JP7146937B2 - サブナノメートルの金展着剤およびそれによるエンドトキシン誘発性敗血症予防方法 - Google Patents

Description

本発明は、展着剤に関し、より詳しくは、エンドトキシン誘発性敗血症を予防するためのサブナノメートルの金展着剤に関する。本発明は、また、サブナノメートルの金展着剤を介してリピドＡを圧縮することにより、エンドトキシン誘発性敗血症を予防するための方法に関する。

エンドトキシンの毒性は、困難な臨床的課題となっているが、この問題にうまく対処できる薬または治療法は未だ特定されていない。エンドトキシン毒性の危険な生物学的結果には、過剰な炎症および致命的な敗血症およびショックを潜在的に引き起越し得る免疫障害さえも含まれる。リポ多糖（ＬＰＳ）のリピドＡの分子のコンホメーションは、エンドトキシン（すなわちリポ多糖、ＬＰＳ）とＴｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）－ＭＤ２複合体との間の自然なホスト－ゲスト相互作用の結合親和性に影響を及ぼすので、エンドトキシン毒性の危険な生物学的結果は、リポ多糖（ＬＰＳ）のリピドＡの分子のコンホメーションと強い相関があると理解されている。ＬＰＳは、生理学的条件下では、自発的に自己組織化して様々な集合体を形成することが可能な両性分子であるため、異なる集合体型は、個々のＬＰＳ分子の分子内の炭化水素鎖間の距離（ｄ間隔）を微調整することによって、リピドＡの分子のコンホメーションを変えることができる。一般的に、リピドＡのコンホメーションは、図形描写の目的で円筒形または円錐形からなるよう単純化され、これは、層状集合体および非層状状集合体といったＬＰＳの２つの典型的な集合体から導かれ得る。用語“円筒形および円錐形”が用いられるのは、個々のリピドＡドメインのｄ間隔の距離が、リピドＡのいくつかの炭化水素鎖を結合させるリンカーとして機能する二糖骨格（ＬＰＳ分子の一部）の断面とほぼ等しいかまたはより大きいからである。ｄ間隔がより低い充填密度を示している円錐形のリピドＡのコンホメーションは、サイトカイン誘導のための、ＬＰＳとＴＬＲ４－ＭＤ２複合体との間のホスト－ゲスト複合体形成を活性化させることができる。さらに、サイトカインの強度プロフィールは、ＬＰＳの集合体が立体的になると著しく向上されることができ、その場合、リピドＡの充填密度は、最低級のものとなる。これに対し、層状のＬＰＳ集合体内に見られる分子内の炭化水素鎖間の密な充填密度は、サイトカイン誘導の減少または排除さえ可能にする。しかしながら、生物環境において、三次元の集合体は安定性に優れることから、リピドＡのコンホメーションは、充填密度を低下させやすい。

グラム陰性菌の危険な組織片（すなわちリポ多糖、ＬＰＳ）から生じるエンドトキシンの毒性は、困難な臨床的課題であるが、この問題にうまく対処できる薬または治療法は未だ特定されていない。

上記欠点を克服すべく、本発明の目的は、エンドトキシン活性を効果的に阻害できて敗血症を予防するサブナノメートルの金展着剤を提供することである。

一態様では、本発明は、サブナノメートルの金展着剤に関する。サブナノメートルの金展着剤は、ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）デンドリマーに内包されたサブナノメートルの金ナノクラスタと、アルキルモチーフのコーティングとを含む。

本発明の別の実施形態では、サブナノメートルの金ナノクラスタの形状は、略フレーク状構造を有する。

本発明の別の実施形態では、ＰＡＭＡＭデンドリマーは、分岐アミンまたは分岐ヒドロキシル基を有する。

本発明の別の実施形態では、ＰＡＭＡＭデンドリマーは、これらに限定されないが、ＰＡＭＡＭ第１世代（Ｇ１）デンドリマー、ＰＡＭＡＭ第２世代（Ｇ２）デンドリマー、ＰＡＭＡＭ第３世代（Ｇ３）デンドリマー、ＰＡＭＡＭ第４世代（Ｇ４）デンドリマー、ＰＡＭＡＭ第５世代（Ｇ５）デンドリマー、ＰＡＭＡＭ第６世代（Ｇ６）デンドリマー、ＰＡＭＡＭ第７世代（Ｇ７）デンドリマー、ＰＡＭＡＭ第８世代（Ｇ８）デンドリマー、ＰＡＭＡＭ第９世代（Ｇ９）デンドリマー、ＰＡＭＡＭ第１０世代（Ｇ１０）デンドリマーを含む。

本発明の別の実施形態では、ＰＡＭＡＭデンドリマーは、Ｇ_ｎＮＨ_２デンドリマー、または、Ｇ_ｎＯＨデンドリマーであり、ｎは、０～４である。

本発明の別の実施形態では、ＰＡＭＡＭデンドリマーは、第４世代（Ｇ４）デンドリマーである。好ましくは、ＰＡＭＡＭデンドリマーは、Ｇ_４ＮＨ_２デンドリマー、または、Ｇ_４ＯＨデンドリマーである。

本発明の別の実施形態では、アルキルモチーフは、これに限定されないが、メチル基、または、エチル基を含む。

本発明の別の実施形態では、サブナノメートルの金ナノクラスタの金原子の近接距離は、０．２８５ｎｍ～０．２８９ｎｍの範囲である。

本発明の一実施形態では、サブナノメートルの展着剤は、リピドＡの分子内の炭化水素鎖間の距離（ｄ間隔）を圧縮することによって、展着剤をＬＰＳとドッキングさせる。リピドＡの分子内の炭化水素鎖間の距離（ｄ間隔）は、サイトカインの過剰誘導によって敗血症を進行させ得るエンドトキシン毒性の活性部位である。

本発明の別の実施形態では、リピドＡのｄ間隔の値は、４．１９Åから３．８５Åまたは３．５４Åまで減少し、サブナノメートルの金展着剤の存在下では、より高い充填密度を示している。

本発明の別の実施形態では、サブナノメートルの展着剤は、ＣＭＣを増大させるだけでなく、充填密度をより高め、敗血症を予防し得る。

本発明の別の実施形態では、これらに限定されないが、血漿中のＴＮＦ－α、ＩＬ－６、ＩＬ－１β、および、ＣＸＣケモカインを含む重要な炎症誘発性のＮＦ－κＢ依存性サイトカインのＬＰＳ投与マウスにおける濃度は、顕著な低下を示した。

他の態様では、本発明は、炎症誘発性サイトカインを抑制する方法に関する。この方法は、投与を必要としているＬＰＳ感染哺乳類にサブナノメートルの展着剤を有効量投与するステップを含む。

