JP7162310B2 - 自己組織化化合物を含む抗凍結組成物 - Google Patents

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Description

本発明は、自己組織化化合物を含む抗凍結組成物に関する。
低温保護剤（cryoprotective agent，ＣＰＡ）は、溶液中に存在するとき、０℃下の温度にさらされる溶液における氷結晶の形成を低減するか、又は氷結晶の成長を阻害できる化合物である。ＣＰＡとしては、小分子、合成ポリマー、および凍結防止剤タンパク質が主に用いられる。
臓器移植は、生存率、生活の質および費用対効果の側面で末期臓器不全の最良の治療法である。しかし、残念ながら、臓器移植物の供給と需要の間には長い時間間隔が存在し、これは臓器移植を必要とする患者に長期間の待機時間中の生活の質の低下を招く、重大な医療障壁になっている。臓器供給の不足の理由の一つは、信頼できる保存方法の不在に起因する。
臓器を適切に保存するためには、臓器を保存溶液で洗浄して血液を除去し、臓器を安定化させなければならない。保存溶液中で臓器を安定化させた後も、ドナーから摘出後に臓器の割り当て、輸送及び移植に利用可能な時間は通常６～１２時間に限られている。この短い時間は、ほとんどの臓器が近距離の患者に移植されるように制限し、遠距離の患者への臓器移植の機会が著しく減少する結果をもたらす。このように、臨床的に利用可能な臓器の不足は、ほぼ全ての国で人間臓器の売買を禁止しているにもかかわらず、違法な臓器売買および人身売買の増加をもたらした。
現在、臓器保存に使用されるＣＰＡとしては、一般的に、特にエチレングリコール、１，２－プロパンジオール、ジメチルスルホキシド、ホルムアミド、グリセロール、スクロース、ラクトース、またはＤ－マンニトールが用いられる。臓器保存温度での氷結晶の成長を低減または阻害するためには、ＣＰＡの有効濃度を通常６０％以上と非常に高くしなければならない。この高濃度では、これらの化合物は保存しようとする組織に毒性を示すこともあり、移植前に昇温とともにＣＰＡを大量に除去するときに不可逆的な細胞死を引き起こすことがあると知られている。
氷結晶の形成を低減または阻害するのに使用される他のＣＰＡとしては、合成ポリマー及び凍結防止剤タンパク質がある。これらは、前述したＣＰＡと同様にそれぞれ欠点を持っている。例えば、自然界に存在する抗凍結タンパク質（antifreeze protein、ＡＦＰ）、例えば魚類、植物または昆虫から単離されたタンパク質は、氷の形成を防止するのに非常に効果的であるが、現在利用可能な凍結防止剤のタンパク質は、純度が低く、生産単価が高いため、産業界で利用するには非効率的であると考えられる。
一方、化学的凍結防止剤、例えば、ＤＭＳＯ（dimethyl sulfoxide）は、発熱、かゆみなどの副作用を引き起こすだけでなく、脳を退化させたり神経毒として作用するなどの生体毒性を示すことが知られている。このため、この化学的凍結防止剤は、細胞、組織、臓器または食品などの凍結に使用し難いという欠点を有する。
本発明の目的は、細胞及び生体への毒性が低い、優れた結氷制御能を有する材料を提供することである。
本発明の他の目的は、氷の再結晶化または氷結晶の直径の増加を抑制できる材料を開発することである。
本発明のまた他の目的は、前記材料を含む結氷制御用組成物、細胞凍結用組成物、および食品凍結用組成物を提供することである。
１．下記の化学式１又は化学式２で表される化合物を含む、結氷制御用組成物。
Figure 0007162310000001
Figure 0007162310000002
前記の化学式１又は２中、
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して
Figure 0007162310000003
 または
Figure 0007162310000004
 であり、
Ｒ３は、
Figure 0007162310000005
 、
Figure 0007162310000006
 、
Figure 0007162310000007
 、
Figure 0007162310000008
 または
Figure 0007162310000009
 であり、
Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立して
Figure 0007162310000010
 または
Figure 0007162310000011
 である。
２．項目１において、前記化合物は、自己組織化（self－assembly）されてフィブリル（fibril）またはシート（sheet）状の構造物を形成する、結氷制御用組成物。
３．項目１において、下記化学式３で表される化合物をさらに含み、このとき、前記組成物は、前記化学式１で表される化合物を含み、化学式３で表される化合物及び化学式１で表される化合物を２：１（mole：mole）の割合で含む、結氷制御用組成物。
Figure 0007162310000012
４．項目３において、前記化学式１中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して
Figure 0007162310000013
 または
Figure 0007162310000014
 であり、Ｒ３は、
Figure 0007162310000015
 である、結氷制御用組成物。
５．項目１において、下記化合物のうちの少なくとも一つを含む、結氷制御用組成物。
Figure 0007162310000016
Figure 0007162310000017
Figure 0007162310000018
Figure 0007162310000019
Figure 0007162310000020
Figure 0007162310000021
Figure 0007162310000022
６．下記の化学式１又は化学式２で表される化合物を含む、細胞凍結用組成物。
Figure 0007162310000023
Figure 0007162310000024
 前記の化学式１又は２中、
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して
Figure 0007162310000025
 または
Figure 0007162310000026
 であり、
Ｒ３は
Figure 0007162310000027
 、
Figure 0007162310000028
 、
Figure 0007162310000029
 、
Figure 0007162310000030
 または
Figure 0007162310000031
 であり、
Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立して
Figure 0007162310000032
 または
Figure 0007162310000033
 である。
７．項目６において、前記化合物は、自己組織化（self－assembly）されてフィブリル（fibril）またはシート（sheet）状の構造物を形成する、細胞凍結用組成物。
８．項目６において、下記化学式３で表される化合物をさらに含み、このとき、前記組成物は、前記化学式１で表される化合物を含み、化学式３で表される化合物及び化学式１で表される化合物を２：１（mole：mole）の割合で含む、細胞凍結用組成物。
Figure 0007162310000034
９．項目８において、前記化学式１中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して
Figure 0007162310000035
 または
Figure 0007162310000036
 であり、Ｒ３は
Figure 0007162310000037
 である、細胞凍結用組成物。
１０．項目６において、下記化合物のうちの少なくとも一つを含む、細胞凍結用組成物。
Figure 0007162310000038
Figure 0007162310000039
Figure 0007162310000040
Figure 0007162310000041
Figure 0007162310000042
Figure 0007162310000043
Figure 0007162310000044
１１．項目６において、前記細胞は、精子、卵子、上皮細胞、神経細胞、表皮細胞、角質細胞、造血細胞、メラニン細胞、軟骨細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、赤血球、マクロファージ、単核球、線維芽細胞、筋肉細胞、胚性幹細胞、間葉系幹細胞、または成体幹細胞である、細胞凍結用組成物。
１２．下記の化学式１又は化学式２で表される化合物を含む、食品凍結用組成物。
Figure 0007162310000045
Figure 0007162310000046
 前記化学式１又は２中、
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して
Figure 0007162310000047
 または
Figure 0007162310000048
 であり、
Ｒ３は
Figure 0007162310000049
 、
Figure 0007162310000050
 、
Figure 0007162310000051
 、
Figure 0007162310000052
 または
Figure 0007162310000053
 であり、
Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立して
Figure 0007162310000054
 または
Figure 0007162310000055
 である。
１３．項目１２において、前記化合物は、自己組織化（self－assembly）されてフィブリル（fibril）またはシート（sheet）状の構造物を形成する、食品凍結用組成物。
１４．項目１２において、下記化学式３で表される化合物をさらに含み、このとき、前記組成物は、前記化学式１で表される化合物を含み、化学式３で表される化合物及び化学式１で表される化合物を２：１（mole：mole）の割合で含む、食品凍結用組成物。
Figure 0007162310000056
１５．項目１４において、前記化学式１中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して
Figure 0007162310000057
 または
Figure 0007162310000058
 であり、Ｒ３は
Figure 0007162310000059
 である、食品凍結用組成物。
１６．項目１２において、下記化合物のうちの少なくとも一つを含む、食品凍結用組成物。
Figure 0007162310000060
