JP7158063B2

JP7158063B2 - グルカゴン保護剤及びその応用

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Publication number: JP7158063B2
Application number: JP2020538994A
Authority: JP
Inventors: タオリン; ミンユーリ; チャオドン; リンジャン; ニンルオ; ゾンシャンチー
Original assignee: Guangzhou Jinde Biotech Ltd
Current assignee: Guangzhou Jinde Biotech Ltd
Priority date: 2018-01-24
Filing date: 2018-11-26
Publication date: 2022-10-21
Anticipated expiration: 2038-11-26
Also published as: JP2021510205A; CN108174843B; WO2019144692A1; CN108174843A

Description

本願は、２０１８年１月２４日に中国特許庁に提出され、出願番号が２０１８１００６６８１９．６、発明の名称が「グルカゴン保護剤及びその応用」の中国特許出願の優先権を主張し、その内容の全体が本願の一部として援用される。

本願は、ポリペプチド保存分野に関し、具体的には、グルカゴン保護剤及びその応用に関する。

グルカゴンは、膵グルカゴンとも呼ばれ、膵臓膵島のα細胞から分泌されるホルモンであり、２９個のアミノ酸で構成される直鎖ポリペプチドであり、分子量が３４８５である。

糖尿病は、慢性的な血糖上昇を特徴とする代謝異常症候群であり、インシュリンとグルカゴンは、血糖レベルを適当に維持することに対して非常に重要である。インシュリンは、グルコースの末梢摂取を増加させ、肝臓から排出されるグルコースを減少させることで、血糖レベルを低下させて肝臓と末梢組織に作用し、また、グルカゴンは、肝臓細胞におけるグルカゴンレセプターと結合することによって、肝臓の糖原が分解してグリコーゲンとして貯蔵されたグルコースを放出し、それにより血液中のグルコースレベルの維持に寄与する。これらの貯蔵が使い果たされると、グルカゴンは、肝臓を刺激して糖新生によってさらなるグルコースを合成し、このグルコースが血流に放出され、低血糖の発生を抑える。

グルカゴンは、重要な臨床的役割を有し、研究によれば、グルカゴンは肝細胞内の環状アデノシン一リン酸（ｃ－ＡＭＰ）の生合成を促進して、肝硬変患者の肝臓貯蔵機能を評価すること、グリコーゲンの分解と糖新生を促進し、血糖を高め、低血糖を治療すること、胃腸の蠕動を抑制するので、胃腸造影及び内視鏡下の胆道膵管造影に利用できること、アデニル酸シクラーゼを活性化し、心筋収縮力を強化させ、難治性心不全を治療すること、糖尿病患者の膵島β細胞機能を評価するなどの臨床的意義があることを確認している。

近年、複数の製薬会社は、グルカゴン類似物の開発に取り組んでおり、臨床試験を行う会社があり、臨床試験を完了して市場に参入する会社もある。このことから、近い将来、グルカゴンが糖尿病や心血管疾患などの疾患の常用の治療薬物の１つとなることが示される。

グルカゴンの含有量変化を正確に監視することは、膵島β細胞、血糖制御及び関連する代謝疾患の治療を評価するための不可欠な前提条件である。しかしながら、グルカゴンは、血液サンプルにおいて非常に不安定であるため、検出に非常に大きな影響をもたらす。如何に臨床サンプルにおけるグルカゴンの安定性を維持するかは、グルカゴンの定量的検出にとって重要な要素になる。抗凝固血液サンプルにアプロチニンを添加することによってグルカゴンの安定性を保護する報道があり、単なるアプロチニン溶液そのものが不安定であり、使用しにくく、アプロチニンが添加されたサンプルでは、グルカゴンの安定性が不十分であり、臨床検出のニーズを満たしにくい。

本願は、主に血液サンプルにおけるグルカゴンの保護に適用されるグルカゴン保護剤を提供することを目的とする。本保護剤は、特性が安定しているとともに、グルカゴンの安定性向上に大きく寄与する。

本願の一態様によれば、成分として、抗凝固剤１０～１００ｇ／Ｌ、抗酸化剤２．５～１５０ｇ／Ｌ、セリンプロテアーゼ阻害剤１～１００ｇ／Ｌ、界面活性剤０．１～５ｇ／Ｌ、ＤＰＰ～ＩＶ阻害剤０．０２～４ｍｍｏｌ／Ｌ、緩衝液２０～２００ｍｍｏｌ／Ｌ、生物学的防腐剤０．１～１０ｍｌ／Ｌを含むグルカゴン保護剤が提供される。

