JP7190378B2 - 皮膚基底膜への障害を予防又は改善する物質のスクリーニング方法 - Google Patents
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基底膜の機能は、表皮と真皮を強く結合させるだけでなく、細胞の機能の維持や真皮の構造の維持にも働いている。皮膚では、基底膜に結合している表皮基底細胞のみが増殖能を獲得し、基底膜から離れると分化過程に入るという動きを見せる。さらに基底膜はケラチノサイトの酵素産生も制御し、また基底膜成分は細胞増殖因子なども結合して因子の機能を調節している。
低下した基底膜の機能回復のための化粧料や外用剤について多数の提案がなされている(特許文献1~3)。
この基底膜のダメージ(障害)に表皮細胞のケモカイン受容体、なかでもCXCR4が関与していることは、殆ど知られていない。
近年、ウイルス感染や腫瘍の転移に関わるタンパク質として、前記のCXCR4が注目されている。CXCR4は、全身の細胞に存在し、エイズウイルスが宿主細胞へ感染する際に利用するケモカイン受容体である。また、腫瘍の転移が起こりやすい臓器ではCXCR4のリガンドCXCL12(SDF-1/PBSF)が発現し、腫瘍細胞ではCXCR4の発現が亢進していることが知られている。さらに乾癬の表皮肥厚に関与していることが明らかになっている。またがん細胞ではCXCR4高発現細胞の方が、がん細胞の組織浸潤性が高いともいわれている。
このCXCR4の作用を抑制してCXCR4が関与する疾患の予防や治療の目的でアンタゴニスト(特許文献4、5)、リガンド(特許文献6)、抗体(特許文献7)などを使用することが提案されている。
すなわち、本発明はCXCR4発現を指標とする皮膚障害の予防改善作用を有する物質のスクリーニング方法を提供することを課題とする。
(1)被験物質の皮膚基底膜障害予防又は改善効果を有する物質をスクリーニングする方
法であって、以下の工程を含むスクリーニング方法。
1.培養表皮正常細胞としてメラノサイトに被験物質を添加し培養する工程
2.被験物質添加後の表皮正常細胞を含む培養液中に、紫外線を照射し培養する工程
3.培養表皮正常細胞を回収する工程
4.回収した細胞のCXCR4発現量を測定する工程
5.被験物を添加しない培養表皮正常細胞のCXCR4発現量と対比し、CXCR4の発現が抑制されている物質を選抜する工程
(2)2.において、細胞を洗浄後に、紫外線を照射する(1)に記載の方法。
(3)表皮正常細胞がヒトメラノサイトである(1)または(2)に記載の方法。
<1.被験物質の添加>
本明細書にいう「表皮正常細胞」とは、表皮を構成する角層中の細胞であって、ケラチノサイト又はメラノサイトをいう。表皮は、ヒト又は非ヒトであっても使用可能であるが、ヒトが好ましい。ケラチノサイト又はメラノサイトは、表皮から分離した初代培養細胞であっても良いし、継代培養された細胞であっても良い。ヒト表皮ケラチノサイト又はメラノサイトは、市販されている研究用の継代培養細胞であれば、本発明に使用可能である。このような市販されている細胞としては、ケラチノサイト:初代ヒトKeratinocyte細胞新生児(HEKn)(Human Epidermal Keratinocytes,neonatal(HEKn))(Thermo Fischer Scientific)、メラノサイト:初代ヒトメラニン形成細胞 新生児(HEMn)(Human Epidermal Melanocytes,neonatal,darkly pigmented donor,(HEMn-DP))(ロンザジャパン)を例示できる。
被験物質の添加後はさらに24時間培養する。
サブコンフルエント状態の表皮正常細胞に、CXCR4を発現させるため、紫外線照射を行なう。紫外線照射は、紫外部領域の波長の中でも、UVBを照射する必要がある。UVBの照射は、UVB照射専用装置または、UVBを含む全紫外部領域照射装置を用いて照射すれば良い。UVB照射専用装置としてはデルマレイ-200(村中医療機器)やUVP製照射機(UV Bench Lamp,15W,XX-15M,302nm,100V)、フィリップス製ランプ(TL20W/12RS)をセットした紫外線照射装置(日本ピー・アイ)や三共電気製ランプ(GL40SE)をセットした植物育成ラック プラントマスターP100蛍光灯タイプ(バイオメディカルサイエンス)による照射を例示できる。UVBの照射量は、5~50mJ/cm 2 、好ましくは10~20mJ/cm 2 、特に好ましくは15~20mJ/cm 2 である。照射にあたっては、予め細胞を培養液又はPBSやHANKS(-)培地等で洗浄しておくことが好ましい。
