JP7164784B2 - ベンゼンスルホンアミド誘導体および脂質ラフトの調節方法 - Google Patents
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Description
本開示は、脂質ラフトの完全性を調節する方法、特にベンゼンスルホンアミド誘導体による脂質ラフトの完全性を調節する方法に関する。本開示はまた、ベンゼンスルホンアミド誘導体を、それを必要とする対象に投与することにより、癌を予防または治療する方法に関する。
前立腺癌は男性の最も重要な医学的困難の１つとして認識されている。アンドロゲン枯渇療法による治療にもかかわらず、進行性前立腺癌が進行して転移が現れると、最終的に去勢抵抗性前立腺癌（ｃａｓｔｒａｔｉｏｎ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ、ＣＲＰＣ）に進行してしまった。現在、患者が治療の選択肢をほとんど持っていないため、ＣＲＰＣ治療には新しい治療剤が必要である。前立腺癌細胞は多くの細胞ストレスに適応できることを考えると、複数の適応メカニズムと戦うために異なる方法で前立腺癌を標的とする有望な治療法は、代替治療オプションを提供するために非常に必要である［非特許文献１］。
アンドロゲン枯渇療法は、進行性転移性前立腺癌の主な治療法であるが、最終的にＣＲＰＣに進行してしまった。アンドロゲン受容体遺伝子の増幅または点突然変異、アンドロゲン受容体と成長因子との間の相互作用、および代償性生存シグナル伝達経路の活性化を含むＣＲＰＣ発生の原因となるいくつかのメカニズムは確認された［非特許文献２～４］。ホスホイノシチド３－キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）／Ａｋｔシグナル伝達経路は、細胞の生存と腫瘍性形質転換の調節に重要な役割を果たし、ほとんどのＣＲＰＣで恒常的に活性化される。ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔの活性化は、ＣＲＰＣの代償性生存シグナル伝達経路のカテゴリーで最も頻繁に報告されている［非特許文献５～７］。５０％～８０％前立腺腺癌患者には、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ活性の負の調節因子である腫瘍抑制因子ＰＴＥＮ（染色体１０で欠失されたホスファターゼおよびテンシンホモログ）が変異または喪失している［非特許文献２］。さらに、ＰＴＥＮ機能の低下とＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ活性化の増加は、高いグリーソンスコアと、進行した病理学的病期とよく相関している［非特許文献８］。また、ＰＴＥＮ発現の喪失は、アビラテロン治療のような前立腺癌治療における生存率の低下およびより短い時間と相関している［非特許文献８７］。さらに、Ａｋｔは、転写後修飾を通じてフォークヘッドボックス転写因子ＦＯＸＯ３Ａ（腫瘍抑制因子）を負に調節することにより、細胞質内蓄積を増加させながら、ＤＮＡ結合の低下を引き起こし、最終的に細胞生存を誘導することができる。前立腺腫瘍標本において、ＦＯＸＯ３Ａの深い細胞質蓄積がグリーソンスコアの増加とともに検出されたことは注目されている［非特許文献９］。全体として、これらの研究は、ＣＲＰＣ進行におけるＰＩ３Ｋ／Ａｋｔの重要な役割を示唆している。
コレステロールは、細胞膜の完全性と流動性を維持するための必須の構造要素であり、ホルモン、ビタミンＤおよび胆汁酸の合成と、複数の細胞シグナル伝達の調節に重要である［非特許文献１０、１１］。膜マイクロドメインである脂質ラフトは、多くの細胞シグナル伝達経路の調節において、コレステロール、飽和脂質およびキナーゼと優先的に会合する［非特許文献１２、１３］。多数の研究は、原形質膜からコレステロールの減少または枯渇がＰＩ３Ｋ／Ａｋｔシグナル伝達を障害できることを示しており［非特許文献１４～１６］、これは膜コレステロール含有量と脂質ラフトの完全性の重要性を示唆している。たとえば、乳癌細胞と前立腺癌細胞は、脂質ラフトがより豊富であり、コレステロールの枯渇によって引き起こされるアポトーシス刺激に対する感受性が高くなると報告されている［非特許文献１７］。また、カベオリン、フロチリン、ガングリオシド（ＧＭ１）およびグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカー型胎盤アルカリ性ホスファターゼ（ＰＬＡＰ）は脂質ラフトマーカーと見なされ［非特許文献５７～６０］、以前の研究において、これらの脂質ラフトマーカーの発現は、前立腺癌［非特許文献５７、６１～６３］、肺癌［非特許文献５７、６４～６９］、膵臓癌［非特許文献７０、７１］、黒色腫［非特許文献５７、６９、７２～７４］、腎臓癌［非特許文献５７、６３、６５、６９、７５］、膀胱癌［非特許文献７６］、セミノーマ［非特許文献６０］、卵巣癌［非特許文献６０］、子宮頸癌［非特許文献６０］、乳癌［非特許文献６３、６９］、大腸癌［非特許文献６３、７７］、肝臓癌［非特許文献３２、５８］、食道癌［非特許文献６２、６３、７８、７９］、口腔癌［非特許文献８０］、舌癌［非特許文献６２］、甲状腺癌［非特許文献６２］、髄膜腫［非特許文献８６］、胆管癌［非特許文献７０］、下咽頭癌［非特許文献８１］、鼻咽頭癌［非特許文献６４、８２］、胃癌［非特許文献８３、８４］、または外陰癌［非特許文献８５］などの一部のがんで増加していることが示されている。
インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）およびインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）の両方の研究において、ｐ－トルエンスルホンアミド（ｐ－ＴＳＡ）は、肝細胞癌、非小細胞肺癌、舌扁平上皮癌などのいくつかの癌に対する小分子である［非特許文献１８～２１］。さらに、これは同時局所注射療法による臨床試験において、進行した肝細胞癌および非小細胞肺癌に対して効果的な抗腫瘍活性を示す［非特許文献２０、２１］。
本明細書では、予期しない脂質ラフト調節剤、p-TSAおよびその誘導体、ならびに脂質ラフトの完全性の障害または破壊、特にコレステロール枯渇による改善しやすい疾患の治療のためのこれらの化合物の使用を提供する。
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本開示は、少なくとも部分的には、ベンゼンスルホンアミド誘導体およびその薬学的に許容される賦形剤を含む、脂質ラフトの完全性を調節するための医薬組成物の発見に基づく。
本開示はまた、それを必要とする対象に医薬組成物を投与することを含む、癌を予防または治療する方法を提供する。
本開示は、ＣＲＰＣ細胞において、いくつかの生存キナーゼのｐ－ＴＳＡを介した再分布と活性における脂質ラフトおよびコレステロール含有量の役割を実証する。コレステロール含有量の乱れと脂質ラフト関連のＡｋｔ／ｍＴＯＲ／ｐ７０Ｓ６Ｋ経路の変化は、ｐ－ＴＳＡ誘発抗ＣＲＰＣ効果の原因であることが初めて示されている。
本開示は、添付の図面を参照して、以下の実施形態の詳細な説明を読むことにより、より完全に理解できる。
図１Ａ～１Ｄは、ヒト去勢抵抗性前立腺癌細胞および初代前立腺細胞の抗増殖効果に対するｐ－ＴＳＡの効果を示す図である。ｐ－ＴＳＡの非存在下または存在下で、細胞を所定時間インキュベートした。処理後、ＳＲＢアッセイ（図１Ａ）およびコロニー形成アッセイ（図１Ｂ）のために、細胞を固定して染色した。ｐ－ＴＳＡのありまたはないＰＣ－３細胞とＤＵ－１４５細胞をインキュベートした。処理後、ＣＦＳＥ染色のフローサイトメトリー分析のために、細胞を回収した（図１Ｃおよび１Ｄ）。親または異なる世代の増殖指数および細胞集団は、Ｍｏｄｆｉｔ ＬＴ ３．２版およびＷｉｎＬｉｓｔ ５．０版のソフトウェアによって計算された。定量的データは、３～４回の独立的な実験の平均値±ＳＥＭとして表される。＊＊＊は対照に対して、Ｐ＜０．００１である。
