JP7162872B2 - 医薬用組成物 - Google Patents
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Description
特許法第３０条第２項適用 ｈｔｔｐｓ：／／ｋａｋｅｎ．ｎｉｉ．ａｃ．ｊｐ／ｒｅｐｏｒｔ／ＫＡＫＥＮＨＩ－ＰＲＯＪＥＣＴ－１５Ｋ０９５１４／１５Ｋ０９５１４２０１６ｈｏｋｏｋｕ／、２０１８年１月１６日
本発明は、関節リウマチ（rheumatoid arthritis：ＲＡ）の治療又は予防に有用な医薬用組成物に関する。
ＲＡは、自己免疫機序による慢性多発性関節炎であり、滑膜の肥厚・増殖に伴う骨・軟骨破壊を特徴とする。ＲＡの病態においては、関節滑膜局所で活性化されたＴ細胞、マクロファージから産生されるＴＮＦ－α（tumor necrosis factor alpha）、ＩＬ－６（interleukin-6）などの炎症性サイトカインにより腫瘍様増殖した線維芽細胞様滑膜細胞（fibroblast-like synoviocytes：ＦＬＳ）が中心的役割を担う。無秩序に増殖したＦＬＳはＭＭＰ（matrix metalloproteinase）などのタンパク分泌を介して軟骨破壊に関わるとともに、ＲＡＮＫＬ（Receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand）を発現することで破骨細胞を活性化し骨破壊を引き起こす。従来、非特異的経口治療薬や炎症性サイトカインをターゲットとした生物学的製剤による治療が行われてきたが、寛解率は必ずしも高くない。このため、ＲＡの病態解明及び新たな治療ターゲットの探索、新規治療薬の開発が求められている。
ＲＡは免疫関連疾患の一種であることから、免疫反応のさらなる解明により、新たな治療ターゲットが発見できる可能性がある。しかしながら、免疫反応は非常に多くの遺伝子が複雑に作用しあっており、実際に有望な治療ターゲットを探索することは困難である。例えば特許文献１には、ＣＤ４＋Ｔ細胞の集団を、抗ＣＤ３抗体とＩＣＡＭ－１、又は、抗ＣＤ抗体と抗ＣＤ２８抗体を用いて活性化した刺激細胞と、比較のための休止細胞とでマイクロアレイ解析を行ったところ、約８０００もの遺伝子で刺激細胞と休止細胞とで発現量に差が観察されたことが開示されている。
一方で、非特許文献１には、ＲＡ患者のＦＬＳではＲａｓＧＲＰ４（Ras guanine nucleotide-releasing protein 4）の発現が亢進していること、ＦＬＳにおけるＲａｓＧＲＰ４のｍＲＮＡ発現量と細胞増殖能は正の相関関係にあること、ｓｉＲＮＡを用いてＲａｓＧＲＰ４をノックダウンした場合、ＦＬＳの細胞増殖能が低下すること、が報告されている。当該文献では、さらに、コラーゲン誘導滑膜炎（collage-induced arthritis：ＣＩＡ）ラットにおいて、ＲａｓＧＲＰ４ ｓｉＲＮＡの足関節内投与は、コントロールと比較して有意に足関節炎スコアと足関節径を減少させ、また骨破壊、軟骨破壊も軽減させることも報告されている。
なお、ＲａｓＧＲＰは、別名ＣａｌＤＡＧ－ＧＥＦと呼ばれるＧＥＦ（guanine nucleotide exchange factor）の一種であり、ＲａｓＧＲＰファミリー分子としてＲａｓＧＲＰ１～４まで同定されている。このうち、ＲａｓＧＲＰ２（ＣａｌＤＡＧ－ＧＥＦＩ）は、Ｒａｓ活性化因子というよりむしろＲａｐ－１の活性化を司るＧＥＦであり、血小板においてＲａｓＧＲＰ２は、Ｒａｐ－１の活性化を通じてインテグリンの発現を調整し、血小板の接着、凝集に関与していることが報告されている（例えば、非特許文献２参照。）。
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Wruck et al.，Annals of the Rheumatic Diseases，2011，vol.70，p.844-850.
本発明は、ＲＡの治療又は予防に有用な医薬用組成物を提供することを目的とする。
本発明者らは、ＲＡ患者由来のＦＬＳにＲａｓＧＲＰ２が高発現していること、及び関節炎モデル動物において関節内局所でのＲａｓＧＲＰ２発現抑制によって関節炎が改善することを見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、以下の医薬用組成物を提供するものである。
［１］ ＲａｓＧＲＰ２遺伝子の機能を抑制又は阻害する物質を有効成分とし、
前記ＲａｓＧＲＰ２遺伝子の機能を抑制又は阻害する物質が、ＲＮＡ干渉により、ＲａｓＧＲＰ２遺伝子の発現自体を抑制させる作用を有する物質であり、
関節リウマチの治療又は予防に用いられる、医薬用組成物。
［２］ 前記ＲａｓＧＲＰ２遺伝子の機能を抑制又は阻害する物質が、ＲａｓＧＲＰ２遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡである、前記［１］の医薬用組成物。
［３］ 滑膜組織の浸潤を抑制する、前記［１］又は［２］の医薬用組成物。
［４］ さらに、ＲａｓＧＲＰ４遺伝子の機能を抑制又は阻害する物質を有効成分とし、
前記ＲａｓＧＲＰ４遺伝子の機能を抑制又は阻害する物質が、ＲＮＡ干渉により、ＲａｓＧＲＰ４遺伝子の発現自体を抑制させる作用を有する物質である、前記［１］～［３］のいずれかの医薬用組成物。
［５］ 前記ＲａｓＧＲＰ４遺伝子の機能を抑制又は阻害する物質が、ＲａｓＧＲＰ４遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡである、前記［４］の医薬用組成物。
［１］ ＲａｓＧＲＰ２遺伝子の機能を抑制又は阻害する物質を有効成分とし、
前記ＲａｓＧＲＰ２遺伝子の機能を抑制又は阻害する物質が、ＲＮＡ干渉により、ＲａｓＧＲＰ２遺伝子の発現自体を抑制させる作用を有する物質であり、
関節リウマチの治療又は予防に用いられる、医薬用組成物。
［２］ 前記ＲａｓＧＲＰ２遺伝子の機能を抑制又は阻害する物質が、ＲａｓＧＲＰ２遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡである、前記［１］の医薬用組成物。
［３］ 滑膜組織の浸潤を抑制する、前記［１］又は［２］の医薬用組成物。
［４］ さらに、ＲａｓＧＲＰ４遺伝子の機能を抑制又は阻害する物質を有効成分とし、
前記ＲａｓＧＲＰ４遺伝子の機能を抑制又は阻害する物質が、ＲＮＡ干渉により、ＲａｓＧＲＰ４遺伝子の発現自体を抑制させる作用を有する物質である、前記［１］～［３］のいずれかの医薬用組成物。
［５］ 前記ＲａｓＧＲＰ４遺伝子の機能を抑制又は阻害する物質が、ＲａｓＧＲＰ４遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡである、前記［４］の医薬用組成物。
本発明に係る医薬用組成物は、ＲａｓＧＲＰ２遺伝子の機能を抑制又は阻害する物質を有効成分とするため、滑膜組織の浸潤を抑制することができ、ＲＡの治療又は予防に有用である。
また、滑膜組織を構成する細胞におけるＲａｓＧＲＰ２遺伝子の発現量は、ＲＡの診断マーカーとして有用であり、よって本発明に係るＲＡ発症可能性の評価方法は、ＲＡの早期発見や、ＲＡ治療剤の治療効果の評価に有用である。
また、滑膜組織を構成する細胞におけるＲａｓＧＲＰ２遺伝子の発現量は、ＲＡの診断マーカーとして有用であり、よって本発明に係るＲＡ発症可能性の評価方法は、ＲＡの早期発見や、ＲＡ治療剤の治療効果の評価に有用である。
