JP7158372B2 - 癌治療のための修飾抗体－アルブミンナノ粒子複合体 - Google Patents

Description

本発明は、癌治療のための修飾抗体－アルブミンナノ粒子複合体に関する。

化学療法は、メラノーマを始めとする多くの種類の癌に対する全身療法のよりどころである。大半の化学療法薬は腫瘍細胞に対してわずかな選択性しかなく、健全な増殖細胞に対する毒性が高いことがあり（Ａｌｌｅｎ ＴＭ． （２００２） Ｃａｎｃｅｒ ２：７５０－７６３）、用量の減量さらには治療の中断さえ必要とされることがある。理論的には、化学療法の毒性の問題を克服するとともに薬効を改善する一つの方法は、腫瘍細胞で選択的に発現（又は過剰発現）されるタンパク質に特異的な抗体を用いて化学療法薬を腫瘍にターゲティングし、もって化学療法薬の生体分布を変化させて、腫瘍に届く薬の量を増やし、健全な組織への影響を減らすことである。しかし、３０年間に及ぶ研究にもかかわらず、治療に関連して特異的ターゲティングが成功した例はほとんどない。

従来の抗体依存性化学療法（ＡＤＣ）は、毒性薬物をターゲティング抗体に合成プロテアーゼ切断性リンカーを介して結合させて設計される。このようなＡＤＣ療法の有効性は、標的細胞が抗体に結合する能力、リンカーが切断される能力及び毒性薬物が標的細胞に取り込まれる能力に依存する。Ｓｃｈｒａｍａ， Ｄ． ｅｔ ａｌ． （２００６） Ｎａｔｕｒｅ ｒｅｖｉｅｗｓ． Ｄｒｕｇ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ５：１４７－１５９参照。

抗体標的化学療法（antibody-targeted chemotherapy）は、ターゲティング能と、多様な細胞障害性薬物と、潜在的に低減した毒性を伴う治療能力の向上との組合せをもたらすので、従来の療法よりも優れていると期待されていた。広範な研究にもかかわらず、臨床的に有効な抗体標的化学療法は未だ判然としない。大きなネックとなっているのは、抗体と化学療法薬の間のリンカーの不安定性、抗体に結合したときの化学療法薬の腫瘍毒性の低下、並びにコンジュゲートが腫瘍細胞に結合及び侵入できないことである。さらに、これらの治療法では抗体－薬物コンジュゲートのサイズを制御できなかった。

従来の治療薬よりも信頼性があって改善された抗腫瘍活性をもたらすべく、標的薬物送達のための細胞傷害性効果を保持する抗体癌治療薬が当技術分野で依然として必要とされている。

治療用抗体及びアルブミン結合パクリタキセルナノ粒子（アルブミン結合パクリタキセルとも呼ばれる；例えば、アブラキサン（登録商標）、ＡＢＸ）の製造の独特な態様では、ベバシズマブ、トラスツズマブ及びリツキシマブを含むヒト化治療用モノクローナル抗体はＡＢＸに高い親和性で結合して、ＡＢＸ内の化学療法薬であるパクリタキセルを腫瘍に特異的にターゲティングする能力を与える。さらに、ベバシズマブでコートされたＡＢＸ（ＡＢ１６０）は、ヒトメラノーマのマウスモデルにおいて、ＡＢＸ単独よりも有効であった。

ただし、すべての抗体がアルブミン（又はＡＢＸ）と望ましい程度に結合してナノ粒子を形成するわけではないと考えられる。そこで、本開示の一態様は、アルブミン結合性モチーフを含まない（例えばアルブミン及び／又はアルブミン結合パクリタキセルナノ粒子とは複合体を形成しないか或いは所望の程度までは複合体を形成しない）抗体であって、本明細書に記載の１以上のアルブミン結合性モチーフを含むように修飾された抗体に関する。別の態様では、本開示は、アルブミン結合性モチーフを含み、本明細書に記載の１以上の追加のアルブミン結合性モチーフを含むように修飾された抗体に関する。かかる抗体としては、特に限定されないが、リツキシマブ、トラスツズマブ、ベバシズマブ及びムロモナブが挙げられる。一実施形態では、本発明は、１以上のアルブミン結合性モチーフを含むように修飾された修飾抗体の製造方法に関する。

別の態様では、本開示は、抗体結合性モチーフを含まない（例えば抗体と複合体を形成してナノ粒子複合体を形成しないか或いは所望の程度までは複合体を形成しない）担体タンパク質であって、本明細書に記載の１以上の抗体結合性モチーフを含むように修飾された担体タンパク質に関する。一態様では、本開示は、抗体結合性モチーフを含み、本明細書に記載の１以上の追加の抗体結合性モチーフを含むように修飾された担体タンパク質（例えばアルブミン）に関する。一実施形態では、本発明は、１以上の抗体結合性モチーフを含むように修飾された修飾担体タンパク質の製造方法に関する。

本開示は、本明細書に記載の修飾抗体及び／又は担体タンパク質を含むナノ粒子複合体であって、好ましくはパクリタキセルを含むナノ粒子複合体にも関する。一実施形態では、本発明の態様は、ナノ粒子複合体の製造方法に関する。別の実施形態では、本発明は、例えば癌の治療に、ナノ粒子複合体を使用する方法に関する。

理論に縛られるものではないが、アルブミンとのパクリタキセルの相互作用は、アルブミンに対する抗体の親和性を高めて、ナノ粒子複合体の形成を可能にすると考えられる。担体タンパク質と抗体のナノ粒子は、パクリタキセルなしで、癌その他の疾患の治療に有益となり得る。したがって、本開示は、修飾担体タンパク質及び／又は抗体（又は他の抗原結合剤、例えば融合タンパク質）を含む複合体であって、パクリタキセルを含まず、追加の治療薬を含んでいても含んでいなくてもよいものに関する。理論に束縛されることを望むものではないが、担体タンパク質への抗体結合性モチーフの追加及び／又は抗体（又は結合剤）へのアルブミン結合性モチーフの追加は、担体タンパク質－抗体の結合を増大させ、パクリタキセルの非存在下でのナノ粒子の形成を可能にすると考えられる。

一実施形態では、本発明は、１以上の抗体結合性モチーフを含むように修飾された修飾ポリペプチド配列を有する担体タンパク質、各々の抗体が抗原結合性ドメインを有する複数の抗体、及び任意的に治療薬を含むナノ粒子複合体であって、インビボで抗原に対する結合特異性を有するナノ粒子複合体に関する。

一実施形態では、本発明は、アルブミン、１以上のアルブミン結合性モチーフを含むように修飾された修飾ポリペプチド配列を有する抗体又は融合タンパク質であって抗原結合性ドメインを有する抗体又は融合タンパク質、及び任意的に治療薬を含むナノ粒子複合体であって、インビボで抗原に対する結合特異性を有するナノ粒子複合体に関する。

一実施形態では、本発明は、１以上の抗体結合性モチーフを含むように修飾された修飾ポリペプチド配列を有する担体タンパク質、１以上のアルブミン結合性モチーフを含むように修飾された修飾ポリペプチド配列を有する抗体又は融合タンパク質であって抗原結合性ドメインを有する抗体又は融合タンパク質、及び任意的に治療薬を含むナノ粒子複合体であって、インビボで抗原に対する結合特異性を有するナノ粒子複合体に関する。

一実施形態では、本発明は、本明細書に記載のナノ粒子複合体を含む組成物に関する。

一実施形態では、抗体結合性モチーフは配列番号３、配列番号４又は配列番号５のアミノ酸配列を含む。

一実施形態では、アルブミン結合性モチーフは配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１又は配列番号１２のアミノ酸配列を含む。

一実施形態では、治療薬はパクリタキセルである。

一実施形態では、複合体は１μｍ未満の平均サイズを有する。一実施形態では、ナノ粒子複合体は約９０ｎｍ～約８００ｎｍの平均サイズを有する。一実施形態では、ナノ粒子複合体は約９０ｎｍ～約４００ｎｍの平均サイズを有する。一実施形態では、ナノ粒子複合体は約９０ｎｍ～約２００ｎｍの平均サイズを有する。一実施形態では、ナノ粒子複合体は約１００ｎｍ～約８００ｎｍの平均サイズを有する。一実施形態では、ナノ粒子複合体は約１００ｎｍ～約４００ｎｍの平均サイズを有する。一実施形態では、ナノ粒子複合体は約１００ｎｍ～約２００ｎｍの平均サイズを有する。

一実施形態では、アルブミン－治療薬と抗体との比は１０：１～１０：３０である。一実施形態では、各々のナノ粒子複合体は約１００～約１０００個の抗体を含む。一実施形態では、各々のナノ粒子複合体は約１００～約８００個の抗体を含む。

一実施形態では、アルブミンはヒト血清アルブミンである。一実施形態では、ヒト血清アルブミンは組換えヒト血清アルブミンである。

一実施形態では、ナノ粒子複合体は凍結乾燥されている。一実施形態では、ナノ粒子複合体を含む組成物は凍結乾燥されている。一実施形態では、凍結乾燥ナノ粒子複合体又は組成物は、水溶液中で再構成したときに、インビボでの抗原結合（認識）能力が残存しているナノ粒子複合体を含む。

一実施形態では、担体タンパク質は、アルブミン、オボアルブミン、ゼラチン、エラスチン、エラスチン由来ポリペプチド、グリアジン、レグミン、ゼイン、大豆タンパク質、乳タンパク質又は乳清タンパク質である。一実施形態では、担体タンパク質はアルブミンである。一実施形態では、アルブミンは、追加の抗体結合性モチーフを含むように修飾されている。

一実施形態では、抗体又は融合タンパク質は、非共有結合によって担体タンパク質と会合している。一実施形態では、抗体又は融合タンパク質は、抗体結合性モチーフ及び／又はアルブミン結合性モチーフを介して担体タンパク質と会合している。一実施形態では、パクリタキセルは、非共有結合によって担体タンパク質と会合している。一実施形態では、抗体又は融合タンパク質は、抗体結合性モチーフを介して担体タンパク質と非共有結合的に会合している。一実施形態では、抗体又は融合タンパク質は、アルブミン結合性モチーフを介して担体タンパク質と非共有結合的に会合している。

一実施形態では、修飾担体タンパク質の少なくともサブセットは、２以上の抗体結合性モチーフを含む。一実施形態では、修飾抗体又は融合タンパク質の少なくともサブセットは、２以上のアルブミン結合性モチーフを含む。

一実施形態では、組成物は薬学的に許容される添加物をさらに含む。

一態様では、本発明は、１以上のアルブミン結合性モチーフを含むように修飾された修飾ポリペプチド配列を有する修飾抗体に関する。一実施形態では、アルブミン結合性モチーフは配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１又は配列番号１２のポリペプチド配列を含む。一実施形態では、本修飾抗体は、非修飾ポリペプチド配列を有する抗体よりもアルブミンに対して高い親和性を有する。

一態様では、本発明は、１以上の抗体結合性モチーフを含むように修飾された修飾ポリペプチド配列を有する修飾担体タンパク質に関する。一実施形態では、抗体結合性モチーフは配列番号３、配列番号４又は配列番号５のポリペプチド配列を含む。一実施形態では、本修飾担体タンパク質は、非修飾ポリペプチド配列を有する担体タンパク質よりも抗体に対して高い親和性を有する。

一態様では、本発明は、ナノ粒子複合体の製造方法であって、アルブミンを、１以上のアルブミン結合性モチーフを含むように修飾された修飾ポリペプチド配列を有する抗体と、ナノ粒子複合体を形成する条件下で、一緒にすることを含む方法に関する。一実施形態では、担体タンパク質又はナノ粒子複合体を治療薬と一緒にする。一実施形態では、治療薬はパクリタキセルである。

一態様では、ナノ粒子複合体の製造方法であって、１以上の抗体結合性モチーフを含むように修飾された修飾ポリペプチド配列を有する担体タンパク質を抗体と共にインキュベートすることを含む方法が開示される。一実施形態では、担体タンパク質はアルブミンである。一実施形態では、担体タンパク質又はナノ粒子複合体を治療薬と一緒にする。一実施形態では、治療薬はパクリタキセルである。一態様では、抗体は、１以上のアルブミン結合性モチーフを含むように修飾された修飾ポリペプチド配列を有する修飾抗体である。

一実施形態では、抗体結合性モチーフは配列番号３、配列番号４又は配列番号５のポリペプチド配列を含む。一実施形態では、アルブミン結合性モチーフは配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１又は配列番号１２のアミノ酸配列を含む。

一態様では、修飾抗体の製造方法であって、当該方法が、ポリペプチド配列を有する抗体を用意し、アルブミン結合性モチーフを含むように該ポリペプチド配列を修飾することを含んでおり、修飾抗体が、修飾前の抗体よりもアルブミンとの結合に関して高い親和性を有する、方法が開示される。一実施形態では、アルブミン結合性モチーフは配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１又は配列番号１２のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、修飾前のポリペプチド配列はアルブミン結合性モチーフを含んでいない。

一態様では、修飾担体タンパク質の製造方法であって、当該方法が、ポリペプチド配列を有する担体タンパク質を用意し、抗体結合性モチーフを含むように該ポリペプチド配列を修飾することを含んでおり、修飾担体タンパク質が、修飾前の担体タンパク質よりも抗体との結合に関して高い親和性を有する、方法が開示される。一実施形態では、抗体結合性モチーフは配列番号３、配列番号４又は配列番号５のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、担体タンパク質は、アルブミン、オボアルブミン、ゼラチン、エラスチン、エラスチン由来ポリペプチド、グリアジン、レグミン、ゼイン、大豆タンパク質、乳タンパク質又は乳清タンパク質である。一実施形態では、修飾前のポリペプチド配列は抗体結合性モチーフを含んでいない。