Figure 0007162310000061
Figure 0007162310000062
Figure 0007162310000063
Figure 0007162310000064
Figure 0007162310000065
Figure 0007162310000066
１７．下記の化学式１又は化学式２で表される化合物を溶媒に添加するステップを含む、結氷制御方法。
Figure 0007162310000067
Figure 0007162310000068
 前記化学式１又は２中、
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して
Figure 0007162310000069
 または
Figure 0007162310000070
 であり、
Ｒ３は、
Figure 0007162310000071
 、
Figure 0007162310000072
 、
Figure 0007162310000073
 、
Figure 0007162310000074
 または
Figure 0007162310000075
 であり、
Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立して
Figure 0007162310000076
 または
Figure 0007162310000077
 である。
１８．下記の化学式１又は化学式２で表される化合物を細胞に処理するステップを含む、細胞凍結保存方法。
Figure 0007162310000078
Figure 0007162310000079
 前記化学式１又は２中、
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して
Figure 0007162310000080
 または
Figure 0007162310000081
 であり、
Ｒ３は、
Figure 0007162310000082
 、
Figure 0007162310000083
 、
Figure 0007162310000084
 、
Figure 0007162310000085
 または
Figure 0007162310000086
 であり、
Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立して
Figure 0007162310000087
 または
Figure 0007162310000088
 である。
１９．下記の化学式１又は化学式２で表される化合物を食品に処理するステップを含む、食品凍結保存方法。
Figure 0007162310000089
Figure 0007162310000090
 前記化学式１又は２中、
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して
Figure 0007162310000091
 または
Figure 0007162310000092
 であり、
Ｒ３は、
Figure 0007162310000093
 、
Figure 0007162310000094
 、
Figure 0007162310000095
 、
Figure 0007162310000096
 または
Figure 0007162310000097
 であり、
Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立して
Figure 0007162310000098
 または
Figure 0007162310000099
 である。
本発明によると、細胞及び生体への毒性が低いながらも、優れた結氷制御能を有する材料を提供することができる。
本発明による結氷制御材料は、氷の再結晶化または氷結晶の直径の増加を抑制することができる。
本発明によると、本発明による材料を含む結氷制御用組成物、細胞凍結用組成物、および食品凍結用組成物を提供することができる。
図１は、ａ）Ｆｍｏｃ－ＦＦ、ｂ）Ｆｍｏｃ－ＦＦＴ、ｃ）Ｆｍｏｃ－ＦＦＶ、ｄ）Ｆｍｏｃ－ＦＦＡ、ｅ）Ｆｍｏｃ－ＦＦＳ、ｆ）Ｆｍｏｃ－ＦＥＦＥＴ、ｇ）Ｆｍｏｃ－ＷＦＴ、ｈ）Ｆｍｏｃ－ＷＷＴ、およびｉ）Ｎａｐｈ－ＦＦＴのＨＰＬＣスペクトルである。 図２は、ａ）Ｆｍｏｃ－ＦＦ、ｂ）Ｆｍｏｃ－ＦＦＴ、ｃ）Ｆｍｏｃ－ＦＦＶ、ｄ）Ｆｍｏｃ－ＦＦＡ、ｅ）Ｆｍｏｃ－ＦＦＳ、ｆ）Ｆｍｏｃ－ＦＥＦＥＴ、ｇ）Ｆｍｏｃ－ＷＦＴ、ｈ）Ｆｍｏｃ－ＷＷＴ、およびｉ）Ｎａｐｈ－ＦＦＴのＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＴＯＦ ＭＳスペクトルである。 図３は、ａ）は、水溶液中でのＦｍｏｃ－ＦＦの二次構造を示すＣＤスペクトルであり、ｂ）は、臨界ミセル凝集のＦｍｏｃ－ＦＦ濃度を示すものであり、ｃ）は、Ｆｍｏｃ－ＦＦのＴＥＭ画像であることを示す。 図４は、水溶液中でのａ）Ｆｍｏｃ－ＦＦＴ、ｂ）Ｆｍｏｃ－ＦＦＶ、ｃ）Ｆｍｏｃ－ＦＦＡ、およびＦｍｏｃ－ＦＦＳのＣＤスペクトルである。 図５は、ａ）は、Ｆｍｏｃ－ＦＦＴのＴＥＭ、ｂ）は、Ｆｍｏｃ－ＦＦＴの超低温（cryogenic）－ＴＥＭ、ｃ）は、Ｆｍｏｃ－ＦＦＴのＳＴＥＭ画像であり、ｄ）は、Ｆｍｏｃ－ＦＦＶのＴＥＭ画像（左上、蛍光顕微鏡）、ｅ）は、Ｆｍｏｃ－ＦＦＡのＴＥＭ及び超低温－ＴＥＭ画像（左上、蛍光顕微鏡）、ｆ）は、水溶液中でのＦｍｏｃ－ＦＦＳのＴＥＭ画像であることを示す。 図６は、ａ）は、水溶液中でのＦｍｏｃ－ＦＥＦＥＴの二次構造を示すＣＤスペクトルであり、ｂ）は、臨界ミセル凝集のＦｍｏｃ－ＦＥＦＥＴ濃度であり、ｃ）は、Ｆｍｏｃ－ＦＥＦＥＴのＴＥＭ画像であり、ｄ）は、Ｆｍｏｃ－ＦＥＦＥＴの超低温－ＴＥＭ画像であり、フィブリルの形成を示している。 図７は、ａ）は、臨界ミセル凝集のＦｍｏｃ－ＦＦ及びＦｍｏｃ－ＦＦＴの共組織化構造体の濃度であり、ｂ）は、Ｆｍｏｃ－ＦＦ及びＦｍｏｃ－ＦＦＴの共組織化構造体の水力学的半径をＤＬＳで確認した結果であり、ｃ）は、Ｆｍｏｃ－ＦＦ及びＦｍｏｃ－ＦＦＴの共組織化構造体のＴＥＭ画像であることを示す。 図８は、ａ）は、Ｆｍｏｃ－ＷＦＴのＣＤスペクトル、ｂ）は、Ｆｍｏｃ－ＷＷＴのＣＤスペクトル、ｃ）は、Ｎａｐｈ－ＦＦＴのＣＤスペクトルであり、ｄ）は、Ｆｍｏｃ－ＷＦＴのＴＥＭ画像、ｅ）は、Ｆｍｏｃ－ＷＷＴのＴＥＭ画像、ｆ）は、Ｎａｐｈ－ＦＦＴのＴＥＭ画像であることを示す。 図９は、ａ）は、１６．７ｎｍの直径のＭＰＡ－Ａｕナノ粒子の１６．７ｎｍのスペクトルのＴＥＭ画像であり、ｂ）は、ＭＰＡ－ＡｕＮＰ、ＭＰＡ－ＡｕＮＰ＋２μＭ ＢＳＡ、およびＭＰＡ－ＡｕＮＰ＋２μＭ ＰＥＧの凍結／解凍後の消光スペクトルであり、凍結－誘導組織化は、消光スペクトルで定量することができる。 図１０は、自己組織化ナノ構造体の凍結／解凍の前（ａ）及び後（ｂ）の吸収スペクトルの変化を示すものであり、ｃ）は、マイクロウェルプレートで各材料（０．５ｍＭの５０μＬ）と混合されたＭＰＡ－ＡｕＮＰ溶液（３００μＭの３５０μＬ）を凍結／解凍の前と後に撮影した写真であり、ｄ）は、ｃ）でのＡｕ ＮＰ凝集を吸収割合として定量したものである。 図１１は、氷を３０分間再結晶化させ、すべての材料の再結晶化ドメインのＭＬＧＳをＤＦＯＭ画像から計算したものであり、ａ）及びｂ）は、視界から最も大きいドメインを１０個選定し、平均を出して測定した。 図１２は、Ｆｍｏｃ－ＦＦ、Ｆｍｏｃ－ＦＦＴ、Ｆｍｏｃ－ＦＦＶ、Ｆｍｏｃ－ＦＦＡ、およびＦｍｏｃ－ＦＦＳのＩＲＩ活性を示すものであり、ａ）は、３０分間再結晶化された氷の再結晶化を示すＤＦＯＭを時間順に示すものであり、ｂ）は、ａ）からの画像を用いて、各材料の再結晶化ドメインのＭＬＧＳを計算したものである。 図１３は、Ｆｍｏｃ－ＦＦ、Ｆｍｏｃ－ＦＦＴ、Ｆｍｏｃ－ＦＥＦＥＴ、およびＦｍｏｃ－ＦＦ：Ｆｍｏｃ－ＦＦＴの共組織化のＭＬＧＳを示すものである。 図１４は、Ｆｍｏｃ－ＦＦ、Ｆｍｏｃ－ＦＦＴ、Ｆｍｏｃ－ＷＦＴ、Ｆｍｏｃ－ＷＷＴ、およびＮａｐｈ－ＦＦＴのＩＲＩ活性を示すものであり、氷の再結晶化を示すＤＦＯＭは時間に応じて撮影され、氷は３０分間再結晶化させた。ｂ）は、ａ）の画像から計算された各材料の再結晶化ドメインのＭＬＧＳである。 図１５は、ａ）は、様々な試料濃度におけるｍＥＳＣのＣＣＫ－分析法で決定された細胞生存率を示すグラフであり、ｂ）は、クリスタルバイオレット染色で確認したものであることを示す。 図１６は、ｍＥＳＣのＣＣＫ－分析法で確認した細胞生存率である。 図１７は、ａ）は、ｍＥＳＣを各試料で凍結保存した後、３７℃で解凍して細胞生存率を確認したものであり、平均＋ＳＤ形式で示している。ｂ）は、試料で凍結保存した後、４日間ｍＥＳＣｓの分化を確認したものである。 図１８は、凍結保存後４日間のｍＥＳＣの分化を凍結保存溶液の濃度によって確認した結果である。 図１９は、凍結／解凍精子の生殖能をＦｍｏｃ－ＦＦ及びＦｍｏｃ－ＦＦＴの共組織化体に対して確認した結果である。 図２０は、試料を使用して凍結保存した精子を注入し、卵子のａ）胚およびｂ）胚盤胞への発達を確認したものである。 図２１は、Ｃ５７ＢＬ／６由来の２－細胞胚のｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでの発達を示すものである。 図２２は、牛肉（ａ）を凍結する前にＦｍｏｃ－ＦＦＴを処理した場合（ｄ、ｅ）とそうでない場合（ｂ、ｃ）における、氷結晶の大きさ及び組織を確認したＳＥＭ画像（ｂ、ｄ）、光学顕微鏡（ｃ、ｅの左）、およびＴＥＭ画像（ｃ、ｅの右）である。
以下、添付の図面を参照して、本発明をより具体的に説明するが、本発明の全てではなく、いくつかの具体例を例示する。実際、これらの発明は、様々な形態で具体化することができ、本明細書に示す具体例のみに限定されて解釈されるものではない。本明細書及び請求の範囲で使用される単数形は、特に他の明示がない限り複数の対象を含む。
本発明では、「抗凍結タンパク質」または「ＡＦＰ」は、相互交換して使用可能であり、ＡＦＰは、様々な動物、植物、カビ及びバクテリアから発見される。これらのタンパク質は、氷結晶に結合することにより、氷の成長および再結晶化を抑制することが知られている。このＡＦＰの性質は、低温で生物学的試料を保存するのに利用されてきた。自然界に存在する抗凍結タンパク質（Anti－freeze protein，ＡＦＰ）は、αヘリックスまたはβシートの二次構造を有するが、前記二次構造で氷の結晶面と接触する位置に、水分子と水素結合または疎水性の相互作用が可能なアミノ酸であるＴ、Ｓ及びＶが配列されていることが知られている。この配列は、氷の結晶面に存在する水分子と一定の間隔をおいて相互作用して、氷結晶面の外側（液状）の水分子と氷結晶面の分子との間の相互作用を抑制することにより、氷の成長または氷の再結晶化を防止または低下する。本発明者らは、この技術的背景をもとに、自己組織化によりペプチドと類似した配列を持つことができる化合物を用いてペプチド類似構造体を製造し、この構造体が結氷制御能があることを確認することにより本発明を完成した。