紫外線照射後は、同条件で24時間培養する。
CXCR4発現を測定するために細胞をPBS(-)で洗浄後、TRIZOL(Thermo Fisher Scientific社製)0.5~1ml入れ、ピペッティングして細胞を溶解し、RNA懸濁液を得た。
抽出したRNA懸濁液から 製品プロトコールに従ってmRNAの抽出と、PrimeScript II 1st strand cDNA Synthesis Kit(タカラバイオ社製)で100ng/μlのRNA濃度でcDNAを合成した。
SYBRPremix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) (タカラバイオ社製)を使用し、LightCycler(登録商標)480システム II(ロシュ・ダイアグノスティックス社製)にてリアルタイムPCRを実施し、RPS18をリファレンス遺伝子として、CXCR4の発現をΔΔCt法により評価した。リアルタイムPCRに使用したプライマー配列は次に示す配列を使用した。
CXCR4
Forward CCTGCCTGGTATTGTCATCCTG(配列番号1)
Reverse ACTGTGGTCTTGAGGGCCTTG(配列番号2)
RPS18
Forward TTTGCGAGTACTCAACACCAACATC(配列番号3)
Reverse GACCATATCTTCGGCCCACAC(配列番号4)
同様の操作を行った、被験物質を添加しない細胞のCXCR4の発現量を測定し、被験物質を添加した場合のCXCR4の発現量を対比する。
<試験例1>
本試験においては、まず、CXCR4のリガンドであり、CXCR4を活性化することが知られている公知のタンパク質マクロファージ遊走阻止因子(MIF)を使用し、CXCR4を活性化することによる基底膜障害効果を確認した。具体的にはMIFがCXCR4の発現を増加し、皮膚基底膜の保護に有用なTypeIVコラーゲンを減少させ、基底膜の破壊を促進するマトリックスメタロプロテナーゼ-9(MMP9)発現を増加することである。
(1)試験に用いた細胞
[メラノサイト]
正常ヒト表皮由来のメラノサイト(ロンザジャパン社製)を15000cells/cm2Medium 254(Thermo Fisher Scientific社製)にHMGS(Thermo Fisher Scientific社製)を添加した培地で24時間培養したものを試験細胞とした。
細胞は、37℃、5%二酸化炭素、95%雰囲気下にて培養を行った。
試験試料としてヒトリコンビナントMIF(Shenandoah Biotechnology社製)を用いた。
メラノサイトを培養中の上記ディッシュに試験試料(MIF)を最終濃度0、100、200ng/mlを添加し(n=3)、6時間培養し、mRNAをRNeasy Mini Kit(Qiagen社製)で製品プロトコールに従って抽出した。PrimeScriptII 1st strand cDNA Synthesis Kit(タカラバイオ社製)でcDNAを合成し、SYBR(登録商標)Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus)(タカラバイオ社製)を用い、LightCycler(登録商標)480システム II(ロシュ・ダイアグノスティックス社製)でRPS18をリファレンス遺伝子として、CXCR4、MMP9の発現をΔΔCt法によって評価した。
CXCR4
Forward CCTGCCTGGTATTGTCATCCTG (配列番号1)
Reverse ACTGTGGTCTTGAGGGCCTTG (配列番号2)
MMP9
Forward CAAGCTGGACTCGGTCTTTGA (配列番号5)
Reverse GCCTGTGTACACCCACACCT (配列番号6)
RPS18
Forward TTTGCGAGTACTCAACACCAACATC (配列番号3)
Reverse GACCATATCTTCGGCCCACAC (配列番号4)
