JP7132155B2 - 天然の抗菌成分および抗真菌成分を有するプロセスチーズならびに製造方法 - Google Patents

Description

本出願は、一般にプロセスチーズ組成物および製造方法に関し、特に、天然の抗菌成分
および抗真菌成分を含有するプロセスチーズ組成物に関する。

スライスした形状および棒状で広く市販されているプロセスチーズは、販売高の多いチ
ーズ製品の１つである。プロセスチーズ製品は、特に子供に人気がある。プロセスチーズ
は従来、例えば、チェダーチーズ、コルビーチーズ、スイスチーズ、ブリックチーズ、ミ
ュンスターチーズ、パスタフィラータチーズ、洗浄したカード、および粒状カードチーズ
が提案されるが、この他にもいくつかの種類のある、乳脂肪含有ナチュラルチーズの１種
類以上を加熱し、粉砕し、および／または混合することにより調製される。次いで、得ら
れたチーズを、チーズの殺菌に十分な高い温度で、無脂肪乾燥乳および乳清固形分等の他
の乳製品ならびにリン酸二ナトリウム等の乳化塩と混合し、シート状、スライス状、また
は他の所望の形状に成形することのできる、均質でポンプ輸送可能な流体チーズ材料を製
造する。

プロセスチーズ等の食品の貯蔵寿命を延長し、および／または、そのような食品の微生
物学的安定性を増大させることが、しばしば望まれる。食品が安定している時間を増大さ
せることによって、製造者は、腐敗した食品による在庫損失を軽減することができる。包
装、保存料、および／または特定の貯蔵パラメータ（例えば、冷蔵）の使用等の従来の方
法が、腐敗を食い止めるために使用されてきた。

特に、リステリア菌およびボツリヌス菌は、場合によっては、生乳、チーズ（特に柔ら
かく熟成させた品種）、アイスクリーム、生野菜、発酵生肉ソーセージ、生および調理済
みの鶏肉、生肉（全ての種類）、ならびに生および燻製した魚等の食品で懸念される。場
合によってはわずか３℃の温度でも成長するこれら病原菌の能力により、冷蔵した食品中
での増殖が可能となる。

さらに、プロセスチーズ等の食品の貯蔵寿命を向上させることが望まれる一方で、天然
成分の含有量を増やした食品を提供することへの要望が増加している。これに関して、天
然成分のみを含む食品を提供するか、またはそうでなければ人工的な材料を除去すること
が望ましい場合がある。例えば、プロセスチーズでは、食品の安全性および貯蔵寿命を改
善するために、ソルビン酸等の保存料を利用することが多い。プロセスチーズの特性を維
持し、および／または、改善しつつも、天然の保存料および／または抗菌物質を組み込む
ことが望ましい場合がある。

天然の抗菌成分および抗真菌成分を含むプロセスチーズを提供する。１つの試みにおい
て、天然の抗菌剤はナイシンである。いくつかの試みにおいて、ナイシンはナイシンＡを
含む。他の試みにおいて、天然の抗真菌剤はナタマイシンである。ナイシンおよびナタマ
イシンを含むプロセスチーズは、ナイシンとナタマイシンの含有が少量であるにもかかわ
らずカビおよびグラム陽性菌の増殖を阻害するので、貯蔵寿命が顕著に長くなることが予
想外にも判明している。ナタマイシンは分解しやすいことが知られているので、こうした
少量のナイシンおよびナタマイシンがプロセスチーズ製品の貯蔵寿命を延ばすために効果
的であることは特に驚くべきことである。

いくつかの試みにおいて、プロセスチーズは、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、亜硝
酸塩、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される人工保存料を含まない。本明
細書において、「含有しない」、「含まない」、または「実質的に含まない」のとの語句
は、約０．５％未満、他の試みでは約０．１％未満、場合によっては約０．０５％未満、
および、他の場合には皆無であることを意味する。

いくつかの試みにおいて、プロセスチーズは、プロセスチーズを約８６°Ｆ（３０℃）
で保存した場合に少なくとも約９日間にわたりボツリヌス菌による毒素形成を阻止するの
に有効な量の天然の抗菌剤を含む。また、プロセスチーズは、４５°Ｆ（７．２℃）での
貯蔵の間、少なくとも約１ヶ月間、別の態様では少なくとも２ヶ月間、別の態様では少な
くとも３ヶ月間、別の態様では少なくとも４ヶ月間、別の態様では少なくとも５ヶ月間、
別の態様では少なくとも６ヶ月間、さらに別の態様では少なくとも７ヶ月間にわたり、リ
ステリア・モノサイトゲネスの増殖を１ｌｏｇを超えて防止するのに有効な量で、天然の
抗菌剤を含む。いくつかの態様において、ナイシンはナイシンＡである。

プロセスチーズの製造中に添加されるナタマイシンの量は、加熱工程中にナタマイシン
の一部が分解されることを念頭において選択されるべきである。したがって、プロセスチ
ーズに当初添加されるナタマイシンの量は、例えば１ヶ月、２ヶ月、または３ヶ月保存時
に製品中に残存しているものよりも著しく高くなり得る。一般に、製品中へのナタマイシ
ンの保持を最適化する加工条件を選択することが望ましい。また、プロセスチーズを製造
する過程における加熱工程の後に、ＨＰＬＣで検出して、約０．１～約１５ｐｐｍのナタ
マイシン、他の試みでは約０．５～約１０ｐｐｍのナタマイシン、他の試みでは約０．５
～約８ｐｐｍのナタマイシン、他の試みでは約０．５～約６ｐｐｍのナタマイシン、他の
試みでは約２～約６ｐｐｍのナタマイシン、他の試みでは約２～約５ｐｐｍのナタマイシ
ン、および他の試みでは約２～約４ｐｐｍのナタマイシンを保持するプロセスチーズ製品
を提供するのに有効である初期ナタマイシン濃度を選択することが望ましいことが分かっ
た。一態様では、ナタマイシンの量は、製品の包装の７２時間以内のように、加熱工程の
終了から７２時間以内に測定することができる。これは加熱工程後の残存量であるので、
プロセスチーズの製造中にナタマイシンの少なくとも一部が分解された後にも所望の量が
残存するように、より多くの量のナタマイシンを最初に包含することが必要となる場合が
ある。

いくつかの試みにおいて、プロセスチーズは、約１～約１０℃で保存された場合に、少
なくとも約３ヶ月、別の態様では少なくとも約４ヶ月、別の態様では少なくとも約５ヶ月
、別の態様では少なくとも約６ヶ月、およびさらに別の態様では少なくとも約７ヶ月にわ
たり、カビの成長を防止するのに有効な量の天然の抗真菌剤を含む。プロセスチーズ製品
中のナタマイシンの有効性は、プロセスチーズの試料に、９０ｃｆｕ／ｇまたは５００ｃ
ｆｕ／ｇ等の既知量のカビ胞子を接種し、４０～４５°Ｆ（４．４～７．２℃）での保存
中の目視可能なカビの成長に関して試料を検査する、カビ検証研究を行うことにより、測
定される。

いくつかの試みにおいて、プロセスチーズのナイシンを、プロセスチーズ中に約１～約
２０％で提供することができる培養乳成分の形でプロセスチーズに含むことができる。ま
た、培養乳成分中のナイシンは、液体乳培地中での単一菌株の発酵から得ることもできる
。菌株は、ラクトコッカス・ラクティスのナイシン生産株等の、任意のナイシン生産菌株
とすることができる。本開示に使用するのに好適なラクトコッカス・ラクティス株は、Ａ
ＴＣＣ ＰＴＡ－１２０５５２のラクトコッカス・ラクティス株の識別特徴のすべてを有
している。

この試みの一態様において、プロセスチーズは、約１０～約９０％のナチュラルチーズ
またはナチュラルチーズ混合物と、１種以上の任意選択の乳化剤と。約８～約２５％のた
んぱく質と、約１０～約３０％の脂肪を含む。

また、天然の抗菌成分および抗真菌成分を含むプロセスチーズを製造する方法が提供さ
れる。この方法は、ラクトコッカス・ラクティス株で液体乳培地を発酵させてナイシンを
含む培養乳成分を作り、１種以上の乳化剤と一緒にナタマイシンおよび培養乳成分を単一
のナチュラルチーズまたはナチュラルチーズの混合物に添加して約８～約２５％のたんぱ
く質と約１０～約２０％の脂肪を有するプロセスチーズを作ることを含む。プロセスチー
ズは、約０．５～約６ｐｐｍのナタマイシンと、８６°Ｆ（３０℃）で約９日間にわたり
、かかるたんぱく質量および脂肪量のプロセスチーズに対してマウスを用いた毒素バイオ
アッセイにより判定された、ボツリヌス菌による毒素形成を防止するのに有効な量のナイ
シンを含む。