本発明に係る結氷制御用組成物は、Ｆｍｏｃ（フルオレニルメチルオキシカルボニル、Fluorenylmethyloxycarbonyl）に２個～５個のアミノ酸、例えば、２個、３個、４個または５個のアミノ酸がペプチド結合で連結されている化合物を含む。前記化合物は、「ペプチド類似化合物」、「本発明に係る試料」「本発明の試料」「本発明に係る化合物」「本発明の化合物」または「試料」と称する。また、前記化合物が自己組織化して形成される構造体は「自己組織化ナノ構造体」と称する。
本発明の一実施形態では、前記化合物に含まれたアミノ酸残基は、アルギニン（Ａｒｇ，Ｒ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ、Ｈ）、リシン（Ｌｙｓ、Ｋ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ、Ｄ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ）、セリン（Ｓｅｒ、Ｓ）、トレオニン（Ｔｈｒ、Ｔ）、アスパラギン（Ａｓｎ、Ｎ）、グルタミン（Ｇｌｎ、Ｑ）、システイン（Ｃｙｓ、Ｃ）、グリシン（Ｇｌｙ、Ｇ）、プロリン（Ｐｒｏ、Ｐ）、アラニン（Ａｌａ、Ａ）、バリン（Ｖａｌ、Ｖ）、イソロイシン（Ｉｌｅ、Ｉ）、ロイシン（Ｌｅｕ、Ｌ）、メチオニン（Ｍｅｔ、Ｍ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ、Ｆ）、チロシン（Ｔｙｒ、Ｙ）、およびトリプトファン（Ｔｒｐ、Ｗ）からなる群より選択される一つ以上のアミノ酸残基である。本発明の他の実施形態では、前記アミノ酸はＴｈｒ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ及びＴｒｐからなる群より選択される一つ以上のアミノ酸残基である。
本発明の一実施形態では、本発明に係る化合物はＦｍｏｃ－ＦＦＸ１、Ｆｍｏｃ－ＷＦＸ１、Ｆｍｏｃ－ＷＷＸ１、ＦｍｏｃＦＷＸ１、Ｆｍｏｃ－ＦＸ２ＦＸ３Ｘ１、Ｆｍｏｃ－ＷＸ２ＦＸ３Ｘ１、Ｆｍｏｃ－ＷＸ２ＷＸ３Ｘ１、ＦｍｏｃＦＸ２ＷＸ３Ｘ１で表される構造を有する。前記Ｘ１は、アミノ酸Ｔ、Ｖ、Ａ、Ｓ及びＣからなる群より選択されるいずれか一つであり、前記Ｘ２及びＸ３は、それぞれ独立してアミノ酸ＤまたはＥである。
本発明に係る化合物のうちＦｍｏｃ－ＦＦにおいて、Ｆｍｏｃは分子間ｐｉ－ｐｉ ｓｔａｃｋｉｎｇを誘導し、Ｐｈｅ－Ｐｈｅはｐｉ－ｐｉ－ｓｔａｃｋｉｎｇ及び水素結合を誘導して自己組織化（self－assembly）され、タンパク質二次構造と類似したαヘリックスまたはβシートを形成する。この配列により、水と相互作用できるアミノ酸残基が自己組織化体の外側に配列され、氷の界面と親水性の相互作用、疎水性の相互作用、または水素結合を形成することができる。また、Ｆｍｏｃ－ＦＦにおいて、少なくとも１つのＰｈｅはＴｒｐで置換することができ、置換された化合物Ｆｍｏｃ－ＦＷＸ、Ｆｍｏｃ－ＷＦＸまたはＦｍｏｃ－ＷＷＸは、親化合物であるＦｍｏｃ－ＦＦＸと比較して、同一又は類似の程度の結氷制御活性を有することが確認された。
本発明の一実施形態では、前記Ｘ１は、水と相互作用できるアミノ酸であって、特にＴｈｒ、Ａｌａ、Ｖａｌ、ＳｅｒまたはＣｙｓであり、本発明の他の実施形態では、前記Ｘ１はＴｈｒまたはＡｌａである。本発明の発明者らは、Ｘ１がＴｈｒ、Ａｌａ、ＶａｌまたはＳｅｒである場合には、いずれも氷の再結晶化を抑制したり、結氷を制御できることを確認した。驚くべきことに、Ｘ１が水と親水性の相互作用、または水素結合を形成できるアミノ酸残基であるＳｅｒの場合と比較して、疎水性の官能基と親水性の官能基の両方を有するＴｈｒの場合に、より良い氷再結晶化の阻害活性、及び／又は結氷制御活性を示すことを確認した。また、Ｘ１がＳｅｒである場合と比較して、疎水性の官能基のみを有するＡｌａである場合に、より良い氷再結晶化の阻害活性、及び／又は結氷制御活性を示すことを確認した。
また、Ｘ２及びＸ３は、それぞれの化合物の親水性レベルを高めて自己組織化ナノ構造体の水溶性を高めるために追加で導入されたものである。本発明の一実施形態では、Ｘ２及びＸ３は、それぞれ独立してＡｓｐまたはＧｌｕであり、本発明の他の実施形態ではＸ２及びＸ３は、それぞれ独立してＧｌｕである。
本発明に係る化合物は、本明細書で以下のように命名される。
Figure 0007162310000100
Figure 0007162310000101

Figure 0007162310000102
本発明の一実施形態では、角錐面（pyramidal plane）とｗｆＡＦＰの高い結合力を模倣するために、本発明の自己組織化構造体が結晶面と効果的に結合できるようにＴｈｒを約１７．５Åの間隔で配列しようとした（Knight, C. A., Cheng, C. C., & DeVries, A. L. (1991). Adsorption of alpha-helical antifreeze peptides on specific ice crystal surface planes. Biophysical Journal, 59(2), 409-418.；Knight, C. A., Driggers, E., & DeVries, A. L. (1993). Adsorption to ice of fish antifreeze glycopeptides 7 and 8. Biophysical Journal, 64(1), 252-259.）。また、ＡＦＰ特性に関与する氷結晶－結合面は、底面（ｂａｓａｌ ｐｌａｎｅ）［０００１］、第１の角柱面（ｐｒｉｍａｒｙ ｐｒｉｓｍ ｐｌａｎｅ）［１０１０］、第２の角柱面（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｐｒｉｓｍ ｐｌａｎｅ）［１１２０］、ピラミッド面（ｐｙｒａｍｉｄａｌ ｐｌａｎｅ）［２０２１］である。このうち、ｂａｓａｌ ｐｌａｎｅは遅い結晶成長を見せるのに対して、角柱面（ｐｒｉｓｍａｔｉｃ ｆａｃｅｓ）は速い結晶成長を見せ、ｐｙｒａｍｉｄａｌ ｐｌａｎｅの場合は、氷結晶の成長過程で露出することが知られている（Lee, H. (2018). Structures, dynamics, and hydrogen-bond interactions of antifreeze proteins in TIP4P/Ice water and their dependence on force fields. PLOS ONE, 13(6), e0198887.；Olijve, L. L. C., Meister, K., DeVries, A. L., Duman, J. G., Guo, S., Bakker, H. J., & Voets, I. K. (2016). Blocking rapid ice crystal growth through nonbasal plane adsorption of antifreeze proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences, 113(14), 3740-3745.）。また、カレイ（winter flounder）に由来するｗｆＡＦＰ１の場合は、ｂａｓａｌ ｐｌａｎｅと比べてｐｙｒａｍｉｄａｌ ｐｌａｎｅに結合したとき、より低い安定化エネルギーを有する。実際、ｗｆＡＦＰ１表面に規則的に存在するＴｈｒ間の間隔が１６．５Åを有し、これは氷の角錐面（pyramidal plane）［２０２１］の酸素－酸素の間隔と一致し、氷結晶の成長抑制の過程で大きな影響を与えることが知られている。そこで、Ｆｍｏｃ－ＦＦとＦｍｏｃ－ＦＦＴを２：１のモル比で混合することにより、［（Ｆｍｏｃ－ＦＦ）（Ｆｍｏｃ－ＦＦ）（Ｆｍｏｃ－ＦＦＴ）］の配列で自己組織化されるようにした。この自己組織化体を含む組成物は、一つの化合物からなる自己組織化構造体に比べて、同等または優れた結氷制御活性及び／又は再結晶化阻害活性を示した。
本発明の一実施形態では、下記の化学式１又は化学式２で表される化合物を含む、結氷制御用組成物を提供する。
Figure 0007162310000103
Figure 0007162310000104
 前記化学式１又は２中、
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して
Figure 0007162310000105
 または
Figure 0007162310000106
 であり、
Ｒ３は
Figure 0007162310000107
 、
Figure 0007162310000108
 、
Figure 0007162310000109
 、
Figure 0007162310000110
 または
Figure 0007162310000111
 であり、
Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立して
Figure 0007162310000112
 または
Figure 0007162310000113
 である。
本発明で使用する用語「氷の再結晶化」は、小さな氷結晶から更に大きな氷結晶に成長する過程を意味し、オストヴァルト熟成（Ostwald ripening）は、常温と結晶間の表面エネルギーの差による圧力によって発生する再結晶化を意味し、融解－拡散－再凍結または昇華－拡散－凝縮のメカニズムで進行され得る。
本発明で使用する用語「抗凍結」、「凍結制御」、「結氷制御」、「凍結抑制」および「結氷抑制」は、相互交換して使用可能であり、氷点を下げたり、氷が形成されないようにするか氷の形成速度を遅らせたり、氷の再結晶化が行われないようにしたり、氷再結晶化の速度を遅らせたり、氷結晶の大きさを小さく維持する作用を意味する。
本発明の結氷制御用組成物は、従来知られている結氷制御能を有する物質をさらに含むことができる。例えば、本発明の一実施形態では、結氷制御用組成物は、本発明に係る自己組織化ナノ構造体の他にも、ＤＭＳＯ（dimethyl sulfoxide）、グリセロール、１，２－プロパン－ジオール、スクロース、グルコース、プロリン、ガラクトース、ラクトース、グリシンベタイン又はフルクトースをさらに含むことができる。本発明の一実施形態では、細胞または食品の凍結保存に用いられる場合には、細胞毒性の低い、スクロース、グルコース、ラクトース、グリシンベタイン又はフルクトースをさらに含むことができる。
本発明の一実施形態では、前記化学式１又は化学式２で表される化合物を含む細胞凍結用組成物を提供する。細胞を凍結する過程および解凍する過程で、氷の再結晶化が起こり得る。氷の再結晶化が発生する場合には、氷の結晶が成長するにつれて、細胞膜が損傷し、細胞の脱水が進行されて細胞組織に損傷を与える。本発明に係る自己組織化ナノ構造体を含む組成物は、氷の成長または再結晶化を抑制させ、細胞凍結保存時の氷結晶の成長により細胞が死滅することを防ぐことができる。