本発明に係る医薬用組成物は、ＲａｓＧＲＰ２遺伝子の機能を抑制又は阻害する物質（以下、まとめて「ＲａｓＧＲＰ２阻害物質」という。）を有効成分とする。ＲａｓＧＲＰ２は、ＦＬＳの遊走を制御し、また、ＩＬ－６の産生にも関与している。このため、滑膜組織においてＲａｓＧＲＰ２遺伝子の機能を抑制又は阻害することにより、ＦＬＳの遊走及びＩＬ－６の産生が抑制され、ＦＬＳによる滑膜組織の浸潤や炎症を抑えることができる。このため、本発明に係る医薬用組成物は、ＲＡの治療又は予防に有用である。
本発明に係る医薬用組成物は、滑膜の浸潤性そのものをターゲットとしている。本発明に係る医薬用組成物は、従来のＲＡ治療は免疫担当細胞やサイトカインを標的とした炎症の抑制を目的とする治療方法とは異なり、新しい治療方法のための医薬品となり得る。このため、本発明に係る医薬用組成物は、従来のＲＡ治療の難治例に対する治療として選択可能な治療になり得る。特に、ＲａｓＧＲＰ２阻害物質によるＲＡ治療は免疫抑制作用を介さないと考えられるため、現行のＲＡ治療の効果と表裏一体である易感染性の問題を解決できる可能性もある。また、一般的に、作用機序の異なる治療を選択することによって副作用の抑制が期待できるため、本発明に係る医薬用組成物を従来のＲＡ治療と併用することも好ましい。
ＲａｓＧＲＰ２遺伝子の機能の抑制又は阻害は、ＲａｓＧＲＰ２遺伝子の発現を阻害することによって達成できる。すなわち、本発明に係る医薬用組成物の有効成分であるＲａｓＧＲＰ２阻害物質としては、ＲＮＡ干渉等により、ＲａｓＧＲＰ２遺伝子の発現自体を抑制させる作用を有する物質が挙げられる。当該物質としては、例えば、ＲａｓＧＲＰ２遺伝子のｃＤＮＡの部分領域（ＲＮＡｉ（ＲＮＡ干渉）標的領域）のセンス鎖とアンチセンス鎖からなる二本鎖構造を有するｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）、ｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ）又はｍｉＲＮＡ（ｍｉｃｒｏ ＲＮＡ）が挙げられる。また、標的であるＦＬＳや滑膜組織を構成する細胞の細胞内において、ｓｉＲＮＡ等を生産させることができるＲＮＡｉ誘導ベクターであってもよい。ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、及びＲＮＡｉ誘導ベクターの作製は、標的とするＲａｓＧＲＰ２遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列情報から、常法により設計し製造することができる。また、ＲＮＡｉ誘導ベクターは、市販の各種ＲＮＡｉベクターの塩基配列に、ＲＮＡｉ標的領域の塩基配列を挿入することによって作製することもできる。
本発明に係る医薬用組成物の有効成分としては、ＲａｓＧＲＰ２タンパク質に直接又は間接的に結合することによって、ＲａｓＧＲＰ２タンパク質の機能、特に、Ｒａｐ－１の活性化又は間接的にＲａｓの活性化を抑制若しくは阻害する物質であってもよい。当該物質としては、特に限定されるものではなく、核酸、ペプチド、タンパク質、低分子化合物のいずれであってもよい。
ＲａｓＧＲＰ２タンパク質に結合してＲａｓＧＲＰ２タンパク質の機能を阻害するタンパク質としては、例えば、ＲａｓＧＲＰ２タンパク質と特異的に結合する抗体（抗ＲａｓＧＲＰ２抗体）が挙げられる。当該抗体としては、モノクローナル抗体でもよく、ポリクローナル抗体でもよい。また、キメラ抗体、一本鎖抗体、ヒト化抗体等の人工的に合成された抗体であってもよい。これらの抗体は、常法により製造することができる。
本発明に係る医薬用組成物の有効成分としては、ＲａｓＧＲＰ２タンパク質を分解する物質であってもよい。ＲａｓＧＲＰ２タンパク質自体が分解されることにより、その機能は阻害される。ＲａｓＧＲＰ２タンパク質を分解する物質としては、ＲａｓＧＲＰ２タンパク質を直接分解する分解酵素であってもよく、タンパク質分解酵素の基質になるようにポリユビキチン等の各種標識を行う物質であってもよい。
本発明に係る医薬用組成物は、ＲａｓＧＲＰ２阻害物質の作用を損なわない限り、その他の有効成分を含有していてもよい。その他の有効成分としては、例えば、ＴＮＦ－α阻害薬、ＩＬ－６阻害薬などの従来からＲＡ治療に使用されてきた生物学的製剤や免疫抑制剤のように、ＲＡに対する治療効果が期待される物質が挙げられる。
本発明に係る医薬用組成物は、ＲａｓＧＲＰ２阻害物質と共にＲａｓＧＲＰ４遺伝子の機能を抑制又は阻害する物質（以下、まとめて「ＲａｓＧＲＰ４阻害物質」という。）を有効成分とすることが好ましい。ＲａｓＧＲＰ４遺伝子の発現を抑制することによってＦＬＳの細胞増殖を抑制することができる（非特許文献１）ことから、ＲａｓＧＲＰ２阻害物質と、ＲａｓＧＲＰ４遺伝子の機能を抑制又は阻害する物質を併用使用することにより、ＲＡに対する相加的・相乗的な治療効果が期待できる。ＲａｓＧＲＰ４阻害物質としては、ＲａｓＧＲＰ４遺伝子のｃＤＮＡの部分領域（ＲＮＡｉ（ＲＮＡ干渉）標的領域）のセンス鎖とアンチセンス鎖からなる二本鎖構造を有するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ又はｍｉＲＮＡや、抗ＲａｓＧＲＰ４抗体、ＲａｓＧＲＰ４に特異的に結合する低分子化合物等が挙げられる。
本発明に係る医薬用組成物の投与経路は特に限定されるものではなく、標的とする細胞及びそれを含む組織に応じて適宜決定される。例えば、本発明に係る医薬用組成物の投与経路としては、経口投与、関節への直接投与、経皮投与、経静脈投与、腹腔内投与、注腸投与等が挙げられる。
本発明に係る医薬用組成物は、通常の方法によって、散剤、顆粒剤、カプセル剤、錠剤、チュアブル剤、徐放剤などの経口用固形剤、溶液剤、シロップ剤などの経口用液剤、注射剤、注腸剤、スプレー剤、貼付剤、軟膏剤などに製剤化することができる。製剤化は、製剤上の必要に応じて、賦形剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、流動化剤、溶剤、溶解補助剤、緩衝剤、懸濁化剤、乳化剤、等張化剤、安定化剤、防腐剤、抗酸化剤、矯味矯臭剤、着色剤等を配合して常法により行うことができる。
本発明に係る医薬用組成物をヒトやヒト以外の動物に投与し、ＲａｓＧＲＰ２遺伝子の機能を抑制又は阻害することにより、ＦＬＳの遊走及びＩＬ－６の産生が抑制され、これらの動物の関節の滑膜組織の浸潤や炎症を抑制することができる。当該動物としては、特に限定されるものではなく、ヒトであってもよく、ヒト以外の動物であってもよい。非ヒト動物としては、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、サル、イヌ、ネコ、ウサギ、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等の哺乳動物や、ニワトリ、ウズラ、カモ等の鳥類等が挙げられる。
ＲＡのＦＬＳは、健常者又はＯＡのＦＬＳに比べてＲａｓＧＲＰ２遺伝子の発現量が多い。このため、ＲａｓＧＲＰ２遺伝子の発現量は、ＲＡを検出するための診断マーカーとして有用である。例えば、被検動物から採取されたＦＬＳのＲａｓＧＲＰ２遺伝子の発現量が、予め設定された所定の閾値以上である場合には、当該被検動物がＲＡを発症している可能性が高いと評価することができる。逆に、ＦＬＳのＲａｓＧＲＰ２遺伝子の発現量が予め設定された所定の閾値よりも少ない場合には、当該被検動物はＲＡを発症している可能性が低い、と評価することができる。
当該閾値は、ＲａｓＧＲＰ２遺伝子の発現量の測定方法の種類等を考慮して、また必要な予備検査等を行うことにより、適宜設定することができる。例えば、その他の検査方法の結果から、ＲＡを発症していないことが確認されている被検動物から採取されたＦＬＳ（非ＲＡ群）のＲａｓＧＲＰ２遺伝子の発現量の測定値と、ＲＡを発症していることが確認されている被検動物から採取されたＦＬＳ（ＲＡ群）のＲａｓＧＲＰ２遺伝子の発現量の測定値とを比較することにより、両群を識別するための閾値を適宜設定することができる。