この方法は、２倍～５倍に濃縮された乳製品培地中で、温度約２５～約３５℃、および
ｐＨ約５～約６にて、約１５～約４８時間にわたり行われる、ラクトコッカス・ラクティ
ス株ＡＴＣＣ ＰＴＡ－１２０５５２の発酵を含むことができる。いくつかの試みでは、
濃縮した液状乳製品培地は、全固形分が約５～約３６％、たんぱく質が約１～約１４％、
脂肪が約０～約１６％の濃縮乳である。

他の試みにおいては、この方法は、プロセスチーズが、ソルビン酸、ソルビン酸カリウ
ム、亜硝酸塩、およびそれらの混合物からなる群より選択される人工保存料を含まないよ
うにするのに有効である。

いくつかの試みにおいて、この方法の培養乳成分は、ナイシンＡと、配列番号９～１９
からなる群から選択される配列と有意な相同性を有するナイシン生成遺伝子クラスタのう
ちの少なくとも１つの遺伝子を有する細菌株を含む。

濃縮された乳製品液から製造された例示的な培養乳成分の製造を示す工程系統図である。 代替的な工程系統図である。 粉末状乳成分から製造された例示的な発酵乳製品成分の生産の第２の形態を示す工程系統図である。 ナイシンおよびナタマイシンを含むプロセスチーズのカビ検証試験の結果を示す表である。 ナイシン産生株のファージ型分析の結果を示す図である。 種々のラクトコッカス・ラクティス株のリボプリンター分析の結果を含む。 種々の乳酸菌のＥＰＳ関連遺伝子を比較した図である。 ナイシンＡのアミノ酸配列を示す。

本出願は、全体として、特に天然の抗菌成分および抗真菌成分を含むプロセスチーズに
関するものである。天然の抗菌剤（ナイシン等）と抗真菌剤（ナタマイシン等のポリエン
化合物等）との両方を含む、本明細書において提供されるプロセスチーズは、人工保存料
および／または他の種類の従来の天然の抗菌剤を除いては同一の配合であるプロセスチー
ズに比べて、大幅に向上した抗菌性を有する。本明細書に記載のプロセスチーズにおける
天然の抗菌成分および抗真菌成分の組み合わせは、両成分が極めて少量の場合にも、ボツ
リヌス菌等のグラム陽性菌およびカビの増殖の抑制に効果的であることが予想外にも発見
された。一態様において、天然の抗菌成分および天然の抗真菌成分は、チーズの製造中に
プロセスチーズに組み込まれており、局所適用としては含まれない。

以下で詳細に述べるように、プロセスチーズ中の高濃度のたんぱく質および脂肪は、水
分が低いことと相まって、市販形態のナイシンおよび他の天然の抗菌剤による阻害から種
々の病原体を保護および／または遮断する傾向のあるチーズマトリクスを提供すると考え
られていたので、従来の抗菌剤は、高濃度のたんぱく質および脂肪を有するプロセスチー
ズにはあまり効果的でない傾向があった。ナイシンおよびナタマイシンを含むプロセスチ
ーズは、ナイシンおよびナタマイシンの含量が低いにもかかわらず、カビおよびグラム陽
性菌の増殖の抑制により、顕著に長い貯蔵寿命を有することが予想外にも分かった。ナタ
マイシンは分解しやすいことが知られているので、このような少量のナイシンおよびナタ
マイシンがプロセスチーズ製品の貯蔵寿命を延ばすために効果的であることは、特に驚く
べきことである。

本明細書において、「天然の抗菌」および「天然の抗真菌」なる用語は、発酵工程の間
に細菌培養物等の生物によって生産される、それぞれの抗菌活性および抗真菌活性を有す
る成分を指す。１種以上の異なる天然の抗菌成分および抗真菌成分をプロセスチーズに含
むことができる。一形態において、プロセスチーズは、十分な量の天然の抗菌成分および
抗真菌成分を含んでいるので、プロセスチーズは、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム等の
人工保存料を含んでない、または、これらが全く存在しない。本明細書において、「を含
まない」、「全く存在しない」、「実質的に存在しない」なる語句は、約０．５％未満、
他の試みでは約０．１％未満、場合によっては約０．０５％未満、および、他の場合には
無であることを意味する。

いくつかの試みでは、プロセスチーズは、プロセスチーズを約８６°Ｆ（３０℃）で保
存した場合に少なくとも約９日間にわたりボツリヌス菌からの毒素形成を防止するのに有
効な量の天然の抗菌剤を含む。また、プロセスチーズは、約４５°Ｆ（７．２℃）での貯
蔵の間に、少なくとも約１ヶ月、他の態様では少なくとも約２ヶ月、他の態様では少なく
とも約３ヶ月、他の態様では少なくとも約４ヶ月、他の態様では少なくとも約５ヶ月、他
の態様では約６ヶ月、および、さらに他の態様では少なくとも約７ヶ月にわたり、リステ
リア・モノサイトゲネスの増殖を１ｌｏｇ超で防止するのに有効な量の天然の抗菌剤を含
む。

好ましい天然の抗真菌剤は、ナタマイシン等のポリエン抗真菌剤を含み、好ましい天然
の抗菌剤は、例えばナイシンを含む。１つの試みでは、プロセスチーズは、約０．１～約
１００ｐｐｍの天然の抗菌剤を、他の試みでは約０．１～約２０ｐｐｍの天然の抗菌剤を
、他の試みでは約１～約１５ｐｐｍの天然の抗菌剤を、他の試みでは約１～約１０ｐｐｍ
の天然の抗菌剤を、他の試みでは約１～約５ｐｐｍの天然の抗菌剤を、他の試みでは約３
～約５ｐｐｍの天然の抗菌剤を、および、さらに他の試みでは約３～約４ｐｐｍの天然の
抗菌剤を含む。いくつかの試みでは、プロセスチーズは、約０．１～約１００ｐｐｍのナ
イシンを、他の試みでは約０．１～約２０ｐｐｍのナイシンを、他の試みでは約１～約１
５ｐｐｍのナイシンを、他の試みでは約１～約１０ｐｐｍの天ナイシンを、他の試みでは
約１～約５ｐｐｍのナイシンを、他の試みでは約３～約５ｐｐｍのナイシンを、および、
さらに他の試みでは約３～約４ｐｐｍのナイシンを含む。さらに他の試みでは、ナイシン
はナイシンＡを含む。

別の態様では、本明細書に記載されプロセスチーズは、約０．１～約１５ｐｐｍの天然
の抗真菌剤を、他の試みでは約０．５～約１０ｐｐｍの天然の抗真菌剤を、他の試みでは
約０．５～約８ｐｐｍの天然の抗真菌剤を、他の試みでは約０．５～約６ｐｐｍの天然の
抗真菌剤を、他の試みでは約２～約４ｐｐｍの天然の抗真菌剤を、および、さらに他の試
みでは約２～約４ｐｐｍの天然の抗真菌剤を含む。いくつかの態様では、天然の抗真菌剤
はナタマイシンである。

プロセスチーズの製造中に添加されるナタマイシンの量は、ナタマイシンの一部が加熱
工程中に分解されることを念頭において選択されるべきである。したがって、最初にプロ
セスチーズに添加されるナタマイシンの量は、例えば１ヶ月、２ヶ月、または３ヶ月保存
時に製品中に残っているものよりも顕著に高くなり得る。一般に、製品中のナタマイシン
の保持を適正化する製造条件を選択することが望ましい。また、プロセスチーズを製造す
る方法における加熱工程の後に、ＨＰＬＣで測定して約０．１～約１５ｐｐｍのナタマイ
シンを、他の試みでは約０．５～約１０ｐｐｍのナタマイシンを、他の試みでは約０．５
～約８ｐｐｍのナタマイシンを、他の試みでは約０．５～約６ｐｐｍのナタマイシンを、
他の試みでは約２～約６ｐｐｍのナタマイシンを、他の試みでは約２～約５ｐｐｍのナタ
マイシンを、および、他の試みでは約２～約４ｐｐｍのナタマイシンを保持するプロセス
チーズ製品を提供するのに有効である初期ナタマイシン濃度を選択することも望ましいこ
とが分かった。一態様において、ナタマイシンの量は、製品の包装から７２時間以内等の
、加熱工程の完了から７２時間以内に測定することができる。これは、加熱工程の後に残
留している量であるので、ナタマイシンの少なくとも一部がプロセスチーズの製造中に分
解した後にも、前記の量が残留するように、大量のナタマイシンを最初に含むことが必要
である場合がある。