前記グルカゴン保護剤において、成分として、抗凝固剤２０～１００ｇ／Ｌ、抗酸化剤３０～１３０ｇ／Ｌ、セリンプロテアーゼ阻害剤１～５０ｇ／Ｌ、界面活性剤０．１～３ｇ／Ｌ、ＤＰＰ～ＩＶ阻害剤０．０２～２ｍｍｏｌ／Ｌ、緩衝液６０～２００ｍｍｏｌ／Ｌ、生物学的防腐剤０．１～３ｍｌ／Ｌを含む。

前記グルカゴン保護剤において、前記抗酸化剤は、クルクミン、グルタチオン、Ｌ－メチオニンのうちの１種または複数種である。

前記グルカゴン保護剤において、前記セリンプロテアーゼ阻害剤は、アプロチニン、トリプシンのうちの１種または複数種である。

前記グルカゴン保護剤において、前記抗凝固剤は、エチレンジアミン四酢酸塩、クエン酸塩のうちの１種または複数種であり、前記界面活性剤は、ポリソルベート脂肪酸グリセライド、脂肪酸ソルビタンのうちの１種または複数種であり、前記ＤＰＰ－ＩＶ阻害剤は、シタグリプチン、ビルダグリプチン、サクサグリプチン、アログリプチン、リナグリプチン、テネリグリプチンのうちの１種または複数種であり、前記緩衝液は、グリシン－水酸化ナトリウム緩衝液であり、前記生物学的防腐剤は、ＰｒｏＣｌｉｎ（登録商標）３００、ＫＹ－１００のうちの１種または複数種である。

前記グルカゴン保護剤において、成分として、エチレンジアミン四酢酸塩２０～１００ｇ／Ｌ、クルクミン１０～３０ｇ／Ｌ、Ｌ－メチオニン１０～５０ｇ／Ｌ、グルタチオン１０～５０ｇ／Ｌ、アプロチニン１～２０ｇ／Ｌ、界面活性剤０．１～３ｇ／Ｌ、ＤＰＰ～ＩＶ阻害剤０．０２～２ｍｍｏｌ／Ｌ、グリシン－水酸化ナトリウム緩衝液６０～２００ｍｍｏｌ／Ｌ、ＰｒｏＣｌｉｎ（登録商標）３０００．１～３ｍｌ／Ｌを含む。

前記グルカゴン保護剤において、エチレンジアミン四酢酸塩１００ｇ／Ｌ、クルクミン１０ｇ／Ｌ、Ｌ－メチオニン５０ｇ／Ｌ、グルタチオン５０ｇ／Ｌ、アプロチニン１０ｇ／Ｌ、界面活性剤１ｇ／Ｌ、ＤＰＰ～ＩＶ阻害剤１．０ｍｍｏｌ／Ｌ、グリシン－水酸化ナトリウム緩衝液２００ｍｍｏｌ／Ｌ、ＰｒｏＣｌｉｎ（登録商標）３０００．４５ｍｌ／Ｌを含む。

前記グルカゴン保護剤において、エチレンジアミン四酢酸塩８０ｇ／Ｌ、クルクミン２０ｇ／Ｌ、Ｌ－メチオニン４０ｇ／Ｌ、グルタチオン３５ｇ／Ｌ、アプロチニン５ｇ／Ｌ、界面活性剤０．８ｇ／Ｌ、ＤＰＰ～ＩＶ阻害剤０．５ｍｍｏｌ／Ｌ、グリシン－水酸化ナトリウム緩衝液１５０ｍｍｏｌ／Ｌ、ＰｒｏＣｌｉｎ（登録商標）３０００．３ｍｌ／Ｌを含む。

前記グルカゴン保護剤において、前記グルカゴン保護剤の使用量は、血液サンプルの体積の１．５～２．５％である。

本願の別の態様によれば、血液サンプルのグルカゴン安定性の向上のためのグルカゴン保護剤の使用が提供される。

本願のグルカゴン保護剤では、抗凝固剤は、エチレンジアミン四酢酸塩、クエン酸塩のうちの１種または複数種であり、エチレンジアミン四酢酸塩は、二ナトリウム、二カリウム及び三カリウム塩であってもよい。抗凝固剤は、血液モデル中のカルシウムイオンを効果的にキレートし、血液の凝固を阻止することができ、ＥＤＴＡ塩は、金属プロテアーゼの活性を阻害し、金属プロテアーゼによるグルカゴンに対する加水分解作用を低下させることができる。本願の保護剤中、抗凝固剤の含有量は、１０～１００ｇ／Ｌであり、好ましくは、２０～１００ｇ／Ｌである。