本発明の別の実施形態では、炎症誘発性サイトカインは、これらに限定されないが、ＮＦ－κＢ、ＴＮＦ－α、ＩＬ－６、ＩＬ－１β、ＣＸＣケモカインプロフィール、ＩＬ－１２ｐ４０、ＧＭ－ＣＳＦ、または、ＧＲＰα（ＫＣ）を含む。

本発明の別の実施形態では、サブナノメートルの展着剤の有効量は、サブナノメートルの展着剤とＬＰＳとのモル比に依存する。好ましくは、サブナノメートルの展着剤とＬＰＳとのモル比は、１：２である。本発明によれば、サブナノメートルの展着剤の有効量は、約５０～１００ｍｇ／ｋｇ（体重）であり、これは、ＬＰＳの量に依存する。好ましくは、サブナノメートルの展着剤の有効量は、約７５ｍｇ／ｋｇ（体重）の濃度である。

本発明の他の態様では、本発明は、ＬＰＳ誘発性敗血症による寿命を著しく延ばす方法に関する。

本発明のサブナノメートルの金展着剤は、ＬＰＳのリピドＡの充填密度を圧縮してエンドトキシンの毒性を不活性化させるようＬＰＳのリピドＡを標的化することができる。これは、グラム陰性菌感染症によって引き起こされる敗血症の早期予防の潜在的な治療戦略となり得るだろう。これらおよび他の態様は、好適な実施形態およびそれに伴う以下の図面により明らかになろう。本開示の新規な着想の趣旨および範囲に逸脱することなく、様々な変更および修正が可能である。添付の図面は、本発明の１以上の実施形態を示すものであり、明文化された記載と併せて、本発明の原理を説明する役割を果たす。全図面を通じて、実施形態の同じまたは類似の要素には、可能な限り同じ参照番号を用いている。

ＬＰＳのリピドＡの充填密度と敗血症の進行との間の可能性のある相関を示す単純モデルを示す。長方形は、デンドリマー内部のサブナノメートルの金展着剤の形成を示し、ステップ１および２は、それぞれ、金ナノクラスタの合成およびアルキルモチーフ修飾を含む。リピドＡのコンホメーションは、円錐形（左側）および円筒形（右側）として描かれ、ＣＭＣの変化およびエンドトキシンの毒性の違いと相関する。 光ルミネセンスのスペクトル、および、１ｎｍ未満になるＳＡｕＮＣのサイズを示す写真である。 金原子が自己堆積して異なる配向の薄膜およびアラインメントを形成することができることを示すＳＡｕＮＣのＨＲＴＥＭ画像およびＥＤパターン（挿入画像）を示す。白い矢印は、個々の金原子間の距離を示す。 金原子が自己堆積して異なる配向の薄膜およびアラインメントを形成することができることを示すＳＡｕＮＣのＨＲＴＥＭ画像およびＥＤパターン（挿入画像）を示す。白い矢印は、個々の金原子間の距離を示す。 金原子が自己堆積して異なる配向の薄膜およびアラインメントを形成することができることを示すＳＡｕＮＣのＨＲＴＥＭ画像およびＥＤパターン（挿入画像）を示す。白い矢印は、個々の金原子間の距離を示す。 展着剤Ａ、展着剤Ｍ、および、展着剤Ｅの^１Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す。約２．５～４ｐｐｍにメチルおよびエチルのピークも現れた。 銅グリッドにおけるアルキルモチーフ修飾前の自己堆積しているＳＡｕＮＣの比較を示す。 銅グリッドにおけるアルキルモチーフ修飾後の自己堆積しているＳＡｕＮＣの比較を示す。挿入画像は、ＥＤパターンを示す。非修飾の金原子は、修飾された金原子に比べ、容易に自己堆積して薄膜および良好なアラインメントを形成できる。白い矢印は、個々の金原子間の距離を示す。 様々な展着剤の存在下および非存在下におけるＬＰＳのＣＭＣおよびｄ間隔の測定を示す。上段は、４種類の展着剤の存在下または非存在下における、異なる濃度での初期のＬＰＳ集合体（ミセルまたはベシクル）からの信号である、ｑの関数としての散乱強度を示す。 様々な展着剤の存在下におけるリピドＡのｄ間隔の測定を示す。表は、各条件下でのｄ間隔の距離をまとめたものである。 展着剤Ｍまたは展着剤Ｅの存在下におけるリピドＡの充填密度を表す単純モデルを示す。 ＬＰＳ、展着剤、および、ＴＬＲ４－ＭＤ２複合体間の結合特異性を示す。ＬＰＳでコーティングしたプレートにおける２種類の展着剤の増大していく量が示されている。これは、プレートに吸収されたＳＡｕＮＣの信号を約４６０ｎｍの発光波長で測定するＥＬＩＳＡリーダーを用いて決定された。 ＬＰＳおよび展着剤の両方でコーティングしたプレートへのＴＬＲ４－ＭＤ２複合体の結合量は、ＬＰＳのみでコーティングしたプレートと比べて著しい減少を示している。測定に際し、ＴＬＲ４－ＭＤ２複合体の結合特性を、発光波長５９４ｎｍの色素ＰＥで標識した。 展着剤とＴＬＲ４との間には有意な相互作用は見られないことを示す。ｙ軸信号（すなわち、ＬＰＳ－ＦＩＴＣおよび展着剤の量）は、較正曲線を用いて決定された。 展着剤Ｍおよび展着剤Ｅは、免疫刺激剤ではないことを示す。注射の２時間後に血液試料を採取し、マウスの血漿中のＩＬ－６の濃度をマウスＩＬ－６ ＥＬＩＳＡキットで測定した。 ＬＰＳ投与マウスにおける血漿中のサイトカインおよびＣＸＣケモカインへの展着剤Ｍの効果を示す。雄のＣ５７ＢＬ／６Ｎａｒｌマウスの後肢の足蹠からＬＰＳ（０．１μｇ）および展着剤Ｍ（７．５μｇ）を表示時点で皮下注射した。ＴＮＦ－αおよび他のサイトカインの測定用に、２回目の処置の１時間後および２時間後にそれぞれ血液試料を採取した。 ＬＰＳ投与マウスの他の血漿中サイトカインおよびケモカインの測定における展着剤Ｍの効果を示す。 ＬＰＳ投与マウスの他の血漿中サイトカインおよびケモカインの測定における展着剤Ｍの効果を示す。 ＬＰＳ投与マウスの他の血漿中サイトカインおよびケモカインの測定における展着剤Ｍの効果を示す。雄のＣ５７ＢＬ／６Ｎａｒｌマウスの後肢の足蹠からＬＰＳ（０．１μｇ）および展着剤Ｍ（７．５μｇ）を表示時点で皮下注射した。２回目の処置の２時間後に血液試料を採取した。Ｐ値は、テューキーの多重比較検定を伴う一元配置ＡＮＯＶＡ（分散分析）を用いて計算された。 ＬＰＳの存在下または非存在下における、Ｃ５７ＢＬ／６ＮａｒｌマウスのＲＡＷ２６４．７および骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）におけるリン酸化ＮＦ－κＢ ｐ６５（セリン５３６）の発現への展着剤の効果を示す。上段の画像：ＲＡＷ２６４．７細胞をＬＰＳ（２０ｎｇ／ｍＬ）で刺激し、表示時点で採取した。中段の画像：ＲＡＷ２６４．７細胞を様々な濃度のＬＰＳで３０分間刺激した。下段の画像： ２種類の展着剤で３０分間処置したＬＰＳ刺激ＲＡＷ２６４．７細胞は、全細胞ライセートからのリン酸化ＮＦ－ｋＢ ｐ６５（セリン５３６）タンパク質の発現の低下を示した。 ２０ｎｇ／ｍＬのＬＰＳの存在下または非存在下で展着剤で３０分間処置したＢＭＤＭ細胞を示す。リン酸化ＮＦ－ｋＢ ｐ６５（セリン５３６）の発現をウエスタンブロット法により検出した。ｐＳｅｒ－ＮＦ－ｋＢ ｐ６５のタンパク質バンドの相対密度を、βアクチン（すなわちローディングコントロール）で正規化し、ＬＰＳに対する計算された倍率変化をブロットの下に示した。 ２種類の展着剤（７５ｍｇ／ｋｇ（体重））で処置されたＬＰＳ誘発性敗血症（２５ｍｇ／ｋｇ（体重））のマウスの生存率を示す。点線は、５０％の生存率を示す。Ｍは、展着剤Ｍを示し、Ｅは、展着剤Ｅを示す。

