JP7148225B2

JP7148225B2 - タイトジャンクション形成促進剤

Info

Publication number: JP7148225B2
Application number: JP2017103227A
Authority: JP
Inventors: 順一池ノ内; 伸二林
Original assignee: NOF Corp
Current assignee: NOF Corp
Priority date: 2017-05-25
Filing date: 2017-05-25
Publication date: 2022-10-05
Anticipated expiration: 2037-05-25
Also published as: JP2018197217A

Description

本発明は、タイトジャンクション形成促進剤に関する。

多細胞生物は上皮細胞に囲まれることにより自己の内と外に区別され、さらに、生体の中は上皮細胞や内皮細胞のシートによりいくつものコンパートメントに分けられている。代表的なコンパートメントは、脳、血管、消化管、腎臓の尿細管などがあり、特殊なものでは甲状腺の濾胞、内耳の蝸牛管などがある。コンパートメントの中のイオン環境やタンパク質の種類や濃度などは、それぞれのコンパートメントの機能に応じて大きく異なっており、この環境を動的に保つことは多細胞生物が生きていくうえで必要不可欠である。これらのコンパートメントを仕切る壁は、多細胞生物であるがゆえに細胞を並べて作らざるを得ないが、この細胞間隙を通る物質の移動（漏れ）を防ぐための特殊な接着機構が必要である。この接着機構はタイトジャンクションと呼ばれ、ここでは隣り合う細胞間の距離がゼロにまで近づき、細胞間隙を通る物質の移動を防いでいる。脊椎動物では、このタイトジャンクションを上皮細胞や内皮細胞に発達させ、これらの細胞シートが各コンパートメントの環境を守るバリアとして働くことを可能としている。

しかし、細胞間の接着機構であるタイトジャンクションのバリア機能が損なわれると様々な症状が現れることが報告されている。例えば、大腸では、腸管バリアの崩壊が常在細菌の侵入を許し、免疫系が働くことで炎症性腸疾患（Crohn病および潰瘍性大腸炎）が生じる。胃では、バリアがなければ胃酸分泌により粘膜下が酸性になり、化学的な障害により胃潰瘍になる。皮膚においても表皮顆粒層の二番目の一層においてタイトジャンクションが形成されており、外界からの異物の進入、あるいは、水分子やカルシウムイオンなどの低分子イオンの細胞間隙からの漏れを防ぎ、皮膚の健康状態が維持されている。血管の内皮細胞においてもタイトジャンクションが形成されており、特に、中枢神経系の血管でよく発達し、血液と脳や脊髄の実質との間に高いバリアを形成（血液脳関門）し、血中を流れる種々の有害物質から神経細胞を守っていることから、タイトジャンクションの破綻は脳に大きな障害をもたらすと考えられている。
以上のように、タイトジャンクションの機能破綻によるこれらの傷害から生体を守るため、タイトジャンクション形成促進剤の開発が望まれていた。

タイトジャンクションは、膜タンパク質であるクローディンやオクルディンなどから構成されている。タイトジャンクションの膜密着部分ではクローディンが細胞膜の中で線上に重合して紐状に並んだストランド構造（ＴＪストランド）がネットワークを形成し、ベルトとして細胞周囲を取り囲んでいる。そして、隣り合う細胞同士の向かい合う細胞膜中のＴＪストランド同士が側面で対合することによりキッシングポイントを形成し、そこで細胞間の距離がゼロに近づき、細胞間隙の物質の移動が抑制され、これらの細胞シートが各コンパートメントの環境を守るバリアとして働いている。

タイトジャンクションの形成促進については、様々な手法を用いて検討されており、既にいくつかのタイトジャンクション形成促進剤が報告されている。例えば、トコフェリルリン酸が、ヒト消化管上皮細胞（Ｃａｃｏ－２細胞）シートの経上皮電気抵抗値を１０日間で上昇させること、表皮角化細胞のクローディンとオクルディンのｍＲＮＡ発現量を４時間で上昇させることから、タイトジャンクションの形成が促進されると報告されている（特許文献１参照）。また、エンメイソウ抽出物が、表皮角化細胞シートの経上皮電気抵抗値を２４時間で上昇させたことから、タイトジャンクション形成促進作用を有すると報告されている（特許文献２参照）。
しかしながら、上皮細胞においてクローディンの発現を促進しても、未重合で過剰なクローディンタンパク質が排除される機構が備わっており、本来タイトジャンクションが形成されるべき細胞の側底膜領域でクローディンの重合はおこらず、タイトジャンクション形成が誘導されないことがある。また、より短時間の内にタイトジャンクション形成を促進する成分が望まれていた。