一態様では、患者の癌を治療する方法であって、当該方法が、本明細書に記載の修飾抗体及び／又は修飾担体タンパク質を含むナノ粒子複合体の治療有効量を患者に投与することを含んでおり、該癌が抗原を発現する方法が開示される。一実施形態では、組成物は静脈内投与される。一実施形態では、組成物は直接注射又は灌流によって腫瘍に投与される。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
ナノ粒子複合体を含む組成物であって、該ナノ粒子複合体の各々が、
１以上の抗体結合性モチーフを含むように修飾された修飾ポリペプチド配列を有する担体タンパク質、
各々の抗体が抗原結合性ドメインを有する複数の抗体、及び
任意的に治療薬
を含んでおり、該ナノ粒子複合体がインビボで抗原に対する結合特異性を有する、組成物。
（項目２）
ナノ粒子複合体を含む組成物であって、該ナノ粒子複合体の各々が、
アルブミン、
１以上のアルブミン結合性モチーフを含むように修飾された修飾ポリペプチド配列を有する抗体又は融合タンパク質であって、抗原結合性ドメインを有する抗体又は融合タンパク質、及び
任意的に治療薬
を含んでおり、該ナノ粒子複合体がインビボで抗原に対する結合特異性を有する、組成物。
（項目３）
ナノ粒子複合体を含む組成物であって、該ナノ粒子複合体の各々が、
１以上の抗体結合性モチーフを含むように修飾された修飾ポリペプチド配列を有する担体タンパク質、
１以上のアルブミン結合性モチーフを含むように修飾された修飾ポリペプチド配列を有する抗体又は融合タンパク質であって、抗原結合性ドメインを有する抗体又は融合タンパク質、及び
任意的に治療薬
を含んでおり、該ナノ粒子複合体がインビボで抗原に対する結合特異性を有する、組成物。
（項目４）
前記抗体結合性モチーフが、配列番号３、配列番号４又は配列番号５のアミノ酸配列を含む、項目１に記載の組成物。
（項目５）
前記抗体結合性モチーフが、配列番号３、配列番号４又は配列番号５のアミノ酸配列を含む、項目３に記載の組成物。
（項目６）
前記アルブミン結合性モチーフが、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１又は配列番号１２のアミノ酸配列を含む、項目２に記載の組成物。
（項目７）
前記アルブミン結合性モチーフが、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１又は配列番号１２のアミノ酸配列を含む、項目３に記載の組成物。
（項目８）
前記抗体結合性モチーフが、配列番号３、配列番号４又は配列番号５のアミノ酸配列に対して約８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、項目１又は項目３に記載の組成物。
（項目９）
前記アルブミン結合性モチーフが、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１又は配列番号１２のアミノ酸配列に対して約８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、項目２又は項目３に記載の組成物。
（項目１０）
前記治療薬がパクリタキセルである、項目１乃至項目７のいずれか１項に記載の組成物。
（項目１１）
前記複合体が１μｍ未満の平均サイズを有する、項目１乃至項目７のいずれか１項に記載の組成物。
（項目１２）
前記ナノ粒子複合体が約１００ｎｍ～約８００ｎｍの平均サイズを有する、項目１１に記載の組成物。
（項目１３）
アルブミン－治療薬と抗体との比が１０：１～１０：３０である、項目１乃至項目７のいずれか１項に記載の組成物。
（項目１４）
前記ナノ粒子複合体の各々が、約１００～約１０００個の抗体を含む、項目１乃至項目７のいずれか１項に記載の組成物。
（項目１５）
前記アルブミンがヒト血清アルブミンである、項目１乃至項目７のいずれか１項に記載の組成物。
（項目１６）
凍結乾燥されている、項目１乃至項目７のいずれか１項に記載の組成物。
（項目１７）
前記担体タンパク質が、アルブミン、オボアルブミン、ゼラチン、エラスチン、エラスチン由来ポリペプチド、グリアジン、レグミン、ゼイン、大豆タンパク質、乳タンパク質又は乳清タンパク質である、項目１乃至項目７のいずれか１項に記載の組成物。
（項目１８）
前記抗体又は融合タンパク質が、非共有結合によって前記担体タンパク質と会合している、項目１乃至項目７のいずれか１項に記載の組成物。
（項目１９）
前記抗体又は融合タンパク質が、前記抗体結合性モチーフ及び／又は前記アルブミン結合性モチーフを介して前記担体タンパク質と会合している、項目１８に記載の組成物。
（項目２０）
パクリタキセルが、非共有結合によって前記担体タンパク質と会合している、項目１乃至項目７のいずれか１項に記載の組成物。
（項目２１）
前記抗体又は融合タンパク質が、前記抗体結合性モチーフを介して前記担体タンパク質と非共有結合的に会合している、項目１、項目３乃至項目５及び項目７のいずれか１項に記載の組成物。
（項目２２）
前記抗体又は融合タンパク質が、前記アルブミン結合性モチーフを介して前記担体タンパク質と非共有結合的に会合している、項目２、項目３及び項目５乃至項目７のいずれか１項に記載の組成物。
（項目２３）
前記修飾担体タンパク質の少なくともサブセットが、２以上の抗体結合性モチーフを含む、項目１、項目３乃至項目５及び項目７のいずれか１項に記載の組成物。
（項目２４）
前記修飾抗体又は融合タンパク質の少なくともサブセットが、２以上のアルブミン結合性モチーフを含む、項目２、項目３及び項目５乃至項目７のいずれか１項に記載の組成物。
（項目２５）
薬学的に許容される添加物をさらに含む、項目１乃至項目２４のいずれか１項に記載の組成物。
（項目２６）
ナノ粒子複合体の製造方法であって、アルブミンを、１以上のアルブミン結合性モチーフを含むように修飾された修飾ポリペプチド配列を有する抗体と、ナノ粒子複合体を形成する条件下で、一緒にすることを含む、方法。
（項目２７）
担体タンパク質又はナノ粒子複合体を治療薬と一緒にする、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
前記治療薬がパクリタキセルである、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
ナノ粒子複合体の製造方法であって、１以上の抗体結合性モチーフを含むように修飾された修飾ポリペプチド配列を有する担体タンパク質を抗体と共にインキュベートすることを含む方法。
（項目３０）
前記担体タンパク質がアルブミンである、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
前記担体タンパク質又はナノ粒子複合体を治療薬と一緒にする、項目２９に記載の方法。
（項目３２）
前記治療薬がパクリタキセルである、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
前記抗体が、１以上のアルブミン結合性モチーフを含むように修飾された修飾ポリペプチド配列を有する、項目２９に記載の方法。
（項目３４）
前記抗体結合性モチーフが、配列番号３、配列番号４又は配列番号５のポリペプチド配列を含む、項目２９乃至項目３３のいずれか１項に記載の方法。
（項目３５）
前記アルブミン結合性モチーフが、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１又は配列番号１２のアミノ酸配列を含む、項目２６乃至項目３３のいずれか１項に記載の方法。
（項目３６）
患者の癌を治療する方法であって、当該方法が項目１乃至項目７のいずれか１項に記載のナノ粒子組成物の治療有効量を該患者に投与することを含んでおり、該癌が前記抗原を発現する、方法。
（項目３７）
１以上のアルブミン結合性モチーフを含むように修飾された修飾ポリペプチド配列を有する抗体。
（項目３８）
前記アルブミン結合性モチーフが、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１又は配列番号１２のポリペプチド配列を含む、項目３７に記載の抗体。
（項目３９）
非修飾ポリペプチド配列を有する抗体よりも、アルブミンに対する高い親和性を有する、項目３７又は項目３８に記載の抗体。
（項目４０）
１以上の抗体結合性モチーフを含むように修飾された修飾ポリペプチド配列を有する担体タンパク質。
（項目４１）
前記抗体結合性モチーフが、配列番号３、配列番号４又は配列番号５のポリペプチド配列を含む、項目４０に記載の担体タンパク質。
（項目４２）
非修飾ポリペプチド配列を有する担体タンパク質よりも、抗体に対する高い親和性を有する、項目４０又は項目４１に記載の担体タンパク質。
（項目４３）
修飾された抗体の製造方法であって、当該方法が、ポリペプチド配列を有する抗体を用意すること、そしてアルブミン結合性モチーフを含むように該ポリペプチド配列を修飾することを含んでおり、該修飾された抗体が、修飾前の抗体よりも、アルブミンとの結合に関して高い親和性を有する、方法。
（項目４４）
前記アルブミン結合性モチーフが、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１又は配列番号１２のアミノ酸配列を含む、項目４３に記載の方法。
（項目４５）
前記ポリペプチド配列が、修飾前はアルブミン結合性モチーフを含んでいない、項目４３又は項目４４に記載の方法。
（項目４６）
修飾担体タンパク質の製造方法であって、当該方法が、ポリペプチド配列を有する担体タンパク質を用意すること、そして抗体結合性モチーフを含むように該ポリペプチド配列を修飾することを含んでおり、該修飾担体タンパク質が、修飾前の担体タンパク質よりも、抗体との結合に関して高い親和性を有する、方法。
（項目４７）
前記抗体結合性モチーフが、配列番号３、配列番号４又は配列番号５のアミノ酸配列を含む、項目４６に記載の方法。
（項目４８）
前記担体タンパク質が、アルブミン、オボアルブミン、ゼラチン、エラスチン、エラスチン由来ポリペプチド、グリアジン、レグミン、ゼイン、大豆タンパク質、乳タンパク質又は乳清タンパク質である、項目４６又は項目４７に記載の方法。
（項目４９）
前記ポリペプチド配列が、修飾前は抗体結合性モチーフを含んでいない、項目４６又は項目４７に記載の方法。

図１Ａは、蛍光標識したリツキシマブ（緑色）をアブラキサン（登録商標）と共にインキュベーションした後に形成されたナノ粒子のＩｍａｇｅＳｔｒｅａｍ（登録商標）画像を示す。 図１Ｂは、非標識リツキシマブと非標識アブラキサン（ＡＢＸ）（左図）、蛍光標識（＊）リツキシマブと非標識ＡＢＸ（中図）又は蛍光標識リツキシマブと蛍光標識ＡＢＸ（右図）からなるＡＲ１６０のフローサイトメトリー分析を示す。 図１Ｃは、ＡＲ１６０を、微粒子画分（ＡＲ１６０；青色）、１００キロダルトン（ＫＤ）超のタンパク質（＞１００ＫＤ；赤色）及び１００ＫＤ未満のタンパク質（＜１００ＫＤ；緑色）に分離した後の各画分に存在するパクリタキセルの量を示すグラフである。各画分中のパクリタキセル濃度をＨＰＬＣで求めたところ、パクリタキセルの約６９．２％が微粒子中にあり、残りのパクリタキセルは１００ｋＤ（３０．５％）超のタンパク質中にあった。１００ｋＤ以上の画分でウエスタンブロットを行ったところ、リツキシマブ、パクリタキセル及びアルブミンは約２００ｋＤのバンドに共存していた。 図２Ａは、ＰＥ抗ヒトＣＤ１９（左図）、蛍光ＡＲ１６０（中図）又はその両方（右図）と共にインキュベートしたＤａｕｄｉ細胞のフローサイトメトリー分析を示す。Ｄａｕｄｉ細胞は、ＣＤ１９、ＡＲ１６０又は両方に対して約７５％陽性であった。図２Ｂは、ＣＤ１９（赤色）及び蛍光ＡＲ１６０（緑色）の両方で標識した、図２Ａと同じ実験で得られたＤａｕｄｉ細胞のＩｍａｇｅＳｔｒｅａｍ画像を示す。 図２Ｃは、１０ｍｇのＡＢＸを表示量のリツキシマブ（ＲＩＴ）と共にインキュベートし、ＮａｎｏＳｉｇｈｔ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社（英国ウスターシャー））によってサイズ分布を分析したときの各サイズの粒子濃度を示すグラフである。表は、サイズ分布（平均、１０パーセンタイル、５０パーセンタイル及び９０パーセンタイル）を示す。 図３は、通常の点滴静注用生理食塩水中でのＡＲ１６０のインビトロ安定性を示すグラフである。ＡＲ１６０の臨床グレードの標品を、室温で様々な期間（０時間、１時間、２時間、４時間、６時間及び２４時間）通常の生理食塩水中に曝露した。各インキュベーションの最後に、粒子のＮａｎｏＳｉｇｈｔ分析を行って粒子数とそのサイズ分布（平均、１０パーセンタイル、５０パーセンタイル及び９０パーセンタイル）を評価した。対照として各時点においてＡＢＸを単独で分析した。 図４Ａは、ヒトＡＢ型血清中でのＡＢＸの安定性を示すグラフである。３０×１０^８個の粒子をヒトＡＢ型血清に添加して、６０分間インキュベートした。ＡＢ型血清に添加して５、１５、３０及び６０分後に、粒子サイズ及び数を決定した。生理食塩水中のＡＢＸを対照として使用した。 図４Ｂは、ヒトＡＢ型血清中でのＡＲ１６０の安定性を示すグラフである。３０×１０^８個の粒子をヒトＡＢ型血清に添加して、６０分間インキュベートした。ＡＢ型血清に添加して５、１５、３０及び６０分後に、粒子サイズ及び数を決定した。生理食塩水中のＡＢＸを対照として使用した。 図４Ｃは、ＡＢ型血清中でインキュベーションした後のＡＲ１６０（実線）に対するＡＢＸ（点線）の粒子数を示すグラフである。 図５Ａ～５Ｆは、アイソタイプ対照抗体（図５Ａ）、未処理（図５Ｂ）、リツキシマブ（図５Ｃ）、アブラキサン（登録商標）（図５Ｄ）、ＡＲ１６０（図５Ｅ）又生理食塩水中で２４時間インキュベートしておいたＡＲ１６０（図５Ｆ）で前処理し、次いで蛍光標識抗ヒトＣＤ２０抗体で標識したＤａｕｄｉ細胞のフローサイトメトリー分析を示す。 図６は、記載されたパクリタキセル濃度で、ＥｄＵ及びＡＢＸ、ＡＲ１６０、生理食塩水中で２４時間インキュベートしておいたＡＲ１６０（ＡＲＤ１６０ ２４０時間）又はリツキシマブで一晩処理した後のＤａｕｄｉ細胞の増殖レベルを示すグラフである。増殖レベルは、細胞をＦＩＴＣ標識抗ＥｄＵで染色することによって決定した。増殖指数は、未処理の陽性対照に対して正規化することによって算出した。 図７Ａ～７Ｇは、生理食塩水（図７Ａ）、１２ｍｇ／ｋｇ（図７Ｂ）若しくは１８ｍｇ／ｋｇ（図７Ｃ）のリツキシマブ、３０ｍｇ／ｋｇ（図７Ｄ）若しくは４５ｍｇ／ｋｇ（図７Ｅ）のアブラキサン（登録商標）、又は３０ｍｇ／ｋｇのＡＲ１６０（図７Ｆ）若しくは４５ｍｇ／ｋｇ（図７Ｇ）のＡＲ１６０で処置したマウスにおける経時的な腫瘍体積を表す。ＡＢＸ及びＡＲ１６０の投与量はパクリタキセルを基準にした。図７Ｈは、図７Ａ～７Ｇのデータに基づくベースライン腫瘍体積のパーセント変化率を表す。 図８は、図７Ａ～７Ｈに示す実験で得られたマウスの生存を示すＫａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ曲線を表す。表は、各コホートにおけるマウスの平均生存期間（日数）を示す。 図９Ａは、蛍光標識ＡＢＸ単独、対照抗体（ＡＢ ＩｇＧ）を有するＡＢＸ又はＡＲ１６０で処置したマウス腫瘍内の薬物沈着を示すためＩＶＩＳ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ蛍光をオーバーレイした写真である。ＡＢＸをＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ７５０で標識し、次いで陰性対照としてのＩＶＩＧ又はリツキシマブ（ＡＲ１６０）のいずれかに結合させ、ＩＶＩＳ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製）を用いて各腫瘍中のＡＢＸの濃度を蛍光法で定量した。図９Ｂは、図９Ａに示す動物の腫瘍で得られた蛍光を示すグラフである。腫瘍（図９Ａの不規則な境界の領域）及びバックグラウンドとして各マウスの背中の遠位領域（図９Ａの円）に対して関心領域（ＲＯＩ）を作成した。腫瘍ＲＯＩから各マウスのバックグラウンドＲＯＩを減算し、得られた放射効率をグラフにした。 図９Ｃは、ＡＲ１６０で処置する２４時間前に１％、１０％又は１００％用量のリツキシマブで前処理したマウス腫瘍内の薬物沈着を示すためＩＶＩＳ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ蛍光をオーバーレイした写真である。図９Ｄは、図９Ｃに示す動物の腫瘍で得られた蛍光を示すグラフである。腫瘍（図９Ｃの不規則な境界の領域）及びバックグラウンドとして各マウスの背中の遠位領域（図９Ａの円）に対して関心領域（ＲＯＩ）を作成した。腫瘍ＲＯＩから各マウスのバックグラウンドＲＯＩを減算し、得られた放射効率をグラフにした。 図１０は、実験室で製造したＡＲ１６０（ＡＲ１６０）対薬局で製造した３つのバッチ（ＡＲ１６０ ｐ１、ｐ２又はｐ３）のサイズ分析のグラフである。サイズ（ｎｍ単位の直径）は、平均サイズ、１０パーセンタイルｄ（０．１）、５０パーセンタイルｄ（０．５）。９０パーセンタイルｄ（０．９）として表す。各標品中の粒子数も併せて決定した（×１０^８／ｍＬ）。 図１１Ａ～１１Ｈは、アイソタイプ対照抗体（図１１Ａ）、未処理（図１１Ｂ）、アブラキサン（登録商標）（図１１Ｃ）、リツキシマブ（図１１Ｄ）、実験室で製造したＡＲ１６０（図１１Ｅ）又は薬局で製造した３つのＡＲ１６０バッチの各々（図１１Ｆ～１１Ｈ）で前処理し、次いで蛍光標識抗ヒトＣＤ２０抗体で標識したＤａｕｄｉ細胞のフローサイトメトリー分析を表す。 図１１Ｉは、記載されたパクリタキセル濃度で、ＥｄＵ及びＡＢＸ、ＡＲ１６０又は薬局で製造した３つのＡＲ１６０バッチの各々で一晩処理した後のＤａｕｄｉ細胞の増殖レベルのグラフである。増殖レベルは、細胞をＦＩＴＣ標識抗ＥｄＵで染色することによって決定した。増殖指数は、未処理の陽性対照に対する正規化によって計算した。 図１２Ａは、トラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標））とＨＳＡペプチド４（配列番号３）との結合を表す。図１２Ｂは、ムロモナブ（ムロモナブ－ＣＤ３又はＡＫＴ３；ＯＲＴＨＯＣＬＯＮＥ ＯＫＴ３（登録商標）とも呼ばれる）とＨＳＡペプチド４との結合を表す。図１２Ｃは、リツキシマブ（ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標））とＨＳＡペプチド４との結合を表す。 図１２Ｄは、ベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標））とＨＳＡペプチド１３（配列番号４）との結合を表す。図１２Ｅは、トラスツズマブとＨＳＡペプチド１３との結合を表す。図１２Ｆは、リツキシマブとＨＳＡペプチド１３との結合を表す。 図１２Ｇは、ベバシズマブとＨＳＡペプチド４０（ＨＳＡアミノ酸４５５～４７２；配列番号５）との結合を表す。図１２Ｈは、トラスツズマブとＨＳＡペプチド４０との結合を表す。図１２Ｉは、ムロモナブとＨＳＡペプチド４０との結合を表す。図１２Ｊは、リツキシマブとＨＳＡペプチド４０との結合を表す。 図１２Ｋは、各ＨＳＡペプチドのアミノ酸配列並びに各ＨＳＡペプチドに対する各抗体の親和性を示す。 図１３Ａは、ベバシズマブペプチド（ＢＥＶペプチド１；アミノ酸１１１～１２５；配列番号７）とＨＳＡペプチド４０との結合を表す。図１３Ｂは、ベバシズマブ可変ペプチド１（配列番号７）とＨＳＡとの結合を表す。図１３Ｃは、ベバシズマブ可変ペプチド２（配列番号６）とＨＳＡとの結合を表す。図１３Ｄは、リツキシマブ可変ペプチド１（配列番号９）とＨＳＡとの結合を表す。図１３Ｅは、トラスツズマブ可変ペプチド１（配列番号１１）とＨＳＡとの結合を表す。 図１３Ｆは抗体を表す図である。青い小さな四角は、アルブミン－パクリタキセル複合体のアルブミンに結合してナノ粒子を形成するベバシズマブ及びリツキシマブ上のおおよその位置を示す。大きな四角は、ベバシズマブ（配列番号１）及びリツキシマブ（配列番号２）の可変部配列を示す。各々のアルブミン結合配列に下線を付して青（ベバシズマブ；配列番号８）及び赤（リツキシマブ；配列番号１０）で示す。図１３Ｇは、図１３Ａ～図１３Ｅで用いたペプチドの幾つかの配列を、ベバシズマブと比較したときの単一アミノ酸変化（赤色）及び予測されるベータシート構造（下線付き）の分析と共に示す。 図１４Ａは、リツキシマブとのナノ粒子形成に対するＨＳＡペプチド４０の競合の効果を表す。ＡＢＸ（５ｍｇ／ｍＬ）を、ペプチドなし（赤色バー）、対照ペプチド（ＨＳＡペプチド１０；緑色バー）又はＨＳＡペプチド４０（紫色バー）のいずれかの共存下で、リツキシマブ（２ｍｇ／ｍＬ）と共にインキュベートした。ペプチドは、抗体量に比して１０倍モル過剰で添加した。直径は１：２００希釈でＭａｌｖｅｒｎ Ｎａｎｏｓｉｚｅｒを用いて測定した。 図１４Ｂは、ベバシズマブとのナノ粒子形成に対するＨＳＡペプチド４０の競合の効果を表す。ＡＢＸ（１０ｍｇ／ｍＬ）を、ペプチドなし（赤色バー）、対照ペプチド（ＨＳＡペプチド１０；緑色バー）、ＨＳＡペプチド１３（紫色バー）、ＨＳＡペプチド４０（青色バー）又はＢＥＶペプチド１２（オレンジ色バー）のいずれかの共存下で、ベバシズマブ（４ｍｇ／ｍＬ）と共にインキュベートした。ペプチドは、抗体量に比して１０倍モル過剰で添加した。直径は１：２００希釈でＭａｌｖｅｒｎ Ｎａｎｏｓｉｚｅｒを用いて測定した。 図１４Ｃは、リツキシマブとＡＢＸとの複合体形成に対するＨＳＡペプチド４の競合の効果を示す。得られた平均粒子サイズは９６ｎｍ（±２３ｎｍ）であった。図１４Ｄは、リツキシマブとＡＢＸとの複合体形成に対するＨＳＡペプチド１３の競合の効果を示す。得られた平均粒子サイズは１８０ｎｍ（±２６ｎｍ）であった。