図２Ａ～２Ｄは、細胞周期停止およびミトコンドリア機能障害に対するｐ－ＴＳＡの効果を示す図である。ｐ－ＴＳＡの非存在下または存在下で、ＰＣ－３およびＤＵ－１４５細胞を２４時間インキュベートした。細胞を回収して、ヨウ化プロピジウム染色で細胞周期相における細胞集団の分布を分析し（図２Ａ）、または、ＪＣ－１染色でＦＡＣＳｃａｎフローサイトメトリー分析を使用してミトコンドリア膜電位を検出した（図２Ｂ）。緑の蛍光はミトコンドリア膜電位の定量化のために示された（図２Ｂ）。細胞を収集して溶解し、ウエスタンブロット分析でいくつかのＢｃｌ－２ファミリーメンバーのタンパク質発現を検出した（図２Ｃおよび２Ｄ）。データは、３～４回の測定の平均値±ＳＥＭとして表される。対照に対して、＊はＰ＜０．０５、＊＊はＰ＜０．０１および＊＊＊はＰ＜０．００１である。図２Ｅおよび２Ｆは、ＰＴＳ誘導によるＰＣ－３細胞のアポトーシスに対するＺ－ＶＡＤ－ＦＭＫの効果を示す図である。所定薬剤の非存在下または存在下で、細胞を２４時間インキュベートした。細胞を収集して、ヌクレオソームＤＮＡ断片アッセイのＰＩ染色（図２Ｅ）のフローサイトメトリー分析（図２Ｆ）に使用した。定量的データは、３回の独立的な実験の平均値±ＳＥＭとして表される。対照に対して、＊＊はＰ＜０．０１および＊＊＊はＰ＜０．００１である。
図３Ａ～３Ｃは、細胞周期調節因子およびキナーゼの発現に対するｐ－ＴＳＡの効果を示す図である。６ｍＭのｐ－ＴＳＡの非存在下または存在下で、細胞を所定時間インキュベートした。処理後、細胞を収集して溶解し、ウエスタンブロット分析で細胞周期調節因子のタンパク質発現（図３Ａ）およびＡｋｔ／ｍＴＯＲ／ｐ７０Ｓ６Ｋ経路シグナル（図３Ｂ）を検出した。発現は、Ｉｍａｇｅ Ｌａｂ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ６．０（ＢＩＯ－ＲＡＤ）を使用して定量化された（図３Ｃ）。データは、３回の測定の平均値±ＳＥＭとして表される。対照に対して、＊はＰ＜０．０５、＊＊はＰ＜０．０１および＊＊＊はＰ＜０．００１である。
図４Ａ～４Ｄは、ＰＴＳ誘導によるいくつかのタンパク質発現の変化に対するＡｋｔの効果を示す図である。ＰＣ－３細胞をＭｙｒ－Ａｋｔプラスミドでトランスフェクトした。次に、ｐ－ＴＳＡの非存在下または存在下で、細胞を３時間（図４Ａ）または２４時間（図４Ｂ）インキュベートした。細胞を収集して溶解し、ウエスタンブロット分析で所定タンパク質を検出した。発現はＩｍａｇｅ Ｌａｂ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ６．０（ＢＩＯ－ＲＡＤ）を使用して定量化された。データは、３回の独立的な実験の平均値±ＳＥＭとして表される。図４Ｅおよび４Ｆは、ＰＣ－３細胞におけるＰＴＳの抗増殖効果を示す図である。所定条件の存在下で、細胞をインキュベートした。ＰＴＳのありまたはない細胞をそれぞれ４８時間または１０日間処理して、ＳＲＢ（図４Ｅ）およびコロニー形成アッセイ（図４Ｆ）をした。処理後、細胞を固定して染色し、アッセイをした。定量的データは、３回の独立的な実験の平均値±ＳＤとして表される。対照に対して、＊はＰ＜０．０５および＊＊はＰ＜０．０１である。
図５Ａ～５Ｃは、いくつかのキナーゼの脂質ラフト関連発現に対するｐ－ＴＳＡの効果を示す図である。図５Ａにおいて、６ｍＭのｐ－ＴＳＡの非存在下または存在下で、ＰＣ－３およびＤＵ－１４５細胞を２時間インキュベートした。処理後、細胞を１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で溶解し、実施例４に記載されているように遠心分離により分画した。タンパク質発現はウエスタンブロッティングにより検出された。図５Ｂおよび図５Ｃにおいて、発現はＩｍａｇｅ Ｌａｂ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ６．０（ＢＩＯ－ＲＡＤ）を使用して定量化された。
図６Ａ～６Ｅは、ｐ－ＴＳＡ媒介効果に対するコレステロールサプリメントの効果を示す図である。所定薬剤の非存在下または存在下で、ＰＣ－３およびＤＵ－１４５細胞を１時間インキュベートした。処理後、細胞を収集して溶解し、ウエスタンブロット分析によりタンパク質発現を検出した（図６Ａおよび６Ｃ）。発現はＩｍａｇｅ Ｌａｂ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ６．０（ＢＩＯ－ＲＡＤ）を使用して定量化された（図６Ｂおよび６Ｄ）。所定薬剤（ＰＴＳ、１．５ｍＭ）の存在下で、ＰＣ－３細胞を１０日間インキュベートした。処理後、細胞を固定および染色して、コロニー形成アッセイをした（図６Ｅ）。データは３回の測定の平均値±ＳＥＭとして表される。ｐ－ＴＳＡ単独に対して、＊はＰ＜０．０５、＊＊はＰ＜０．０１および＊＊＊はＰ＜０．００１である。
図７Ａ～７Ｄは、インビボ抗腫瘍異種移植モデルにおけるｐ－ＴＳＡの効果を示す図である。ヌードマウスにＰＣ－３細胞（１０７細胞／マウス）を皮下注射した。腫瘍は毎日測定された。腫瘍の体積が１００ｍｍ３に達したら、マウスを２つグループに分け、腹腔内ｐ－ＴＳＡ注射を開始した。腫瘍の長さ（ｌ）および幅（ｗ）を測定し、腫瘍体積をｌｗ２／２として計算した（図７Ａおよび７Ｂ）。体重も測定した（図７Ｃ）。インビボ試験のプロトコルは、国立台湾大学の動物管理使用委員会により承認された。すべての動物の手順とプロトコルは、国際実験動物ケア評価認証協会（ＡＡＡＬＡＣ）の認定施設により承認された。対照とＰＴＳグループの両方でランダムに選択された６つ腫瘍のｐ－Ａｋｔ発現が検出された（図７Ｄ）。データは平均値±ＳＤとして表される。
以下の実施例は、本開示を例示するために使用される。当業者は、本開示の明細書に基づいて、本開示の他の利点を思いつくことができる。本開示はまた、異なる例で説明されるように実現または適用され得る。異なる態様および用途について、本開示の精神および範囲に違反することがない限り、本開示を実行するための当該実施例を修正および／または変更することが可能である。
さらに、本明細書で使用される場合、単数形「一つ（ａ）」、「一つ（ａｎ）」、および「当該（ｔｈｅ）」は、明確かつ明確に１つの指示対象に限定されない限り、複数の指示対象を含むことに留意されたい。「または」という用語は、文脈がそうでないことを明確に示さない限り、「および／または」という用語と交換可能に使用される。
本開示は、ベンゼンスルホンアミド誘導体、およびその薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物を提供する。
本開示の一実施形態では、ベンゼンスルホンアミド誘導体は、式（Ｉ）で表され、またはその薬学的に許容される塩である。
式（I）において、Ｒ１～Ｒ７は、Ｈ、Ｃ１－Ｃ６直鎖または分岐アルキル基、Ｃ１－Ｃ６直鎖または分岐アルコキシ基、Ｃ３－Ｃ６シクロアルキル基、Ｃ３－Ｃ６シクロヘテロアルキル基、アミノ基およびハロ基からなる群から独立して選択され、またはＲ６とＲ７が互いに結合して環を形成する。
本開示の一実施形態では、Ｒ１～Ｒ７におけるアルキル基、アルコキシ基、シクロアルキル基、シクロヘテロアルキル基および環は、非置換または１つ以上の置換基で置換されている。本開示の一実施形態では、当該置換基は、フェニル基、ハロ基、オキソ基、エーテル基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、アミノ基、スルホ基およびスルホンアミド基からなる群から選択される。
