KR20230067477A - 금속-유기 구조체를 포함하는 얼음 결정의 형성 또는 성장 억제용 조성물 및 이의 제조 방법 - Google Patents

금속-유기 구조체를 포함하는 얼음 결정의 형성 또는 성장 억제용 조성물 및 이의 제조 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 지르코늄계 금속-유기 구조체(Metal-organic framework, MOF)를 포함하는 얼음 결정의 형성 또는 성장 억제용 조성물 및 이의 제조 방법에 관한 것으로, 구체적으로 금속-유기 구조체 입자의 크기 제어 및 표면 개질을 통한 아미노산 결합을 통해 얼음 결정의 형성 또는 성장을 효과적으로 억제한다.

Description

금속-유기 구조체를 포함하는 얼음 결정의 형성 또는 성장 억제용 조성물 및 이의 제조 방법{COMPOSITIONS INCLUDING METAL ORGANIC FRAME FOR INHIBITING FORMATION AND GROWTH OF ICE CRYSTALLIZATION AND PREPARING METHOD THEREOF}
본 발명은 금속-유기 구조체를 포함하는 얼음 결정의 형성 또는 성장 억제용 조성물 및 이의 제조 방법 에 관한 것이다.
동결은 제약, 식품 산업 등에서 주변 환경 요인에 의한 오염을 차단하면서 물질을 보존하기 위한 방법으로 광범위하게 사용된다. 다만, 동결 과정에서 물질은 낮은 온도에 노출되면 동결 대상 물질이 기능에 손상을 입는 경우가 많고, 특히 세포는 해동 전후 과정에서 세포의 동일성과 생존율을 확보하기 어려우므로, 이러한 세포를 생리기능이 회복될 수 있는 상태로 동결, 보존할 수 있는 기술이 필요하며, 특히 최근 코로나 19 백신의 보관 및 운반과 관련하여 초저온/냉동 보관 기술에 대한 관심이 높다.
자연계에 존재하는 항-동결 단백질 (antifreeze protein, AFP), 즉 어류, 식물, 또는 곤충에서 단리된 단백질의 경우 얼음 형성을 방지하는데 효과적이지만, 현재 이용 가능한 동결방지제 단백질은 순도가 낮고 생산 단가가 높아 산업에서 이용하기에 비효율적이다. 또한, 대표적인 화학적 동결 방지제인 DMSO(dimethyl sulfoxide)는 뇌를 퇴화시키거나 신경독으로 작용하는 등 생체 독성을 나타내는 단점이 있으며, 사용 후 제거가 용이하지 않다.
따라서 상기와 같은 문제점이 개선된 새로운 항동결제의 개발에 대한 필요가 절실하다.
한국등록특허 제10-1439231호
본 발명은 신규하고 효과적인 얼음 결정의 형성 또는 성장 억제용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 신규하고 효과적인 세포 또는 조직 동결 보존용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 신규하고 효과적인 식품 동결 보존용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 신규하고 효과적인 얼음 결정의 형성 또는 성장 억제용 조성물 제조 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
1. 지르코늄을 중심금속으로 하는 금속-유기 구조체(Metal-organic framework, MOF) 입자를 포함하고,
상기 입자 표면의 지르코늄은 인접한 지르코늄과 하기 화학식 1로 표시되는 구조의 결합을 포함하는 것인, 얼음 결정의 형성 또는 성장 억제용 조성물:
[화학식 1]
Figure pat00001
(식 중, Zr은 상기 입자 표면의 지르코늄이고,
R1 및 R2 는 각각 탄소수 1 내지 5인 알킬이고,
R3은 Thr, Val, Ala, Ser 및 Gly으로 구성된 군에서 선택된 것임).
2. 위 1에 있어서, 상기 입자의 크기는 35nm이하인 것인, 얼음 결정의 형성 또는 성장 억제용 조성물.
3. 위 1에 있어서, 상기 금속-유기 구조체는 푸마레이트를 유기 리간드로 하는 것인, 얼음 결정의 형성 또는 성장 억제용 조성물.
4. 위 1 내지 3 중 어느 하나의 조성물을 포함하는 세포 또는 조직 동결 보존용 조성물.
5. 위 1 내지 3 중 어느 하나의 조성물을 포함하는 식품 동결 보존용 조성물.
6. 지르코늄을 중심금속으로 하는 금속-유기 구조체(Metal-organic framework, MOF) 입자를 말단에 카복실기를 포함하는 아크릴레이트로 표면 개질하는 제1 단계; 및
상기 표면 개질된 금속-유기 구조체 입자에 Thr, Val, Ala, Ser 및 Gly으로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산을 처리하여, 상기 아크릴레이트에 상기 아미노산을 결합시키는 제2 단계;를 포함하는 얼음 결정의 형성 또는 성장 억제용 조성물 제조 방법.
7. 위 6에 있어서, 상기 금속-유기 구조체는 푸마레이트를 유기 리간드로 포함하는 것인, 얼음 결정의 형성 또는 성장 억제용 조성물 제조방법.
8. 위 6에 있어서, 상기 제1 단계 전, 35nm 이하의 크기로 상기 금속-유기 구조체 입자를 제조하는 단계를 더 포함하는, 얼음 결정의 형성 또는 성장 억제용 조성물 제조방법.