いくつかの試みでは、プロセスチーズは、約１～約１０℃で貯蔵した場合に、少なくと
も約３ヶ月、他の態様では少なくとも４ヶ月、他の態様では少なくとも５ヶ月、他の態様
では少なくとも６ヶ月、および、さらに他の態様では少なくとも７ヶ月にわたりカビの成
長を防止するのに有効な量の天然の抗真菌剤を含む。プロセスチーズ製品中のナタマイシ
ンの有効性は、プロセスチーズの試料に、９０ｃｆｕ／ｇまたは５００ｃｆｕ／ｇ等の公
知の量のカビ胞子を接種し、４０～４５°Ｆ（４．４～７．２℃）での貯蔵中の可視的な
カビの成長を調べるというカビ検証試験を行うことより、測定される。

一形態において、天然の抗真菌剤は、ピマリシンとして知られるナタマイシンも含む。
ナタマイシンは、ストレプトマイセス・ナタレンシス、または、ナタマイシンを産生する
ように遺伝子組み換えされた他の生物を用いた発酵により産生することができる。所望で
あれば、ダニスコ（Ｄａｎｉｓｃｏ）社のＮＡＴＡＭＡＸ（商標）ＳＦ（８７％粉末ナタ
マイシン）等の市販のナタマイシン源を使用することができる。所望であれば、例えば、
（特定のストレプトマイセス種によって産生される）ポリリシン等の他の天然の抗真菌剤
も含むことができる。

一形態において、天然の抗菌成分は、天然の抗菌成分、および／または、適当な発酵条
件の下で天然の抗菌剤を産生することができる培養物を含む、発酵乳成分または濃縮され
た発酵乳成分を介して、プロセスチーズに組み込まれる。本明細書において、「発酵乳成
分」または「濃縮された発酵乳成分」なる用語は、いくつかの試みでは濃縮、および、発
酵抗菌成分を含まないと具体的に特定されていない限りは、ナイシン等の抗菌性ペプチド
を産生するのに有効な条件下で、選択された抗菌剤産生培養物での発酵を受けた発酵乳基
質またはその誘導体を一般に指す。

天然の抗菌成分は、乳酸菌の抗菌剤産生株を用いて発酵することにより産生することが
できる。本明細書において、「乳酸菌」なる用語は、一般に、炭水化物発酵の主要代謝産
物として乳酸を生成するグラム陽性細菌を意味する。乳酸菌は、例えば、乳酸連鎖球菌、
または、代替的な試みにおいて、ブレビバクテリア系の抗菌剤産生株である。

いくつかの態様において、天然の抗菌成分は、抗菌性ペプチドである。例えば、抗菌性
ペプチドは、ナイシンと、いくつかの試みにおいて、ナイシンＡを含むことができる。ナ
イシンは、３４個のアミノ酸残基を有する阻害性多環式ペプチドである。ナイシンは、異
常アミノ酸であるランチオニン、メチルランチオニン、デヒドロアラニン、およびデヒド
ロアミノ酪酸を含む。これらのアミノ酸は翻訳後修飾によって合成される。これらの反応
では、リボソーム合成された５７－ｍｅｒを最終的なペプチドに変換する。不飽和アミノ
酸はセリンおよびトレオニン由来である。

ナイシンは、乳を含む天然基質上でナイシン産生細菌を培養することによって得ること
ができる。ナイシンは、グラム陽性の腐敗菌および病原菌を抑制することにより、安全で
使用可能な寿命を延長するために、食品に含まれている。高度に選択的な活性ゆえに、ナ
イシンは、グラム陰性の細菌、酵母およびカビの単離のための微生物学的培地における選
択剤として使用することができる。ナイシンを含む２つの市販の抗菌剤は、Ｎｉｓａｐｌ
ｉｎ（登録商標）およびＮｏｖａｓｉｎ（商標）であり、両者ともにデンマークのＤａｎ
ｉｓｏ Ａ／Ｓから発売されている。典型的には、Ｎｉｓａｐｌｉｎは約３．０重量％未
満のナイシンを含み、残部はＮａＣｌ、たんぱく質、炭水化物および水分からなる。本明
細書においてナイシン成分に言及した場合、この成分は、ナイシンのみならず、担体、塩
、たんぱく質、炭水化物、および発酵工程から得られる代謝産物等の他の材料を含むこと
ができる。

一態様において、抗菌成分はナイシンＡを含む。ナイシンＡは、約３，３５１．５ダル
トンの分子量および配列番号１のアミノ酸配列を有する。また、他の天然の抗菌剤は、本
明細書に記載のプロセスチーズ製品にも利用され得ることを理解すべきである。例えば、
ナイシンＺ、ナイシンＱ、ナイシンＦ、およびナイシンＦを含む他の形態のナイシンを含
むことができる。また、クラスＩバクテリオシン、クラスＩＩバクテリオシン、クラスＩ
ＩＩバクテリオシン、およびクラスＩＶバクテリオシン等の他のバクテリオシンを含むこ
とができる。

さらに、天然の抗菌剤を産生する細菌株を提供することができる。かかる菌株は、例え
ば、ラクトコッカス・ラクティスまたはブレビバクテリウム・リネンのナイシン産生株等
の、例えば、乳酸菌の抗菌剤産生菌株を含む。
プロセスチーズ

１つの試みでは、プロセスチーズは、ナチュラルチーズまたはナチュラルチーズの混合
物と、水分（例えば、水または限外濾過乳の形）と、任意選択の付加的な乳たんぱく質源
（乳たんぱく質濃縮物、乳清、乳清たんぱく質濃縮物、限外ろ過乳等）を一緒に配合する
ことによって製造することができる。また、ナタマイシン等の天然の抗真菌をこの時点で
添加することもできる。塩化ナトリウムを呈味のために添加することができる。他の任意
成分をテクスチャ、呈味、栄養、および／またはコスト属性を改善するために添加するこ
とができる。これらには、乳清由来の成分（例えば、乳清タンパク濃縮物）、脱脂粉乳、
乳タンパク濃縮物、無水乳脂肪、ゴム、デンプン、ゼラチン等が含まれるが、これらに限
定されない。成分を一緒に配合し、調理器具（例えば、レイダウンクッカー）に移し、低
温殺菌の温度に加熱する。いくつかの態様では、いくつかの試みでは培養乳成分の形態で
あるナイシンを調理器具に添加する。配合工程後に存在する任意の微生物によって、貯蔵
中にナイシンが少なくとも部分的に消費され、その有効性が減少し得るので、ナイシンを
調理器具に、かつ、加熱工程の前ではなく添加することが望ましい場合がある。任意選択
的に、せん断を加熱中または加熱後に適用し、実質的に均質な塊を形成することができる
。次いで、生成物は、スライスまたはローフ形状等の適当なまたは所望の形に包装される
。

蒸気を調理器具に注入し、加熱からの凝集蒸気を混合し、および／または直接水を添加
する等の任意の方法により、水分を配合物に添加することができるが、これらに限定され
ない。無論、水分は、様々な成分（例えばナチュラルチーズからの水分）を介して系に入
ることもある。最終チーズ製品の全体的な水分は、最終製品にどのようにして水分が導入
されたに関わらず、全ての水分を含む。培養された乳成分はナイシンを含むため、有利に
は、プロセスチーズの水管理が改善される。この目的のため、ナイシンおよび他のテクス
チャ改良成分を別々に添加する必要がないので、培養乳成分の原料を介してプロセスチー
ズに添加される水がより少なくなる傾向がある。

乳清たんぱく質とは、乳を凝固させ、ろ過した後に残留する液体である乳清から単離す
ることができる球状たんぱく質の集合を指す。乳清たんぱく質は、典型的には、βラクト
グロブリン、αラクトアルブミン、および血清アルブミンたんぱく質の混合物である。一
実施形態において、乳清タンパク濃縮物（ＷＰＣ）を、乳清タンパク源として使用しても
よい。ＷＰＣは、従来の濃縮技術によって、乳清から生じるものである。また、乳清たん
ぱく質源は、ラクトース、ビタミン、ミネラル、および脂肪を含むことができる。

当業者に知られているように、チーズ製品の所望の結果に応じて、様々な量で原料をプ
ロセスチーズ中に使用することができる。例えば、減塩チーズ製品に対して、チーズメー
カーは、チーズ混合物に塩を少量含め、または全く含めないことができる。また、プロセ
スチーズは、培養乳成分の形態および組成ならびにプロセスチーズの所望の形態に応じて
、ある範囲の量の培養乳成分を含むこともできる。