本開示の一実施形態では、当該ベンゼンスルホンアミド誘導体は、ｐ-トルエンスルホンアミド、ｏ-トルエンスルホンアミド、ｍ-トルエンスルホンアミド、N-エチル-ｐ-トルエンスルホンアミド、N-エチル-ｏ-トルエンスルホンアミド、N-シクロヘキシル-ｐ-トルエンスルホンアミド、
が含まれるが、これらに限定されない。
が含まれるが、これらに限定されない。
本開示の一実施形態では、当該ベンゼンスルホンアミド誘導体は、ｐ-トルエンスルホンアミド（ｐ-ＴＳＡ）である。
本開示の一実施形態では、当該薬学的に許容される賦形剤は、充填剤、結合剤、防腐剤、崩壊剤、滑沢剤、懸濁剤、湿潤剤、溶媒、界面活性剤、酸、香味剤、ポリエチレングリコール（PEG）、アルキレングリコール、セバシン酸、ジメチルスルホキシド、アルコールまたはそれらの組み合わせであってもよい。
本開示の一実施形態では、当該ベンゼンスルホンアミド誘導体は、約５重量％～約６０重量％の範囲の量で存在する。
本開示の一実施形態では、当該医薬組成物は、非経口投与、注射、持続注入、舌下投与、皮下投与または経口投与に適した形態である。
本開示の一実施形態では、当該医薬組成物の形態は、注射製剤、乾燥粉末、錠剤、経口液体、ウエハース、フィルム、ロゼンジ、カプセル、顆粒、または丸剤を含むが、これらに限定されない。
また、本開示は、脂質ラフトの完全性を調節するために、治療を必要とする対象に医薬組成物を投与することを含む、細胞の脂質ラフトの完全性を調節する方法を提供する。
本開示の一実施形態では、当該医薬組成物は、脂質ラフトの完全性を障害または破壊する。本開示の一実施形態では、当該医薬組成物は、細胞の原形質膜からコレステロールを枯渇させる。
本開示の一実施形態では、当該方法は、脂質ラフトの完全性の低下したレベルにより、改善しやすい疾患を治療する。本開示の別の一実施形態では、当該疾患は癌である。
また、本開示は、医薬組成物を必要とする対象に投与することを含む、癌を予防または治療する方法を提供する。
本開示の一実施形態では、当該医薬組成物中のベンゼンスルホンアミド誘導体は、１日あたり約２０ｍｇ～約４０００ｍｇの治療的有効量で対象に投与される。
本開示の一実施形態では、当該医薬組成物は、腫瘍内、静脈内、皮下、皮内、経口、くも膜下腔内、腹腔内、鼻腔内、筋肉内、胸膜内、または噴霧により対象に投与される。
本開示の一実施形態では、当該ベンゼンスルホンアミド誘導体は、癌の腫瘍増殖を阻害するための脂質ラフト調節剤として機能する。本開示の別の実施形態では、脂質ラフトの完全性のレベルは、癌の腫瘍細胞において低下する。本開示の別の実施形態では、ラフト関連キナーゼの総形態またはリン酸化形態のレベルは、癌の腫瘍細胞において低下する。本開示の別の実施形態では、肺癌（非小細胞肺癌、肺扁平上皮癌、小細胞肺癌、肺腺癌を含むがこれらに限定されない）、乳癌、肝臓癌（肝細胞癌を含むがこれに限定されない）、前立腺癌、皮膚癌、膵臓癌（膵腺癌を含むがこれに限定されない）、黒色腫、腎臓癌（腎細胞癌を含むがこれに限定されない）、膀胱癌（尿路上皮癌を含むがこれに限定されない）、セミノーマ、卵巣癌、子宮頸癌、大腸癌、食道癌（食道扁平上皮癌を含むがこれに限定されない）、口腔癌（口腔扁平上皮癌を含むがこれに限定されない）、舌癌（舌扁平上皮癌を含むがこれに限定されない）、甲状腺癌、髄膜腫、胆管癌、下咽頭癌（下咽頭扁平上皮癌を含むがこれに限定されない）、鼻咽頭癌、胃癌および外陰癌（外陰部扁平上皮がんを含むがこれに限定されない）からなる群から選択される少なくとも１つである。
本開示の一実施形態では、当該ベンゼンスルホンアミド誘導体は、癌の腫瘍成長を阻害するためのコレステロール枯渇剤として機能する。本開示の別の実施形態では、当該コレステロールのレベルは、癌の腫瘍細胞において低下する。本開示の別の実施形態では、当該癌は、肺癌、乳癌、肝臓癌、皮膚癌、前立腺癌、骨髄性白血病および口腔癌からなる群から選択される少なくとも１つである。
本開示の一実施形態では、当該ベンゼンスルホンアミド誘導体は、適切な分子を空間的に整理する脂質ラフト/カベオラ分子プラットフォームを破壊することにより、特定のシグナル伝達経路（Ａｋｔ不活性化を含むが、これに限定されない）を阻害する。
本開示の一実施形態では、当該方法は、少なくとも１つの追加の抗癌剤を対象に投与することをさらに含む。
本開示の一実施形態では、当該方法は、対象に少なくとも１つの追加の抗癌療法を施すことをさらに含み、当該抗癌療法は、全身化学療法、放射線療法、または温熱療法を含むが、これらに限定されない。
以下は、本開示の効果をさらに実証する特定の実施形態であるが、本開示の範囲を限定するものではない。
去勢抵抗性前立腺癌（ＣＲＰＣ）細胞は、生存を確実にするために多くの細胞ストレスに抵抗できる。患者の最適な治療を実現するために、細胞内の複数の適応メカニズムと対抗するための満たされていない医療ニーズがある。以下の実施例により、本開示は、ｐ－エンスルホンアミド（ｐ－ＴＳＡ）が、サイクリンＤ１がダウンレギュレートされ、Ｒｂリン酸化が抑制された細胞周期におけるｐ２１およびｐ２７に依存しないＧ１停止を通じて、２つのＣＲＰＣ細胞株であるＰＣ－３およびＤＵ－１４５の細胞増殖を阻害する小分子であることを実証した。ｐ－ＴＳＡも２つのプロアポトーシスＢｃｌ－２ファミリーメンバーであるＢａｋとＰＵＭＡの両方のアップレギュレーションに起因するミトコンドリア膜電位の有意な損失を引き起こすことにより、アポトーシスを引き起こした。ｐ－ＴＳＡは、両方の細胞株でｍ－ＴＯＲ、４Ｅ－ＢＰ１およびｐ７０Ｓ６Ｋのリン酸化を阻害した。恒常的に活性型Ａｋｔの過剰発現は、Ａｋｔ依存経路を示すＰＣ－３細胞におけるｍＴＯＲ／ｐ７０Ｓ６Ｋシグナル伝達の阻害を救った。一方、Ａｋｔに依存しない効果はＤＵ－１４５細胞で観察された。脂質ラフトは、複数の細胞シグナル伝達および輸送プロセスの機能プラットフォームとして機能する。両方の細胞株は、ラフト関連のＡｋｔ、ｍＴＯＲおよびｐ７０Ｓ６Ｋを発現した。ｐ－ＴＳＡは、これらのキナーゼのラフト関連の全ての形態およびリン酸化形態の両方で発現の減少を誘発した。ｐ－ＴＳＡで誘発される抑制効果は、脂質ラフトの必須成分であるコレステロールの補給によって救い、これはコレステロールの含有量の重要な役割を示す。さらに、腫瘍異種移植モデルには、ｐ－ＴＳＡが０．４４のＴ４（治療／対照）で腫瘍の成長を阻害し、インビボでの有効性を示す５６％の成長率阻害を示した。結論として、このデータは、ｐ－ＴＳＡがＡｋｔ依存性と非依存性の両方のｍＴＯＲ／ｐ７０Ｓ６Ｋ経路を阻害することにより、インビトロおよびインビボで有効な抗腫瘍剤であることを示唆している。さらに、脂質ラフトとコレステロールの含有量の乱れは、ｐ－ＴＳＡを介した抗腫瘍プロセスを説明する可能性がある。
本開示の実施例で使用される材料の源は以下のとおりである。ヒト前立腺腺癌細胞株であるＰＣ－３およびＤＵ－１４５は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ロックビル、ＭＤ、米国）から入手した。ＲＰＭＩ １６４０培地、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ペニシリン、およびストレプトマイシンは、ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬライフテクノロジー（グランドアイランド、ＮＹ、米国）から入手した。ＰＡＲＰ－１、Ｂｃｌ－２、Ｂａｋ、Ｍｃｌ－１、アポトーシスのｐ５３アップレギュレートされたモジュレーター（ＰＵＭＡ）、α－チューブリン、サイクリンＥ、サイクリンＡ、サイクリンＢ、サイクリン依存性キナーゼ（Ｃｄｋ）４、Ｃｄｋ２、Ｃｄｋ１、ＧＡＰＤＨ、ｐ２７、およびカベオリン－１の抗体は、サンタクルーズバイオテクノロジー株式会社（サンタクルーズ、ＣＡ、米国）から入手した。Ｒｂ、ｐ－ＲｂＳｅｒ８０７／８１１、ｐ２１、Ａｋｔ、ｐ－ＡｋｔＴｈｒ３０８、ｐ－ＡｋｔＳｅｒ４７３、Ｂｉｄ、サイクリンＤ１、ｍＴＯＲ、ｐ－ｍＴＯＲＳｅｒ２４４８、４Ｅ－ＢＰ１、ｐ－４Ｅ－ＢＰ１Ｔｈｒ３７／４６、ｐ－ｐ７０Ｓ６ＫＴｈｒ３８９およびｐ－ＩκＢ－αＳｅｒ３２の抗体は、セル・シグナリング・テクノロジー（ボストン、ＭＡ、米国）から入手した。