一方、クローディンの重合を共焦点顕微鏡にて直接観察できる細胞と、それを利用したタイトジャンクション形成促進剤のスクリーニング方法が提案されている。さらに、そのスクリーニング方法により、ＫＮ－９３がタイトジャンクション形成促進作用を有することが報告されている（特許文献３参照）。しかしながら、ＫＮ－９３の供給安定性に不安があり、新たなタイトジャンクション形成促進剤が望まれていた。
以上より、タイトジャンクション形成を短時間で誘導することができ、供給安定性に問題のないタイトジャンクション形成促進剤の開発が望まれていた。

特開２００７－２１０９４８号公報特開２０１３－０５６８４１号公報国際公開第２０１５／１５９８５５号

本発明は、タイトジャンクションの破綻に起因する疾患を予防又は改善するための、安全で短時間で効果が得られるタイトジャンクション形成促進剤を提供することである。そのタイトジャンクション形成促進剤は、医薬品、食品、医薬部外品、化粧品に利用できる。

本発明者らは、植物抽出物からタイトジャンクション形成を短時間に増強させる有効成分を探索したところ、ユーカリ葉抽出物にその効果を見出した。
すなわち、本発明は、ユーカリ葉抽出物からなるタイトジャンクション形成促進剤である。

本発明によれば、新規なタイトジャンクション形成促進剤を提供できる。本発明は、タイトジャンクションの機能破綻による傷害から生体を守るための食品、医薬品、医薬部外品、化粧品に利用可能である。

GFPmCL1L細胞のクローディンの重合度を示す共焦点顕微鏡写真である（図面代用写真）。 GFPmCL1L細胞のクローディンの重合度を数値化したグラフである。上皮細胞（ＥｐＨ４細胞）のタイトジャンクション形成を示す蛍光顕微鏡写真である（図面代用写真）。ヒト３次元培養表皮モデルシートの上下間の経上皮電気抵抗（ＴＥＲ）値の測定結果を示したグラフである。

本発明に用いられるユーカリは、フトモモ科ユーカリノキ属に属する植物であり、学名はEucalyptus globulusである。オーストラリアの南東端部とタスマニア島に分布し、耐寒性があり生長が早いので世界各地で造林用に用いられている。地中海沿岸で多く栽植され、日本には明治初めに入った。樹高は４５～５５ｍ、直径は１.２～２ｍになる常緑高木である。樹皮は灰色で、薄片状に細長くはげ、青灰色のはげ跡が残る。葉は著しい異型性を示し、若木では長さ約１０ｃｍの卵形、無柄で対生し、成木では長さ約２０ｃｍの披針形、全緑で、やや鎌形に曲がり、柄があり互生する。

本発明に用いられるユーカリ葉抽出物は、植物の抽出に利用される公知の抽出法によって得られた抽出液そのもの、もしくはその濃縮液をいう。
ユーカリ葉の抽出方法としては、浸漬抽出法、連続抽出法、水蒸気蒸留抽出法（常圧、減圧）、超臨界流体抽出法、圧搾抽出法等が挙げられるが、この中でも浸漬抽出法等の抽出溶媒を使用した抽出方法が特に好ましい。
以下、浸漬抽出法等の抽出溶媒を使用した抽出方法について、具体例を挙げて詳細に説明する。
浸漬抽出法の具体的手順としては、ユーカリの葉を抽出溶媒に浸漬して抽出し、ろ過等の公知の固液分離方法によってユーカリの葉と抽出液を分離する方法が挙げられる。なお、得られたユーカリ葉抽出物は、そのままタイトジャンクション形成促進剤として利用するほか、抽出溶媒を留去して濃縮したり、カラムクロマトグラフィーや溶媒分画等の処理により精製したりしてもよい。
抽出に使用するユーカリの葉は、抽出効率を高めるために乾燥させたものであることが好ましい。乾燥方法としては、天日干し、風乾、加熱乾燥、真空乾燥、気流乾燥等が挙げられる。
また、抽出に使用するユーカリの葉は、抽出効率を高めるために粗く破砕されたものであることが好ましい。破砕方法としては、一軸型破砕機や二軸型破砕機等の破砕機を用いて行うことが挙げられる。

