JP7141079B2 - 栄養障害型表皮水疱症治療剤 - Google Patents

Description

本発明は、栄養障害型表皮水疱症の治療剤に関する。

表皮水疱症は、表皮～基底膜～真皮の接着を担っている接着構造分子が生まれつき少ないか消失しているため、日常生活で皮膚に加わる力に耐えることができずに表皮が真皮から剥がれて水ぶくれ（水疱）や皮膚潰瘍を生じてしまう疾患である。そのうち、表皮が千切れて水疱ができる病型を単純型表皮水疱症、表皮と基底膜の間で剥がれて水疱ができる病型を接合部型表皮水疱症、基底膜と真皮の間で剥がれる病型を栄養障害型表皮水疱症という。

栄養障害型表皮水疱症は、表皮水疱症の約５割を占める。殆どの場合、生直後から爪の変形や脱落を認める。また、潰瘍部の真皮で線維化が亢進して固くなる、いわゆる瘢痕形成と、その表面に脂肪の粒である稗粒腫が生じる。優性遺伝型に比べて劣性遺伝型の症状が強く、優性遺伝型は経過と共に症状が軽くなることが多い一方、劣性遺伝型では手指の癒着、開口障害、眼瞼癒着など、瘢痕に伴う皮膚・粘膜症状が進行する場合がある。重症な場合は成人以降に瘢痕癌を合併する場合があり、また食道粘膜剥離による食道瘢痕狭窄、慢性炎症に伴う糸球体腎炎、心筋症など内臓の合併症も引き起こす。栄養障害型表皮水疱症は、VII型コラーゲン遺伝子等の種々のタンパク質産生遺伝子に異常が認められ、特に劣性栄養障害型表皮水疱症ではVII型コラーゲン遺伝子異常が認められ、重症の場合、手指の瘢痕癒着が進行し、また成人後に瘢痕癌を合併することが多い（非特許文献１）。

特開２０１６－１３０７０号公報

難病情報センターの表皮水疱症（指定難病３６）に関するサイト(http://www.nanbyou.or.jp/entry/5338)

表皮水疱症、特に栄養障害型表皮水疱症には有効な治療法がなく、治療法の開発が望まれている。
従って、本発明の課題は、栄養障害型表皮水疱症の治療剤を提供することにある。

そこで本発明者は、難病に指定されている表皮水疱症の治療手段を開発すべく検討してきたところ、全く意外にも、本発明者が先に脂肪組織由来幹細胞から分化誘導した表皮角化前駆細胞（特許文献１）がVII型コラーゲンを発現することを見出し、当該表皮角化前駆細胞を投与すれば、栄養障害型表皮水疱症が治療できることを見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、次の〔１〕～〔３〕を提供するものである。

〔１〕脂肪組織由来幹細胞から分化誘導された、VII型コラーゲンを発現する表皮角化前駆細胞を有効成分とする栄養障害型表皮水疱症治療剤。
〔２〕前記表皮角化前駆細胞が、脂肪組織由来幹細胞を、線維芽細胞、レチノイン酸及び骨形成タンパク質４の存在下に培養することにより分化誘導された表皮角化前駆細胞である〔１〕記載の栄養障害型表皮水疱症治療剤。
〔３〕前記培養系が、さらにコラーゲンを含有する〔２〕記載の栄養障害型表皮水疱症治療剤。

本発明によれば、VII型コラーゲン遺伝子に異常が生じている栄養障害型表皮水疱症患者の皮膚に、コラーゲンを発現する表皮角化前駆細胞を供給できるため、患者の表皮でコラーゲン産生が行なわれるようになり、栄養障害型表皮水疱症が治療できる。

本発明の栄養障害型表皮水疱症治療剤に用いられる有効成分は、脂肪組織由来幹細胞から分化誘導された、VII型コラーゲンを発現する表皮角化前駆細胞である。この表皮角化前駆細胞は、特許文献１記載の方法によって製造することができる。ここで、本発明に用いられる表皮角化前駆細胞は、脂肪組織由来細胞から分化誘導されたものであり、VII型コラーゲンを発現することになった理由は不明であり、特性だけで特定すると範囲が広くなってしまうため、構造又は特性により直接特定することは不可能である。