Ｐ７０Ｓ６Ｋはアブカム（ケンブリッジ、イギリス）から入手した。カスパーゼ－３はＩＭＧＥＮＥＸ社（サンディエゴ、ＣＡ、米国）から入手した。カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ株式会社（ユージーン、ＯＲ、米国）から入手した。抗マウスおよび抗ウサギＩｇＧは、ジャクソン・イムノリサーチ・ラボラトリーズ株式会社（、ウェストグローブ、ＰＡ、米国）から入手した。ｐ－トルエンスルホンアミド（ｐ－ＴＳＡ）、スルホローダミンＢ（ＳＲＢ）、ロイペプチン、ＮａＦ、ＮａＶＯ４、ジチオトレイトール、フッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）、トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）、ミトキサントロン、水溶性コレステロール、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）およびその他すべての化学物質はシグマアルドリッチ（セントルイス、ＭＯ、米国）から入手した。
実施例１：去勢抵抗性前立腺癌（ＣＲＰＣ）細胞において、細胞増殖の阻害に対するｐ－トルエンスルホンアミド（ｐ－ＴＳＡ）の効果の検討
ＰＣ－３とＤＵ－１４５の２つの去勢抵抗性前立腺癌（ＣＲＰＣ）細胞株は、５％ＦＢＳ（ｖ／ｖ）、ペニシリン（１００単位／ ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を含むＲＰＭＩ １６４０培地に培養された。培養物は５％ＣＯ２を含む３７℃のインキュベーターに維持され、コンフルエンスが約８０％に達すると、０．０５％トリプシン－ＥＤＴＡを使用して付着培養物が継代された。前立腺細胞は、ドナーのインフォームドコンセントに従って、国立台湾大学病院の倫理審査委員会による完全な審査の後に得られたヒト組織サンプルからのものであった。前立腺標本は、経尿道的前立腺切除術による男性からのものであった。前立腺歴のあるすべての患者は直腸指診、前立腺の経直腸的超音波検査および尿流動態検査により、良性の前立腺肥大と診断された。前立腺組織外植片からのヒト前立腺細胞の分離は、以前の研究［非特許文献２２］で説明されている。前立腺細胞は、前立腺癌細胞に対して脂質ラフトの量が少なかった。
ＳＲＢアッセイ、コロニー形成アッセイ、およびカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）染色は、抗増殖測定に使用された。ＳＲＢアッセイは、細胞タンパク質の定量的ＳＲＢ染色に基づく正確で再現可能なアッセイであり、ＳＲＢアッセイのプロセスは次のように実行された。ＰＣ－３およびＤＵ－１４５の各細胞を、１０％ＦＢＳを含む培地の９６ウェルプレートに播種した。２４時間後、ＰＣ－３およびＤＵ－１４５細胞を１０％ＴＣＡで固定して、ｐ－ＴＳＡ添加時の細胞集団を表した。４８時間または７２時間のＤＭＳＯまたはｐ－ＴＳＡの追加インキュベート後、細胞を１０％ＴＣＡで固定して、１％酢酸中の０．４％（ｗ／ｖ）ＳＲＢを添加してＰＣ－３とＤＵ－１４５細胞を染色した。結合されていないＳＲＢを１％酢酸で洗い流し、ＳＲＢ結合細胞を１０ｍＭ Ｔｒｉｓベースで溶化した。ＳＲＢの吸光度は、ｐ－ＴＳＡ添加時（以下、時間ゼロ、ＴＺと呼ぶ）、およびＤＭＳＯ（以下、対照増殖と呼ぶ）またはｐ－ ＴＳＡ（以下、Ｔｘと呼ぶ）の追加インキュベーション後に、５１５ ｎｍの波長で測定された。細胞増殖阻害の割合は、［１－（Ｔｘ－ＴＺ）／（ＣＴＬ－ＴＺ）］×１００％の式によって計算された。細胞増殖の５０％阻害（ＩＣ５０）は、ｐ－ＴＳＡ濃度で決定され、これにより、ｐ－ＴＳＡインキュベーション中に対照細胞の総タンパク質増加が５０％減少する。
足場依存性クローン原性効果をアッセイするために、ＰＣ－３およびＤＵ－１４５の各細胞（１５０細胞／ウェル）を６ウェルプレートに播種した。ｐ－ＴＳＡで１０日間処理した後、細胞コロニーをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）でリンスし、２０％メタノールに溶解した０．４％（ｗ／ｖ）クリスタルバイオレットで染色し、５０％エタノールに溶解した５０ｍＭクエン酸ナトリウムで溶解した。５９５ｎｍの波長で吸光度を読み取った。
図１Ａに示す結果として、ｐ－ＴＳＡは、ＰＣ－３およびＤＵ－１４５細胞株の両方の濃度依存性阻害を示し、ＩＣ５０値は約３ｍＭであった。さらに、データは、ｐ－ＴＳＡが正常な前立腺細胞においてより低い抗増殖活性を表示することも示した。また、図１Ｂに示す結果として、クローン原性アッセイは、ｐ－ＴＳＡがＰＣ－３およびＤＵ－１４５細胞の両方において長期抗増殖効果（１０日）を表示することを実証した。
抗増殖効果はＣＦＳＥ染色によりさらに調べた。ＣＦＳＥは細胞追跡用の蛍光細胞染色色素であり、細胞内タンパク質にコンジュゲートされ、細胞増殖後に分裂した細胞に均一に遺伝した。その結果、蛍光染色は時間の経過とともに後の世代の細胞に分布した。ＣＦＳＥ染色のプロセスは以下のように行った。ＣＦＳＥをＤＭＳＯに溶解して１０ｍＭの保存液を形成し、使用するまで－２０℃で保存した。ＰＣ－３およびＤＵ－１４５細胞は１０６細胞／ｍｌの密度に調整され、チューブにおいて最終濃度が１０μＭであるＣＦＳＥで処理された。３７℃で１０分間インキュベートした後、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ培地を添加することにより標識をブロックした。チューブを氷上に５分間置き、次に洗浄した。チューブを遠心分離した後、５％ＣＯ２／９５％空気条件下、細胞をｐ－ＴＳＡの非存在下または存在下で１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ培地に３７℃で４８時間播種した。蛍光強度は、フローサイトメトリー分析により決定された。細胞増殖は、娘細胞における標識強度の低下をモニタリングすることにより評価された。親世代または異なる世代の増殖指数と細胞集団は、Ｍｏｄｆｉｔ ＬＴ ３．２版およびＷｉｎＬｉｓｔ５．０版のソフトウェアを使用して計算された。
フローサイトメトリー分析は以下のように行った。トリプシン処理により細胞を回収し、７０％（ｖ／ｖ）アルコールで４℃、３０分間固定し、ＰＢＳで洗浄した。遠心分離後、細胞をリン酸塩－クエン酸緩衝液（０．２ｍｏｌ／ｌのＮａＨＰＯ４、０．１ｍｏｌ／ｌのクエン酸、ｐＨ ７．８）で室温で３０分間インキュベートした。次に、細胞を遠心分離し、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（０．１％ｖ／ｖ）、ＲＮａｓｅ（１００μｇ／ｍｌ）およびＰＩ（８０μｇ／ｍｌ）を含む０．５ｍｌのヨウ化プロピジウム（ＰＩ）溶液で再懸濁した。ＤＮＡ含有量は、ＦＡＣＳｃａｎおよびＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（ベクトン・ディッキンソン、マウンテンビュー、ＣＡ、米国）で分析された。
図１Ｃおよび１Ｄに示すように、ｐ－ＴＳＡは細胞増殖を有意に阻害し、初期世代の細胞集団の増加を誘発した。ＣＦＳＥ染色アッセイに基づくＰＣ－３とＤＵ－１４５の両方の細胞の増殖指数は、ｐ－ＴＳＡ作用に対する濃度依存的な阻害を示した。ｐ－ＴＳＡは分子量１７１ダルトンの単純な小分子であるため、ｐ－ＴＳＡがミリモル濃度の範囲内に効果的であることは合理的である。他のいくつかの化合物や薬物も、ミリモル濃度で活性を示すことが報告されており、例えば、活性酸素種（ＲＯＳ）を除去するＮ－アセチルシステインおよびトロロックス、ならびに、細胞周期の停止とアポトーシス細胞死の誘導におけるアスピリンおよびエピガロカテキン－３－ガレートである［非特許文献２３、２４］。