定義
本明細書中に使用される用語は概して、本発明の文脈において、また各々の用語が使用される特定の文脈において、当該技術分野におけるそれらの通常の意味を有するものである。本発明を記載するために使用される特定の用語は、以下、または、本明細書中の他の部分で論じられ、本発明の記載に関わる実務者に付加的な手引きを提供するものである。便宜上、幾つかの用語を強調することもあり、例えば、イタリックおよび／または引用符を使用することもある。強調を使用しても用語の範囲および意味に影響を与えることはなく、それが強調されるにせよされないにせよ、同様の文脈において用語の範囲および意味は同じである。同じ事項を、２つ以上の方法で述べることがあることを理解されたい。したがって、ここで論じられる用語のいずれか１つまたは複数に、代替的な用語および同義語を使用してもよく、また、用語がここで補足説明されるかまたは述べられるかにせよされないにせよ、それに特殊な意義が課されることもない。幾つかの用語に対して同義語を提示している。１つまたは複数の同義語の詳説は、他の同義語の使用を排除するものではない。ここに述べられるあらゆる用語の用例を含む本明細書全体での用例の使用は、例示を目的とするにすぎず、本発明または例を挙げた全ての用語の範囲および意味を限定するものではない。同様に、本発明は本明細書中に与えられる様々な実施形態に限定されるものでもない。

特に定義しない限り、ここに使用される全ての技術的および科学的な用語は、本願発明が属する分野の当業者が共通して理解する意味と同じ意味を有するものである。矛盾が生じる場合には、定義を含む本明細書を照合するものとする。本明細書中で使用される場合、“およそ”、“約”、または、“略”は概して、所与の値または範囲の２０パーセント以内、好ましくは１０パーセント以内、より好ましくは５パーセント以内を意味するものとする。

本明細書中で使用される場合、“ナノクラスタ”という用語は、２ｎｍより小さい直径を有するかまたは１００個未満の原子から構成される粒子を指す。

用語“金ナノ粒子”とは、２ｎｍより大きく１００ｎｍまでの範囲の直径を有する球形の金粒子を指す。デンドリマーは繰り返し分枝した分子である。
デンドリマーは典型的に、コアを取り囲むように対称であり、多くの場合、球状の三次元形態をとる。デンドリマーはまた、世代によって分類され、これは、その合成中に繰り返された分枝サイクルの数を指す。例えば、収束的合成によってデンドリマーを生成し、分枝反応がコア分子上で３回行われた場合、結果として生じるデンドリマーは、第３世代デンドリマーとみなされる。デンドリマーは、世代番号（Ｇｎ）によって識別され、それぞれの完全合成反応の結果、新たなデンドリマー世代が生ずる。後続の各世代は、前の世代の約２倍の分子量のデンドリマーとなる。第１世代デンドリマー、第２世代デンドリマー、および、第３世代デンドリマーは、それぞれ、世代１（Ｇ－１）、世代２（Ｇ－２）、および、世代３（Ｇ－３）デンドリマーと表される。デンドリマー捕捉金ナノ粒子は、技術的に周知である。例えば、本発明は、Ｇ４デンドリマーを提供する。

米国保健福祉省の食品医薬品局により出版されている“健康な成人志願者における治療薬に関する臨床試験の安全な初期投与量を推定する産業および査閲者のための手引き”は、“ヒト等価用量”が下記の式によって得ることができることを開示している。
ヒト等価用量（ＨＥＤ）＝動物の投与量（ｍｇ／ｋｇ）×（動物の体重（ｋｇ）／ヒトの体重（ｋｇ））^０．３３
ＨＥＤは、投与の経路などの他の因子に応じて変化し得る。
略記号：ＣＲ：カルバペネム耐性；ＡＢ：アシネトバクター・バウマニ；ＥＣ：大腸菌；ＫＰ：肺炎桿菌；ＰＡ：緑膿菌。

本発明の範囲を限定することを意図せずに、本発明の実施形態による例示的な器具、装置、方法、および、それらに関連する結果を以下に挙げる。読み手の便宜上、実施例中に表題または副題を使用することがあるが、これは本発明の範囲を限定するものではないことに留意されたい。さらには、いくつかの理論をここで提案および開示するが、正しかろうと間違っていようと、作用の特有の理論またはスキームを何ら問わない発明に従って本発明を実行する限り、それらの理論によって本発明の範囲が限定されることは決してないものとする。