抽出溶媒の種類は、特に限定されず、植物抽出に用いられる公知の溶媒を適宜選択することができるが、具体的なものとしてヘキサン、シクロヘキサン、ヘプタン等の脂肪族炭化水素類；ベンゼン、トルエン等の芳香族炭化水素類；酢酸エチル、酢酸ブチル等のエステル類；メチルエチルケトン、アセトン等のケトン類；ジエチルエーテル、メチル－ｔ－ブチルエーテル等のエーテル類；ジクロロメタン、トリクロロエチレン等のハロゲン化炭化水素類；エタノール、プロピレングリコール、１、３－ブチレングリコール等のアルコール類；水等が挙げられる。なお、溶媒は２種類以上を組み合わせた混合溶媒であってもよい。これらの中でも、水、アルコール類、水とアルコール類の混合溶媒が好ましく、水、低級アルコール、多価アルコール、水と低級アルコールの混合溶媒、水と多価アルコールの混合溶媒がより好ましく、水、エタノール、１，３－ブチレングリコール、水とエタノールの混合溶媒、水と１，３－ブチレングリコールがさらに好ましい。アルコール類を含む抽出溶媒であると、有効成分の抽出効率が高くなり、タイトジャンクション形成促進作用に優れたユーカリ葉抽出物を得やすくなる。また、エタノール等の殺菌作用のある溶媒を含む抽出溶媒であると、腐敗が生じにくいユーカリ葉抽出物を得ることができる。さらに製造過程においては、抽出液の濃縮時間が短い、抽出後の容器の洗浄性に優れるなどの利点がある。

抽出溶媒が水を含む混合溶媒である場合の抽出溶媒における水の含有量は、通常１体積％以上、好ましくは５体積％以上、より好ましくは１０体積％以上、さらに好ましくは３０体積％以上であり、通常９９体積％以下、好ましくは９５体積％以下、より好ましくは９０体積％以下、さらに好ましくは７０体積％以下である。
抽出溶媒がアルコール類を含む混合溶媒である場合の抽出溶媒におけるアルコール類の含有量は、通常１体積％以上、好ましくは５体積％以上、より好ましくは１０体積％以上、さらに好ましくは３０体積％以上であり、通常９９体積％以下、好ましくは９５体積％以下、より好ましくは９０体積％以下、さらに好ましくは７０体積％以下である。
抽出溶媒が水とアルコール類の混合溶媒である場合、水とアルコールの体積比率（水／アルコール類）は、通常０．０１以上、好ましくは０．１以上、より好ましくは０．４以上であり、通常１００以下、好ましくは１０以下、より好ましくは２．０以下である。
上記の範囲内であると、タイトジャンクション形成促進作用に優れたユーカリ葉抽出物を得やすくなる。

抽出における抽出溶媒の使用量は、ユーカリの葉に対して質量換算で、通常１倍以上、好ましくは２倍以上、より好ましくは５倍以上、さらに好ましくは１０倍以上であり、通常１００００倍以下である。上記の範囲内であると、タイトジャンクション形成促進作用に優れたユーカリ葉抽出物を得やすくなる。

抽出温度は、抽出溶媒の種類等に応じて適宜選択されるべきであるが、通常０℃よりも大きく、好ましくは５℃以上、より好ましくは２０℃以上、さらに好ましくは５０℃以上であり、通常２００℃以下、好ましくは１５０℃以下、より好ましくは１００℃以下である。
抽出時間は、抽出温度等に応じて適宜選択されるべきであるが、通常１分以上、好ましくは１０分以上、より好ましくは３０分以上、さらに好ましくは１時間以上であり、通常１週間以下である。

本発明のタイトジャンクション形成促進剤は、上記のユーカリ葉抽出物からなるものであり、食品、医薬品、医薬部外品、化粧品として利用することができる。なお、本発明のタイトジャンクション形成促進剤は、経口摂取用であっても、経皮摂取用であってもよい。さらに本発明のタイトジャンクション形成促進剤が経皮摂取用である場合、その剤形はローション、乳剤、ゲル、クリーム、粉末、顆粒、カプセル、シート、スプレー、エアゾール、ペースト、パック等の公知のものを適宜採用することができ、剤形に応じて公知の成分を適宜含むものであってもよい。

本発明のタイトジャンクション形成促進剤が目的とする効能は、タイトジャンクションの形成を促進することによって得られるアレルギー抑制、消化管粘膜炎症抑制、アトピー性皮膚炎抑制、肌荒れ抑制、敏感肌改善等が挙げられる。

以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明は下記実施例に制限されるものではない。なお、特に断りのない限り、％は質量％を表わす。

〔ユーカリ葉抽出物の調製〕
乾燥したユーカリの葉１００ｇに１０００ｇの５０質量％エタノール水溶液を加えて６０℃で１時間抽出し、ろ過することによりユーカリ葉の抽出液を得た。この抽出液をロータリーエバポレーターで減圧下、６０℃で固形状態になるまで濃縮し、ユーカリ葉抽出物２０．１ｇを得た。得られた固形物を所定の有効分濃度となるように、５０質量％エタノール水溶液で希釈して使用した。