上記から、ｐ－ＴＳＡがＣＲＰＣ細胞の増殖を阻害したことがわかる。
実施例２：細胞周期の進行とミトコンドリアのストレスに対するｐ－ＴＳＡの効果の検討
図２Ａに示すように、ｐ－ＴＳＡは、細胞周期のＧ１期におけるＰＣ－３細胞およびＤＵ－１４５細胞の両方の蓄積を誘導し、細胞アポトーシスを加速した。細胞周期チェックポイントは、適正な細胞分裂を確実にするための重要なメカニズムである。Ｇ１チェックポイントは、細胞が細胞周期に入ることに専念する主要なチェックポイントである。ＤＮＡ損傷または特定の細胞ストレスが発生すると、損傷が修復されるまでＧ１停止が発生する。適切に修復されない場合、アポトーシスは、生存促進成分の阻害またはアポトーシス経路の活性化によって引き起こされ、ミトコンドリアがこれらのシグナルを調整する最も敏感なオルガネラである。
ミトコンドリアは、細胞の成長と増殖のために、タンパク質、脂質、ヌクレオチドなどの生理活性成分を合成するためのＡＴＰの大部分を生成する。ミトコンドリアへのストレスとＡＴＰ産生の障害は、細胞周期の停止を誘発することが示されている［非特許文献２５］。ミトコンドリア膜電位（ΔΨｍ）の測定は、以下のように行った。ＪＣ－１は、膜電位依存的に生細胞のミトコンドリアを染色するミトコンドリア色素であり、ミトコンドリア膜電位（ΔΨｍ）の決定に使用された。ＰＣ－３およびＤＵ１４５細胞は、ｐ－ＴＳＡの有無で処理された。インキュベーション終了の３０分前に、細胞とＪＣ－１（最終濃度５μＭ）を３７℃で３０分間インキュベートした。最後に細胞を回収し、フローサイトメトリー分析を使用してＪＣ－１の蓄積を測定した。図２Ｂに示すように、ｐ－ＴＳＡはミトコンドリア膜電位の濃度依存的な低下をもたらし、また、ミトコンドリアストレスがカスパーゼ依存性アポトーシスを引き起こしたことを示す。その原因は、汎カスパーゼ阻害剤（pan-caspase inhibitor）であるＺ－ＶＡＤ－ＦＭＫは、ＰＩ染色のフローサイトメトリー分析およびヌクレオソームＤＮＡ断片アッセイの両方を使用して、ＰＴＳ誘発アポトーシスを大幅に阻害した（図２Ｅおよび図２Ｆ）。アポトーシス因子の放出につながる外ミトコンドリア膜の透過性の増加は、細胞アポトーシスの鍵である。ミトコンドリア膜の透過性は、Ｂｃｌ－２ファミリーのタンパク質によって直接制御される［非特許文献２６］。
図２Ｃおよび２Ｄに示すデータは、ｐ－ＴＳＡがＰＣ－３およびＤＵ－１４５細胞における２つのプロアポトーシスＢｃｌ－２ファミリーメンバーであるＰＵＭＡおよびＢａｋの発現の増加を誘導したことを示しした。さらに、各Ｍｃｌ－１、Ｂｃｌ－２、Ｂｉｄ、ＰＵＭＡ、およびＢａｋのタンパク質発現アッセイは、以下の方法でウエスタンブロッティングにより行った。ＰＣ－３およびＤＵ１４５細胞をｐ－ＴＳＡで処理した後、細胞をトリプシン処理で回収し、遠心分離して、１０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＧＴＡ、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、１ｍＭ ＰＭＳＦ、１０μｇ／ｍｌロイペプチン、１０μｇ／ｍｌアプロチニン、５０ｍＭ ＮａＦおよび１００μＭオルトバナジン酸ナトリウムを含む０．１ｍｌの溶解緩衝液で溶解した。総タンパク質を定量し、サンプル緩衝液と混合し、９０℃で５分間煮沸した。８％または１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥにおいて、等量のタンパク質（３０μｇ）を電気泳動により分離し、ＰＶＤＦ膜に転写して、Ｍｃｌ－１、Ｂｃｌ－２、Ｂｉｄ、ＰＵＭＡおよびＢａｋタンパク質のそれぞれに特異的な抗体（１：１０００希釈）で検出した。適切に標識された二次抗体（１：３０００希釈）とのインキュベーション後の免疫反応性タンパク質は、強化化学発光検出キット（アマシャム、バッキンガムシャー、イギリス）で検出された。また、図２Ｄから観察され、ｐ－ＴＳＡはＤＵ－１４５細胞における抗アポトーシスＢｃｌ－２ファミリーメンバーであるＭｃｌ－１のタンパク質発現を有意に減少させた。これらの影響はミトコンドリアのストレスと相関していた。
細胞周期のＧ１期では、サイクリンＤ１／Ｃｄｋ４複合体が、Ｒｂタンパク質のリン酸化によるＳ期への進行を担っている。サイクリンＤ１／Ｃｄｋ４複合体は、ｐ２１やｐ２７などのＣｄｋ阻害剤（ＣＤＫＩ）の活性を低下させ、その後ＤＮＡ合成に関連する多くのタンパク質を活性化するサイクリンＥ／Ｃｄｋ２複合体の活性化を引き起す［非特許文献２７］。
細胞死検出用のＤＮＡ断片は、細胞死検出ＥＬＩＳＡｐｌｕｓキット（ロシュ、マンハイム、ドイツ）を使用して決定された。このアッセイは、誘導された細胞死後、細胞質ヒストン関連ＤＮＡフラグメント（モノヌクレオソームおよびオリゴヌクレオソーム）の定量的なインビトロ決定に基づいた。化合物で処理した後、細胞を溶解および遠心分離し、製造元のプロトコルに従って、上清をヌクレオソームＤＮＡの検出に使用した。
図３Ａに示すように、そらはｐ－ＴＳＡがＰＣ－３細胞におけるサイクリンＤ１タンパク質発現およびＲｂリン酸化の両方の低下を誘導したが、Ｒｂ変異ＤＵ－１４５細胞におけるサイクリンＤ１発現の低下のみを誘導したことを実証した。また、ＰＣ－３とＤＵ－１４５の両方の細胞で、ｐ２１とｐ２７のどちらの発現もｐ－ＴＳＡによって変更されなかった。ｐ－ＴＳＡ誘発サイクリンＤ１ダウンレギュレーションは細胞周期のＧ１停止と相関していた。ただし、ｐ－ＴＳＡを介したＧ１停止におけるｐ２１とｐ２７の両方の独立性は、他の要因によって説明される可能性があり、以下で説明する。
上記から、ｐ－ＴＳＡが細胞周期とミトコンドリアストレスのＧ１停止を誘導する効果を提供することがわかる。
実施例３：Ａｋｔ／ｍＴＯＲ／ｐ７０Ｓ６Ｋ経路の調節に対するｐ－ＴＳＡの効果の検討
Ｇ１期の間、細胞はサイズが大きくなり、ＤＮＡ合成に必要なｍＲＮＡとタンパク質を合成する。セリン／スレオニンキナーゼｍＴＯＲおよびｐ７０Ｓ６Ｋは、下流のいくつかの翻訳因子のリン酸化または活性に影響を与えることによりタンパク質合成（ｍＲＮＡ翻訳）を調節し、Ｇ１期の重要な調節因子である［非特許文献２８～３０］。各Ａｋｔ、ｍＴＯＲ ４Ｅ－ＢＰ１、およびｐ７０Ｓ６Ｋのタンパク質発現アッセイは、ウエスタンブロット法により行った。図３Ｂおよび３Ｃに示すように、それはｐ－ＴＳＡがＰＣ－３およびＤＵ－１４５細胞の両方でｍＴＯＲ、４Ｅ－ＢＰ１（ｍＲＮＡ翻訳のリプレッサー）およびｐ７０Ｓ６Ｋタンパク質のリン酸化に対する阻害効果を誘導したことを実証するため、これらの細胞にタンパク質合成および抗がん効果の阻害を説明した。さらに、ｐ－ＴＳＡは、ＰＣ－３細胞におけるｍＴＯＲ、４Ｅ－ＢＰ１およびｐ７０Ｓ６Ｋのシグナル伝達経路の重要なプレーヤーであるＡｋｔのリン酸化を阻害するので、Ａｋｔ／ｍＴＯＲ／ｐ７０Ｓ６Ｋ軸活性化の阻害がｐ－ＴＳＡを介した効果の原因である可能性があることを示した。一方、ＤＵ－１４５細胞においてｐ－ＴＳＡはＡｋｔリン酸化を変更しなかったため、Ａｋｔに依存しないｍＴＯＲ／ｐ７０Ｓ６Ｋシグナリングを示唆した。