例えば、一形態において、プロセスチーズは、約１０～約９０％のナチュラルチーズを
含むことができる。他の形態によれば、プロセスチーズは、約３０～約６０％のナチュラ
ルチーズを含むことができる。本明細書で使用するナチュラルチーズとは、レンネット（
またはレンネット代用物）と酸性化の組み合わせを使用して、乳または他の液状乳製品を
凝固させることにより作られる未殺菌のチーズを意味する。本明細書に記載のプロセスチ
ーズに用いられるナチュラルチーズは、作りたてとすることも、または熟成させることも
できる。

さらに他の形態では、本明細書のプロセスチーズは、約３５～約５５％のナチュラルチ
ーズを含むことができる。本明細書において、ナチュラルチーズとは、一般に、凝乳と、
レンネット、レンネット代用品、酸性化、およびそれらの組み合わせのうちの１つとから
得られた未殺菌のチーズからもたらされたチーズを意味する。

また、プロセスチーズは、特定の用途の必要に応じて、さまざまな供給源からの多数の
他の乳原料を含むこともできる。例えば、一形態において、プロセスチーズは、約０～約
５０％（他の試みでは、約１０～約２５％）の乳タンパク濃縮物と、約０～約２５％（他
の試みでは、約１～約１０％）の乳清タンパク濃縮物、、約０～約３０％（他の試みでは
、約１～約１０％）の乳清、約０～約３０％（他の試みでは、約１～約１５％）の乳脂肪
／クリーム等を含むことができる。また、プロセスチーズは、クエン酸ナトリウム、リン
酸二ナトリウム等の乳化剤を、約０～約５％（他の試みでは、約１％～約３％）の量で含
むことができる。また、プロセスチーズは、塩、香料、強化剤、着色剤等を含み、所望の
色、風味等を提供することができる、また、プロセスチーズは、所望の最終製品に提供す
るために、添加水および／または原料からの水分を含むことができる。例えば、ビタミン
および他のミネラルを、必要に応じて添加し、プロセスチーズに対して約０～約３％のビ
タミンＡ、ビタミンＤ、および／または、カルシウム粉末（リン酸三カルシウム等）を強
化することができる。他の用途において、必要に応じて塩を添加することができる。いく
つかの試みにおいて、約０～約５％の塩を添加することができる。

伝統的な防腐剤の代わりに、プロセスチーズは、ナタマイシンおよびナイシンまたはナ
イシンを含む培養乳成分を含むことができる。一態様において、ナイシンを含む培養乳成
分を、本明細書に記載の方法によって製造することができる。一形態では、プロセスチー
ズは、約１～約２０％の培養乳成分を含むことができる。他の形態では、プロセスチーズ
は、約４～約１０％の培養乳成分を含む。いくつかの試みでは、本開示の培養乳成分は、
ナイシン含量に対するナイシン当量（ナイシン活性比）に比べて非常に高い総抗菌活性を
提供する。例えば、いくつかの試みにおいて、本明細書に記載の培養乳成分の量を用いた
培養乳成分およびプロセスチーズは、約０．３以下のナイシン活性比を示す。

なお、天然の抗菌成分および天然の抗真菌成分を、人工防腐剤の代替として使用するこ
とができることに留意されたい。プロセスチーズが本明細書の培養乳成分を含む場合には
、チーズは、ソルビン酸、亜硝酸塩等の従来の保存料を実質的に含まなくすることができ
る。１つの試みでは、実質的に含まないとは、一般的に、約０．５％未満を、他の試みで
は約０．１％未満を、さらに他の試みでは全く存在しないことを意味する。

天然の抗菌成分および／または天然の抗真菌成分は、全体的なプロセスチーズ組成物中
の他の成分を、少なくとも部分的に補完し、または置換するために使用することができる
。例えば、培養乳成分の形態に応じて、培養乳成分の量は、乳脂肪、カゼイン、乳清等の
、組成物中の他の乳製品材料の一部を補完または置換するために使用することができる。
換言すれば、他の乳製品原料の割合は、培養乳成分の使用の結果として変更することがで
きる。

一形態では、プロセスチーズは、約４０％のナチュラルチーズ、３５％の他の乳製品原
料、約８％の培養乳成分、約１２％の水、および、残部としての塩、香料、着色剤、ビタ
ミン、ミネラル等を含む。プロセスチーズは、一般に、加熱中、またはチーズ配合工程中
に、培養乳成分を添加すると理解されるように製造することができる。一形態において、
本明細書に記載のチーズ製品は、チーズディップ、チーズスプレッド、チーズブロック、
スライスチーズ、細切りチーズ等のいずれであってもよい。いくつかの試みでは、本開示
のプロセスチーズの様々な形態は、約１０～約９０％のナチュラルチーズ、約０～約５０
％の乳タンパク濃縮物、約０～約３０％の乳脂肪またはクリーム、約４０～約６０％の水
、約１～約２０％の培養乳成分、約０～約３０％の乳清、および約０～約２５％の乳清タ
ンパク濃縮物を、上述した種々の任意選択の香料、塩、および乳化剤と組み合わせて含む
ことができる。

他の形態では、プロセスチーズは、約１０～約３０％の総脂肪（他の試みでは約２０～
約３０％の脂肪）、約８～約２５％の総たんぱく質（他の試みでは約１５～約２５％の総
たんぱく質）、および約４０～約６０％の総水分（他の試みでは約４０～約５０％の水分
）を含む。

理論によって限定されることは望まないが、本明細書に記載のプロセスチーズの高たん
ぱく質、高脂肪、および、いくつかの場合には、低い水分レベルにより提供されるチーズ
マトリックスは、ナタマイシンを保護し、および／または封入する傾向があるので、ナタ
マイシンがプロセスチーズ加熱工程をよりよく耐え抜く。プロセスチーズに含まれるナタ
マイシンをこのように低量にしつつも、依然としてカビの繁殖なしに顕著に長い貯蔵寿命
を提供することができたのは、驚くべきことであり、予想外であった。

また、理論によって限定されることは望まないが、培養乳成分は、加熱工程中のナタマ
イシンを保護する役割を果たすことができるものと現在では考えられる。ナタマイシンと
、本明細書に記載の方法によって提供される培養乳成分との両方を用いて調製したプロセ
スチーズ製品は、製品の貯蔵中にＨＰＬＣにより測定されるナタマイシンの量が変化する
ことに留意されたい。例えば、ナタマイシンの検出可能な量は、貯蔵２および３ヶ月では
増加し、その後、４ヶ月では減少することが分かった。チーズマトリクスは貯蔵中に経時
的に変化し、ナタマイシンを２および３ヶ月で放出するので、ナタマイシンが製品中に存
在するカビと接触し、これを不活性化することができると現在では考えられている。その
後、カビによってナタマイシンが消費されるので、ナタマイシンの含有量は４ヶ月目に減
少する。２ヶ月および３ヶ月の間にナタマイシンの検出可能な含有量が増加するのは、ナ
タマイシンは経時的に分解するものと予想されていたので、非常に驚くべきことであった
。ナイシンおよびナタマイシンが、クリームチーズ製品等の他のチーズ製品に含まれる場
合には、この効果は観察されなかった。したがって、本明細書に記載の発酵乳成分がプロ
セスチーズ製品に含まれる場合に提供される、プロセスチーズ製品の固有のたんぱく質お
よび脂肪マトリックスは、驚くべきことに、所望の微生物安定性および貯蔵安定性を依然
として提供しつつも、含まれるべきナイシンおよびナタマイシンの量をこのように低くす
ることを可能とすると、現在では考えられている。

また、本開示の培養乳成分で作られたプロセスチーズは、約１０～約３０％の脂肪と約
８～２５％のタンパクを有するプロセスチーズ製品等の、高タンパク高脂肪製品における
抗菌特性を改善する。従来の市販形態のナイシンは、液状培地または培養液中のボツリヌ
ス菌を阻害すると一般的に考えられていたが、かかる従来の形態のナイシンが、プロセス
チーズ等の高たんぱく質高脂肪食品系に用いられた場合には、ナイシンは、ボツリヌス菌
および他の病原菌の阻害効果が低かった。理論によって限定されることを望まないが、本
明細書に記載のプロセスチーズの高タンパク、高脂肪、および、いくつかの場合には、低
い水分含量は、ボツリヌス菌および他の病原菌を保護し、および／または封入する傾向が
あるため、従来のナイシンおよび従来の天然の抗菌物質の効果を低くしていた。本明細書
の抗菌培養物から得られたナイシン、特に、菌株３２９は、高脂肪高たんぱく質プロセス
チーズ中において、全体として下記の実施例１に示すような他の形態のナイシンに比べて
、ボツリヌス菌、および、リステリア菌等の他の食品媒介病原菌を阻害するのにはるかに
有効であることが意外にも発見された。いくつかの試みでは、プロセスチーズ中の培養乳
成分は、本明細書に記載の高タンパク高脂肪のプロセスチーズにおいて、マウスを用いた
従来の毒素バイオアッセイにより測定されるボツリヌス菌からの毒素形成を、約８６°Ｆ
（３０℃）で少なくとも約９～約１０日にわたり防止するのに有効な量のナイシンを提供
する。１つの試みでは、生物毒素アッセイは、下記から入手可能なＨａｉｍ Ｍ． Ｓｏ
ｌｏｍｏｎらの細菌学的分析マニュアル、第１７章、ボツリヌス菌、２００１年１月にし
たがって行うことができる。
ｈｔｔｐ：／ ／ ｗｗｗ．ｆｄａ．ｇｏｖ／Ｆｏｏｄ／ＦｏｏｄＳｃｉｅｎｃｅＲｅｓ
ｅａｒｃｈ／ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭｅｔｈｏｄｓ／ｕｃｍ０７０８７９．ｈｔｍ
参照によりその全体を本明細書に援用する。