抗酸化剤は、クルクミン、グルタチオン、Ｌ－メチオニンのうちの１種または複数種であり、好ましくは、クルクミン、グルタチオン、Ｌ－メチオニンの組成物である。グルカゴンは、２９個のアミノ酸で形成された直鎖ポリペプチドであり、これらにはメチオニン、アルギニンなど、酸化されやすいアミノ酸を含む。これらのアミノ酸は、酸素遊離基に敏感であり、酸化されやすいため、グルカゴンの構造を変え、グルカゴンのアミロイド化と繊維化を促進し、グルカゴンの凝集を引き起こす。

クルクミンは、ショウガ科植物であるキョウオウ等の根茎から抽出された酸性ポリフェノール類物質であり、抗酸化作用を有する。研究により、クルクミンが血液サンプルにおける遊離基を体内外で直接クリアーできることが証明された。クルクミンは、細胞内の還元型グルタチオンのレベルを増加させることによって、遊離基の生成を阻害でき、且つ、クルクミンは、酸化反応に関与する遊離基をクリアーし、脂質の過酸化反応を阻害し、各種の抗酸化酵素の活性を維持することもできる。クルクミンはまた、アミロイドタンパク質の分解を促進し、アミロイドタンパク質の形成を防止することができる。

グルタチオンは、ヒト細胞において自然に合成されるトリペプチドであり、グルタミン酸、システイン及びグリシンから構成される。そのうちの還元型グルタチオンは、過酸化物及び遊離基と結合することで、酸化剤の酸化作用を減少させることができるとともに、クルクミンと組み合わせて遊離基の酸化作用を阻害することもできる。

Ｌ－メチオニンは、還元性を持つ硫黄含有アミノ酸である。Ｌ－メチオニンは、グルカゴン中のメチオニンに対して保護効果を果たし、グルカゴン構造の安定性を維持することができる。

実験によれば、保護剤に２．５～１５０ｇ／Ｌの抗酸化剤を添加すると、血液サンプルにおけるグルカゴン構造の安定性を良好に維持することができ、好ましくは、抗酸化剤の使用量は、３０～１３０ｇ／Ｌである。更に好ましくは、使用量について、クルクミン１０～３０ｇ／Ｌ、Ｌ－メチオニン１０～５０ｇ／Ｌ、グルタチオン１０～５０ｇ／Ｌに制御する。

グルカゴンは、直鎖ポリペプチド構造であり、アミノ酸が露出するので、プロテアーゼにより分解されて構造を変えることが発生しやすい。グルカゴン構造の安定性を維持するために、構造の変更を引き起こし得るプロテアーゼを阻害し、これらのプロテアーゼを不活性化させる必要がある。従って、保護剤に所定の含有量のセリンプロテアーゼ阻害剤とＤＰＰ－ＩＶ阻害剤を添加する必要がある。

セリンプロテアーゼ阻害剤は、アプロチニン、トリプシンのうちの１種または複数種であり、好ましくは、アプロチニンである。アプロチニンは、牛の肺から抽出された単鎖ポリペプチドであり、広いスペクトルのプロテアーゼ阻害剤であり、各種のキニノゲナーゼ、トリプシン、キモトリプシン、プラスミン、ペプシン等に対して阻害作用を有する。アプロチニンは、所定の化学比率で阻害対象となる酵素と可逆的阻害物である酵素複合体を形成し、酵素の活性を阻害・低下する。

ＤＰＰ－ＩＶは、哺乳動物の体内に分布する重要なセリン加水分解酵素であり、体内の複数種の生物学的活性ペプチド（例えば、グルカゴン、インクレチン、神経ペプチド、ガストリン放出ペプチド、成長ホルモン放出ホルモン等）の加水分解に関与し、それらを一部的または完全に不活性化させる。ＤＰＰ－ＩＶ阻害剤は、ＤＰＰ－ＩＶの酵素活性を特異的に阻害し、それによるグルカゴンに対する分解作用を低下させることができる。本願では、ＤＰＰ－ＩＶ阻害剤は、シタグリプチン、ビルダグリプチン、サクサグリプチン、アログリプチン、リナグリプチン、テネリグリプチンの１種または複数種である。