Ａｋｔの役割をさらに実証するために、以下に示す方法により、Ｍｙｒ－Ａｋｔを過剰発現させたＰＣ－３細胞を調製した。Ｎ末端にミリストイル化シグナルが付加されたＡｋｔであるＭｙｒ－Ａｋｔをコードするプラスミドは、Ｍｉｅｎ－Ｃｈｉｅ Ｈｕｎｇ教授（テキサス大学医学博士、アンダーソンがんセンター）からの贈り物であった。トランスフェクションのために、ＰＣ－３細胞を３０％コンフルエンスの６０ｍｍ組織培養皿に播種し、２４時間で５０～６０％コンフルエンスまで増殖させた。各ディッシュを無血清Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（ライフテクノロジー）で洗浄し、２ｍｌの無血清Ｏｐｔｉ－ＭＥＭを添加した。製造元の指示に従って、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（インビトロジェン）を使用して、Ｍｙｒ－Ａｋｔ発現ベクターを含むアリコートまたは無血清Ｏｐｔｉ－ＭＥＭの対照プラスミドを細胞にトランスフェクトした。３７℃で６時間インキュベートした後、細胞を無血清Ｏｐｔｉ－ＭＥＭで洗浄し、１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ－１６４０培地で４８時間インキュベートした。細胞をｐ－ＴＳＡありまたはなしでず処理して、関連する分析を行った。図４Ａ～４Ｄに示すように、ＰＣ－３細胞における恒常的に活性なＭｙｒ－Ａｋｔの過剰発現は、ｍＴＯＲと４Ｅ－ＢＰ１の両方のリン酸化に対する阻害効果を大幅に救い、カスパーゼ－３の活性化と下流基質ＰＡＲＰ－１の切断を抑制した。さらに、Ｍｙｒ－Ａｋｔの機能的救助が決定された。データには、ＳＲＢアッセイとコロニー形成アッセイの両方を使用して、ＰＣ－３細胞における恒常的に活性なＭｙｒ－Ａｋｔの過剰発現は中程度だが、ＰＴＳを介した増殖阻害が有意に鈍化されたことを示した（図４Ｅおよび図４Ｆ）。ＩＣ５０値は、それぞれ１．９７±０．０１から２．１８±０．１０ ｍＭ（Ｐ＜０．０５）および０．５８±０．０２から０．６８±０．０２ ｍＭ（Ｐ＜０．０１）に大幅にシフトした。しかしながら、Ｍｙｒ－Ａｋｔの過剰発現は、ｐ－ＴＳＡ誘発性サイクリンＤ１のダウンレギュレーションに最小限の影響を与えた。データは、ＡｋｔがサイクリンＤ１ダイナミクスの調節ではなく、ｍＴＯＲ翻訳経路の重要な役割を果たすことを示唆した。
上記から、ｐ－ＴＳＡはＡｋｔ／ｍＴＯＲ／ｐ７０Ｓ６Ｋ経路の活性化を阻害したことがわかる。
実施例４：脂質ラフトとコレステロールがｐ－ＴＳＡ作用に及ぼす影響の検討
脂質ラフトは、スフィンゴ糖脂質と特定のグリコリポタンパク質マイクロドメインに配置された多数の受容体とを含む細胞の原形質膜であり、さまざまな細胞プロセスのシグナル分子、膜液、タンパク質輸送を収集するための組織化センターとして機能する［非特許文献３１］。Ａｋｔ、ｍＴＯＲおよびｐ７０Ｓ６Ｋを含むいくつかのラフト関連シグナル伝達経路成分は細胞生存の調節に関与することが示唆されている能する［非特許文献３２］。脂質ラフトがｐ－ＴＳＡ作用に及ぼす影響を調べるために、ショ糖勾配分画により全細胞から脂質ラフトを単離して、イムノブロッティングによりラフト画分におけるいくつかのセリン／スレオニンキナーゼの局在を分析した。脂質ラフト分離の詳細な方法は以下のように行った。
溶解条件と不連続なショ糖勾配での遠心分離を使用して、脂質ラフトを単離した。簡単に言えば、ｐ－ＴＳＡありまたはなしで細胞を処理した後、細胞を氷冷ＰＢＳで洗浄し、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含むＴＮＥＶ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４、１ｍＭ ＰＭＳＦ）により氷上で３０分間溶解した。細胞をＢｉｏｖｉｓｉｏｎ組織ホモジナイザーと１５ストロークでホモジナイズした。２００ｇで８分間遠心分離した後、細胞核と細胞破片をペレット化し、４００μｌの上清を４００μｌの８５％（ｗ／ｖ）スクロースを含むＴＮＥＶ緩衝液と混合し、Ｂｅｃｋｍａｎ １３ｘ５１ｍｍの遠心チューブの底に移した。希釈した溶解物を、２．４ ｍｌの３５％（ｗ／ｖ）スクロースを含むＴＮＥＶ緩衝液で覆って、最後に１．４ ｍｌの５％（ｗ／ｖ）スクロースを含むＴＮＥＶ緩衝液で覆った。Ｂｅｃｋｍａｎ Ｏｐｔｉｍａ Ｌ１００Ｋ超遠心分離機（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、パロアルト、ＣＡ、米国）において、サンプルをＳＷ５５ローターで２００，０００ｇ、１８時間、４℃で遠心分離した。次に、各容量が３５０μｌである画分を上部グラジエントから収集した。各画分の１５μｌをウエスタンブロット分析に供すことにより、不連続なショ糖勾配における標的タンパク質の位置を決定した。
結果を図５Ａ、５Ｂおよび５Ｃに示した。データは、ＰＣ－３およびＤＵ－１４５細胞株の両方が、さまざまなレベルで３つのラフト関連キナーゼすべてを発現し、ｐ７０Ｓ６Ｋが最も豊富であることを示した。さらに、ｐ－ＴＳＡは、ラフト関連の総形態とリン酸化形態のキナーゼの両方の発現を低下させ、リン酸化のｐ７０Ｓ６Ｋ発現はＰＣ－３とＤＵ－１４５の両方の細胞株で完全に絶滅された。
さらに、コレステロールは、すべての動物細胞によって生合成されるユニークな脂質分子であって、細胞膜の構造的完全性と流動性を維持するために不可欠な構造的成分である。ラフトは、外側の細胞外リーフレットにおけるスフィンゴ脂質とコレステロールで構成され、脂質二重層の内側細胞質リーフレットのリン脂質とコレステロールに接続される［非特許文献３３、３４］。最近の研究は、脂質ラフトからのコレステロールの枯渇がいくつかの癌のアポトーシスに関与することを示した。コレステロールがｐ－ＴＳＡ作用に及ぼす影響を調べるために、ｐ－ＴＳＡ処理したＰＣ－３およびＤＵ－１４５細胞にコレステロールを供給した。結果を図６Ａ～６Ｄに示し、データは、適切な濃度のコレステロール補足がｐ－ＴＳＡによって誘発されたＡｋｔとｐ７０Ｓ６Ｋのリン酸化の低下を大幅に救ったが、ＰＣ－３とＤＵ－１５の両方の細胞におけるサイクリンＤ１を救わなかった。コレステロール自体は、特にＤＵ－１４５細胞において、サイクリンＤ１タンパク質発現の低下と同時に、Ａｋｔリン酸化の増加を誘導した。また、細胞増殖におけるコレステロールの機能的救済も決定され、結果が図６Ｅに示された。データは、コロニー形成アッセイを使用することにより、コレステロールが細胞増殖のＰＴＳ誘発性阻害を有意に救済したことを示した。
上記から、脂質ラフトとコレステロールは、ｐ－ＴＳＡ作用に対するいくつかのキナーゼの活性に重要であることがわかる。
実施例５：マウス異種移植モデルにおけるｐ－ＴＳＡ作用の効果の検討
インビボ抗腫瘍研究は以下のように行った。ヌードマウスのＰＣ－３由来の癌異種移植片をインビボモデルとして使用した。ヌードマウスにＰＣ－３細胞（１０７細胞／マウス）を皮下注射した。腫瘍は毎日測定された。腫瘍の体積が１００ｍｍ３に達したら、マウスを２つのグループ（ｎ＝８－１０）に分け、化合物の治療を開始した。ｐ－ＴＳＡを１５％の１－メチル－２－ピロリドン（ＮＭＰ）に溶解した。媒介物（１５％ＮＭＰ）またはｐ－ＴＳＡを隔日で腹腔内投与した。腫瘍の長さ（ｌ）と幅（ｗ）を測定し、腫瘍体積をｌｗ２／２として計算した。インビボ試験のプロトコルは、国立台湾大学の動物管理使用委員会により承認された。すべての動物の手順とプロトコルは、ＡＡＡＬＡＣの認定施設により承認された。データ分析は以下のように示した。データは、示された数の個別の実験の平均値±平均値の標準誤差（ＳＥＭ）として表された。統計分析は、複数のサンプルセットに対して一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を使用して実行された。適切なグループの単一比較は、スチューデントのｔ検定で行われた。０．０５未満のＰ値は統計的に有意であると見なされる。