材料
Ｇ_４ＮＨ_２デンドリマー、Ｇ_４ＯＨデンドリマー、ＨＡｕＣｌ_４、および、ＬＰＳ（大腸菌Ｏ１１１：Ｂ４）を、シグマ（米国、カリフォルニア州サンディエゴ）から購入した。ＭＷＣＯメンブレンフィルターを、ミリポアから購入した（ＰＥＳメンブレン）。ＷＳＴ－１を、同仁化学研究所（日本、熊本県）から入手した。陰イオン交換樹脂を、Ｍｅｒｃｋから購入した（フラクトゲル（登録商標）ＥＭＤ ＴＭＡＥ Ｈｉｃａｐ）。

展着剤Ｈ、展着剤Ａ、展着剤Ｍ、および、展着剤Ｅの合成
展着剤Ａおよび展着剤Ｈを含むサブナノメートルの金ナノクラスタ（ＳＡｕＮＣ）を、既に公開されている方法にしたがって合成した。まず、ＨＡｕＣｌ_４、および、ＨＡｕＢｒ_４（シグマアルドリッチ、２００μＬ、３０μｍｏｌ、１５０ｍＭ）を、Ｇ_４ＮＨ_２（アルドリッチ、２０重量％のメタノール溶液中に９４．９μＬ、５μｍｏｌ）、および、Ｇ_４ＯＨ（アルドリッチ、１０重量％のメタノール溶液中に７５．４μＬ、０．５μｍｏｌ）を含有する２０ｍＬの脱イオン水にそれぞれ添加した。マイクロ波を照射（ＣＥＭ、Ｄｉｓｃｏｖｅｒ ＬａｂＭａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍ、３００Ｗ／１２０℃で３０分間）する前に、Ｇ_４ＮＨ_２およびＨＡｕＣｌ_４混合溶液を４℃で一晩インキュベートした。還元後、沈殿およびＳＡｕＮＣを３ＫＤａＭＷＣＯＰＥＳメンブレンフィルター（ミリポア、アミコンウルトラ）でろ過し、ＡｕＣｌ_４ ^－またはＡｕＢｒ_４ ^－である余分な陰イオンを陰イオン交換クロマトグラフィーによって除去することによって、Ｇ_４ＮＨ_２およびＧ_４ＯＨの被包から精製された展着剤Ａおよび展着剤Ｈをそれぞれ得た。その後、デンドリマーに内包されたＳＡｕＮＣ（すなわち展着剤Ａ、６３．６ｍｇ、４μｍｏｌ）の内部の第三級アミン基、および、表面のアミン基を、ジクロロメタン／Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド／Ｈ_２Ｏ（１ｍＬ／１ｍＬ／０．１ｍＬ）中で、ヨウ化メチルおよびヨウ化エチルと、室温または３７℃で一晩それぞれ反応させた。それぞれの反応混合物をジクロロメタンによって３回抽出して凍結乾燥させることにより、２つの黄色いゲル状化合物（すなわち、展着剤Ｍおよび展着剤Ｅ）を得た。この修飾の確認として、展着剤Ａと比較した場合、^１Ｈ ＮＭＲスペクトルは、メチル基およびエチル基から２，５ｐｐｍ～４ｐｐｍでメインピークを示した。測定に際し、すべての試料を溶媒としてのＤ_２Ｏに溶解した。

ＳＡｕＮＣの高解像度透過型電子顕微鏡（ＨＲＴＥＭ）イメージング
各試料をレイシーカーボンフィルムに載置した。３００ｋＶでの透過型電子顕微鏡測定（ＪＥＯＬ ＪＥＭ－３０００Ｆ、日本）の前に、グリッドを乾燥させた。

小角Ｘ線散乱（ＳＡＸＳ）および微小角入射広角Ｘ線散乱（ＧＩＷＡＸＳ）による測定
ＬＰＳ溶液のためのＳＡＸＳデータを、国立放射光研究センター（ＮＳＲＲＣ、台湾）の２３Ａ ＳＷＡＸＳワークステーションにて得た。すべてのＳＡＸＳ測定は、１５．０ｋｅＶ（波長λ＝０．８２６７Å）のビームを用い、試料－検出器間の距離を３０６０ｍｍとしてなされた。ＳＡＸＳデータを、１６９×１７９ｍｍ^２の有効面積、および、１７２μｍの検出器ピクセル分解能を有するピクセル検出器であるＤｅｃｔｉｒｓ－Ｐｉｌａｔｕｓ １Ｍで収集した。散乱θおよびλによって定義される散乱波長ｑ＝４πλ^－１ ｓｉｎθを、ベヘン酸銀の標準試料によって較正した。放射線障害を最低限にすべく、試料溶液の長時間のスポット露光（ビーム直径約０．５ｍｍ）を防ぐために、細い（１２μｍ）カプトン窓（直径４ｍｍ）付きの２．５ｍｍの試料溶液のそれぞれを、１．５×１．５ｍｍ^２の領域内で静かにゆさぶり、室温で測定した。ＳＡＸＳデータから、ＬＰＳ試料溶液に用いられるのと同一環境下で測定された緩衝液散乱を減算した。その後、データを、前のレポートで詳しく述べたように、入射フラックス、試料厚さ、および、検出器の電子雑音について修正した。各ＳＡＸＳ測定のためのＬＰＳ－ＳＡｕＮＣ比は、５０（ｗ／ｗ）に維持されたことに留意されたい。ＧＩＷＡＸＳ測定も、ＢＬ２３Ａエンドステーションで実現された。シリコンウエハにドロップキャスティングすることにより、ＧＩＷＡＸＳ測定のためのフィルム試料を調製した。１５ｋｅＶのビーム（波長λ＝０．８２６７Å）、１３２ｍｍの試料－検出器距離、および、０．２度の入射角により、ＣＭＯＳフラットパネルＸ線検出器Ｃ９７２８ＤＫ（５２．８ｍｍ角）を用いてＧＩＷＡＸＳデータを収集した。ギニエ解析により、前方散乱強度（すなわち、Ｉ（_０））、および、回転半径（Ｒｇ）を得た：Ｉ（ｑ）＝Ｉ（_０）ｅｘｐ（－Ｒ_ｇ ^２ ｑ^２／３）^３。これは、測定された散乱強度の二乗（すなわち、ｑ^２）の関数としてのｌｎ（Ｉ）の線形プロットに当てはめることができる（図６Ａの中央の行を参照）。Ｒ_ｇは、散乱長密度で重み付けした分子の密度の中心までの平均二乗平均平方根距離であり、前方散乱強度Ｉ（_０）は、ＬＰＳミセルまたはベシクルの分子量および濃度に比例する。同様のＲ_ｇ値は、ＬＰＳ集合体のサイズが濃度の低下に伴い変化しなかったことを示した。

