１０２ａまたは１０２ｂを経て到達した粒子検出部１０３ａ、１０３ｂにおいて、電気的検出が行われる。この時、粒子検出部１０３ａ、１０３ｂの内部と、アウトレット１０４ａ、１０４ｂは電解質を含む溶液で満たされ、アウトレット１０４ａ、１０４ｂには電極５４ａ、５４ｂが浸漬されている。さらに、電極５４ａ、５４ｂへは、それぞれに接続された導線５５を介して電気測定器５６、電源５７が接続されている。粒子検出時は、電源５７により任意の値の電流が流れており、アパーチャ５３を介した閉回路ができている。さらに電気測定器５６は解析部６１に接続されており、電気測定器５６から得られた検出シグナルを解析部６１で計算し、粒子径分布を作成する。

アウトレット１０４ａ、１０４ｂは電解質を含む流体で満たされるが、その電気伝導度は粒子を懸濁している流体よりも高い電気伝導度を持つ流体で満たされている。前記条件において、例えば粒子を懸濁している流体の電気伝導度が５ｍＳ／ｃｍであった場合、アウトレット１０４ａ、１０４ｂに満たされる流体の電気伝導度は５ｍＳ／ｃｍよりも大きく、１０ｍＳ／ｃｍよりも大きい方が好ましい。

また、アウトレット１０４ａ、１０４ｂの容量は、相対的に低い電気伝導度をもつ粒子を懸濁している流体の流入による影響（電気伝導度の低下）を軽減するために、前記流体の流入量に対して十分大きい容量となるよう設計することが好ましく、好ましくは０．１μＬ以上、より好ましくは１μＬ以上の容量を持つことが好ましい。

また、図３（ａ）（ｂ）に示す通り、粒子を含むサンプルは、流体導入口であるインレット１４から導入され、送液部によって流路下流へと送液され、導入流路１０１、排出流路１０２、粒子検出部１０３を通過して、流体排出口であるアウトレット１０４へ流出させてもよい。導入流路１０１を流れる粒子は、粒子回収流路１０２へと流れ、到達した粒子検出部１０３において、電気的検出が行われる。この時、粒子検出部１０３の内部は電解質を含む溶液で満たされ、電極５４ａ、５４ｂは電解質に浸漬されている。さらに、電極５４ａ、５４ｂへは、それぞれに接続された導線５５を介して電気測定器５６、電源５７が接続されている。粒子検出時は、電源５７により任意の値の電流が流れており、アパーチャ５３を介した閉回路ができている。さらに電気測定器５６は解析部６１に接続されており、電気測定器５６から得られた検出シグナルを解析部６１で計算し、粒子径分布を作成する。

図３（ｂ）に示す態様においては、電極５４ａ、５４ｂが浸漬されている電解質を含む流体は、その電気伝導度は粒子を懸濁している流体よりも高い電気伝導度を持つ流体で満たされている。

また、図３（ｃ）、（ｄ）に示すように、インレット１４ａから導入された粒子を含むサンプルが、インレット１４ｂから導入されたシース流体によって中央に集束する態様を取ることもできる。この時、シース流体の電気伝導度が前記サンプルの電気伝導度よりも高い電気伝導度を持つ流体であり、前記条件において、例えば粒子を懸濁している流体の電気伝導度が５ｍＳ／ｃｍであった場合、シース流体の電気伝導度は５ｍＳ／ｃｍよりも大きく、１０ｍＳ／ｃｍよりも大きい方が好ましい。つまり、電極を備える空間を満たす流体の少なくとも一部、好ましくは半分以上の流体の電気伝導度が、粒子を懸濁している流体の電気伝導度よりも高ければ、本発明の効果を得ることができる。

粒子を含むサンプルは、測定対象とする粒子を含んだ流体である。本発明における粒子とは、粒径が１ｎｍ～１０００μｍ、好ましくは１０ｎｍ～１００μｍの範囲にあり、例えば、核酸、タンパク質、小胞、リポソーム、細胞外小胞、無機粒子、金属コロイド、高分子粒子、ウイルス、ウイルス様粒子、細胞、細胞塊、前記粒子の凝集体や会合体、融合体などが含まれる。また本発明における流体は、導電性の流体であり、好ましくは電解質を含む水溶液であるが、電解質を含む有機溶媒、導電性のオイルや油を用いることもできる。