ＦＬＳのＲａｓＧＲＰ２遺伝子の発現量は、ｍＲＮＡレベルで測定してもよく、タンパク質レベルで測定してもよい。ＲａｓＧＲＰ２遺伝子の発現量の測定方法としては、細胞中の標的タンパク質量又は標的のｍＲＮＡ量を定量的又は半定量的に測定可能な方法であれば特に限定されるものではなく、検体中のｍＲＮＡやタンパク質の検出に用いられる公知の方法の中から、適宜選択して用いることができる。各方法は常法により行うことができる。
ＲａｓＧＲＰ２遺伝子のｍＲＮＡ量は、ＲａｓＧＲＰ２遺伝子のｍＲＮＡとハイブリダイズし得るプローブを用いたハイブリダイゼーション法により検出してもよく、ＲａｓＧＲＰ２遺伝子のｍＲＮＡとハイブリダイズし得るプライマーとポリメラーゼとを用いた核酸増幅反応を利用した方法により検出してもよい。その他、市販されている検出用キット等を利用することもできる。例えば、ＦＬＳから抽出した総ＲＮＡを鋳型として逆転写反応を行うことによりｃＤＮＡを合成した後、得られたｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）等を行い、得られた増幅産物量を測定することによって、ＲａｓＧＲＰ２遺伝子のｍＲＮＡ量を定量できる。増幅産物量は、ゲルやキャピラリー電気泳動等で特異的に分離した後、それを検出することにより定量的に測定することができる。また、ＰＣＲに代えてリアルタイムＰＣＲ等の半定量的ＰＣＲを行うことにより、ＲａｓＧＲＰ２遺伝子のｍＲＮＡの検出と同時にその定量を簡便に行うことができる。
ＲａｓＧＲＰ２タンパク質量は、抗ＲａｓＧＲＰ２抗体を用いて測定することができる。例えば、抗ＲａｓＧＲＰ２抗体を一次抗体とした免疫染色を行い、染色の有無や染色強度に基づいて、ＦＬＳ中におけるＲａｓＧＲＰ２の発現の有無や発現強度を調べる。当該免疫染色は、酵素標識した抗体を用いる酵素抗体染色法であってもよく、蛍光標識した抗体を用いる蛍光抗体染色法であってもよい。また、ＦＬＳのＲａｓＧＲＰ２タンパク質量は、ＦＬＳから調製された細胞抽出液中のタンパク質を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ等により分離させた後、ウェスタンブロット法等により定量的に測定することができる。
ＲＡのＦＬＳは、健常者又はＯＡのＦＬＳに比べてＲａｓＧＲＰ４遺伝子の発現量が多い（非特許文献１参照。）。このため、ＲａｓＧＲＰ４遺伝子の発現量は、ＲＡを検出するための診断マーカーとして有用である。例えば、被検動物から採取されたＦＬＳのＲａｓＧＲＰ４遺伝子の発現量が、予め設定された所定の閾値以上である場合には、当該被検動物がＲＡを発症している可能性が高いと評価することができる。逆に、ＦＬＳのＲａｓＧＲＰ４遺伝子の発現量が予め設定された所定の閾値よりも少ない場合には、当該被検動物はＲＡを発症している可能性が低い、と評価することができる。ＦＬＳのＲａｓＧＲＰ４遺伝子の発現量は、前述のＲａｓＧＲＰ２遺伝子の発現量の測定と同様にして測定することができる。ＲＡ発症の有無を判断するためのＲａｓＧＲＰ４遺伝子の発現量の閾値は、前述のＲａｓＧＲＰ２遺伝子の発現量の閾値と同様して設定することができる。
ＲａｓＧＲＰ２遺伝子の発現量とＲａｓＧＲＰ４遺伝子の発現量とを組み合わせてＲＡを検出するための診断マーカーとして用いることにより、より精度よくＲＡを検出することができる。例えば、被検動物から採取されたＦＬＳのＲａｓＧＲＰ２遺伝子の発現量が予め設定された所定の閾値以上であり、かつＲａｓＧＲＰ４遺伝子の発現量が予め設定された所定の閾値以上である場合には、当該被検動物がＲＡを発症している可能性が高いと評価することができる。逆に、ＦＬＳのＲａｓＧＲＰ２遺伝子の発現量が予め設定された所定の閾値よりも少ない場合やＲａｓＧＲＰ４遺伝子の発現量が予め設定された所定の閾値よりも少ない場合には、当該被検動物はＲＡを発症している可能性が低い、と評価することができる。
ＲａｓＧＲＰ２遺伝子の発現量やＲａｓＧＲＰ４遺伝子の発現量を、ＲＡを検出するための診断マーカーとして用いる対象の被検動物としては、特に限定されるものではなく、ヒトであってもよく、ヒト以外の動物であってもよい。非ヒト動物としては、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、サル、イヌ、ネコ、ウサギ、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等の哺乳動物や、ニワトリ、ウズラ、カモ等の鳥類等が挙げられる。
次に実施例等を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
なお、以降の動物実験は、北海道大学の動物実験倫理委員会の承認のもと、北海道大学動物実験に関する規定に従い行った。
なお、以降の動物実験は、北海道大学の動物実験倫理委員会の承認のもと、北海道大学動物実験に関する規定に従い行った。
［参考例１］
リウマチ患者の滑膜組織におけるＲａｓＧＲＰの発現解析を行った。
リウマチ患者の滑膜組織におけるＲａｓＧＲＰの発現解析を行った。
＜リウマチ患者＞
２０１２年４月から２０１７年４月までに北海道大学病院整形外科で人工膝関節置換術を施行されたリウマチ患者のうち、ＲＡ患者８名（ＲＡ１～８）及びＯＡ患者６名（ＯＡ１～６）から、文書による説明と同意取得を行った後、滑膜組織を採取した。本研究はヘルシンキ宣言と臨床試験の基本理念に従って施行し、北海道大学大学院医学研究科倫理委員会の承認（承認番号：００８－０１０３）を得て行った。
２０１２年４月から２０１７年４月までに北海道大学病院整形外科で人工膝関節置換術を施行されたリウマチ患者のうち、ＲＡ患者８名（ＲＡ１～８）及びＯＡ患者６名（ＯＡ１～６）から、文書による説明と同意取得を行った後、滑膜組織を採取した。本研究はヘルシンキ宣言と臨床試験の基本理念に従って施行し、北海道大学大学院医学研究科倫理委員会の承認（承認番号：００８－０１０３）を得て行った。
＜ＦＬＳの採取＞
各リウマチ患者から採取された滑膜組織は、結合組織や脂肪を除去した後、細かく切り刻み、５ｍｇ／ｍＬのType I collagenase（Sigma社製）含有Hanks’ balanced salt solutionで３７℃、２時間インキュベートを行った。インキュベート後の懸濁物を、メッシュを通した後、遠心分離して細胞成分を回収した。回収された細胞成分を、１０％非働化ＦＢＳ（ウシ胎児血清）含有のIscove’s modified Dulbecco’s medium（Sigma社製）で培養した。この方法で分離・培養される細胞は、９７％以上の純度でＦＬＳである。なお、ＦＬＳは、ＨＳＰ－４７染色によって確認できる。
各リウマチ患者から採取された滑膜組織は、結合組織や脂肪を除去した後、細かく切り刻み、５ｍｇ／ｍＬのType I collagenase（Sigma社製）含有Hanks’ balanced salt solutionで３７℃、２時間インキュベートを行った。インキュベート後の懸濁物を、メッシュを通した後、遠心分離して細胞成分を回収した。回収された細胞成分を、１０％非働化ＦＢＳ（ウシ胎児血清）含有のIscove’s modified Dulbecco’s medium（Sigma社製）で培養した。この方法で分離・培養される細胞は、９７％以上の純度でＦＬＳである。なお、ＦＬＳは、ＨＳＰ－４７染色によって確認できる。