本発明に係る組成物は、氷結晶の成長抑制効果に優れるだけでなく、細胞毒性が低く、細胞、組織または臓器の凍結保存に有用に使用することができる。前記細胞は、例えば、これらに限定されないが、微生物を含む原核細胞、植物、動物、菌類、原生生物を含む真核生物の細胞、例えば、精子、卵子、上皮細胞、神経細胞、表皮細胞、角質細胞、造血細胞、メラニン細胞、軟骨細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、赤血球、マクロファージ、単核球、線維芽細胞、筋肉細胞、胚性幹細胞、間葉系幹細胞、または成体幹細胞であってもよい。本発明の一実施形態では、前記組織は、膜上皮組織および腺上皮組織を含む上皮組織；疎性結合組織、脂肪組織、緻密繊維結合組織、細網結合組織、軟骨、骨組織、血液、およびリンパを含む結合組織；ニューロン及び神経膠を含む神経組織；並びに、平滑筋、心筋及び骨格筋を含む筋肉組織であってもよいが、これらに限定されるものではない。本発明の一実施形態では、前記臓器は、甲状腺、血管、肺、食道、肝臓、脾臓、腎臓、小腸、大腸、気管、心臓、尿管および子宮を含むが、これらに制限されるものではない。
細胞、組織または臓器を凍結保存する方法は、凍結保存する対象に、本発明に係る有効量の自己組織化ナノ構造体を接触または添加し、凍結保存のための温度に冷却するステップを含む。細胞、組織または臓器の凍結保存方法は、当該技術分野で公知の技術を用いて行うことができ、例えば、急速冷却器または液体窒素を用いることができるが、これらに限定されるものではない。
本発明の一実施形態では、本発明に係る組成物は、精子及び卵子を含む生殖細胞、および幹細胞の凍結保存に用いることができる。生殖細胞の冷凍保存は、生殖補助技術（assisted reproductive technology，ＡＲＴｓ）として、また家畜の場合には、繁殖管理のための重要な技術として、バイオテクノロジーで広く研究されている。一方、解凍後は精子の質が低下して生殖能が低下することになるが、主な原因としては、急激な温度変化、氷の形成および浸透圧などが挙げられる。本発明に係る生体適合性を有する自己組織化ナノ構造体を用いると、氷の形成及び／又は再結晶化が抑制される。これにより、細胞内、溶媒内または培地内での局所的な濃度の増加に起因する浸透圧の変化を最小限に抑えることができ、結果として、凍結後に解凍された精子の生存率および生殖能を上昇できることを確認した。
本発明の一実施形態では、前記の化学式１又は化学式２で表される化合物を含む食品凍結保存用の組成物を提供する。食品を凍結及び／又は解凍する過程において、水分から発生した氷結晶が成長するが、これは食品に存在する細胞及び／又は組織を破壊して食感の低下を引き起こす。本発明に係る自己組織化ナノ構造体は、結氷を抑制したり、氷の再結晶化を抑制するので、氷結晶の成長、及びそれによる浸透圧の変化による食品の品質低下を最小限に抑えることができる。
食品の凍結保存方法は、凍結保存する対象に、本発明に係る有効量の自己組織化ナノ構造体を接触または添加し、凍結保存のための温度に冷却するステップを含む。凍結保存方法は、当該技術分野で公知の技術を用いることができ、例えば、急速冷却器または液体窒素を用いることができるが、これらに限定されるものではない。
通常の技術者は、「約」の使用を避けられない場合があることを理解するだろう。本明細書で用語「約」は、誤差の範囲内の数値を含むものと理解すべきである。
本発明で使用する用語「実質的に同一」は、誤差の範囲内で同一であるか、又は認識できない程度の差があることを意味する。本発明で使用する用語「実質的にない」又はそれと類似した表現は、０または誤差の範囲内に０が含まれる場合、若しくは通常の技術者の認識上無視できる場合を指す。
実施例
製造例１．Ｆｍｏｃ－ＦＦの製造
Ｆｍｏｃ－ＦＦは、CEM Focused MicrowaveTM Synthesis System、Discoverで標準固相ペプチド合成（solid－phase peptide synthesis、ＳＰＰＳ）方法を用いて、リンクアミド（Rink Amide）ＭＢＨＡ樹脂上で合成した。ＤＣＭ（dichloromethan）により樹脂を洗浄した後、攪拌培養器で３０分間ＤＭＦ（dimethylformamide）及びＤＣＭが１：１で混合された溶液で樹脂を膨張させた。樹脂のＦｍｏｃ部分をＤＭＦ中で２０％ピペリジンで３分間マイクロ波で除去し、ＤＭＦ、ＤＣＭ及びＮＭＰ（N－Methyl－2pyrrolidone）で完全に洗浄した。その後、Ｆｍｏｃ－Ｐｈｅ－ＯＨ（５．０当量）、ＨＢＴＵ（O－（Benzotriazol－1－yl）－N,N,N',N'－tetramethyluronium Hexafluorophosphate）（４．９当量）およびＤＩＰＥＡ（N,N－Diisopropylethylamine）（５．０当量）と混合されたＮＭＰ溶液を樹脂に添加し、１０分間マイクロ波で処理した。その後、Ｆｍｏｃ－Ｐｈｅ－ＯＨをＦｍｏｃ－ＦＦ－樹脂の順に樹脂上のペプチドのＮ－末端とカップリングさせた。それぞれのカップリング及び保護基の除去工程に対して、カイザーテスト（Kaiser test）により自由アミノ基の存在を確認した。樹脂に切断溶液（ＴＦＡ（Trifluoroacetic acid）：ＴＩＳ（Triisopropylsilane）：Ｈ２Ｏ＝９５：２．５：２．５）を攪拌培養器で２時間処理した。過量のＴＦＡは、アルゴンガスで除去し、生成物を冷たいＥｔ２Ｏで沈殿させた後、４０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。ペプチドは、逆相ＨＰＬＣでＣ１８カラム（SUPELCO、Discovery（登録商標） BIO Wide Pore C18、5μm、10x250mm）で２ｍＬ ｍｉｎ－１の速度で水（０．１％ＴＦＡ）及びアセトニトリル（０．１％ＴＦＡ）の線形勾配を用いてペプチドを精製し、２３０ｎｍ及び２５４ｎｍでＵＶ吸収スペクトルで確認した。Ｆｍｏｃ－ＦＦの分子量（５５７［Ｍ＋Ｎａ］＋）は、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＴＯＦ質量分析計で確認した。
製造例２．Ｆｍｏｃ－ＦＦＸの製造
Ｆｍｏｃ－ＦＦＸは、CEM Focused MicrowaveTM Synthesis System、Discoverで標準固相ペプチド合成方法を用いて、リンクアミド（Rink Amide）ＭＢＨＡ樹脂上で合成した。ＤＣＭにより樹脂を洗浄した後、攪拌培養器で３０分間ＤＭＦ及びＤＣＭが１：１で混合された溶液で樹脂を膨張させた。樹脂のＦｍｏｃ部分をＤＭＦ中で２０％ピペリジンで３分間マイクロ波で除去し、ＤＭＦ、ＤＣＭ及びＮＭＰで完全に洗浄した。その後、それぞれＦｍｏｃ－ＦＦＴのためにはＦｍｏｃ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）－ＯＨ（５．０当量）、Ｆｍｏｃ－ＦＦＶのためにはＦｍｏｃ－Ｖａｌ－ＯＨ（５．０当量）、Ｆｍｏｃ－ＦＦＡのためにはＦｍｏｃ－Ａｌａ－ＯＨ（５．０当量）、Ｆｍｏｃ－ＦＦＳのためにはＦｍｏｃ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－ＯＨ（５．０当量）；ＨＢＴＵ（４．９当量）；およびＤＩＰＥＡ（５．０当量）と混合されたＮＭＰ溶液を樹脂に添加し、１０分間マイクロ波で処理した。その後、Ｆｍｏｃ－Ｐｈｅ－ＯＨをＦｍｏｃ－ＦＦ－樹脂の順に樹脂上のペプチドのＮ－末端とカップリングさせた。それぞれのカップリング及び保護基の除去工程に対して、カイザーテスト（Kaiser test）により自由アミノ基の存在を確認した。樹脂に切断溶液（ＴＦＡ：ＴＩＳ：Ｈ２Ｏ＝９５：２．５：２．５）を攪拌培養器で２時間処理した。過量のＴＦＡは、アルゴンガスで除去し、生成物を冷たいＥｔ２Ｏで沈殿させた後、４０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。ペプチドは、逆相ＨＰＬＣでＣ１８カラム（SUPELCO、Discovery（登録商標） BIO Wide Pore C18、5μm、10x250mm）で２ｍＬ ｍｉｎ－１の速度で水（０．１％ＴＦＡ）及びアセトニトリル（０．１％ＴＦＡ）の線形勾配を用いてペプチドを精製し、２３０ｎｍ及び２５４ｎｍでＵＶ吸収スペクトルで確認した。Ｆｍｏｃ－ＦＦＴの分子量（６５７［Ｍ＋Ｎａ］＋）、Ｆｍｏｃ－ＦＦＶの分子量（６５５［Ｍ＋Ｎａ］＋、６７１［Ｍ＋Ｋ］＋）、Ｆｍｏｃ－ＦＦＡの分子量（６２７［Ｍ＋Ｎａ］＋）、およびＦｍｏｃ－ＦＦＳの分子量（６４３［Ｍ＋Ｎａ］＋、６５９［Ｍ＋Ｋ］＋）は、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＴＯＦ質量分析計で確認した。
製造例３．Ｆｍｏｃ－ＦＥＦＥＴの製造
Ｆｍｏｃ－ＦＥＦＥＴは、CEM Focused MicrowaveTM Synthesis System、Discoverで標準固相ペプチド合成方法を用いて、リンクアミド（Rink Amide）ＭＢＨＡ樹脂上で合成した。ＤＣＭにより樹脂を洗浄した後、攪拌培養器で３０分間ＤＭＦ及びＤＣＭが１：１で混合された溶液で樹脂を膨張させた。樹脂のＦｍｏｃ部分をＤＭＦ中で２０％ピペリジンで３分間マイクロ波で除去し、ＤＭＦ、ＤＣＭ及びＮＭＰで完全に洗浄した。その後、それぞれＦｍｏｃ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）－ＯＨ（５．０当量）；ＨＢＴＵ（４．９当量）；およびＤＩＰＥＡ（５．０当量）と混合されたＮＭＰ溶液を樹脂に添加し、１０分間マイクロ波で処理した。その後、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－ＯＨ及びＦｍｏｃ－Ｐｈｅ－ＯＨをＦｍｏｃ－ＦＥＦＥＴ－樹脂の順に樹脂上のペプチドのＮ－末端とカップリングさせた。それぞれのカップリング及び保護基の除去工程に対して、カイザーテスト（Kaiser test）により自由アミノ基の存在を確認した。樹脂に切断溶液（ＴＦＡ：ＴＩＳ：Ｈ２Ｏ＝９５：２．５：２．５）を攪拌培養器で２時間処理した。過量のＴＦＡは、アルゴンガスで除去し、生成物を冷たいＥｔ２Ｏで沈殿させた後、４０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。ペプチドは、逆相ＨＰＬＣでＣ１８カラム（SUPELCO、Discovery（登録商標） BIO Wide Pore C18、5μm、10x250mm）で２ｍＬ ｍｉｎ－１の速度で水（０．１％ＴＦＡ）及びアセトニトリル（０．１％ＴＦＡ）の線形勾配を用いてペプチドを精製し、２３０ｎｍ及び２５４ｎｍでＵＶ吸収スペクトルで確認した。Ｆｍｏｃ－ＦＥＦＥＴの分子量（９１５［Ｍ＋Ｎａ］＋、９３２［Ｍ＋Ｋ］＋）は、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＴＯＦ質量分析計で確認した。