測定時に粒子を懸濁する流体の塩濃度を下げ、電気伝導度を下げることで粒子の凝集を抑制する必要がある粒子としては、冒頭に記載したシリカ粒子の様な無機粒子以外にも前述の各粒子にも同様のことが言える。また、細胞やリポソームのように、膜構造を持つ粒子においては、粒子を懸濁する流体は細胞やリポソームの膜内部の流体と等張である方が好ましく、そうでない場合は浸透圧の差により粒子が収縮または膨張により破裂する可能性がある。従って膜構造をもつ粒子の場合においても、粒子を懸濁する流体の塩濃度を下げて測定をする場合が想定されることから、本発明は細胞やリポソームのような粒子においても同様の効果が得られるといえる。

送液部は、シリンジポンプやペリスタポンプ、圧送ポンプ等の圧力勾配により送液させる方法を用いてもよいし、マイクロチップ１０の流路断面における不均一な速度分布を抑制するために電気浸透流ポンプを用いてもよい。この場合、ポンプから接続された配管はインレット１４へ直接接続することでインレット１４内に保持されているサンプルへ圧力を印加することで送液する。また、アウトレットへ配管を介してポンプを接続し、陰圧をかけることによりマイクロチップ１０の流路内の流体を吸引させることで送液してもよい。さらに、インレット１４の液面を、アウトレット１０４ａまたはアウトレット１０４ｂの液面よりも高くすることで、液面差により送液してもよく、この場合送液部は不要となる。より定量的な測定をするためには圧力勾配により粒子を通過させた方が好ましく、脈動がより少ない圧送ポンプで送液する態様が最も好ましい。

送液部の流量は、流路の断面積やアパーチャの断面積により任意の値に設定することが好ましく、一例として、０．０１μＬ／ｈｏｕｒから１ｍＬ／ｈｏｕｒの間に設定することが好ましい。

粒子検出部１０３は、アパーチャ５３と電気検出器とを含む。アパーチャ５３は、流路内に形成された流路直径よりも小さい穴を指し、粒子検出流路６２とアパーチャ形成構造５２により規定される。アパーチャの断面積は、測定する粒子よりも大きければよいが、一般にＥＳＺで測定可能な粒子径範囲は、アパーチャ断面積の２～６０％といわれているため、流入してくると想定される粒子の大きさに応じて設計する必要がある。

粒子検出部１０３は２以上配置されてもよく、それぞれの末端に流体排出口が接続されている。電極５４ａ、５４ｂは流体排出口内の電解質を含む溶液内にその先端が浸漬するようにして配置されており、電源から供給された電流は、一方の電極５４ａまたは５４ｂから、アパーチャ５３ａまたは５３ｂを通過し、分岐部１１０を通ってもう一方のアパーチャを通過し、他方の電極へと流れることになる。この場合、ＥＳＺによる粒子検出の感度は、アパーチャと電極までの間の流路抵抗に比例して低下するため、得られたシグナルから粒子径を算出する場合は、このシグナル低下を加味する必要がある（式（１）参照）。この時、Ｌはアパーチャを形成する流路の長さ、ｄｅはアパーチャの等価直径、Ｌ’は中継流路６０の長さ、ｄｅ’は中継流路６０の等価直径とした。また、式（１）によるシグナル低下の加味はその流路構造に応じて適宜行うことが好ましく、必ずしも式（１）と完全に合致した式でなくてもよい。

複数の粒子検出部１０３のアパーチャ５３ａ、５３ｂの各々の断面積または体積が同じ場合、両アパーチャから得られるシグナルは凡そ同一となる。すなわち、両アパーチャへ流れてきた粒子全てを同様に検出することが可能であり、濃度の定量的な測定という観点で好ましい。

電源５７は直流または交流電源を用いられるが、測定の際によりノイズが影響しにくいものを選択する方が好ましく、コスト面からは、例えば乾電池等の安価で低ノイズである直流電源を用いる方が好ましい。また、電極の材料は電気抵抗が小さい材質であれば制限はなく、金属、無機化合物、有機化合物を用いることができるが、耐久性とコストの面から金属であることが好ましい。