検出結果は3ウエルの平均値を求めさらに、無処置ウエルの測定値を1とする相対値を算出した。
MIFによるメラノサイトのCXCR4発現促進の結果を図1、TypeIVコラーゲンの産生抑制効果の試験結果を図2、MMP9発現促進試験の結果を図3に示す。
図1~図3から明らかなようにMIFは、メラノサイトのCXCR4発現とMMP9発現を促進し、TypeIVコラーゲンの産生を抑制することがわかった。すなわちメラノサイトのCXCR4の活性化やCXCR4の発現が増加することにより皮膚基底膜障害を誘導し、皮膚基底膜機能が低下することが明らかとなった。
本試験においては、まず、強力なCXCR4の活性抑制作用が知られている公知の化合物Plerixafor 8HCl(AMD3100)を使用し、CXCR4活性を抑制することによる基底膜障害抑制効果を確認した。具体的にはAMD3100が皮膚基底膜の保護に有用なTypeIVコラーゲン産生を増加させ、基底膜の破壊を促進するマトリックスメタロプロテナーゼ-9(MMP9)発現を抑制することである。
なおAMD3100は次の化学式1で表されるCXCR4は活性抑制剤として開発された化合物である。
(1)試験に用いた細胞
[メラノサイト]
正常ヒト表皮由来のメラノサイト(ロンザジャパン社製)を15000cells/cm2Medium 254(Thermo Fisher Scientific社製)にHMGS(Thermo Fisher Scientific社製)を添加した培地で24時間培養したものを試験細胞とした。
細胞は、37℃、5%二酸化炭素、95%雰囲気下にて培養を行った。
試験試料として精製AMD3100(Sigma Aldrich社)を用いた。
メラノサイトを培養中の上記ディッシュに試験試料(AMD3100)を最終濃度、0、100、1000ng/mlを添加し(n=3)、24時間培養し、mRNAをRNeasy Mini Kit(Qiagen社製)で製品プロトコールに従って抽出した 。PrimeScriptII 1st strand cDNA Synthesis Kit(タカラバイオ社製)でcDNAを合成し、SYBR(登録商標)Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)(タカラバイオ社製)を用い、LightCycler(登録商標)480システム II(ロシュ・ダイアグノスティックス社製)でRPS18をリファレンス遺伝子として、MMP9の発現をΔΔCt法によって評価した。
MMP9
Forward CAAGCTGGACTCGGTCTTTGA(配列番号5)
Reverse GCCTGTGTACACCCACACCT (配列番号6)
RPS18
Forward TTTGCGAGTACTCAACACCAACATC (配列番号3)
Reverse GACCATATCTTCGGCCCACAC (配列番号4)
検出結果は3ウエルの平均値を求めさらに、無処置ウエルの測定値を1とする相対値を算出した。
AMD3100によるメラノサイトのMMP9発現抑制試験の結果を図4、TypeIVコラーゲンの産生促進効果の試験結果を図5に示す。
図4、図5から明らかなようにAMD3100は極めて低濃度で、メラノサイトのMMP9発現を抑制し、TypeIVコラーゲン産生を促進することがわかった。MIF添加およびAMD3100添加実験の結果から、メラノサイトのCXCR4抑制(CXCR4活性抑制及びCXCR4発現抑制)を指標とすることで効率よく皮膚の皮膚基底膜への障害を予防又は改善する物質がスクリーニングできることが明らかとなった。
(1)ケラチノサイトを用いたスクリーニング試験
1)試験に用いた細胞
[ケラチノサイト]
正常ヒト表皮由来のケラチノサイト(Thermo Fisher Scientific社製)を9000cells/cm2でφ35mm ディッシュに播種し、EpiLife(登録商標)Medium with 60μM Calcium(Thermo Fisher Scientific社製)にHumedia-KG2増殖添加剤(倉敷紡績株式会社製)を添加した培地で2日間培養したものを試験細胞とした。
細胞は、37℃、5%二酸化炭素、95%雰囲気下にて培養を行った。