製造例４．Ｆｍｏｃ－ＷＦＴの製造
Ｆｍｏｃ－ＷＦＴは、CEM Focused MicrowaveTM Synthesis System、Discoverで標準固相ペプチド合成方法を用いて、リンクアミド（Rink Amide）ＭＢＨＡ樹脂上で合成した。ＤＣＭにより樹脂を洗浄した後、攪拌培養器で３０分間ＤＭＦ及びＤＣＭが１：１で混合された溶液で樹脂を膨張させた。樹脂のＦｍｏｃ部分をＤＭＦ中で２０％ピペリジンで３分間マイクロ波で除去し、ＤＭＦ、ＤＣＭ及びＮＭＰで完全に洗浄した。その後、それぞれＦｍｏｃ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）－ＯＨ（５．０当量）；ＨＢＴＵ（４．９当量）；およびＤＩＰＥＡ（５．０当量）と混合されたＮＭＰ溶液を樹脂に添加し、１０分間マイクロ波で処理した。その後、Ｆｍｏｃ－Ｔｒｐ－ＯＨ及びＦｍｏｃ－Ｐｈｅ－ＯＨをＦｍｏｃ－ＷＦＴ－樹脂の順に樹脂上のペプチドのＮ－末端とカップリングさせた。それぞれのカップリング及び保護基の除去工程に対して、カイザーテスト（Kaiser test）により自由アミノ基の存在を確認した。樹脂に切断溶液（ＴＦＡ：ＴＩＳ：Ｈ２Ｏ＝９５：２．５：２．５）を攪拌培養器で２時間処理した。過量のＴＦＡは、アルゴンガスで除去し、生成物を冷たいＥｔ２Ｏで沈殿させた後、４０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。ペプチドは、逆相ＨＰＬＣでＣ１８カラム（SUPELCO、Discovery（登録商標） BIO Wide Pore C18、5μm、10x250mm）で２ｍＬ ｍｉｎ－１の速度で水（０．１％ＴＦＡ）及びアセトニトリル（０．１％ＴＦＡ）の線形勾配を用いてペプチドを精製し、２３０ｎｍ及び２５４ｎｍでＵＶ吸収スペクトルで確認した。Ｆｍｏｃ－ＷＦＴの分子量（６７４［Ｍ＋Ｈ］＋、６９６［Ｍ＋Ｎａ］＋）は、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＴＯＦ質量分析計で確認した。
製造例５．Ｆｍｏｃ－ＷＷＴの製造
Ｆｍｏｃ－ＷＷＴは、CEM Focused MicrowaveTM Synthesis System、Discoverで標準固相ペプチド合成方法を用いて、リンクアミド（Rink Amide）ＭＢＨＡ樹脂上で合成した。ＤＣＭにより樹脂を洗浄した後、攪拌培養器で３０分間ＤＭＦ及びＤＣＭが１：１で混合された溶液で樹脂を膨張させた。樹脂のＦｍｏｃ部分をＤＭＦ中で２０％ピペリジンで３分間マイクロ波で除去し、ＤＭＦ、ＤＣＭ及びＮＭＰで完全に洗浄した。その後、それぞれＦｍｏｃ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）－ＯＨ（５．０当量）；ＨＢＴＵ（４．９当量）；およびＤＩＰＥＡ（５．０当量）と混合されたＮＭＰ溶液を樹脂に添加し、１０分間マイクロ波で処理した。その後、Ｆｍｏｃ－Ｔｒｐ－ＯＨをＦｍｏｃ－ＷＷＴ－樹脂の順に樹脂上のペプチドのＮ－末端とカップリングさせた。それぞれのカップリング及び保護基の除去工程に対して、カイザーテスト（Kaiser test）により自由アミノ基の存在を確認した。樹脂に切断溶液（ＴＦＡ：ＴＩＳ：Ｈ２Ｏ＝９５：２．５：２．５）を攪拌培養器で２時間処理した。過量のＴＦＡは、アルゴンガスで除去し、生成物を冷たいＥｔ２Ｏで沈殿させた後、４０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。ペプチドは、逆相ＨＰＬＣでＣ１８カラム（SUPELCO、Discovery（登録商標） BIO Wide Pore C18、5μm、10x250mm）で２ｍＬ ｍｉｎ－１の速度で水（０．１％ＴＦＡ）及びアセトニトリル（０．１％ＴＦＡ）の線形勾配を用いてペプチドを精製し、２３０ｎｍ及び２５４ｎｍでＵＶ吸収スペクトルで確認した。Ｆｍｏｃ－ＷＷＴの分子量（７１４［Ｍ＋Ｈ］＋、７３６［Ｍ＋Ｎａ］＋、７５２［Ｍ＋Ｋ］＋）は、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＴＯＦ質量分析計で確認した。
製造例６．Ｎａｐｈ－ＦＦＴの製造
Ｎａｐｈ－ＦＦＴは、CEM Focused MicrowaveTM Synthesis System、Discoverで標準固相ペプチド合成方法を用いて、リンクアミド（Rink Amide）ＭＢＨＡ樹脂上で合成した。ＤＣＭにより樹脂を洗浄した後、攪拌培養器で３０分間ＤＭＦ及びＤＣＭが１：１で混合された溶液で樹脂を膨張させた。樹脂のＦｍｏｃ部分をＤＭＦ中で２０％ピペリジンで３分間マイクロ波で除去し、ＤＭＦ、ＤＣＭ及びＮＭＰで完全に洗浄した。その後、それぞれＦｍｏｃ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）－ＯＨ（５．０当量）；ＨＢＴＵ（４．９当量）；およびＤＩＰＥＡ（５．０当量）と混合されたＮＭＰ溶液を樹脂に添加し、１０分間マイクロ波で処理した。その後、Ｆｍｏｃ－Ｐｈｅ－ＯＨをＮａｐｈ－ＦＦＴ－樹脂の順に樹脂上のペプチドのＮ－末端とカップリングさせた。Ｆｍｏｃは、同じカップリングプロセスにより１－ナフチル酢酸（1－Naphthylacetic acid）で置換させた。それぞれのカップリング及び保護基の除去工程に対して、カイザーテスト（Kaiser test）により自由アミノ基の存在を確認した。樹脂に切断溶液（ＴＦＡ：ＴＩＳ：Ｈ２Ｏ＝９５：２．５：２．５）を攪拌培養器で２時間処理した。過量のＴＦＡは、アルゴンガスで除去し、生成物を冷たいＥｔ２Ｏで沈殿させた後、４０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。ペプチドは、逆相ＨＰＬＣでＣ１８カラム（SUPELCO、Discovery（登録商標） BIO Wide Pore C18、5μm、10x250mm）で２ｍＬ ｍｉｎ－１の速度で水（０．１％ＴＦＡ）及びアセトニトリル（０．１％ＴＦＡ）の線形勾配を用いてペプチドを精製し、２３０ｎｍ及び２５４ｎｍでＵＶ吸収スペクトルで確認した。Ｎａｐｈ－ＦＦＴの分子量（６０３［Ｍ＋Ｎａ］＋、６１９［Ｍ＋Ｋ］＋）は、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＴＯＦ質量分析計で確認した。
前記の製造例１～６によってＦｍｏｃ－ＦＦ、Ｆｍｏｃ－ＦＦＴ、Ｆｍｏｃ－ＦＦＶ、Ｆｍｏｃ－ＦＦＡ、Ｆｍｏｃ－ＦＦＳ、Ｆｍｏｃ－ＦＥＦＥＴ、Ｆｍｏｃ－ＷＦＴ、Ｆｍｏｃ－ＷＷＴ、およびＮａｐｈ－ＦＦＴが成功的に製造されたことを、ＨＰＬＣ（図１）及びＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ－ＴＯＦ（図２）により確認した。
製造例７．ナノ構造体の形成
前記の製造例１～６で合成されたすべての化合物を、臨界濃度を考慮して精製水に１０～２０μＭの濃度で添加することにより、自己組織化されたナノ構造体を製造した。
７．１ Ｆｍｏｃ－ＦＦ
合成されたＦｍｏｃ－ＦＦは、ＣＤ分光法の実験で、１９５ｎｍにおける正の最大楕円率（positive maximum ellipticity）と、２２０ｎｍにおける負の最小楕円率（negative minimum ellipticity）を示したことから、水溶液中で典型的なβシート二次構造を有していることが分かった。また、濃度による発光強度（emission intensity）の差から、１７μＭの臨界ミセル濃度（Critical micellar concentration、ＣＭＣ）を有することが分かった。このＦｍｏｃ－ＦＦは、水溶液中で５ｎｍの厚さを有するフィブリルを形成することをＴＥＭ（transmission electron microscopy）実験により確認した（図３）。
７．２ Ｆｍｏｃ－ＦＦＴ、Ｆｍｏｃ－ＦＦＶ、Ｆｍｏｃ－ＦＦＡ及びＦｍｏｃ－ＦＦＳ
合成されたＦｍｏｃ－ＦＦをベースとするＦｍｏｃ－ＦＦＴ、Ｆｍｏｃ－ＦＦＶ、Ｆｍｏｃ－ＦＦＡ及びＦｍｏｃ－ＦＦＳペプチドは、いずれもβシート二次構造を有することをＣＤ分光法により確認した（図４）。しかし、自己組織化ナノ構造体の形態は、化合物によって異なっていた（図５）。Ｆｍｏｃ－ＦＦにＴｈｒ残基を導入したＦｍｏｃ－ＦＦＴは、１Ｄフィブリル構造が維持されるのに対し、Ｆｍｏｃ－ＦＦＴにおけるＴｈｒ残基のヒドロキシル基がメチル基で置換されたＦｍｏｃ－ＦＦＶの場合には、疎水性の相互作用が強化されて２Ｄシート構造が形成された。メチル基もヒドロキシル基もないＦｍｏｃ－ＦＦＡの場合も、２Ｄシート構造またはリボン構造が形成された。メチル基が除去されたＦｍｏｃ－ＦＦＳの場合には、フィブリルをそのまま維持することが確認できた。
７．３ Ｆｍｏｃ－ＦＥＦＥＴ
Ｆｍｏｃ－ＦＥＦＥＴは、Ｆｍｏｃ－ＦＦＴと比べてＣＭＣが２２．８μｍに増加したことから、溶解度が向上したことが確認できた。また、βシート二次構造を有し、水溶液中で非常によく分散されたフィブリルを形成することをｃｒｙｏ－ＴＥＭとＴＥＭで確認した（図６）。
７．４ Ｆｍｏｃ－ＦＦ及びＦｍｏｃ－ＦＦＴの共組織化（co－assembly）
Ｆｍｏｃ－ＦＦ及びＦｍｏｃ－ＦＦＴを２：１（mole：mole）で混合し、ＦｍｏｃＦＦ：ＦｍｏｃＦＦＴの共組織化体を製造した。Ｆｍｏｃ－ＦＦ及びＦｍｏｃ－ＦＦＴとＣＭＣが類似していた。ＤＬＳ分光法により、共組織化体が均一な分散性を有し、ナノ構造体の形態は、フィブリルをそのまま維持することをＴＥＭ実験により確認した（図７）。
７．５ Ｆｍｏｃ－ＷＦＴ、Ｆｍｏｃ－ＷＷＴ及びＮａｐｈ－ＦＦＴ
Ｆｍｏｃ－ＷＦＴ及びＦｍｏｃ－ＷＷＴの場合は、それぞれランダムコイル、αヘリックス二次構造が優勢に形成されることを確認した。特に、ＦをすべてＷで置換したＦｍｏｃ－ＷＷＴの場合には、ヘリカルフィブリルが形成されることを確認した（図８）。
実施例１．結氷制御効果
実施例１．１ 金ナノ粒子の色変化を利用した抗凍結効果の分析（ＴＨ、ＩＲＩの評価）