発明の詳細な説明を読了すれば、本発明を様々な代替的実施形態及び代替的用途で如何に実施すればよいか当業者には明らかになろう。ただし、本明細書には本発明の様々な実施形態がすべて記載されているわけではない。本明細書に記載された実施形態は例示のためのものであり、限定のためのものではない。したがって、様々な代替実施形態に関する発明の詳細な説明は、本発明の技術的範囲を以下に開示されたものに限定するものと解釈すべきではない。

本発明を開示するに当たり、以下に記載される態様は特定の組成物に限定されるものではなく、かかる組成物の製造方法又はその使用方法は当然ながら変更し得ることを理解されたい。本明細書で用いる用語は専ら特定の態様を説明することを目的としたものであり、限定的なものではないことも理解すべきである。

本発明の詳細な説明は、専ら読者の便宜のために様々な欄に分けられているが、いずれかの欄に記載された開示内容は他の欄の開示内容と組合せることができる。本明細書では、読者の便宜のために表題又は副題を用いることがあるが、それらは本発明の技術的範囲に影響を及ぼすことを意図するものではない。

定義
別途定義しない限り、本明細書で用いる技術用語及び科学用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者が通常理解する通りの意味を有する。本明細書及び添付の特許請求の範囲で用いる幾つかの用語については、以下の意味を有するものと定義される。

本明細書で用いる用語は、特定の実施形態を説明することを目的としたものであり、本発明を限定することを意図するものではない。本明細書では単数形で記載されたものであっても、文脈から別途明らかでない限り、複数系の場合も含む。

「任意的に」とは、その用語に続いて記載された事象又は状況が起きても起きなくてもよいことを意味しており、かかる記載はその事象又は状況が起こる場合と起こらない場合とを包含する。

「約」という用語が、範囲を含めて、温度、時間、量、濃度その他の数値の前に用いられている場合、±１０％、±５％、±１％、又はそれらの間の部分範囲又は中間値で変動し得る近似値を示す。好ましくは、用量に関して用いられる「約」という用語は、用量が±１０％変動し得ることを意味する。

「含む」とは、組成物及び方法が記載された要素を含んでいるが、その他の要素を除外するものではないことを意味する。「から本質的になる」とは、組成物及び方法の定義に用いられる場合、記載された目的に関して組合せに本質的重要性をもつ他の要素を除外することを意味する。したがって、本明細書で定義された要素から本質的になる組成物は、特許請求の範囲に記載された発明の基本的かつ新規な特徴に実質的な影響を与えない他の材料又はステップを除外するものではない。「からなる」とは、痕跡量を超える他の成分及び実質的な方法ステップを除外することを意味する。これらの移行句の各々によって定義される実施形態は、本発明の技術的範囲に属する。

本明細書で用いる「ナノ粒子」という用語は、少なくとも１つの寸法が５μｍ未満である粒子をいう。静脈内投与のような好ましい実施形態では、ナノ粒子は１μｍ未満である。直接投与の場合、ナノ粒子はもっと大きい。大きな粒子であっても明示的に本発明の想定内である。

粒子の集団において、個々の粒子のサイズは平均の周りで分布している。したがって、母集団の粒子サイズは平均値で表すことができるし、パーセンタイルで表すこともできる。Ｄ５０は、粒子の５０％がその粒子サイズ未満に属する粒子サイズである。粒子の１０％はＤ１０値よりも小さく、粒子の９０％はＤ９０よりも小さい。明らかでない場合、「平均」サイズはＤ５０に等しい。

本明細書で用いる「担体タンパク質」という用語は、抗体又は融合タンパク質を運搬する機能を担うタンパク質をいう。本開示の抗体又は融合タンパク質は、担体タンパク質に可逆的に結合できる。担体タンパク質の非限定的な例については、以下でさらに詳しく説明する。

本明細書で用いる「コア」という用語は、ナノ粒子の中心部分又は内側部分をいい、担体タンパク質、担体タンパク質と治療薬又は他の薬剤若しくは薬剤の組合せからなることができる。

「緩衝剤」という用語は、凍結乾燥前に溶液のｐＨを許容範囲内に維持する薬剤を包含し、コハク酸塩（ナトリウム又はカリウム）、ヒスチジン、リン酸塩（ナトリウム又はカリウム）、Ｔｒｉｓ（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）、ジエタノールアミン、クエン酸塩（ナトリウム）などを挙げることができる。一実施形態では、本発明の緩衝液は、約５．５～約６．５の範囲のｐＨを有し、好ましくは約６．０のｐＨを有する。ｐＨをこの範囲に制御する緩衝剤の例としては、コハク酸塩（コハク酸ナトリウムなど）、グルコン酸塩、ヒスチジン、クエン酸塩その他の有機酸緩衝剤が挙げられる。

「医薬製剤」という用語は、活性成分を有効にすることができる形態の標品であって、製剤が投与される被験体に対して毒性である追加成分を含まない標品をいう。

「薬学的に許容される」添加物（ビヒクル、添加剤）は、用いられる有効成分の有効量を与えるために対象哺乳動物に適切に投与できるものである。

本明細書で用いる「治療薬」という用語は、治療に有用な薬物、例えば、病状、生理学的状態、症状又は病因の治療、寛解又は軽減のための薬物或いはそれらの評価又は診断のための薬物を意味する。治療薬は、非限定的な例として、可視化のための放射性同位体その他の分子、或いは抗癌剤、例えば化学療法薬又は放射線療法薬を含んでいてもよい。幾つかの実施形態では、１種以上の治療薬又は複数の種類の薬剤を組成物から明示的に除外することができる。

本明細書で用いる「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分（すなわち、抗原に免疫特異的に結合する抗原結合部位を含む分子）をいう。この用語は、２本の免疫グロブリン重鎖と２本の免疫グロブリン軽鎖からなる抗体、並びに全長抗体及びその一部分を含む様々な形態も指し、例えば、免疫グロブリン分子、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体、ヒト化抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ジスルフィド結合Ｆｖ、ｓｃＦｖ、シングルドメイン抗体（ｄＡｂ）、ｄｉａｂｏｄｙ、多特異性抗体、二重特異性抗体、抗イディオタイプ抗体、二重特異性抗体、これらの機能的に活性なエピトープ結合断片、二機能性ハイブリッド抗体（例えばＬａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １７， １０５ （１９８７））及び単鎖（例えばＨｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．， ８５， ５８７９－５８８３ （１９８８）及びＢｉｒｄ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２， ４２３－４２６ （１９８８）、これらの開示内容は援用によって本明細書の内容の一部をなす。）が挙げられる。（全般には、Ｈｏｏｄ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｂｅｎｊａｍｉｎ， Ｎ．Ｙ．， ２ＮＤ ｅｄ． （１９８４）；Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ， Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ． Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ （１９８８）；Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｈｏｏｄ， Ｎａｔｕｒｅ， ３２３， １５－１６ （１９８６）を参照されたい。これらの開示内容は援用によって本明細書の内容の一部をなす。）。抗体はどのような種類（例えばＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ又はＩｇＤ）のものであってもよい。好ましくは、抗体はＩｇＧである。抗体は、ヒト以外のもの（例えばマウス、ヤギその他の動物由来のもの）、完全にヒトのもの、ヒト化されたもの又はキメラであってもよい。

本明細書で用いる「融合タンパク質」という用語は、２以上のドメインを有するタンパク質であって、一方のドメインがあるタンパク質に由来し、他方のドメインが異なるタンパク質に由来するものをいう。アフリベルセプト（ＺＡＬＴＲＡＰ（商標））は、結腸直腸癌の治療薬としてＦＤＡから承認された融合タンパク質である。トレバナニブ（ＡＭＧ３８６、Ａｍｇｅｎ社）及びＡＰＧ１０１（ＡＰＯＣＥＰＴ、Ａｐｏｇｅｎｉｘ社）を始めとする、癌の治療のための他の融合タンパク質も知られている。幾つかの実施形態では、融合タンパク質はＦｃ融合タンパク質である。

本明細書で用いる「凍結乾燥」という用語は、乾燥すべき材料（例えばナノ粒子）をまず凍結してから、真空環境中での昇華によって氷又は凍結溶媒を除去するプロセスをいう。保存時の凍結乾燥品の安定性を高めるため、予備凍結乾燥製剤に添加物を配合してもよい。幾つかの実施形態では、担体タンパク質、抗体若しくは融合タンパク質及び／又は治療薬は別個に凍結乾燥される。他の実施形態では、担体タンパク質、抗体又は融合タンパク質及び／又は治療薬を最初に混合してから凍結乾燥する。凍結乾燥試料はさらに追加の添加物を含んでもよい。抗体－アルブミン－パクリタキセルナノ粒子複合体の凍結乾燥は、例えば米国特許第９４４６１４８号に記載されており、その開示内容は援用によって本明細書の内容の一部をなす。

「治療」という用語は、ヒト患者のような対象における病気又は疾患（例えば癌）の治療を包含し、（ｉ）病気又は疾患の抑制、すなわち病気又は疾患の進行の停止、（ｉｉ）病気又は疾患の緩和、すなわち病気又は疾患の後退、（ｉｉｉ）病気又は疾患の増悪の遅延、及び／又は（ｉｖ）病気又は疾患の１以上の症状の抑制、緩和又は増悪遅延を包含する。

細胞／細胞集団に関して「死滅させる」という用語は、その細胞／細胞集団の死をもたらす任意の種類の操作を包含する。

本明細書において、ナノ粒子のコアに関していう「外面」という用語は、コアの外側にあるコアの部分をいう。幾つかの実施形態では、結合剤（例えば抗体又は融合タンパク質）は外面と会合している。

本明細書で用いる「抗体特異性を保持しながら」という記載は、アルブミンと会合した抗体が、標的であるエピトープを認識（結合）し続けることを示す。抗体特異性は、大きなナノ粒子の状況及び／又はインビボでのナノ粒子の解離又は部分的解離後も保持されることがある。

本明細書で用いる「同一性」又は「類似性」という用語は、２つのペプチド間又は２つの核酸分子間の配列類似性をいう。参照ポリペプチド配列との「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」とは、２つの配列をアライメントさせ、必要に応じて、最大のパーセント配列同一性を達成するためにギャップを導入した後の候補配列において、保存的置換は配列同一性の一部として一切考慮せずに、参照ポリペプチド配列のアミノ酸残基と同一であるアミノ酸残基の百分率として定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定するためのアライメントは、当技術分野の慣用技術に属する様々な方法で、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアのような公衆に利用可能なコンピューターソフトウェアを用いて、達成できる。当業者であれば、比較すべき配列の全長にわたって最大アライメントを達成するのに必要とされるアルゴリズムを始めとして、配列のアライメントのための適切なパラメーターを決定することができる。

ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド領域（又はポリペプチド又はポリペプチド領域）が別の配列とある割合（例えば６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％又は９９％）の「配列同一性」又は「類似性」を有するとは、アライメントした状態で、２つの配列を比較したときにその割合の塩基（又はアミノ酸）が同一であることを意味する。こうしたアライメント及びパーセント配列同一性は、例えばＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ． ｅｄｓ． （２００７） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙに記載されているものなど、当技術分野で公知のソフトウェアプログラムを用いて決定することができる。生物学的に等価なポリヌクレオチドは、上記で特定したパーセント配列同一性を有し、同一又は類似の生物学的活性を有するポリペプチドをコードするものである。

本明細書に記載された修飾担体タンパク質又は修飾結合剤（例えば抗体）についていう「修飾」という用語は、記載されたポリペプチド配列がタンパク質（又は他の分子）に追加されていることを示すことがある。例えば、修飾抗体は、未修飾抗体には存在しないアルブミン結合性モチーフを含むように修飾（遺伝子操作、改変、変異導入）された抗体、或いは既に存在していたアルブミン結合性モチーフに加えてアルブミン結合性モチーフを含むように修飾された抗体とし得る。一実施形態では、モチーフは、タンパク質に存在する１以上のアミノ酸を変化（変異）させることによって追加し得る。一実施形態では、モチーフは、モチーフ配列をタンパク質（又は他の分子）に挿入することによって追加し得る。一実施形態では、モチーフは、モチーフ配列をタンパク質（又は他の分子）に共有結合させることによって追加し得る。

さらに、本明細書で用いる幾つかの用語については、以下でさらに具体的に定義される。

修飾結合剤
一態様では、本発明は、１以上のアルブミン結合性モチーフを含むように修飾された修飾ポリペプチド配列を有する修飾抗体に関する。一実施形態では、アルブミン結合性モチーフは配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１又は配列番号１２のポリペプチド配列を含む。一実施形態では、修飾抗体はアルブミンに結合する（アルブミンに結合することができる）。一実施形態では、修飾抗体は、未修飾ポリペプチド配列を有する抗体よりもアルブミンに対して高い親和性を有する。

一態様では、修飾抗体の製造方法であって、当該方法が、ポリペプチド配列を有する抗体を用意し、アルブミン結合性モチーフを含むように該ポリペプチド配列を修飾することを含む方法が開示される。一実施形態では、修飾抗体は、修飾前の抗体よりもアルブミンとの結合に関して高い親和性を有する。一実施形態では、アルブミン結合性モチーフは配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１又は配列番号１２のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、修飾前のポリペプチド配列はアルブミン結合性モチーフを含んでいない。

一実施形態では、アルブミン結合性モチーフは配列番号６のポリペプチド配列を含む。一実施形態では、アルブミン結合性モチーフは配列番号６のポリペプチド配列に対して７０％以上の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。一実施形態では、アルブミン結合性モチーフは配列番号６のポリペプチド配列に対して８０％以上の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。一実施形態では、アルブミン結合性モチーフは配列番号６のポリペプチド配列に対して８５％以上の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。一実施形態では、アルブミン結合性モチーフは配列番号６のポリペプチド配列に対して９０％以上の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。一実施形態では、アルブミン結合性モチーフは配列番号６のポリペプチド配列に対して少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。一実施形態では、アルブミン結合性モチーフは、少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０個のアミノ酸残基を含む配列番号６の切断型ポリペプチド配列を含む。

一実施形態では、アルブミン結合性モチーフは配列番号７のポリペプチド配列を含む。一実施形態では、アルブミン結合性モチーフは配列番号７のポリペプチド配列に対して７０％以上の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。一実施形態では、アルブミン結合性モチーフは配列番号７のポリペプチド配列に対して８０％以上の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。一実施形態では、アルブミン結合性モチーフは配列番号７のポリペプチド配列に対して８５％以上の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。一実施形態では、アルブミン結合性モチーフは配列番号７のポリペプチド配列に対して９０％以上の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。一実施形態では、アルブミン結合性モチーフは配列番号７のポリペプチド配列に対して少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。一実施形態では、アルブミン結合性モチーフは、少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０個のアミノ酸残基を含む配列番号７の切断型ポリペプチド配列を含む。

一実施形態では、アルブミン結合性モチーフは配列番号８のポリペプチド配列を含む。一実施形態では、アルブミン結合性モチーフは配列番号８のポリペプチド配列に対して７０％以上の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。一実施形態では、アルブミン結合性モチーフは配列番号８のポリペプチド配列に対して８０％以上の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。一実施形態では、アルブミン結合性モチーフは配列番号８のポリペプチド配列に対して８５％以上の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。一実施形態では、アルブミン結合性モチーフは配列番号８のポリペプチド配列に対して９０％以上の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。一実施形態では、アルブミン結合性モチーフは配列番号８のポリペプチド配列に対して少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。一実施形態では、アルブミン結合性モチーフは、少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７又は１８個のアミノ酸残基を含む配列番号８の切断型ポリペプチド配列を含む。

一実施形態では、アルブミン結合性モチーフは配列番号９のポリペプチド配列を含む。一実施形態では、アルブミン結合性モチーフは配列番号９のポリペプチド配列に対して７０％以上の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。一実施形態では、アルブミン結合性モチーフは配列番号９のポリペプチド配列に対して８０％以上の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。一実施形態では、アルブミン結合性モチーフは配列番号９のポリペプチド配列に対して８５％以上の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。一実施形態では、アルブミン結合性モチーフは配列番号９のポリペプチド配列に対して９０％以上の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。一実施形態では、アルブミン結合性モチーフは配列番号９のポリペプチド配列に対して少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。一実施形態では、アルブミン結合性モチーフは、少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８又は１９個のアミノ酸残基を含む配列番号９の切断型ポリペプチド配列を含む。

一実施形態では、アルブミン結合性モチーフは配列番号１０のポリペプチド配列を含む。一実施形態では、アルブミン結合性モチーフは配列番号１０のポリペプチド配列に対して７０％以上の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。一実施形態では、アルブミン結合性モチーフは配列番号１０のポリペプチド配列に対して８０％以上の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。一実施形態では、アルブミン結合性モチーフは配列番号１０のポリペプチド配列に対して８５％以上の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。一実施形態では、アルブミン結合性モチーフは配列番号１０のポリペプチド配列に対して９０％以上の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。一実施形態では、アルブミン結合性モチーフは配列番号１０のポリペプチド配列に対して少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。一実施形態では、アルブミン結合性モチーフは、少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７又は１８個のアミノ酸残基を含む配列番号１０の切断型ポリペプチド配列を含む。