＜ＲａｓＧＲＰのｍＲＮＡに基づく発現解析＞
４～８継代培養したＦＬＳを回収し、TRIzol RNA reagentを用いてｍＲＮＡを抽出した。抽出したｍＲＮＡは、SuperScript VILO を用いてｃＤＮＡとし、Taq-Man Gene Expression Assay（Applied Biosystems社製）によるReal-time-PCR法でヒトＲａｓＧＲＰ１ ｍＲＮＡ、ヒトＲａｓＧＲＰ２ ｍＲＮＡ、ヒトＲａｓＧＲＰ３ ｍＲＮＡ、ヒトＲａｓＧＲＰ４ ｍＲＮＡ及びヒトＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡの発現を定量した。ΔΔＣＴ値法によって各ＦＬＳにおけるＲａｓＧＲＰ１～４のｍＲＮＡ発現量の比較を行った。ＲａｓＧＲＰ１～４のｍＲＮＡ発現量は、ＯＡ１患者由来のＦＬＳにおけるＲａｓＧＰＲ１のΔΔＣＴ値を１とした相対量（ＲＱ）として求めた。
４～８継代培養したＦＬＳを回収し、TRIzol RNA reagentを用いてｍＲＮＡを抽出した。抽出したｍＲＮＡは、SuperScript VILO を用いてｃＤＮＡとし、Taq-Man Gene Expression Assay（Applied Biosystems社製）によるReal-time-PCR法でヒトＲａｓＧＲＰ１ ｍＲＮＡ、ヒトＲａｓＧＲＰ２ ｍＲＮＡ、ヒトＲａｓＧＲＰ３ ｍＲＮＡ、ヒトＲａｓＧＲＰ４ ｍＲＮＡ及びヒトＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡの発現を定量した。ΔΔＣＴ値法によって各ＦＬＳにおけるＲａｓＧＲＰ１～４のｍＲＮＡ発現量の比較を行った。ＲａｓＧＲＰ１～４のｍＲＮＡ発現量は、ＯＡ１患者由来のＦＬＳにおけるＲａｓＧＰＲ１のΔΔＣＴ値を１とした相対量（ＲＱ）として求めた。
ＦＬＳにおけるＲａｓＧＲＰ１～４のｍＲＮＡ発現量（相対値）の測定結果を図１に示す。図１中、「Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ」の欄中、「＋」が生物学的製剤治療を受けていることを、「－」が生物学的製剤治療を受けていないことを、それぞれ示す。ＲＡ患者群のＦＬＳにおいて、ＯＡ患者群と比較してＲａｓＧＲＰ１～４は全てｍＲＮＡの発現が亢進している傾向が観察された。特に、ＲＡ患者の一部（ＲＡ１～ＲＡ３）では、ＲａｓＧＲＰ４と共にＲａｓＧＲＰ２の顕著な発現亢進が認められた。
＜ＲａｓＧＲＰの免疫組織化学染色に基づく発現解析＞
各リウマチ患者から採取された滑膜組織の一部は、４％パラホルムアルデヒドで２４時間固定し、パラフィン包埋した後、６μｍ厚さの組織切片を作成した。この組織切片は、キシレンで脱パラフィンを行い、エタノールで洗浄し、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）に置換した。次いで、抗原賦活化液 High pH（DAKO社製）を加え、９５℃で２０分間静置した後、水洗した。水洗後の組織切片は、内因性ペルオキシダーゼ活性を不活化するため、さらに、０．３％過酸化水素を混ぜたＰＢＳに常温で３０分間浸した。
各リウマチ患者から採取された滑膜組織の一部は、４％パラホルムアルデヒドで２４時間固定し、パラフィン包埋した後、６μｍ厚さの組織切片を作成した。この組織切片は、キシレンで脱パラフィンを行い、エタノールで洗浄し、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）に置換した。次いで、抗原賦活化液 High pH（DAKO社製）を加え、９５℃で２０分間静置した後、水洗した。水洗後の組織切片は、内因性ペルオキシダーゼ活性を不活化するため、さらに、０．３％過酸化水素を混ぜたＰＢＳに常温で３０分間浸した。
続いて、各組織切片に、抗Ｃａｄｈｅｒｉｎ－１１抗体（R&D Systems社製）、抗ＲａｓＧＲＰ２抗体（Abcam社製）を加えて、一晩４℃でインキュベートし、それぞれ免疫組織化学染色を行った。連続切片を用いて免疫組織化学染色することで、これらのタンパク質の共発現を検討した。
図２に、ＲＡ１患者由来の滑膜組織切片とＯＡ４患者由来の滑膜組織切片の染色像を示す。免疫組織化学染色において、ＲａｓＧＲＰ２はＲＡ患者の血管内皮細胞とＣａｄｈｅｒｉｎ－１１で同定されるＦＬＳに発現が確認された。一方ＯＡ患者においては、ＲａｓＧＲＰ２は、血管内皮細胞に発現は認められるものの、ＦＬＳにおける発現は確認されなかった。
＜ＣＩＡマウスの足関節組織の免疫組織化学染色＞
非特許文献１に記載されている方法によりＣＩＡマウスを作成し、ＲａｓＧＲＰ2の発現解析を免疫組織化学染色にて行った。具体的には、各リウマチ患者から採取された滑膜組織と同様にして、ＣＩＡマウスの足関節組織から６μｍ厚さの組織切片を作成し、抗ＲａｓＧＲＰ２抗体による免疫組織化学染色を行った。対照として、健常マウスの足関節組織の免疫組織化学染色も同様にして行った。
非特許文献１に記載されている方法によりＣＩＡマウスを作成し、ＲａｓＧＲＰ2の発現解析を免疫組織化学染色にて行った。具体的には、各リウマチ患者から採取された滑膜組織と同様にして、ＣＩＡマウスの足関節組織から６μｍ厚さの組織切片を作成し、抗ＲａｓＧＲＰ２抗体による免疫組織化学染色を行った。対照として、健常マウスの足関節組織の免疫組織化学染色も同様にして行った。
図３に、ＣＩＡマウスと対照マウスの足関節組織の抗ＲａｓＧＲＰ２抗体による免疫組織化学染色像を示す。ＣＩＡマウスの滑膜組織においても、ＲａｓＧＲＰ２の発現が確認された。また、マウスＲａｓＧＲＰ２が、増殖滑膜組織の表層部に高発現しており、また骨に増殖滑膜が侵入している箇所において特に高発現していることも確認された。
［参考例２］
ＦＬＳをサイトカイン刺激した場合のＲａｓＧＲＰ２の発現変化を調べた。サイトカインは、ＴＮＦ－α、ＩＬ－６、ＩＬ－１β、ＩＦＮ-γ(interferon gamma)、ＩＬ－１７Ａ、ＩＬ－２２、ＰＤＧＦ（platelet-derived growth factor）、ＶＥＧＦ（vascular endothelial growth factor）、及びＴＧＦ－β（transforming growth factor beta）を用いた。
ＦＬＳをサイトカイン刺激した場合のＲａｓＧＲＰ２の発現変化を調べた。サイトカインは、ＴＮＦ－α、ＩＬ－６、ＩＬ－１β、ＩＦＮ-γ(interferon gamma)、ＩＬ－１７Ａ、ＩＬ－２２、ＰＤＧＦ（platelet-derived growth factor）、ＶＥＧＦ（vascular endothelial growth factor）、及びＴＧＦ－β（transforming growth factor beta）を用いた。
＜サイトカイン刺激＞
４～８継代のＦＬＳを１２ウェルプレートに散布し、１０％非働化ＦＢＳ含有Iscove’s modified Dulbecco’s mediumで培養を行った。１～１０ｎｇ／ｍＬの各サイトカインを培養液に添加し、２４時間後に細胞を回収した。
４～８継代のＦＬＳを１２ウェルプレートに散布し、１０％非働化ＦＢＳ含有Iscove’s modified Dulbecco’s mediumで培養を行った。１～１０ｎｇ／ｍＬの各サイトカインを培養液に添加し、２４時間後に細胞を回収した。
＜ＲａｓＧＲＰの発現解析＞
回収した細胞の一部から、参考例１と同様にしてｍＲＮＡを抽出し、Real-time-PCR法でヒトＲａｓＧＲＰ２ ｍＲＮＡとヒトＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡの発現を定量した。ΔΔＣＴ値法によってサイトカイン刺激におけるＲａｓＧＲＰ２のｍＲＮＡ発現量の比較を行った。ΔΔＣＴ値は、サイトカイン無添加の対照細胞におけるＲａｓＧＰＲ１の発現量を１とした。