抗凍結活性として、熱履歴現象（thermal hysteresis、ＴＨ）は、 Park,J.-I., Lee, J. H., Gwak, Y., Kim, H. J., Jin, E., & Kim, Y.-P. (2013). Frozen assembly of gold nanoparticles for rapid analysis of antifreeze protein activity. Biosensors and Bioelectronics, 41, 752-757に記載された方法で測定した。氷再結晶化の抑制（ice recrystallization inhibition、ＩＲＩ）活性は、Mitchell, D. E., Congdon, T., Rodger, A., & Gibson, M. I. (2015). Gold Nanoparticle Aggregation as a Probe of Antifreeze (Glyco) Protein-Inspired Ice Recrystallization Inhibition and Identification of New IRI Active Macromolecules. Scientific Reports, 5(1)に基づいて測定した。より具体的には、金ナノ粒子が分散された溶液にＡＦＰを分散させて溶液を冷凍した後、再度解凍するとき、ＡＦＰと氷結晶面の結合力が良い場合には、金ナノ粒子の分散性が良く、本来の溶液の色を維持するのに対して、結合力が弱くてＡＦＰを析出して氷結晶が急速に生成される場合には、溶液は色変化を起こる。
実施例１．１．１ 金ナノ粒子の合成
クエン酸で安定化された金ナノ粒子（Cit－AuNP）を合成し、メルカプトプロピオン酸（mercaptopropionic acid、ＭＰＡ）－ＡｕＮＰを製造した。１ｍＭのＨＡｕＣｌ４・３Ｈ２Ｏを含有する２０ｍＬの保存用溶液を５０ｍＬの精製水（deionized water、DI water）に添加した。前記溶液を攪拌しながら沸点まで加熱した後、２ｍＬの精製水中の３０ｍＭソジウムクエン酸を前記溶液にさらに添加し、２０分間加熱した。溶液の色は明るい黄色からバーガンディ色に変化した。その後、溶液を攪拌しながら室温まで冷却し、さらに１時間攪拌した。ＭＰＡ－ｃａｐｐｅｄ ＡｕＮＰの平均サイズは、約１６．７ｎｍで測定された。
実施例１．１．２ 比色分析（Colorimetric assay）
マイクロウェルプレートで０．５ｍＭの試料を含む溶液５０μＬを３００μＭ ＭＰＡ－ＡｕＮＰ溶液３５０μＬにそれぞれ添加した。対照群として３００μＭ ＭＰＡ－ＡｕＮＰ溶液３５０μＬを使用した。試料混合物が入れられたマイクロウェルプレートを－６５℃で２３分間冷却し、完全に溶けるまで室温で昇温した。凍結過程の間に５分ごとに試料を観察し、２０分経過した時点からは１分ごとに確認した。凍結前および解凍後の色の変化を定量的に確認するために、凍結前および解凍後に各混合物の吸収スペクトルをＵＨ５３００分光計で測定した。スペクトルは、４００ｎｍ／ｍｉｎスキャン速度で３００ｎｍ～９００ｎｍで測定し、各混合物の凝集特性（Ｅ５２５／Ｅ６５０）を比較した。
実施例１．１．３ ＢＳＡ、ＰＥＧのＴＨ及びＩＲＩ活性の測定
氷再結晶化の抑制効果を有することが知られているウシ血清アルブミン（Bovine Serum Albumin、ＢＳＡ）と、氷再結晶化の抑制効果のないポリエチレングリコール（Polyethelyene glycol、ＰＥＧ）を用いて、前記実験の信頼性を確認した。ＢＳＡの添加時は凝集が起こらず色の変化がなかったが、ＰＥＧの添加溶液は、色の変化が起きた。このことから、凝集が起こったことを確認した（図９）。この実験により、不凍効果の確認が可能なことを証明した。
実施例１．１．４ Ｆｍｏｃ－ＦＦ、Ｆｍｏｃ－ＦＦＸ、Ｆｍｏｃ－ＦＥＦＥＴ、Ｆｍｏｃ－ＦＦ：ＦｍｏｃＦＦＴ＝２：１、Ｆｍｏｃ－ＷＦＴ、Ｆｍｏｃ－ＷＷＴ、Ｎａｐｈ－ＦＦＴのＴＨ及びＩＲＩ活性の測定
５２５ｎｍで最も強い吸収を示す金粒子が溶液の冷凍／解凍後、特異的にＦｍｏｃ－ＷＦＴ及びＦｍｏｃ－ＷＷＴを添加した場合は凝集現象を示し、吸収ピークが６５０ｎｍで、一部が赤色偏移されたことを確認することができた（図１０）。これは、この２つの試料の場合は、他の試料とは異なり、二次構造がβシート形態から外れているため、表面のトレオニン（Ｔｈｒ）、すなわち、氷と結合する残基の規則的な配列が変わるためであると説明することができる。
実施例１．２ スプラット・アッセイ（splat assay）を用いたＩＲＩ活性の分析
氷結晶の成長抑制効果をより明確に確認するために、ＩＲＩ（Ice recrystallization inhibition）特性を分析した。氷再結晶化の分析は、Mitchell, D. E., Clarkson, G., Fox, D. J., Vipond, R. A., Scott, P., & Gibson, M. I. (2017). Antifreeze Protein Mimetic Metallohelices with Potent Ice Recrystallization Inhibition Activity. Journal of the American Chemical Society, 139(29), 9835-9838、及びBudke, C., Heggemann, C., Koch, M., Sewald, N., & Koop, T. (2009). Ice Recrystallization Kinetics in the Presence of Synthetic Antifreeze Glycoprotein Analogues Using the Framework of LSW Theory. The Journal of Physical Chemistry B, 113(9), 2865-2873を参照して行った。より具体的には、１０μＬの試料を１．５ｍの高さから、予め－６０℃に冷却したカバーガラスの表面に落として薄い氷膜を生成した。薄い氷膜が形成されたカバーグラスを－２０℃に設定されたペルチェ（Peltier）冷却器に移し、カバーガラスの表面を５ｍｉｎ－１の速度で－６℃まで昇温し、試料を３０分間アニーリングした。暗視野顕微鏡（ＤＦＯＭ）の画像を氷再結晶化の間に撮影し、画像から最も大きい１０個の粒子を選択して平均値を計算することにより、ＩＲＩ活性を評価した。平均最大粒径（mean largest grain size、ＭＬＧＳ）の分析は、３回繰り返し実験により行った。
Ｆｍｏｃ－ＦＦＴ、Ｆｍｏｃ－ＦＦＶ、Ｆｍｏｃ－ＦＦＡ及びＦｍｏｃ－ＦＦＳは、ＩＲＩ効果を持つことを確認した。凍結後の解凍時、氷再結晶の過程から得られたＤＦＯＭ画像（図１２ａ）を定量分析することにより、ＩＲＩ効果を決定した。最も高いＩＲＩ活性を示したのはＦｍｏｃ－ＦＦＴであり、その次には、ＦＦＡ、ＦＦＶ及びＦＦＳの順にＩＲＩ活性があることを示した。このことから、親水性および疎水性の残基の両方が存在することが凍結抑制活性において重要なことを確認した。つまり、親水性基は、水と水素結合を形成し、疎水性基は、間に水を閉じ込める方法で氷の成長を抑制できると考えられる。
Ｆｍｏｃ－ＦＥＦＥＴナノフィブリルの場合は、Ｆｍｏｃ－ＦＦＴと比較して、同等または少し高いＩＲＩ効果を有することを確認することができた。角錐面との結合を誘導したＦｍｏｃ－ＦＦとＦｍｏｃ－ＦＦＴを共組織化したナノフィブリルの場合は、より少し高いＩＲＩ効果を有することを確認することができた（図１３）。
また、Ｆｍｏｃ－ＦＦＴのＦｍｏｃをナフタレンで置換したＮａｐｈ－ＦＦＴ、および少なくとも１つのフェニルアラニンをトリプトファン、すなわち疎水性アミノ酸で置き換えたＦｍｏｃ－ＷＦＴ及びＦｍｏｃ－ＷＷＴの場合も、いずれもＩＲＩの効果を有することが示された（図１４）。
実施例２．幹細胞および生殖細胞に対する毒性の評価及び凍結保存の効果
実施例２．１ 細胞実験方法
実施例２．１．１ 動物
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（OrientBio Korea）を精子ドナー（１２～１５週齢）および卵子ドナー（８～１０週齢）として用いた。Ｃ５７ＢＬ／６をベースとして遺伝的に変異したマウスの１０種を体外受精（In Vitro Fertilization、ＩＶＦ）および胚移植に用いた。ＩＣＲマウス（８～１０週齢、SLC JAPAN）を２－細胞胚の受容体として使用した。
実施例２．１．２ 培地
精子を凍結保存するために、本発明に係る凍結保存剤が添加された１００ｍＭ Ｌ－グルタミン又は脱脂乳を含有する変更された１８％ラフィノースペンタハイドレート／３％脱脂乳（Difco、Becton Dickinson）溶液を製造した。ＩＶＦの過程では、ＨＴＦ（human tubal fluid）培地を使用し、２－細胞胚を胚盤胞ステップまで培養する間には、ＰＳＯＭ（potassium simplex optimized medium）を使用した。
実施例２．１．３ 精子の凍結及び解凍
６０μＬで分注された精子凍結保存溶液を３５ｍｍの培養皿に入れ、パラフィンオイルで覆った。雄マウスを頸部転位で犠牲にした後、精巣上体尾を除去して断片に分けた。凍結保存溶液に移す前に、顕微鏡で観察しながらすべての脂肪及び血液を除去した。培養皿を３７℃で３分間維持し、毎分丁寧に攪拌して組織から精子が分散されるようにした。精子を準備する間、凍結用ストロー（freezing straw）に１００μＬの凍結保存溶液および１５ｍｍの空気を１ｍＬの注射器を用いて注入した。精子懸濁液を凍結ストローに注入し、両端を密封した。密封されたストローを凍結用容器に移し、保存のために液体窒素に入れた。ＩＶＦ実験前に試料を液体窒素から取り出し、３７℃の恒温水槽で１０分間解凍した。
実施例２．１．４ 体外受精
成体雌マウスに７．５ＩＵのウマ絨毛性性腺刺激ホルモンを腹腔内注射して過排卵を誘導した。４８時間後に、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（human chorionic gonadotropin、ｈＣＧ）を７．５ＩＵ注入した。１５時間後、マウスを犠牲にして輸卵管を迅速に除去し、パラフィンオイルが入れられた受精用の皿に移した。その後、２匹～３匹の雌マウスのらっぱ管膨大部から４～６個の卵子卵丘複合体を得、卵子にＨＴＦ培地９０μＬを加えた。
様々な条件下で凍結された精子を解凍させ、卵子を含有するＩＶＦドロップ（drop）に添加し、３７℃で培養した（最終的な運動型精子の濃度：２００－４００ｓｐｅｒｍ／μｌ）。６時間後、受精された卵子をＨＴＦドロップで３回洗浄した。受精から２４時間後、全卵子数に対する２－細胞胚の合計数を百分率にして受精率を求めた。
実施例２．１．５ 胚培養及び着床
ＩＦＶを行った後、２－細胞胚を胚盤胞ステップで培養する群と、ＩＣＲ雌の輸卵管に着床させる群に分類した。出産後、子の数を記録した。
実施例２．１．６ 統計の分析
２つの群間の比較には、Student's t検定を用い、多数の群の比較には、一方または双方のＡＮＯＶＡｓを用いた。すべてのデータは、平均±ＳＥＭで表記した。*は、統計的に有意なレベルを示す（*、Ｐ＜０．０５、and **、Ｐ＜０．０１）。Ｐ＜０．０５は、統計的に有意なものと見なした。
実施例２．１．７ マウス胚性幹細胞の培養