脂肪組織由来幹細胞から表皮角化前駆細胞への分化誘導は、例えば、脂肪組織由来幹細胞を、線維芽細胞、レチノイン酸及び骨形成タンパク質４の存在下に培養することにより行うことができる。

原料である脂肪組織由来幹細胞は、脂肪組織、例えば皮下脂肪組織をコラゲナーゼ処理後、遠心分離により間質血管細胞群を分離することにより採取することができる。
得られた脂肪組織由来幹細胞であることは、（１）この細胞が、ＣＤ３４、ＣＤ４４、ＣＤ９０及びＣＤ１０５陽性であること、（２）この細胞を、３－イソブチル－１－メチルキサンチン、ビオチン、パントテン酸塩、ロシグリタゾン、デキサメサゾン、インスリン等の存在下に培養して脂肪細胞へ分化すること、を確認すればよい。
脂肪組織由来幹細胞は、患者に対して拒絶反応を生じないヒトを含む動物由来であればよい。例えば、ＨＬＡ型の適合した細胞を用いることができる。

脂肪組織由来幹細胞は、レチノイン酸及び骨形成タンパク質４の存在下で単独培養しても表皮角化前駆細胞へは分化しないが、線維芽細胞を共存させて、レチノイン酸及び骨形成タンパク質４添加系で培養すれば、表皮角化前駆細胞へと分化誘導される。

線維芽細胞は、結合組織から採取することができ、例えば、皮膚を径５ｍｍ大で切り取り、その真皮成分より採取することができる。

線維芽細胞の使用量は、脂肪組織由来幹細胞とほぼ同量（細胞数）であるのが好ましく、具体的には、０．５～２．０倍量用いるのが好ましく、さらに０．８～１．２倍量用いればよい。また、脂肪組織由来幹細胞を表皮角化前駆細胞へ分化誘導した後、この表皮角化前駆細胞のみを採取する必要があることから、線維芽細胞と脂肪組織由来幹細胞とは分離して培養するのが望ましい。例えば、培養ウエルの内部に、トランスウエルで形成した内部ウエルを挿入した二重ウエルを設置し、内部ウエルの下側に線維芽細胞を含有させ、トランスウエル内に脂肪組織由来幹細胞を含有させるのが好ましい。

レチノイン酸は、培養液中、１μＭ～３μＭ含有させるのが好ましい。また、骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）は、培養液中に２５ｎｇ／ｍＬ～３０ｎｇ／ｍＬ含有させるのが好ましい。

さらに、培養系には、分化誘導効率を向上させる点から、コラーゲンを共存させるのが好ましく、コラーゲンの培養系中の含有量は１～１０μｇ／ｍＬ、特に５μｇ／ｍＬが好ましい。また、コラーゲンとしては、IV型コラーゲンが好ましい。なお、コラーゲンは、脂肪組織由来幹細胞と接触しているのが好ましい。例えば、トランスウエルで形成した内部ウエルの内部にコラーゲンを添加し、そのコラーゲンの上に脂肪組織由来幹細胞を含有させるのが好ましい。

培養は、例えば１０％仔ウシ血清（ＦＣＳ）含有ダルベッコ変性イーグル培地（ＤＭＥＭ）や角化細胞用培地中で３７℃、９５％ＣＯ₂下、２４～４００時間行うのが好ましい。

より好ましくは、培養ウェルの中に線維芽細胞を培養し、IV型コラーゲンをコーティングしたトランスフェルをのせて、その中に脂肪組織由来幹細胞を培養し、次いで２４時間後にオールトランスレチノイン酸を添加する。７２時間後にＢＭＰ４を添加し、４日後にトランスウェル内のみ角化細胞用培地（ＫＳＦＭ）に変える。７日間培養したらトランスウェル上の細胞だけ取り出してIV型コラーゲンをコーティングしたディッシュにまき直し、７－１４日間培養するのが好ましい。