본 발명은 얼음 재결정화를 효과적으로 억제하고, 세포 독성이 낮아 식품, 의약품 등에 활용하기 적합하며, 저가의 공정으로 대량 제조가 가능한 얼음 결정의 형성 또는 성장 억제용 조성물, 세포 또는 조직 동결 보존용 조성물 또는 식품 동결 보존용 조성물을 제공한다.
본 발명은 얼음 재결정화를 효과적으로 억제하고, 세포 독성이 낮아 식품, 의약품 등에 활용하기 적합하며, 저가의 공정으로 대량 제조가 가능한 얼음 결정의 형성 또는 성장 억제용 조성물의 제조 방법을 제공한다.
도 1a는 MOF의 구조를 도식화하고, 여러 크기의 MOF 입자의 제조 후 해당 TEM 이미지를 나타낸 것이다.
도 1b-d는 MOF-801의 분석 결과로, 도 1b는 N2 adsorption-desorption isotherms, 도 1c는 FT-IR spectra, 도 1d는 X선 회절 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 MOF 입자의 표면을 아크릴레이트 기능기로 개질화한 TEM 이미지를 나타낸 것이다.
도 3a-b는 입자 크기별 MOF의 IRI 활성을 나타낸 것으로 도 3a는 splat assay 결과를, 도 3b IRI 효과를 평균최대입자크기(mean largest grain size, MLGS)로 나타낸 것이다.
도 4a-b는 입자 크기별 MOF-acrylate의 IRI 활성을 나타낸 것으로, 도 4a는 splat assay 결과를, 도 4b는 IRI 효과를 평균최대입자크기(mean largest grain size, MLGS)로 나타낸 것이다.
도 5a-b는 각 MOF의 세포 생존율을 나타낸 것이다. 도 5a는 입자 크기 및 표면 개질화 여부별, 도 5b는 MOF-801 10nm의 농도별 A549: lung carcinoma (폐암종), 293T: kidney (embryo) cell, BEAS2B: non-tumorigenic lung epithelial cell (비유전성 폐상피세포)에서의 세포 생존율을 나타낸 것이다.
도 6은 MOF-801 NP의 293T cell에 대한 세포 내재화를 유세포 분석 히스토그램(좌) 및 CLSM 이미지(우)를 통해 확인한 것이다.
도 7a-b는 293T : kidney (embryo) cell을 대상으로 세포 동결보존 효과를 나타낸 것으로, DMSO를 대조군으로 사용하였다. 도 7a는 TEM 이미지를, 도 7b는 입자 크기별 MOF 및 MOF-Acrylate의 DMSO에 대한 상대적인 세포 동결보존 효과를 나타낸 것이다.
도 8은 MOF-Acryl에 대한 아미노산 결합을 도식화하여 나타낸 것이다.
도 9는 MOF-Acryl의 FT-IR 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 10a-c는 MOF-Acryl에 아미노산을 결합한 FT-IR 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 MOF, MOF-Acryl, MOF-Acryl/Val 및 MOF-Acryl/Thr의 XPS 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 12a-b는 아미노산 결합된 MOF-Acryl에 아미노산을 결합한 IRI 효과를 나타낸 것으로, 도 12a는 splat assay 결과를, 도12b는 IRI 효과를 평균최대입자크기(mean largest grain size, MLGS)로 나타낸 것이다.
도 13은 MOF, MOF-Acryl, MOF-Acryl/Val 및 MOF-Acryl/Thr의 IRI 억제 효과를 함께 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 설명한다.
본 발명은 지르코늄을 중심금속으로 하는 금속-유기 구조체(Metal-organic framework, MOF) 입자를 포함하고, 상기 입자 표면의 지르코늄은 인접한 지르코늄과 하기 화학식 1로 표시되는 구조의 결합을 포함하는 것인, 얼음 결정의 형성 또는 성장 억제용 조성물에 관한 것이다.
[화학식 1]
Figure pat00002
(식 중, Zr은 상기 입자 표면의 지르코늄이고, R1 및 R2 는 각각 탄소수 1 내지 5인 알킬이고, R3은 Thr, Val, Ala, Ser 및 Gly으로 구성된 군에서 선택된 것임).
상기 금속-유기 구조체(Metal-organic framework, MOF)는 금속이 유기물질에 의해 연결되어 네트워크를 형성한 규칙적인 결정성 물질을 의미한다. 구체적으로, 중심금속 이온(또는 금속클러스터)으로 구성된 2차합성단위(secondary building unit, SBU)와 이들을 연결하는 유기 리간드인 링커(linker)로 구성될 수 있다. MOF의 기하구조는 SBU의 물성에 의존하며, 기공도는 링커의 길이에 따라 변한다.