ナタマイシンおよび発酵乳成分は、高タンパク高脂肪プロセスチーズにおけるカビ、ボ
ツリヌス菌および他の病原体の阻害に有効であるだけでなく、発酵乳成分は、かかる阻害
効果を、従来可能であると判明していたものよりも低い活性レベルおよび／または低い用
量レベルで達成する。

他の試みにおいて、本明細書の培養乳成分の液体形態、または、本明細書に記載の方法
で作られた培養乳成分の液状形態は、最終プロセスチーズ中のナイシン活性を高いレベル
に維持するが、これは、従来の市販形態のナイシンをプロセスチーズに使用した場合には
達成できなかった。１つの試みによれば、本明細書に記載の発酵乳成分および本明細書に
記載の方法で作られた発酵乳成分は、プロセスチーズに組み入れる前の成分の活性に比べ
て、約５０～約９０％、他の試みでは、約６０～約７５％の活性を保持するのに有効であ
る。

いくつかの試みでは、培養乳成分は、発酵の前または後に限外濾過した液状乳を用いて
作られる。これらの試みでは、培養乳成分は、ラクトースおよび他の乳製品ミネラルの水
準が低下している。例えば、いくつかの試みにおいて、培養乳成分および培養乳成分を利
用するプロセスチーズは、約０．１％未満のラクトースと、酸として約１５％未満の乳酸
を有することができる。また、他の試みでは、培養乳成分および培養乳成分を利用するプ
ロセスチーズは、約６００ｍｇ／１００ｇ未満のカルシウムを有することができる。

プロセスチーズに使用するための抗菌成分の産生
一形態において、本明細書に記載されプロセスチーズ製品に含有するための培養乳成分
は、抗菌剤産生培養物で発酵させた乳基質を含む。いくつかの試みでは、乳製品基質は、
乳等の液状乳製品、または、２～５倍に濃縮された乳基質等の濃縮された液状乳製品もし
くは乳基質である。一態様では、抗菌剤産生培養物はナイシン産生培養物である。１つの
特定の形態では、培養物により産生するナイシンは、ナイシンＡである。

ここで、効果的な培養乳濃縮物とプロセスチーズを製造する方法についてより詳細に説
明する。最初に図１を参照し、工程図１０は、抗菌剤（ナイシンＡ等）を産生するのに有
効な培養乳製品材料または培養乳濃縮物を製造する１つの方法を例示しており、その製品
はプロセスチーズに使用するのに有効である。この例示的な工程１０において、全乳の如
き液状乳製品等の液状乳出発材料１４を用いることができる。他の試みでは、出発液状乳
は、乳タンパク濃縮物および／または乳清材料とすることができる。出発材料１４は、全
固形が約５～約３５％で、脂肪が約０～約１６％で、たんぱく質が約１～約１４％で、水
分が約６４～約９５％とすることができる。他の形態では、出発材料１４は、全固形が約
２６～約３０％で、脂肪が約１０～約１５％で、たんぱく質が約８～約１２％で、水分が
約７０～約７０％である、３．５倍に濃縮した全乳とすることができる。

別の試みでは、出発材料１４は、液状乳製品の限外濾過から得られた濃縮液状乳である
。濃縮された出発材料は、全固形分で規定して、約２倍～約５倍の濃度、他の試みでは約
２倍～約４倍、さらに他の試みでは約３倍～約３．５倍の液状乳製品に濃縮することがで
きる。すなわち、３倍濃度は、出発液状乳製品に対して全固形分の水準が３倍であり、５
倍濃度は、出発液状乳製品に対して全固形分の水準が約５倍である。１つの試みにおいて
、限外濾過膜を用いて、適当に濃縮された出発材料を達成することができる。１つの適切
な膜は、約５～約２０ＫＤの分子量カットオフを有する。また、特定の用途の必要に応じ
て、精密濾過、ナノ濾過、および逆浸透等の他の濃縮方法を用いることもできる。

以下でさらに説明するように、本開示の２倍～５倍の乳等の濃縮乳中での発酵は、典型的
には、従来の抗菌性発酵物および発酵では問題が生ずる。本開示の生成物および方法にお
いて使用される菌株３２９は、濃縮液状乳製品中での発酵を可能にし、同時に、ナイシン
の形成を許容する。濃縮乳を、本開示のプロセスチーズ成分の発酵および最終的な製造に
利用することにより、得られるプロセスチーズ中の水分含量がより良好に制御される。い
くつかの試みでは、これによって、プロセスチーズの製造工程における全体的な水分負荷
が軽減し、場合によっては、プロセスチーズ成分系列が単純となる。

液状乳製品または濃縮液状乳成分のいずれかである出発材料１４は、次いで殺菌１６さ
れた後、１つ以上の発酵槽１８に入る。低温殺菌は、約１５０～約１９０°Ｆ（６５．６
～８７．８℃）で約２０～約４０秒とすることができ、殺菌された主発材料の出口温度が
約８０～約９０°Ｆ（２６．７～３２．２℃）となる。ラクトコッカス・ラクティス株３
２９等の抗菌剤を産生する培養物２０を、水酸化ナトリウム（例えば、５．５Ｎ希水酸化
ナトリウム）等の塩基溶液２２と一緒に発酵槽１８に添加する。一形態では、約２×１０
^６～約２×１０^８ＣＦＵ／ｍｌの抗菌剤産生培養物２０を発酵槽に添加する。一実施形態
では、培養物２０は、培養物を解凍した形態である。１つの試みでは、発酵温度は、約２
５～約３５℃（いくつかの試みでは約２８～約３２℃、他の試みでは約３０℃）に維持さ
れ、発酵槽内でのｐＨは約５～約６（他の試みでは、約５．４～約５．８、さらに他の試
みでは約５．４～約５．６）である。また、培養物が、選択された条件下で所望の水準の
ナイシンを産生することができる場合には、他の温度およびｐＨを用いることもできる。
例えば、１つの試みにおいて、ｐＨは約５～約７の範囲であり、温度は約２０～約４０℃
の範囲である。組成物を種々の期間にわたって発酵させて、組成物に異なる風味特性を付
与することができる。例えば、ある試みにおいて、組成物を約１８～約２２時間にわたり
発酵させる。他の形態では、発酵を、約１５～約４８時間の範囲にわたって行うことがで
きる。

次に、組成物は、任意選択のせん断装置２４に送られ、形成されている可能性のある小
さな／柔らかいカードをせん断する。ある試みでは、せん断装置は、ロータ／ステータ・
ミキサー（Ｄｉｓｐａｘ等）または他のロータせん断装置とすることができる。この工程
は、他の処理条件およびこの処理で利用される材料の特性に応じて、任意選択とすること
ができる。次いで、組成物は、最終的に任意選択の熱処理工程２６に供される。一形態に
おいて、組成物は、約１５０～約１６０°Ｆ（６５．６～７１．１℃）で概ね約６０～約
１００秒間にわたり熱処理２６される。他の形態では、組成物を熱処理して、ｃｆｕ／ｍ
ｌを約１０００ｃｆｕ／ｍｌ未満に低減する。得られた組成物１２は、ナイシンおよび／
またはナイシン産生物質を含む培養乳成分または培養乳濃縮物である。少なくともいくつ
かの試みにおいて、これらの２つの成分を、３２９株等の同じ出発細菌株から、同じ発酵
条件下で生成することが有利である。組成物は、約６～約４０％の全固形分を有する液体
の形態とすることができる。一形態では、この液体は、全固形分が約２０～約３０％であ
り、いくつかの試みでは全固形分が約２８．５％である。