セリンプロテアーゼ阻害剤の含有量は、１～１００ｇ／Ｌ、好ましくは１～５０ｇ／Ｌ、更に好ましくは１～２０ｇ／Ｌである。ＤＰＰ－ＩＶ阻害剤の添加量は、０．０２～４ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．０２～２ｍｍｏｌ／Ｌである。実験によれば、以上の含有量のセリンプロテアーゼ阻害剤とＤＰＰ－ＩＶ阻害剤を添加すると、両者が相乗作用し、グルカゴンの分解と凝集を良好に阻害できることを発見した。

界面活性剤は、ポリソルベート（Ｔｗｅｅｎ）脂肪酸グリセライド、脂肪酸ソルビタン（スパン）のうちの１種または複数種であり、好ましくは、Ｔｗｅｅｎ８０を添加する。０．１～５ｇ／ＬのＴｗｅｅｎ８０を添加すると、グルカゴンとクルクミンの溶解性を向上でき、好ましくは、０．１～３ｇ／Ｌを添加する。

本願の保護剤は、グリシン－水酸化ナトリウム緩衝液を用いる。グリシン－水酸化ナトリウム緩衝液は、安定したアルカリ性環境を維持でき、血液中のアスパラギン酸プロテアーゼを不活性化させ、グルカゴンの分解を防止し、グリシンがグルカゴンの酸化に対して所定の阻害作用を有する。緩衝液の含有量は、２０～２００ｍｍｏｌ／Ｌが好適であり、好ましくは、６０～２００ｍｍｏｌ／Ｌである。

生物学的防腐剤は、ＰｒｏＣｌｉｎ（登録商標）３００、ＫＹ－１００のうちの１種または複数種であり、生物学的防腐剤は、広いスペクトラムの抗菌活性を有し、長い時間に亘って細菌、真菌等の微生物の成長を阻害できるとともに、系における酵素の活性を維持できる。添加量は、０．１～１０ｍｌ／Ｌ、好ましくは０．１～３ｍｌ／Ｌである。

本願のグルカゴン保護剤は、血液サンプルのグルカゴン安定性の向上に適用され、使用量が血液サンプルの体積の１．５～２．５％であり、一般的な液体添加剤の添加量である５～１０％より大幅に低い。その利点は、サンプルの体積変化を減少させ、検出結果への影響を低下させ、さらにコストを削減でき、１ｍＬあたりの血液サンプルに添加する保護剤の費用が約０．２～０．５元だけであることである。

先行技術に比べて、本願のグルカゴン保護剤の有益な効果は、主に以下のとおりである。
１、本願は、血液サンプルにおけるグルカゴンの安定性の向上に対して顕著な作用を持っている。
２、本願のサンプル保護剤は、特性が安定しており、貯蔵・使用が容易である。
３、本願は、成分がシンプルであり、材料が安くて入手されやすく、製造プロセスがシンプルであり、工業的生産に適する。

以下、実施例を参照しながら、本願の技術案について明瞭かつ完全に説明し、当然ながら、説明される実施例は、本願の一部の実施例であり、すべての実施例ではない。本願の実施例に基づいて当業者が創造的な努力を必要とせずに得られるすべての他の実施例は、本願の特許範囲に属する。なお、矛盾しない限り、本願の実施例及び実施例の特徴は、互いに任意に組み合わせることができる。

本願は、成分として、抗凝固剤１０～１００ｇ／Ｌ、抗酸化剤２．５～１５０ｇ／Ｌ、セリンプロテアーゼ阻害剤１～１００ｇ／Ｌ、界面活性剤０．１～５ｇ／Ｌ、ＤＰＰ－ＩＶ阻害剤０．０２～４ｍｍｏｌ／Ｌ、緩衝液２０～２００ｍｍｏｌ／Ｌ、生物学的防腐剤０．１～１０ｍｌ／Ｌを含むグルカゴン保護剤を提供する。

好ましくは、各成分の含有量は、抗凝固剤２０～１００ｇ／Ｌ、抗酸化剤３０～１３０ｇ／Ｌ、セリンプロテアーゼ阻害剤１～５０ｇ／Ｌ、界面活性剤０．１～３ｇ／Ｌ、ＤＰＰ－ＩＶ阻害剤０．０２～２ｍｍｏｌ／Ｌ、緩衝液６０～２００ｍｍｏｌ／Ｌ、生物学的防腐剤０．１～３ｍｌ／Ｌである。