본 발명 조성물은 지르코늄이 중심금속으로 사용된 지르코늄계 MOF를 포함한다. 지르코늄은 세포 독성이 낮은 금속으로 이를 기반으로 한 MOF는 의약품, 식품 등에 사용되기에 적합하며, 지르코늄계 MOF로는 예를 들면 MOF 801, MOF-802, UiO-66, MOF-808, MOF-841, DUT-67, PIZOF-2, MOF-804, MOF-805 및 MOF-806 이 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 SBU는 예를 들면 Zr6O4(OH)4(-CO2)12, Zr6O4(OH)4(-CO2)10, Zr6O4(OH)4(-CO2)9 또는 Zr6O4(OH)4(-CO2)6일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 유기 리간드를 링커(linker)라고도 하며, 배위결합할 수 있는 작용기를 가진 어떠한 유기 화합물도 이용할 수 있고, 예를 들어 카르복실기(-COOH), 카르복실산 음이온기(-COO-), 아민기(-NH2) 및 이미노기(=NH), 니트로기(-NO2), 히드록시기(-OH), 할로겐기(-X) 및 슬폰산기(-SO3H), 술폰산 음이온기(-SO3-), 메탄디티오산기(-CS2H), 메탄디티오산 음이온기(-CS2-), 피리딘기 및 피라진기로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 작용기를 갖는 화합물 또는 이의 혼합물을 중심금속과 결합시켜 사용할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들면 상기 유기 리간드는 푸마레이트, 숙시네이트, 글루타레이트, 무코네이트, 아디페이트, 2,5-티오펜디카르복실레이트, 테레프탈레이트, 2,5-피라진 디카르복실레이트, 나프탈렌-2,6-디카르복실레이트, 비페닐-4,4'-디카르복실레이트, 아조벤젠디카르복실레이트, 디클로로아조벤젠디카르복실레이트, 아조벤젠테트라카르복실레이트, 디하이드 록소아조벤젠디카르복실레이트, 벤젠-1,2,4-트리카르복실레이트, 벤젠-1,3,5-트리카르복실레이트, 벤젠1,3,5-트리벤조에이트, 1,3,5-트리스[4'-카르복시(1,1'-비페닐-4-yl)벤젠, 벤젠-1,2,4,5-테트라카르복실레이 트, 나프탈렌-2,3,6,7-테트라카르복실레이트, 나프탈렌-1,4,5,8-테트라카르복실레이트, 비페닐-3,5,3',5'-테 트라카르복실레이트, 2-아미노테레프탈레이트, 2-니트로테레프탈레이트, 2-메틸테레프탈레이트, 2-클로로 테레프탈레이트, 2-브로모테레프탈레이트, 2,5-디하이드록소테레프탈레이트, 테트라플루오로테레프탈레이트, 2,5-디카르복시테레프탈레이트, 디메틸-4,4'-비페닐디카르복실레이트, 테트라메틸-4,4'-비페닐디카르복실레이트, 또는 디카르복시-4,4'-비페닐디카르복실레이트일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
얼음 결정은 얼음 재결정화를 통해 성장할 수 있는데, 이는 작은 얼음 결정으로부터 더 큰 얼음 결정으로 성장하는 과정을 의미하고, 이 성장은 오스왈드 숙성(Ostwald ripening) 메커니즘을 따라 일어난다. 오스왈드 숙성은 상온 및 결정 사이 표면 에너지 차이로 인한 압력으로 인해 융해-확산-재동결 또는 승화-확산-응축 메커니즘으로 진행될 수 있다. 즉, 얼음 결정의 성장은 얼음끼리 붙어서 성장하는 것이 아닌, 작은 얼음 결정이 결정 사이에서 융해되어 큰 얼음 결정쪽으로 확산된 후 큰 얼음 결정의 일부가 되어 재동결되면서 일어난다.
상기 입자의 크기는 예를 들면 100nm 이하, 95nm 이하, 90nm 이하, 85nm 이하, 80nm 이하, 75nm 이하, 70 nm 이하, 65 nm 이하, 60 nm 이하, 55 nm 이하, 50 nm 이하, 45 nm 이하, 40 nm 이하, 35nm 이하, 30 nm 이하, 25 nm 이하, 20 nm 이하, 15 nm 이하, 10 nm 이하인 것일 수 있으며, 바람직하게는 35 nm 이하, 10 nm 이하일 수 있다.
상기 MOF는 격자 구조로 인해 규칙적인 간격으로 얼음 결정 표면에 수소 공여체를 제공하여 얼음 결정 격자와 맞아 떨어짐으로써 얼음 결정의 형성 또는 성장을 억제할 수 있으며, 본 발명 실시예에서와 같이 MOF 입자의 크기가 적을수록, 예를 들면 100nm 이하, 35nm 이하, 10nm 이하에서 높은 효과가 나타난다.
본 발명의 조성물은 상기 MOF 입자의 표면을 개질화한 화합물을 포함하며, 구체적으로 얼음 결정에 결합하는 것으로 알려진 아미노산, 예를 들면 Thr, Val, Ala, Ser 또는 Gly이 MOF 입자에 결합한 것일 수 있다. 상기 개질을 통해 물에 대한 용해도와 안정성을 향상시키고 추가적인 동결 방지 효과를 얻을 수 있다.
상기 아미노산 도입은 생체 분자인 아미노산을 도입함으로써 생체 적합성이 증가한 이점이 있다. 또한, 추가적인 아미노산 도입으로 물 분자와의 직접적인 수소 결합을 유도할 수 있으며, 소수성 효과를 유도하여 물 분자를 밀어냄으로써 얼음 결정 성장을 저해할 수 있다. MOF가 일정한 격자를 가진다는 특징을 이용하여, 여기에 아미노산을 도입하였을 때, 물 분자와 직접적으로 작용할 수 있는 기능기를 일정한 격자 간격을 가지고 배열시킬 수 있다.
즉, 본 발명의 조성물은 얼음 결정의 성장 또는 형성 억제 효과가 우수할 뿐만 아니라 생체 친화적이므로 세포 또는 조직의 동결보존제로, 예를 들면 식품 또는 의약품 분야에서 동결 보존에 이용될 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물에 포함되는 화합물은 천연 단백질인 AFP와 비교하여 생산이 용이하고, 고분자 동결보존제에 비하여 구조적, 기능적 변화를 주기 용이하다는 장점이 있다.