ＬＰＳ－展着剤複合体、および、ＴＬＲ４－ＭＤ２複合体を検出するための結合アッセイ
９６ウェル高結合型イムノアッセイプレート（Ｃｏｓｔａｒ３９９１、コーニング）を、０．０２ＭのＥＤＴＡを含有する０．１ＭのＮａ_２ＣＯ_３緩衝液において３０μｇ／ｍｌの固定濃度のＬＰＳでコーティングし、３７℃で２００分間加熱した。その後、コーティングプレートを脱イオン水で洗浄し、１６時間乾燥させた。そして、プレートを、１％のＢＳＡを含むＰＢＳで、３７℃で３０分間ブロッキングし、０．１％のＢＳＡを含むＰＢＳで洗浄した。２種類の金展着剤のＬＰＳへの結合を検出するために、濃度が増大している展着剤Ｍまたは展着剤ＥをＬＰＳでコーティングしたプレートに添加した。金展着剤の存在下において、ＬＰＳへのＴＬＲ４の結合の阻止を検出するために、プレートをまずＬＰＳでコーティングし、次に、固定濃度の展着剤Ｍまたは展着剤Ｅでコーティングした。そして、濃度が増大しているＴＬＲ４結合ＰＥ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を、ＬＰＳおよび展着剤でコーティングしたプレートに添加して、５９４ｎｍの発光波長で読み取った。再び、金展着剤とＴＬＲ４との間の相互作用を、市販のマウスＴｏｌｌ様受容体４ ＥＬＩＳＡキットプレート（カタログ番号：ＭＢＳ７６５１１２、ＭｙＢｉｏＳｏｕｒｃｅ）。により決定した。濃度が増大しているＦＩＴＣ標識ＬＰＳ（大腸菌Ｏ１１１：Ｂ４、シグマ）、および、２種類の金展着剤を、市販のＴＬＲ４でコーティングされたプレートに添加した。較正曲線によってＹ軸を決定し、ＬＰＳ－ＦＩＴＣおよび展着剤を計量した。金展着剤、ＴＬＲ４－ＰＥ、および、ＬＰＳ－ＦＩＴＣをインキュベート後のコーティングされたウェルのそれぞれに添加し、３７℃で６０分間インキュベートした。その後、プレートを０．１％のＢＳＡを含むＰＢＳで３回洗浄した。最後に、各コーティングされたウェルに１００μｌの脱イオン水を添加し、ＥＬＩＳＡリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ２、モレキュラーデバイス）を用いて蛍光を出力した（金展着剤：Ｅｘ３９０ｎｍ／Ｅｍ４６０ｎｍ、ＰＥ：Ｅｘ４９６ｎｍ／Ｅｍ５９４ｎｍ、ＦＩＴＣ：４９６ｎｍ／５４０ｎｍ）。

動物
雄の８～１２週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｎａｒｌマウスを台湾国家実験動物センター（台湾、台北）から購入した。すべてのマウスは、国家衛生研究院（ＮＨＲＩ）の実験動物センターにおいて適度な湿度および温度による特定の無菌状態で飼育された。すべての動物実験手順は、ＮＨＲＩの施設内動物実験委員会によって承認された公開ガイドラインに従った。

ＬＰＳ処置
ＳＡｕＮＣとＬＰＳとのインビボでの相互作用を明らかにすべく、０．１μｇ（２μｇ／ｍｌの５０μＬ、４ｍｇ／ｋｇ（体重））のＬＰＳ（大腸菌Ｏ１１１：Ｂ４、シグマ、米国ミズーリ州セントルイス）の単回投与、または、７．５μｇのＳＡｕＮＣを含む５０μＬのＰＢＳの単回投与を、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎａｒｌマウスの後肢の足蹠から皮下注射にて行った。コンタミネーションを最小限にすべく、ＳＡｕＮＣ溶液およびＬＰＳ溶液のどちらをも、細孔径が０．２２μｍの親水性ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）メンブレンを有するシリンジフィルターを介して殺菌した。保護群のマウスには、ＳＡｕＮＣの単回投与の注射から２０分後にＬＰＳを単回投与で注射した。処置群のマウスには、まずＬＰＳを注射し、その２０分後に、ＳＡｕＮＣを単回投与で注射した。指示された２回目の注射の２時間後に、イソフルランの過剰吸入により安楽死させてから、心臓穿刺により血液試料を収集した。ＴＮＦ－αアッセイのために、最初の注射から１時間後に血液試料を採取した。ＬＰＳ誘発性敗血症の実験モデルでは、雄のＣ５７ＢＬ／６Ｎａｒｌマウス（平均体重２４．９±１．３ｇ）に、致死量である２５ｍｇ／ｋｇのＬＰＳを注射する前後に、１００μＬのＰＢＳに溶解した２種類のＳＡｕＮＣ（７５ｍｇ／ｋｇ（体重））を３０分間隔で、２９ゲージ針を用いて腹腔内注射した（ｎ＝１０／群）。マウスを異なる間隔で一週間まで観察した。

血漿
初期免疫応答の研究のために、ルミネックスバイオプレックス２００システムによるバイオプレックスプロマウス２３プレックスアッセイ（バイオラッド）によって、メーカーの指示に従い、血漿マルチプレックスサイトカインアッセイを行った。マウスＴＮＦ－αイムノアッセイキット（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を用いて、メーカーの指示に従い、血漿中のＴＮＦ－αを測定した。

マウス骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）の単離
雄のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの大腿骨および脛骨から骨髄細胞を単離し、赤血球を溶解した。６ウェルプレート中に１０％の加熱不活性化したＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、１００μＭの２‐メルカプトエタノール、および、１０ｎｇ／ｍｌのマクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を含むＲＰＭＩ－１６４０完全培地で骨髄前駆細胞（５×１０^６／ウェル）を７日間維持した。
処置前に、培地を取り除くことによって、非接着細胞を除去した。

ＬＰＳ（２０ｎｇ／ｍｌ）で刺激されないかまたは刺激されたＢＭＤＭを展着剤Ｍで３０分間処置した。ウエスタンブロット法による分析のためにＢＭＤＭを収穫した。

ウエスタンブロット
マウスＲＡＷ２６４．７マクロファージ細胞を６ｃｍのペトリ皿に１×１０^６の細胞密度で播種し、４８時間成長させて９０％密生させ、１０％の加熱不活性化したＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、および１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを追加したＲＰＭＩ－１６４０完全培地で維持した。ＲＡＷ２６４．７細胞を表示時間に収穫し、Ｈａｌｔプロテアーゼ／ホスファターゼ混合型阻害剤（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含むＲＩＰＡ緩衝液（シグマ）によって溶解した。全細胞ライセートを８％のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルを用いて電気泳動により分離し、ＰＶＤＦメンブレン（ミリポア）に移し、５％のＢＳＡを含むＴＢＳＴで１時間ブロッキングし、ｐｈｏｓｐｈｏ－Ｓｅｒ５３６ ＮＦ－κＢ ｐ６５（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、および、ローディングコントロールとしてのβアクチンを含む一次抗体によって４℃で一晩イムノブロットした。メンブレンをＨＲＰ基質（ミリポア）に露出させ、アマシャムイメージャ６００（ＧＥヘルスケアライフサイエンス）において特定のタンパク質を視覚化した。