一実施形態では、アルブミン結合性モチーフは配列番号１１のポリペプチド配列を含む。一実施形態では、アルブミン結合性モチーフは配列番号１１のポリペプチド配列に対して７０％以上の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。一実施形態では、アルブミン結合性モチーフは配列番号１１のポリペプチド配列に対して８０％以上の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。一実施形態では、アルブミン結合性モチーフは配列番号１１のポリペプチド配列に対して８５％以上の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。一実施形態では、アルブミン結合性モチーフは配列番号１１のポリペプチド配列に対して９０％以上の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。一実施形態では、アルブミン結合性モチーフは配列番号１１のポリペプチド配列に対して少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。一実施形態では、アルブミン結合性モチーフは、少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８又は１９個のアミノ酸残基を含む配列番号１１の切断型ポリペプチド配列を含む。

一実施形態では、アルブミン結合性モチーフは配列番号１２のポリペプチド配列を含む。一実施形態では、アルブミン結合性モチーフは配列番号１２のポリペプチド配列に対して７０％以上の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。一実施形態では、アルブミン結合性モチーフは配列番号１２のポリペプチド配列に対して８０％以上の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。一実施形態では、アルブミン結合性モチーフは配列番号１２のポリペプチド配列に対して８５％以上の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。一実施形態では、アルブミン結合性モチーフは配列番号１２のポリペプチド配列に対して９０％以上の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。一実施形態では、アルブミン結合性モチーフは配列番号１２のポリペプチド配列に対して少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。一実施形態ではアルブミン結合性モチーフは、少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８又は１９個のアミノ酸残基を含む配列番号１２の切断型ポリペプチド配列を含む。

一態様では、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１又は配列番号１２のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアルブミン結合性モチーフは、参照配列に対する置換（例えば保存的置換）、挿入又は欠失を含む。幾つかの実施形態では、かかる配列を含むアルブミン結合性モチーフは、アルブミンに結合する能力を保持する。幾つかの実施形態では、かかる配列を含むアルブミン結合性モチーフは、該モチーフが結合剤（例えば抗体又は融合タンパク質）に挿入されたときもアルブミンに結合する能力を保持する。

アルブミン結合性モチーフは抗体の任意の領域に追加することができる。幾つかの態様では、アルブミン結合性モチーフは抗体のＦｃ部分に追加される。幾つかの態様では、アルブミン結合性モチーフは抗体のＦａｂ部分に追加される。幾つかの実施形態では、アルブミン結合性モチーフは抗体の片方又は両方の重鎖に追加される。幾つかの実施形態では、アルブミン結合性モチーフは抗体の片方又は両方の可変部に追加される。幾つかの実施形態では、アルブミン結合性モチーフは抗体の片方又は両方の軽鎖に追加される。好ましくは、アルブミン結合性モチーフは、抗体の三次構造又は四次構造に実質的に影響しない抗体の領域に追加される。さらに好ましくは、アルブミン結合性モチーフは、抗体の抗原結合能に実質的に影響しない抗体の領域に追加される。一実施形態では、アルブミン結合性モチーフは抗体のアミノ末端領域に追加される。一実施形態では、アルブミン結合性モチーフは抗体のカルボキシ末端領域に追加される。

一実施形態では、複数のアルブミン結合性モチーフが結合剤の同じ領域に（例えば互いに隣接して又は約１～約３０アミノ酸以内の間隔で）追加される。一実施形態では、複数のアルブミン結合性モチーフが結合剤の異なる領域に（例えば約３０アミノ酸を超える間隔及び／又は別々のポリペプチド上に）追加される。

好ましくは、結合剤は抗体である。幾つかの実施形態では、抗体は非治療用及び非内因性ヒト抗体である。幾つかの実施形態では、抗体はキメラ抗体、非内在性ヒト抗体、ヒト化抗体又は非ヒト抗体である。抗体については本明細書でさらに定義される。

一実施形態では、抗体は公知の治療用抗体である。本発明で修飾して使用することが想定される抗体としては、限定されるものではないが、リツキシマブ、トラスツズマブ、ベバシズマブ、アレムツズマブ、ブリナツモマブ、ブレンツキシマブ、セツキシマブ、デノスマブ、ジヌツキシマブ、イブリツモマブ、イピリムマブ、ニボルマブ、オビヌツズマブ、オファツムマブ、パニツムマブ、ペンブロリズマブ、ペルツズマブ、ゲムツズマブ、トシツモマブ、ムロモナブ又はこれらのバイオシミラー（バイオ後続品）。アルブミン結合部位を含む抗体については、１以上の追加のアルブミン結合性モチーフを追加して修飾抗体を形成することができる。

一態様では、本発明は、単離アルブミン結合性モチーフに関する。一実施形態では、単離アルブミン結合性モチーフは、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１又は配列番号１２のポリペプチド配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する。一実施形態では、単離アルブミン結合性モチーフはアルブミンに結合する能力を保持する。一実施形態では、単離アルブミン結合性モチーフは抗体結合性モチーフに結合する能力を保持する。一実施形態では、単離アルブミン結合性モチーフは配列番号３、配列番号４又は配列番号５のポリペプチド配列を有するペプチド或いはそれらの変異体に結合する能力を保持する。一態様では、本発明は、例えば結合剤又はその他のアルブミンに結合する分子を作るための、単離アルブミン結合性モチーフ又はその変異体の使用に関する。

抗体を含むペプチド配列の修飾及び生産は、現在公知の方法又は将来開発されるものを含めた任意の適切な方法によって行うことができる。本開示はさらに、本明細書に記載の修飾抗体のポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチド配列、並びにそれらのポリヌクレオチド配列を含む細胞（例えばＣＨＯ又はＨＥＫ細胞）又は非ヒト動物（例えばマウス）に関する。

修飾担体タンパク質
一態様では、本発明は、１以上の抗体結合性モチーフを含むように修飾された修飾ポリペプチド配列を有する修飾担体タンパク質に関する。一実施形態では、抗体結合性モチーフは配列番号３、配列番号４又は配列番号５のポリペプチド配列を含む。一実施形態では、修飾担体タンパク質は、非修飾ポリペプチド配列を有する担体タンパク質よりも抗体に対して高い親和性を有する。

一態様では、修飾担体タンパク質の製造方法であって、当該方法が、ポリペプチド配列を有する担体タンパク質を用意し、抗体結合性モチーフを含むように該ポリペプチド配列を修飾することを含む方法が開示される。一実施形態では、修飾担体タンパク質は、修飾前の担体タンパク質よりも抗体との結合に関して高い親和性を有する。一実施形態では、抗体結合性モチーフは配列番号３、配列番号４又は配列番号５のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、担体タンパク質は、アルブミン、オボアルブミン、ゼラチン、エラスチン、エラスチン由来ポリペプチド、グリアジン、レグミン、ゼイン、大豆タンパク質、乳タンパク質又は乳清タンパク質である。一実施形態では、修飾前のポリペプチド配列は抗体結合性モチーフを含んでいない。

幾つかの実施形態では、担体タンパク質は、アルブミン、ゼラチン、エラスチン（トポエラスチンを含む）又はエラスチン由来ポリペプチド（例えばα－エラスチン及びエラスチン様ポリペプチド（ＥＬＰ））、グリアジン、レグミン、ゼイン、大豆タンパク質（例えば分離大豆タンパク質（ＳＰＩ））、乳タンパク質（例えばβ－ラクトグロブリン（ＢＬＧ）及びカゼイン）又は乳清タンパク質（例えば乳清タンパク質濃縮物（ＷＰＣ）及び乳清タンパク質分離物（ＷＰＩ））。好ましい実施形態では、担体タンパク質はアルブミンである。好ましい実施形態では、アルブミンは卵白（オボアルブミン）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などである。さらにさらに好ましい態様では、担体タンパク質はヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）である。幾つかの実施形態では、担体タンパク質は組換えタンパク質（例えば組換えＨＳＡ）である。幾つかの実施形態では、担体タンパク質は、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって承認された一般に安全と認められる（ＧＲＡＳ；generally regarded as safe）添加物である。

一実施形態では、抗体結合性モチーフは配列番号３のポリペプチド配列を含む。一実施形態では、抗体結合性モチーフは配列番号３のポリペプチド配列に対して７０％以上の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。一実施形態では、抗体結合性モチーフは配列番号３のポリペプチド配列に対して８０％以上の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。一実施形態では、抗体結合性モチーフは配列番号３のポリペプチド配列に対して８５％以上の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。一実施形態では、抗体結合性モチーフは配列番号３のポリペプチド配列に対して９０％以上の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。一実施形態では、抗体結合性モチーフは配列番号３のポリペプチド配列に対して少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。一実施形態では、抗体結合性モチーフは、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６又は１７個のアミノ酸残基を含む配列番号３の切断型ポリペプチド配列を含む。

一実施形態では、抗体結合性モチーフは配列番号４のポリペプチド配列を含む。一実施形態では、抗体結合性モチーフは配列番号４のポリペプチド配列に対して７０％以上の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。一実施形態では、抗体結合性モチーフは配列番号４のポリペプチド配列に対して８０％以上の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。一実施形態では、抗体結合性モチーフは配列番号４のポリペプチド配列に対して８５％以上の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。一実施形態では、抗体結合性モチーフは配列番号４のポリペプチド配列に対して９０％以上の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。一実施形態では、抗体結合性モチーフは配列番号４のポリペプチド配列に対して少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。一実施形態では、抗体結合性モチーフは、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６又は１７個のアミノ酸残基を含む配列番号４の切断型ポリペプチド配列を含む。

一実施形態では、抗体結合性モチーフは配列番号５のポリペプチド配列を含む。一実施形態では、抗体結合性モチーフは配列番号５のポリペプチド配列に対して７０％以上の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。一実施形態では、抗体結合性モチーフは配列番号５のポリペプチド配列に対して８０％以上の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。一実施形態では、抗体結合性モチーフは配列番号５のポリペプチド配列に対して８５％以上の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。一実施形態では、抗体結合性モチーフは配列番号５のポリペプチド配列に対して９０％以上の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。一実施形態では、抗体結合性モチーフは配列番号５のポリペプチド配列に対して少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。一実施形態では、抗体結合性モチーフは、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６又は１７個のアミノ酸残基を含む配列番号５の切断型ポリペプチド配列を含む。

一態様では、配列番号３、配列番号４又は配列番号５のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する抗体結合性モチーフは、参照配列に対する置換（例えば保存的置換）、挿入又は欠失を含む。幾つかの実施形態では、かかる配列を含む抗体結合性モチーフは抗体に結合する能力を保持する。幾つかの態様では、かかる配列を含む抗体結合性モチーフは、該モチーフが担体タンパク質に挿入されたときも抗体に結合する能力を保持する。

抗体結合性モチーフは、担体タンパク質の任意の領域に追加することができる。好ましくは、抗体結合性モチーフは、担体タンパク質の三次構造又は四次構造に実質的に影響しない。一実施形態では、抗体結合性モチーフは、担体タンパク質のアミノ末端領域に追加される。一実施形態では、抗体結合性モチーフは、担体タンパク質のカルボキシ末端領域に追加される。

一実施形態では、複数の抗体結合性モチーフが、担体タンパク質の同じ領域に（例えば互いに隣接して又は約１～約３０アミノ酸以内の間隔で）追加される。一実施形態では、複数の抗体結合性モチーフが担体タンパク質の異なる領域に（例えば約３０アミノ酸を超える間隔で）追加される。

一実施形態では、本発明は単離抗体結合性モチーフに関する。一実施形態では、単離抗体結合性モチーフは、配列番号３、配列番号４又は配列番号５のポリペプチド配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する。一実施形態では、単離抗体結合性モチーフは、抗体に結合する能力を保持する。一実施形態では、単離抗体結合性モチーフは、アルブミン結合性モチーフに結合する能力を保持する。一実施形態では、単離抗体結合性モチーフは配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１又は配列番号１２のポリペプチド配列を有するペプチド或いはそれらの変異体に結合する能力を保持する。一態様では、本発明は、例えば担体タンパク質又はその他の抗体と結合する分子を作るための、単離抗体結合性モチーフ又はその変異体の使用に関する。

担体タンパク質を含むペプチド配列の修飾及び生産は、現在公知の方法又は将来開発されるものを含めた任意の適切な方法によって行うことができる。本開示はさらに、本明細書に記載の修飾担体タンパク質のポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチド配列、並びにそれらのポリヌクレオチド配列を含む細胞（例えばＣＨＯ又はＨＥＫ細胞）又は非ヒト動物（例えばマウス）に関する。

ペプチド変異体
特定の実施形態では、本発明で提供される抗体結合性モチーフ及びアルブミン結合性モチーフのアミノ酸配列変異体が想定される。例えば、該モチーフ（又は該モチーフを含むタンパク質）の結合親和性及び／又は他の生物学的特性を改善することが望まれることがある。モチーフのアミノ酸配列変異体は、モチーフをコードするヌクレオチド配列に適切な修飾を導入することによって或いはペプチド合成によって調製することができる。かかる修飾には、例えば、モチーフのアミノ酸配列の残基の欠失及び／又は挿入及び／又は置換が挙げられる。幾つかの実施形態では、最終構築物が所望の特性（例えば抗体結合特性又はアルブミン結合特性）を有することを条件として、最終構築物に到達するため欠失、挿入及び置換の任意の組合せを行うことができる。

ある態様では、１以上のアミノ酸置換を有する抗体変異体が提供される。保存的置換を、以下の表１に「好ましい置換」という見出しの下に示す。さらに実質的な変更を、表１の「置換の例」という見出しの下に示すとともに、アミノ酸側鎖の分類に関連して以下でさらに説明する。アミノ酸置換を目的の抗体に導入して、生成物を所望の活性（例えば保持／改善された抗原結合性、減少した免疫原性、又は改善されたＡＤＣＣ若しくはＣＤＣ）についてスクリーニングすればよい。

アミノ酸は、共通する側鎖の性質に従って分類することができる。
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖の配向に影響を与える残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。

非保存的置換は、これらの分類の一つに属するものを別の分類のものに交換することを伴う。

ある実施形態では、その変更によってモチーフが抗体（抗体結合性モチーフの場合）又はアルブミン（アルブミン結合性モチーフの場合）と結合する能力が実質的に低下しない限り、モチーフ内で置換、挿入又は欠失が生じてもよい。例えば、結合親和性を実質的に低下させない保存的改変（例えば本明細書で規定する保存的置換）をなすことができる。

一実施形態では、変異体は、所定の位置に１～５個のアミノ酸置換を有する。一実施形態では、変異体は、所定の位置に１～５個のアミノ酸欠失を有する。一実施形態では、変異体は、所定の位置に１～１０のアミノ酸挿入を有する。一実施形態では、変異体は、カルボキシ末端領域及び／又はアミノ末端領域に追加された１個以上（例えば１～２００個）のアミノ酸を有する。

一実施形態では、アルブミン結合性モチーフ変異体は、アルブミンに結合する能力を保持する。一実施形態では、アルブミン結合性モチーフ変異体は抗体結合性モチーフに結合する能力を保持する。一実施形態では、アルブミン結合性モチーフ変異体は、配列番号３、配列番号４又は配列番号５のポリペプチド配列を有するペプチド或いはそれらの変異体に結合する能力を保持する。

一実施形態では、抗体結合性モチーフ変異体は抗体に結合する能力を保持する。一実施形態では、抗体結合性モチーフ変異体は、アルブミン結合性モチーフに結合する能力を保持する。一実施形態では、抗体結合性モチーフ変異体は、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１又は配列番号１２のポリペプチド配列を有するペプチド或いはそれらの変異体に結合する能力を保持する。

変異導入の標的となり得る抗体の残基又は領域を同定するための有用な方法は、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ （１９８９） Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４４：１０８１－１０８５に記載されているように「アラニンスキャニング変異導入」と呼ばれる。この方法では、残基又は複数の標的残基の群（例えばａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ及びｇｌｕなどの荷電残基）を同定し、中性又は負に荷電したアミノ酸（例えばアラニン又はポリアラニン）で置換して、抗原との抗体の相互作用が影響を受けるか否かを調べる。最初の置換に対して機能的感受性を示したアミノ酸位置に追加の置換を導入してもよい。その代わりに又はそれに加えて、抗原－抗体複合体の結晶構造を用いて抗体と抗原との接触点を同定する。アルブミン－抗体複合体の結晶構造も同様に抗体とアルブミンとの接触点を同定するのに使用し得る。このような接触残基及び隣接残基は、置換の候補として標的にしてもよいし、除去してもよい。変異体は、それらが所望の特性を含むか否かを決定するためにスクリーニングし得る。

アミノ酸配列挿入は、１残基から１００残基以上のポリペプチドに至る長さのアミノ末端及び／又はカルボキシル末端融合部、並びに１個は複数のアミノ酸残基の配列内挿入を包含する。

修飾ナノ粒子複合体
本開示は、抗体結合性モチーフを含む担体タンパク質、アルブミン結合性モチーフを含む抗体又は他のタンパク質、及び任意的に治療薬を含むナノ粒子複合体及びナノ粒子組成物に関する。担体タンパク質及び抗体の一方又は両方は、抗体結合性モチーフ及び／又はアルブミン結合性モチーフの１以上を含むように修飾される。

一実施形態では、本発明は、１以上の抗体結合性モチーフを含むように修飾された修飾ポリペプチド配列を有する担体タンパク質、各々の抗体が抗原結合性ドメインを有する複数の抗体、及び任意的に治療薬を含むナノ粒子複合体であって、インビボで抗原に対する結合特異性を有するナノ粒子複合体に関する。