본 발명의 조성물은 종래에 알려진 항동결능을 갖는 물질을 더 포함할 수 있다. 예를 들면, DMSO(dimethyl sulfoxide), 글리세롤, 1,2-프로판-디올, 수크로오즈, 글루코오스, 프롤린, 갈락토오스, 락토오스, 글리신 베타인, 또는 프룩토오스를 포함하는 것일 수 있다. 또한, 세포 동결 보존 또는 식품 동결 보존에 이용하는 경우에는 세포 독성이 낮은 수크로오스, 글루코오스, 락토오스, 글리신 베타인, 또는 프룩토오스를 포함하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 전술한 얼음 결정의 형성 또는 성장 억제용 조성물 중 어느 하나를 포함하는 세포 또는 조직 동결 보존용 조성물에 관한 것이다.
동결 보존이란 보존 대상을 동결시키는 과정을 거쳐 초저온 상태에서 보관 후 필요할 때 해동하여 사용할 수 있도록 하는 방법이다. 동결 보존시 세포 사멸을 초래하는 생화학 반응을 포함하는 모든 생물 활성이 효과적으로 정지된다.
세포 또는 조직을 동결 보존하면, 이후 사용하고자 할 때 동결된 세포 또는 조직을 녹이는 과정에서 얼음 재결정화가 일어날 수 있다. 얼음 재결정화가 발생되는 경우, 얼음 결정이 성장함에 따라 세포 막이 손상되고 세포 탈수가 진행되어 세포 및 조직에 손상을 입힌다. 즉, 저온 환경에 사는 유기체들은 얼음 재결정화로 인해 더 쉽게 손상을 받을 수 있다.
본 발명의 세포 또는 조직 동결 보존용 조성물은 얼음 형성 또는 재결정화를 억제시켜, 얼음 결정 성장으로 인하여 세포 또는 조직이 사멸되는 것을 막을 수 있다.
본 발명의 세포 또는 조직 동결 보존용 조성물은 통상 보존을 위해 동결하여 사용하는 모든 세포 또는 조직이 그 적용 대상이 될 수 있다. 적용 대상이 되는 세포는 예를 들면, 원핵 세포; 진핵 세포; 미생물; 동물 세포; 암 세포, 정자; 난자; 성체 줄기 세포, 배아 줄기 세포, 역분화 줄기 세포를 포함하는 줄기 세포; 제대혈, 백혈구, 적혈구, 및 혈소판을 포함하는 혈액 세포; 신장 세포, 간 세포, 및 근육 세포를 포함하는 조직 세포일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 적용 대상이 되는 조직은 예를 들면, 각막, 신장, 심장, 소장, 췌장, 폐, 간 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 세포 또는 조직 동결 보존용 조성물은 예를 들면 전술한 얼음 결정의 형성 또는 재결정 억제용 조성물 외에 세포, 조직 동결 보존을 위한 보존액을 포함할 수 있다. 보존액은 물, 식염수, PBS (phosphate buffered saline), 각종 세포 배양액 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 전술한 조성물 중 어느 하나의 조성물을 포함하는 식품 동결 보존용 조성물에 관한 것이다.
동결 보존은 전술한 범위 내의 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
식품을 동결 보존하면, 이후 사용하고자 할 때 동결된 식품을 녹이는 과정에서 얼음 재결정화가 일어날 수 있다. 얼음 재결정화가 발생되는 경우, 수분으로부터 발생된 얼음 결정이 성장하게 되는데 이는 식품에 존재하는 세포 또는 조직을 파괴하여 식감 저하를 초래한다.
본 발명의 식품 동결 보존용 조성물은 얼음 결정의 형성 또는 재결정화를 억제시켜, 얼음 결정 성장으로 인한 삼투압 변화나 식품 내 세포 또는 조직이 사멸되는 것을 막아 식품 품질 저하를 최소화할 수 있다.
본 발명의 식품 보존용 조성물은 통상 보존을 위해 동결하여 사용하는 모든 식품이 그 적용 대상이 될 수 있다. 적용 대상이 되는 식품은 육류, 어패류, 과채류 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 지르코늄을 중심금속으로 하는 금속-유기 구조체(Metal-organic framework, MOF) 입자를 말단에 카복실기를 포함하는 아크릴레이트로 표면 개질하는 제1 단계; 및 상기 표면 개질된 금속-유기 구조체 입자에 Thr, Val, Ala, Ser 및 Gly으로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산을 처리하여, 상기 아크릴레이트에 상기 아미노산을 결합시키는 제2 단계;를 포함하는 얼음 결정의 형성 또는 성장 억제용 조성물 제조 방법에 관한 것이다.
상기 지르코늄을 중심금속으로 하는 금속-유기 구조체에 대해서는 전술한 바와 같으며, 상기 MOF는 예를 들면 푸마레이트를 유기 리간드로 하는 것일 수 있다.
상기 말단에 카복실기를 포함하는 아크릴레이트는 MOF와 아미노산과의 결합을 매개하기 위한 것으로, 상기 제1 단계는 예를 들면 ligand exchange에 의해 MOF 표면의 유기 리간드가 상기 아크릴레이트로 교체되는 것일 수 있다.
상기 제2 단계는 용매 또는 비용매 조건에서 아미노산 분자와 MOF-Acryl의 Aza-Michael addition 반응을 통해 이루어질 수 있다. 상기 용매는 EtOH, DMF, THF 등 MOF와 아미노산이 잘 녹을 수 있는 용매라면 특별히 제한되지 않는다. 구체적으로 아크릴레이트 말단의 불포화결합 부분이 아미노산의 -NH2와 결합한다.