ＰＣ－３細胞が皮下接種されたヌードマウスモデルにおける腫瘍異種移植片を使用して、ｐ－ＴＳＡのインビボ有効性評価を実施した。操作員は実験的な治療を完全に知らされなかった。腫瘍が１００ｍｍ３（ｐ－ＴＳＡグループが１２１±４０ｍｍ３、対照グループが１０１±４８ｍｍ３）のサイズに達したときに、７５ｍｇ／ｋｇのｐ－ＴＳＡの最初の腹腔内注射が行われた。まず、腫瘍成長阻害治療／対照（Ｔ／Ｃ）比を使用して、マウス異種移植モデルにおけるｐ－ＴＳＡの治療効果を定量化した。図７Ａに示すように、データは、ｐ－ＴＳＡ治療終了したとき、腫瘍増殖阻害Ｔ／Ｃ比が０．４４であることを示した。さらに、ｐ－ＴＳＡ治療の中止により腫瘍のリバウンド成長が引き起こされたので、ｐ－ＴＳＡが腫瘍成長の阻害に完全に関与することが示唆された。また、図７Ｂに示すように、対照グループの成長率とｐ－ＴＳＡグループの成長率は３７．８ｍｍ３／日と１６．８ｍｍ３／日であるため、ｐ－ＴＳＡによる５６％の阻害を示した。対照グループの腫瘍サイズの中央値は７６５ｍｍ３に対して、ｐ－ＴＳＡグループの腫瘍サイズの中央値は４０３ｍｍ３なので、ｐ－ＴＳＡによる４７％の阻害を示した。さらに、図７Ｃに示すように、グループ間の有意差が示されなかったが、インビボ研究は対照グループとｐ－ＴＳＡグループの両方で体重の漸進的な減少を示した。また、ｐ－ＴＳＡグループの２２日目に２０％の体重減少に達したことに対して、対照グループは１２日目に達したことも示した。また、図７Ｄに示すように、腫瘍におけるｐ－Ａｋｔ発現の検出はＰＴＳの有意な阻害効果も示した。
上記から、ｐ－ＴＳＡはマウス異種移植モデルにおいて抗ＣＲＰＣのインビボ有効性を示したことがわかる。
癌細胞の特徴の１つである自律細胞増殖は、活性化された生存および増殖を促進する癌遺伝子によって引き起こされる。ホスファチジルイノシトール－３－キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）／Ａｋｔ／ｍＴＯＲ／ｐ７０Ｓ６Ｋシグナル伝達経路は、前立腺癌細胞で一般的に活性化される経路である。ＰＴＥＮ腫瘍抑制因子の喪失は、この経路の異常な活性化の要因として報告されることが多く、前立腺癌細胞の生存と増殖だけでなく、腫瘍転移にも関与している［非特許文献５、３６、３７］。したがって、これらの経路の不活性化は、前立腺癌の治療の機会をもたらす可能性がある。いくつかの研究では、ＰＩ３Ｋ阻害剤の有望な前臨床結果が報告されているが、臨床試験のデータは説得力がなかった。したがって、より優れた抗癌結果を達成するために、ＰＩ３Ｋ／ＡｋｔとｍＴＯＲの両方をブロックするデュアルＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ阻害剤が提案されている［非特許文献３６、３８］。しかしながら、さまざまな生物学的および臨床的行動を示す前立腺癌は、極端な遺伝的異質性のエピフェノメナを表してる［非特許文献３７］。複数の特定の分子変化の検査と複数の要因に基づく最も適切な治療法の開発は、治療のより良い機会を提供するかもしれなかった。
本開示は、ＰＣ－３およびＤＵ－１４５細胞株の両方を使用してＣＲＰＣを標的とし、インビトロおよびインビボの両方で細胞の増殖および生存を効率的に遮断するｐ－ＴＳＡを介した複数のメカニズムを詳述する。ｐ－ＴＳＡは、Ｇ１期の誘導を通じて、効果的かつ長期的に安定した抗増殖活性を示し、最終的に細胞アポトーシスを誘導した。通常、ＤＮＡ損傷または特定の細胞ストレスは、Ｇ１チェックポイント停止を引き起こし、損傷を修復してプログラム細胞死から細胞を救出する傾向がある。ただし、ｐ－ＴＳＡはミトコンドリアの損傷を誘発し、これは、細胞障害は、最終的にアポトーシスにつながるｐ－ＴＳＡ治療中に大幅に修復されなかったことを示した。ミトコンドリア膜の完全性と透過性は、Ｂｃｌ－２ファミリーのタンパク質によって厳しく調節された［２６］。ＰＵＭＡは、Ｂｃｌ－２ファミリーのＢＨ３のみのサブグループのｐ５３依存性およびｐ５３非依存性プロアポトーシスメンバーであり、ＢＨ３ドメインを介して抗アポトーシスＢｃｌ－２メンバーに直接結合することにより、アポトーシス促進Ｂｃｌ－２メンバーの活性化とミトコンドリア外膜透過性の増加を誘導して、ミトコンドリア機能障害とカスパーゼ活性化につながることが確認される［非特許文献３９］。最近、いくつかの証拠により、Ｂｉｍ、Ｎｏｘａ、ｔＢｉｄと同様に、ＰＵＭＡはＢａｋのオリゴマー化と活性化を開始できる直接のＢａｋ活性化因子であることが示唆されている［非特許文献４０］。ｐ－ＴＳＡは、ＰＵＭＡおよびＢａｋの発現の有意な増加を有意に誘導し、ミトコンドリア機能障害へのそれらの寄与を示す。ｐ－ＴＳＡは、ＤＵ－１４５細胞におけるＭｃｌ－１発現も有意に抑制した。Ｍｃｌ－１とＰＵＭＡがミトコンドリアに共局在し、ＰＵＭＡとの共発現中にＭｃｌ－１レベルが増加することが報告されており、ＰＵＭＡがＭｃｌ－１を安定化できることを示す。一方、いくつかの研究では、ＰＵＭＡのＭｃｌ－１への結合はＭｃｌ－１の急速な分解を防ぐのに十分ではないことが明らかになっている［非特許文献４１］。私たちのデータは、ＰＵＭＡがＭｃｌ－１分解を防止せず、さらにミトコンドリア機能障害がＤＵ－１４５細胞におけるＭｃｌ－１分解に部分的に起因するという同様の結果を示した。
Ｇ１期中、ＤＮＡ合成のためにｍＲＮＡおよびタンパク質が強力的に合成されることにより細胞のサイズは大きくなり、ｍＴＯＲはリン酸化の誘導およびいくつかの下流の翻訳因子の活性化を通じて重要な役割を果たす［非特許文献２８～３０］。ｐ－ＴＳＡは、ｍＴＯＲ活性化の重要なマーカーであるＣ末端調節領域内のＳｅｒ２４４８のｍＴＯＲのリン酸化を著しく阻害した［非特許文献２８、４２］。このリン酸化は、Ａｋｔ依存性経路または非依存性経路のいずれかを介して活性化できる［非特許文献４２、４３］。Ａｋｔの恒常的な活性化形態であるＭｙｒ－Ａｋｔの過剰発現は、ＰＣ－３細胞におけるｍＴＯＲＳｅｒ２４４８と４Ｅ－ＢＰ１Ｔｈｒ３７／４６（ｍＴＯＲの直接基質）の両方でのリン酸化のｐ－ＴＳＡ媒介阻害をほぼ完全に廃止し、ｐ－ＴＳＡ作用に対するＡｋｔ依存性ｍＴＯＲ活性の阻害を示唆する。一方、ＰＣ－３以外、ＤＵ－１４５がｍＲＮＡとタンパク質の両方のレベルでＰＴＥＮを発現するため、ＤＵ－１４５細胞のＡｋｔ活性が明らかでなかった原因は、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ活性の負の調節因子であるＰＴＥＮの存在による可能性がある［非特許文献４４］。ＤＵ－１４５細胞におけるＡｋｔ非依存性経路を介したｍＴＯＲ活性の調節については、以下で討論する。
サイクリンＤ１は、細胞周期進行のＧ１期の主要な調節因子であり、異常なサイクリンＤ１発現は、多くのヒト腫瘍における腫瘍形成、転移および腫瘍進行に関与している［非特許文献４５、４６］。サイクリンＤ１の過剰発現は、前立腺の発癌と骨転移の悪化に関与している［非特許文献４５］。ｐ－ＴＳＡは細胞周期のＧ１停止を誘発し、骨転移由来のＰＣ－３細胞と脳転移由来のＤＵ－１４５細胞の両方でサイクリンＤ１の発現を効率的にブロックするため、ｐ－ＴＳＡが前立腺癌の転移を抑制する可能性を示す。ただし、Ｍｙｒ－Ａｋｔの過剰発現はサイクリンＤ１ダウンレギュレーションを救わないので、Ａｋｔに依存しない調節経路の存在を示す。細胞のＡＴＰレベルの低下、プロテインキナーゼＣとホスファターゼＰＰ２Ａとの活性化、アデニンヌクレオチドトランスロカーゼ２の枯渇、ｃ－Ｍｙｃのダウンレギュレーションを含む、いくつかの経路がサイクリンＤ１のダウンレギュレーションに関与することが提案されている［非特許文献４７～４９］。明確な経路はさらに解明する必要がある。ｐ－ＴＳＡを介した細胞周期のＧ１停止は、ｐ２１およびｐ２７とは無関係であった。同様の効果が多くの研究で報告されている。Ｖａｚｉｒｉらは、酪酸によって誘発されたＧ１停止が、トランスジェニックｐ２１「ノックアウト」マウス（ｐ２１－／－）からの線維芽細胞の初代培養で発生し、ｐ２１誘導の独立性を示すと報告した［非特許文献５０］。Ｂｅｒｎｓらは、ｐ２７とｐ２１の両方を欠く胚線維芽細胞において、ｃ－Ｍｙｃのドミナントネガティブ変異体が細胞周期マウスのＧ１停止を誘発する可能性があると報告している［非特許文献５１］。これらの研究は、ｐ２１とｐ２７の両方がをｐ－ＴＳＡを介したＧ１停止に対する細胞周期調節因子の律速ではないことを支持している。