抗凝固剤は、エチレンジアミン四酢酸塩、クエン酸塩のうちの１種または複数種であり、抗酸化剤は、クルクミン、グルタチオン、Ｌ－メチオニンのうちの１種または複数種であり、セリンプロテアーゼ阻害剤は、アプロチニン、トリプシンのうちの１種または複数種であり、界面活性剤は、ポリソルベート脂肪酸グリセライド、脂肪酸ソルビタンのうちの１種または複数種であり、ＤＰＰ－ＩＶ阻害剤は、シタグリプチン、ビルダグリプチン、サクサグリプチン、アログリプチン、リナグリプチン、テネリグリプチンのうちの１種または複数種であり、生物学的防腐剤は、ＰｒｏＣｌｉｎ（登録商標）３００、ＫＹ－１００のうちの１種または複数種である。

具体的には、各成分の含有量は、エチレンジアミン四酢酸塩２０～１００ｇ／Ｌ、クルクミン１０～３０ｇ／Ｌ、Ｌ－メチオニン１０～５０ｇ／Ｌ、グルタチオン１０～５０ｇ／Ｌ、アプロチニン１～２０ｇ／Ｌ、界面活性剤０．１～３ｇ／Ｌ、ＤＰＰ－ＩＶ阻害剤０．０２～２ｍｍｏｌ／Ｌ、グリシン－水酸化ナトリウム緩衝液６０～２００ｍｍｏｌ／Ｌ、ＰｒｏＣｌｉｎ（登録商標）３０００．１～３ｍｌ／Ｌである。

保護剤の製造
１、濃度２０～２００ｍｍｏｌ／Ｌのグリシン－水酸化ナトリウム緩衝液を１００ｍＬ調製した。
２、所定の含有量のクルクミン、エチレンジアミン四酢酸塩二カリウム、Ｌ－メチオニン、グルタチオン、Ｔｗｅｅｎ－８０をそれぞれ秤取し、順にグリシン－水酸化ナトリウム緩衝液に溶解し、０．０１～１ｍｌのＰｒｏＣｌｉｎ（登録商標）３００を量り取り、上記溶液に溶解し、混合して濾過し、使用時まで２～８℃で放置した。
３、１０ｍｌの上記溶液を取り、所定含有量のアプロチニンを正確に秤取し、混合し溶解させ、濃度０．１ｍｍｏｌ／ｍＬのＤＰＰ－ＩＶ阻害剤（テネリグリプチン）を２～４００μｌ量り取り、上記溶液に加えて均一に混合し、２～８℃で保存した。

上記材料は、いずれも市販品である。アプロチニン：上海アラジンバイオケムテクノロジー社から購入、クルクミン：Ｓｉｇｍａ社から購入、ＤＰＰ－ＩＶ阻害剤（テネリグリプチン）：ＭｅｄＣｈｅｍｅｘｐｒｅｓｓ社から購入。

表１に、いくつかの実施例の具体的な処方の組成を示した。なお、本願の保護剤の材料処方は、表１中のデータに限られない。

テスト例
以下、実施例１～７のグルカゴン保護剤の保存効果の検出結果を示す。

１、器具、試薬、及びサンプル
主な器具：マイクロプレートアナライザー：型番ＲＴ－６０００、ＲａｙｔｏＬｉｆｅａｎｄＡｎａｌｙｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓＣｏ．，Ｌｔｄ．製。
主な試薬：グルカゴン検出キット（商品番号１０－１２７１－０１）：スエーデンＭｅｒｃｏｄｉａ社製。
使い捨て型ヒト静脈血採血容器（ＥＤＴＡ２Ｋ）：瀏陽市三力医用科技発展有限公司製。
グルカゴン保護剤：実施例１～７のグルカゴン保護剤。
サンプル：血液サンプル：華南霊長類研究センターより提供されるカニクイザルから由来。

２、実験プログラム
カニクイザルを１２時間以上絶食させ、使い捨て型ヒト静脈血採血容器で採血した。同じカニクイザルから１本２ｍＬで７本採血した。採血直後に４０μＬの実施例１～７のグルカゴン保護剤を加えて均一に混合し、遠心させ、上清血漿を分注し、グルカゴンの２～８℃での安定性を検出した。

表２から分かるように、２～８℃では、サンプルにおけるグルカゴンの検出結果が経時的に有意に変化せず、これは、本願のグルカゴン保護剤によるサンプルにおけるグルカゴンに対する保護効果が非常に強いことを示した。その中でも、実施例３、実施例６及び実施例７の保護効果が最も強かった。