상기 아크릴레이트는 말단에 카르복시기를 포함하는 아크릴레이트면 특별히 제한되지 않으며, 바람직하게는 2-carboxyethyl acrylate일 수 있고, 2-carboxyethyl acrylate와 같이 간결한 구조를 가지는 아크릴레이트를 이용시, MOF 입자 표면에 아미노산이 근접하게 도입되어 MOF 입자 크기 제어에 대한 효과와 아미노산 도입의 효과를 동시에 볼 수 있고, 근접한 분자가 아미노산의 기능기를 잘 가리지 않는 이점이 있다.
상기 표면 개질은 예를 들면 상기와 같은 화학반응을 통해 MOF의 표면에 기능기를 부착하는 등 MOF 표면을 변형시키는 것을 의미한다.
상기 제조 방법은 상기 제1 단계 전, 예를 들면 100nm 이하, 95nm 이하, 90nm 이하, 85nm 이하, 80nm 이하, 75nm 이하, 70 nm 이하, 65 nm 이하, 60 nm 이하, 55 nm 이하, 50 nm 이하, 45 nm 이하, 40 nm 이하, 35nm 이하, 30 nm 이하, 25 nm 이하, 20 nm 이하, 15 nm 이하, 10 nm 이하 35nm 이하의 크기로 상기 금속-유기 구조체 입자를 제조하는 단계를 포함할 수 있으며, 바람직하게는 35 nm 이하, 10 nm 이하일 수 있다. 전술한 바와 같이 MOF는 작은 입자 크기일 때 우수한 얼음 결정의 형성 또는 성장 억제 효과가 나타난다.
이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다.
실시예
1. MOF 입자의 제조 및 개질화
1-1. 크기 제어된 MOF 입자의 제조
입자 크기에 따른 MOF의 항동결 효과를 확인하기 위하여, 약 10nm, 35nm, 100nm, 250nm로 크기가 제어된 MOF 입자를 제조하였다. Fumaric acid (1.16 g) (Sigma Aldrich, Germany) 및 ZrOCl2·8H2O (3.2 g) (Sigma Aldrich, Germany)를 40 mL DMF/포름산 의 혼합 용매에 용해시키고, 6시간 동안 130℃로 가열하여 흰색 침전물을 얻었다. 합성된 MOF-801은 20 mL의 깨끗한 DMF로 3회 및 20 mL의 메탄올로 3회 세척하였다. 그 다음 고체를 24 시간 동안 100℃에서 말려 샘플을 수득하였다.
도 1a에 MOF-801 NP 구조를 도식화하고 여러 크기로 제조된 MOF 입자 이미지를 나타내었으며, 고해상도 TEM(HRTEM) 측정 결과를 통해 MOF-801 NP의 격자 무늬는 ZrO2의 (011) 면을 나타내는 3.04Å임을 확인하였다. 에너지 분산 분광법 (EDS) 매핑을 통한 스캐닝 TEM (STEM) 원소 분석은 ZrO2 및 푸마르산염에서 Zr 및 O의 존재를 보여준다.
N2 adsorption-desorption isotherms 분석을 결과로부터(도 1b) MOF-801의 영구 다공성을 확인할 수 있으며, 특히 10 nm NP의 나노기공성(nanoporous)이 매우 높다.
도 1c의 FT-IR spectra 결과를 살펴보면, -COO-에서 1575 cm-1에 위치하는 비대칭 신축 진동 피크가 푸마르산에서 유래한 1400 cm-1에서 대칭 신축 진동 피크의 이동과 함께 나타나 MOF-801 NP의 형성을 확인할 수 있다.
제조된 크기별 MOF-801 NP에 대해 X선 회절 분석(PXRD)을 시행하였으며(도 1d), 회절 패턴은 시뮬레이션된 결정학적 데이터 및 표준 값과 일치하였다. 격자 매개변수는 각 MOF-801 NP에 대해 17.88 ± 0.05Å 범위로 계산되었으며, 이는 벌크 재료에 대해 알려진 격자 매개변수 17.91Å에 매우 가깝다. 또한 MOF-801 NP의 크기가 작아짐에 따라 peak broadening이 관찰되었으며, 이는 NP의 곡률이 높아질수록 interlayer ordering constraints이 부여된 것이다.
1-2. MOF 입자의 아크릴레이트를 이용한 표면 개질화
제조된 MOF에 ice-binding moiety를 도입하기 위하여, MOF를 2-carboxyethylacrylate를 이용하여 표면 개질화 하였다.
구체적으로, MOF-801에 ligand exchange 방법을 이용하여 MOF 표면에 결합한 링커 푸마르산을 2-carboxyethylacrylate로 교체할 수 있으며, 당업자가 적절한 촉매를 처리할 수 있다. 실험 용매로는 에탄올을 사용하였으며, 이는 간단한 실험 방법으로 표면 개질된 MOF의 대량 생산에 용이하다.
Acrylate-functionalization은 에탄올 용매 상에서 진행 되었다. MOF-801과 2-carboxyethylacrylate를 에탄올 용매에 함께 녹인 후, ligand exchange가 일어날 때, 활성화 에너지를 줄일 수 있는 hydrofluoric acid를 촉매로서 사용하였다. 반응은 24 시간 동안 진행 되었고, 합성된 MOF-801-Acryl은 메탄올, 에탄올, DMF 순서대로 washing 된 후, 건조시켜 샘플을 수득하였다.