回収した細胞の一部から、参考例１と同様にしてｍＲＮＡを抽出し、Real-time-PCR法でヒトＲａｓＧＲＰ２ ｍＲＮＡとヒトＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡの発現を定量した。ΔΔＣＴ値法によってサイトカイン刺激におけるＲａｓＧＲＰ２のｍＲＮＡ発現量の比較を行った。ΔΔＣＴ値は、サイトカイン無添加の対照細胞におけるＲａｓＧＰＲ１の発現量を１とした。
また、回収した細胞の残りはprotease inhibitor（Sigma社製）含有のcell lysis buffer（Wako社製）で処理を行い、１５分間氷上に放置した後、１０分間遠心分離し、上清を回収した。濃度調整した上清にドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を加えて９５℃で１０分間加温した。次に、９％アクリルアミドゲルを作製し、サンプル中のタンパク質を電気泳動させた。その後、ＰＶＤＦ（polyvinylidene difluoride）膜にタンパク質を転写し、スキムミルクでブロッキングを行った。Solution 1（Toyobo社製）で１０００倍希釈した抗ＲａｓＧＲＰ２抗体を室温で一晩反応させ、洗浄後、二次抗体を反応させた。検出試薬には、Amerisham（登録商標）ＥＣＬ（登録商標） Western Blotting Detection Reagents（GE Healthcare社製）を使用した。
図４に、各サイトカインで刺激したＦＬＳのＲａｓＧＲＰ２のｍＲＮＡ量及びタンパク質発現量の測定結果を示す。データは平均±標準誤差で示した（＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１、ｔ－ｔｅｓｔ）。ＶＥＧＦ及びＴＧＦ－βの刺激によって、ＲａｓＧＲＰ２ ｍＲＮＡの発現量が増加した。また、統計学的有意差は確認できなかったものの、ＩＬ－６、ＩＬ－１β、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１７Ａ、ＩＬ－２２、及びＰＤＧＦの刺激によってもＲａｓＧＲＰ２ ｍＲＮＡの発現量が増加する傾向が認められた。イムノブロッティングでは、ＩＬ－２２、ＰＤＧＦ、ＶＥＧＦ、ＴＧＦ－βの刺激によるＲａｓＧＲＰ２のタンパク質発現量の増加が確認された。
［参考例３］
ＦＬＳにＲａｓＧＲＰ２を強制発現し、その影響を調べた。
ＦＬＳにＲａｓＧＲＰ２を強制発現し、その影響を調べた。
＜ＲａｓＧＲＰ２発現ベクターの作成＞
ＲａｓＧＲＰ２のリファレンス配列（アクセッション番号：ＮＭ＿００１０９８６７０．１、Homo sapiens RAS guanyl releasing protein 2, transcript variant 3）をＰｕｂＭｅｄから入手し、Primer-BLASTを用いて全オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むように、プライマーを表１のように設計した。
ＲａｓＧＲＰ２のリファレンス配列（アクセッション番号：ＮＭ＿００１０９８６７０．１、Homo sapiens RAS guanyl releasing protein 2, transcript variant 3）をＰｕｂＭｅｄから入手し、Primer-BLASTを用いて全オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むように、プライマーを表１のように設計した。
Ｊｕｒｋａｔ細胞のｃＤＮＡを鋳型とし、KOD plus Neo（Toyobo社製）を用いたＰＣＲ反応で、ＲａｓＧＲＰ２のＯＲＦ配列の増幅を行った。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動し、目的サイズのＤＮＡ断片が増幅されていることを確認した。目的のＤＮＡは、Wizard（登録商標）SV Gel and PCR Clean-Up System（Promega社製）を用いてゲル片から抽出した。得られたＤＮＡは、Ｔａｑ酵素（Toyobo社製）を用いてＴ付加反応を行った後、pcDNA3.1/V5-His-TOPO expression vector（Thermo Fisher Scientific社製）にライゲーションした。
その後、大腸菌コンピテントセルに形質転換し、培養を行った。得られたコロニーに対し、表２に記載のプライマーを用いてコロニーＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動し、目的のバンドが得られたコロニーを液体培地でさらに培養し、Wizard（登録商標）Plus SV Minipreps DNA Purification System（Promega社製）を用いてプラスミドベクターの単離、精製を行った。
＜ＲａｓＧＲＰ２の強制発現＞
まず、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）発現ベクターを用いたトランスフェクションし、蛍光顕微鏡観察で最大のトランスフェクション効率となる条件を検討した。
次いで、このトランスフェクション効率が最大となる条件で、ＲａｓＧＲＰ２発現ベクターをトランスフェクションし、参考例２と同様にしてReal-time-PCR法とイムノブロッティングを行い、ＲａｓＧＲＰ２のｍＲＮＡとタンパク質発現量が増加することを確認した。
まず、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）発現ベクターを用いたトランスフェクションし、蛍光顕微鏡観察で最大のトランスフェクション効率となる条件を検討した。
次いで、このトランスフェクション効率が最大となる条件で、ＲａｓＧＲＰ２発現ベクターをトランスフェクションし、参考例２と同様にしてReal-time-PCR法とイムノブロッティングを行い、ＲａｓＧＲＰ２のｍＲＮＡとタンパク質発現量が増加することを確認した。
＜シグナル伝達関連因子のイムノブロッティング＞
シグナル伝達関連因子のイムノブロッティングを行い、ＲａｓＧＲＰ２強制発現によるシグナル伝達経路の変化を調べた。
ＲａｓＧＲＰ２発現ベクターをＦＬＳにトランスフェクションし、７２時間後に細胞を回収した。対照として空ベクターも同様の方法でＦＬＳにトランスフェクションした。
参考例２と同様にして各ＦＬＳの細胞ライセートを作成し、そのうち一部は、ＧＳＴ（Glutathione S-transferase）融合タンパク質、グルタチオンアガロースビーズ（Cell signaling technology社製）と共にインキュベートし、ＳＤＳ溶液でＧＴＰ結合Ｒａｐ－１を沈降させた（プルダウンアッセイ）。得られたライセート及び溶出液は、ポリアクリルアミド電気泳動の後、抗ＲａｓＧＲＰ２抗体、抗Ｅｒｋ１／２抗体、抗Ｐ－Ｅｒｋ抗体、抗ｐ３８ＭＡＰＫ抗体、抗Ｐ－ｐ３８ＭＡＰＫ抗体、抗ＪＮＫ抗体、抗Ｐ－ＪＮＫ抗体、抗ｍ－ＴＯＲ抗体、抗Ｒａｐ－１抗体、及び抗β－ａｃｔｉｎ抗体を用いてイムノブロッティングを行った。
シグナル伝達関連因子のイムノブロッティングを行い、ＲａｓＧＲＰ２強制発現によるシグナル伝達経路の変化を調べた。
ＲａｓＧＲＰ２発現ベクターをＦＬＳにトランスフェクションし、７２時間後に細胞を回収した。対照として空ベクターも同様の方法でＦＬＳにトランスフェクションした。