図１Ａに示す代替の方法２００において、まず水和した粉末および／または液状乳２０
２を、高温短時間殺菌（ＨＴＳＴ）または超高温殺菌（ＵＨＴ）工程で加熱２０４するこ
とができる。次に、加熱された液体を、前述の方法に関連して説明したのと同様の材料、
培養物、および条件で発酵２０６させる。発酵後、材料を、任意選択でせん断２０８し、
その後に濃縮２１０することができる。この試みでは、濃縮を、膜濾過、蒸発、または遠
心分離とすることができる。濃縮後、得られた濃縮物を、例えば、ＨＴＳＴまたはＵＨＴ
を用いて、任意選択で再加熱２１２することができる。

培養乳成分を調製するための他の工程１００を図２に示す。図２の工程１００は、粉末乳
タンパク濃縮物および粉末乳清等の粉末状の出発材料１１２を利用する。この試みでは、
約３～約１０％の粉末乳タンパク濃縮物、約２～約６％の粉末乳清、および約７５～約９
５％の水をタンクまたは発酵槽中で配合し、発酵培地を形成する。粉末を、発酵槽１１８
に添加する前に混合１１４し、加水することができる。これらの主発材料を、その後、発
酵槽１１８中で、約２×１０^６ＣＦＵ／ｍｌ～約２×１０^８ＣＦＵ／ｍｌの量のラクトコ
ッカス・ラクティス株３２９等の抗菌剤産生培養物１２０と混和し、図１に関して説明し
たと同じ方法で発酵させる。また、図１の方法と同様に、処理水と、希水酸化ナトリウム
等の塩基も、タンク１２３から発酵槽１１８に添加することができる。発酵の後、組成物
を、任意選択で、必要に応じて加熱または冷却し、次いで、最終的な培養乳成分１１２に
調製することができる。いくつかの試みでは、工程には、特定の用途の必要に応じで、様
々な中間加熱および冷却１１２を含むことができる。この点では、組成物１１２を、濃縮
液の形態で使用するための１つまたは複数の保持タンク１３０または他の貯蔵場所に置く
ことができる。貯蔵タンクの温度保持は、約３０～約５０°Ｆ（－１．１～１０℃）とす
ることができる。一実施形態（液体形態等）において、培養乳成分は、約６～約１１％の
全固形分、別の形態では約２０％の全固形分を有することができる。さらに、培養乳成分
を、噴霧器１４０等で噴霧乾燥することができる。１つの試みでは、噴霧器は、乾燥温度
が約１６０～約１８０度（約７１．１～約８２．２℃）であり、かつ、圧力降下が約１５
～約２５ｐｓｉ（約０．１０ＭＰａ～約０．１７ＭＰａ）とすることができる。

培養乳成分は、種々の形態を取り得る。例えば、図１および２に示すように、培養乳成
分は、液状とすることができる。また、培養乳成分は、図２に示すような噴霧乾燥等によ
る、粉末の形態をとることができる。さらに、培養乳成分は、蒸発、濾過等によって得ら
れた成分等の濃縮形態であってもよい。図１または２の方法で得られた生成物は、特定の
用途に応じて、液体とし、または噴霧乾燥することができる。図２は噴霧乾燥の例示的な
工程を示しており、これらの工程を図１の方法と共に使用することができることが理解さ
れるであろう。培養された乳成分をさらに濃縮、噴霧乾燥等により処理する場合、このさ
らなる処理は、実質的にナイシンに影響を与えないやり方で完了されることが理解される
であろう。

図１および２の方法によって産生された培養乳成分を、その後、プロセスチーズに使用
し、および／または、プロセスチーズを製造するために用いることができる。

本明細書において、長期活性単位（ＡＵ）は、抗菌剤が組み込まれた培養乳成分および
プロセスチーズ中の天然の抗菌剤の生物学的活性を説明するために用いることができる。
また、生物学的活性は、国際単位（ＩＵ）で表すこともでき、ＡＵとＩＵは交換可能に使
用することができる。いくつかの試みでは、本開示の培養乳成分およびそれを用いて調製
したプロセスチーズは、約４０～約４００ＩＵ／ｇ、他の用途では約５０～約２００ＩＵ
／ｇのナイシン活性を有することができる。

一形態では、培養乳成分はナイシン成分を含み、および／または、発酵培地の重量の約
３０～約９０ｐｐｍの範囲内のナイシン成分を産生することができる培養物を含む。

天然の抗菌剤は、乳製品基質に適当な発酵条件下で抗菌剤産生細菌を培養することによ
り提供することができる。乳製品基質は、例えば、乳、クリーム、乳清または他の乳製品
含有粉末もしくは液体を含むことができる。また、乳製品基質は、デキストロース、コー
ンシロップ、または細菌の成長のための他の栄養素を補充した他の炭水化物を、炭酸カル
シウム等の酸中和剤とともに、または酸中和剤なしに、含むことができる。

いくつかの形態において、乳は、生乳の形態であってもよく、または、少なくとも約２
倍に濃縮された乳製品、他の態様では最大約５倍に濃縮した乳製品等の濃縮乳製品の形態
であってもよい。典型的には、乳基質は、約３％超のラクトースおよび窒素源を含むであ
ろう。基質は、水和粉末から製造され、または、脱脂乳、２％乳、全乳等の新鮮な液状乳
製品由来とすることができる。１つの試みでは、出発乳製品基質は、全固形分が約５～約
３６％で、たんぱく質含量が約１～約１４％で、脂肪含量が約０～約１６％で、水分含量
が約６４～約９５％である濃縮乳を含む。

培養乳成分をプロセスチーズの製造に用いる場合、プロセスチーズ製品への投入前に培
養乳成分から水分を除去することに関連するコストの増大を低減するために、乳製品基質
中の水分を低水準に維持することが望ましいことが分かっている。さらに、培養乳成分の
特定の成分が不安定であってもよく、水分除去工程の間に分解し、または損傷を受けても
よい。しかし、特定の用途のために望ましい場合は、培養された抗菌剤を含む培養乳成分
は、液体および／または粉末等の様々な形態をとることができる。

少なくともいくつかの試みでは、本明細書で用いるナイシンＡ産生培養物は、ラクトコ
ッカス・ラクティス亜種ラクティス株３２９である。２０１３年８月２１日に、菌株３２
９は、１０８０１ユニバーシティブルバード、マナッサス、バージニア州 ２０１１０の
アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託され、受託番号ＰＴ
Ａ－１２０５５２を与えられた。寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関す
るブダペスト条約の規定に従って行われた。また、菌株３２９は、２０１３年８月２２日
に出願された米国特許出願第１３／９７３６６０号に詳細に記載されており、その全体を
参照により本明細書に援用する。

ラクトコッカス・ラクティス株３２９は、乳酸菌の他のナイシン産生株と比較して、独
特の遺伝子およびファージプロファイルを有することが分かっている。有利なことに、菌
株３２９は、約２～約５倍の乳を含む濃縮乳製品基質中で生育することができることが分
かった。このように高度に濃縮された乳基質中で生育可能な培養物は少ないことが分かっ
ている。例えば、この培養物は、約１０時間で少なくとも約１０^９ＣＦＵ／ｇまで成長す
るのに有効であり、約２倍～約５倍に濃縮された発酵培地中であっても、約１８時間で約
２０００ＩＵ／グラムを超えるナイシンＡを産生する。菌株３２９は、以下でより詳細に
説明するように、多重座配列タイピング（ＭＬＳＴ）、ファージタイピングおよびリボタ
イピングを用いて特徴付けられた。

多重座配列タイピング（ＭＬＳＴ）

ナイシン産生株でもある、ラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティス ＩＬ １４０
３（ｔａｘｉｄ：２７２６２３）の公的に入手可能な遺伝情報は、ＩＬ１４０３と菌株３
２９の比較における遺伝子マーカーとして使用される７つのハウスキーピング遺伝子の選
択のためのテンプレートとして用いられる。選択された遺伝子は、下記の表１に詳述され
るように、染色体上の遺伝子座のある範囲に広がる。７種の遺伝子のそれぞれを増幅し、
配列決定した。次いで、この配列を基準として、ＩＬ１４０３を用いて整列および比較を
行った。各配列の多様性が評価され、これは個々の対立遺伝子を表す。