一実施形態では、本発明は、アルブミン、１以上のアルブミン結合性モチーフを含むように修飾された修飾ポリペプチド配列を有する抗体又は融合タンパク質であって抗原結合性ドメインを有する抗体又は融合タンパク質、及び任意的に治療薬を含むナノ粒子複合体であって、インビボで抗原に対する結合特異性を有するナノ粒子複合体に関する。

一実施形態では、本発明は、１以上の抗体結合性モチーフを含むように修飾された修飾ポリペプチド配列を有する担体タンパク質、１以上のアルブミン結合性モチーフを含むように修飾された修飾ポリペプチド配列を有する抗体又は融合タンパク質であって抗原結合性ドメインを有する抗体又は融合タンパク質、及び任意的に治療薬を含むナノ粒子複合体であって、インビボで抗原に対する結合特異性を有するナノ粒子複合体に関する。

一実施形態では、本発明は、本明細書に記載のナノ粒子複合体を含む組成物に関する。

一実施形態では、抗体結合性モチーフは配列番号３、配列番号４又は配列番号５のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、抗体結合性モチーフは配列番号３、配列番号４又は配列番号５のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。

一実施形態では、アルブミン結合性モチーフは配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１又は配列番号１２のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、アルブミン結合性モチーフは、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１又は配列番号１２のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。

一実施形態では、治療薬はパクリタキセルである。

一実施形態では、複合体は１μｍ未満の平均サイズを有する。一実施形態では、ナノ粒子複合体は約９０ｎｍ～約８００ｎｍの平均サイズを有する。一実施形態では、ナノ粒子複合体は約９０ｎｍ～約４００ｎｍの平均サイズを有する。一実施形態では、ナノ粒子複合体は約９０ｎｍ～約２００ｎｍの平均サイズを有する。一実施形態では、ナノ粒子複合体は約１００ｎｍ～約８００ｎｍの平均サイズを有する。一実施形態では、ナノ粒子複合体は約１００ｎｍ～約４００ｎｍの平均サイズを有する。一実施形態では、ナノ粒子複合体は約１００ｎｍ～約２００ｎｍの平均サイズを有する。サイズは、上下限を含め、これらの範囲内の任意の値又は部分範囲とし得る。

一実施形態では、アルブミン－治療薬と抗体との比は１０：１～１０：３０である。比率は、上下限を含め、この範囲内の任意の値又は部分範囲とし得る。一実施形態では、各々のナノ粒子複合体は約１００～約１０００個の抗体を含む。一実施形態では、各々のナノ粒子複合体は約１００～約８００個の抗体を含む。抗体の数は、上下限を含め、これらの範囲内の任意の値又は部分範囲とし得る。

一実施形態では、アルブミンはヒト血清アルブミンである。一実施形態では、ヒト血清アルブミンは組換えヒト血清アルブミンである。

一実施形態では、ナノ粒子複合体は凍結乾燥される。一実施形態では、ナノ粒子複合体を含む組成物は凍結乾燥される。一実施形態では、凍結乾燥複合体又は組成物は、水溶液中で再構成したときに、インビボで抗原に結合（認識／結合）する能力が残っているナノ粒子複合体を含む。

一実施形態では、担体タンパク質は、アルブミン、オボアルブミン、ゼラチン、エラスチン、エラスチン由来ポリペプチド、グリアジン、レグミン、ゼイン、大豆タンパク質、乳タンパク質又は乳清タンパク質である。一実施形態では、担体タンパク質はアルブミンである。一実施形態では、アルブミンは、追加の抗体結合性モチーフを含むように修飾される。

一実施形態では、抗体又は融合タンパク質は、非共有結合によって担体タンパク質と会合している。一実施形態では、抗体又は融合タンパク質は、抗体結合性モチーフ及び／又はアルブミン結合性モチーフを介して担体タンパク質と会合している。一実施形態では、パクリタキセルは、非共有結合によって担体タンパク質と会合している。一実施形態では、抗体又は融合タンパク質は、抗体結合性モチーフを介して担体タンパク質と非共有結合的に会合している。一実施形態では、抗体又は融合タンパク質は、アルブミン結合性モチーフを介して担体タンパク質と非共有結合的に会合している。

一実施形態では、修飾担体タンパク質の少なくともサブセットは、２以上の抗体結合性モチーフを含む。一実施形態では、修飾抗体又は融合タンパク質の少なくともサブセットは、２以上のアルブミン結合性モチーフを含む。

一実施形態では、組成物は薬学的に許容される添加物をさらに含む。

幾つかの態様では、化学療法薬は担体タンパク質と会合している。幾つかの実施形態では、複合体は治療量以下の量のパクリタキセルをさらに含む。

幾つかの実施形態では、化学療法薬の有効量は、約１００ｍｇ／ｍ^２、約１０５ｍｇ／ｍ^２、約１１０ｍｇ／ｍ^２、約１１５ｍｇ／ｍ^２、約１２０ｍｇ／ｍ^２、約１２５ｍｇ／ｍ^２、約１３０ｍｇ／ｍ^２、約１３５ｍｇ／ｍ^２、約１４０ｍｇ／ｍ^２、約１４５ｍｇ／ｍ^２、約１５０ｍｇ／ｍ^２、約１５５ｍｇ／ｍ^２、約１６０ｍｇ／ｍ^２、１６５ｍｇ／ｍ^２、約１７０ｍｇ／ｍ^２、約１７５ｍｇ／ｍ^２、約１８０ｍｇ／ｍ^２、約１８５ｍｇ／ｍ^２、約１９０ｍｇ／ｍ^２、約１９５ｍｇ／ｍ^２又は約２００ｍｇ／ｍ^２の化学療法薬からなる量から選択される。

なお、治療薬（すなわち、化学療法薬）は、ナノ粒子の内側、外側表面又はその両方に位置し得る。ナノ粒子は、２種以上の異なる治療薬、例えば、２種類の治療薬、３種類の治療薬、４種類の治療薬、５種類の治療薬又はそれ以上を含んでいてもよい。さらに、ナノ粒子は、ナノ粒子の内側及び外側に同一又は異なる治療薬を含んでいてもよい。

一態様では、ナノ粒子中の化学療法薬（例えばパクリタキセル）の量は、ナノ粒子の形成を可能にするのに十分である。抗体－アルブミンナノ粒子複合体の形成のための治療量以下の量のパクリタキセルの使用は、例えば２０１６年９月６日出願の米国仮特許出願第６２／３８４１１９号に記載されており、その開示内容は援用によって本明細書の内容の一部をなす。

一実施形態では、ナノ粒子複合体に存在するパクリタキセルの量は、ナノ粒子複合体に安定性をもたらすことができる最小量以上である。一実施形態では、ナノ粒子複合体に存在するパクリタキセルの量は、タンパク質担体に対する１種以上の治療薬の親和性をもたらすことができる最小量以上である。一実施形態では、ナノ粒子複合体に存在するパクリタキセルの量は、１種以上の治療薬とタンパク質担体との複合体形成を促進することができる最小量以上である。一実施形態では、ナノ粒子複合体の担体タンパク質とパクリタキセルとの重量比は約９：１超である。一実施形態では、重量比は、約１０：１超、約１１：１超、約１２：１超、約１３：１超、約１４：１超、約１５：１超、約１６：１超、約１７：１超、約１８：１超、約１９：１超、約２０：１超、約２１：１超、約２２：１超、約２３：１超、約２４：１超、約２５：１超、約２６：１超、約２７：１超、約２８：１超、約２９：１超又は約３０：１超である。一実施形態では、パクリタキセルの量は、ナノ粒子複合体に安定性をもたらすことができる最小量に等しい。一実施形態では、パクリタキセルの量は、タンパク質担体に対する１種以上の治療薬の親和性をもたらすことができる最小量以上である。一実施形態では、パクリタキセルの量は、１種以上の治療薬とタンパク質担体との複合体形成を促進することができる最小量以上である。これらの実施形態のいずれにおいても、パクリタキセルの量は、パクリタキセルの治療量未満とすることができる。換言すると、その量は、治療効果をもたらすために規定又は想定される量（例えば癌を効果的に治療するための化学療法量など）よりも少なくてもよい。

一実施形態では、ナノ粒子組成物に存在するパクリタキセルの量は、水溶液で再構成したときに約５ｍｇ／ｍＬ未満である。一実施形態では、ナノ粒子組成物に存在するパクリタキセルの量は、水溶液で再構成したときに約４．５４ｍｇ／ｍＬ未満、約４．１６ｍｇ／ｍＬ未満、約３．５７ｍｇ／ｍＬ未満、約３．３３ｍｇ／ｍＬ未満、約３．１２ｍｇ／ｍＬ未満、約２．９４ｍｇ／ｍＬ未満、約２．７８ｍｇ／ｍＬ未満、約２．６３ｍｇ／ｍＬ未満、約２．５ｍｇ／ｍＬ未満、約２．３８ｍｇ／ｍＬ未満、約２．２７ｍｇ／ｍＬ未満、約２．１７ｍｇ／ｍＬ未満、約２．０８ｍｇ／ｍＬ未満、約２ｍｇ／ｍＬ未満、約１．９２ｍｇ／ｍＬ未満、約１．８５ｍｇ／ｍＬ未満、約１．７８ｍｇ／ｍＬ未満、約１．７２ｍｇ／ｍＬ未満又は約１．６７ｍｇ／ｍＬ未満である。

幾つかの実施形態では、抗体、アプタマー、治療薬又はそれらの組合せは明示的に除外される。

ある場合には、本明細書に記載の複合体は、１μｍ未満の平均直径を有するように設計できる。例えば、１μｍ未満の平均直径を有する複合体が形成されるように、適切な濃度の担体タンパク質及び抗体（又は他の結合剤）を使用することができる。ある場合には、本発明で提供される複合体は、０．１μｍ～１μｍ（例えば０．１μｍ～０．９５μｍ、０．１μｍ～０．９μｍ、０．１μｍ～０．８μｍ、０．１μｍ～０．７μｍ、０．１μｍ～０．６μｍ、０．１μｍ～０．５μｍ、０．１μｍ～０．４μｍ、０．１μｍ～０．３μｍ、０．１μｍ～０．２μｍ、０．２μｍ～１μｍ、０．３μｍ～１μｍ、０．４μｍ～１μｍ、０．５μｍ～１μｍ、０．２μｍ～０．６μｍ、０．３μｍ～０．６μｍ、０．２μｍ～０．５μｍ又は０．３μｍ～０．５μｍ）の平均直径を有することができる。０．１μｍ～０．９μｍの平均直径を有する本発明で提供される複合体は、哺乳動物の体内に存在する癌その他の疾患を治療するために全身的（例えば静脈内）に投与することができる。

ある場合には、本発明で提供される複合体は、該複合体の６０％超（例えば６５％超、７０％超、７５％超、８０％超、９０％超、９５％超又は９９％超）が０．１μｍ～０．９μｍ（例えば０．１μｍ～０．９５μｍ、０．１μｍ～０．９μｍ、０．１μｍ～０．８μｍ、０．１μｍ～０．７μｍ、０．１μｍ～０．６μｍ、０．１μｍ～０．５μｍ、０．１～０．４μｍ、０．１μｍ～０．３μｍ、０．１μｍ～０．２μｍ、０．２μｍ～１μｍ、０．３μｍ～１μｍ、０．４μｍ～１μｍ、０．５μｍ～１μｍ、０．２μｍ～０．６μｍ、０．３μｍ～０．６μｍ、０．２μｍ～０．５μｍ又は０．３μｍ～０．５μｍ）の直径を有する。直径０．１μｍ～０．９μｍの複合体を６０％超（例えば６５％超、７０％超、７５％超、８０％超、９０％超、９５％超又は９９％超）有する本発明で提供される複合体は、哺乳動物の体内に存在する関連抗原を発現する癌その他の疾患を治療するために全身的（例えば静脈内）に投与することができる。

一態様では、ナノ粒子組成物の平均粒子サイズは、約１μｍ未満である。一態様では、ナノ粒子組成物の平均粒子サイズは約９０ｎｍ～約１μｍ（例えば約９０ｎｍ～約８００ｎｍ、約９０ｎｍ～約７００ｎｍ、約９０ｎｍ～約６００ｎｍ、約９０ｎｍ～約５００ｎｍ、約９０ｎｍ～約４００ｎｍ、約９０ｎｍ～約３００ｎｍ、約９０ｎｍ～約２００ｎｍ又は約９０ｎｍ～約１８０ｎｍ）である。想定される値は、上下限を含め、これらの範囲内の任意の値、部分範囲又は範囲を包含する。

好ましい態様では、本明細書に記載されたサイズ及びサイズ範囲は、再構成した凍結乾燥ナノ粒子組成物の粒子サイズに関する。すなわち、凍結乾燥ナノ粒子を水溶液（例えば水、ＰＢＳ、その他の薬学的に許容される添加物、緩衝液など）に再懸濁した後の粒子サイズ又は平均粒子サイズは本明細書に記載された範囲内にある。

一態様では、ナノ粒子の少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％又は９９．９％は、再構成組成物中で単一ナノ粒子として存在する。すなわち、ナノ粒子の約５０％未満、４０％未満、３０％未満等々しか二量化又はオリゴマー化されない。幾つかの実施形態では、組成物中のナノ粒子の二量化の割合は、個数基準で、２０％未満、１０％未満、好ましくは５％未満である。

幾つかの実施形態では、ナノ粒子のサイズは、結合剤に対する担体タンパク質の量（例えば比率）を調整することによって制御できる。ナノ粒子のサイズ及びサイズ分布も重要である。本発明のナノ粒子は、それらのサイズに応じて異なる挙動を呈することがある。大きなサイズでは、凝集塊が血管を塞ぎかねない。したがって、ナノ粒子の凝集は、組成物の性能及び安全性に影響を与えかねない。一方、大きな粒子は、特定の条件下（例えば静脈内投与しない場合）で治療効果が高まることがある。

一態様では、ナノ粒子複合体は、ナノ粒子の表面に非共有結合した約１００～約１０００個の結合剤を含む。一態様では、ナノ粒子複合体は、ナノ粒子の表面に非共有結合した約２００～約１０００個の結合剤を含む。一態様では、ナノ粒子複合体は、ナノ粒子の表面に非共有結合した約３００～約１０００個の結合剤を含む。一態様では、ナノ粒子複合体は、ナノ粒子の表面に非共有結合した約４００～約１０００個の結合剤を含む。一態様では、ナノ粒子複合体は、ナノ粒子の表面に非共有結合した約５００～約１０００個の結合剤を含む。一態様では、ナノ粒子複合体は、ナノ粒子の表面に非共有結合した約６００～約１０００個の結合剤を含む。一態様では、ナノ粒子複合体は、ナノ粒子の表面に非共有結合した約２００～約８００個の結合剤を含む。一態様では、ナノ粒子複合体は、ナノ粒子の表面に非共有結合した約３００～約８００個の結合剤を含む。好ましい実施形態では、ナノ粒子複合体は、ナノ粒子の表面に非共有結合した約４００～約８００個の結合剤を含む。想定される値は、上下限を含め、これらの範囲内の任意の値又は部分範囲を包含する。

一実施形態では、結合剤は腫瘍抗原に結合する（腫瘍抗原に特異的である）。一実施形態では、結合剤は、α－フェトプロテイン（ＡＦＰ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＡ－１２５、ＭＵＣ－１、上皮腫瘍抗原（ＥＴＡ）、メラノーマ関連抗原（ＭＡＧＥ）、チロシナーゼ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＣＤ３、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ４７、ＣＤ２７４、ＣＤ２７９、ＣＤ３０、ＣＤ５２、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＧＤ２、ＶＥＧＦ、ＢＣＲ－ＡＢＬ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＭＡＧＥ－１、ＭＡＧＥ－３、ＳＳＸ２、メランＡ、ＥＧＦＲ、ＣＤ３８又はＲＡＮＫリガンドに結合する。これらは抗原の例示にすぎず、限定的なものではない。

修飾ナノ粒子複合体の製造方法
一態様では、本発明は、ナノ粒子複合体の製造方法であって、アルブミンを、１以上のアルブミン結合性モチーフを含むように修飾された修飾ポリペプチド配列を有する抗体と、ナノ粒子複合体を形成する条件下で、一緒にすることを含む方法に関する。一実施形態では、担体タンパク質又はナノ粒子複合体を治療薬と一緒にする。一実施形態では、治療薬はパクリタキセルである。

一態様では、ナノ粒子複合体の製造方法であって、１以上の抗体結合性モチーフを含むように修飾された修飾ポリペプチド配列を有する担体タンパク質を抗体と共にインキュベートすることを含む方法が開示される。一実施形態では、担体タンパク質はアルブミンである。一実施形態では、担体タンパク質又はナノ粒子複合体を治療薬と一緒にする。一実施形態では、治療薬はパクリタキセルである。一態様では、抗体は、１以上のアルブミン結合性モチーフを含むように修飾された修飾ポリペプチド配列を有する修飾抗体である。

一態様では、ナノ粒子複合体は、担体タンパク質又は担体タンパク質－治療薬粒子を結合剤と、約１０：１～約１０：３０の担体タンパク質粒子又は担体タンパク質－治療薬粒子／結合剤比で接触させることによって形成される。一実施形態では、上記比は約１０：２～約１０：２５である。一実施形態では、上記比は約１０：２～約１：１である。好ましい実施形態では、上記比は約１０：２～約１０：６である。特に好ましい実施形態では、上記比は約１０：４である。想定される比は、上下限を含め、これらの範囲内の任意の値、部分範囲又は範囲を包含する。