参考例２と同様にして各ＦＬＳの細胞ライセートを作成し、そのうち一部は、ＧＳＴ（Glutathione S-transferase）融合タンパク質、グルタチオンアガロースビーズ（Cell signaling technology社製）と共にインキュベートし、ＳＤＳ溶液でＧＴＰ結合Ｒａｐ－１を沈降させた（プルダウンアッセイ）。得られたライセート及び溶出液は、ポリアクリルアミド電気泳動の後、抗ＲａｓＧＲＰ２抗体、抗Ｅｒｋ１／２抗体、抗Ｐ－Ｅｒｋ抗体、抗ｐ３８ＭＡＰＫ抗体、抗Ｐ－ｐ３８ＭＡＰＫ抗体、抗ＪＮＫ抗体、抗Ｐ－ＪＮＫ抗体、抗ｍ－ＴＯＲ抗体、抗Ｒａｐ－１抗体、及び抗β－ａｃｔｉｎ抗体を用いてイムノブロッティングを行った。
この結果、Ｅｒｋ１／２、Ｐ－Ｅｒｋ、ｐ３８ＭＡＰＫ、Ｐ－ｐ３８ＭＡＰＫ、ＪＮＫ、Ｐ－ＪＮＫ、及びｍ－ＴＯＲの発現量は、ＲａｓＧＲＰ２発現ベクターを導入したＲａｓＧＲＰ２強制発現細胞と空ベクターを導入した対照細胞で差がなかった。すなわち、ＲａｓＧＲＰ２強制発現により、Ｅｒｋ経路、ｐ３８ＭＡＰＫ経路、ＪＮＫ経路、ｍ－ＴＯＲ経路の明らかな変化は認められなかった。一方で、ＲａｓＧＲＰ２強制発現細胞では対照細胞と比べて、Ｒａｐ－１の総タンパク質量には変化はみられなかったものの、ＧＴＰ結合型のＲａｐ－１タンパク質は明らかに増加していた。抗ＲａｓＧＲＰ２抗体、抗Ｒａｐ－１抗体、及び抗β－ａｃｔｉｎ抗体を用いたイムノブロッティングの結果を図５に示す。図中、「Ｃｏｎｔｒｏｌ」は対照細胞の結果を、「ＲａｓＧＲＰ２＋」はＲａｓＧＲＰ２強制発現細胞の結果を、それぞれ示す。
＜ＢｒｄＵアッセイ＞
ＲａｓＧＲＰ２強制発現と細胞増殖能との関係をＢｒｄＵアッセイにより調べた。
ＲａｓＧＲＰ２発現ベクター又は空ベクターをそれぞれＦＬＳにトランスフェクションし、４８時間後に細胞培養液中にＢｒｄＵ（ブロモデオキシウリジン）を添加した。チミジンアナログであるＢｒｄＵは、細胞周期のＳ期において新たに合成されたＤＮＡに取り込まれ、細胞増殖を反映する。添加２４時間後に細胞を固定し、ペルオキシダーゼ標識抗ＢｒｄＵ抗体（Roche社製）を反応させた。その後、化学発光基質を加え、発光強度をＥＬＩＳＡリーダーで測定した。
ＲａｓＧＲＰ２強制発現と細胞増殖能との関係をＢｒｄＵアッセイにより調べた。
ＲａｓＧＲＰ２発現ベクター又は空ベクターをそれぞれＦＬＳにトランスフェクションし、４８時間後に細胞培養液中にＢｒｄＵ（ブロモデオキシウリジン）を添加した。チミジンアナログであるＢｒｄＵは、細胞周期のＳ期において新たに合成されたＤＮＡに取り込まれ、細胞増殖を反映する。添加２４時間後に細胞を固定し、ペルオキシダーゼ標識抗ＢｒｄＵ抗体（Roche社製）を反応させた。その後、化学発光基質を加え、発光強度をＥＬＩＳＡリーダーで測定した。
発光強度の測定結果を図６に示す。データは平均±標準誤差で示した。発光強度は、対照細胞（図中、「Ｃｏｎｔｒｏｌ」）とＲａｓＧＲＰ２強制発現細胞（図中、「ＲａｓＧＲＰ２＋」）とで有意な差はなく、ＲａｓＧＲＰ２の強制発現は、ＢｒｄＵアッセイにおける細胞増殖能評価に明らかな影響を及ぼさなかった。
＜創傷治癒アッセイ＞
創傷治癒アッセイを行い、ＲａｓＧＲＰ２強制発現と細胞遊走能との関係を調べた。
ＲａｓＧＲＰ２発現ベクター又は空ベクターをそれぞれＦＬＳにトランスフェクションし、４８時間後にコンフルエントとなるように１２ウェルプレートで培養した。コンフルエントとなった１２ウェルプレートを、１０００μＬピペットチップの先端でひっかき、細胞の空白地帯（創傷）を作成した。その後、細胞が遊走し空白が埋まっていく（創傷が治癒していく）様子を経時的に光学顕微鏡で観察し、空白（創傷）面積の大きさを画像解析ソフトウェアＩｍａｇｅ Ｊで定量した。
創傷治癒アッセイを行い、ＲａｓＧＲＰ２強制発現と細胞遊走能との関係を調べた。
ＲａｓＧＲＰ２発現ベクター又は空ベクターをそれぞれＦＬＳにトランスフェクションし、４８時間後にコンフルエントとなるように１２ウェルプレートで培養した。コンフルエントとなった１２ウェルプレートを、１０００μＬピペットチップの先端でひっかき、細胞の空白地帯（創傷）を作成した。その後、細胞が遊走し空白が埋まっていく（創傷が治癒していく）様子を経時的に光学顕微鏡で観察し、空白（創傷）面積の大きさを画像解析ソフトウェアＩｍａｇｅ Ｊで定量した。
創傷形成直後（０時間後）、創傷形成から２４時間後、及び４８時間後の対照細胞（図中、「Ｃｏｎｔｒｏｌ」）とＲａｓＧＲＰ２強制発現細胞（図中、「ＲａｓＧＲＰ２＋」）の透過光画像を図７に示す。また、創傷形成直後（０時間後）の創傷面積を１００％とした、創傷形成から２４時間後及び４８時間後の相対創傷面積（％）の測定結果を図８に示す。２４時間後と４８時間後のいずれにおいても、ＲａｓＧＲＰ２強制発現細胞（図中、「ＲａｓＧＲＰ２＋」）では対照細胞（図中、「Ｃｏｎｔｒｏｌ」）よりも創傷面積が小さかった。つまり、ＲａｓＧＲＰ２の強制発現によって有意な創傷治癒 (遊走) の促進が確認された。
＜ＩＬ－６産生量の測定＞
ＲａｓＧＲＰ２強制発現とＩＬ－６産生量との関係を調べた。
ＲａｓＧＲＰ２発現ベクター又は空ベクターをそれぞれＦＬＳにトランスフェクションし、４８時間後に培地交換を行い、その２４時間後に細胞培養上清を回収した。その培養上清中のＩＬ－６濃度をＥＬＩＳＡキット（R&D System社製）で定量した。
ＲａｓＧＲＰ２強制発現とＩＬ－６産生量との関係を調べた。
ＲａｓＧＲＰ２発現ベクター又は空ベクターをそれぞれＦＬＳにトランスフェクションし、４８時間後に培地交換を行い、その２４時間後に細胞培養上清を回収した。その培養上清中のＩＬ－６濃度をＥＬＩＳＡキット（R&D System社製）で定量した。
定量結果を図９に示す。ＲａｓＧＲＰ２強制細胞（図中、「ＲａｓＧＲＰ２＋」）では、対照細胞（図中、「Ｃｏｎｔｒｏｌ」）に比べて培養上清中のＩＬ－６濃度は有意に増加していた。この結果から、ＲａｓＧＲＰ２の強制発現によって、ＦＬＳのＩＬ－６分泌が促進されることがわかった。
これらの知見から、ＲａｓＧＲＰ２はＲＡの病態と深く関わっていることが明らかである。より詳細には、ＲＡのＦＬＳが腫瘍様に増殖し、骨・軟骨に遊走、浸潤してパンヌスを形成していく過程で、ＲａｓＧＲＰ２は、遊走とＩＬ－６産生に関与する。
［実施例１］
ＲＡモデルラットにおけるＲａｓＧＲＰ２ノックダウンの影響を調べた。ＲＡモデルラットとして、ＣＩＡラットを用いた。また、ＲａｓＧＲＰ２のノックダウンは、ＲａｓＧＲＰ２遺伝子の第６エキソン中の領域をターゲットとするｓｉＲＮＡ（ＲａｓＧＲＰ２－１）（Ｓ１６７８６７：Applied Biosystems社製）と、第７エキソン中の領域をターゲットとするｓｉＲＮＡ（ＲａｓＧＲＰ２－２）（Ｓ１６７８６５：Applied Biosystems社製）を用いた。また、対照のｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ（Ｃｏｎｔｒｏｌ）（Applied Biosystems社製）を用いた。
ＲＡモデルラットにおけるＲａｓＧＲＰ２ノックダウンの影響を調べた。ＲＡモデルラットとして、ＣＩＡラットを用いた。また、ＲａｓＧＲＰ２のノックダウンは、ＲａｓＧＲＰ２遺伝子の第６エキソン中の領域をターゲットとするｓｉＲＮＡ（ＲａｓＧＲＰ２－１）（Ｓ１６７８６７：Applied Biosystems社製）と、第７エキソン中の領域をターゲットとするｓｉＲＮＡ（ＲａｓＧＲＰ２－２）（Ｓ１６７８６５：Applied Biosystems社製）を用いた。また、対照のｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ（Ｃｏｎｔｒｏｌ）（Applied Biosystems社製）を用いた。