粒子検出部１０３の電気検出器は、電極５４、電極５４に導線５５を介して接続される電気測定器５６、及び電源５７から主に構成される。電気測定器５６は、電気的特性を検知するものであればよく、電流測定器、電圧測定器、抵抗測定器、電荷量測定器が挙げられ、ＥＳＺの測定においては電流測定器を用いるのが最も好ましい。また、ＩＶアンプを用いて、電流電圧変換後に利得を上げて、微小な電流値変化を検出することが、より微小な粒子を検出する上で好ましい。またアパーチャ内を通過した粒子を取りこぼしなく検出するために、電気測定器５６のサンプリング時間間隔は、粒子がアパーチャを通過するのに要する時間よりも十分短いことが好ましく、１秒間に１万回以上サンプリングすることが好ましく、１秒間に２万回以上サンプリングすることがさらに好ましい。

解析部６１では、測定結果を演算するための演算装置と、測定結果又はそれに由来する演算結果を記録するための記録媒体とを具備することができる。あるいは、これらの演算装置及び記録媒体は、電気測定器５６と一体化していてよいし、電気測定器５６に対して接続可能な外部装置であってもよい。記録媒体に記録されるデータには、サンプリングした電流値と、粒子が通過した際に発生する電流値変化、またその電流値変化から算出される粒子径、粒子数、粒子濃度、検出時間又は測定開始時からの経過時間が含まれる。

粒子検出装置の製造
本発明による粒子検出方法を実施するための粒子検出装置の実施形態を備えたマイクロチップ１０は、一般的なフォトリソグラフィーとソフトリソグラフィー技術を用いて作製した。具体的な手順を以下の通り示す。
４インチベアシリコンウェハ（株式会社フィルテック）上へ、フォトレジストＳＵ－８３００５（Ｍｉｃｒｏｃｈｅｍ社）を滴下後、スピンコーター（ＭＩＫＡＳＡ社）を用いてフォトレジスト薄膜を形成した。この時、目的膜厚に応じて、ＳＵ－８３００５へ希釈剤Ｃｙｃｌｏｐｅｎｔａｎｏｎｅ（東京応化工業社）を添加した。続いて、マスクアライナー（ウシオ電機社）と、任意のパターンを形成したクロムマスクを用いて流路パターンをフォトレジスト膜へ形成し、ＳＵ－８Ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ（Ｍｉｃｒｏｃｈｅｍ社）を用いて流路パターンを現像することで、用いたい流路の鋳型を作製した。
続いて、作製した鋳型へ、未硬化のＬＳＲ７０７０ＦＣ（モメンティブパフォーマンス社）を流し込み、８０℃で２時間加熱することで、流路の形状を転写されたポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）を作製した。硬化したＰＤＭＳを鋳型から剥がし、カッターで任意の大きさに成形後、パンチャーを用いて流路のインレット、アウトレットを形成した。剥離したＰＤＭＳとスライドガラス（松浪ガラス社）を酸素プラズマ発生装置（メイワフォーシス社）で表面処理後、ＰＤＭＳとスライドガラスを貼り合わせることでマイクロチップ１０を作製した。

ＥＳＺによる粒子の電気的検出
作製したマイクロチップ１０は、基板上へ載置され、マイクロチップ１０内の複数の粒子検出部１０３へ電極を接続した。電極は一対の白金線より構成され、一方の電極は導線を介してプログラマブル電流増幅器ＣＡ５３５０（エヌエフ回路社）へ接続され、ＡＤコンバーターを介してＰＣへと接続され、送信されてきたデジタルの信号をＬａｂＶｉｅｗにより解析した。また粒子検出部１０３へ接続される電極のもう一方は９Ｖの乾電池へ導線を介して接続した。
各インレットは、テフロンチューブを介してＰ－ＰｕｍｐＢａｓｉｃ（ＤｏｌｏｍｉｔｅＭｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ社）へ接続し、一定の流量で送液した。

サンプル調製
検出対象の粒子を含有する流体１００Ｐ中の粒子としては以下の標準粒子を用いた。
０．１μｍ粒子としてポリスチレン標準粒子３１００Ａ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ製）
０．２μｍ粒子としてポリスチレン標準粒子３２００Ａ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ製）
分離対象の粒子を含有する流体１００Ｐとしては、
ツイーン２０を０．０５％（ｖ／ｖ）含有し塩化ナトリウムを０．３重量％含むリン酸緩衝液（電気伝導度５．４ｍＳ／ｃｍ）
ツイーン２０を０．０５％（ｖ／ｖ）含有し塩化ナトリウムを０．９重量％含むリン酸緩衝液（電気伝導度１３．６ｍＳ／ｃｍ）
を調製した。前記各流体は、粒子を懸濁する前にポアサイズ０．１μｍのシリンジフィルター（メルクミリポア社製）を用いて異物除去を行ってから実験に用いた。