ファージタイピング

スポットプレートを用いて、高力価のファージストックのファージプロファイリングを
行った。ファージを同定した。ファージタイピングの結果を図４に示す。

リボタイピング

本明細書において、「リボタイピング」は、１６Ｓおよび２３ＳのｒＲＮＡをコードす
る遺伝子の全部または一部を含むゲノムＤＮＡ制限断片のフィンガープリントを指す。制
限酵素としてＥｃｏＲＩを利用した従来のリボタイピング技術を行った。結果を図５に示
す。リボタイピングにより、ラクトコッカス・ラクティス株３２９は、ナイシン生産株で
もある、公的に利用可能なラクトコッカス・ラクティス株ＡＴＣＣ寄託番号１１４５４と
実質的に異なることが確認された。

ＤＮＡ配列解析

図６に示すように、ラクトコッカス・ラクティス株３２９は、エキソポリサッカライド
およびナイシンクラスタ遺伝子の特有の組み合わせを有することがわかった。ラクトコッ
カス・ラクティス株３２９は、下記の表２のナイシンクラスタ遺伝子配列を含み、図７の
アミノ酸配列（配列番号１）を有するナイシンを生成する。

少なくとも、図１の方法を参照しつつ本明細書で説明した発酵条件下で、ラクトコッカ
ス・ラクティス株３２９は、５７アミノ酸長のナイシンＡ前駆体ペプチド（ナイシンＡ前
駆体は、配列番号２０のアミノ酸配列を有する）に比べて高い水準の３４アミノ酸長のナ
イシンＡを産生する。ナイシンＡは、ナイシン前駆体の翻訳後修飾によって生成される。
少なくともいくつかの試みでは、ラクトコッカス・ラクティス株３２９は、ナイシンＡを
、ナイシンＡ前駆体に対する比として、少なくとも約９：１で、他の態様では少なくとも
約９．５：０．５で、生成する。対照的に、ＤａｎｉｓｃｏのＮｉｓａｐｌｉｎ（登録商
標）は、約８３％のナイシンＡと、１７％のナイシンＡ前駆体を含む。

上述したナイシンを生成するのに効果的な発酵条件と同じ発酵条件下で、ラクトコッカ
ス・ラクティス株３２９は、例えば、図１の方法を参照して本明細書で説明した発酵条件
下等で、エキソポリサッカライドを産生する。ラクトコッカス・ラクティス株３２９は、
下記の表３のＥＰＳクラスタ遺伝子を含む。

少なくともいくつかの試みにおいて、本明細書に記載される方法に有用な抗菌剤産生細
菌株は、図１を参照して説明した発酵条件下で約２０００ＩＵ／ｇ以上のナイシンＡとエ
キソポリサッカライドの両方を産生することができる。

本明細書に提供される配列情報は、誤って識別されたヌクレオチドの包含が必須である
かのように、狭義に解釈されるべきではない。当業者は、本明細書中に開示される配列を
用いて、細菌株から完全な遺伝子を単離し、さらに遺伝子を配列解析に供し、配列決定エ
ラーを識別することができる。

本明細書において、「相同性」および「同一性」なる用語は互換的に使用される。２つ
の配列のパーセント同一性または相同性を求めるために、配列を最適な比較目的のために
整列させることができる。次いで、ヌクレオチドまたはアミノ酸を、２つの配列の、対応
するヌクレオチドまたはアミノ酸の位置で比較する。例えば、第１の配列中のヌクレオチ
ドまたはアミノ酸は、同一ヌクレオチドまたはアミノ酸が第２の配列の対応する位置に配
置される場合には、第２の配列のヌクレオチドまたはアミノ酸と同一であると考えられる
。パーセント同一性は、同一の位置の数を、位置（すなわち、重複位置）の総数で除し、
１００を乗じて求めることにより、計算される。

機能性核酸等価物もまた本開示において考慮される。例えば、機能性核酸等価物は、コ
ードされたポリペプチドの生物学的機能を変化させないサイレント突然変異または他の突
然変異を含む。

一形態において、本明細書に記載の方法に有用な抗菌剤生産細菌株は、配列番号９－１
９および２１－３３に対して有意な相同性を有する１つ以上の遺伝子を有しており、ナイ
シンを産生することができる。本明細書において、「有意な相同性」との用語は、少なく
とも７０％の相同性、他の態様では少なくとも７５％の相同性、他の態様では少なくとも
８０％の相同性、他の態様では少なくとも８５％の相同性、他の態様では少なくとも９０
％の相同性、他の態様では少なくとも９５％の相同性、さらに他の態様では少なくとも９
９％の相同性、および、さらに他の態様では完全に相同であることを意味する。

いくつかの試みでは、本明細書に記載される方法に有用な抗菌物質産生細菌株は、配列
番号９～１９および２１～３３からなる群から選択される配列に有意な相同性の少なくと
も２つの遺伝子、他の態様では、配列番号９～１９および２１～３３からなる群から選択
される配列に有意な相同性の少なくとも３つの遺伝子、他の態様では、配列番号９～１９
および２１～３３からなる群から選択される配列に有意な相同性の少なくとも４つの遺伝
子、他の態様では、配列番号９～１９および２１～３３からなる群から選択される配列に
有意な相同性の少なくとも５つの遺伝子、他の態様では、配列番号９～１９および２１～
３３からなる群から選択される配列に有意な相同性の少なくとも６つの遺伝子、他の態様
では、配列番号９～１９および２１～３３からなる群から選択される配列に有意な相同性
の少なくとも７つの遺伝子、他の態様では、配列番号９～１９および２１～３３からなる
群から選択される配列に有意な相同性の少なくとも８つの遺伝子、他の態様では、配列番
号９～１９および２１～３３からなる群から選択される配列に有意な相同性の少なくとも
９つの遺伝子、他の態様では、配列番号９～１９および２１～３３からなる群から選択さ
れる配列に有意な相同性の少なくとも１０個の遺伝子、他の態様では、配列番号９～１９
および２１～３３からなる群から選択される配列に有意な相同性の少なくとも１１個の遺
伝子、他の態様では、配列番号９～１９および２１～３３からなる群から選択される配列
に有意な相同性の少なくとも１２個の遺伝子、他の態様では、配列番号９～１９および２
１～３３からなる群から選択される配列に有意な相同性の少なくとも１３個の遺伝子、他
の態様では、配列番号９～１９および２１～３３からなる群から選択される配列に有意な
相同性の少なくとも１４個の遺伝子、他の態様では、配列番号９～１９および２１～３３
からなる群から選択される配列に有意な相同性の少なくとも１５個の遺伝子、他の態様で
は、配列番号９～１９および２１～３３からなる群から選択される配列に有意な相同性の
少なくとも１６個の遺伝子、他の態様では、配列番号９～１９および２１～３３からなる
群から選択される配列に有意な相同性の少なくとも１７個の遺伝子、他の態様では、配列
番号９～１９および２１～３３からなる群から選択される配列に有意な相同性の少なくと
も１８個の遺伝子、他の態様では、配列番号９～１９および２１～３３からなる群から選
択される配列に有意な相同性の少なくとも１９個の遺伝子、他の態様では、配列番号９～
１９および２１～３３からなる群から選択される配列に有意な相同性の少なくとも２０個
の遺伝子、他の態様では、配列番号９～１９および２１～３３からなる群から選択される
配列に有意な相同性の少なくとも２１個の遺伝子、他の態様では、配列番号９～１９およ
び２１～３３からなる群から選択される配列に有意な相同性の少なくとも２２個の遺伝子
、他の態様では、配列番号９～１９および２１～３３からなる群から選択される配列に有
意な相同性の少なくとも２３個の遺伝子、さらに他の態様では、配列番号９～１９および
２１～３３からなる群から選択される配列に有意な相同性の少なくとも２４個の遺伝子を
有する。

組成物、方法、および本明細書において説明する方法によって製造された組成物の利点
および実施形態を、以下の実施例によってさらに説明する。しかし、特定の条件、処理順
、材料、およびこれらの実施例に記載の量、ならびに他の条件および詳細は、過度にこの
方法を限定するものと解釈されるべきではない。特に断らない限り、本開示内のすべての
百分率および比率は重量基準である。

以下の実施例は、上述した培養乳成分を用いて調製したプロセスチーズスライスと、培
養乳成分を用いず、その代わりに、保存料としてソルビン酸を使用した対照試料の性能を
示す。試料は、一般に、様々な量の保存料および／または培養乳成分（示されている場合
）、香料、着色料、ビタミン、ミネラル等を含み、水分が約４６％、脂肪が約２３％、塩
が約１．２％、たんぱく質が約１８％であるプロセスチーズスライスとして調製した。