2. MOF 입자의 IRI(Ice Recrystallization Inhibition) 효과
제조된 MOF 입자의 얼음 결정 성장 억제 효과를 확인하기 위해 IRI (ice recrystallization inhibition) 활성을 분석하였다. 통상적으로 알려진 스플랏 에세이(splat assay)를 통해 IRI 효과를 확인하였다.
IRI 활성은 Charles A. Knight, John Hallett, A. L. DeVries (1988). Solute effects on ice recrystallization: An assessment technique. Cryobiology, 25(1)에 기초하여 측정하였다.
IRI 활성은 Charles A. Knight, John Hallett, A. L. DeVries (1988). Solute effects on ice recrystallization: An assessment technique. Cryobiology, 25(1)에 기초하여 측정하였다. 0.5 mg/ml 농도의 10 μL 샘플을 1.0m 높이에서 냉각된(-150 ℃) 커버 슬립 표면으로 떨어뜨려 얇은 얼음 막을 만든다. 얼음 박막이 있는 유리 커버 슬립이 -20 ℃에서 nanolilter osmometer (Otago Osmometers, Dunedin, New Zealand)로 옮겨졌다. 그 후 유리 덮개 슬립의 온도를 -6 ℃까지 점진적으로 증가시켰고, 샘플은 30 min 동안 관찰되었다. 얼음 결정을 관찰하기 위해 일반 광학 현미경에 편광판을 장치한 편광 광학 현미경 영상을 얻었다. 편광 광학 현미경 영상은 Polarizing Microscope ECLIPSE LV100POL(Nikon, Tokyo, Japan)를 이용하여 촬영되었다. 시야에서 가장 큰 도메인 30개를 선택하고 IRI 활동을 평가하기 위해 평균을 구했다. 평균 최대 입자 크기 (mean largest grain size, MLGS) 분석은 각각의 개별 실험에서 평균화 되었다.
실험 결과 지르코늄 기반 MOF는 물에 대한 용해도가 높고 안정성이 뛰어나 모든 샘플군에서 IRI 효과가 확인되었으며, 특히 입자의 크기가 작을수록 더 뛰어난 IRI 효과를 확인하였다.
또한, 추후 아미노산 결합을 위하여 표면을 아크릴레이트로 개질화하더라도(MOF-Acrylate) 개질 전 MOF와 비교하여 IRI 효과에 큰 차이가 없음을 확인하였다.
3. MOF 입자의 세포 생존력
냉동보존제로서의 MOF-801 NP의 세포 생존력을 CellTiter-Glo®를 사용하여 인간 배아 신장(293T), 비종양성 폐 기관지 상피(BEAS-2B) 및 폐 암종 상피(A549) 세포주에서 먼저 조사하였다.
MOF NP 처리 후 2일의 배양 후에도 눈에 띄는 독성은 관찰되지 않았다. 세포 생존력은 배양 시간이 증가함에 따라 더욱 향상되었으며, 이는 정상 세포와 암세포 모두에 대한 동결 보존 나노제제로 활용될 MOF-801 NP의 능력을 시사한다(도 5a).
또한 MOF-801 10 nm NP의 농도에 따른 세포 생존율을 조사한 결과(도 5b), 세포 생존율은 농도가 증가함에 따라 개선되는 경향이 있어 MOF-801 NP가 세포 환경에서 독성이 없음을 나타낸다.
구체적으로 각각 A549, 293T, BEAS2B 세포를 37 ℃ 및 5-6.5%의 CO2에서 3시간동안 1 μg/ml 악티노마이신 C1이 포함된 배양 배지에서 1 × 106 세포/ml의 농도로 배양하였다. 1 μg/ml 악티노마이신 C1 및 0.001-0.5 ng/ml 농도의 hTNF-α를 포함하는 100 μl 배양 배지에서 5 × 104 cells/well 농도의 종자 세포를 마이크로플레이트(tissue culture grade, 96 wells, flat bottom). 37°C 및 5-6.5% CO2에서 24시간 동안 세포 배양을 진행 하였다. 배양 기간 후, 각 well에 MTT 표지 시약(최종 농도 0.5 mg/ml) 10 μl를 추가하고 4시간 동안 마이크로플레이트를 배양하였다. 각 well에 solubilization solution 100 μl를 추가한 후, 인큐베이터에서 밤새 방치하였다. 보라색 포르마잔 결정이 완전히 가용화 되었는지 확인하고 마이크로플레이트(ELISA) 판독기를 사용하여 샘플의 흡광도를 측정하였다. 위 실험에서 사용된 MTT (3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide) (1x), at 5 mg/ml in phosphate buffered saline (PBS)와 solubilization solution은 Merck, Germany에서 구입하였다.
4. MOF 입자의 세포 동결보존 효과
본 발명 조성물이 세포 동결보존제로 사용될 경우의 효과를 확인하기 위하여, 293T : kidney (embryo) cell을 대상으로 세포 동결보존 효과를 확인하였다.
293T 세포를 0.1% 젤라틴(Sigma Aldrich, Germany)이 코팅된 60 mm 세포 배양 접시에서 분화를 막기 위한 2 mM L-글루타민 (Mediatech Inc), 1% 페니실린/스트렙토마이신 (Mediatech Inc), 15% 열-불활성화된 우태아혈청 (Hyclone), 20 mM HEPES-pH 7.3 (Cellgro), 0.1 mM MEM 비필수 아미노산 (Cellgro), 0.1 mM 2-머캅토에탄올 (Sigma Aldrich, Germany) 및 1000U/mL LIF (Millipore)가 첨가된 DMEM (Hyclone) 배지에서 배양하였다.