一実施形態では、ナノ粒子の形成に使用される溶液その他の液体媒体の量が特に重要である。担体タンパク質（又は担体タンパク質－治療薬）及び抗体の過度に希釈された溶液中ではナノ粒子は形成されない。過度に濃縮された溶液は、組織化されていない凝集物を生じる。幾つかの実施形態では、使用される溶液（例えば滅菌水、生理食塩水、リン酸緩衝食塩水）の量は約０．５ｍＬの溶液～約２０ｍＬの溶液である。幾つかの実施形態では、担体タンパク質の量は約１ｍｇ／ｍＬ～約１００ｍｇ／ｍＬである。幾つかの実施形態では、結合剤の量は約１ｍｇ／ｍＬ～約３０ｍｇ／ｍＬである。例えば、幾つかの実施形態では、担体タンパク質：結合剤：溶液の比は、１ｍＬの溶液（例えば生理食塩水）中、約９ｍｇの担体タンパク質（例えばアルブミン）と４ｍｇの結合剤（例えば抗体（例えばＢＥＶ））である。ある量の治療薬（例えばタキソール）も担体タンパク質に添加することができる。例えば、１ｍＬの溶液中、４ｍｇの結合剤（例えば抗体、Ｆｃ融合分子又はアプタマー）及び９ｍｇの担体タンパク質に１ｍｇのタキソール（１０ｍｇの担体タンパク質－治療薬）を添加することができる。典型的な静注用バッグを例えば約１リットルの溶液と共に使用する場合、１ｍＬで使用する場合と比較して１０００倍量の担体タンパク質／担体タンパク質－治療薬及び抗体を使用する必要がある。そのため、本発明のナノ粒子は、標準的な静注用バッグ内では形成することはできない。さらに、各成分を本発明の治療量で標準的な静注用バッグに加えても、それらの成分が自己集合してナノ粒子を形成することはない。

一実施形態では、担体タンパク質又は担体タンパク質－治療薬粒子は、約４～約８のｐＨを有する溶液中で結合剤と接触させる。一実施形態では、担体タンパク質又は担体タンパク質－治療薬粒子は、約４のｐＨを有する溶液中で結合剤と接触させる。一実施形態では、担体タンパク質又は担体タンパク質－治療薬粒子は、約５のｐＨを有する溶液中で結合剤と接触させる。一実施形態では、担体タンパク質又は担体タンパク質－治療薬粒子は、約６のｐＨを有する溶液中で結合剤と接触させる。一実施形態では、担体タンパク質又は担体タンパク質－治療薬粒子は、約７のｐＨを有する溶液中で結合剤と接触させる。一実施形態では、担体タンパク質又は担体タンパク質－治療薬粒子は、約８のｐＨを有する溶液中で結合剤と接触させる。例えば、担体タンパク質又は担体タンパク質－治療薬粒子は、約５～約７のｐＨを有する溶液中で結合剤と接触させる。

一実施形態では、担体タンパク質粒子又は担体タンパク質－治療薬粒子を、約５℃～約６０℃の温度或いは上下限を含めて、この範囲内の任意の範囲、部分範囲又は値の温度で、結合剤と共にインキュベートする。好ましい態様では、担体タンパク質粒子又は担体タンパク質－治療薬粒子を、約２３℃～約６０℃の温度で結合剤と共にインキュベートする。一実施形態では、担体タンパク質粒子又は担体タンパク質－治療薬粒子を室温で結合剤と共にインキュベートする。

理論に縛られるものではないが、ナノ粒子複合体の安定性は、少なくとも部分的には、ナノ粒子複合体が形成される温度及び／又はｐＨ、並びに溶液中の各成分（すなわち、担体タンパク質、結合剤及び任意的に治療薬）の濃度に依存すると考えられる。

一般に、担体タンパク質、化学療法薬及び結合剤の任意の適切な組合せを本明細書に記載の通り使用することができる。例えば、適量の担体タンパク質（例えば化学療法薬と共に）及び適量の結合剤を同じ容器内で一緒に混合することができる。この混合物は、癌患者に投与する前に、適温（例えば室温、５℃～６０℃、２３℃～６０℃、１５℃～３０℃、１５℃～２５℃、２０℃～３０℃又は２０℃～２５℃）で所定期間（例えば約３０分間或いは約５～約６０分間、約５～約４５分間、約１５～約６０分間、約１５～約４５分間、約２０～約４００分間又は約２５～約３５分間）インキュベートすることができる。

ある場合には、化学療法薬を含む担体タンパク質ナノ粒子を結合剤と接触させて、患者に投与するまで保存される複合体を形成することができる。例えば、組成物を、本明細書に記載の通り形成して、患者に投与されるまの期間（例えば数日又は数週間）保存することができる。

幾つかの実施形態では、化学療法薬は、アビラテロン、ベンダムスチン、ボルテゾミブ、カルボプラチン、カバジタキセル、シスプラチン、クロラムブシル、ダサチニブ、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、エルロチニブ、エトポシド、エベロリムス、ゲフィチニブ、イダルビシン、イマチニブ、ヒドロキシウレア、イマチニブ、ラパチニブ、リュープロレリン、メルファラン、メトトレキサート、ミトキサントロン、ネダプラチン、ニロチニブ、オキサリプラチン、パクリタキセル、パゾパニブ、ペメトレキセド、ピコプラチン、ロミデプシン、サトラプラチン、ソラフェニブ、ベムラフェニブ、スニチニブ、テニポシド、トリプラチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、ビンクリスチン及びシクロホスファミドからなる群から選択される。

他の化学療法薬を含むアブラキサン（登録商標）及びアルブミン粒子の両方が、米国特許第７７５８８９１号、同第７８２０７８８号、同第７９２３５３６号、同第８０３４３７５号、同第８１３８２２９号、同第８２６８３４８号、同第８３１４１５６号、同第８８５３２６０号及び同第９１０１５４３号に開示されており、その各々の開示内容は援用によって本明細書の内容の一部をなす。さらに、担体タンパク質、化学療法薬、抗体コンジュゲート又はそれらの組合せは、ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０５４２９５及び米国特許出願公開第２０１４／０１７８４８６号に開示されており、その各々の開示内容は援用によって本明細書の内容の一部をなす。

凍結乾燥
本発明の凍結乾燥組成物は、安定剤、緩衝剤などの存在下又は非存在下での、標準的な凍結乾燥技術によって調製される。驚くべきことに、これらの条件はナノ粒子の比較的脆弱な構造を変化させない。さらに、これらのナノ粒子は凍結乾燥時にそれらのサイズ分布を保持し、さらに重要なことに、あたかも新たに調製したかのように実質的に同じ形態及び比率でインビボ投与（例えば静脈内送達）のために再構成し得る。

製剤
一態様では、ナノ粒子組成物は全身送達、例えば静脈内投与用に製剤化される。

一態様では、ナノ粒子組成物は、腫瘍への直接注射用に製剤化される。直接注射は、腫瘍部位又はその近傍への注射、腫瘍への灌流などを包含する。ナノ粒子組成物は全身投与されないので、ナノ粒子組成物は腫瘍への直接注射用に製剤化され、任意の平均粒子サイズを含んでいてもよい。理論に縛られるものではないが、大きな粒子（例えば５００ｎｍ超、１μｍ超など）は、腫瘍内に固定化される可能性が高く、そのため有益な効果が高まると考えられる。

別の態様では、本発明で提供される化合物と１種以上の薬学的に許容される添加物とを含む組成物が本明細書で提供される。

一般に、本発明で提供される化合物は、許容される投与様式のいずれかによって患者に投与するために製剤化することができる。様々な製剤及び薬物送達システムが当技術分野で利用できる。例えば、Ｇｅｎｎａｒｏ， Ａ．Ｒ．， ｅｄ． （１９９５） Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， １８ｔｈ ｅｄ．， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．参照。

一般に、本発明で提供される化合物は、医薬組成物として、以下の経路：経口、全身（例えば経皮、鼻腔内又は坐剤）又は非経口（例えば筋肉内、静脈内又は皮下）投与のいずれかによって投与される。

組成物は、一般に、本発明の化合物と１種以上の薬学的に許容される添加物との組合せからなる。許容される添加物は非毒性であり、投与を助長し、本発明に係る化合物の治療効果に悪影響を及ぼさない。かかる添加物は、固体、液体、半固体、或いはエアロゾル組成物の場合には当業者が一般に入手し得る気体添加物とし得る。

固体医薬添加物としては、デンプン、セルロース、タルク、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルクなどが挙げられる。液体及び半固体添加物は、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノール、並びに石油、動物、植物又は合成起源のものを始めとする各種の油、例えば落花生油、大豆油、鉱油、ゴマ油などから選択し得る。液体担体、特に注射液用の液体担体としては、水、生理食塩水、水性デキストロース及びグリコールが挙げられる。他の適切な医薬添加物及びそれらの製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｅ． Ｗ． Ｍａｒｔｉｎ （Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ， １８ｔｈ ｅｄ．， １９９０）に記載されている。

本発明の組成物は、所望に応じて、活性成分を含有する１以上の単位用量剤形を含むパック又はディスペンサー装置で提供し得る。かかるパック又は装置は、例えば、ブリスターパックのように金属若しくはプラスチック箔、又はバイアルのようにガラス及びゴム栓を備えていてもよい。パック又はディスペンサー装置には、投与のための説明書を添付してもよい。また、本発明の化合物を適合性の医薬担体中に製剤化してなる組成物を調製し、適切な容器に入れ、所定の状態の治療に関するラベルを貼付してもよい。

修飾ナノ粒子複合体の使用方法
本明細書に記載のナノ粒子複合体は、哺乳動物の癌細胞及び／又は腫瘍の治療に有用である。好ましい実施形態では、哺乳動物はヒト（すなわちヒトの患者）である。好ましくは、凍結乾燥ナノ粒子組成物を投与前に再構成する（水性添加物中に懸濁する）。

一態様では、癌細胞を処置するための方法であって、細胞を有効量のナノ粒子複合体と接触させること及び癌細胞の治療のための本明細書に記載の免疫療法を含む方法が提供される。癌細胞の処置としては、増殖の減少、細胞の死滅、細胞の転移の予防などが挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書に記載の複合体を得るには適切な方法を用いればよい。本明細書に記載の複合体を哺乳動物に投与するには適切な方法を用いればよい。例えば、担体タンパク質／結合剤／化学療法薬複合体を含む組成物は、注射（例えば皮下注射、筋肉内注射、静脈内注射又は髄腔内注射）によって投与できる。

本明細書に記載のナノ粒子複合体、組成物及び方法によって治療することができる癌又は腫瘍としては、胆道癌；膠芽腫及び髄芽腫を含む脳腫瘍；乳癌；子宮癌；卵管癌；子宮頸癌；絨毛癌；大腸癌；膀胱癌；子宮内膜癌；膣癌；外陰癌；食道癌；口腔癌；胃癌；腎臓癌；急性リンパ性白血病及び骨髄性白血病を含む血液腫瘍；多発性骨髄腫；エイズ関連白血病及び成人Ｔ細胞白血病リンパ腫；ボーエン病及びパジェット病を含む上皮内腫瘍；肝癌（肝細胞癌）；肺癌；頭頸部癌又は口腔癌（口、喉、食道、鼻咽頭、顎、扁桃、鼻、唇、唾液腺、舌など）；ホジキン病及びリンパ球性リンパ腫を含むリンパ腫；神経芽細胞腫；神経内分泌腫瘍；扁平上皮癌を含む口腔癌；副腎癌；肛門癌；血管肉腫；虫垂癌；胆管癌；骨癌；カルチノイド腫瘍；軟部肉腫；横紋筋肉腫；眼癌；上皮細胞、間質細胞、生殖細胞及び間葉細胞から発生するものを含む卵巣癌及び卵管癌；胆嚢癌；膵癌；前立腺癌；直腸癌；平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、脂肪肉腫、線維肉腫及び骨肉腫を含む肉腫；メラノーマ、カポジ肉腫、基底細胞癌及び扁平上皮癌を含む皮膚癌；胚性腫瘍（セミノーマ、非セミノーマ［奇形腫、絨毛癌］）、間質性腫瘍及び胚細胞性腫瘍を含む精巣癌；陰茎癌；血管内皮腫；消化器癌；尿管癌；尿道癌；脊髄癌；下垂体癌；原発性中枢神経系（ＣＮＳ）リンパ腫；甲状腺癌（甲状腺腺癌及び髄様癌を含む）；並びに腺癌及びウィルムス腫瘍を含む腎臓癌が挙げられるが、これらに限定されない。重要な実施形態では、癌又は腫瘍として、乳癌、前立腺癌、結腸直腸癌、リンパ腫、多発性骨髄腫及びメラノーマが挙げられる。

本発明で提供する複合体を含む組成物を哺乳動物に投与する前に、そのが癌又は関連抗原を発現する疾患を有するか否かを決定するためにその哺乳動物を検査してもよい。哺乳動物が癌又は関連抗原を発現する疾患を有するか否かを決定するには適切な方法を用いればよい。例えば、標準的な診断技術を用いて哺乳動物（例えばヒト）を同定することができる。ある場合には、組織生検を収集及び分析して、哺乳動物が特定の抗原を発現する癌又は疾患を有するか否かを判定することができる。

哺乳動物が疾患又は癌を有すると同定されると、本発明で提供される複合体を含む組成物をその哺乳動物に投与することができる。例えば、複合体を含む組成物は、腫瘍の外科的切除に先だって又はその代わりに投与することができる。ある場合には、本発明で提供される複合体を含む組成物は、腫瘍の切除後に投与することができる。

ある特定の哺乳動物が特定の量に反応しないときは、その量を例えば２倍に増加させることができる。この高い濃度が投与された哺乳動物を、治療に対する反応性及び毒性症状の両方についてモニターし、それに応じて調整を行ってもよい。有効量は、治療に対する哺乳動物の反応に応じて、一定のまま保つこともできるし、スライド式又は可変用量として調整することもできる。特定の用途に用される実際の有効量には、様々な要因が影響する可能性がある。例えば、投与頻度、治療期間、複数の治療薬の併用、投与経路及び癌又は疾患の重症度によって、投与される実際の有効量の増減が必要とされることがある。

本発明で提供される複合体を含む組成物は、所望の結果（例えば無増悪生存期間（progression-freesurvival）の延長）を達成するのに有効な、適切な量及び適切な頻度で、適切な期間にわたって哺乳動物に投与し得る。ある場合には、本発明で提供される組成物は、癌又は疾患を有する哺乳動物に、癌又は疾患の増悪率（progression rate）を５％、１０％、２５％、５０％、７５％、１００％又はそれ以上減少させるために投与することができる。例えば、それ以上の癌の進行が認められなくなるまで増悪率を低下させることができる。

癌の増悪率の低下の有無を判断するために、適切な方法を用いることができる。例えば、癌の増悪率は、様々な時点で組織を撮像して、癌細胞の存在量を求めることによって評価することができる。様々な時点で決定した組織内の癌細胞の量を比較することによって増悪率を決定することができる。本明細書に記載された治療の後、増悪率を別の時間間隔で再度決定することもできる。ある場合には、治療後の癌のステージを判定して、治療前のステージと比較することによって、増悪率が低下したか否かを判定することができる。

ある場合には、本発明で提供される組成物は、未治療の癌を有する対応哺乳動物の無増悪生存期間中央値又は投与前に複合体を形成することなく担体タンパク質、化学療法薬及び結合剤で治療した癌を有する対応哺乳動物の無増悪生存期間中央値と比較して、無増悪生存期間が増加（例えば５％、１０％、２５％、５０％、７５％、１００％又はそれ以上）する条件下で、癌を有する哺乳動物に投与することができる。ある場合には、本発明で提供される組成物は、癌を有する対応哺乳動物に担体タンパク質、化学療法薬、担体タンパク質／化学療法薬ナノ粒子（結合剤なし）又は結合剤単独を投与したときの無増悪生存期間中央値と比較して、無増悪生存期間を５％、１０％、２５％、５０％、７５％、１００％又はそれ以上増加させるために癌を有する哺乳動物に投与することができる。無増悪生存期間は、いかなる期間（例えば１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月又はそれ以上）で測定してもよい。

ある場合には、本発明で提供される複合体を含む組成物は、哺乳動物の集団の８週間無増悪生存率が、本明細書に記載の複合体を含む組成物が投与されていない対応哺乳動物の集団で観察されるものよりも６５％以上（例えば６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％又はそれ以上）大きくなる条件下で哺乳動物に投与することができる。ある場合には、組成物は、哺乳動物の集団の無増悪期間（time to progression）中央値が１５０日以上（例えば少なくとも１５５日、１６０日、１６３日、１６５日又は１７０日）となる条件下で、癌を有する哺乳動物に投与することができる。

本発明で提供される複合体を含む組成物の有効量は、哺乳動物に対して有意な毒性を生じることなく、結合剤によって認識される抗原を発現する癌若しくは疾患の増悪率（progression rate）の低下、無増悪生存率の増加又は無増悪期間中央値の増加をもたらすいずれかの量とすることができる。ある特定の哺乳動物が特定の量に反応しないときは、その量を例えば２倍に増加させることができる。この高い濃度が投与された哺乳動物を、治療に対する反応性及び毒性症状の両方についてモニターし、それに応じて調整を行ってもよい。有効量は、治療に対する哺乳動物の反応に応じて、一定のまま保つこともできるし、スライド式又は可変用量として調整することもできる。特定の用途に用される実際の有効量には、様々な要因が影響する可能性がある。例えば、投与頻度、治療期間、複数の治療薬の併用、投与経路及び癌又は疾患の重症度によって、投与される実際の有効量の増減が必要とされることがある。

投与の頻度は、哺乳動物に対して有意な毒性を生じることなく、癌若しくは疾患の増悪率の低下、無増悪生存率の増加又は無増悪期間中央値の増加をもたらすいずれかの頻度とすることができる。例えば、投与頻度は、１月に約１回～約３回、１月に約２回～約６回又は２月に約１回～約３回とし得る。投与頻度は、一定のままであってもよいし、治療期間中に変えてもよい。本発明で提供される組成物での治療の過程は、休息期間を含んでいてもよい。例えば、２週間の投与期間とそれに続く２週間の休止期間で組成物を投与することができ、かかる投与計画を複数回繰り返すことができる。有効量と同様に、特定の用途に用いられる実際の投与頻度には様々な要因が影響する可能性がある。例えば、有効量、治療期間、複数の治療薬の併用、投与経路及び癌又は疾患の重症度によって、投与頻度の増減が必要とされることがある。