精製プルネチン(Sigma Aldrich社)及びソメイヨシノ葉抽出液(製品名「サクラエキスB(一丸ファルコス株式会社)(組成:ソメイヨシノ葉エキス 2.0%、1,3-ブチレングリコール49.0%、精製水 49.0%)」、ラベンダー花エキス(製品名「オーガニックラベンダーエキス(香栄興業株式会社)組成:ラベンダー花エキス 1.0%、1,3-ブチレングリコール49.5%、精製水 49.5%)」)、カニナバラ果実エキス(製品名「ファルコレックスノバラB(一丸ファルコス株式会社)組成:カニナバラ果実エキス 1.7%、1,3-ブチレングリコール49.15%、精製水 49.15%)」)、サンザシエキス(製品名「サンザシ抽出液BG-J(丸善製薬株式会社)」)組成:サンザシエキス 1.0%、1,3-ブチレングリコール49.5%、精製水 49.5%)、マンダリンオレンジ果皮エキス(製品名「マンダリンクリア(一丸ファルコス株式会社)組成:マンダリンオレンジ果皮エキス 1.0%、1,3-ブチレングリコール49.5%、精製水 49.5%)」)、マヨナラ葉エキス(「製品名マジョラム抽出液BG(丸善製薬株式会社)」)組成:マヨナラ葉エキス 1.0%、1,3-ブチレングリコール 49.5%、精製水 49.5%)、アピゲニン(富士フイルム和光純薬株式会社)、(-)エピガロカテキンガレート(富士フイルム和光純薬株式会社)、ナリンジン(富士フイルム和光純薬株式会社)、グリチルリチン酸ジカリウム(丸善製薬株式会社)、タンゲレチン(富士フイルム和光純薬株式会社)、セリン(富士フイルム和光純薬株式会社)、ケルセチン(富士フイルム和光純薬株式会社)、ラポンチシン(富士フイルム和光純薬株式会社)、マグノロール(富士フイルム和光純薬株式会社)、プロリン(富士フイルム和光純薬株式会社)、L-アスコルビン酸2-グルコシド(昭和電工株式会社)を評価物質とした。いずれも天然物由来の化合物、その誘導体や植物抽出物である。
ケラチノサイトを培養中の上記ディッシュに試験試料を植物抽出液は最終濃度0.01~1.0%(乾燥エキスで0.0001~0.02%)を、化合物は最終濃度0.00001mg/ml~1000mg/mlの範囲で培地に添加し(n=3)24時間培養したものを試験細胞とした。その後、HANKS(-)2mlで細胞を洗浄後、HANKS(-)1mlを入れ、15mJ/cm2のUVBを照射してCXCR4を誘導した。さらに24時間経過後にmRNAを抽出した。培養ディッシュにTRIZOL(Thermo Fisher Scientific社製)を0.5~1ml添加してmRNAを溶解した。定法に従ってmRNAを抽出し、PrimeScript II 1st strand cDNA Synthesis Kit(タカラバイオ社製)でcDNAを合成した。
SYBRPremix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus) (タカラバイオ社製)で調製し、LightCycler(登録商標)480システム II(ロシュ・ダイアグノスティックス社製)でRPS18をリファレンス遺伝子として、CXCR4の発現をΔΔCt法により評価した。
精製プルネチン(Sigma Aldrich社)及びソメイヨシノ葉抽出液(製品名「サクラエキスB(一丸ファルコス株式会社)」、ラベンダー花エキス(製品名「オーガニックラベンダーエキス(香栄興業株式会社)」)、カニナバラ果実エキス(製品名「ファルコレックスノバラB(一丸ファルコス株式会社)」)、サンザシエキス(製品名「サンザシ抽出液BG-J(丸善製薬株式会社)」)、マンダリンオレンジ果皮エキス(製品名「マンダリンクリア(一丸ファルコス株式会社)」)、アピゲニン(富士フイルム和光純薬株式会社)、ナリンジン(富士フイルム和光純薬株式会社)、グリチルリチン酸ジカリウム(丸善製薬株式会社)、でCXCR4発現抑制作用を有していた。それぞれのUVB照射・サンプル無添加のCXCR4発現量に対する50%CXCR4発現阻止濃度は表1の通りであった。陽性対照であるアピゲニンは0.1μM(0.00003 mg/ml)で、UVBで誘導されるCXCR4発現を50%抑制していた。
1)試験に用いた細胞
[メラノサイト]
φ35mm ディッシュに正常ヒト表皮由来のメラノサイト(ロンザジャパン社製) を15000cells/cm2の濃度にMedium 254(Thermo Fisher Scientific社製)にHMGS(Thermo Fisher Scientific社製)を添加した培地で播種し、24時間培養したものを試験細胞とした。