마우스 ES 세포를 상기의 다양한 동결보존 용액이 담긴 96웰 플레이트에서 웰 당 8 x 104 세포씩 접종하였다. 9시간 후, CCK-8 시약을 첨가하고 ELISA Reader (TECAN)을 이용하여 형광 강도를 측정하였다. 트립신화된 293T 용액 250 μL, FBS 200 μL 및 동결보존 용액 50 μL (0 μg/ml, 50 μg/ml, 100 μg/ml, 200 μg/ml, 400 μg/ml)를 급속 냉동고에서 2일간 냉동시킨 후, LN2 탱크에서 저장하였다. 해동은 37 ℃ 항온수조에서 수행하였다. 세포 냉동 스톡 혼합물은 15mL 튜브의 4.5 mL 배지에 접종하고 1000 rpm으로 5분간 원심 분리시켰다. 세포 펠릿에 1 mL 배지를 첨가하고 6웰 플레이트에 접종하였다. 마우스 ES 세포를 2.5 μM 내지 10 μM 동결보존 용액에서 12시간 동안 배양하였다. 세포를 PBS 500 μL로 세척하고 4% PFA 500 μL를 15분간 첨가하였다. 고정된 세포를 PBS 500 μL로 2회 세척하고 0.5% 크리스탈 바이올렛 용액을 30분간 첨가하였다. 염색된 세포는 수돗물로 세척하였다. 현재 널리 사용되는 동결보존제인 DMSO를 대조군으로 사용하였다.
도 6은 MOF-801 NP의 293T cell에 대한 cell internalization을 확인한 것으로, 좌측은 flow cytometry histograms, 우측은 MOF-801 NP의 293T cell에 대한 intracellular distribution을 나타내는 confocal laser scanning microscopy (CLSM) 이미지이다. MOF-8010 NP가 cell 내부에 침투하는 cell-penetrating cryopreservative 라는 것을 확인하였다.
도 7a-b에서, MOF 및 MOF-Acryl 모두 입자 크기가 작을수록 세포 동결보존 효과가 증가하는 경향을 확인하였으며, 35nm 이하의 MOF의 경우 DMSO보다 높은 동결보존 효과를 나타냈다.
MOF-801 NP의 크기가 작을수록 얼음-물 계면에 더 높은 microcurvature를 형성하여 더 높은 cryopreservation effficiency를 나타내었고, 아미노산으로 표면 개질화를 하였을 때, hydrophobic interaction으로 인하여 물 분자를 밀어낼 수 있게 되어 bare MOF-801 NP보다 더 높은 cryopreservation efficiency를 나타낼 수 있었다.
5. MOF 입자의 FT-IR 및 XPS 분석
MOF-801 입자의 표면에 acrylate functionalization이 되었는지 확인하고, 아미노산이 binding 되었는지 확인하기 위해 FT-IR 분석을 진행하였다. ZnSe (Zinc Selenide) window를 이용하여 1.0 mg/ml 농도의 샘플을 10 μL씩 떨어뜨린 후 상온에서 건조시켰다. Vertex 70v (Bruker, Germany)를 이용하여 진공 상태에서 분석을 진행하였다.
FT-IR 분석을 통해 기존의 MOF의 acrylate functionalization(도 9) 및 MOF-Acryl에 아미노산이 결합되었음을 확인하였다(도 10a).
도 10b는 FT-IR 분광법으로 MOF-801 NP 10 nm 표면 개질화 반응의 순차적 완료를 확인한 것이다. 1675 cm-1에서 카르복실기의 C=O 신축 피크를 나타내는 10 nm의 MOF-801 NP와 비교하여 MOF-801-Acryl NP에서 카르복실기의 C=O 신축 피크 가 약해지고 α, β-불포화 에스테르의 C=O 신축 피크가 1720 cm-1에서 나타났다. MOF-801-Acryl/Val 및 /Thr NPs에서 α,β-불포화 에스테르의 C=O 스트레칭 피크는 사라지고, 1670cm-1 및 1705cm-1에서 아미노산의 C-말단에서 파생된 C=O 스트레칭 피크가 나타났다. 또한 MOF-801-Acryl/Val NP 및 /Thr NP에서 아크릴레이트와 아미노산의 조합에서 파생된 2차 아민의 N-H 신축 피크가 각각 3320 및 3335 cm-1에서 관찰되었다.
TEM 이미지는 표면 기능화 후에도 MOF NP의 크기가 bare MOF-801 NP와 유사하게 유지되었음을 보여준다. 유사하게, Val 및 Thr은 FT-IR 분광법으로 확인된 바와 같이 각각 35nm 및 100nm-MOF-801-Acryl NP에 성공적으로 도입되었다. 도 10c에서는 동일하게 각 MOF-801 NP 35 nm 및 MOF-801 NP 100nm에 대하여 FT-IR 분광법으로 표면 개질화 반응의 순차적 완료를 확인하였다.