本発明で提供される組成物の投与のための有効期間は、哺乳動物に対して有意な毒性を生じることなく、癌若しくは疾患の増悪率の低下、無増悪生存率の増加又は無増悪期間中央値の増加をもたらすいずれかの期間とし得る。例えば、有効期間は数日から数週間、数ヶ月又は数年まで変動し得る。一般に、癌又は疾患の治療のための有効期間は、数週間乃至数ヶ月の範囲とすることができる。ある場合には、有効期間は、個々の哺乳動物が生存している期間とすることができる。特定の治療に使用される実際の有効期間には、様々な要因が影響する。例えば、有効期間は、投与頻度、有効量、複数の治療薬の併用、投与経路及び癌又は疾患の重症度によって変動することがある。

本発明で提供される担体タンパク質／化学療法薬／結合剤複合体を含む組成物は、任意の適切な形態とし得る。例えば、本発明で提供される組成物は、溶液又は粉末の形態とすることができ、注射用懸濁液を作るための希釈剤を含んでいてもよいし、含んでいなくてもよい。組成物は、限定されるものではないが、薬学的に許容されるビヒクルを始めとする追加成分を含んでいてもよい。薬学的に許容されるビヒクルとしては、例えば、生理食塩水、水、乳酸、マンニトール又はこれらの組合せが挙げられる。

本発明で提供される組成物を哺乳動物に投与した後、哺乳動物をモニターして癌又は疾患が治療されたか否かを判定することができる。例えば、哺乳動物を治療後に評価して、癌又は疾患の増悪率の低下（例えば停止）の有無を判定することができる。本明細書に記載の通り、増悪及び生存率の評価には任意の方法を用いることができる。

他の実施形態
本発明をその詳細な説明と共に説明してきたが、以上の説明は例示を目的としたものであり、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の技術的範囲を限定するものではない。その他の態様、利点及び変更は添付の特許請求の範囲の技術的範囲に属する。

当業者には明らかであろうが、本明細書に記載する粒子の製造及び使用に関する説明は専ら例示を目的としたものであり、本開示はこのような例示によって限定されるものではない。

本明細書で用いる略語は、通常の科学的意味を有する。別途記載しない限り、温度はすべて℃である。本明細書において、以下に示す用語は、別途定義しない限り、以下の意味を有する。

実施例１：リツキシマブ－アルブミン－パクリタキセルナノ粒子複合体の調製及び特徴
ＡＲ１６０ナノ粒子複合体を調製するために、アブラキサン（登録商標）（ＡＢＸ；Ｃｅｌｇｅｎｅ社（米国ニュージャージー州サミット））とリツキシマブ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ社（米国カリフォルニア州サンフランシスコ））を（別途記載しない限り）それぞれ１０ｍｇ／ｍＬ及び４ｍｇ／ｍＬで混合し、室温で３０分間インキュベートした。

リツキシマブはアブラキサン（登録商標）（ＡＢＸ）に高い親和性で結合し、解離定数はピコモル濃度域にある。４ｍｇ／ｍＬのリツキシマブを１０ｍｇ／ｍＬのＡＢＸと混合すると、１６０ｎｍのナノ粒子ＡＲ１６０が形成される。ＡＲ１６０ナノ粒子を視覚化するため、リツキシマブをＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ４８８で標識し、１０ｍｇ／ｍＬのＡＢＸと共にインキュベートした。標識リツキシマブを含むＡＲ１６０ナノ粒子を、Ａｍｎｉｓ ＩｍａｇｅＳｔｒｅａｍフローサイトメーターを用いて視覚化した（図１Ａ）。

ＡＢＸとのリツキシマブの結合を調べるため、ＡＲ１６０分子のフローサイトメトリー分析を行った。ＡＢＸ及びリツキシマブを、製造元のプロトコルに従ってＡｌｅｘａ－ｆｌｕｏｒ ４８８（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社（米国イリノイ州ロックフォード））で標識した。Ａｌｅｘａ－ｆｌｕｏｒ ４８８を１ｍｇのタンパク質と共に室温で６０分間インキュベートし、結合しなかった標識をサイズ排除カラムによって標識タンパク質から分離した。非標識ＡＢＸと非標識リツキシマブ又は非標識ＡＢＸと標識リツキシマブ又は標識ＡＢＸと標識リツキシマブを用いて、上述の通りＡＲ１６０複合体を調製した。フローサイトメトリーデータを図１Ｂに示すが、このデータはＡＢＸとリツキシマブとの相互作用を示す。

遠心した微粒子、１００ｋＤ超のタンパク質及び１００ｋＤ未満のタンパク質を含むＡＲ１６０画分のパクリタキセル含有量を定量した。ＡＲ１６０は上述の通り調製した。１００００ｒｐｍで２回の遠心分離工程で微粒子を遠心沈殿させた。パクリタキセルの約７０％がＡＲ１６０微粒子と共に残り、残りの３０％のほとんどは１００ｋＤを超えるタンパク質と共にあり、ごくわずかな割合（０．３％）のパクリタキセルが１００ｋＤ未満のタンパク質画分中に存在していた（図１Ｃ、左図）。

１００ｋＤを超えるタンパク質画分の内容物を確認するため、パクリタキセル、リツキシマブ及びヒトアルブミンの染色によってウエスタンブロット分析を行った。上清中のタンパク質複合体を変性し、次いでＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルクロマトグラフィーで分離した。次いでタンパク質をＰＶＤＦ膜に移し、アルブミンについては１：１００００希釈のウサギ抗ヒトアルブミン（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社（米国マサチューセッツ州ダンバース））で、パクリタキセルについては１：１００００希釈のウサギ抗タキソール（ＡｂＣａｍ社（米国マサチューセッツ州ケンブリッジ））で、リツキシマブについては１：５００希釈のラット抗リツキシマブＨＲＰ（Ｂｉｏ－ｒａｄ社（米国カリフォルニア州ハーキュリーズ））でウエスタンブロットした。１：２０００希釈のヤギ抗ウサギＩｇＧ ＨＲＰ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社（米国マサチューセッツ州ダンバース））をアルブミン及びタキソールに対する二次抗体として使用した。タンパク質はＥＣＬ基質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社（米国イリノイ州ロックフォード））によって視覚化した。

アルブミン、抗体及びパクリタキセルは約２００ｋＤのバンド内に共存しており（図１Ｃ、右図）、これは１６０ｎｍ粒子が、抗体と共に腫瘍ターゲティング能力を有する複数の機能単位に解離し、２００ｋＤ高分子種内に細胞障害性薬物を保持していることを示唆する。

実施例２：膜結合ＣＤ２０へのリツキシマブ－アルブミン－パクリタキセルナノ粒子複合体の結合
ＡＲ１６０が膜結合ＣＤ２０に結合するか否かを決定するため、Ｄａｕｄｉ細胞をＰＥ抗ヒトＣＤ１９及びＡＲ１６０（ＡＢＸをＡｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ ４８８で標識し、リツキシマブでコートしたもの）で染色した。散布図は、Ｄａｕｄｉ細胞の集団が、ＰＥ抗ヒトＣＤ１９で染色したときは７５％陽性、蛍光標識ＡＲ１６０で染色したときは７５％陽性、ＰＥ抗ヒトＣＤ１９とＡｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ ４８８タグ付けＡＲ１６０の両方で染色したときは約７４％二重陽性であることを示しており、ＡＲ１６０がＤａｕｄｉ細胞に結合することを示唆している（図２Ａ）。染色Ｄａｕｄｉ細胞は、Ａｍｎｉｓ ＩｍａｇｅＳｔｒｅａｍでのイメージングフローサイトメトリーによっても視覚化した（図２Ｂ）。

ＰＥ抗ヒトＣＤ１９及びＣＤ２０は、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社（米国ニュージャージー州フランクリンレイクス）から購入した。Ｄａｕｄｉ細胞を、Ａｌｅｘａ－ｆｌｕｏｒ ４８８ ＡＲ １６０、ＰＥ抗ヒトＣＤ１９及びＰＥ抗ヒトＣＤ２０と４℃で３０分間インキュベートした。細胞をＦＡＣＳ緩衝液（０．５％ＢＳＡ及び０．１％Ｎａアジドを含む１×ＰＢＳ）で２回洗浄した。Ｇｕａｖａフローサイトメーター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社（米国マサチューセッツ州ビレリカ））で細胞を流し、データを収集した。フローサイトメトリーデータは、ＧｕａｖａＳｏｆｔソフトウェア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社（米国マサチューセッツ州ビレリカ））を用いて分析し、ＡＲ１６０＋、ＣＤ１９＋及びＣＤ２０＋細胞の百分率を計数した。Ａｌｅｘａ－ｆｌｕｏｒ ４８８標識ＡＢＸ及びＰＥ抗ヒトＣＤ１９／Ａｌｅｘａ－ｆｌｕｏｒ ４８８ ＡＲ１６０標識Ｄａｕｄｉ細胞の共焦点写真には、Ａｍｎｉｓ ＩｍａｇｅＳｔｒｅａｍ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社（米国マサチューセッツ州ビレリカ））を用いた。データの解析及び写真の収集には、Ｉｎｓｐｉｒｅソフトウェア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社（米国マサチューセッツ州ビレリカ））を用いた。

実施例３：リツキシマブ－アルブミン－パクリタキセルナノ粒子複合体のサイズ及び安定性
様々な量のリツキシマブを用いて形成されたナノ粒子複合体のサイズを決定するため、１０ｍｇのＡＢＸを０ｍｇ、２ｍｇ、４ｍｇ、６ｍｇ、８ｍｇ又は１０ｍｇのリツキシマブと共にインキュベートした。サイズの測定にはＭａｌｖｅｒｎ Ｎａｎｏｓｉｇｈｔ（Ｍａｌｖｅｒｎ社（英国ウスターシャー））を用いた。粒子を１：２００に希釈し、カメラレベル９及び捕捉検出閾値１６を用いて粒子サイズ及び数を決定した。Ｎａｎｏｓｉｇｈｔは、粒子サイズ及び濃度を得るのに光散乱及びブラウン運動を利用する。得られたサイズを図２Ｃに示す。

粒子形成に対するインキュベーション中のｐＨレベルの影響を調べるため、ＡＲ１６０ナノ粒子をインキュベーションｐＨ３、７又は９で実施例１に記載の通り形成し、解離定数（Ｋｄ）を決定した。ｐＨ３で形成したナノ粒子複合体のＫｄは４．４×１０^－１０であり、ｐＨ７で形成したナノ粒子複合体のＫｄは３．９×１０^－９であり、ｐＨ９で形成したナノ粒子複合体のＫｄは２．５×１０^－８であった。これらのデータは、混合条件のｐＨを変えるとＡＢＸ／リツキシマブ結合の強さに影響を与えることを示している。

ＡＢＸ単独と対比したＡＲ１６０の安定性を、Ｎａｎｏｓｉｇｈｔ技術を用いて評価した。ＡＢＸ及びＡＲ１６０を記載のように調製し、生理食塩水中室温で０～６時間及び２４時間静置し、各時点で粒子の量及びサイズを測定した（図３）。ＡＢＸ単独の粒子数は４．２３×１０^８であったのに対して、ＡＲ１６０は０～２４時間で１９．１～２３．５×１０^８粒子の範囲であった。ＡＢＸの平均サイズは９０ｎｍであり、０～２４時間で１２７～１３３ｎｍの平均サイズを有していたＡＲ１６０よりも格段に小さかった。さらに、インキュベーション時間を通して粒子の数及びサイズが同じままであったことから示唆されるように、ＡＲ１６０のサイズは２４時間を通して安定であった。ＡＢＸはインキュベーション期間中に不安定になり、ＡＢＸの粒子サイズ及び数の測定が困難であったため、時間０のデータのみを示す（図３）。

血清中でのＡＲ１６０の安定性をＡＢＸと対比して評価するため、ＡＢＸ及びＡＲ１６０の同数（３０×１０^８）の粒子をヒトＡＢ型血清に添加した。室温で５、１５、３０及び６０分間インキュベートした後の残存粒子数を定量した（図４Ａ及び図４Ｂ）。５、１５、３０及び６０分の各時点で、それぞれ、ＡＢＸ単独（１１、６．６、４．２及び５．２×１０^８）よりも多数のＡＲ１６０粒子（１９、１６、１１及び１０×１０^８）が測定された（図４Ｃ）。さらに、ＡＢＸの粒子数は、わずか１５分間インキュベートしただけで、血清を基準とするベースラインに戻ったが、ＡＲ１６０の粒子数は、６０分間のインキュベーションを通して血清単独よりも高いままであった（図４Ｃ）。

実施例４：リツキシマブ－アルブミン－パクリタキセルナノ粒子複合体は、Ｄａｕｄｉ細胞への抗ＣＤ２０抗体の結合を防止する。
ＡＲ１６０複合体中のリツキシマブのリガンド結合能を調べた。ＣＤ２０＋Ｄａｕｄｉ細胞をリツキシマブ（図５Ｃ）、ＡＢＸ（図５Ｄ）、ＡＲ１６０（図５Ｅ）又は２４時間経過ＡＲ１６０（図５Ｆ）と共にインキュベートした。インキュベーション後、細胞を洗浄し、ＰＥ－マウス抗ヒトＣＤ２０で染色し、フローサイトメトリーで計数した。アイソタイプ対照（６．２％陽性；図５Ａ）及びＰＥマウス抗ヒトＣＤ２０（８３．６％陽性；図５Ｂ）をそれぞれ陰性対照及び陽性対照として用いた。結果は、リツキシマブ及びＡＲ１６０が、その後の抗ヒトＣＤ２０抗体の結合を阻害することを示しており、リツキシマブが単独でかつＡＲ１６０複合体内においても抗ＣＤ２０抗体の結合を阻害することを示唆している。ＡＢＸ単独では抗体の結合を阻害しなかったが、これは、ＡＲ１６０粒子中のリツキシマブがそのリガンド結合特性を特異的に保持していることを示している。

実施例５：リツキシマブ－アルブミン－パクリタキセルナノ粒子複合体の毒性
ＡＲ１６０中のパクリタキセルがその抗増殖能力を維持していることを確認するため、ＣＤ２０＋Ｄａｕｄｉ細胞でのインビトロ毒性アッセイにおいて、ＡＢＸ及びリツキシマブ単独、ＡＲ１６０、及び試験の２４時間前に調製しておいたＡＲ１６０を試験した。細胞増殖の測定は、チミジンアナログのＥｄＵを用いて行い、これをＦＩＴＣコンジュゲート抗ＥｄＵを用いて検出し、フローサイトメトリーによって計数した。パクリタキセルを含有するすべての薬物でＩＣ５０が約２５μｇ／ｍＬであったのに対して、リツキシマブ単独では毒性が認められなかった（図６）。従って、パクリタキセルの毒性はＡＲ１６０内においても損なわれていない。

ヒトＢ細胞リンパ腫株Ｄａｕｄｉ（ＡＴＣＣ（米国バージニア州マナサス））は、１％ペニシリン、ストレプトマイシン及びグルタミン（ＰＳＧ）及び１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ中で培養した。細胞を採取し、２４ウェルプレートに１ウェル当たり０．２×１０^６細胞で播種した。細胞を、パクリタキセル濃度０～２００μｇ／ｍＬのＡＢＸ単独若しくはＡＲ１６０又はリツキシマブ（０～２００μｇ／ｍＬ）に３７℃及び５％ＣＯ２で一晩曝露した。増殖の測定には、Ｃｌｉｃｋ－ｉＴ ＥｄＵ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社（米国オレゴン州ユージーン））キットを利用した。簡単に説明すると、１０ｍＭ ＥｄＵをウェルに添加して、細胞及びＡＢＸ、リツキシマブ又はＡＲ１６０と共に一晩インキュベートした。細胞を１％サポニンで膜透過処理し、取り込まれたＥｄＵをＦＩＴＣ結合抗体で標識した。増殖指数は、各処理で得られたＦＩＴＣ陽性細胞を未処理ＥｄＵ標識細胞の最大増殖率で除算することによって決定した。

実施例６：リツキシマブ－アルブミン－パクリタキセルナノ粒子複合体のインビボ試験
腫瘍に対する有効性を試験するために、５×１０^６個のＤａｕｄｉヒトリンパ腫細胞を胸腺欠損ヌードマウス（Ｈａｒｌａｎ Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ社（米国インディアナ州インディアナポリス））の右側腹部に移植した。腫瘍が約８００ｍｍ^３の大きさに達したときに、マウスを無作為化し、マウス背側尾静脈への１００μｌの静脈内注射によって生理食塩水、ＲＩＴ（１２ｍｇ／ｋｇ；Ｒｉｔ１２）、ＲＩＴ（１８ｍｇ／ｋｇ；Ｒｉｔ１８）、ＡＢＸ（３０ｍｇ／ｋｇ；ＡＢＸ３０）、ＡＢＸ（４５ｍｇ／ｋｇ；ＡＢＸ４５）、ＡＲ１６０（１２ｍｇ／ｋｇのＲＩＴ及び３０ｍｇ／ｋｇのＲＩＴを含むもの；ＡＲ１６０ ３０）又はＡＲ１６０（１８ｍｇ／ｋｇのＲＩＴ及び４５ｍｇ／ｋｇのＡＢＸを含むもの；ＡＲ１６０ ４５）で処置した。腫瘍の大きさを週２～３回モニターし、腫瘍の体積を式（長さ×幅^２）／２によって計算した。腫瘍の大きさがマウスの体重の１０％又は約２５００ｍｍ^３に等しくなったときにマウスを屠殺した。ベースラインからの１０日目の変化を以下の通り計算した：［（処置日の腫瘍サイズ－１０日目の腫瘍サイズ）／治療日の腫瘍サイズ］×１００。Ｋａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ曲線を作成し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ社（米国カリフォルニア州ラホヤ））を用いて生存率期間中央値を計算した。