マウスＥＳ細胞を０．１％ゼラチン（Sigma）がコーティングされた６０ｍｍ細胞培養皿で、分化を防ぐための２ｍＭ Ｌ－グルタミン（Mediatech Inc）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Mediatech Inc）、１５％熱不活性化された牛胎児血清（Hyclone）、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ｐＨ７．３（Cellgro）、０．１ｍＭ ＭＥＭ非必須アミノ酸（Cellgro）、０．１ｍＭ ２－メルカプトエタノール（Sigma）、及び１０００Ｕ／ｍＬ ＬＩＦ（Millipore）が添加されたＤＭＥＭ（Hyclone）培地で培養した。
実施例２．１．８ マウス胚性幹細胞の生存率の分析
マウスＥＳ細胞を前記の様々な凍結保存溶液が入れられた９６ウェルプレートでウェル当たり８×１０４細胞ずつ接種した。９時間後、ＣＣＫ－８試薬を添加し、ＥＬＩＳＡ Ｒｅａｄｅｒ（TECAN）を用いて蛍光強度を測定した。
実施例２．１．９ マウス胚性幹細胞の凍結及び解凍
トリプシン化されたマウスＥＳ細胞２５０μＬ、ＦＢＳ ２００μＬ及び凍結保存溶液５０μＬ（０．００５μＭ、０．０１μＭ、０．０５μＭ、０．１μＭ）を急速冷凍庫で２日間冷凍した後、ＬＮ２タンクで保存した。解凍は３７℃の恒温水槽で行った。細胞冷凍ストックの混合物は、１５ｍＬチューブの４．５ｍＬ培地に接種し、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。細胞ペレットに１ｍＬ培地を添加し、６ウェルプレートに接種した。
実施例２．１．１０ クリスタルバイオレット染色
マウスＥＳ細胞を２．５μＭ～１０μＭ凍結保存溶液中で１２時間培養した。細胞をＰＢＳ５００μＬで洗浄し、４％ＰＦＡ５００μＬを１５分間添加した。固定された細胞をＰＢＳ５００μＬで２回洗浄し、０．５％クリスタルバイオレット溶液を３０分間添加した。染色された細胞は、水道水で洗浄した。
実施例２．２ マウス胚性幹細胞（Mouse embryonic stem cells、mESCs）に対する毒性及び凍結保存効果
Ｆｍｏｃ－ＦＦ、Ｆｍｏｃ－ＦＦＴ、Ｆｍｏｃ－ＦＦＡ、Ｆｍｏｃ－ＦＥＦＥＴ及びＦｍｏｃ－ＦＦ＋Ｆｍｏｃ－ＦＦＴ（２：１mole：mole）の幹細胞に対して凍結保存効果を確認した。
実施例２．２．１ ＣＣＫ－８分析を用いたｍＥＳＣの細胞生存率の評価
化学的凍結防止剤であるＤＭＳＯを対照群とし、前記Ｆｍｏｃ－ＦＦ、Ｆｍｏｃ－ＦＦＴ、Ｆｍｏｃ－ＦＦＡ、Ｆｍｏｃ－ＦＥＦＥＴおよびＦｍｏｃ－ＦＦ＋Ｆｍｏｃ－ＦＦＴ（２：１mole：mole）に対して、５～２０ｕＭの範囲内でｍＥＳＣに処理し、ＣＣＫ－８分析法を用いて細胞生存率を確認した。
クリスタルバイオレット染色画像から確認できるように、ＤＭＳＯは細胞に対して高い毒性を示した。これに対して、本発明に係るＦｍｏｃ－ＦＦ、Ｆｍｏｃ－ＦＦＴ、Ｆｍｏｃ－ＦＦＡ、Ｆｍｏｃ－ＦＥＦＥＴ及びＦｍｏｃ－ＦＦ＋Ｆｍｏｃ－ＦＦＴ（２：１mole：mole）は、毒性を示さなかった（図１５ａ－ｃ）。このことから、本発明に係る材料は、生体適合性材料であることを確認した。
また、Ｆｍｏｃ－ＦＦＶ、Ｆｍｏｃ－ＦＦＳ、Ｆｍｏｃ－ＷＦＴ、Ｆｍｏｃ－ＷＷＴ及びＮａｐｈ－ＦＦＴもまた、ｍＥＳＣに対して相当なレベルの細胞生存率を示すことを確認した（図１６）。
実施例２．２．２ ｍＥＳＣに対する凍結保存活性
細胞保管溶液は、本発明に係る試料溶液１０％（ｖ／ｖ）、ＦＢＳ４０％（ｖ／ｖ）、Ｍｅｄｉａ５０％（ｖ／ｖ）で製造した。それを急速冷凍庫を用いて－８０℃で凍結させた後２日間細胞を保管し、液体窒素タンクに２日以上保管した後、解凍して実験に用いた。また、ＬＩＦ（leukemia inhibitory factor）と共に処理して細胞を培養することにより、幹細胞の分化能を確認した。対照群は、本発明に係る試料の代わりに精製水を添加した以外は、いずれも同様な条件で培養して分化させた。
本発明に係るＦｍｏｃ－ＦＦ、Ｆｍｏｃ－ＦＦＴ、Ｆｍｏｃ－ＦＦＡ、Ｆｍｏｃ－ＦＥＦＥＴおよびＦｍｏｃ－ＦＦ＋Ｆｍｏｃ－ＦＦＴ（２：１mole：mole）を用いて凍結及び解凍する場合には、ｍＥＳＣの生存および増殖が円滑に行われるのに対し、対照群の場合には、ほとんどの細胞が死滅することが確認された（図１７ａ）。また、ｍＥＳＣの細胞分化を４日後まで確認したところ（図１７ｂ）、本発明に係る材料は、幹細胞の凍結保存剤として使用でき、また高濃度でも細胞分化が良好に起こることを確認した（図１８）。
実施例２．３ 生殖細胞精子（sperm）の凍結保存効果
精子を３％脱脂乳；及びＦｍｏｃ－ＦＦ、Ｆｍｏｃ－ＦＦＴ、Ｆｍｏｃ－ＦＦＡ、Ｆｍｏｃ－ＦＦＳ、Ｆｍｏｃ－ＦＦＶ、Ｆｍｏｃ－ＷＦＴ、Ｆｍｏｃ－ＷＷＴ、Ｎａｐｈ－ＦＦＴ、またはＦｍｏｃ－ＦＦ＋Ｆｍｏｃ－ＦＦＴ（２：１mole：mole）と共に前記の実施例２．２．２の方法により凍結及び解凍した後、卵子に体外受精（IVF、in vitro fertilization）して胚細胞の生成有無を確認することにより、凍結及び解凍された生殖細胞が生殖機能を維持するかを確認した。また、マウスに直接的に受精卵を移植することにより、凍結保存された精子が本来の機能を維持するのかについて検討した。
まず、共組織化されたファイバー材料、Ｆｍｏｃ－ＦＦ＋Ｆｍｏｃ－ＦＦＴ（２：１mole：mole）および３％脱脂乳で精子を凍結させた後、卵子に受精させて形成された受精卵（fertilized egg）の数を確認した。２．５～７．５μＭで７０％以上、２．５～１０μＭで５０％以上の受精卵が成功的に形成されたことを確認した（図１９）。
また、前記本発明に係る９つの材料に対して、１０～２０μＭを含む３％脱脂乳で精子を凍結し、卵母細胞に注入した後、接合体の成長（Zygote Development）過程で２－細胞胚を分離した。その後、胚盤胞（Blastosysts）への成熟過程を確認することにより、凍結保存効果を確認しようとした（図２０）。すべてのサンプルは、解凍した精子を卵子に受精する際、６０％以上の割合で２－細胞胚が形成された。特異的にＦｍｏｃ－ＷＷＴの場合は、７７％以上の高効率で２－細胞胚が生成されたことを確認した。分離された２－細胞胚の胚盤胞の生成率は、いずれも７０％以上を示した。特に角錐面と結合を誘導した、共組織化されたＦｍｏｃ－ＦＦ＋Ｆｍｏｃ－ＦＦＴ（２：１mole：mole）の場合は、７０％以上の割合で２－細胞胚を形成し、９２％以上が胚盤胞を形成することを確認した。これは氷の成長を抑制するとともに、生成された氷の形状が針状ではない球状である氷の成長過程を誘導するためであると判断した。
胚盤胞は、受精卵が子宮壁に着床するときの形態であるので、６０個の２－細胞胚を３匹の雌マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）の子宮に注入したところ、生まれたマウスのうち５０～６０％のマウスが健康に生存することを確認した（図２１）。
実施例３．食品に対する結氷制御効果
Ｆｍｏｃ－ＦＦＴが食品の凍結保存剤として使用可能であるかを判断するために、牛肉（図２２ａ）にＦｍｏｃ－ＦＦＴを添加した後、－２０℃で１日間冷凍し、室温で解凍した後、ＳＥＭ画像を観察した（図２２ｂ及びｄ）。Ｆｍｏｃ－ＦＦＴを添加していない場合は、組織の表面が非常に荒くて大きな穴が発見されるのに対し（図２２ｂ）、Ｆｍｏｃ－ＦＦＴを添加した場合は、組織の表面が非常に滑らかで、組織の間の大きな穴があまり発見されなかった（図２２ｄ）。
凍結及び解凍後の牛肉組織を確認するために、Ｆｍｏｃ－ＦＦＴを水に添加し、－２０℃で凍らせた後、氷の再結晶過程を光学顕微鏡で観察したところ、Ｆｍｏｃ－ＦＦＴを添加した場合は（図２２ｅ）、Ｆｍｏｃ－ＦＦＴを添加していない場合（図２２c）と比較して、再結晶氷の大きさが顕著に小さいことを確認した。
また、組織の変化をより詳細に確認するために、解凍した組織を急速に液体窒素で凍らせて－２０℃を維持したまま切り、内部組織を観察した。Ｆｍｏｃ－ＦＦＴを肉に添加した場合（図２２ｅの右）は、Ｆｍｏｃ－ＦＦＴを添加していない場合（図２２ｃの右）と比較して、再結晶氷の大きさが顕著に小さいことを確認した。Ｆｍｏｃ－ＦＦＴを添加していない場合は、組織の穴の大きさが２２±８．６μｍであり、添加した場合は、５±２．３μｍであった。
例えば、特許請求の範囲の構築目的上、別添の特許請求の範囲は多少なりともその文字通りの意味より狭く構築されているものではなく、したがって明細書の代表的な実施形態が特許請求の範囲として読み取られることはない。したがって、本発明は説明のために記載されており、特許請求の範囲の範囲に限定を加えるものではないと理解される。したがって、本発明は、別添の特許請求の範囲によってのみ制限される。本出願で引用した全ての刊行物、交付された特許、特許出願、書籍及び学術論文はそれぞれ、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

Claims (19)

  1. 下記の化学式１又は化学式２で表される化合物を含む、結氷制御用組成物。
    Figure 0007162310000114
    Figure 0007162310000115
    （前記の化学式１又は２中、
    Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して
    Figure 0007162310000116
    または
    Figure 0007162310000117
     であり、
    Ｒ３は
    Figure 0007162310000118
     、
    Figure 0007162310000119
     、
    Figure 0007162310000120
     、
    Figure 0007162310000121
    または
    Figure 0007162310000122
     であり、
    Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立して
    Figure 0007162310000123
     または
    Figure 0007162310000124
     である。）
  2. 前記化合物は、自己組織化（self－assembly）されてフィブリル（fibril）またはシート（sheet）状の構造物を形成する、請求項１に記載の結氷制御用組成物。
  3. 下記化学式３で表される化合物をさらに含み、このとき、前記組成物は、前記化学式１で表される前記化合物を含み、前記化学式３で表される前記化合物及び前記化学式１で表される前記化合物を２：１（mole：mole）の割合で含む、請求項１に記載の結氷制御用組成物。
    Figure 0007162310000125
  4. 前記化学式１中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して
    Figure 0007162310000126
     または
    Figure 0007162310000127