薬物動態の研究
雄のＣ５７ＢＬ／６Ｎａｒｌマウスに、ＳＡｕＮＣ（１００μＬの滅菌ＰＢＳ中に７５ｍｇ／ｋｇ（体重））を６０分間隔で２回、２９ゲージ針を用いて腹腔内注射した。最初にＳＡｕＮＣを注射してから０分（ベースライン）、１５分、３０分、６０分、７５分、９０分、１０５分、１２０分、３時間、４時間、５時間、６時間、８時間、１２時間、２４時間、４８時間後に血液試料を採取した。ＥＤＴＡを血液凝固阻止剤として含有する紫キャップの採血管に血液試料全体を収集し、誘導結合プラズマ質量分析（ＩＣＰ－ＭＳ）によって金原子含有量を測定した。エクセルソフトウェアを用いて薬物動態パラメータを計算し、半減期（ｔ_１／２）、最大血漿濃度時（Ｔ_ｍａｘ）、最大血漿濃度（Ｃ_ｍａｘ）、および、濃度時間曲線下面積（ＡＵＣ_ａｌｌ）を含めた。

統計分析
統計分析を実施するために、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍプログラム（ｖ７．０２）を用いた。バイオアッセイ用データを、平均値±標準偏差（ＳＤ）で表し、テューキーの多重比較検定を伴う一元配置ＡＮＯＶＡ（分散分析）を用いてＰ値を計算し、Ｐ値が０．０５未満を統計的に有意な試験結果とみなした。ＬＰＳ誘発性敗血症の実験モデルでは、カプラン・マイアー曲線を用いて生存率データをプロットし、ＳＡｕＮＣ群とＬＰＳのみの群とを比較するために、ログランク（マンテルコックス）検定によって分析した。

結果
本研究では、リピドＡ（ＬＰＳのエンドトキシン毒性の活性部位）のｄ間隔を圧縮することによって、エンドトキシン活性を阻害する超微小金展着剤の構築を目指した。分子内充填密度を操作することによって、リピドＡドメインのコンホメーションをより低密度からより高密度に変換することができ、それによって、先天性免疫認識に劇的に影響を及ぼすことができる。充填密度をより低くするかまたは高くするｄ間隔の差は、数オングストロームの違いでしかない。このような微妙な変化を微調整するために、抗エンドトキシン展着剤は、柔らかい材料からなる接着剤のようなモチーフと、フレーク状の超微小でありながらも硬い基体とによって構成されることが必要であろう。この展着剤のような構造は、ＬＰＳの非層状集合を阻害するための臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）を高めるだけでなく、リピドＡのｄ間隔にも影響を及ぼすことが期待されよう。しかしながら、ほとんどのナノメートルスケールの硬い材料、すなわち、無機ナノ粒子は、異なる曲率を有する立体形状を有するため、フレーク状の展着剤の基体に用いられるには不適切である。幸いにも、ナノ粒子のサイズをサブナノメートルのレンジまで縮小すると、このような粒子の形状をフレーク状に変えることができる。例えば、フレーク状のサブナノメートルの金ナノクラスタ（ＳＡｕＮＣ）は、理論上はすでに確立されている。我々は、ＳＡｕＮＣのこのような平坦面は、リピドＡの分子内のｄ間隔を圧縮することによって、付着した接着剤状モチーフがＬＰＳのリピドＡドメインと容易に結合することを可能にし（図１）、それによって、エンドトキシン誘発性敗血症を発症させるＴＬＲ４－ＭＤ２複合体の認識を低下させ得るだろうと仮定した。

図２Ａは、本研究に用いられたＳＡｕＮＣからの、励起ピークが約３９０ｎｍ、発光ピークが約４６０ｎｍにある青色光ルミネセンスを示す。ＳＡｕＮＣのサイズをどのようにして正確に測定するかということは難問であるが、光ルミネセンスの発光波長は、いくつの金原子が単一のナノクラスタを構成しているかの合理的な見積もりを可能にする。約４６０ｎｍで見られる発光波長の最大値は、ＳＡｕＮＣがＡｕ８を主成分とするナノクラスタであることを示している（すなわち、Ａｕ８は８個の金原子からなる）。デンドリマーに内包されたＳＡｕＮＣの形成に基づく合成プロトコルは、１つのデンドリマー内のＡｕ８を主成分としたナノクラスタを主産物として実証した質量測定とともに、別の文献で公開されている。それ以外では、デンドリマーに内包されたＳＡｕＮＣの全体のサイズは、金原子の埋め込みによってデンドリマーの外側のアミンに不可逆的なバックフォールディングを生じさせることができ、その結果、デンドリマーの立体構造が収縮するという事実によって、２ｎｍくらいしかないはずであると報告されている。デンドリマーのコンホメーションの収縮は、ｐＨおよび溶媒極性、イオン強度を含む様々なパラメータを調整する間に容易に起こり得ることを強調しておくべきである。ＳＡｕＮＣの寸法は、１ｎｍ未満になると推定され、このようなナノクラスタは、おそらくフレーク状であろうと考えられる。したがって、ＳＡｕＮＣの形状を研究するために、高分解能透過型電子顕微鏡（ＨＲＴＥＭ）をさらに用いた。非常に驚くべきことに、銅グリッドにナノクラスタが層ごとに堆積でき（図２Ｂ～２Ｄ）、いくつかのドメインは、良好なアラインメントを示したので（図２Ｃ）、これらのＳＡｕＮＣは、薄膜へと自発的に自己組織化できることが推測され得る。さらに、金原子の近接距離は、０．２８５～０．２８９ｎｍの範囲（図２Ｂ～２Ｄに白い矢印で示す）であり、これは、最近接間隔の理論値（すなわち０．２８８ｎｍ）と非常に近いことを発見した。原子分解能は、このアラインメントが金ナノ粒子のものではなく、デンドリマーに内包されたＳＡｕＮＣのアラインメントと一致することを確かめるための直接証拠をもたらす。つまり、このアラインメントは、金ナノ粒子の形成およびアラインメントを生じる、金原子の合体から形成されたチオール保護ＳＡｕＮＣの高次構造のアラインメントとは異なる。本研究で用いられるＳＡｕＮＣの層ごとの堆積は、保護している分子（すなわち、変形デンドリマー）が金原子の合体を防ぐとともに、ＳＡｕＮＣの自己組織化の助けとなり得ることも実証した。その結果、薄膜の観察により、ＳＡｕＮＣの形状が、層ごとのアラインメントを可能にし得るフレーク状構造を成すという説明も可能になる。この観察に基づき、ＳＡｕＮＣをメチル基およびエチル基という２種類のアルキルモチーフで修飾し、それを接着剤として用いて展着剤Ｍおよび展着剤Ｅを得た。これらの展着剤の合成およびキャラクタリゼーションの詳細は、補足的文章に記載され、図３～４Ｂに示されている。