１０日目までに、ＡＲ１６０ ４５処置群（１７／１７）のマウスはすべて腫瘍反応を示し、ＡＲ１６０ ３０処置群の９４．１％（１６／１７）のマウスが完全な腫瘍反応を示したのに対して、ＡＢＸ４５、ＡＢＸ３０、ＲＩＴ１８、ＲＩＴ１２及び生理食塩水処置群で応答したマウスは、それぞれ、７／１４（５０％）、３／７（４２．８％）、１／４（２５％）、０／７（０％）及び０／５（０％）であった（図７Ａ～７Ｇ）。各群において１０日目に生存していたマウスの百分率は、生理食塩水、ＲＩＴ１２、ＲＩＴ１８、ＡＢＸ３０、ＡＢＸ４５、ＡＲ１６０ ３０及びＡＲ１６０ ４５の群で、それぞれ、０％、１２％、３８％、４３％、７１％、９２％及び１００％であった（図７Ｈ）。他のすべての群と比較したＡＲ１６０ ４５群におけるベースライン腫瘍サイズからの変化率は有意であった：生理食塩水及びＲＩＴ１２に対してｐ＜０．０００１、ＲＩＴ１８に対してｐ＝０．０００３、ＡＢＸ３０に対してｐ＝０．００５４、ＡＢＸ４５に対してｐ＝０．００９８、及びＡＲ１６０ ３０に対してｐ＝０．００３。生理食塩水、ＲＩＴ１２、ＲＩＴ１８、ＡＢＸ３０、ＡＢＸ４５及びＡＲ１６０ ３０で処置したマウスの生存期間中央値がそれぞれ９日、８日、１０．５日、１２日、１６日及び５３．５日であったのに対して、ＡＲ１６０ ４５で処置したマウスの生存期間中央値は、すべてのマウスを屠殺した９０日でも定義できないままであった（図８）。ＡＲ１６０ ４５群の生存期間中央値は、生理食塩水、ＲＩＴ１２、ＲＩＴ１８、ＡＢＸ３０、ＡＢＸ４５群のマウスよりも有意に高かった（ｐ＜０．０００１）が、２つのＡＲ１６０群間の差は有意ではなかった（ｐ＝０．０７１５）。

インビボイメージングのため、ＳＡＩＶＩ抗体標識キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社（米国イリノイ州ロックフォード））からのプロトコールに従って、アブラキサン粒子をＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ７５０色素で標識した。色素及び粒子溶液を室温で６０分間インキュベートし、次いで精製カラムに通して未結合の標識を除去した。標識粒子を、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ遠心分離フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社（米国マサチューセッツ州ビレリカ））を用いて１４．５４ｍｇパクリタキセル／ｍＬの濃度に濃縮した。アブラキサンを、それぞれ濃度１０ｍｇ／ｍＬ及び４ｍｇ／ｍＬのＩＶＩＧ（ＣＳＬ Ｂｅｒｈｉｎｇｈ社（米国ペンシルバニア州キングオブプルシア））又はリツキシマブ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ社（米国カリフォルニア州サンフランシスコ））と共に３０分間インキュベートした。Ｍａｌｖｅｒｎ Ｎａｎｏｓｉｇｈｔ（Ｍａｌｖｅｒｎ社（英国ウスターシャー））で粒子サイズをチェックしてＡＲ１６０の形成を確認した。マウスに、１００ｍｇの２ｍｇ／ｍＬの標識アブラキサン、ＩｇＧと共にインキュベートしたアブラキサン（ＡＢＩｇＧ）又はＡＲ１６０を注射した。注射して６、２４、４８及び７２時間後に、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＩＶＩＳ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社（米国マサチューセッツ州ウォルサム））を用いてマウスをイメージングした。蛍光イメージングは、７１０／７６０の励起／発光スペクトルで行い、Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅソフトウェア（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社（米国マサチューセッツ州ウォルサム））を用いて関心領域（ＲＯＩ）を適用した。設定ＲＯＩによって決定した腫瘍領域内の平均放射効率の尺度によって腫瘍送達を決定した。Ａｂｒａｘａｎｅ、Ａｂｘ＋ＩｇＧ及びＡＲ１６０と比較して、粒子の安定性の向上が測定に与える影響を除外するためにバックグラウンドＲＯＩを用いた。マウス背部の関心領域（ＲＯＩ）を用いてバックグラウンド蛍光を測定し、腫瘍ＲＯＩの蛍光測定値から減算した。

各マウスについてバックグラウンドを減算した後、ＡＲ１６０を投与したマウスではＡＢＸ単独及びＡＢＸ結合ＩｇＧと比較して１９．１％の増加が検出されたが（図９Ａ及び図９Ｂ）、リンパ腫を標的とする抗体であるリツキシマブを添加すると腫瘍部位での化学療法薬の沈着が増加することを示唆している。さらに、ＡＲ１６０処置マウスにおけるＡＢＸの腫瘍沈着の増加が抗体－リガンド媒介性であることを示すために、蛍光標識ＡＲ１６０を注射する２４時間前に、ＡＲ１６０中での投与量の１％（０．１２ｍｇ／ｋｇ）、１０％（１．２ｍｇ／ｋｇ）及び１００％（１２ｍｇ／ｋｇ）のリツキシマブでマウスを前処置した。ＡＲ１６０注射して２４時間後にマウスをイメージングした（図９Ｃ）。ＡＲ１６０単独を注射したマウスは腫瘍内に高レベルの蛍光標識ＡＲ１６０を有していたが、漸増量のリツキシマブで前処理すると腫瘍内の標識ＡＲ１６０量が減少した（図９Ｄ）。まとめると、これらのデータは、ＡＢＸ単独と比較して腫瘍部位で標識ＡＲ１６０レベルが増加し、こうした腫瘍での薬物沈着の増加はリツキシマブのＣＤ２０リガンド特異性によって媒介されることを示唆している。

実施例７：薬局製リツキシマブ－アルブミン－パクリタキセルナノ粒子複合体と実験室製複合体との比較
実験室で決定した条件下で、ＡＲ１６０の３つのバッチを薬局で調製した（ＡＲ１６０ ｐ１、ｐ２及びｐ３）。これらをＡＢＸ単独及び実験室で調製したＡＲ１６０（ＡＲ１６０）と比較し、ＮａｎｏＳｉｇｈｔによるサイズ分布、並びに各標品中の粒子数について分析した（図１０）。ＡＲ１６０のサイズ及び粒子数は、調製方法にかかわらず、同様であった。

ＡＲ１６０複合体中のリツキシマブのリガンド結合能を、実施例４に記載したように評価した。薬局で製造した各バッチは、実験室製ＡＲ１６０と同様に、Ｄａｕｄｉ細胞との抗ＣＤ２０抗体の結合を防止した（図１１Ａ～図１１Ｉ）。

実施例８：ヒト血清アルブミンの抗体結合性モチーフの決定
Ｂｉａｃｏｒｅ表面プラズモン共鳴技術を利用して、様々な抗体（リツキシマブ、トラスツズマブ、ベバシズマブ及びムロモナブ）とアルブミンとの結合部位がどこにあるかを調べた。アルブミンペプチドライブラリーを各々６アミノ酸残基のオーバーラップを含む１８アミノ酸残基ペプチドを用いて構築し、ＣＭ５チップ上に固定したリツキシマブに対して各アルブミンペプチドを泳動させた。ペプチドをＨＢＳ－ＥＰプラス泳動バッファー中に５～１０ｍｇ／ｍＬで懸濁した。水不溶性ペプチドは１０％ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社（米国ミズーリ州セントルイス））中に溶解させた。リツキシマブはアミンカップリングによってＢｉａｃｏｒｅ ＣＭ５（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社（米国イリノイ州））チップ上に固定化した。Ｂｉａｃｏｒｅ Ｘ－１００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社（米国イリノイ州シカゴ））を用いて、固定化リツキシマブ上でアルブミンペプチドライブラリーをスクリーニングした。１２０秒の曝露時間で１～５０μｇ／ｍＬからペプチドをスクリーニングした。Ｂｉａｃｏｒｅ Ｘ１００ソフトウェアを用いて結合キネティクスを決定した。

ペプチドをＨＢＳ泳動緩衝液中５０、２５、１０、５、２．５、１．２５μｇ／ｍＬで泳動した。Ｂｉａｃｏｒｅ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅによって解離定数を求めた。ＨＳＡペプチド４（配列番号３）、ＨＳＡペプチド１３（配列番号４）及びＨＳＡペプチド４０（配列番号５）の３種類のアルブミンペプチドが抗体に結合することが認められた（図１２Ａ～図１２Ｊ）。解離定数（Ｋｄ）を図１２Ｋに示す。興味深いことに、ペプチド４０は、多くの薬物に結合する公知の疎水性結合部位である十分に特徴付けられたＳｕｄｌｏｗサイトＩＩにマッピングされる。Ｄｉａｎａ， Ｆ．Ｊ．， Ｖｅｒｏｎｉｃｈ， Ｋ． ＆ Ｋａｐｏｏｒ， Ａ．Ｌ． Ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ ｎｏｎｓｔｅｒｏｉｄａｌ ａｎｔｉ－ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ ｒａｃｅｍｉｃ ｗａｒｆａｒｉｎ ａｎｄ ｉｔｓ ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒｓ ｔｏ ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ． Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ ７８， １９５－１９９ （１９８９）；Ｓｕｄｌｏｗ， Ｇ．， Ｂｉｒｋｅｔｔ， Ｄ．Ｊ． ＆ Ｗａｄｅ， Ｄ．Ｎ． Ｔｈｅ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｗｏ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｄｒｕｇ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅｓ ｏｎ ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ． Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ １１， ８２４－８３２ （１９７５）参照。

実施例９：複数の抗体のアルブミン結合性モチーフの決定
Ｂｉａｃｏｒｅ表面プラズモン共鳴技術は、ＨＳＡペプチド４、１３又は４０に結合するリツキシマブ、トラスツズマブ、ベバシズマブ又はムロモナブ上の部位の決定にも利用した（図１３Ａ～１３Ｅ）。ベバシズマブ（配列番号１）及びリツキシマブ（配列番号２）の両方について、結合部位が位置する重鎖の可変部の配列を図１３Ｆに示す。興味深い１９アミノ酸領域をベバシズマブ（配列番号８－ＷＹＦＤＶＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴ）及びリツキシマブ（配列番号１０－ＷＹＦＮＶＷＧＡＧＴＴＶＴＶＳＡＡＳＴ）について下線を付して示すが、これらは約８０％の同一性がある。図１３Ｇは、ＨＳＡに結合する各抗体由来の配列を示す。興味深いことに、ムロモナブはＨＳＡペプチド４及び４０には結合したが、ムロモナブペプチドは全長ＨＳＡタンパク質には結合しなかった。

上述のように、４ｍｇ／ｍＬのリツキシマブを１０ｍｇ／ｍＬのＡＢＸと共にインキュベートすると、ＮａｎｏＳｉｇｈｔで測定して、ＡＢＸ単独の８０ｎｍのサイズが、リツキシマブがＡＢＸに結合したときの約１１０ｎｍにシフトする。アルブミン結合性ペプチドを競合アッセイに用いて、それらがＡＲ１６０の形成に干渉するか否かを調べた。簡単に説明すると、１０ｍｇ／ｍｌのＡＢＸを４ｍｇ／ｍｌのリツキシマブ及び１０モル過剰の対照ペプチド（ＨＳＡ１０）、ＨＳＡペプチド４０又はペプチドなし（ＡＲ１６０対照）と共に３０分間インキュベートした。すべての粒子でサイズ測定及び計数のためインキュベーション後、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｎａｎｏｓｉｇｈｔ（Ｍａｌｖｅｒｎ社（英国ウスターシャー））を利用した。粒子を１：２００に希釈し、カメラレベル９及び捕捉検出閾値１６を用いて粒子サイズ及び数を決定した。

ＡＢＸ単独では７７ｎｍのサイズを有していたが、ＡＢＸにリツキシマブが結合すると１００ｎｍの粒子が得られた。アルブミン結合性ペプチド（ペプチド４０）をＡＢＸ及びリツキシマブとのインキュベーションに添加すると、得られたナノ粒子は、ＡＢＸ単独のサイズに相当する７０ｎｍであったのに対して、非結合性対照ペプチドでは、この実験におけるＡＲ１６０のサイズ（１０９ｎｍ）に相当する１００ｎｍの粒子が得られた（図１４Ａ）。これらのデータは、ＨＳＡペプチド４０がＡＲ１６０の形成を効果的に阻害したことを示唆している。結合性ペプチド４及び１３で得られた結果は、さらに不均質なナノ粒子集団を呈し、リツキシマブに対する親和性が低いこれら２種類のアルブミンペプチドが、ＡＲ１６０の形成を不完全に阻止したことを示唆している（図１４Ｃ及び図１４Ｄ）。

ベバシズマブを用いて同様の実験を行った（図１４Ｂ）。結果は、ＨＳＡペプチド４０又はＢｅｖペプチド１（配列番号７）の添加が、ＡＢＸとの抗体複合体形成の指標となる粒子サイズの３０ｎｍ増大を防ぐことを示しており、両方のペプチドが抗体－アルブミン結合に干渉することを示している。

Claims (20)

1. ナノ粒子複合体を含む、患者の癌を治療するための組成物であって、該ナノ粒子複合体の各々が、
   アルブミン、
   少なくとも１つのアルブミン結合性モチーフが挿入された抗体又は融合タンパク質であって、ここで、該アルブミン結合性モチーフは、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１又は配列番号１２のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、ここで、該抗体又は融合タンパク質は、抗原結合性ドメインを有し、任意的に、該抗体又は融合タンパク質の少なくともサブセットは、１つより多いアルブミン結合性モチーフを含む、抗体又は融合タンパク質、及び
   任意的に治療薬
   を含んでおり、該癌は該抗原を発現し、そして、該ナノ粒子複合体がインビボで該抗原に対する結合特異性を有し、該抗体又は融合タンパク質が、ベバシズマブ、トラスツズマブ、リツキシマブ又はムロモナブではない、組成物。
2. 前記治療薬がパクリタキセルである、請求項１に記載の組成物。
3. 前記ナノ粒子複合体が１μｍ未満の平均サイズを有する、請求項１に記載の組成物。
4. 前記ナノ粒子複合体が１００ｎｍ～８００ｎｍの平均サイズを有する、請求項３に記載の組成物。
5. アルブミン－治療薬と抗体との比が１０：１～１０：３０である、請求項１に記載の組成物。
6. 前記ナノ粒子複合体の各々が、１００～１０００個の抗体を含む、請求項１に記載の組成物。
7. 前記アルブミンがヒト血清アルブミンである、請求項１に記載の組成物。
8. 凍結乾燥されている、請求項１に記載の組成物。
9. 前記抗体又は融合タンパク質が、非共有結合によって前記アルブミンと会合している、請求項１に記載の組成物。
10. 前記抗体又は融合タンパク質が、前記アルブミン結合性モチーフを介して前記アルブミンと会合している、請求項９に記載の組成物。
11. 前記パクリタキセルが、非共有結合によって前記アルブミンと会合している、請求項２に記載の組成物。
12. 前記修飾抗体又は融合タンパク質の少なくともサブセットが、少なくとも２つのアルブミン結合性モチーフを含む、請求項１に記載の組成物。
13. 薬学的に許容される添加物をさらに含む、請求項１乃至請求項１２のいずれか１項に記載の組成物。
14. ナノ粒子複合体の製造方法であって、アルブミンを、少なくとも１つのアルブミン結合性モチーフが挿入された抗体と、ナノ粒子複合体を形成する条件下で、一緒にすることを含む、方法であって、ここで、該アルブミン結合性モチーフは、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１又は配列番号１２のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、該抗体が、ベバシズマブ、トラスツズマブ、リツキシマブ又はムロモナブではない、方法。
15. 前記アルブミン又は前記ナノ粒子複合体を治療薬と一緒にする、請求項１４に記載の方法。
16. 前記治療薬がパクリタキセルである、請求項１５に記載の方法。
17. 抗体または融合タンパク質を含む、患者の癌を治療するための組成物であって、該抗体または融合タンパク質は、少なくとも１つのアルブミン結合性モチーフが挿入されており、ここで、該アルブミン結合性モチーフは、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１又は配列番号１２のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、該抗体又は融合タンパク質が、ベバシズマブ、トラスツズマブ、リツキシマブ又はムロモナブではない、組成物。
18. 前記抗体または融合タンパク質が、挿入されたアルブミン結合性モチーフを有さない抗体または融合タンパク質と比較して、アルブミンに対するより高い親和性を有する、請求項１７に記載の組成物。
19. 患者の癌を治療するための、修飾された抗体または融合タンパク質の製造方法であって、当該方法が、抗体または融合タンパク質を用意すること、そして少なくとも１つのアルブミン結合性モチーフを挿入することによって該抗体または融合タンパク質のポリペプチド配列を修飾することを含んでおり、ここで、該アルブミン結合性モチーフは、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１又は配列番号１２のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、ここで、該修飾された抗体または融合タンパク質が、挿入されたアルブミン結合性モチーフを有さない抗体または融合タンパク質と比較して、アルブミンに対してより高い親和性を有し、該抗体又は融合タンパク質が、ベバシズマブ、トラスツズマブ、リツキシマブ又はムロモナブではない、方法。
20. 前記ポリペプチド配列が、前記少なくとも１つのアルブミン結合性モチーフを挿入する前はアルブミン結合性モチーフを含んでいない、請求項１９に記載の方法。

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