最近、Ａｋｔ、ｍＴＯＲ、ｐ７０Ｓ６Ｋを含むラフト関連シグナル伝達経路の成分は細胞生存制御に関与しているので、抗癌研究における脂質ラフトの機能に多くの注意が払われている［非特許文献３２］。前立腺癌細胞にはより多くの脂質ラフトが含まれているため、前立腺癌の治療にはそれが重要である［非特許文献３４、５２］。コレステロールは、膜の完全性と流動性を維持する上で不可欠であり、また、ラフト／カベオラの形成に不可欠である。細胞のコレステロール含有量の変化は脂質ラフトの特性を変更する可能性があり［非特許文献５３］、原形質膜からのコレステロールの枯渇は、特に膜コレステロール含有量が高い前立腺癌細胞において、アポトーシスを誘導する［非特許文献５２］。したがって、ラフト／コレステロールを標的とする療法は、潜在的な戦略となる。データは、ＰＣ－３およびＤＵ－１４５細胞株の両方が、ラフト関連のＡｋｔ、ｍＴＯＲ、およびｐ７０Ｓ６Ｋを発現することを示した。ｐ－ＴＳＡは、これらの総形態とリン酸化形態の発現の低下を誘発した。いくつかの研究は、脂質ラフトの完全性がこれらのキナーゼの活性に必要であることを示唆している。脂質ラフトの障害または破壊は、これらのキナーゼのリン酸化を損なう可能性がある［非特許文献５４～５６］。したがって、ｐ－ＴＳＡは脂質ラフトの障害または破壊を引き起こし、これらのキナーゼの解離と不活性化につながる可能性がある。コレステロールの補給は、これらのキナーゼのｐ－ＴＳＡを介した不活性化を大幅に救い、ｐ－ＴＳＡを介したラフトの破壊に対するコレステロールの役割をさらに関連付けた。しかし、コレステロールの補給は、ラフト関連成分ではなかったため、サイクリンＤ１のダウンレギュレーションを防止しなかった。データは、サイクリンＤ１のダウンレギュレーションがＡｋｔ／ｍＴＯＲ／ｐ７０Ｓ６Ｋ経路の下流イベントではないという考えも支持した。最後に、ヌードマウス異種移植モデルを使用して、ｐ－ＴＳＡのインビボ抗腫瘍効果を調べた。ｐ－ＴＳＡの腹腔内治療は、Ｔ／Ｃと成長率の測定を通じて腫瘍成長の５６％の阻害と、中央腫瘍サイズを検出することによる４７％の阻害を誘発した。腫瘍のＡｋｔリン酸化もＰＴＳによって有意に抑制された。データにより、ｐ－ＴＳＡのインビボの有効性が明らかになった。
結論として、このデータは、ｐ－ＴＳＡがインビトロとインビボの両方で有効な抗腫瘍剤であることを示唆している。ｐ－ＴＳＡは、ＰＣ－３細胞とＤＵ－１４５細胞の両方で、Ｇ１期の細胞周期の停止と、ＢａｋとＰＵＭＡが関与するミトコンドリア機能障害を介したアポトーシスにより抗増殖効果を誘発した。さらに、Ａｋｔは、アポトーシスを調節するｍＴＯＲ／ｐ７０Ｓ６Ｋ経路に対して、ＰＴＥＮヌル／Ａｋｔ活性化のＰＣ－３細胞では重要であるが、ＰＴＥＮ野生型ＤＵ－１４５細胞では重要ではない。脂質ラフトとコレステロールの含有量の妨害は、少なくとも部分的に、両方の細胞株におけるＡｋｔ、ｍＴＯＲおよびｐ７０Ｓ６Ｋの解離と不活性化を説明する可能性がある。
本開示は、例示的な実施形態を使用して説明されてきた。しかしながら、本開示の範囲は、開示された実施形態に限定されないことを理解されたい。逆に、さまざまな変更や同様の再配置をカバーすることを目的としている。したがって、クレームの範囲は、そのようなすべての変更および類似の構成を包含するように、最も広い解釈に従うべきである。
Claims (12)
- 脂質ラフトの完全性を調節するための治療を必要とする対象に医薬組成物を投与することを含む、細胞の脂質ラフトの完全性のレベルを低下させることにより改善しやすい癌を治療する方法に用いられる医薬組成物であって、
前記癌は、脂質ラフトがより豊富であり、
ただし、前記癌が、腺様嚢胞癌、肺癌、肝臓癌、食道癌、乳癌、頭頸部扁平上皮癌、軟口蓋扁平上皮癌、喉頭癌、結腸癌、鼻咽頭癌および舌癌であることはなく、
前記医薬組成物は、ベンゼンスルホンアミド誘導体およびその薬学的に許容される賦形剤を含み、かつ、ビタミンＣを含まず、
当該ベンゼンスルホンアミド誘導体は、式（I）
（式（I）において、Ｒ１～Ｒ７は、Ｈ、Ｃ１－Ｃ６直鎖または分岐アルキル基、Ｃ１－Ｃ６直鎖または分岐アルコキシ基、Ｃ３－Ｃ６シクロアルキル基、Ｃ３－Ｃ６シクロヘテロアルキル基、アミノ基およびハロ基からなる群から独立して選択され、またはＲ６とＲ７が互いに結合して環を形成し、
当該アルキル基、当該アルコキシ基、当該シクロアルキル基、当該シクロヘテロアルキル基および当該環は、非置換または１つ以上の置換基で置換され、
当該置換基は、フェニル基、ハロ基、オキソ基、エーテル基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、アミノ基、スルホ基およびスルホンアミド基からなる群から選択される）で表されるものまたはその薬学的に許容される塩である、医薬組成物。 - 当該ベンゼンスルホンアミド誘導体は、ｐ-トルエンスルホンアミド、ｏ-トルエンスルホンアミド、ｍ-トルエンスルホンアミド、N-エチル-ｐ-トルエンスルホンアミド、N-エチル-ｏ-トルエンスルホンアミド、N-シクロヘキシル-ｐ-トルエンスルホンアミド、
からなる群から選択される少なくとも1つである、請求項１に記載の医薬組成物。 - 細胞の原形質膜からコレステロールを枯渇させる、請求項１に記載の医薬組成物。
- 当該癌は、前立腺癌、皮膚癌、膵臓癌、黒色腫、腎臓癌、膀胱癌、セミノーマ、卵巣癌、子宮頸癌、大腸癌、口腔癌、甲状腺癌、髄膜腫、胆管癌、下咽頭癌、胃癌および外陰癌からなる群から選択される少なくとも１つである、請求項１に記載の医薬組成物。
- 医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、癌を予防または治療する方法に用いられる医薬組成物であって、
前記癌は、脂質ラフトがより豊富であり、
ただし、前記癌が、腺様嚢胞癌、肺癌、肝臓癌、食道癌、乳癌、頭頸部扁平上皮癌、軟口蓋扁平上皮癌、喉頭癌、結腸癌、鼻咽頭癌および舌癌であることはなく、
前記医薬組成物は、ベンゼンスルホンアミド誘導体およびその薬学的に許容される賦形剤を含み、かつ、ビタミンＣを含まず、
前記ベンゼンスルホンアミド誘導体は式（I）
（式（I）において、Ｒ１～Ｒ７は、Ｈ、Ｃ１－Ｃ６直鎖または分岐アルキル基、Ｃ１－Ｃ６直鎖または分岐アルコキシ基、Ｃ３－Ｃ６シクロアルキル基、Ｃ３－Ｃ６シクロヘテロアルキル基、アミノ基およびハロ基からなる群から独立して選択され、またはＲ６とＲ７が互いに結合して環を形成し、
当該アルキル基、当該アルコキシ基、当該シクロアルキル基、当該シクロヘテロアルキル基および当該環は、非置換または１つ以上の置換基で置換され、
当該置換基は、フェニル基、ハロ基、オキソ基、エーテル基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、アミノ基、スルホ基およびスルホンアミド基からなる群から選択される）で表されるものまたはその薬学的に許容される塩である、医薬組成物。 - 当該癌は、前立腺癌、皮膚癌、膵臓癌、黒色腫、腎臓癌、膀胱癌、セミノーマ、卵巣癌、子宮頸癌、大腸癌、口腔癌、甲状腺癌、髄膜腫、胆管癌、下咽頭癌、胃癌および外陰癌からなる群から選択される少なくとも１つである、請求項５に記載の医薬組成物。
- 対象に少なくとも１つの追加の抗癌療法を施すことをさらに含む、請求項５に記載の医薬組成物。
- 当該追加の抗癌療法は、全身化学療法、放射線療法、または温熱療法である、請求項７に記載の医薬組成物。
- 当該医薬組成物におけるベンゼンスルホンアミド誘導体は、１日あたり２０ｍｇから４０００ｍｇの治療的有効量で対象に投与される、請求項５に記載の医薬組成物。
- 当該医薬組成物は、癌細胞の脂質ラフトの完全性を調節する、請求項５に記載の医薬組成物。
- 当該医薬組成物は、癌細胞の原形質膜からコレステロールを枯渇させる、請求項１０に記載の医薬組成物。
- 当該医薬組成物は、癌細胞の脂質ラフトの完全性を障害または破壊させる、請求項１０に記載の医薬組成物。
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