次に、展着剤Ｍまたは展着剤Ｅの存在がＬＰＳのＣＭＣに影響を及ぼし、その結果、ＬＰＳの集合を阻害し得るか否か決定することは非常に興味深い。
比較のため、他の親水性ＳＡｕＮＣ（展着剤Ａ）および疎水性ＳＡｕＮＣ（展着剤Ｈ）も調製した。これらは、ＬＰＳ集合体をもたらすことが検証済みであるアルキルモチーフの修飾を含まない。すなわち、ＬＰＳのＣＭＣは、これらには影響され得ないということである。図５Ａ（上段）は、小角Ｘ線散乱（ＳＡＸＳ）による、様々な展着剤の存在下および非存在下における、ＬＰＳの集合体形成を決定した約０．１Ａ^－１の強い信号を示す。ギニエ解析に従い、前方散乱強度Ｉ（_０）は、測定された散乱強度の二乗（ｑ^２）の関数としてのｌｎ（Ｉ）の線形プロットを当てはめることにより得られた（図５Ａ、中段）。Ｉ（_０）は、低い溶液濃度に対して良好な直線性を示すので（図５Ａの下段）、各条件でのＬＰＳのＣＭＣ値を、直線外挿によって計算することができた。
予想通り、図５Ａ（４番目および５番目の列）は、展着剤Ｍまたは展着剤Ｅの存在下では、ＬＰＳのＣＭＣ値が、ＬＰＳのみ（１番目の列）よりも著しく（１０倍）上昇したことを示している。これらの効果は、ＳＡｕＮＣにおけるメチルおよびエチルモチーフとリピドＡとの相互作用に起因するのかも知れず、ＬＰＳの自己組織化プロセスを阻止するという結果となり得た。微小角入射広角Ｘ線散乱（ＧＩＷＡＸＳ）を用いたリピドＡのｄ間隔の測定を図５Ｂ（左側）に示す。結果は、展着剤Ｍおよび展着剤Ｅのいずれも散乱ベクトル（ｑ）の目立った変化をもたらし、展着剤Ｍは１４．９６ｎｍ^－１から１６．３２ｎｍ^－１に変化し、展着剤Ｅは１４．９６ｎｍ^－１から１７．７２ｎｍ^－１に変化したことがわかった。各条件でのリピドＡのｄ間隔（２π／ｑ）の値を計算し、図５Ｂに示した（右側）。ｄ間隔の値は、４．１９Åから３．５４Åまでにほぼ分布している。ＬＰＳのみで確認されたリピドＡのｄ間隔と比べて、展着剤Ｈ、Ｍ、およびＥは、リピドＡのｄ間隔を圧縮したということに注目されたい。つまり、展着剤Ａは圧縮しなかった。これらの結果は、疎水性部分を有する展着剤、特に、メチルおよびエチルモチーフだけを有する展着剤は、ＣＭＣを高めるだけでなく、個別のＬＰＳ分子それぞれの分子内のｄ間隔を縮小することで充填密度をより高め（図５Ｃ）、敗血症を予防することができることを示した。

上記したような、ＬＰＳのリピドＡと直接結合できる展着剤の他にも、展着剤Ｍおよび展着剤ＥがＴＬＲ４－ＭＤ２複合体と結合するアンタゴニストとしての役割を果たせるか否かを評価する必要もある。予想通り、展着剤Ｍおよび展着剤ＥのいずれもＬＰＳと結合し、用量依存性応答を示した（図６Ａ）が、ＴＬＲ４と結びつくことはできない（図６Ｃ）ことがわかった。結果として、我々の展着剤がＴＬＲ４アンタゴニストとして機能するという結論は、除外できる。さらに重要なことに、ＬＰＳ単独での会合に比べて、展着剤Ｍおよび展着剤Ｅの存在下でのＬＰＳとＴＬＲ４－ＭＤ２複合体との会合は、劇的に減少する（図６Ｂ）。この観察は、ＬＰＳと様々なタンパク質との間の相互作用を阻害するためには、展着剤Ｍおよび展着剤ＥがＬＰＳのリピドＡと結合しさえすればよいことを示唆している。

このように、我々の戦略に基づき、展着剤は、抗エンドトキシン用の有効な阻害剤となるであろう。超微小金展着剤によるリピドＡの圧縮により、ＬＰＳ誘発性炎症からマウスを保護することができるという仮説を検証する必要がある。展着剤Ｍおよび展着剤Ｅのいずれも単独では免疫刺激剤とは考えられないことに留意されたい（図７）。単純化のため、展着剤Ｍのみの調査を、ＬＰＳ投与マウスにおける重要な炎症誘発性サイトカインおよびケモカインの誘導を詳細に研究することによって行った。展着剤Ｍの注射の前処置または後処置に関わらず、ＬＰＳ誘発性サイトカイン／ケモカイン誘導の阻止は、ＬＰＳと展着剤Ｍとのプレミックス（図８、および、図９Ａ～９Ｃ、混合物と記されたカラム）の注射に匹敵した。例えば、ＬＰＳ投与マウスにおける、血漿中のＴＮＦ－α、ＩＬ－６、および、ＩＬ－１βを含む炎症誘発性のＮＦ－κＢ依存性サイトカインの濃度は、著しく低下した。また、血漿中の免疫賦活性ＩＬ－１２ｐ７０の濃度は変わらなかったが、血漿中のＩＬ－１２ｐ４０の濃度は、展着剤Ｍの前処置の方が展着剤Ｍの後処置より低くなった。ＩＬ－１２ｐ４０は、先天性防御免疫と適応性防御免疫との橋渡しとしての免疫調節の役割を果たす。その一方で、展着剤Ｍを注射されたマウスでは、ＬＰＳの投与に応答して先天性免疫細胞によって分泌された血漿中のＧＭ－ＣＳＦおよびＧＲＯα（ＫＣ）のいずれの濃度も著しく低下した。他の血漿中のサイトカインおよびＣＸＣケモカインプロフィールの産生（図９Ａ～９Ｃ）、および、ＲＡＷ２６４．７および骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）からのリン酸化ＮＦ－κＢの発現（図１０Ａおよび図１０Ｂ）も著しい減少を示した。総合すると、結果は、超微小金展着剤Ｍは、リピドＡの機能に影響を及ぼし得るので、ＬＰＳの注射後、より早い事象においてエンドトキシンの細胞毒性を減少させることになることを示唆した。