〔タイトジャンクション形成促進作用の評価試験１〕
本発明のタイトジャンクション形成促進作用の評価方法は、国際公開第２０１５／１５９８５５号やＳｈｉｏｍｉ等の文献（ＳｃｉＲｅｐ．２０１５、５、１３２６２）に記載された細胞及びそれを利用したスクリーニング方法で実施した。pCAGGS-Claudin1-GFPを安定発現するL929細胞（GFPmCL1L細胞）を９６マイクロウエルオプティカルボトムプレート（Nunc社製）に播種し、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ培地）に１０％牛胎児血清を添加した培地でコンフルエントになるまで培養した。所定の濃度になるように培地で調整した試料をオプティカルボトムプレート中に添加した。ユーカリ葉抽出物の濃度は０．０１％、ＫＮ－９３は１０μＭに調整した。試料を添加して５時間後に、共焦点顕微鏡を用いてクローディン－1 GFP（蛍光）が細胞接着部位に高度に濃縮しているかどうか、つまりクローディンの重合によるタイトジャンクションが形成しているかどうかを観察した（図１参照）。また、そのときの細胞間接着部位に濃縮された蛍光強度を画像解析で求め、試料添加時のクローディン－１GFP強度を、試料無添加のときの蛍光強度を１００％とした相対値で表した（図２参照）。図１の写真の比較から、無添加よりもユーカリ葉抽出物やＫＮ－９３の添加の方が細胞間接着部位に濃縮されたクローディン－１GFPによる蛍光強度が増強され、クローディンの重合によるタイトジャンクションの形成が促進されていることが確認できた。また、図２より、そのときの細胞間接着部位に濃縮されたクローディン－１ＧＦＰの蛍光強度は、ユーカリ葉抽出物が最も顕著に高かった。したがって、ユーカリ葉抽出物が５時間という短時間のうちにタイトジャンクション形成促進作用を発揮していることが確認できた。

〔タイトジャンクション形成促進作用の評価試験２〕
マウス乳腺上皮細胞（EpH4細胞）を用いてタイトジャンクションの形成誘導を確認した。Ｅｐｈ４細胞をＤＭＥＭ培地でコンフルエントになるまで培養した。ユーカリ葉抽出物の濃度を０．０１％になるように培地で調整し、それを添加して５時間培養した後、蛍光抗体法にてクローディンを染色した。無添加は培地のみとした。図３に抗体染色像を示した。図３より、ユーカリ葉抽出物は無添加よりも細胞間の抗体染色像が側方向に広がっていることから、上皮細胞においてユーカリ葉抽出物はクローディンの重合を５時間で増強し、タイトジャンクションの形成を促進することが確認できた。

〔ヒト３次元培養表皮モデルを用いた経上皮電気抵抗の評価試験〕
タイトジャンクションのバリア機能の定量法の一つであるＴＥＲ（trans-epithelial electrical resistance、経上皮電気抵抗）法を用いて、細胞間隙における物質透過性を定量した。実際の手順は以下の通りである。ヒト正常表皮細胞を重層培養したヒト３次元培養表皮モデルLabCyte EPI-MODEL12（株式会社ジャパン・ティッシュ・エンジニアリング製）を付属のアッセイ培地で２４時間培養した。ユーカリ葉抽出物（０．０１％及び０．０３％）及びＫＮ－９３（５０μＭ）を所定の濃度になるようにアッセイ培地で試料溶液を調製し、各試料溶液を培養カップの表皮組織表面に１ｍＬ添加した。コントロールはアッセイ培地のみを添加した。３次元培養表皮モデルの上下に発生するＴＥＲ値は、電極Millicell-ERS2（ミリポア社製）を用いて、試料溶液の添加直後（０時）、１時間後及び２時間後に測定した。図４に、ＴＥＲ値は各試料０時のＴＥＲ値を１００％として相対値として表した。その結果、ユーカリ葉抽出物はＫＮ－９３と同様に添加１時間後からＴＥＲ値を上昇させたことから、３次元培養表皮モデル上下間にバリア機能を増強させることが確認できた。
以上の評価試験で得られた結果は、ユーカリ葉抽出物がクローディンを短時間で細胞膜上に重合させることでタイトジャンクション形成を促進し、バリア機能を高めることが可能であることを示すものである。

本発明のタイトジャンクション形成促進剤は、タイトジャンクションの機能破綻による傷害から生体を守るための食品、医薬品、医薬部外品、化粧品に利用可能である。

Claims

ユーカリ（Eucalyptus globulus）葉抽出物からなるタイトジャンクション形成促進剤。