比較例
比較例１
１、器具、試薬及びサンプル
主な器具：マイクロプレートアナライザー：型番ＲＴ－６０００、ＲａｙｔｏＬｉｆｅａｎｄＡｎａｌｙｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓＣｏ．，Ｌｔｄ．製。
主な試薬：グルカゴン検出キット（商品番号１０－１２７１－０１）：スエーデンＭｅｒｃｏｄｉａ社製。
使い捨て型ヒト静脈血採血容器（ＥＤＴＡ２Ｋ）：瀏陽市三力医用科技発展有限公司製。
グルカゴン保護剤：広州市進徳生物科技有限公司により提供。
サンプル：血液サンプル：華南霊長類研究センターより提供されるカニクイザルから由来。

２、実験プログラム
カニクイザルに１２時間以上絶食させ、使い捨て型ヒト静脈血採血容器で採血した。カニクイザルに１～６の番号を付け、それぞれのカニクイザルから１本２ｍＬで５本採血した。第１管は、採血後に０．９％の塩化ナトリウム溶液を４０μＬ加え（対照群１）、第２管は、採血直後にアプロチニン溶液を４０μＬ加え（対照群２）、第３～５管は、採血後にそれぞれグルカゴン保護剤を４０μＬ加え（実験群、それぞれ実施例３、実施例６及び実施例７）、均一に混合した後、遠心させ、上清血漿を分注して、検出に用いた。

サンプルを以下の保存条件で検出した。
（１）遠心直後に検出、
（２）３７℃で４時間放置してから検出、
（３）２～８℃で２４時間放置してから検出、
（４）実施例６のサンプルを２～８℃で２４、４８、７２、９６及び１２０時間放置してから検出。

サンプル検出は、グルカゴン検出キット（商品番号１０－１２７１－０１）の仕様書で実行された。

３、実験結果
表３は、対照群１、対照群２及び実験群のサンプルを遠心させた直後に検出した保存状況であり、単位：ｐｍｏｌ／Ｌであった。

表３から分かるように、対照群１の検出値が対照群２と実験群より有意に低く、これは、血液サンプルの処理過程にアプロチニンが添加されないと、サンプルにおけるグルカゴンが大幅に分解することを示した。

対照群２と実験群の検出値が近く、これは、アプロチニンの添加と本願のグルカゴン保護剤の添加では、血液サンプルにおけるグルカゴンに対する保護効果が相当することを示した。

表４は、対照群１、対照群２及び実験群サンプルを３７℃で４時間放置した保存状況であり、単位：ｐｍｏｌ／Ｌであった。

表４から分かるように、サンプルを３７℃で４時間放置した後、対照群１の検出結果の低下が非常に顕著であり、検出下限に近かった。対照群２の検出結果も大幅に低下し、実験群の検出結果の低下程度が小さく、これは、３７℃条件において、本願のグルカゴン保護剤によるサンプルにおけるグルカゴンに対する保護効果が、アプロチニンが添加された群より有意に大きいことを示した。

表５は、対照群１、対照群２及び実験群サンプル２～８℃を２４時間放置した後の保存状況であり、単位：ｐｍｏｌ／Ｌであった。

表５から分かるように、サンプルを２～８℃で２４時間放置した後、対照群１の検出結果の低下が非常に顕著であり、対照群２の検出結果も大幅に低下し、実験群の検出結果が有意に変化せず、それは、２～８℃条件において、本願のグルカゴン保護剤によるサンプルにおけるグルカゴンに対する保護効果が、アプロチニンが添加された群より有意に大きいことを示した。

実施例６の保護剤を実験群として２～８℃で２４、４８、７２、９６及び１２０時間放置した後の保護状況を観察し、単位：ｐｍｏｌ／Ｌであった。

表６から分かるように、サンプルを２～８℃で１２０時間放置した後、サンプルにおけるグルカゴンの検出結果が有意に変化せず、これは、２～８℃条件において、本願のグルカゴン保護剤によるサンプルにおけるグルカゴンに対する保護効果が非常に強く、臨床サンプルの検出ニーズをより満たすことを示した。

比較例２
１、器具、試薬及びサンプル
主な器具：マイクロプレートアナライザー：型番ＲＴ－６０００、ＲａｙｔｏＬｉｆｅａｎｄＡｎａｌｙｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓＣｏ．，Ｌｔｄ．製。
主な試薬：グルカゴン検出キット（商品番号１０－１２７１－０１）、スエーデンＭｅｒｃｏｄｉａ社製。
使い捨て型ヒト静脈血採血容器（ＥＤＴＡ２Ｋ）：瀏陽市三力医用科技発展有限公司製。
グルカゴン保護剤：広州市進徳生物科技有限公司により提供。
サンプルの由来：健康なボランティア。