薬物動態の研究では、表１に示すように、展着剤Ｍの半減期は１７．４時間であり、展着剤Ｅの半減期である１５．４時間よりわずかに長かった。ＬＰＳ誘発性敗血症マウスにおける展着剤Ｍおよび展着剤Ｅを用いた予防効果を検証した（図１１）。

我々の展着剤ではグラム陰性菌を殺すことができなかったので（表２）、実験的敗血症は、菌の死後のエンドトキシン片の放出を模倣した。展着剤を注射しないＬＰＳ誘発性敗血症マウスのメディアン生存時間は、２２．５時間であるのに対し、展着剤Ｍおよび展着剤Ｅで前処置されたＬＰＳ誘発性敗血症マウスのメディアン生存時間は、それぞれ６７．５時間および７０時間であった。２種類の展着剤（すなわち、展着剤Ｍおよび展着剤Ｅ）は、ＬＰＳ誘発性敗血症マウスの生存時間を著しく長く、３倍に延ばした。展着剤Ｅを注射したＬＰＳ誘発性敗血症マウスの生存時間は、展着剤Ｍを注射したＬＰＳ誘発性敗血症マウスの生存時間よりわずかに長かった。このさらなる向上は、分子間のファンデルワールス力により、エチルモチーフがメチルモチーフより強くリピドＡと接着することができるという事実によるものであると推測される。まとめると、修飾されたメチルおよびエチルモチーフを有する超微小金展着剤は、抗エンドトキシン展着剤として機能する可能性があり得る。

要するに、エンドトキシン活性を効果的に阻害することができる、敗血症を予防する手段としてのサブナノメートルの金展着剤を本明細書に提示する。
超微小展着剤は、フレーク状の基体として機能する金ナノクラスタと、グラム陰性菌の危険な組織片であるＬＰＳと結合するための接着剤としての役割を果たす短いアルキルモチーフのコーティングとからなり、リピドＡを標的化し、その分子内の炭化水素鎖間の距離（ｄ間隔）を圧縮する。生物学的関連性では、ＬＰＳ投与マウスの血漿中の腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ－α）、ＩＬ－６、ＩＬ－１β、および、ケモカインを含む重要な炎症誘発性のＮＦ－κＢ依存性サイトカインの誘導は、顕著な減少を示した。そればかりでなく、抗エンドトキシン展着剤の処置は、ＬＰＳ誘発性敗血症マウスの生存時間を著しく延ばすことができた。抗エンドトキシン展着剤の注射は、グラム陰性菌感染症によって引き起こされる敗血症の早期予防の潜在的な治療戦略となる可能性があり、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、敗血症性ショック、および、敗血症による致死から患者を効果的に保護するだろう。

Claims (15)

1. ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）デンドリマーに内包されたサブナノメートルの金ナノクラスタを含み、
   前記ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）デンドリマーは、アルキル基で修飾され、
   前記サブナノメートルの金ナノクラスタの形状は、略フレーク状構造を有する、
   サブナノメートルの含金構造。
2. 前記ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）デンドリマーは、Ｇ _n ＮＨ ₂ デンドリマー、または、Ｇ _n ＯＨデンドリマーであり、ｎは、０～４である、請求項１に記載のサブナノメートルの含金構造。
3. 前記ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）デンドリマーは、第４世代（Ｇ４）デンドリマーである、請求項２に記載のサブナノメートルの含金構造。
4. 前記ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）デンドリマーは、Ｇ ₄ ＮＨ ₂ デンドリマー、または、Ｇ ₄ ＯＨデンドリマーである、請求項３に記載のサブナノメートルの含金構造。
5. 前記アルキル基は、メチル基、または、エチル基を含む、請求項１に記載のサブナノメートルの含金構造。
6. 前記サブナノメートルの含金構造は、リポ多糖（ＬＰＳ）のリピドＡの分子内の炭化水素鎖間の距離（ｄ間隔）を圧縮するための有効量が使用され、投与を必要とする哺乳類中のエンドトキシン活性を阻害するために使用される請求項１～５のいずれか一項に記載のサブナノメートルの含金構造。
7. リピドＡの前記ｄ間隔の値を、４．１９Åから３．５４Åまで減少させる、請求項６に記載のサブナノメートルの含金構造。
8. リピドＡの前記ｄ間隔の値を、４．１９Åから３．８５Åまで減少させる、請求項７に記載のサブナノメートルの含金構造。
9. ＬＰＳ感染哺乳類中の炎症誘発性サイトカインを抑制するために使用される請求項１～５のいずれか一項に記載のサブナノメートルの含金構造。
10. 前記サブナノメートルの含金構造の有効量は、前記サブナノメートルの含金構造と前記ＬＰＳとのモル比に依存する、請求項９に記載のサブナノメートルの含金構造。
11. 前記サブナノメートルの含金構造と前記ＬＰＳとの前記モル比は、１：２である、請求項１０に記載のサブナノメートルの含金構造。
12. 前記サブナノメートルの含金構造の有効量は、約５０～１００ｍｇ／ｋｇ（体重）である、請求項９に記載のサブナノメートルの含金構造。
13. 前記炎症誘発性サイトカインは、ＮＦ－κＢ、ＴＮＦ－α、ＩＬ－６、ＩＬ－１β、ＣＸＣケモカインプロフィール、ＩＬ－１２ｐ４０、ＧＭ－ＣＳＦ、または、ＧＲＰα（ＫＣ）を含む、請求項９に記載のサブナノメートルの含金構造。
14. 前記サブナノメートルの含金構造は、ＬＰＳの非層状集合を阻害するための臨界ミセル濃度を高めるための有効量が使用され、投与を必要とする哺乳類中のエンドトキシン誘発性敗血症を予防するために使用される請求項１～５のいずれか一項に記載のサブナノメートルの含金構造。
15. 前記ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）デンドリマーは、第４世代（Ｇ４）デンドリマーであり、
    前記アルキル基は、メチル基、または、エチル基である、請求項１に記載のサブナノメートルの含金構造。

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