実施例１：０．１、０．２μｍ標準粒子を低電気伝導度溶液へ懸濁し、アウトレット１０４へ高電気伝導度溶液を満たした場合の粒子検出
図１で示されるマイクロチップ１０を、上述の手順に基づき作製した。０．１、０．２μｍ標準粒子は、それぞれリン酸緩衝液（電気伝導度５．４ｍＳ／ｃｍ）により、それぞれ５μｇ／ｍＬの濃度となるよう調製した後、両者を混合して粒子懸濁液（サンプル）とした。従って、サンプル中に含まれるポリスチレン粒子全体の濃度は１０μｇ／ｍＬとなるよう調製した。

この時、マイクロチップ１０の各流路について、粒子検出部１０２の２つのアパーチャ部分以外の流路の高さはすべて４．５μｍとし、流路の端部に、基板１１の上面に貫通するインレット１４、流体排出口１０４ａ、１０４ｂ（それぞれ穴の直径２ｍｍ）を設けた。また導入流路１０１は、幅７５μｍ、長さ４ｍｍ、中継流路６０はそれぞれ幅６５μｍ、長さ１ｍｍとした。また、粒子検出部１０２の２つのアパーチャは、どちらも幅０．９μｍ、長さ２．５μｍ、高さ０．４μｍとした。また、式（１）において算出されるｋ値は、アパーチャ抵抗と、アパーチャから電極が挿入されているアウトレットまでの流路の抵抗比から、３．０とした。また、アウトレット１０４へはリン酸緩衝液（電気伝導度１３．６ｍＳ／ｃｍ）を満たした。

上述のマイクロチップ１０を用い、インレット１４へ調製した粒子懸濁液を０．０３μＬ／ｈｏｕｒの流量で送液した。続いて、上述の電気検出実施例に基づき各アパーチャへ流入した粒子を１分間検出した。この時の、粒子検出部１０３の電流値変化の測定の様子の一部を図４に示した。図４の通り、０．１、０．２μｍ標準粒子の電流値変化が確認された。

また、測定結果をヒストグラムへまとめると図５の通りとなり、混合粒子でもピークが分離することを確認した。また、測定結果から得られた０．１μｍ標準粒子の濃度は、５．０９μｇ／ｍＬであり、０．２μｍ標準粒子の濃度は、４．７４μｇ／ｍＬであった。また、測定結果から得られた０．１μｍ標準粒子の平均粒径は、０．１０９μｍであり、０．２μｍ標準粒子の平均粒径は、０．１９２μｍであった。

比較例１：０．１、０．２μｍ標準粒子を低電気伝導度溶液へ懸濁し、アウトレット１０４へ低電気伝導度溶液を満たした場合の粒子検出
アウトレット１０４へリン酸緩衝液（電気伝導度５．４ｍＳ／ｃｍ）を満たした点以外は全て同様にして粒子を１分間検出し、この時の粒子検出部１０３の電流値変化の測定の様子の一部を図６に示した。図６の通り、０．１、０．２μｍ標準粒子の電流値変化は確認されなかった。

以上から、本発明を用い、アウトレット１０４へ高電気伝導度溶液を満たしておくことで、測定したい粒子を低電気伝導度溶液へ懸濁した場合においても粒子径測定が可能であることを確認した。

１０マイクロチップ
１１基板
１４インレット
５０粒子
５１粒子の流れる方向
５２アパーチャ形成構造
５３アパーチャ
５４電極
５５導線
５６電気測定器
５７電源
６１解析部
６２粒子検出流路
１０１導入流路
１０２排出流路
１０３粒子検出部
１０４アウトレット
１１０分岐部
８００シース流体
８０１粒子を含むサンプル
８０２シース流体流路
８０３粒子を含むサンプルとシース流体の界面

Claims

流体導入口に連通する導入流路から分岐された２以上の排出流路を介し、前記排出流路の下流に位置する粒子検出部、前記粒子検出部の下流に位置する電極を備える空間兼流体排出口で構成される流路において電気的検知帯法により流体中に存在する粒子を検出する方法であって、
前記流体の電気伝導度に対して、前記空間兼液体排出口を満たす流体の電気伝導度が高いことを特徴とする粒子検出方法。
前記電極を備える空間を満たす流体の電気伝導度が１０ｍＳ／ｃｍよりも大きいことを特徴とする請求項１記載の粒子検出方法。