実施例１

ナタマイシン（ＤａｎｉｓｃｏのＮａｔａｍａｘ ＳＦ）を、７ｐｐｍおよび１５ｐｐ
ｍの濃度でプロセスチーズに（加熱工程の前に）組み入れた。その後、プロセスチーズを
カビ検証試験に供した。プロセスチーズに、（カビの一般的な種類を代表する）フォーマ
属、ゲオトリクム属、クラドスポリウム属、およびペニシリウム属のカビ混合物（液体培
地中で胞子）を、１９グラムスライス当たり９０胞子で接種した。スライスしたチーズの
上に混合物を広げることにより、試料に接種する。対照品には接種しなかった。ナタマイ
シンを含むプロセスチーズは、貯蔵寿命が顕著に延長され、防カビ剤の入っていない対照
品よりも少なくとも６ヶ月長くなった。驚くべきことに、４５°Ｆ（７．２℃）で保存し
た場合に、ナタマイシンを含有するチーズは、製品中の検出可能なナタマイシン濃度が６
ヶ月で０．６２ｐｐｍ（７ｐｐｍ試料の場合）および４．８９ ｐｐｍの（１５ｐｐｍ試
料の場合）にまで低下したにもかかわらず、貯蔵寿命を６ヶ月を超えて延長するのに有効
であることが分かった。ナタマイシンの検出可能なレベルは、ＨＰＬＣにより測定された
。

実施例２

ナタマイシン（ＤａｎｉｓｃｏのＮａｔａｍａｘ ＳＦ）を、０ｐｐｍ、１０ｐｐｍ、
および１５ ｐｐｍの濃度でプロセスチーズに（加熱工程の前に）組み入れた。各用量の
４つの試料を調製した。ナイシンを含有する培養乳成分は、プロセスチーズの全重量を基
準にして８％で、全ての製品に組み込まれた。プロセスチーズの製造３日後に測定をした
ところ、ナタマイシン１０ｐｐｍおよび１５ｐｐｍで出発した試料は、平均で、それぞれ
２．８ ｐｐｍおよび４．９ ｐｐｍのナタマイシンを有していた。

これらの製品に、実施例１のカビ混合物をチーズスライスの表面に適用し、包装を開いた
ままにすることにより、５００ｃｆｕ／ｇまたは９５００ｃｆｕ／スライスでカビ混合物
を接種した。プロセスチーズ（カビ混合物を接種していない）の他の包装を、意図的に穿
孔して包装に穴を開け、実世界の状況を模した。スライス当たり９５００胞子を接種した
もの（「非漏洩品」）および穿孔した包装実験（「漏洩品」）の結果を図３に示す。 こ
れらの試料は、５００ｃｆｕ／ｇまたはスライス当たり９５００胞子で接種した場合に、
非常に大きな９５００胞子／スライスの接種水準ですら、対照品のほぼ２倍の貯蔵寿命を
示した。

実施例３

約４．８ｐｐｍのナタマイシン（ＤａｎｉｓｃｏのＮａｔａｍａｘ ＳＦ）を含有する
プロセスチーズのスライスを製造した。４５°Ｆ（７．２℃）で貯蔵した場合に、５ヶ月
の貯蔵寿命において、スライスには目に見えるカビは存在しなかったが、ナタマイシンを
含まない対照品は、３ヶ月で目に見えるカビが発生した。

実施例４

ナタマイシン（ＤａｎｉｓｃｏのＮａｔａｍａｘ ＳＦ）を１５ｐｐｍでプロセスチー
ズに（加熱工程の前に）に組み入れた。ナイシンを含有する培養乳成分を、プロセスチー
ズの全重量を基準として８％で全ての製品に組み入れた。プロセスチーズの試料に、１０
０ｃｆｕ／ｇおよび５００ｄｆｕ／ｇで接種した。下記の表４に示すように、ナタマイシ
ンの検出可能なレベルは、４５°Ｆ（７．２℃）での製品の貯蔵中に変化することが分か
った。ナタマイシンの検出可能な水準は、ＨＰＬＣにより測定された。

約３ヵ月の時点で、検出可能なナタマイシンの水準はピークを示し、、平均で６．８で
あった。このことは、プロセスチーズ製品が３ヶ月の時点で店舗で販売可能なままである
ので、商業的観点からは有利である。

前述の説明および添付の図面に記載の事項は、単なる例示であり、限定ではない。特定
の実施形態を示し、説明してきたが、変更および修正が、出願人の寄与する広い態様から
逸脱することなくなされ得ることは、当業者には明らかであろう。求められる保護の実際
の範囲は、従来技術に基づいて適切な観点で見た場合に、以下の特許請求の範囲で定義さ
れることが意図される。

Claims (11)

1. 天然の抗菌成分および抗真菌成分を含むプロセスチーズであって、
   前記プロセスチーズは、１０～３０％の総脂肪含有量、および８～２５％の総たんぱく質含有量を有し、
   前記プロセスチーズは、
   １０～９０％のナチュラルチーズまたはナチュラルチーズ混合物と、
   １種以上の乳化剤と、
   １～２０％の発酵乳成分であって、８６°Ｆ（３０℃）で９日間にわたり、前記たんぱく質量および脂肪量のプロセスチーズに対してマウスを用いた毒素バイオアッセイにより判定された、ボツリヌス菌による毒素形成を防止するのに有効な量のナイシンを含む発酵乳成分と、
   ０．５～６ｐｐｍのナタマイシンと
   の混合物を含み、
   前記プロセスチーズは１～１００ｐｐｍのナイシンを含み、
   前記発酵乳成分は、単離されたラクトコッカス・ラクティス株の発酵により提供され、前記発酵は、２５～３５℃の温度およびｐＨ５～６で、１５～４８時間行われ、前記単離されたラクトコッカス・ラクティス株は、全固形分が５～３６％であり、たんぱく質を１～１４％、脂肪を０～１６％含む、２倍～５倍に濃縮された液状乳製品培地中で生育可能であり、前記単離されたラクトコッカス・ラクティス株は、前記濃縮された液状乳製品培地中で１０時間で少なくとも１０^９ＣＦＵ／ｇまで生育可能であり、
   前記単離されたラクトコッカス・ラクティス株は、配列番号９～１９の配列を有するナイシンクラスタ遺伝子と、配列番号２１～３３の配列を有するエキソポリサッカライドクラスタ遺伝子とを有することを特徴とするプロセスチーズ。
2. ２～６ｐｐｍのナタマイシンを含む、請求項１に記載のプロセスチーズ。
3. ２～５ｐｐｍのナタマイシンを含む、請求項１に記載のプロセスチーズ。
4. 前記プロセスチーズは、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、亜硝酸塩、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される人工保存料を含まない、請求項１に記載のプロセスチーズ。
5. 前記ナイシンはナイシンＡである、請求項１に記載のプロセスチーズ。
6. 天然の抗菌成分および抗真菌成分を含むプロセスチーズを製造する方法であって、
   全固形分が５～３６％であり、たんぱく質を１～１４％、脂肪を０～１６％含む、２倍～５倍に濃縮された液状乳製品培地をラクトコッカス・ラクティス株で２５～３５℃の温度およびｐＨ５～６で、１５～４８時間発酵させてナイシンを含む培養乳成分を作るステップと、
   １種以上の乳化剤と一緒にナタマイシンおよび前記培養乳成分をナチュラルチーズまたはナチュラルチーズ混合物に添加して、８～２５％のたんぱく質と１０～２０％の脂肪を有するプロセスチーズを作るステップと
   を含み、
   前記ラクトコッカス・ラクティス株は、前記濃縮された液状乳製品培地中で１０時間で少なくとも１０^９ＣＦＵ／ｇまで生育可能であり、
   前記ラクトコッカス・ラクティス株は、配列番号９～１９の配列を有するナイシンクラスタ遺伝子と、配列番号２１～３３の配列を有するエキソポリサッカライドクラスタ遺伝子とを有し、
   前記プロセスチーズは、１～２０％の前記培養乳成分を含み、前記プロセスチーズは、０．５～６ｐｐｍのナタマイシンと、８６°Ｆ（３０℃）で９日間にわたり、前記たんぱく質量および脂肪量のプロセスチーズに対してマウスを用いた毒素バイオアッセイにより判定された、ボツリヌス菌による毒素形成を防止するのに有効な量のナイシンを含み、
   前記プロセスチーズは、１～１００ｐｐｍのナイシンを含むことを特徴とする方法。
7. 前記プロセスチーズは、２～６ｐｐｍのナタマイシンを含む、請求項６に記載の方法。
8. 前記プロセスチーズは、２～５ｐｐｍのナタマイシンを含む、請求項６に記載の方法。
9. 前記培養乳成分は、１～１００ｐｐｍのナイシンを含む、請求項６に記載の方法。
10. 前記プロセスチーズは、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、亜硝酸塩、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される人工保存料を含まない、請求項６に記載の方法。
11. 前記ナイシンはナイシンＡである、請求項６に記載の方法。

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