또한, MOF-801 NP, MOF-801-Acryl NP, MOF-801-Acryl/Val NP 및 MOF-801-Acryl/Thr NP에 대하여 X선광전자분광법(XPS)을 진행하였다. 도 11의 XPS 스펙트럼은 MOF-801 NP 및 MOF-801-Acryl NP 35 nm에서 Zr, C 및 O의 존재를 시사하며, MOF-801-Acryl NP 35 nm 스펙트럼에서 동일한 크기의 MOF-801 NP와 비교할 때 Zr 3d 피크의 상대적 이동으로 아크릴레이트 기능화가 입증된다.
두 샘플에서 Zr 3d3/2 및 3d5/2의 거의 동일한 위치는 아크릴레이트 기가 MOF NP 표면에 배위결합이 아닌 공유결합으로 결합되었음을 의미한다. 또한, 아미노산의 도입은 MOF-801-Acryl/Val 및 /Thr NP 35 nm의 스펙트럼에서 N 1s 피크의 출현으로 추가로 확인되었다.
6. MOF-Acryl/아미노산의 IRI 효과
전술한 MOF-Acryl에 얼음 결정에 잘 결합하는 것으로 알려진 Thr 및 Val을 결합하여 MOF-Acryl/Thr 및 MOF-Acryl/Val을 제조하였다. 구체적으로, 전술한 MOF-801-Acrylate와 아미노산 분자를 용매에 넣고 상온에서 24시간 동안 stirring하여 Aza-Michael addition 반응을 통해 아미노산을 결합할 수 있다. 상기 용매는 EtOH, DMF, THF 등 MOF와 아미노산이 잘 녹을 수 있는 용매라면 특별히 제한되지 않으며, 용매가 없는 조건으로도 반응이 가능하다.
이 실험의 경우에는, THF를 용매로 채택하여 반응을 진행하였다. 4 mL 크기의 유리 바이알 용기에 MOF-801과 준비된 HPLC-grade의 L-Threonine 또는 L- Valine (Sigma Aldrich, Germany)를 THF에 녹인 후, 24 시간 동안 상온에서 stirring 하였다.
위와 같이 아미노산을 결합함으로써 생체적합성이 더 높아지고, 얼음 결정에 대한 화학적 흡착력이 증가한 MOF 입자를 얻을 수 있다.
아미노산을 결합한 MOF-Acryl의 IRI 효과는 도 12a-b 및 13에 나타내었으며, Thr과 Val을 결합한 MOF 모두 10nm에서 PBS와 비교하여 현저히 MLGS가 감소하였음을 확인할 수 있다. MOF-Acryl/Thr 및 MOF-Acryl/Val의 IRI 활성화 정도는 기존의 10 nm 크기를 가지는 MOF-801, MOF-Acryl의 IRI 활성화 정도와 크게 다르지 않지만, 기존의 알려진 MOF-801에 생체 분자인 아미노산을 도입하여 생체 적합성이 증가하고 물 분자와의 직접적인 수소 결합을 유도할 수 있다.
도 13에서, MOF-801 NP의 크기가 작을수록 얼음-물 계면에 더 높은 microcurvature를 형성하여 더 높은 IRI 효과를 나타내었다. 또한, 아미노산으로 표면 개질화를 하였을 때, hydrophobic interaction으로 인하여 물 분자를 밀어낼 수 있게 되어 bare MOF-801 NP보다 더 높은 IRI 효과를 나타내었다.

Claims (8)

  1. 지르코늄을 중심금속으로 하는 금속-유기 구조체(Metal-organic framework, MOF) 입자를 포함하고,
    상기 입자 표면의 지르코늄은 인접한 지르코늄과 하기 화학식 1로 표시되는 구조의 결합을 포함하는 것인, 얼음 결정의 형성 또는 성장 억제용 조성물:
    [화학식 1]
    Figure pat00003

    (식 중, Zr은 상기 입자 표면의 지르코늄이고,
    R1 및 R2 는 각각 탄소수 1 내지 5인 알킬이고,
    R3은 Thr, Val, Ala, Ser 및 Gly으로 구성된 군에서 선택된 것임).
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 입자의 크기는 35nm이하인 것인, 얼음 결정의 형성 또는 성장 억제용 조성물.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 금속-유기 구조체는 푸마레이트를 유기 리간드로 포함하는 것인, 얼음 결정의 형성 또는 성장 억제용 조성물.
  4. 청구항 1 내지 3 중 어느 하나의 조성물을 포함하는 세포 또는 조직 동결 보존용 조성물.
  5. 청구항 1 내지 3 중 어느 하나의 조성물을 포함하는 식품 동결 보존용 조성물.
  6. 지르코늄을 중심금속으로 하는 금속-유기 구조체(Metal-organic framework, MOF) 입자를 말단에 카복실기를 포함하는 아크릴레이트로 표면 개질하는 제1 단계; 및
    상기 표면 개질된 금속-유기 구조체 입자에 Thr, Val, Ala, Ser 및 Gly으로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산을 처리하여, 상기 아크릴레이트에 상기 아미노산을 결합시키는 제2 단계;를 포함하는 얼음 결정의 형성 또는 성장 억제용 조성물 제조 방법.
  7. 청구항 6에 있어서, 상기 금속-유기 구조체는 푸마레이트를 유기 리간드로 포함하는 것인, 얼음 결정의 형성 또는 성장 억제용 조성물 제조방법.
  8. 청구항 6에 있어서, 상기 제1 단계 전, 35nm 이하의 크기로 상기 금속-유기 구조체 입자를 제조하는 단계를 더 포함하는, 얼음 결정의 형성 또는 성장 억제용 조성물 제조방법.
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