＜ＣＩＡラットの作製＞
７週齢のＬＥＷラット（雌）に対し、２００μＬのincomplete Freund’s adjuvant（Chondrex社製）に溶解した２００μｇのウシType II collagen（Chondrex社製）を尾に皮下投与して免疫を行った（Day 0）。
コラーゲン投与から７日目（Day 7）には、１００μＬのincomplete Freund’s adjuvant（Chondrex社製）に溶解した１００μｇのウシType II collagen（Chondrex社製）を尾に再皮下投与して追加免疫を行った。
コラーゲン投与から７日目以降は、誘導された関節炎について、関節炎スコアと足関節の直径を、週１回測定した。
７週齢のＬＥＷラット（雌）に対し、２００μＬのincomplete Freund’s adjuvant（Chondrex社製）に溶解した２００μｇのウシType II collagen（Chondrex社製）を尾に皮下投与して免疫を行った（Day 0）。
コラーゲン投与から７日目（Day 7）には、１００μＬのincomplete Freund’s adjuvant（Chondrex社製）に溶解した１００μｇのウシType II collagen（Chondrex社製）を尾に再皮下投与して追加免疫を行った。
コラーゲン投与から７日目以降は、誘導された関節炎について、関節炎スコアと足関節の直径を、週１回測定した。
＜関節炎スコア＞
関節炎スコアは、０点：関節に発赤及び腫脹を認めない、１点：足根骨又は足関節に軽度の発赤と腫脹を認める、２点：足関節から足根骨にかけて軽度の発赤と腫脹を認める、３点：足関節から中足骨関節にかけて中等度の発赤と腫脹を認める、４点：足関節、足部、足趾にまで広がる重度の発赤と腫脹を認める、又は足趾の関節強直を認める、とした（非特許文献３参照。）。
関節炎スコアは、０点：関節に発赤及び腫脹を認めない、１点：足根骨又は足関節に軽度の発赤と腫脹を認める、２点：足関節から足根骨にかけて軽度の発赤と腫脹を認める、３点：足関節から中足骨関節にかけて中等度の発赤と腫脹を認める、４点：足関節、足部、足趾にまで広がる重度の発赤と腫脹を認める、又は足趾の関節強直を認める、とした（非特許文献３参照。）。
＜ＲＮＡ干渉によるＲａｓＧＲＰ２のノックダウン＞
コラーゲン投与から１４日目（Day 14）のＣＩＡラットの関節内に、１０μＭとなるようにｓｉＲＮＡ（ＲａｓＧＲＰ２－１）、ｓｉＲＮＡ（ＲａｓＧＲＰ２－２）、又はｓｉＲＮＡ（Ｃｏｎｔｒｏｌ）をatelocollagen（Koken社製）に混合したｓｉＲＮＡ溶液５０μＬを投与した。
コラーゲン投与から１４日目（Day 14）のＣＩＡラットの関節内に、１０μＭとなるようにｓｉＲＮＡ（ＲａｓＧＲＰ２－１）、ｓｉＲＮＡ（ＲａｓＧＲＰ２－２）、又はｓｉＲＮＡ（Ｃｏｎｔｒｏｌ）をatelocollagen（Koken社製）に混合したｓｉＲＮＡ溶液５０μＬを投与した。
図１０に、各ＣＩＡラットの関節炎スコアの測定結果を、図１１に各ＣＩＡラットの足関節の直径の測定結果を、それぞれ平均±標準誤差で示す（＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１、ｔ－ｔｅｓｔ）。この結果、ｓｉＲＮＡ（ＲａｓＧＲＰ２－１）を投与したＣＩＡラット（図中、「ｓｉＲＮＡ ＲａｓＧＲＰ２－１」）又はｓｉＲＮＡ（ＲａｓＧＲＰ２－２）を投与したＣＩＡラット（図中、「ｓｉＲＮＡ ＲａｓＧＲＰ２－２」）では、関節炎スコアと足関節の直径のいずれも、対照であるｓｉＲＮＡ（Ｃｏｎｔｒｏｌ）を投与したＣＩＡラット（図中、「Ｃｏｎｔｒｏｌ」）よりも明らかに小さく抑えられていた。
＜足関節組織のマイクロＣＴ撮像と骨びらんスコア＞
ＣＩＡラットは、コラーゲン投与から３５日目（Day 35）に、麻酔下の心臓全採血により安楽死処理した。各ＣＩＡラットの足関節組織を、４％パラホルムアルデヒドで２４時間固定した。次いで、足関節のマイクロＣＴを撮像した後、脱灰しパラフィン包埋を行った。
ＣＩＡラットは、コラーゲン投与から３５日目（Day 35）に、麻酔下の心臓全採血により安楽死処理した。各ＣＩＡラットの足関節組織を、４％パラホルムアルデヒドで２４時間固定した。次いで、足関節のマイクロＣＴを撮像した後、脱灰しパラフィン包埋を行った。
マイクロＣＴ所見による骨びらんスコアは、０点：正常、１点：軟部組織の腫脹のみ、２点：軟部組織の腫脹と軽度の骨びらん、３点：重度の骨びらん、とした（非特許文献４参照。）。
各ＣＩＡラットの足関節のマイクロＣＴ画像を図１２に、骨びらんスコアの結果を図１３（＊：ｐ＜０．０５、ｔ－ｔｅｓｔ）に、それぞれ示す。ｓｉＲＮＡ（Ｃｏｎｔｒｏｌ）を投与したＣＩＡラット（図中、「Ｃｏｎｔｒｏｌ」）では、重度の骨びらんが観察されたが（図１２左図中、矢印箇所）、ｓｉＲＮＡ（ＲａｓＧＲＰ２－１）又はｓｉＲＮＡ（ＲａｓＧＲＰ２－２）を投与したＣＩＡラット（図中、「ｓｉＲＮＡ ＲａｓＧＲＰ２」）では、軟部組織の腫脹は観察されたものの、重度の骨びらんは生じておらず（図１２右図中、矢印箇所）、骨びらんスコアも小さかった。
これらの結果から、ＲＮＡ干渉によってＲａｓＧＲＰ２遺伝子の発現を抑制することによって、ＲＡの病態が改善されること、すなわち、ＲａｓＧＲＰ２阻害物質がＲＡ治療のための医薬用組成物の有効成分として有用であることが確認された。
［実施例２］
ＲＡモデルラットにおけるＲａｓＧＲＰ２及びＲａｓＧＲＰ４ノックダウンの影響を調べた。ＲＡモデルラットとして、実施例１と同様にして作製したＣＩＡラットを用いた。ＲａｓＧＲＰ２のノックダウンは、ＲａｓＧＲＰ２遺伝子の第６エキソン中の領域をターゲットとするｓｉＲＮＡ（ＲａｓＧＲＰ２－１）（Ｓ１６７８６７：Applied Biosystems社製）を用い、ＲａｓＧＲＰ４のノックダウンは、ＲａｓＧＲＰ４遺伝子の第６エキソン中の領域をターゲットとするｓｉＲＮＡ（ＲａｓＧＲＰ４－１）（Ｓ１３９３２０：Applied Biosystems社製）を用いた。対照のｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ（Ｃｏｎｔｒｏｌ）（Applied Biosystems社製）を用いた。
ＲＡモデルラットにおけるＲａｓＧＲＰ２及びＲａｓＧＲＰ４ノックダウンの影響を調べた。ＲＡモデルラットとして、実施例１と同様にして作製したＣＩＡラットを用いた。ＲａｓＧＲＰ２のノックダウンは、ＲａｓＧＲＰ２遺伝子の第６エキソン中の領域をターゲットとするｓｉＲＮＡ（ＲａｓＧＲＰ２－１）（Ｓ１６７８６７：Applied Biosystems社製）を用い、ＲａｓＧＲＰ４のノックダウンは、ＲａｓＧＲＰ４遺伝子の第６エキソン中の領域をターゲットとするｓｉＲＮＡ（ＲａｓＧＲＰ４－１）（Ｓ１３９３２０：Applied Biosystems社製）を用いた。対照のｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ（Ｃｏｎｔｒｏｌ）（Applied Biosystems社製）を用いた。
＜ＲＮＡ干渉によるＲａｓＧＲＰ２及び／又はＲａｓＧＲＰ４のノックダウン＞