細胞は、37℃、5%二酸化炭素、95%雰囲気下にて培養を行った。
精製プルネチン(Sigma Aldrich社)及びソメイヨシノ葉抽出液(製品名「サクラエキスB(一丸ファルコス株式会社)」、ラベンダー花エキス(製品名「オーガニックラベンダーエキス(香栄興業株式会社)」)、カニナバラ果実エキス(製品名「ファルコレックスノバラB(一丸ファルコス株式会社)」)、サンザシエキス(製品名「サンザシ抽出液BG-J(丸善製薬株式会社)」)、マンダリンオレンジ果皮エキス(製品名「マンダリンクリア(一丸ファルコス株式会社)」)、アピゲニン(富士フイルム和光純薬株式会社)を評価物質とした。
メラノサイトを培養中の上記ディッシュに植物抽出液は最終濃度0.01~1.0%(乾燥エキスで0.0001~0.02%)を、化合物は最終濃度0.00001mg/ml~1000mg/mlの範囲で培地に添加し(n=3)、24時間培養した。その後、HANKS(-)2mlで細胞を洗浄後、HANKS(-)1mlを入れ、15mJ/cm2のUVBを照射し、さらに24時間経過後にmRNAをRNeasy Mini Kit(Qiagen社製)で定法に従ってmRNAを抽出した。PrimeScriptII 1st strand cDNA Synthesis Kit(タカラバイオ社製)でcDNAを合成し、SYBR(登録商標)Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus)(タカラバイオ社製)を用い、LightCycler(登録商標)480システム II(ロシュ・ダイアグノスティックス社製)でRPS18をリファレンス遺伝子として、CXCR4の発現をΔΔCt法によって評価した。
Primer 配列
CXCR4
Forward CCTGCCTGGTATTGTCATCCTG(配列番号1)
Reverse ACTGTGGTCTTGAGGGCCTTG(配列番号2)
RPS18
Forward TTTGCGAGTACTCAACACCAACATC(配列番号3)
Reverse GACCATATCTTCGGCCCACAC(配列番号4)
メラノサイトを培養中の上記ディッシュに本試験でCXCR4発現抑制成分として見出した精製プルネチンを最終濃度、0、3.125、6.25μMを添加し(n=3)、24時間培養し、mRNAをRNeasy Mini Kit(Qiagen社製)で製品プロトコールに従って抽出した 。PrimeScriptII 1st strand cDNA Synthesis Kit(タカラバイオ社製)でcDNAを合成し、SYBR(登録商標)Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)(タカラバイオ社製)を用い、LightCycler(登録商標)480システム II(ロシュ・ダイアグノスティックス社製)でRPS18をリファレンス遺伝子として、MMP9の発現をΔΔCt法によって評価した。
MMP9
Forward CAAGCTGGACTCGGTCTTTGA (配列番号5)
Reverse GCCTGTGTACACCCACACCT (配列番号6)
RPS18
Forward TTTGCGAGTACTCAACACCAACATC (配列番号3)
Reverse GACCATATCTTCGGCCCACAC (配列番号4)
検出結果は3ウエルの平均値を求めさらに、無処置ウエルの測定値を1とする相対値を算出した。
評価結果を下記表2に示す。
Claims (3)
- 被験物質の皮膚基底膜障害予防又は改善効果を有する物質をスクリーニングする方法であって、以下の工程を含むスクリーニング方法。
1.培養表皮正常細胞であるメラノサイトに被験物質を添加し培養する工程
2.被験物質添加後の表皮正常細胞を含む培養液中に、紫外線を照射し培養する工程
3.培養表皮細胞を回収する工程
4.回収した細胞のCXCR4発現量を測定する工程
5.被験物を添加しない培養表皮正常細胞のCXCR4発現量と対比し、CXCR4の発現が抑制されている物質を選抜する工程 - 2.において、細胞を洗浄後に、紫外線を照射する請求項1に記載の方法。
- 表皮正常細胞がヒトメラノサイトである請求項1または2に記載の方法。
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