２、実験プログラム
健康なボランティア、男性、１０人。１２時間以上断食させ、使い捨て型ヒト静脈血採血容器で採血した。１～１０の番号を付け、それぞれの人から１本２ｍＬで３本採血した。第１管は、採血後に０．９％の塩化ナトリウム溶液を４０μＬ加え（対照群１）、第２管は、採血直後にアプロチニン溶液を４０μＬ加え（対照群２）、第３管は、採血後にそれぞれグルカゴン保護剤を４０μＬ加え（実験群、実施例６）、均一に混合した後、遠心させ、上清血漿を分注して、検出に用いた。

３、実験結果：
表７は、対照群１、対照群２及び実験群サンプルを遠心させた直後に検出した保存状況であり、単位：ｐｍｏｌ／Ｌであった。

表７から分かるように、対照群１の検出値が対照群２と実験群より有意に低く、これは、臨床血液サンプルの処理過程にアプロチニンが添加されないと、サンプルにおけるグルカゴンが大幅に分解することを示した。

表８は、対照群１、対照群２及び実験群サンプルを３７℃で４時間放置した保存状況であり、単位：ｐｍｏｌ／Ｌであった。

表８から分かるように、サンプルを３７℃で４時間放置した後、対照群１の検出結果の低下が非常に顕著であり、検出下限に近かった。対照群２の検出結果も大幅に低下し、実験群の検出結果の低下程度が小さく、これは、３７℃条件において、本願のグルカゴン保護剤によるサンプルにおけるグルカゴンに対する保護効果が、アプロチニンが添加された群より有意に大きいことを示した。

表９は、対照群１、対照群２及び実験群サンプルを２～８℃で２４時間放置した後の保存状況であり、単位：ｐｍｏｌ／Ｌであった。

表９から分かるように、サンプルを２～８℃で２４時間放置した後、対照群１の検出結果の低下が非常に顕著であり、対照群２の検出結果も所定の程度低下し、実験群の検出結果が有意に変化せず、これは、２～８℃条件において、本願のグルカゴン保護剤によるサンプルにおけるグルカゴンに対する保護効果が、アプロチニンが添加された対照群２より有意に大きいことを示した。

実験群（実施例６）のサンプルを、２～８℃で２４、４８、７２、９６及び１２０時間放置した後のグルカゴンの安定性を観察し、単位：ｐｍｏｌ／Ｌであった。

表１０から分かるように、サンプルを２～８℃で１２０時間放置し、臨床サンプルにおけるグルカゴンの検出結果が有意に変化せず、これは、２～８℃条件において、本願のグルカゴン保護剤による臨床サンプルにおけるグルカゴンに対する保護効果が非常に強く、臨床サンプルの検出ニーズをより満たすことを示した。

前記のように、本願によるグルカゴン保護剤は、特性が安定しおり、貯蔵・使用が容易であり、グルカゴンの安定性の向上に大きく寄与し、該保護剤は、製造プロセスがシンプルであり、成分がシンプルであり、材料が入手されやすく、価格が安い。

以上、説明された内容は、独立して実施してもよく、様々な方式で組合せて実施してもよく、これらの変形方式は、すべて本願の特許範囲に属する。

最後に、以上の実施例は、本願の技術案を説明するためのものに過ぎず、制限するものではない。前述した実施例を参照しながら、本願について詳細に説明したが、当業者であれば、前述した各実施例に記載の技術案を補正したり、一部の技術的特徴を等同置換したりすることができ、これらの補正や置換により、対応する技術案の主旨が本願の各実施例の技術案の精神と範囲から逸脱することはない。

本願のグルカゴン保護剤は、血液サンプルにおけるグルカゴンの安定性の向上に大きく寄与し、本サンプル保護剤は、特性が安定しており、貯蔵・使用が容易であり、成分がシンプルであり、材料が安くて入手されやすく、製造プロセスがシンプルであり、工業的生産に適する。