ＲａｓＧＲＰ２ノックダウンＣＩＡラット、ＲａｓＧＲＰ４ノックダウンＣＩＡラット、及びコントロールＣＩＡラットは、それぞれ、１０μＭとなるようにｓｉＲＮＡ（ＲａｓＧＲＰ２－１）、ｓｉＲＮＡ（ＲａｓＧＲＰ４－１）、又はｓｉＲＮＡ（Ｃｏｎｔｒｏｌ）をatelocollagen（Koken社製）に混合したｓｉＲＮＡ溶液５０μＬを、コラーゲン投与から１４日目（Day 14）のＣＩＡラットの関節内に投与して作製した（それぞれ、ｎ＝３）。ＲａｓＧＲＰ２／ＲａｓＧＲＰ４ダブルノックダウンＣＩＡラットは、１０μＭとなるようにｓｉＲＮＡ（ＲａｓＧＲＰ２－１）をatelocollagen（Koken社製）に混合したｓｉＲＮＡ溶液２５μＬと、１０μＭとなるようにｓｉＲＮＡ（ＲａｓＧＲＰ４－１）をatelocollagen（Koken社製）に混合したｓｉＲＮＡ溶液２５μＬとを、コラーゲン投与から１４日目（Day 14）のＣＩＡラットの関節内に投与して作製した（ｎ＝３）。
ＲａｓＧＲＰ２ノックダウンＣＩＡラット、ＲａｓＧＲＰ４ノックダウンＣＩＡラット、及びコントロールＣＩＡラットは、それぞれ、１０μＭとなるようにｓｉＲＮＡ（ＲａｓＧＲＰ２－１）、ｓｉＲＮＡ（ＲａｓＧＲＰ４－１）、又はｓｉＲＮＡ（Ｃｏｎｔｒｏｌ）をatelocollagen（Koken社製）に混合したｓｉＲＮＡ溶液５０μＬを、コラーゲン投与から１４日目（Day 14）のＣＩＡラットの関節内に投与して作製した（それぞれ、ｎ＝３）。ＲａｓＧＲＰ２／ＲａｓＧＲＰ４ダブルノックダウンＣＩＡラットは、１０μＭとなるようにｓｉＲＮＡ（ＲａｓＧＲＰ２－１）をatelocollagen（Koken社製）に混合したｓｉＲＮＡ溶液２５μＬと、１０μＭとなるようにｓｉＲＮＡ（ＲａｓＧＲＰ４－１）をatelocollagen（Koken社製）に混合したｓｉＲＮＡ溶液２５μＬとを、コラーゲン投与から１４日目（Day 14）のＣＩＡラットの関節内に投与して作製した（ｎ＝３）。
＜関節炎スコアと足関節の直径＞
各ＣＩＡラットについて、実施例１と同様にして、関節炎スコアと足関節の直径の測定を行った。
各ＣＩＡラットについて、実施例１と同様にして、関節炎スコアと足関節の直径の測定を行った。
＜足関節組織のマイクロＣＴ撮像と骨びらんスコア＞
各ＣＩＡラットは、コラーゲン投与から３５日目（Day 35）に、麻酔下の心臓全採血により安楽死処理した。各ＣＩＡラットの足関節組織を、４％パラホルムアルデヒドで２４時間固定した。次いで、足関節のマイクロＣＴを撮像した後、脱灰しパラフィン包埋を行った。足関節のマイクロＣＴ画像に基づき、実施例１と同様にして、骨びらんスコアを測定した。
各ＣＩＡラットは、コラーゲン投与から３５日目（Day 35）に、麻酔下の心臓全採血により安楽死処理した。各ＣＩＡラットの足関節組織を、４％パラホルムアルデヒドで２４時間固定した。次いで、足関節のマイクロＣＴを撮像した後、脱灰しパラフィン包埋を行った。足関節のマイクロＣＴ画像に基づき、実施例１と同様にして、骨びらんスコアを測定した。
＜ＨＥ染色とパンヌススコア＞
パラフィン包埋から作製した切片に対して、ＨＥ（hematoxylin-eosin）染色を行い、ＨＥ染色画像からパンヌス形成を評価した。パンヌス形成は、０点：正常、１点：軽度のパンヌス形成、２点：中等度のパンヌス形成、３点：重度のパンヌス形成、としてスコア化した（非特許文献５参照。）。
パラフィン包埋から作製した切片に対して、ＨＥ（hematoxylin-eosin）染色を行い、ＨＥ染色画像からパンヌス形成を評価した。パンヌス形成は、０点：正常、１点：軽度のパンヌス形成、２点：中等度のパンヌス形成、３点：重度のパンヌス形成、としてスコア化した（非特許文献５参照。）。
図１４に各ＣＩＡラットの関節炎スコアの測定結果を、図１５に各ＣＩＡラットの足関節の直径の測定結果を、図１７に各ＣＩＡラットの骨びらんスコアの測定結果を、図１８に各ＣＩＡラットのパンヌススコアの測定結果を、それぞれ平均±標準誤差で示す（＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１、ｔ－ｔｅｓｔ）。また、図１６に、各ＣＩＡラットの足関節のマイクロＣＴ画像及びＨＥ染色画像を示す。各図中、「Ｃｏｎｔｒｏｌ」はコントロールＣＩＡラット、「ｓｉＲＮＡ ＲａｓＧＲＰ２」はＲａｓＧＲＰ２ノックダウンＣＩＡラット、「ｓｉＲＮＡ ＲａｓＧＲＰ４」はＲａｓＧＲＰ４ノックダウンＣＩＡラット、「ｓｉＲＮＡ ＲａｓＧＲＰ２＋４」はＲａｓＧＲＰ２／ＲａｓＧＲＰ４ダブルノックダウンＣＩＡラット、の結果を表す。また、図１６中、矢印箇所は足関節を示し、矢頭は増殖性滑膜組織を示す。
この結果、ＲａｓＧＲＰ２ノックダウンＣＩＡラットとＲａｓＧＲＰ４ノックダウンＣＩＡラットは、関節炎スコア、足関節の直径、骨びらんスコア、及びパンヌススコアのいずれも、コントロールＣＩＡラットよりも明らかに小さく抑えられていた。関節炎スコア、足関節の直径、骨びらんスコア、及びパンヌススコアへの改善効果は、いずれもＲａｓＧＲＰ２ノックダウンＣＩＡラットよりもＲａｓＧＲＰ４ノックダウンＣＩＡラットのほうが大きな効果を示した。また、骨びらん及びパンヌス形成に対しては、投与したｓｉＲＮＡはそれぞれ半量でしかなかったにもかかわらず、ＲａｓＧＲＰ２／ＲａｓＧＲＰ４ダブルノックダウンＣＩＡラットは、ＲａｓＧＲＰ４ノックダウンＣＩＡラットよりも高い改善効果を示した。これらの結果から、ＲａｓＧＲＰ２とＲａｓＧＲＰ４の両者の機能を抑制することにより、滑膜組織の浸潤等の関節炎の諸症状への治療効果に対して相乗効果を示すことが確認された。
Claims (5)
- ＲａｓＧＲＰ２遺伝子の機能を抑制又は阻害する物質を有効成分とし、
前記ＲａｓＧＲＰ２遺伝子の機能を抑制又は阻害する物質が、ＲＮＡ干渉により、ＲａｓＧＲＰ２遺伝子の発現自体を抑制させる作用を有する物質であり、
関節リウマチの治療又は予防に用いられる、医薬用組成物。 - 前記ＲａｓＧＲＰ２遺伝子の機能を抑制又は阻害する物質が、ＲａｓＧＲＰ２遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡである、請求項１に記載の医薬用組成物。
- 滑膜組織の浸潤を抑制する、請求項１又は２に記載の医薬用組成物。
- さらに、ＲａｓＧＲＰ４遺伝子の機能を抑制又は阻害する物質を有効成分とし、
前記ＲａｓＧＲＰ４遺伝子の機能を抑制又は阻害する物質が、ＲＮＡ干渉により、ＲａｓＧＲＰ４遺伝子の発現自体を抑制させる作用を有する物質である、請求項１～３のいずれか一項に記載の医薬用組成物。 - 前記ＲａｓＧＲＰ４遺伝子の機能を抑制又は阻害する物質が、ＲａｓＧＲＰ４遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡである、請求項４に記載の医薬用組成物。
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| Publication Number | Publication Date |
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-
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Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Arthritis and Rheumatology，2015年，67，396-407 |
| International Journal of Immunopathology and Pharmacology，2012年，25，455-466 |
| Prostaglandins and Other Lipid Mediators，2010年，89，26-33 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2020015678A (ja) | 2020-01-30 |
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