培養により脂肪組織由来幹細胞が皮膚角化前駆細胞に分化誘導されたかどうかを確認するには、脂肪組織由来幹細胞はデスモグレイン３の発現が変化せず、皮膚角化前駆細胞はデスモグレイン３、ケラチン５、ケラチン１０の発現が増加するので、デスモグレイン３、ケラチン５、ケラチン１０の発現の増加を検出すればよい。

前記方法により得られた皮膚角化前駆細胞は、VII型コラーゲンを発現している。従って、この皮膚角化前駆細胞を、栄養障害型表皮水疱症患者の皮膚等に投与すれば、その患者表皮がコラーゲンを発現することから、栄養障害型表皮水疱症が治療できる。

本発明の治療剤が適用される栄養障害型表皮水疱症としては、劣性栄養障害型表皮水疱症がより好ましい。

皮膚角化前駆細胞の投与手段としては、患者の皮膚に移植するのが望ましい。皮膚角化前駆細胞の移植は、例えば局所に塗布、局所注射、あるいは血管内注射によって皮膚に投与すればよい。

次に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明する。

参考例１
（脂肪組織由来幹細胞の採取）
（１）皮下脂肪組織を採取し、リン酸緩衝生理食塩水にて洗浄した。コラゲナーゼに浸した後１０％仔ウシ血清含有ダルベッコ変法イーグル培地にてコラゲナーゼを中和した。
（２）４０μｍのナイロンメッシュを通して残渣を除去した。１２００ｒｐｍで１０分間遠心し、沈殿物を回収した。再び１０％仔ウシ血清含有ダルベッコ変法イーグル培地５ｍＬに溶解し、培養プレートに播種して数日間培養し、培養プレート底面に接着したものが脂肪由来幹細胞である。

実施例１
トランスウェルで下側に線維芽細胞を播種して１０％ウシ血清入りＤＭＥＭで２４時間培養した。次いで上側のメンブレンの両面にIV型コラーゲンをコーティングして脂肪組織由来幹細胞を播種して１０％ウシ血清入りＤＭＥＭで、３７℃で２４時間培養した。オールトランスレチノイン酸を１μＭで上側に添加した。７２時間後に骨形成因子４を２５ｎｇ／ｍＬで添加した。
４日後に上側をＫＳＦＭ培地に変更した。下側は１０％ウシ血清入りＤＭＥＭのままで、２－３日ごとに培地を変えながら３７℃で７日間培養した。
上側のプレートを取り外し、IV型コラーゲンをコーティングしたディッシュ上に播種し直して、ＫＳＦＭ培地で３７℃で２週間培養した。
本細胞について、リアルタイムＰＣＲや免疫染色（蛍光免疫染色）により検討した結果、本細胞はケラチン１０などの表皮角化細胞マーカーを発現しており、高率にVII型コラーゲンを発現していた。
得られた皮膚角化前駆細胞はケラチン１０などの表皮角化細胞マーカーを発現しており、高率にVII型コラーゲンを発現していた。従って、本細胞はVII型コラーゲン遺伝子異常による栄養障害型表皮水疱症患者の皮膚に投与することで、皮膚でVII型コラーゲンを生成させることができる。

Claims (1)

1. 脂肪組織由来幹細胞から分化誘導された、ＶＩＩ型コラーゲンを発現する表皮角化前駆細胞を有効成分とする栄養障害型表皮水疱症治療剤であって、前記表皮角化前駆細胞が、脂肪組織由来幹細胞を、線維芽細胞、レチノイン酸、骨形成タンパク質４及びＩＶ型コラーゲンの存在下に培養することにより分化誘導された表皮角化前駆細胞である、栄養障害型表皮水疱症治療剤。