Claims

成分として、抗凝固剤１０～１００ｇ／Ｌ、抗酸化剤２．５～１５０ｇ／Ｌ、セリンプロテアーゼ阻害剤１～１００ｇ／Ｌ、界面活性剤０．１～５ｇ／Ｌ、ＤＰＰ－ＩＶ阻害剤０．０２～４ｍｍｏｌ／Ｌ、緩衝液中の緩衝剤成分２０～２００ｍｍｏｌ／Ｌ、生物学的防腐剤０．１～１０ｍｌ／Ｌを含み、
前記抗酸化剤は、クルクミン、グルタチオン、Ｌ－メチオニンの組成物であることを特徴とする、グルカゴン保護剤。
成分として、抗凝固剤２０～１００ｇ／Ｌ、抗酸化剤３０～１３０ｇ／Ｌ、セリンプロテアーゼ阻害剤１～５０ｇ／Ｌ、界面活性剤０．１～３ｇ／Ｌ、ＤＰＰ～ＩＶ阻害剤０．０２～２ｍｍｏｌ／Ｌ、緩衝液中の緩衝剤成分６０～２００ｍｍｏｌ／Ｌ、生物学的防腐剤０．１～３ｍｌ／Ｌを含む、ことを特徴とする請求項１に記載のグルカゴン保護剤。
前記セリンプロテアーゼ阻害剤は、アプロチニン、トリプシンのうちの１種または複数種である、ことを特徴とする請求項１に記載のグルカゴン保護剤。
前記抗凝固剤は、エチレンジアミン四酢酸塩、クエン酸塩のうちの１種または複数種であり、
前記界面活性剤は、ポリソルベート、脂肪酸ソルビタンのうちの１種または複数種であり、
前記ＤＰＰ－ＩＶ阻害剤は、シタグリプチン、ビルダグリプチン、サクサグリプチン、アログリプチン、リナグリプチン、テネリグリプチンのうちの１種または複数種であり、
前記緩衝液は、グリシン－水酸化ナトリウム緩衝液であり、
前記生物学的防腐剤は、ＰｒｏＣｌｉｎ（登録商標）３００である、ことを特徴とする請求項３に記載のグルカゴン保護剤。
成分として、エチレンジアミン四酢酸塩２０～１００ｇ／Ｌ、クルクミン１０～３０ｇ／Ｌ、Ｌ－メチオニン１０～５０ｇ／Ｌ、グルタチオン１０～５０ｇ／Ｌ、アプロチニン１～２０ｇ／Ｌ、界面活性剤０．１～３ｇ／Ｌ、ＤＰＰ－ＩＶ阻害剤０．０２～２ｍｍｏｌ／Ｌ、グリシン－水酸化ナトリウム緩衝液６０～２００ｍｍｏｌ／Ｌ、ＰｒｏＣｌｉｎ（登録商標）３０００．１～３ｍｌ／Ｌを含む、ことを特徴とする請求項４に記載のグルカゴン保護剤。
成分として、エチレンジアミン四酢酸塩１００ｇ／Ｌ、クルクミン１０ｇ／Ｌ、Ｌ－メチオニン５０ｇ／Ｌ、グルタチオン５０ｇ／Ｌ、アプロチニン１０ｇ／Ｌ、界面活性剤１ｇ／Ｌ、ＤＰＰ－ＩＶ阻害剤１．０ｍｍｏｌ／Ｌ、グリシン－水酸化ナトリウム緩衝液２００ｍｍｏｌ／Ｌ、ＰｒｏＣｌｉｎ（登録商標）３０００．４５ｍｌ／Ｌを含む、ことを特徴とする請求項５に記載のグルカゴン保護剤。
成分として、エチレンジアミン四酢酸塩８０ｇ／Ｌ、クルクミン２０ｇ／Ｌ、Ｌ－メチオニン４０ｇ／Ｌ、グルタチオン３５ｇ／Ｌ、アプロチニン５ｇ／Ｌ、界面活性剤０．８ｇ／Ｌ、ＤＰＰ－ＩＶ阻害剤０．５ｍｍｏｌ／Ｌ、グリシン－水酸化ナトリウム緩衝液１５０ｍｍｏｌ／Ｌ、ＰｒｏＣｌｉｎ（登録商標）３０００．３ｍｌ／Ｌを含む、ことを特徴とする請求項５に記載のグルカゴン保護剤。
前記グルカゴン保護剤の使用量は、血液サンプルの体積の１．５～２．５％である、ことを特徴とする請求項１～７のいずれか１項に記載のグルカゴン保護剤。
血液サンプルのグルカゴン安定性の向上における請求項１～７のいずれか１項に記載のグルカゴン保護剤の使用。