     であり、Ｒ３は
    Figure 0007162310000128
     である、請求項３に記載の結氷制御用組成物。
  5. 下記化合物のうちの少なくとも一つを含む、請求項１に記載の結氷制御用組成物。
    Figure 0007162310000129
    Figure 0007162310000130
    Figure 0007162310000131
    Figure 0007162310000132
    Figure 0007162310000133
    Figure 0007162310000134
    Figure 0007162310000135
  6. 下記の化学式１又は化学式２で表される化合物を含む、細胞凍結用組成物。
    Figure 0007162310000136
    Figure 0007162310000137
    （前記の化学式１又は２中、
    Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して
    Figure 0007162310000138
    または
    Figure 0007162310000139
    であり、
    Ｒ３は
    Figure 0007162310000140
     、
    Figure 0007162310000141
     、
    Figure 0007162310000142
     、
    Figure 0007162310000143
    または
    Figure 0007162310000144
    であり、
    Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立して
    Figure 0007162310000145
    または
    Figure 0007162310000146
     である。）
  7. 前記化合物は、自己組織化（self－assembly）されてフィブリル（fibril）またはシート（sheet）状の構造物を形成する、請求項６に記載の細胞凍結用組成物。
  8. 下記化学式３で表される化合物をさらに含み、このとき、前記組成物は、前記化学式１で表される前記化合物を含み、前記化学式３で表される前記化合物及び前記化学式１で表される前記化合物を２：１（mole：mole）の割合で含む、請求項６に記載の細胞凍結用組成物。
    Figure 0007162310000147
  9. 前記化学式１中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して
    Figure 0007162310000148
    または
    Figure 0007162310000149
    であり、Ｒ３は
    Figure 0007162310000150
    である、請求項８に記載の細胞凍結用組成物。
  10. 下記化合物のうちの少なくとも一つを含む、請求項６に記載の細胞凍結用組成物。
    Figure 0007162310000151
    Figure 0007162310000152
    Figure 0007162310000153
    Figure 0007162310000154
    Figure 0007162310000155
    Figure 0007162310000156
    Figure 0007162310000157
  11. 前記細胞は、精子、卵子、上皮細胞、神経細胞、表皮細胞、角質細胞、造血細胞、メラニン細胞、軟骨細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、赤血球、マクロファージ、単核球、線維芽細胞、筋肉細胞、胚性幹細胞、間葉系幹細胞、または成体幹細胞である、請求項６に記載の細胞凍結用組成物。
  12. 下記の化学式１又は化学式２で表される化合物を含む、食品凍結用組成物。
    Figure 0007162310000158
    Figure 0007162310000159
    （前記の化学式１又は２中、
    Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して
    Figure 0007162310000160
    または
    Figure 0007162310000161
    であり、
    Ｒ３は
    Figure 0007162310000162
     、
    Figure 0007162310000163
     、
    Figure 0007162310000164
     、
    Figure 0007162310000165
    または
    Figure 0007162310000166
    であり、
    Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立して
    Figure 0007162310000167
    または
    Figure 0007162310000168
    である。）
  13. 前記化合物は、自己組織化（self－assembly）されてフィブリル（fibril）またはシート（sheet）状の構造物を形成する、請求項１２に記載の食品凍結用組成物。
  14. 下記化学式３で表される化合物をさらに含み、このとき、前記組成物は、前記化学式１で表される前記化合物を含み、前記化学式３で表される前記化合物及び前記化学式１で表される前記化合物を２：１（mole：mole）の割合で含む、請求項１２に記載の食品凍結用組成物。
    Figure 0007162310000169
  15. 前記化学式１中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して
    Figure 0007162310000170
    または
    Figure 0007162310000171
    であり、Ｒ３は
    Figure 0007162310000172
    である、請求項１４に記載の食品凍結用組成物。
  16. 下記化合物のうちの少なくとも一つを含む、請求項１２に記載の食品凍結用組成物。
    Figure 0007162310000173
    Figure 0007162310000174
    Figure 0007162310000175
    Figure 0007162310000176
    Figure 0007162310000177
    Figure 0007162310000178

    Figure 0007162310000179
  17. 下記の化学式１又は化学式２で表される化合物を溶媒に添加するステップを含む、結氷制御方法。
    Figure 0007162310000180
    Figure 0007162310000181
    （前記の化学式１又は２中、
    Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して
    Figure 0007162310000182
    または
    Figure 0007162310000183
    であり、
    Ｒ３は
    Figure 0007162310000184
     、
    Figure 0007162310000185
     、
    Figure 0007162310000186
     、
    Figure 0007162310000187
    または
    Figure 0007162310000188
    であり、
    Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立して
    Figure 0007162310000189
    または
    Figure 0007162310000190
    である。）
  18. 下記の化学式１又は化学式２で表される化合物を細胞に処理するステップを含む、細胞凍結保存方法。
    Figure 0007162310000191
    Figure 0007162310000192
    （前記の化学式１又は２中、
    Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して
    Figure 0007162310000193
    または
    Figure 0007162310000194
    であり、
    Ｒ３は
    Figure 0007162310000195
     、
    Figure 0007162310000196
     、
    Figure 0007162310000197
     、
    Figure 0007162310000198
    または
    Figure 0007162310000199
    であり、
    Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立して
    Figure 0007162310000200
    または
    Figure 0007162310000201
    である。）
  19. 下記の化学式１又は化学式２で表される化合物を食品に処理するステップを含む、食品凍結保存方法。
    Figure 0007162310000202
    Figure 0007162310000203
    （前記の化学式１又は２中、
    Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して
    Figure 0007162310000204
    または
    Figure 0007162310000205
    であり、
    Ｒ３は
    Figure 0007162310000206
     、
    Figure 0007162310000207
     、
    Figure 0007162310000208
     、
    Figure 0007162310000209
    または
    Figure 0007162310000210
    であり、
    Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立して
    Figure 0007162310000211
    または
    Figure 0007162310000212
     である。）
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